CZ2010818A3 - Primery na detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku - Google Patents
Primery na detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2010818A3 CZ2010818A3 CZ20100818A CZ2010818A CZ2010818A3 CZ 2010818 A3 CZ2010818 A3 CZ 2010818A3 CZ 20100818 A CZ20100818 A CZ 20100818A CZ 2010818 A CZ2010818 A CZ 2010818A CZ 2010818 A3 CZ2010818 A3 CZ 2010818A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- pathogen
- fragment
- lysv
- slv
- Prior art date
Links
- 241000156303 Leek yellow stripe virus Species 0.000 title claims abstract description 21
- 241000167946 Onion yellow dwarf virus Species 0.000 title claims abstract description 19
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 title claims abstract description 15
- 241000218627 Garlic common latent virus Species 0.000 title abstract description 17
- 241000710168 Shallot latent virus Species 0.000 title 1
- 244000245420 ail Species 0.000 title 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 23
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 18
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229910001710 laterite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011504 laterite Substances 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract description 4
- 102100039696 Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit Human genes 0.000 abstract 1
- 101001034527 Homo sapiens Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit Proteins 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 241000123646 Allioideae Species 0.000 description 2
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 2
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- ACEMKCOYIINOHN-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1.CC1=CNC(=O)NC1=O ACEMKCOYIINOHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXXVSCRPHPIDIW-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;7h-purine Chemical compound C1=NC=C2NC=NC2=N1.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 AXXVSCRPHPIDIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001135992 Garlic poty virus Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000567769 Isurus oxyrinchus Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N tantalum atom Chemical compound [Ta] GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká primeru pro detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku metodou RT PCR a ELISA testu, kdy pri detekci patogena Onion yellow dwarf virus (OYDV) o má primer složení OYDV81F (SEQ ID NO: 1) TTTAGCACGTTACGCATTCGA, OYDV81R (SEQ ID NO: 2) TTACCATCCAGGCCAAACAA, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 132 bp, pro detekci patogena Leek yellow stripe virus (LYSV) má primer složení LYSV81-410F (SEQ ID NO: 3) AAGAACACCAGTTAGAGCGCG, LYSV81-535R (SEQ ID NO: 4) TGCCTCTCCGTGTCCTCATC, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 126 bp, pro detekci patogena Garlic common latent virus (GCLC) má primer složení GCLV2F (SEQ ID NO: 5) CGACCACCTGCTGGTTGG, GCLV1R (SEQ ID NO: 6) TCAAGTGGCTGCACACAAGC, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 106 bp a pro detekci fragmentu patogena Stripe latent virus (SLV) má primer složení SLV81-569F (SEQ ID NO: 7) AACAAAGCAGCGATTCAACC, SLV81-730R (SEQ ID NO: 8) ACATCCGAAGAAACCTCCAGT, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 160 bp.
Description
Příměry na detekci virů OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech česneku
Oblast techniky
Řešení se týká nových primerů pro detekci a případnou kvantifikaci virových patogenů česneku a dalších zemědělských plodin rodu Alliaceae, což má význam v rostlinolékařství, molekulární biologii a v uchovávání genových zdrojů.
Dosavadní stav techniky
Kulturní rostliny rodu Allium patří mezi nej významnější zeleniny. V České republice se pěstují zejména cibule (Allium cepa var. cepa), česnek kuchyňský (Allium sativum) a pór (Allium porrum). Výnos a kvalita jejich produkce je každoročně značně snižována komplexem virových chorob, z nichž nejvíce rozšířené jsou: Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek yellow stripe virus (LYSV), Garlic common latent virus (GCLV), a Stripe latent virus (SLV). V České republice jsou všechny uvedené druhy virů značně rozšířeny jak v komerčně pěstovaných česnecích, tak i v importovaných druzích (Klukáčková et al., 2007, Journal of Plant Diseases and Protection 114: 97100, „Naturel infection of garlic (Allium sativum L.) by viruses in the Czech Republic“; Karlova et al., 2009, Agrículture 55: 58-60, „Virus diseases in coilection of genetic resources of garlic in the Czech Republic“)* Všechny jmenované druhy virů jsou přenášeny neperzistentně mšicemi. Vyznačují se úzkým okruhem hostitelů většinou omezených na rod Allium. Nejsou známy diferenciační hostitelé, což značně komplikuje jejich identifikaci zvláště, když se vyskytují ve směsných infekcích. Navíc se některé druhy projevují příznaky, často až když je přítomno více druhů virů v jedné rostlině.
Přesná a včasná diagnostika virových infekcí má velký význam v systému ochrany polních plodin. Klasické metody diagnostiky jsou zatížené velkou chybou, neboť se vnější příznaky (symptomy) choroby překrývají, mohou být velmi variabilní nebo se nemusí vyskytovat vůbec. Proto je identifikace virů na základě vizuálního hodnocení rostlin značně nespolehlivá. V současné době je přítomnost virů nejčastěji stanovována ELISA testem, avšak pro tento test je nutné značné množství rostlinného materiálu. Test rovněž vykazuje nižší citlivost. Tam, kde je nutno virus detekovat v minimálním množství rostlinné tkáně a kde se virus vyskytuje v nízké koncentraci částic, poskytuje ELISA falešně negativní výsledky.
V současné době se přistupuje k produkci bezvirózních česneků buď jejich pěstováním ze semen nebo ozdravováním rostlin pomocí in vitro kultur. Zde vyvstala potřeba přesné a citlivé metody detekce virů v rostlinných pletivech. Jako nejvhodnější se ukázala metoda RT PCR, kterou už pro detekci virů česneku použili Dovas et al., 2001, J. Phytopathology 149: 731737, „Comparison of methods for virus detection in Allium spp.“; Lunello P., et al., 2004, Journal of Virological Methods 118: 15-21, “Ultra-sensitive detection of two garlic potyviruses using a real-time fluorescent (Taqman) RT-PCR assay“. V různých částech světa se vyskytují různé patotypy uvedených druhů virů, které se vyznačují vysokou mírou genetické variability. Je proto velmi obtížné detekovat všechny patotypy daného druhu viru pomocí jedné sady primerů, což je nevyhovující.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňují primery pro detekci virů OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech česneku metodou RT PCR a ELISA testu, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že při detekci patogena Onion yellow dwarf virus (OYDV) o má primer složení OYDV81F (SEQ ID NO: 1) TTTAGCACGTTACGCATTCGA
OYDV81R (SEQ ID NO: 2) TTACCATCCAGGCCAAACAA, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 132 bp, pro detekci patogena Leek yellow stripe virus (LYSV) má primer složení LYSV81-410F (SEQ ID NO: 3) AAGAACACCAGTTAGAGCGCG
LYSV81-535R (SEQ ID NO: 4) TGCCTCTCCGTGTCCTCATC, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 126 bp, pro detekci patogena Garlic common latent virus (GCLV) má primer složení GCLV2F (SEQ ID NO: 5) CGACCACCTGCTGGTTGG
GCLV1R (SEQ ID NO: 6) TCAAGTGGCTGCACACAAGC, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 106 bp a pro detekci fragmentu parogena Stripe latent virus (SLV) má primer složení SLV81-569F (SEQ ID NO: 7) AACAAAGCAGCGATTCAACC
SLV81-730R (SEQ ID NO: 8) ACATCCGAAGAAACCTCCAGT, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 160 bp.
Podstatou vynálezu jsou primerové páry, specificky detekujícími OYDV, LYSV, GCLV a SLV, které byly navrženy na základě sekvencí genu pro plášťový protein daného viru. Metoda RT PCR s těmito příměrovými páry podle vynálezu umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 132 bp pro OYDV, 126 bp pro LYSV, pro 106 bp pro GCLV a 160 bp pro SLV.
Definice některých použitých pojmů je nutné vysvětlit:
Pojem DNA
Molekula DNA slouží u všech ostatních organismů s výjimkou RNA virů k uchovávání a kopírování genetické informace. DNA je tvořena dvěma řetězci. V každém řetězci se střídá pětiuhlíkový cukr deoxyribóza se zbytkem kyseliny fosforečné (fosfátem). Na deoxyribózu je kovalentní vazbou připojen jeden ze 4 typů heterocyklických sloučenin, tzv. bází. Dvě z nich jsou odvozeny ze struktury purinu - adenin (A) a guanin (G); a dvě od pyrimidinu thymin (T) a cytosin (C). Trojice deoxyribóza-zbytek kyseliny fosforečné-báze, tzv. nukleotid, tvoří základní jednotku (monomer) DNA. Protože na místě báze se mohou vyskytovat čtyři různé molekuly (A, T, C nebo G), existují i čtyři
| • ·· · · | » · · | ||
| • · · | • | • · · | |
| • · · | • | • | • · · |
| ··· ·· | » é · | • · · | · · · · |
různé základní stavební jednotky (nukleotidy) - deoxyadenosinfosfát, deoxytymidinfosfát, deoxyguanosinfosfát a deoxycytidinfosfát. Genetická informace je v DNA zapsána v pořadí bází. Ve dvouřetězcové molekule DNA jsou k sobě oba řetězce vázány vodíkovými můstky mezi tzv. komplementárními bázemi A-T a C-G.
Pojem RNA
Molekula RNA je v případě tzv. RNA virů uzpůsobena pro uchovávání a kopírování jejich genetické informace. Molekula RNA je tvořena jedním řetězcem. V každém řetězci se střídá pětiuhlíkový cukr ribóza se zbytkem kyseliny fosforečné (fosfátem). Na ribózu jsou kovalentní vazbou připojeny báze podobné jako u DNA. RNA je velmi málo stabilní molekula a proto je v laboratorní praxi po extrakci přepisována na DNA pomocí tzv. reverzní transkripce.
Pojem cílová sekvence
Znamená úsek DNA, který má být amplifikován, detekován či jinak analyzován.
Pojem příměry
Příměry jsou krátké oligonukleotidy (cca 20 nukleotidů), které jsou komplementární s templátovou DNA na počátku a na konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové molekuly DNA. Tvoří počátek pro zahájení syntézy polynukleotidového řetězce. Unikátní kombinace nukleotidů primeru má za následek amplifikaci pouze požadované sekvence DNA.
Pojem reverzní transkripce
Reverzní transkripce je přepis RNA na DNA, který je prováděn enzymem reverzní transkriptázou jako syntéza nového řetězce DNA na základě sekvence templátové RNA.
Pojem amplifikace a PCR
Amplifikace DNA je zvyšování počtu kopií molekul DNA v laboratorních podmínkách. PCR (polymerase chain reaction) polymerázová řetězová reakce je proces, při kterém dochází k amplifikace DNA. Tento proces probíhá ve třech krocích: 1. teplotní denaturace DNA - dojde k uvolnění vodíkových můstků a dvoušroubovice DNA se rozpadne na dvě samostatná vlákna ssDNA; 2. annealing neboli nasednutí primerů na templátovou DNA a 3. elongace neboli prodlužování nově vznikajícího řetězce pomocí enzymu DNAdependentní DNA polymerázy. Tento třístupňový proces se opakuje 30 až 40x a je prováděn ve speciálním zařízení termocykleru s rychlým ohřevem a chlazením. Běžné techniky molekulární biologie jsou vysvětleny v literatuře, např. Sambrook et al., 2001: Molecular Cloning - a laboratory manual I., II., III.
Přehled obrázků na výkresech
Na přiložených výkresech jsou na Obr. 1 znázorněny grafý disociační křivky amplifikovaného produktu a to a) OYDV, b) LYSV, c) GCLV, d) SLV.
Původcem vynálezu byla úspěšně prokázána specifická reakce primerů podle vynálezu s RNA virových patogenů a v následujících tabulkách jsou shrnuty výsledky jeho měření, které bylo provedeno ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i. v Praze, CZ.
Následný příklad provedení technické řešení pouze dokládá, aniž by ho jakkoliv omezoval.
Příklad provedení
Příklad 1
Ověření funkčnosti a spolehlivosti primerů pro detekci OYDV, LYSV, GCLV a SLV na biologickém materiálu:
Vzorky listových pletiv 50 genotypů česneku byly odebrány na pracovišti v Olomouci (Tabulka 1). 0,1 g rostlinného materiálu bylo rozdrceno v třecí misce v prostředí tekutého dusíku. RNA byla extrahována pomocí komerční soupravy High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche, Mannheim, Germany).
RT PCR byly provedeny jednostupňově v jedné zkumavce pro každý vzorek. Reakce byly prováděny vreakční směsi za uvedených reakčních podmínek (Tabulka 2 a 3) v přístroji ABI PRISM 7900 fy Applied Biosystems. Ke sběru a analýze dat sloužil program ABI PRISM 7900 Sequence Detection Systém. Výsledky byly srovnány s výsledky ELISA testu provedeném na témž rostlinném materiálu (Tabulka 1).
Závěr měření:
Měření prokázalo dobrou funkčnost nových primerů OYDV81F (SEQ ID NO: 1), OYDV81R (SEQ ID NO: 2), LYSV81-410F (SEQ ID NO: 3), LYSV81535R (SEQ ID NO: 4), GCLV2F (SEQ ID NO: 5), GCLV1R (SEQ ID NO: 6), SLV81-569F (SEQ ID NO: 7) a SLV81-730R (SEQ ID NO: 8), které byly schopny prokázat přítomnost DNA patogenů OYDV, LYSV, GCLV a SLV v infikovaném biologickém materiálu s detekovatelnou mírou patogena v pletivu (Obrázek 1). Výsledky prokázaly vyšší citlivost RT PCR ve srovnání s ELISA testem (Tabulka 1).
Vzorky obsahující RNA virů OYDV, LYSV, GCLV či SLV s primery OYDV81F (SEQ ID NO: 1), OYDV81R (SEQ ID NO: 2), LYSV81-410F (SEQ ID NO: 3), LYSV81-535R (SEQ ID NO: 4), GCLV2F (SEQ ID NO: 5), GCLV1R (SEQ ID NO: 6), SLV81-569F (SEQ ID NO: 7) a SLV81-730R (SEQ ID NO: 8) se za uvedených reakčních podmínek vyznačovaly pozitivní odezvou, tj. pikem při dané teplotě disociace, u negativní kontroly nebyl cílový fragment amplifikován - nebyl nalezen žádný pík nebo pík při nižší teplotě disociace.
Průmyslová využitelnost
Nové primery pro detekci OYDV, LYSV, GCLV a SLV mají využití v rostlinolékařství při diagnostice virů zejména v procesu ozdravování genotypů česneku a dalších zemědělských plodin rodu Alliaceae pro potřeby šlechtění a uchovávání genových zdrojů.
| • «* | * | • | |
| ·· · · | 4 | · | • * |
| • · · • · · · • · · | • • • | • • · | |
| ··· ·· | *♦ ♦ | • · · | • · |
Tabulka 1 - Analyzované vzorky a výsledky RT PCR a ELISA testu
| ECN | Název kultivaru | OYDV | LYSV | GCLV | SLV | ||||
| PCR 2010 | ELISA 2010 | PCR 2010 | ELISA 2010 | PCR 2010 | ELISA 2010 | PCR 2010 | ELISA 2010 | ||
| 09H0100019 | Beloretchenskij | + | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100026 | Mako | + | 4- | - | - | + | + | 4- | + |
| 09H0100028 | Sukoradsky | + | + | 4- | 4- | 4- | + | 4- | 4- |
| 09H0100047 | landrace (Olomouc 1) | + | 4- | 4- | + | 4- | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100033 | Řevničan | + | 4- | - | - | - | - | 4- | - |
| 09H0100034 | Kuklenský | + | + | + | 4- | + | 4- | + | 4- |
| 09H0100038 | Poděbradský | + | 4- | - | 4- | + | + | + | 4- |
| 09H0100050 | landrace (Olomouc 2) | + | 4- | + | 4- | + | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100051 | Rožďalovický | + | + | 4- | + | 4- | 4- | 4- | + |
| 09H0100052 | DAlsace Freres | + | + | 4- | + | + | + | 4- | + |
| 09H0100054 | Severský Paličák | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100071 | Král | + | 4- | 4- | + | 4- | + | 4- | |
| 09HO100074 | Znojemský | + | 4- | 4· | + | + | + | 4- | |
| 09H0100080 | Moravan | + | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | |
| 09H0100081 | Ropal | + | 4> | + | 4- | + | 4- | 4- | |
| 09H0100076 | Bzenecký | + | 4- | 4- | 4- | + | 4- | 4- | |
| 09H0100073 | Záhorský | + | 4- | 4- | 4- | + | 4- | - | - |
| 09H0100069 | Alan | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100079 | Prim | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | + |
| 09H0100078 | Japo | + | 4- | 4- | 4- | 4- | + | 4- | 4- |
| 09H0100030 | Záhorský | + | 4- | 4- | - | + | 4- | + | 4- |
| 09H0100241 | Řevničan X-ray | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100253 | novošlechtění | + | + | - | - | 4- | + | 4- | 4- |
| 09H0100254 | KS-29/8 | + | 4- | 4- | 4- | + | + | + | + |
| 09H0100257 | landrace (Dolní Němci 1) | + | 4- | 4* | - | 4- | 4- | + | 4- |
| 09H0100305 | Bianco Veneto | + | 4- | 4- | 4- | - | - | + | + |
| 09H0100454 | landrace (CSK BK 87/19) | + | + | 4- | - | 4- | 4- | + | - |
| 09H0100251 | landrace (Rousínov 1) | + | 4- | - | - | + | + | + | + |
| 09H0100256 | landrace (Olomouc 4) | + | 4- | + | 4- | 4* | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100802 | landrace (Pavlovce 287) | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | + | + |
| 09H0100783 | landrace (Kosihy nad Ipelom 13 | + | 4- | 4- | 4- | + | + | - | - |
| 09H0100786 | landrace (Kalonda 1) | + | 4- | 4- | - | 4- | 4- | + | 4- |
| 09H0100799 | landrace (Rozhanovce) | + | + | 4- | - | 4- | 4- | - | - |
| 09H0100806 | landrace (Baska 13) | 4- | + | 4- | - | - | - | 4- | + |
| 09H0100918 | landrace (Djambul 2/64) | + | 4- | 4- | + | 4- | 4- | + | 4- |
| 09H0101180 | Alan Imp. | + | + | + | 4- | + | 4- | + | 4- |
| 09H0101052 | landrace (Dubovy vrch) | 4- | 4- | - | - | 4- | 4- | 4- | + |
| 09H0100986 | landrace | 4- | 4- | + | 4- | + | 4- | 4- | 4- |
| 09H0100989 | landrace | + | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | + | 4- |
| 09H0101092 | Landrace(Javorníka) | 4- | + | + | 4- | - | - | 4- | 4- |
| 09H0101093 | landrace (Prostějovsko) | 4- | + | 4- | 4- | 4- | + | 4- | + |
| 09H0101170 | Blanin | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- | 4- |
| 09H0101171 | Lukan | + | 4- | 4- | - | 4- | 4- | + | + |
| 09H0101172 | N9A | + | 4- | 4- | - | 4- | 4- | - | - |
| 09H0101175 | landrace (Fiala) | 4- | 4- | + | 4- | - | - | 4- | + |
| 09H0101167 | (landrace) Karel | 4- | + | - | - | + | + | 4- | + |
| 09H0101190 | Tantal | 4- | 4- | 4- | - | 4- | + | 4- | 4- |
| 09H0101191 | Tristan | + | + | 4- | - | + | 4- | + | + |
| 09H0101196 | Anton | + | + | 4- | - | 4- | 4- | - | |
| 09H0101197 | Anin | 4- | 4- | 4- | 4- | + | + | 4- | 4- |
Tabulka 2 - Složení reakční směsi
| Chemikálie | Koncentrace | Objem |
| Primer mix | 5 uM | 1,5 ul |
| SYBRgreen Master Mix | 2x | 12,5 ul |
| Multiscribe Reverse Transcriptase | 50 U/ul | 0,125 ul |
| Rnase Inhibitor | 20 U/ul | 0,5 ul |
| H2O (bez RNáz) | 8,375 ul | |
| Templátová RNA | 150 ng/ul | 2,0 ul |
| Reakční objem | 25 ul |
Tabulka 3 - Reakční podmínky
| PCR reakce 48 °C | 30 minut |
| 95 °C | 10 minut |
| 40 cyklů: | |
| 95 °C | 15 sekund |
| 60 °C | 1 minuta |
| Disociace | 95 °C | 15 sekund |
| 60 °C | 15 sekund | |
| 95 °C | 15 sekund |
Claims (8)
1. Příměry pro detekci virů OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech česneku metodou RT PCR a ELISA testu, kdy při detekci patogena Onion yellow dwarf virus (OYDV) o má přiměř složení OYDV81F (SEQ ID NO: 1) TTTAGCACGTTACGCATTCGA
OYDV81R (SEQ ID NO:
2) TTACCATCCAGGCCAAACAA, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 132 bp, pro detekci patogena Leek yellow stripe virus (LYSV) má primer složení LYSV81 -41 OF (SEQ ID NO:
3) AAGAACACCAGTTAGAGCGCG
LYSV81-535R (SEQ ID NO:
4) TGCCTCTCCGTGTCCTCATC, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 126 bp, pro detekci patogena Garlic common laterit virus (GCLV) má primer složení GCLV2F (SEQ ID NO:
5) CGACCACCTGCTGGTTGG
GCLV1R (SEQ ID NO:
6) TCAAGTGGCTGCACACAAGC, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 106 bp a pro detekci fragmentu parogena Stripe laterit virus (SLV) má primer složení SLV81-569F (SEQ ID NO:
7) AACAAAGCAGCGATTCAACC
SLV81-730R (SEQ ID NO:
8) ACATCCGAAGAAACCTCCAGT, které umožní amplifikaci fragmentu patogena o velikosti 160 bp.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100818A CZ2010818A3 (cs) | 2010-11-10 | 2010-11-10 | Primery na detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20100818A CZ2010818A3 (cs) | 2010-11-10 | 2010-11-10 | Primery na detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2010818A3 true CZ2010818A3 (cs) | 2012-05-23 |
Family
ID=46082615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20100818A CZ2010818A3 (cs) | 2010-11-10 | 2010-11-10 | Primery na detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2010818A3 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2469948R1 (es) * | 2012-12-19 | 2014-11-17 | Universidad Politécnica de Madrid | PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR EN PLANTAS LA INFECCIÓN POR LOS VIRUS DE ARN DE CADENA SENCILLA QUE INFECTAN AL AJO OYDV, LYSV, GCLV, SLV, IYSV y ALLEXIVIRUS. |
-
2010
- 2010-11-10 CZ CZ20100818A patent/CZ2010818A3/cs unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2469948R1 (es) * | 2012-12-19 | 2014-11-17 | Universidad Politécnica de Madrid | PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR EN PLANTAS LA INFECCIÓN POR LOS VIRUS DE ARN DE CADENA SENCILLA QUE INFECTAN AL AJO OYDV, LYSV, GCLV, SLV, IYSV y ALLEXIVIRUS. |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2013055956A5 (cs) | ||
| Moreno et al. | Reference genes for reliable potyvirus quantitation in cassava and analysis of Cassava brown streak virus load in host varieties | |
| WO2002099129A2 (en) | Designing degenerate pcr primers | |
| JP2017516466A (ja) | 黄龍病を検出するための組成物および方法 | |
| Galipienso et al. | Cucumber vein yellowing virus isolate-specific expression of symptoms and viral RNA accumulation in susceptible and resistant cucumber cultivars | |
| EP3320113B1 (en) | Methods and kits for the detection of powdery mildew | |
| EP3387149B1 (en) | Isothermal amplification for the detection of influenza viruses in a sample. | |
| CN116348614A (zh) | 开关寡核苷酸 | |
| CZ2010818A3 (cs) | Primery na detekci viru OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech cesneku | |
| EP3625371B1 (en) | Set of random primers and method for preparing dna library using the same | |
| CZ22202U1 (cs) | Primery na detekci virů OYDV, LYSV, GCLV a SLV v pletivech česneku | |
| US20220220536A1 (en) | Compositions and methods of using a dna nanoswitch for the detection of rna | |
| KR102944251B1 (ko) | 차세대 염기서열 분석법을 이용한 감악 바이러스 서열 라이브러리 제조 방법 및 전장 게놈 서열 확인 방법 | |
| US20120082995A1 (en) | Method for quantitative pcr amplification of deoxyribonucleic acids from a sample containing pcr inhibitors | |
| KR20150134004A (ko) | 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트 | |
| KR20260039854A (ko) | 차세대 염기서열 분석을 위한 호흡기세포융합바이러스 게놈 라이브러리 제조 방법 | |
| KR20260039855A (ko) | 차세대 염기서열 분석을 위한 뎅기바이러스 라이브러리 제조 방법 | |
| CN106939356A (zh) | 一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| US20210172012A1 (en) | Preparation of dna sequencing libraries for detection of dna pathogens in plasma | |
| Ibrahim et al. | RT-qPCR analysis of genotype-specific beet yellows virus accumulation in sugar beet | |
| CZ32308U1 (cs) | Reakční směs pro normalizaci kvantifikace RNA při analýze viromu v pšenici a ječmeni | |
| JP2007000040A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法 | |
| KR20160127517A (ko) | 복수의 miRNA의 정량적 동시 검출 방법 | |
| AU2021288610A1 (en) | Isothermal real-time PCR method for determining presence of a pre-determined RNA sequence in a sample | |
| Liberti et al. | Biological properties and partial molecular characterization of an apricot strain of CGRMV |