CZ2006592A3 - Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby - Google Patents

Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby Download PDF

Info

Publication number
CZ2006592A3
CZ2006592A3 CZ20060592A CZ2006592A CZ2006592A3 CZ 2006592 A3 CZ2006592 A3 CZ 2006592A3 CZ 20060592 A CZ20060592 A CZ 20060592A CZ 2006592 A CZ2006592 A CZ 2006592A CZ 2006592 A3 CZ2006592 A3 CZ 2006592A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polymer
copolymer
groups
hpma
grafts
Prior art date
Application number
CZ20060592A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298945B6 (cs
Inventor
Etrych@Tomáš
Chytil@Petr
Ulbrich@Karel
Mrkvan@Tomáš
Ríhová@Blanka
Original Assignee
Zentiva, A. S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentiva, A. S. filed Critical Zentiva, A. S.
Priority to CZ20060592A priority Critical patent/CZ2006592A3/cs
Priority to UAA200903818A priority patent/UA97812C2/ru
Priority to US12/441,619 priority patent/US8603990B2/en
Priority to PCT/CZ2007/000087 priority patent/WO2008034391A1/en
Priority to EP07801128.5A priority patent/EP2063914B1/en
Priority to EA200900453A priority patent/EA017073B1/ru
Publication of CZ298945B6 publication Critical patent/CZ298945B6/cs
Publication of CZ2006592A3 publication Critical patent/CZ2006592A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Polymerní lécivo, v nemž je na vodorozpustný polymerní nosic pripravený na bázi kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu navázáno kancerostatikumpripojené pomocí spojek obsahující hydrolyticky štepitelné hydrazonové vazby, kde struktura polymerního léciva sestává z hlavního retezce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu nesoucího kancerostatikum adalšího retezce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu- roubu, který prípadne nese rovnež kancerostatikum, pricemž tyto rouby jsou k hlavnímu retezci pripojeny vazbou v organizmu stálou a/nebo vazbou v organizmu štepitelnou, zejména oligopeptickou spojkou zvolenou z rady GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly, a zpusob jeho výroby.

Description

Vynález se týká vysokomolekulámích vodorozpustných polymemích nosičů kancerostatik umožňujících cílený transport protinádorových léčiv, zejména doxorubicinu (DOX), do pevných nádorů a zajišťujících eliminaci polymeru z organizmu. Účinek konjugátu polymemího nosiče s kancerostatikem je zaměřen na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
Nejnovější trendy vývoje léčiv se zaměřují na lékové formy umožňující cílený účinek biologicky aktivní látky přednostně v místě požadovaného terapeutického efektu. Cíleně působící léčiva nalézají uplatnění především v oblastech, kdy vedlejší účinky aktivní složky mohou vést k poškození zdravých částí organizmu. Toto nebezpečí je nej aktuálnější při léčbě cytostatiky. Použití polymemích látek, zvláště vodorozpustných polymerů jako nosičů léčiv nabízí jednu z významných možností řešení zmíněného problému. Připojení cytostatika k vodorozpustnému polymeru chemickou vazbou umožňuje zásadním způsobem zvýšit rozpustnost nerozpustných nebo málo rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich toxicitu. Vysoká molekulová hmotnost polymerů zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i větší biologickou využitelnost léčiva. Navíc se mohou makromolekulámí látky a zvláště syntetické polymery akumulovat v pevných nádorech díky EPR (enhanced permeability and retention) efektu [Maeda 2000, 2001], Této skutečnosti je možné, v případě navázání kancerostatika na makromolekulámí nosič, využít pro jeho cílenou akumulaci v nádoru. Byla vyvinuta celá řada systémů, které jsou založeny na tomto principu. Jedním z nich jsou polymemí micely. Jsou strukturně jiným nosičovým systémem nežli rozpustné polymery vyvíjené s cílem nádorově specifické dopravy cytostatik do pevných nádorů, využívají rovněž EPR efektu pevných nádorů pro zvýšenou akumulaci vysokomolekulámího léčiva v nádoru, ale jsou obvykle připravovány uspořádáním amfifilních diblokových kopolymerů do vysokomolekulámích micelámích útvarů tvořících koloidní roztoky. V micelách je obvykle léčivo vázáno do hydrofobního jádra micely fyzikálními (hydrofobní « « c interakce, iontové vazby) a nebo kovalentními vazbami [Kataoka 2001, Yokoyama 1999, Bae 2003, Yoo 2002, Bronich 1999]. Má-li být léčivo zmicely uvolněno, musí dojít k přerušení chemické vazby a zároveň i rozrušení hydrofobních interakcí v jádře micely. To platí předeyším pro hydrofobní léčiva. Oproti tomu v rozpustných systémech akumulujících se v pevných nádorech jsou makromolekuly rozpuštěny ve vodném prostředí molekulárně a molekula obvykle zaujímá tvar náhodného klubka. Léčivo je pak v kontaktu s hydrofilním polymerem a při uvolnění nemusí překonávat bariéru hydrofobních interakcí. Byly připraveny a studovány polymemí konjugáty kancerostatik s rozpustnými polymery, ve kterých bylo léčivo s protinádorovým účinkem připojeno k polymeru neštěpitelnou kovalentní vazbou, hydrolyticky nestabilní iontovou vazbou a nebo kovalentní vazbou náchylnou k enzymatické či prosté chemické hydrolýze. Takové systémy jsou schopny uvolnit kancerostatikum z nosiče v jeho aktivní formě buď v nádoru, nebo i více specificky, přímo v nádorové buňce. Významnou skupinu tvoří polymemí léčiva připravená na bázi kopolymerů N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), z nichž je řada aktivně směrována k nádorům prostřednictvím k polymeru připojené směrující struktury (protilátky, hormony). [Duncan 1985, Říhová 2000, Kopeček 2001, 2000]. Jejich syntéza je však značně složitá. V literatuře existuje celá řada informací o přípravě a studiu vlastností polymerů nesoucích kancerostatikum připojené k polymeru vazbou náchylnou k hydrolýze ve vodném prostředí [Kratz 1999]. Mezi nimi zaujímají významné postavení rovněž kopolymery HPMA, nesoucí kancerostatikum doxorubicin vázaný k polymemímu řetězci hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou [Etrych 2002, Ulbrich 2004a, Ulbrich 2004b, Ulbrich - patenty]. Tato vazba je relativně stálá v prostředí krevního řečiště (v průběhu transportu v organizmu) a hydrolyticky labilní v mírně kyselém prostředí živé buňky. Rychlost hydrolýzy této vazby řídí i rychlost uvolňováni léčiva, a tedy i koncentraci aktivní látky v místě požadovaného účinku. Takováto polymemí kancerostatika vykazovala při in vitro i in vivo testech na myších podstatně vyšší protinádorovou účinnost proti řadě nádorových linií nežli volné léčivo a v řadě případů vedlo jejich použití k úplnému vyléčení pokusných zvířat i při terapeutickém způsobu podání. [Říhová 2001, Etrych 2001]. Hlavním problémem použití HPMA kopolymerů je jejich neštěpitelný uhlíkatý řetězec, a tak obor molekulových hmotností použitelných pro přípravu polymemího nosiče je omezen na molekulové hmotnosti menší nežli 40 000 až 50 000, tedy pod vylučovací mezí organizmu. Polymery o vyšší molekulové hmotnosti nemohou být efektivně a dostatečně účinně z organizmu vyloučeny a jejich použití by vedlo k jejich nadměrné akumulaci v organizmu. Pro dosažení účinného EPR efektu, tedy výrazné akumulace v nádorech, je však třeba pracovat s polymery, a to platí i pro kopolymery HPMA, o molekulové hmotnosti vysoko nad vylučovací mezí (Seymour 1995, Noguchi 1998). Proto je výhodné, aby molekulová hmotnost polymemího nosiče byla dostatečně vysoká, ale aby po uvolnění účinné složky došlo k degradaci polymeru na fragmenty vylučitelné z organizmu např. glomerulámí filtrací. Ve vynálezu proto navrhujeme a dokládáme účinnost vysokomolekulámího polymemího léčiva s definovaným a biodegradovatelným skeletem nosiče, umožňujícím jak dopravu cytostatika do nádoru, tak i pozdější vyloučení polymemího nosiče z organizmu.
Literatura:
Bae, Y. S., Fukushima, S.; Harada, A.; Kataoka, K. pH responsive drug-loaded polymeric micelles: Intracellular drug release correlated with in vitro cytotoxicity on human small cell lung cancer SBC-3. 2003. Salt Lake City, Utah, U.S.A. Winter Symposium and 11th International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems. 2003.
Bronich, T. K.; Nehls, A.; Eisenberg, A.; Kabanov, V. A.; Kabanov, A. V. Colloids Surf. B 1999, 16, 243-251.
R. Duncan, J.B. Lloyd, J. Kopeček, P. Rejmanová, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, V. Chytrý: Synthetic Polymeric Drugs (1985). Czech. PV 0095/85, Australia 589587, Canada 130053, Denmark 164485, Europe 0187547, US 5,037,883, Japan 000137/86
Etrych, T., Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties. J. Controlled Release 73, 89-102 (2001).
T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002)
- 4 Etrych T., Chytil P., Pechar M., Studenovský M., Říhová B., Ulbrich K.: Způsob přípravy polymemích konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZ PV 2005-558
Kataoka, K; Harada, A.; Nagasaki, Y. Adv. Drug Delivery Rev. 2001, 47, 113-131.
Kopeček J., Kopečková P., Minko T., Lu Z., HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61-81 (2000)
Kopeček, J., Kopečková, P., Minko, T., Lu, Z.R., Peterson, C.M. (2001) “Water soluble polymers in tumor targeted delivery”. J. Controlled Release 74, 165-173.
F. Kratz, U. Beyer, M.T. Schutte, Drug-polymer conjugates containing acid-cleavable bonds, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sy st. 16 (1999) 245-288.
Maeda, H., J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, and K. Hori. 2000. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Release 65:271-284.
Maeda, H. 2001. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug targeting. Adv Enzyme Regul 41:189-207.
Y. Noguchi, J. Wu, R. Duncan, J. Strohalm, K. Ulbrich, T. Akaike, H. Maeda, Jpn. J. Cancer Res. 89, 307-314 (1998)
P. Rejmanová, J. Labský, J. Kopeček, Aminolyses of Monomeric and Polymeric 4-nitrophenyl Esters of N-Methacroylamino Acids, Makromol. Chern. 178, 2159 -2168 (1977)
B. Říhová, M. Jelínková, J. Strohalm, V. Šubr, D. Plocová, O. Hovorka, M. Novák, D. Plundrová, Y. Germano, K. Ulbrich, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules II. Anti-cancer Activity of antibody or (Fab')2-targeted Conjugates and Combined Therapy with Immunomodulators. J. Controlled Rei. 64, 241-261 (2000)
L .W. Seymour, Y. Miyamoto, Η. Maeda, Μ. Brereton, J. Strohalm, K. Ulbrich, R. Duncan, Europ. J. Cancer 31 A, 766 - 770 (1995)
V .Subr, K.Ulbrich, B.Říhová, Reactive polymers and copolymers based on N-(2hydroxypropyljmethacrylamide, a method of their preparation and their use for synthesis of polymer drugs, for modification of biologically active proteins and for gene transport systems, PV 1950/03
V. Subr, C.Koňák, R.Laga, K.Ulbrich, Coating of DNA/poly(L-lysine) complexes by covalent attachment of poly[ N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide], Biomacromolecules 7, 122-130 (2006)
K. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. Controlled Rei. 64, 63-79(2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted PolymerDoxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug Targeting 12(8) (2004) 477489]. (A)
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug Delivery Rev. 56/7, 1025-1052 (2004) (B)
K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhova, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 2931787, CZ 293886
Yokoyama, M.; Okano, T.; Sakurai, Y.; Fukushima, S.; Okamoto, K.; Kataoka, K. J. Drug Targeting 1999, 7, 171-186.
Yoo, H. S.; Lee, E. A.; Park, T. G. J. Controlled Release 2002, 82, 17-27.
Podstata vynálezu
- 6 Podstata polymemího léčiva podle vynálezu spočívá v tom, že je na vodorozpustný polymemí nosič připravený na bázi kopolymeru HPMA navázáno kancerostatikum doxorubicin, připojený kpolymemím řetězcům pomocí spojek (spacerů) obsahujících pH-senzitivní hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby. Tyto spojky mohou být tvořeny jednotlivými aminokyselinami, oligopeptidy a nebo dalšími strukturami dovolujícími jejich zakončení hydrazidovou skupinou. Struktura polymemího léčívaje volena tak, že sestává z hlavního polymemího řetězce tvořeného kopolymerem HPMA nesoucího doxorubicin připojený přes spojku hydrazonovou vazbou, na který jsou roubovány další řetezce HPMA homopolymeru a nebo kopolymeru rovněž nesoucí doxorubicin připojený hydrazonovou vazbou. Výrazným znakem léčiv podle vynálezu je, že polymemí rouby jsou připojeny k hlavnímu řetězci bud’ vazbou v organizmu stálou a nebo vazbami v organizmu štěpitelnými, s výhodou vazbami štěpitelnými v cílové nádorové buňce, jako například enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí a nebo reduktivně štěpitelnou vazbou disulfidovou. Molekulová hmotnost hlavního řetězce je volena pod vylučovací mezí organizmu, s výhodou v rozmezí 10 000 až 50 000 g/mol, molekulové hmotnosti polymemích roubů se pohybují v rozmezí 5 000 až 50 000 g/mol. Enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence obsahují s výhodou oligopeptidové sekvence GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly nebo GlyLeuPheGly, reduktivně štěpitelné vazby obsahující disulfídové struktury různého složení. Molekulová hmotnost polymemích roubů i hlavního řetězce jsou voleny tak, aby jak samostatný hlavní řetězec před vazbou roubů, tak i samostatné rouby byly vylučitelné z organizmu, s výhodou glomerulámí filtrací. Molekulová hmotnost roubovaného polymeru je pak vysoká, převyšující vylučovací limit organizmu a zabezpečující prodlouženou dobu cirkulace a dostatečný EPR efekt a záchyt ve tkáni pevných nádorů. Molekulové hmotnosti nových roubovaných konjugátů doxorubicinu je možné řídit nejen molekulovou hmotností základního polymeru a roubů, ale i poměrem počtu roubů na jeden hlavní řetězec. Molekulová hmotnost takového roubovaného polymeru se pohybuje s výhodou mezi 50 000 až 400 000 g/mol, obsah doxorubicinu jak v hlavním řetězci, tak i v roubech se pohybuje mezi 1 a 25 % hmotn. (0,3 až 8 % mol).
Polymemí léčivo podle vynálezu by mělo být podáváno převážně intravenósně (injekce nebo infuze), může být ale podáno i intratumorálně či intraperitoneálně. Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti, hydrazonová vazba mezi —7 — doxorubicinem a polymerem je relativně stabilní za fyziologických podmínek krevního řečiště (pH 7,4). Po extravasaci a záchytu v pevných nádorech díky EPR efektu dochází k průniku molekulárně rozpuštěného konjugátu do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou a v důsledku poklesu pH z vnějšího pH 7,4 na intracelulámí pH 5 až 6 by mělo dojít k hydrolýze hydrazonové vazby, uvolnění cytostatika v cílové buňce a tedy k aktivaci jeho cytotoxického efektu. V mírně kyselém reduktivním prostředí buňky (literatura uvádí koncentrace glutathionu v cytoplasmě živočišných buněk v rozsahu 1 až 5 mmol) by pak mělo dojít k hydrolýzou řízenému uvolnění léčiva a redukci disulfidových vazeb a rozpadu vysokomolekulámího roubovaného polymeru na původní polymemí fragmenty vylučitelné z organizmu. K podobné degradaci nosiče by mělo dojít i u nosiče obsahujícího rouby připojené enzymaticky štěpitelnými oligopeptidovými sekvencemi. Zde by mělo dojít k degradaci polymemího skeletu účinkem lysosomálních buněčných enzymů. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polymerních léčiv podle vynálezu je doložena experimenty modelového uvolňování doxorubicinu z polymemího nosiče i experimenty degradací polymeru prováděné ve fyziologickém prostředí modelujícím poměry v živočišné buňce. Výsledky těchto testů, včetně testů protinádorové aktivity, jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.
Syntéza a struktury polymerních konjugátů
Syntéza polymerních konjugátů podle vynálezu je prováděna v několika krocích, detailní finální struktura konjugátu významně záleží na zvolené syntetické cestě.
V prvním kroku syntézy jsou syntetizovány základní monomery: HPMA, methakryloylované deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených 4-nitrofenoxy (ONp) nebo thiazolidin-2thionovou (TT) skupinou, methakryloylované deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazidovou (NHNH2) skupinou, případně zakončené hydrazidovou skupinou chráněnou t.butyloxykarbonylovou skupinou (Boc) nebo zakončené hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem a methakryloylované makromonomery připravené methakryloylací HPMA semitelechelického kopolymeru zakončeného primární amino skupinou (NH2).
Ve druhém kroku jsou syntetizovány polymemí prekurzory, tj. náhodné HPMA kopolymery (random copolymers) sloužící jako hlavní řetězec, a semitelechelické polymery s koncovými reaktivními skupinami sloužícími pro roubování hlavního polymemího řetězce.
-8 Hlavní polymerní řetězec nesoucí podél řetězce funkční skupiny, 4-nitrofenoxy, thiazolidin-2thionové, hydrazidové, primární amino, sulfhydrylové (SH) nebo dithiopyridylové (PDS), je možné připravit buď radikálovou kopolymerizací výše uvedených funkčních monomerů s HPMA, nebo polymeranalogickou přeměnou základního kopolymeru nesoucího funkční skupiny.
Základní kopolymer je kopolymer HPMA a methakryloylovaných hydrazidů aminokyselin nebo oligopeptidů, jehož podstatou je, že obsahuje 70 až 98 mol % HPMA a 2 až 30 % mol jednotek s funkčními skupinami. V níže uvedených strukturních schématech jsou zavedeny dvě zkratky pro spojky (spacery) v bočních řetězcích kopolymerů: i) SPi je aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazidech a methakryloyl(aminoacyl)aminech, například glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly; ii) SP2 je složený acyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazidech a methakryloyl(aminoacyl)aminech vycházející z enzymaticky degradovatelné oligopeptidové sekvence obsahující s výhodou oligopeptidové sekvence GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly nebo GlyLeuPheGly.
Kopolymeracemi a nebo polymeranalogickými reakcemi je možné připravit následující náhodné (random) kopolymery o výše uvedeném zastoupení monomemích jednotek:
Kopolymery 1:
Tyto kopolymery nesou podle řetězce reaktivní 4-nitrofenylesterové nebo acylthiazolidin-2thionové skupiny.
Radikálovou kopolymerizací byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 4nitrofenoxy (Kopolymer la) nebo thiazolidin-2-thionovou skupinou (Kopolymer 1b).
-9 ~
Schéma struktury Kopolymeru[la)
Kopolymery 2:
Tyto kopolymery nesou podle řetězce reaktivní hydrazidové nebo primární amino skupiny.
Radikálovou kopolymerizací HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou byl připraven Kopolymer 2a.
Schéma struktury Kopolymeru^a^
Radikálovou kopolymerizací byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným hydrazidovou skupinou. (Kopolymer 2b)
-10 —
Schéma struktury Kopolymeru ÍZb
Polymeranalogickou reakcí s využitím Kopolymeru la a 1b byl připraven Kopolymer 2c. Reakcí 4-nitrofenylesterových (Kopolymer la) nebo acylthiazolidin-2-thionových skupin (Kopolymer lb) s nadbytkem hydrazin hydrátu, ethylendiaminu, butylendiaminu nebo hexametylendiaminu byl připraven náhodný kopolymer nesoucí podle řetězce reaktivní hydrazidové nebo primární amino skupiny.
x - o, 2,4, 6
Schéma struktury Kopolymeru
Kopolymery 3:
Tyto náhodné kopolymery nesou podle řetězce reaktivní dithiopyridylové skupiny.
-11 Po sejmutí chránící skupiny byl polymeranalogickou reakcí kopolymeru 2a s 7V-sukcinimidyl-[3“(2-pyridyldithio)]propionátem (SPDP) (obecně s bifunkčním činidlem s aktivovaným karboxylem a pyridyldisulfídovou skupinou jako např. SPDP, 4-sukcinimidyloxykarbonyl-a-methyl-a-(2- pyridyldithiojtoluen^, V-sukcinimidyl-[4-(2-pyridyldithio)]butyrát, V-(2-sulfosukcinimidyl-[3-(2pyridyldithio)]propionát) připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými 7V-[3-(2-pyridyldithio)propionyl]ethylamidovou skupinou. (Kopolymer 3a)
Schéma struktury Kopolymeru^
Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 2b a 2c s N-sukcinimidyI-[3-(2-pyndyldithio)]propionátem (SPDP) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným N-•[3-(2-pyridyldithio)propionyl]ethylamidovou skupinou. (Kopolymer 3b)
Mít
Schéma struktury Kopolymeru^b)
Polymeranalogickou reakcí kopolymerů la a 1b s 2-(2-pyridyldithio)ethylaminem (PDEA) (obecně s bifunkčním činidlem s primární amino nebo hydrazidovou skupinou a pyridyldisulfídovou skupinou jako např. PDEA, 2-(2-pyridyldithio)ethylhydrazinem, 4-(2-pyridyldithio)butylaminem) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným biodegradovatelným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 2-(2-pyridyldithio)ethylamidovou skupinou. (Kopolymer 3c).
Schéma
Kopolymery 4:
Tyto náhodné kopolymery nesou podle řetězce reaktivní sulfhydrylové skupiny.
Po sejmutí chrámci skupiny byl polymeranalogickou reakcí kopolymeru 2a s 2-imino-thiolanem (ITH) připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými 4-sulfanylbutanimidohydrazidovou skupinou. (Kopolymer 4a)
Schéma struktury Kopolymeru 4a
-14 Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 2b a 2c s 2-imino-thiolanem (ΠΉ) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 4-sulfanylbutanimidamidovou skupinou. (Kopolymer 4b)
Schéma struktury Kopolymerů
Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 3a s dithiothreitolem (DTT) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými 3sulfanylpropanohydrazidovou skupinou (Kopolymer 4c).
Schéma struktury Kopolymerů 4c
-15Polymeranalogickou reakcí kopolymerů 3b a 3c s dithiothreitolem (DTT) byl připraven terpolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovaným oligopeptidem (např. GlyPheLeuGly) zakončeným 3-sulfanylpropanamidovou (Kopolymer 4d) nebo 2sulfanylethylaminovou skupinou (Kopolymer 4e).
(d)
Schéma struktury Kopolymerů 4d, 4e
Semitelechelické kopolymery jsou charakteristické tím, že obsahují 85 až 99 mol % HPMA, 1 až 15 % mol jednotek methakryloylovaných Boc-chráněných hydrazidů aminokyselin nebo oligopeptidů a reaktivní skupinu situovanou u konce polymemího řetězce. Tyto polymery byly připraveny radikálovou kopolymerizací prováděnou v přítomnosti přenašeče řetězce [kyselina sulfanylpropionová (SPK) nebo cysteaminem], za iniciace azoiniciátorem 3,3'-azo-bis(4—kyan^isovalerovou kyselinou) (ABIK) a nebo za iniciace reaktivním azoiniciátorem 3,3'-[4,4'-azobis(4-kyan^-4-methyl-1 -oxo-butan-4,1 -diyl)]bis(thiazolidin-2-thionem) (ABIK-TT).
Kopolymerizacemi a případnými modifikacemi koncových funkčních skupin byly připraveny následující semitelechelické kopolymery jako rouby pro přípravu roubovaných kopolymerů:
Schéma struktury ABIK-TT
Rouby 1:
Do této skupiny polymerů patří semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní Nsukcinimidylesterové nebo acylthiazolidin-2-thionové skupiny.
Radikálovou polymerizací HPMA iniciovanou iniciátorem ABIK-TT byl připraven homopolymer HPMA s koncovou reaktivní acylthiazolidin-2-thionovou skupinou (Roub la).
Schéma struktury Roubí/1 a
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven radikálovou polymerizací HPMA prováděnou v přítomnosti přenašeče SPK. Kopolymer je zakončen IV-sukcinimidylesterovou skupinou. (Roub 1b).
-\Ί —
Schéma struktury Roubuílb
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a končící acylthiazolidin-2-thionovou skupinou byl připraven radikálovou kopolymerizací odpovídajících monomerů za iniciace ABIK-TT. Kopolymer končící JV-sukcinimidylesterovou skupinou byl připraven obdobným způsobem za iniciace ABIK a následnou aktivací koncové karboxylové skupiny JV-hydroxysukcinimidem (Roub 1c).
Schéma struktury Roubu(lc^)
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a končící jV-sukcinimidylovým esterem
-18 biodegradovatelného oligopeptidu (např.GlyPhe LeuGly-OSu) obecně SP2 (Roub ld) byl připraven radikálovou kopolymerizací HPMA s příslušnými monomery iniciovanou ABIK a následnou aktivací koncové karboxylové skupiny N-hydroxysukcinimidem.
Schéma struktury Roubu ld
Rouby 2:
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní hydrazidové nebo primární amino skupiny.
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven radikálovou kopolymerizací prováděnou v přítomnosti cysteaminu. Tento kopolymer končí primární aminoskupinou. (Roub 2a)
Schéma struktury Roubu (la^
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou končící primární aminoskupinou byl připraven reakcí koncových aktivovaných karboxylů Roubů lb a 1c s nadbytkem hydrazin hydrátu, ethylendiaminu, butylendiaminu nebo hexametylendiaminu (Roub 2b).
Schéma struktury Roubu(2b ch3
Rouby 3:
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní dithiopyridylové skupiny.
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou zakončený 2-(2-pyridyldithio)ethylamidovou skupinou byl připraven reakcí koncových reaktivních skupin roubů lb a 1c s PDEA (Roub 3a).
Schéma struktury Roubu(3a
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou zakončený A-[3-(2-pyridyldithio)propionyl]amidovou skupinou byl připraven reakcí koncových reaktivních skupin roubů 2a a 2b s SPDP (Roub 3b).
Rouby 4:
Tyto semitelechelické kopolymery obsahují koncové reaktivní sulfhydrylové skupiny.
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven reakcí roubů 2a a 2b s ITH. Polymemí řetězec tohoto kopolymeru končí 4-sulfanylbutanimidamidovou skupinou nebo 4sulfanylbutanimidohydrazidovou skupinou (Roub 4a)
Schéma struktury Roubu kaj
Kopolymer HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou byl připraven reakcí roubů 3a a 3b s DTT. Řetězec tohoto kopolymeru končí 3-sulfanylpropanohydrazidovou, 3-sulfanylpropanamidovou skupinou nebo 2sulfanylethylaminovou skupinou (Roub 4b)
Schéma struktury RoubuMb
-22 Polymerní nosič a polymerní konjugát. Polymemí nosič je roubovaný vysokomolekulámí polymer bez navázaného léčiva, připravený roubovací reakcí semitelechelického kopolymeru na základní kopolymer, jak je ukázáno v příkladové části. K reakcím se ve většině případů používají výše uvedené kopolymery, jejichž hydrazidová skupina je chráněna Boc skupincn (t.-butyloxykarbonyl). V poslední fázi syntézy konjugátů je sejmuta chránící skupina z hydrazidové skupiny a na konjugát je navázán doxorubicin hydrazonovou vazbou reakcí v methanolu za katalýzy kyselinou octovou. Finální polymemí léčivo (konjugát) je čištěno přesrážením a případně kolonovou chromatografií, jak je uvedeno v příkladové části.
Předmětem patentu jsou polymemí konjugáty doxorubicinu, jejichž detailní struktury jsou uvedeny v obrazové části a jejichž syntéza je popsána v příkladové části.
Vzhledem k typu reagujících skupin u základních polymerů a semitelechelických roubů jsou dále polymemí konjugáty rozděleny do 5 základních skupin. Byly připraveny následující konjugáty:
Konjugáty 1
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány nedegradovatelnou vazbou. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce hydrazidové nebo primární aminoskupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými V-sukcinimidylesterovými nebo acylthiazolidin-2-thionovými skupinami.
Konjugát la byl připraven reakcí hydrazidových skupin Kopolymeru 2a s acylthiazolidin-2-thionovými skupinami Roubu la, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
- 23 —
Schéma struktury Konjugátu|la|(n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 -10, r = 34 - 350).
Konjugát 1b byl připraven reakcí hydrazidových skupin Kopolymeru 2a s thiazolidin-2-thionovými nebo V-sukcinimidylovými skupinami Roubu lb nebo 1c, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Konjugát 1c byl připraven reakcí hydrazidových skupin Kopolymeru 2a s N-sukcinimidylesterovými skupinami Roubu ld, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
Konjugát Id byl připraven reakcí hydrazidových nebo primárních amino skupin Kopolymerů 2b nebo 2c s acylthiazolidin-2-thionovými nebo A-sukcinimidylesterovými skupinami Roubu lb nebo lc , odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu(l<^ (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
-26 Konjugáty 2
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce reaktivní 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionové skupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými hydrazidovými nebo primárními amino skupinami.
Konjugát 2 byl připraven reakcí acylthiazolidin-2-thionových nebo 4-nitrofenylesterových skupin Kopolymeru la nebo 1b s hydrazidovými nebo primárními amino skupinami Roubu 2a nebo 2b , odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu(2) (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0-50, t = l20).
Konjugáty 3
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - disulfidovými můstky reduktivně štěpitelnými v cytoplasmě cílových buněk. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce reaktivní dithiopyridylové skupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými sulfhydrylovými skupinami.
-27 — neo
Konjugát 3a byl připraven reakcí dithiopyridylových skupin Kopolymeru 3a nebo 3b s sulfhydrylovými skupinami Roubu 4a nebo 4b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
x = o, 2, 4, 6 y = 0, 2, 4, 6
Schéma struktury Konjugátu^ (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0-50, t = 1 20).
Konjugát 3b byl připraven reakcí dithiopyridylových skupin Kopolymeru 3c s sulfhydrylovými skupinami Roubu 4a nebo 4b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu[3bj(n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0-50, t = 1 20).
Konjugáty 4
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - disulfidovými můstky reduktivně štěpitelnými v cytoplasmě cílových buněk. Pro přípravu těchto polymemích konjugátů byly použity kopolymery nesoucí podél hlavního řetězce sulfhydrylové skupiny a semitelechelické kopolymery s koncovými reaktivní dithiopyridylovými skupinami.
Konjugát 4a byl připraven reakcí sulfhydrylových skupin Kopolymeru 4a nebo 4b s dithiopyridylovými skupinami Roubu 3a nebo 3b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
x - 0,2,4,6 y « O, 2, 4, 6
Schéma struktury Konjugátu(4d (n = 40 - 335, m = O - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = O - 50, t = 1 20).
Konjugát 4b byl připraven reakcí sulfhydrylových skupin Kopolymeru 4c nebo 4d s dithiopyridylovými skupinami Roubu 3a nebo 3b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
- 30 —·
Schéma struktury Konjugátu (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20).
Konjugát 4c byl připraven reakcí sulfhydrylových skupin Kopolymerů 4e s dithiopyridylovými skupinami Roubu 3 a nebo 3b, odchráněním hydrazidových skupin a následnou vazbou DOX na polymer.
Schéma struktury Konjugátu (4c) (n = 40 - 335, m = 0 - 85, p = 1 - 20, q = 1 - 10, r = 34 - 350, s = 0 - 50, t = 1 20). '
-31 —
Konjugáty 5
Tyto konjugáty nesou DOX vázaný na polymer hydrazonovou vazbou, rouby jsou k hlavnímu řetězci vázány biodegradovatelnou vazbou - enzymaticky štěpitelnou oligopeptidovou sekvencí a byly připraveny radikálovou terpolymerizací HPMA s methakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými Boc-chráněnou hydrazidovou skupinou a methakryloylovanými makromonomery připravenými methakryloylací HPMA semitelechelického kopolymeru zakončeného primární aminoskupinou (Makromonomery, Obr. 32). Makromomery byly připraveny reakcí hydrazidových nebo primárních aminoskupin Roubů 2a a 2b s methakryloylovanými deriváty biodegradovaných oligopeptidů zakončených 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionovou skupinou.
Schéma struktury Makromonomerů (r = 34 - 350, s = 1 - 70).
x = 0,2,4,6
Schéma struktury Konjusátu^(„ - 40 - 335, m - 0 - 85, p -1.20, q -1 -10, r - 34 - 350,, - O - 50, t -1 - 20).
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje graf rychlosti uvolňování DOX z roubovaných polymemích konjugátů a lineárního polymemího konjugátu v pufru o pH 5 (model intracelulámího prostředí).
Obr. 2 znázorňuje graf rychlosti uvolňování DOX z roubovaných polymemích konjugátů a lineárního polymemího konjugátu v pufru o pH 7,4 (model krevního řečiště).
Obr. 3 znázorňuje závislost molekulové hmotnosti roubovaných polymemích konjugátů na čase pn degradaci těchto konjugátů - A) degradace Konjugátu Id pomocí lysosomálního enzymu kathepsinu B [c(kathepsin B) = 5.10’7 mol/1]; B) degradace Konjugátu 3a pomocí glutathionu [c(glutathion) = 3.10'3 mol/1].
Obr. 4 znázorňuje graf přežívání B/6 myší s inokulovaným myším lymfomem EL 4 léčených roubovanými konjugáty DOX po i.v. podání jedné dávky 15 mg/kg ekvivalentu DOX v terapeutickém režimu podání léčiva.
««CL
Příklady provedení syntézy meziproduktů a konjugátů podle vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů a iniciátoru ABIK-TT
3>3 *[4,4'-Azobis(4-kyan^-4-methyl-l-oxo-butan-4,l-diyl)]bis(thiazolidin-2-thion) (ABIK-TT) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Šubr 2006]
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000], Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatografícky čistý.
6-(Methakryloylamino)hexanoyl-2V'-(tórz.-butyloxykarbonyl)hydrazin (MA-AH-NHNH-Boc) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich 2004a]
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin (Ai'-fb-hydrazino-e-oxohexyl^-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent], MA-GFLG-TT nebo MA-GFLG-ONp
4-Nitrofenyl ester ÍV-methakryloylglycyl-DL-fenylalanylleucylglycinu (MA-GFLG-ONp) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Rejmanová 1977]
Thiazolidin-2-thion 7V-methakryloylglycyl-DL-fenylalanylleucylglycinu (MA-GFLG-TT) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Šubr patent]
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin-Doxorubicin (MA-AH-NHN=DOX)
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazin (40 mg, 0,188 mmol) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 6 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakění nádobky, ve které byl umístěn Doxorubicin.HCI (115 mg, 0,198 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo pndano 310 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin při teplotě místnosti. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanoltchlorofomrtkyselina octová 2:8:1, RflPOX)- 0,75, RI(MA-AH-NHN=DOX)= 0,9). Poté bylo do homogenní reakční směsi přidáno 100 mg kopolymeru 1 (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymemích a mzkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Filtrát byl zahuštěn na 2 ml a produkt vysrážen do 30 ml
-34 diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 110 mg produktu (79 %) s teplotou tání 172 až 175 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,9. MALDI-TOF MS: 762 (M+Na).
Methakryloylovaný makromonomer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GLFG-MA byl připraven reakcí koncových hydrazidových nebo primárních amino skupin semitelechelických kopolymeru (Roubů 2a a 2b) s 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionovými skupinami methakryloylovaných derivátů biodegradovaných oligopeptidů.
200 mg kopolymeru Roub 2a (0,0125 mmol NH2 skupin) bylo rozpuštěno v 2 ml methanolu a za rychlého míchám při teplotě místnosti byl přidán roztok 7,7 mg MA-GFLG-TT (0,0137 mol, 110% vzhledem kNH2 skupinám) 1 ml methanolu. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 6 ml methanolem a methakrylovaný makromonomer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemi frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 3 ml a makromonomer byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 2: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 1b - kopolymeru HPMA s MAGFLG-TT
Kopolymer Poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-TT) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA, MA-AH-NHNH-Boc a MA-GFLG-TT v DMSO při 60 °C. 465 mg (3,25 mmol) HPMA, 44,5 mg (0,14 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 100 mg (0,18 mmol) MA-GFLG-TT (12,5 hS% monomerů) a 98,3 mg (0,60 mmol) ABIN bylo rozpuštěno v 3,8 ml DMSO. Ampule s roztokem polymerizační směsi byla 10 min probublávána dusíkem, pote zatavena a na 6 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 60 °C. Následně byla reakční směs vysrážena do 80 ml směsi aceton : diethylether 3:1a zcentrifugována. Polymer byl přesrážen z methanolu do stejné směsi, zfíltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
-35 Příklad 3: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 2a - kopolymeru HPMA s MAAH-NHNHj
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH.NHNH2) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizaci HPMA a MA-AH-NHNH, v methanolu při 60 °C podle dříve popsaného postupu [Etrych patent].
Příklad 4: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 2c - kopolymeru poly(HPMA-coMA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2)
Kopolymer poly(HPMA.co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG- TT) s nadbytkem ethylendiaminu (EDA).
410 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-TT) (0,10 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml methanolu. Do intenzivně míchaného nažloutlého roztoku bylo přidáno 70 μΐ EDA (1,05 mmol). Po 30 min byl odbarvený roztok vysrážen do 120 ml směsi aceton : diethylether 3:1, přesrážen z methanolu do stejné směsi a zfiltrován. Polymer byl usušen do konstantní hmotnosti.
Přiklad 5: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 3a - kopolymeru poly(HPMA-co— MA-AH-NHNH2-C0-MA-AH-PDS)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) s bifunkíním Činidlem SPDP.
400 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (0,17 mmol NHNH2 skupin) bylo rozpuštěno v 7 ml methanolu a do intenzivně míchaného roztoku byl přidán roztok 30 mg SPDP (0,094 mmol) v 1 ml methanolu. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 8 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 100 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti
-36 Přiklad 6: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 3c - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-PDS)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-PDS) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-TT) s bifunkčním činidlem PDEA.
mg PDEA.HC1 (0,089 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml DMSO a za intenzivního míchání bylo přidáno 14,5 μΐ diisopropylethylaminu (0,089 mmol). Po 5 min byl do tohoto roztoku přidán za intenzivního míchání při teplotě místnosti roztok 300 mg polymeru poly(HPMA-co- MA-AHNHNH-Boc-co-MA-AH-TT) (0,073 mmol TT skupin) ve 4 ml DMSO. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 6 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 80 ml směsi aceton : diethylether 1:3. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 7: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 4b - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-SH)
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-SH) byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG- — NH2) s ITH ve fosfátovém pufru.
350 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) (0,11 mmoÍNH2 skupin) bylo rozpuštěno v 7 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufr s 0,1 M NaCl, pH 7,4). 80 mg ITH (0,58 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymeru. Po 30 min byla reakční směs naředěna na 20 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT2.
Příklad 8: Syntéza polymerního prekurzoru -Kopolymeru 4c - kopolymeru poly(HPMA-co- — MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-SH)
-37 —
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2^o-MA-AH-SH) byl připraven redukci PDS skupin kopolymeru Poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) pomocí DTT v destilované vodě.
300 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) (0,075 mmol PDS skupin) bylo rozpuštěno v 5 ml destilované vody. 40 mg DTT (0,26 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymeru. Po 20 min byla reakční směs naředěna na 15 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofílizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT-2
Přiklad 9: Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru -Roubu 1b - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc vDMSO při 60 °C za iniciace iniciátorem ABIK-TT.
367 mg (2,57 mmol) HPMA, 70 mg (0,224 mmol) MA-AH-NHNH-Boc (14 hm% monomerů) bylo rozpuštěno v 2,7 ml DMSO a tento roztok byl umístěn do polymetaěni ampule, ve které bylo již naváženo 140 mg (0,290 mmol) ABIK-TT (4 hm%). Roztok v ampuli byl 15 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a umístěna do termostatu vyhřívaného na 6$C. K rozpuštění iniciátoru došlo po 3 min při teplotě 6(fc. Po 6 h byla reakění směs vysrážena do 80 ml směsi aceton : diethylether 2:1. Kopolymer byl rozpuštěn ve 4 ml methanolu a opět vysrážen do 60 ml stejné srážecí směsi. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 10: Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru -Roubu 1c - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu
Semitelechehcký kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc vethanolu při 50 °C za iniciace iniciátoru ABIK a následnou aktivací koncových karboxylových skupin na Nsukcinimidylový ester.
-38 3,33 g (23,2 mmol) HPMA, 674 mg ( 2,16 mmol) MA-AH-NHNH-Boc (12 hm% monomerů) a 600 mg (2,14 mmol) ABIK (1,8 hm%) bylo rozpuštěno v 35 ml ethanolu. Roztok byl umístěn do polymerizační ampule a 15 min probubláván dusíkem. Následně byla ampule zatavena a umístěna do termostatu vyhřívaného na 50 °C. Po 21 h byla reakční směs vysrážena do 700 ml acetonu a zcentrifugována. Kopolymer byl přesrážen z methanolu do stejného srážedla, zfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. V druhém kroku bylo 400 mg polymeru (0,027 mmol COOH) rozpuštěno v 1,75 ml DMF. 27,5 mg dicyklohexylcarbodiimidu (DCC) (0,133 mmol) a 15,4 mg A-hydroxysukcinimidu (0,133 mmol) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMF a přidáno k míchanému a na 4 °C chlazenému (směsí voda - led) roztoku kopolymeru. Reakční směs byla michana 1,5 h při 4 °C a 2 h při teplotě místnosti. Polymer byl vysrážen do 50 ml acetonu a odfiltrován na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C.
Příklad 11: Syntéza semitelechelického polymemího prekurzoru (syntéza s přenosem SPK) -Roubu 1c - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu byl připraven srážecí radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v acetonu při 50 °C v přítomnosti iniciátoru ABIN a přenosového činidla SPK. Koncové karboxylové skupiny byly v druhém kroku převedeny reakcí s DCC a A-hydroxysukcinimidem na A-sukcinimidylový ester.
438 mg (3,07 mmol) HPMA, 76 mg (0,36 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 4,6 mg (0,028 mmol) ABIN a 6 mg (0,057 mmol) SPK bylo rozpuštěno v 3,86 ml acetonu a roztok byl umístěn do polymerizační ampule. Roztok v ampuli byl 10 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a na 19 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 50 °C. Vyloučený polymer byl odfiltrován, rozpuštěn v 2 ml methanolu a frakcionován na koloně naplněné Sephadexem LH-60 při použití methanolu jako eluentu. Po oddělení oligomemí frakce byl roztok polymeru vakuově zahuštěn a vysrážen do lOnásobného přebytku směsi acetonu s diethyletherem (1:1). Polymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. V druhém kroku bylo 340 mg polymeru (0,028 mmol COOH) rozpuštěno v 1,6 ml DMF. 28,5 mg dicyklohexylcarbodiimidu (DCC) (0,138 mmol) a 15,9 mg A-hydroxysukcinimidu (0,138 mmol) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMF a přidáno k míchanému a na 4°C chlazenému roztoku kopolymeru. Reakční směs byla míchána 3,5 h při 4
-39 °C a 3 h při teplotě místnosti. Polymer byl izolován srážením do 50 ml acetonu a filtrací na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C.
Příklad 12: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru -Roubu Id - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GFLG-OSu
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GFLG-OSu byl připraven dvojkrokovou syntézou. V prvním kroku reagoval N-sukcinimidylový ester kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu s amino skupinou oligopeptidu GFLG. Koncové karboxylové skupiny připraveného kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GFLGCOOH byly v druhém kroku převedeny reakcí sDCC a V-hydroxysukcinimidem na Nsukcinimidylový ester.
300 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-OSu (0,025 mmol OSu skupin) bylo rozpuštěno v 2 ml DMF a k tomuto roztoku byl přidán roztok 14 mg oligopeptidu GFLG (0,036 mmol) v 0,2 ml DMF. Reakční směs byla míchána 3,5 h při teplotě místnosti. Polymer byl izolován srážením do 40 ml acetonu a filtrací na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C. V druhém kroku bylo 320 mg polymeru (0,027 mmol COOH) rozpuštěno v 1,6 ml DMF. 28,5 mg dicyklohexylcarbodiimidu (DCC) (0,138 mmol) a 15,9 mg V-hydroxysukcinimidu (0,138 mmol) bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMF a přidáno k míchanému a na f C chlazenému roztoku kopolymeru. Reakční směs byla míchána 4 h při 4 °C a 3 h při teplotě místnosti. Polymer byl izolován srážením do 50 ml acetonu a filtrací na fritě S4. Po usušení do konstantní hmotnosti byl vzorek skladován pod argonem při -18 °C.
Příklad 13: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru (syntéza s přenosem cysteaminem) -Roubu 2a - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHNH-Boc v metanolu při 50 °C v přítomnosti iniciátoru ABIN a přenosového činidla cysteaminu.
385 mg (2,69 mmol) HPMA, 76 mg (0,36 mmol) MA-AH-NHNH-Boc, 1,55 mg (0,0095 mmol) ABIN a 2,8 mg (0,036 mmol) cysteaminu bylo rozpuštěno v 4 ml methanolu a roztok byl umístěn do polymerizační ampule. Roztok vampuli byl 10 min probubláván dusíkem, ampule byla zatavena a na 24 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 50 °C. Polymer byl izolován
-40vysráženém do 60 ml směsi aceton : diethylether 2:1. Kopolymer byl odfiltrován na fritě S4 a přesrážen z methanolu (3 ml) do 40 ml stejné srážecí směsi. Polymer byl odfiltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 14: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru-Roubu 2b - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT s ethylendiaminem v methanolu.
450 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT (0,041 mmol TT skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml methanolu. Do intenzivně míchaného nažloutlého roztoku bylo přidáno 30 μΐ EDA (0,45 mmol). Po 30 min byl odbarvený roztok vysrážen do 120 ml směsi aceton : di ethylether 3:1, přesrážen z methanolu do stejné směsi a zfiltrován. Polymer byl usušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 15: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 3a - kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT s bifunkčmm činidlem PDEA v DMSO.
mg PDEA.HC1 (0,045 mmol) bylo rozpuštěno v 0,5 ml DMSO a za intenzivního míchání bylo přidáno 7,3 μΐ diisopropylethylaminu (0,045 mmol). Po 5 min byl do tohoto roztoku přidán za intenzivního míchání při teplotě místnosti roztok 400 mg polymeru poly(HPMA-co- MA-AHNHNH-Boc)-TT (0,036 mmol TT skupin) v 5 ml DMSO. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu (RI detekce). Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 6 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 80 ml směsi aceton : diethylether 3:1. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
-41 —
Příklad 16: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 3b - kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 s bifunkčním činidlem SPDP v methanolu.
300 mg polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 (0,025 mmol NHNH2 skupin) bylo rozpuštěno v 4 ml methanolu a do intenzivně míchaného roztoku byl přidán roztok 11 mg SPDP (0,035 mmol) v 1 ml. Po 2 h byla reakční směs naředěna na 15 ml methanolem a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 8 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 100 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Příklad 17: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 4a - kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH byl připraven polymeranalogickou reakcí kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 sITH ve fosfátovém pufru.
250 mg kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NH2 (0,021 mmol NH2 skupin) bylo rozpuštěno v 5 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufr s 0,1 M NaCl, pH 7,4). 16 mg ΙΊΉ (0,116 mmol) bylo rozpuštěno v 0,5 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymerů. Po 25 min byla reakční směs naředěna na 15 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofilizačním přístroji Lyovac GT-2.
Přiklad 18: Syntéza semitelechelického polymerního prekurzoru - Roubu 4b - kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH
Semitelechelický kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH byl připraven redukcí PDS skupin kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS pomocí DTT v destilované vodě.
-42300 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2)-PDS (0,022 mmol PDS skupin) bylo rozpuštěno v 5 ml destilované vody. 20 mg DTT (0,13 mmol) bylo rozpuštěno v 1 ml destilované vody a tento roztok byl za intenzivního míchání při teplotě místnosti přidán do roztoku kopolymeru. Po 20 min byla reakční směs naředěna na 15 ml destilovanou vodou a kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadex G25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofílizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT-2.
Příklad 19: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát ld - kopolymeru poly(HPMA-co' MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG-NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co' MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLGNH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí amino skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) s TT skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
180 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-TT (0,015 mmol TT) bylo rozpuštěno ve 3 ml DMSO a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 70 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-NH2) (0,017 mmol NH2) ve 2 ml DMSO. Po 2,5 h reakce při teplotě místnosti byl roztok vysrážen do 50 ml směsi ethylacetát: diethylether 3:1a odfiltrován na fritě S4. Roubovaný kopolymer byl rozpuštěn ve 4 ml methanolu, vysrážen opět do směsi ethylacetát: diethylether, zfiltrován a vysušen do konstantní hmotnosti. Při odstranění chránících Boc skupin bylo 220 mg roubovaného kopolymeru rozpuštěno ve 6 ml směsi TFA : triisopropylsilan : voda 95 : 2,5 : 2,5. Po 15 minutách byla směs opakovaně odpařována s methanolem (v pětinásobném přebytku) na vakuové odparce za vakua vodní vývěvy, dokud se nevyloučily po odpaření krystalky. Produkt byl rozpuštěn ve vodě a pH vodného roztoku bylo zvýšeno na pH = 7 - 8. Kopolymer byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí gelovou chromatografíí na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofílizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT-2. Při vazbě DOX na roubovaný kopolymer bylo 200 mg kopolymeru rozpuštěno ve 2 ml methanolu a tento roztok byl nalit do termostatované
-43 — cely, ve které bylo umístěno 20 mg DOX.HC1 (0,034 mmol). Nehomogenní suspenze byla michana v temnu při 25 °C a po 1 minutě bylo přidáno 100 μΐ kyseliny octové. V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 23 h reakce byl z homogenního roztoku polymemí produkt vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí a nenavázaného léčiva gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 vmethanolu. Polymemí frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 3 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 30 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Přiklad 20: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 2 - kopolymerů poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG-NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLGNH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí ONp skupin kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-GFLG-ONp) s hydrazidovými skupinami kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NHNH2, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
250 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-NHNH2 (0,019 mmol TT) bylo rozpuštěno ve 4 ml DMSO a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 90 mg poly(HPMA-co-MA-AH- NHNH-Boc-co-MA-GFLG-ONp) (0,021 mmol NH2) ve 2,5 ml DMSO. Po 3 h reakce při teplotě místnosti byl roztok vysrážen do 50 ml směsi aceton : diethylether 3:1a odfiltrován na fritě S4. Roubovaný kopolymer byl rozpuštěn v 5 ml methanolu, vysrážen opět do směsi ethylacetát : diethylether, zfíltrován a vysušen do konstantní hmotnosti. Odstranění chránících Boc skupin a navazam léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Příklad 21: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 3a - kopolymerů poly(HPMA-coMA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)-graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MAAH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] ca· c
-44 Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí PDS skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) s sulfhydrylovými skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
330 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-SH (0,021 mmol SH skupin) bylo rozpuštěno v 7 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufr s 0,1 M NaCl, 0,01 M ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pH 7,4) a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 108 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-PDS) (0,025 mmol PDS skupin) ve 2,5 ml téhož pufru. Po 3 h reakce při teplotě místnosti byl roubovaný kopolymer vyčištěn od mzkomolekulamich příměsí gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofílizačním přístroji Lyovac GT-2. Odstranění chránících Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Přiklad 22: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 3a - kopolymeru poly(HPMA-co- MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)-graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-AH-SS-)graft-[(SS)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven reakcí SH skupin kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-SH) sPDS skupinami kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS, následným odchráněním hydrazidových skupin pomocí triflouroctové kyseliny (TFA) a navázáním DOX v metanolu za katalýzy kyseliny octové.
280 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-PDS (0,019 mmol PDS skupin) bylo rozpuštěno v 6 ml fosfátového pufru (0,05 M fosfátový pufr s 0,1 M NaCl, 0,01 M ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), pH 7,4) a přidáno při teplotě místnosti k míchanému roztoku 95 mg poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc-co-MA-AH-SH) (0,024 mmol SH skupin) ve 2,5 ml téhož pufru. Po 3 h reakce při teplotě místnosti byl roubovaný kopolymer vyčištěn od mzkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně naplněné Sephadex G-25 v destilované vodě za RI detekce. Polymemí frakce byla zachycena a zlyofilizována na lyofíhzačmm přístroji Lyovac GT-2. Odstranění chránících Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Příklad 23: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugát 5 - kopolymeru poly(HPMA-co-MA- AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG-NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA_ AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)]
Polymemí konjugát poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-co-MA-AH-NHN=DOX-co-MA-GFLG- NH-)-graft-[(GFLG)-poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA, MA-AH-NHNH2 a poly(HPMA-co-MA-AH_NHNH-Boc)-GLFG-MA v methanolu při 60 °C.
465 mg (3,25 mmol) HPMA, 44,5 mg (0,20 mmol) MA-AH-NHNH2, 950 mg (0,076 mmol) poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH-Boc)-GLFG-MA a 98,3 mg (0,60 mmol) ABIN bylo rozpuštěno v 9 ml methanolu. Ampule s roztokem polymerizační směsi byla 10 min probublávána dusíkem, poté zatavena a na 24 h umístěna do termostatu vyhřívaného na 60 °C. Následně byla reakční směs vysrážena do 100 ml směsi aceton : diethylether 3:1a zcentrifugována. Polymer byl presrazen z methanolu do stejné směsi, zfíltrován na fritě S4 a sušen do konstantní hmotnosti. Odstranění chrámcích Boc skupin a navázání léčiva na roubovaný kopolymer bylo provedeno obdobným způsobem jako v příkladu 19.
Příklad 24: Uvolňování doxorubicinu z roubovaných polymerních konjugátů
Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z roubovaných polymerních konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaného DOX v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu). V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 μΐ inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSKGel G 3000x1, izokratický průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanohoctanový pufr pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství DOX bylo vypočteno z ploch píků volného a vázaného DOX (UV-VIS detekce při 488 nm). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 36 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 8 %/24 hod) (Obr.33); naopak rychlost uvolňování DOX —46 — z roubovaných polymemích konjugátů, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva, je v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 (Obr. 35) značná. Rychlosti uvolňování léčiva vpH 7,4 a pH 5 z roubovaných polymemích konjugátů jsou plně srovnatelné s rychlostmi uvolňování léčiva zjištěných u hydrazonových konjugátů připravených pouze z lineárních kopolymerů [Etrych patent].
Příklad 25: Degradace roubovaných polymerních konjugátů pomocí glutathionu nebo cathepsinu B na degradační produkty vylučitelné z organizmu
Degradační experimenty byly provedeny ve fosfátovém pufru (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl, pH 6) v přítomnosti katepsinu B nebo glutathionu jako degradačních činidel, tj. v prostředí modelujícím prostředí buňky (cytoplasma, endosom a sekundární lysosom). Roubované polymemí konjugáty byly rozpuštěny ve fosfátovém pufru v koncentraci 50 mg/ml a těsně před umístěním těchto roztoků do termostatu (teplota 3^C) byl do těchto roztoků přidán zásobní roztok katepsinu B nebo glutathionu, tak aby výsledná koncentrace těchto činidel byla pro kathepsin B 5.10’7 mol/1 a pro glutathion 3.1Ο'3 mol/1 vinkubačním médiu. V předem určených intervalech byly z inkubačních roztoků odebírány alikvoty (200 μΐ), které byly odsoleny na kolonách PD-10 a zlyofilizovány. Molekulová hmotnost degradačních produktů byla změřena na kapalinovém chromatografu Shimadzu SIL-HT doplněném diferenciálním refraktometrem (Shimadzu RID-10A) a mnohoúhlovým detektorem rozptylu světla (DAWN EOS, Wyatt Technology, USA). Analýza byla prováděna na koloně Superose™6 (300 x 10 mm) (Amersham Bioscience). Jako mobilní fáze byl použit 0,3 M octanový pufr (CH3COONa/CH3COOH; pH = 6,5; 0,5 g/1 NaN3) o průtoku 0,5 ml/min. Molekulová hmotnost a polydisperzita kopolymerů byla vypočtena pomocí Astra software (Wyatt Technology, USA).
Konjugáty obsahující enzymaticky degradovatelné sekvence GlyPheLeuGly (Konjugát Id) byly degradovaný během 24h katepsinem B na degradační produkty s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace (Obr.37). V roztoku obsahujícím koncentraci glutathionu (3.10'3 mol/1) jsme zjistili rychlou degradaci roubovaných konjugátů obsahujících disulfidické můstky. Tyto roubované konjugáty byly po 24h degradovány na polymemí degradační produkty s molekulovou hmotností pod limitem renální filtrace (~ 25000 g/mol).
Příklad 26. Ukázka in vitro biologické aktivity roubovaných konjugátů doxorubicinu při inkubaci s buňkami různých nádorových linií.
Tabulka 1: Cytotoxicity roubovaných polymerů, srovnání s Hydrazonem
Vzorek č.: Struktura: EL4 38C13 SW620 ConA 3T3 Ráji Jurkat
B-578 P- Acap-Dox (Hydrazon) <0,016 0,342 0.035 0,004 <0,016 0,034 0,09 0,019 <0,016 0,258
B-624 P -AK-NH- N=Dox \ GFLG-OH 0( 152 0,290 0)0094 0(0008 0,900* 0,040 0,051 0,213 0.045 1 0,04 0,003 0,0107 0,835* 0.461 1
B-599 P-AK-HN- N=Dox \ gr-GFLG-PNHN=Dox 0,557 <0,016
B-613 P -AK-NH- N=Dox \ gr-S-S-P-AKNH-N=Dox 0,017 0,01 0,019 0,098
— Dox 0,015 0,007 0,0005 0,0002 0,003 0,029 0,008 0,009 0,003 0.0005 4 0.0014 1 0t119* 0tl 19
Oba typy roubovaných konjugátů Dox (s enzymaticky štěpitelnou vazbou i reduktivně štěpitelnou vazbou připojenými rouby) byly in vitro testovány na škále nádorových linií jak myšího (EL 4; 38C13; 3T3; BCL1) tak lidského původu (SW 620). Bylo zjištěno, že hodnota IC50 konjugátů je u všech hnu 5 - 10 x nižší než je IC50 pro volný nemodifikovaný doxorubicin. Všechny testované hrne jsou na konjugáty velmi citlivé, závisí ale na jejich původu. Nejcitlivější je linie myšího B buněčného lymfomu 38C13. Méně citlivá je linie lidského kolorektálního karcinomu a myšího fibrosarkomu, následuje linie myší B leukémie. Nejméně citlivý je myší T buněčný lymfom.
-48 —
Příklad 27. Ukázka in vivo biologické aktivity roubovaných konjugátů doxorubicinu u myší inokulovaných T buněčným lymfomem EL4
Pro in vivo pokusy byl použit model myšího T buněčného lymfomu EL 4, experimentální zvířata byly myši (samci) kmene B/6, kterým bylo v den 0 subkutánně implantováno 105 nádorových buněk. Konjugáty byly podány intravenózně 1x15 mg/kg DOX ekvivalentu. Jednorázové podání se uskutečnilo devátý den po transplantaci nádorových buněk, tj. v době, kdy byl nádor hmatatelný a o velikosti cca 400 mm3. Všechny experimentální skupiny vykázaly již třetí den po první aplikaci významně zpomalený růst nádorů při srovnání s kontrolami. Oba roubované konjugáty (Konjugát ld a Konjugát 3a) vykázaly velmi výrazný protinádorový efekt. V obou případech došlo k potlačení růstu nádoru a u většiny pokusných zvířat dokonce k vymizení nádoru. Po aplikaci Konjugátu 3a (SS můstek) přežívalo 100 % myší 70. den po podání nádorových buněk, což byl konec experimentu. V případě podání Konjugátu ld přežilo 88 % laboratorních zvířat rovněž 70. den, kdy byl experiment ukončen. U obou experimentálních skupin léčených vzorky roubovaných konjugátů byl zřetelný významný ústup nádoru po podání zmíněných konjugátů, úbytek váhy jako znak toxicity, nebyl pozorován. U kontrolní léčby lineárním rozpustným konjugátem bylo vyléčeno pět myší z osmi. U kontrol došlo k úhynu všech zvířat, nejkratší interval přežití je 28 dní a nejdelší 35 dní. Příklady výsledky in vivo testů jsou demonstrovány na obr. 4 a v tabulce 1 (LTS - long term survivors, dlouhodobě přežívající).
—
Konjugát 1d Konjugát 3a Lineární konjugát Kontroly
39 LTS 41 28
LTS LTS 41 29
LTS LTS 49 29
LTS LTS LTS 29
LTS LTS LTS 29
LTS LTS LTS 32
LTS LTS LTS 34
LTS LTS LTS 35
Tabulka 1. Přežívání B/6 myší s inokulovaným myším lymfomem EL 4 (den 0, 105 buněk, s.c.) léčených roubovanými konjugáty DOX po i.v. podání jedné dávky 15 mg/kg ekvivalentu DOX v terapeutickém režimu podání léčiva (den 9). Lineární konjugát je kontrolní „klasický“ rozpustný neroubovaný konjugát. Dny znamenají jednotlivé dny uhynu zvířat, LTS přežívající zvířata byla bez hmatatelného nádoru.

Claims (25)

1. Polymerní léčivo, v němž je na vodorozpustný polymerní nosič připravený na bázi kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu navázáno kancerostatikum doxorubicin, připojené pomocí spojek obsahující hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby, vyznačující se tím, že struktura polymemího léčiva sestává z hlavního řetězce N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu nesoucího doxorubicin a dalšího řetězce N-(2-hydroxypropyljmethakrylamidu jako roubu, který případně nese rovněž doxorubicin, přičemž tyto rouby jsou k hlavnímu řetězci připojeny vazbou v organizmu stálou a/nebo vazbou v organizmu štěpitelnou.
2. Polymerní léčivo podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou rouby připojeny k hlavnímu řetězci vazbou štěpitelnou v nádorové buňce, a to enzymaticky a/nebo reduktivně.
3. Polymerní léčivo podle nároku 2, vyznačující se tím, že jsou rouby připojeny k hlavnímu řetězci oligoptidickou sekvencí a/nebo disulfidovou vazbou.
4. Polymerní léčivo podle nároku 3, vyznačující se tím, že jsou rouby připojeny k hlavnímu řetězci oligopeptickou spojkou zvolenou z řady GlyLeuGly, GlyPheGly, GlyPheLeuGly a GlyLeuPheGly.
5. Polymerní léčivo podle nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že jsou molekulové hmotnosti hlavního řetězce i roubů voleny tak, aby jak hlavní řetězec před vazbou roubů, tak i samotné rouby byly po degradaci vyloučitelné z organizmu, zatímco celková molekulová hmotnost roubovaného polymeru převyšovala vylučovací limit organizmu.
6. Polymerní léčivo podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že molekulová hmotnost roubovaného polymeru je 50 000 až 400 000 g/mol a obsah doxorubicinu se pohybuje mezi 1 až 25 % hmotn.
-51
7. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou la
znamena zbytek doxorubicinu a SPi představuje aminoacyl, zejména glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-ammohexanoyl (AH) nebo 4-aminobenzoyl a/nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů
GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly.
-52 —
8. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 1b
(1b) kde s nabývá hodnot 0 až 50 a 11 až 20 a ostatní symboly mají význam uvedený v nároku 7.
9. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 1c
tlc%) kde SP2 představuje složený acyl vycházející z enzymaticky odbouratelné oligopeptidické sekvence typu GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly a ostatní symboly mají význam uvedený v nároku Ίου & .
—54 —*
10. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou Id
kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 9.
11. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 2
kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 9.
12. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 3a <?H3
kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
—57 —
13. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 3b
X 0,2,4, 6 kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
— 58
Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 4a
kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
-59 —
15. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 4b
t4b)' kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
16. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 4c
~60 kde jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 8.
17. Polymemí léčivo podle nároku 1, vyznačující se strukturou 5
kde jednotlivé symboly mají
význam uvedený v nároku 9.
18. Farmaceutická kompozice obsahující jako účinnou složku látku podle kteréhokoli předchozího nároku, určená k léčbě nádorových onemocnění.
19. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, určená k léčbě pevných tumorů.
20. Farmaceutická kompozice podle nároku 18, určená k léčbě některých typů lymfomů a leukémií.
21. Způsob výroby polymemího léčiva podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se sestává z následujících stupňů:
a. pnprava základních monomeiýních jednotek, kterými je N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid a další methakryloylované deriváty aminokyselin nebo oligopeptidů zakončené reaktivní 4-nitrofenoxy- nebo
-61 — thiazolidinthionovou skupinou; nebo jsou zakončeny hydrazinovou skupinou chráněnou butyloxykarboxylovou skupinou; nebo jsou zakončeny doxorubicinem; nebo methakryloylované makromonomery připravené metakryloylací semitelechelického kopolymeru M(2hydroxypropyl)methakrylamidu zakončené primární amino skupinou;
b. syntéza polymemích prekursorů, tj.: (a) základního řetězce nesoucího funkční skupiny 4-nitrofenoxy, thiazolidin-2-thionové, hydrazidové, primární amino, sulfhydrylové (SH) nebo dithiopyridylové (PDS), buď polymerací základních monomerů nesoucích tyto skupiny nebo modifikací funkčních skupin polymeranalogickou reakcí, a (b) roubů zakončených reaktivní skupinou, připravených radikálovou polymerací základních monomemích jednotek, popřípadě radikálovou kopolymerací prováděnou v přítomnosti přenašeče nebo iniciovanou iniciátorem 3,3 '-[4,4 '-azobis(4-kyan#-4-methyl-1 -oxo-butan-4,1 -
-diyl)]bis(thiazolidin-2-thionem) (ABIK-TT) s následnými modifikacemi koncových skupin;
c. reakce funkčních skupin základního řetězce a reaktivních skupin roubu za vzniku polymemího nosiče, popřípadě hotového polymemího konjugátu, pokud byly použity k přípravě polymerů monomemí jednotky s obsahem doxorubicinu;
d. případné odstranění 1^-butyloxykarbonylové (Boc) skupiny chránící hydrazidové skupiny a jejich následná reakce s příslušným kancerostatikem.
22. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce la; 1b; 1c nebo ld, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře buď hydrazidové nebo primární aminoskupiny, zatímco rouby jsou zakončeny skupinami A-sukcinimidylesterovou nebo acylthiazolidin-2-thionovou.
23. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymemího léčiva vzorce 2, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře reaktivní 4-nitrofenoxy nebo thiazolidin-2-thionové skupiny, zatímco rouby jsou zakončeny koncovou hydrazidovou nebo primárními aminoskupinou.
-62 —
24. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymerního léčiva vzorce 3a nebo 3b, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře reaktivními dithiopyridilové skupiny, zatímco rouby jsou zakončeny sulfhydrylovou skupinou.
25. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymerního léčiva vzorce 4a ; 4b nebo 4c, vyznačující se tím, že základní řetězec při reakci podle bodu c. nese ve své struktuře sulfhydrylové skupiny, zatímco rouby jsou zakončeny dithiopyridylovou skupinou.
26. Způsob podle nároku 21 pro výrobu polymerního léčiva vzorce 5, vyznačující se radikálovou terpolymerací ^-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu smethakryloylovanými aminokyselinami nebo oligopeptidy zakončenými t?-1' - butyloxykarbonyl hydrazinovou skupinou a makromonomery připravenými methakryloylací Ař-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu semitelechelického kopolymeru zakončeného aminoskupinou vzorce:
CZ20060592A 2006-09-18 2006-09-18 Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby CZ2006592A3 (cs)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060592A CZ2006592A3 (cs) 2006-09-18 2006-09-18 Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
UAA200903818A UA97812C2 (ru) 2006-09-18 2007-09-18 Прививочные макромолекулярные конъюгаты доксорубицина с противоопухолевой активностью и способ их получения
US12/441,619 US8603990B2 (en) 2006-09-18 2007-09-18 Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
PCT/CZ2007/000087 WO2008034391A1 (en) 2006-09-18 2007-09-18 Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
EP07801128.5A EP2063914B1 (en) 2006-09-18 2007-09-18 Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
EA200900453A EA017073B1 (ru) 2006-09-18 2007-09-18 Привитые макромолекулярные конъюгаты доксорубицина, обладающие противораковой активностью, и способ их получения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20060592A CZ2006592A3 (cs) 2006-09-18 2006-09-18 Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ298945B6 CZ298945B6 (cs) 2008-03-19
CZ2006592A3 true CZ2006592A3 (cs) 2008-03-19

Family

ID=38982478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060592A CZ2006592A3 (cs) 2006-09-18 2006-09-18 Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8603990B2 (cs)
EP (1) EP2063914B1 (cs)
CZ (1) CZ2006592A3 (cs)
EA (1) EA017073B1 (cs)
UA (1) UA97812C2 (cs)
WO (1) WO2008034391A1 (cs)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010042638A2 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Young Bok Lee Hpma - docetaxel or gemcitabine conjugates and uses therefore
CZ301288B6 (cs) * 2008-10-23 2009-12-30 Zentiva, A. S Polymerní prípravek se synergickým úcinkem pri lécbe nádorových onemocnení
CZ303072B6 (cs) * 2009-02-13 2012-03-21 Zentiva, K.S. Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
CN104587484A (zh) * 2009-10-13 2015-05-06 瑞沙恩医药公司 用于抗癌剂递送的聚合物系统
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
CA2827029C (en) 2011-02-11 2019-07-02 The Regents Of The University Of Michigan Tripeptide compositions and methods
HUE033575T2 (hu) 2011-05-26 2017-12-28 Xuanzhu Pharma Co Ltd Tirozin-kináz inhibitor kinazolin származék, elõállítási eljárása és alkalmazása
CN103936945B (zh) * 2013-01-23 2017-02-08 中国科学院化学研究所 一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法
CN106995516B (zh) * 2016-01-22 2019-08-02 北京化工大学 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法
CZ308419B6 (cs) * 2016-04-11 2020-08-12 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Blokový kopolymer pro překonání lékové rezistence nádorů k chemoterapii, jeho polymerní konjugát s léčivem, farmaceutická kompozice je obsahující, způsob jejich přípravy a jejich použití
CN105963706B (zh) * 2016-04-15 2019-03-15 四川大学 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用
CZ309585B6 (cs) * 2019-12-17 2023-05-03 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Polymerní konjugát s hydrolytickým uvolňováním kancerostatika cytarabinu, způsob jeho přípravy a jeho použití
CN112940248B (zh) * 2021-02-04 2023-07-18 西安交通大学 一种pH响应型金属配位聚前药纳米粒子及其制备方法
CN113908289B (zh) * 2021-10-09 2023-07-25 北京化工大学 一种具有精确调控药物比例的抗肿瘤多元载药体系及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4619457B2 (ja) * 1993-11-18 2011-01-26 シルテックス、メディカル、リミテッド 徐放性製剤
US6060518A (en) * 1996-08-16 2000-05-09 Supratek Pharma Inc. Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same
GB9913359D0 (en) * 1999-06-09 1999-08-11 Cancer Res Campaign Tech Polymer modified biological elements
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů
CZ297827B6 (cs) * 2005-09-05 2007-04-04 Zentiva, A. S. Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva

Also Published As

Publication number Publication date
EP2063914B1 (en) 2018-12-26
EP2063914A1 (en) 2009-06-03
EA200900453A1 (ru) 2009-10-30
EA017073B1 (ru) 2012-09-28
CZ298945B6 (cs) 2008-03-19
US20090306004A1 (en) 2009-12-10
UA97812C2 (ru) 2012-03-26
WO2008034391A1 (en) 2008-03-27
US8603990B2 (en) 2013-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8603990B2 (en) Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation
Chytil et al. HPMA copolymer–drug conjugates with controlled tumor‐specific drug release
Chytil et al. Properties of HPMA copolymer–doxorubicin conjugates with pH-controlled activation: effect of polymer chain modification
JP5944836B2 (ja) 高分子薬物送達結合体ならびにその製造および使用方法
JP5781084B2 (ja) 樹状高分子量ポリマー薬物担体および特に固形腫瘍の処置のための薬物とのそれらの結合体
Nakamura et al. Comparison between linear and star-like HPMA conjugated pirarubicin (THP) in pharmacokinetics and antitumor activity in tumor bearing mice
US20190358341A1 (en) Biocompatible and hydrophilic polymer conjugate for targeted delivery of an agent
EP1463529B9 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
Etrych et al. Comparison of the pharmacological and biological properties of HPMA copolymer-pirarubicin conjugates: A single-chain copolymer conjugate and its biodegradable tandem-diblock copolymer conjugate
CZ303072B6 (cs) Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika
Chytil et al. Structural design and synthesis of polymer prodrugs
EP3442594A1 (en) Block copolymer for overcoming drug resistance of tumours to chemotherapy, its polymer-drug conjugate, pharmaceutical composition containing them, method of preparation and use thereof
Etrych et al. High-molecular-weight polymers containing biodegradable disulfide bonds: synthesis and in vitro verification of intracellular degradation
CZ2006207A3 (cs) Micelární nosiče léčiv s protinádorovou aktivitou
CZ2006505A3 (cs) Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy
CZ2019778A3 (cs) Kopolymer s hydrolytickým uvolňováním kancerostatika cytarabinu, způsob jeho přípravy a jeho použití
CZ2003605A3 (en) pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20190918