CZ32308U1 - Reakční směs pro normalizaci kvantifikace RNA při analýze viromu v pšenici a ječmeni - Google Patents

Description

Reakční směs pro normalizaci kvantifikace RNA při analýze viromu v pšenici a ječmeni

Oblast techniky

Řešení se týká reakční směsi a postupu pro současnou detekci a kvantifikaci RNA tri referenčních genů ječmene a pšenice za účelem normalizace kvantifikace RNA pro analýzu viromu s využitím molekulární detekce a kvantifikace mRNA.

Dosavadní stav techniky

Obilniny se pěstují na rozloze téměř 1600 tisíc hektarů, což představuje více než 60 % z celkové výměry orné půdy České republiky. Kvůli rozsáhlému pěstování a jednoduchým osevním postupům jsou obilniny napadány mnoha patogeny. Virózy obilnin patří mezi významné choroby, které mohou způsobovat velké výnosové ztráty. Proti virovým chorobám rostlin neexistuje v současné době účinná ochrana. Mezi nej důležitější viry obilnin v ČR patří virus žluté zakrslosti ječmene (Barley yellow dwarf virus - BYDV), virus zakrslosti pšenice (Wheat dwarf virus - WDV), virus ěárkovité mozaiky pšenice (Wheat streak mosaic virus - WSMV).

Současné diagnostické metody rostlinných virů jsou založeny buď na detekci virových proteinů pomocí sérologických metod, nebo na molekulární detekci virové nukleové kyseliny. S éro logickými testy (ELISA test) je možno dosáhnout semi-kvantitativní analýzy, kdy je vzorek ředěn aritmetickou řadou (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 atd.). Tato metoda je nicméně schopna titr virů jen porovnat, a ne absolutně stanovit. Limity citlivosti jsou u této metody poměrně omezené. Pomocí této metody lze v každé eseji stanovit pouze jeden patogen.

Nukleové kyseliny patogenů se stanovují nejčastěji pomocí RT-PCR, kdy u RNA virů dojde nejprve k přepisu do cDNA a taje poté amplifikována za pomoci druhově specifických primerů. Při vhodném navržení různých délek koncových produktů PCR lze detekovat několik různých patogenů současně (Multiplex PCR), obvykle je však snížena citlivost detekce.

Metoda TaqMan RT-qPCR založená na detekci virových nukleových kyselin pomocí specifických primerů a sond v reálném čase je jednou z nejspolehlivějších v současnosti existujících kvantifikaěních metod. Při RT-qPCR je produkt detekován a měřen po každém cyklu, což umožňuje detekci produktu a zároveň kvantifikaci výchozího množství templátu. TaqMan sondy jsou dvojitě barvené hydrolyzaění sondy nesoucí na 5' konci reportérový fluoro for, na 3’ konci molekulu zhášeěe. Existuje několik fluoro fórů různých vlnových délek, které lze kombinovat v jedné eseji a takto účinně detekovat a kvantifikovat více patogenních činitelů současně. Pro přesnou kvantifikaci je nutno získaná data normalizovat za pomoci tzv. referenčních genů hostitele (tj. pšenice a ječmen v tomto případě).

Pro BYDV, WDV i WSMV byly vyvinuty primery a sondy umožňující jejich současnou detekci pomocí TaqMan RT-qPCR. Nebyla však vyvinuta metoda umožňující normalizaci kvantifikace pomocí referenčních genů pšenice a ječmene v jedné reakci současně.

Podstata technického řešení

V technickém řešení je uvedena reakční směs pro detekci a kvantifikaci tri referenčních genů ječmene (a-tubulin gen - TUBA; β-tubulin gen - TUBB; glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázaGAPDH;) a pšenice (TUBA; TUBB; eukaryotický iniciační faktor 4a - EIF4A) s využitím RT-qPCR. Podstata technického řešení spočívá v tom, že ve stejném čase, ve stejných podmínkách proběhnou současně tři amplifikaění reakce umožňující detekci všech tri virů

- 1 CZ 32308 Ul najednou.

Reakční směs obsahuje 4 μΐ vzorku testované cDNA, TaqMan® RT-PCR mix, destilovanou vodu a specifické primery a sondy pro detekci viru žluté zakrslosti ječmene. Všechny primery a sondy jsou o konečné koncentraci 0,16 μΜ. Konkrétně se jedná o následující primery a sondy:

TUBB-R GTCGTTCATGTTGCTCTC

TUBB-F CCTTCTTGCACTGGTACA

TUBB-Taq FAM-CGGTGAACTCCATCTCGTCCA-BHQ1

TUBA-R GGC ACGCTTGGCGTACAT

TUBA-F CCAGCGTCGTCGAGGTCTTCTC

TUBA-Taq Cy5-CGCATCGACCACAAGTTTGACCT-BHQ2

Eif4a-R GGGAGGTCATAGTTGATG

Eif4a-F GGAGTTCAGATCAGGTTC

Eif4a-Taq HEX-CATCA AT ACC ACGAGC A AGC AGG-BHQ1

GapB-R CTGCTGTCACCAACGAAG

GapB-F TTGTTGATCTCACTGTTAGAACC

GapB-Taq HEX-ACATCAAGAAGGCTATCAAGGCTGCTTCC-BHQ1 cDNA se připraví z izolované RNA rostlin za pomoci náhodných hexamerů a reverzní transkriptázy dle protokolu výrobce dané transkriptázy.

Směsi pro RT-PCR podle technického řešení se připravují v mikrozkumavkách, kapilárách nebo na Real-time PCR desce, a každá obsahuje 4 μΐ cDNA testovaného vzorku, TaqMan® PCR Master Mix, obsahující 0,25 μΐ DNA polymerázy o koncentraci 5U/pl, 5 μΐ směsi oligonukleotidů o koncentraci 2,5 mM, 5 μΐ pufru obsahujícího MgCh o konečné koncentraci 5,5mM; destilovanou vodu, kterou je každá reakční směs doplněna do konečného objemu 25 μΐ a 0,4 μΐ jednotlivých specifických primerů a sond pro detekci a kvantifikaci mRNA referenčních genů pšenice a ječmene o původní koncentraci 10 μΜ (konkrétně primery TUBA-R, TUBA-F, TUBB-R, TUBB-F, GapB-R a GapB-F a sondy TUBA-Taq, TUBB-Taq a GapB-Taq pro ječmen; a primery TUBA-R, TUBA-F, TUBB-R. TUBB-F, Eif4a-R a Eif4a-F a sondy TUBA-Taq, TUBB-Taq a Eif4a-Taq pro pšenici).

Při amplifikaci mRNA TUBB vznikne produkt dlouhý 143 bp produkující signál při vlnové délce 494 až 515 nm. Při amplifikaci mRNA GAPDH a EIF4a vzniknou produkty dlouhé 148 bp a 102 bp produkující signál při vlnové délce 535 až 555 nm. Při amplifikaci mRNA TUBA vznikne produkt dlouhý 65 bp produkující signál při vlnové délce 651 až 674 nm. Všechny signály lze detekovat v jedné reakci najednou.

Vlastní qPCR probíhá v Real-time termocykleru nejprve 15 minut při 95 °C. Následuje 40 cyklů, každý obsahuje dva kroky: 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C.

Toto technické řešení umožňuje přesnou současně probíhající normalizaci kvantifikace obilných virů, pouze v jedné reakci. Touto metodou lze docílit vysokých úspor času i financí. Takto průkazných výsledků nebylo dosud dosahováno.

Následující příklady provedení reakční směs podle technického řešení pouze dokládají, aniž by ji jakkoliv omezovaly.

Příklady uskutečnění technického řešení

Vyhodnocení reakcí pšenice na směsné infekce BYDV, WDV a WSMV.

Ve výzkumné instituci je založen pokus sledující možné synergické/antagonické reakce mezi třemi běžně se vyskytujícími viry obilnin. Pokusné rostliny pšenice jsou inokulovány všemi třemi

-2CZ 32308 UI viry najednou. V určitých časových intervalech jsou z každé rostliny odebrány vzorky listů. Ze vzorků je v laboratoři izolována celková RNA. Z celkové RNA je syntetizována pomocí reverzní transkriptázy a náhodných hexamerů cDNA.

Každý vzorek je napipetován v triplikátu dvakrát - tj. jeden triplikát pro detekci a kvantifikaci virů v jedné reakci (BYDV, WDV, WSMV) a jeden triplikát pro detekci a kvantifikaci mRNA referenčních genů pšenice (TUBA, TUBB, EIF4a) - viz schéma.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Vzl vir

Vz2 vir

Vz3 vir

Vz4 vir

Vz5 vir

Vz6 vir

Vz7 vir

Vz8 vir

Vz9 vir

VzlO vir

Poz. Kontr. Vir

Neg. Kontr. Vir

B

Vzl vir

Vz2 vir

Vz3 vir

Vz4 vir

Vz5 vir

Vz6 vir

Vz7 vir

Vz8 vir

Vz9 vir

VzlO vir

Poz. Kontr. Vir

Neg. Kontr. Vir

C

Vzl vir

Vz2 vir

Vz3 vir

Vz4 vir

Vz5 vir

Vz6 vir

Vz7 vir

Vz8 vir

Vz9 vir

VzlO vir

Poz. Kontr. Vir

Neg. Kontr. Vir

D

Vzl ref gen

Vz2 ref gen

Vz3 ref gen

Vz4 ref gen

Vz5 ref gen

Vz6 ref gen

Vz7 ref gen

Vz8 ref gen

Vz9 ref gen

VzlO ref gen

Poz. Kontr. Ref gen

Neg. Kontr. Ref gen

E

Vzl ref gen

Vz2 ref gen

Vz3 ref gen

Vz4 ref gen

Vz5 ref gen

Vz6 ref gen

Vz7 ref gen

Vz8 ref gen

Vz9 ref gen

VzlO ref gen

Poz. Kontr. Ref gen

Neg. Kontr. Ref gen

F

Vzl ref gen

Vz2 ref gen

Vz3 ref gen

Vz4 ref gen

Vz5 ref gen

Vz6 ref gen

Vz7 ref gen

Vz8 ref gen

Vz9 ref gen

VzlO ref gen

Poz. Kontr. Ref gen

Neg. Kontr. Ref gen

G

H

Schéma rozmístění vzorků na 96-jamkové Real-time PCR desce μΐ cDNA jsou napipetovány do sterilní Real-time PCR desky dle náčrtu. Dále je přidán TaqMan® PCR Master Mix obsahující 0,25 μΐ DNA polymerázy o koncentraci 5U/pl, 5 μΐ směsi oligonukleotidů o koncentraci 2,5 mM, 5 μΐ pufru obsahujícího MgCh o konečné koncentraci 5,5mM; 0,4 μΐ jednotlivých primerů a sond o koncentraci 10 μΜ. Objem každé reakce je doplněn destilovanou vodou do 25 μΐ.

Vlastní RT-PCR probíhá v Real-time termocykleru Lightcycler480 (Roche). První část reakce probíhá 10 minut při 95 °C. Následovalo 40 cyklů, každý obsahoval dva kroky: 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C.

Výsledné C_t hodnoty jednotlivých virů ve vzorcích byly porovnány vůči zprůměrovaným hodnotám C_t, hodnot mRNA referenčních genů pšenice. Titr jednotlivých virů byl porovnán v jednotlivých skupinách.

-3CZ 32308 UI

Takto lze testovat materiál jak na šlechtitelských stanicích, tak rostliny z polních odběrů nebo laboratorních izolátů. Protože virovou infekci nelze nijak léčit, je jedinou ochranou proti virovým chorobám obilnin použití rezistentních odrůd nebo preventivní kroky zabraňující dalšímu šíření viróz včetně včasné detekce.

Průmyslová využitelnost

Reakční směsi pro současnou detekci a kvantifikaci normalizačních genů pšenice a ječmene je možno dodávat laboratořím zabývajícím se ochranou proti rostlinným patogenům jako detekční a kvantifikaění kit k okamžitému použití (ready - to use). Uživateli pak stačí pouze přidat svůj vzorek testované cDNA a provést reakci dle přesně stanovených podmínek.

Claims (1)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Reakční směs pro současnou detekci a kvantifikaci RNA tří referenčních genů ječmene a pšenice pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase, vyznačující se tím, že reakční směs obsahuje 4 μΐ vzorku testované cDNA; TaqMan PCR Master Mix, který obsahuje 0,25 μΐ DNA polymerázy o koncentraci 5 U/μΙ, 5 μΐ směsi oligonukleotidů o koncentraci 2,5 mM, 5 μΐ pufru obsahujícího MgC12 o konečné koncentraci 5,5mM; 2,4 pL specifických primerů o původní koncentraci 10μΜ pro detekci TUBA, TUBB a GAPDH pro ječmen a TUBA, TUBB a EIF4a pro pšenici, konkrétně

   0,4 μΐ primerů TUBA-R o sekvenci 5’-GGCACGCTTGGCGTACAT-3’,

   0,4 μΐ primerů TUBA-F o sekvenci 5’-CCAGCGTCGTCGAGGTCTTCTC-3‘,

   0,4 μΐ primerů TUBB-R o sekvenci 5’- GTCGTTCATGTTGCTCTC-3‘,

   0,4 μΐ primerů TUBB-F o sekvenci 5’-CCTTCTTGCACTGGTACA-3’,

   0,4 μΐ primerů GapB-R o sekvenci 5’-CTGCTGTCACCAACGAAG-3’,

   0,4 μΐ primerů GapB-F o sekvenci 5’-TTGTTGATCTCACTGTTAGAACC-3’,

   0,4 μΐ primerů EIF4a-R o sekvenci 5’-GGGAGGTCATAGTTGATG-3’,

   0,4 μΐ primerů EIF4a-F o sekvenci 5’-GGAGTTCAGATCAGGTTC-3’;

   1,2 μΐ specifických sond o původní koncentraci 10μΜ pro detekci TUBA, TUBB a GAPDH pro ječmen a TUBA, TUBB a EIF4a pro pšenici, konkrétně

   0,4 μΐ sondy TUBB-Taq o sekvenci 5’-FAM-CGGTGAACTCCATCTCGTCCA-BHQl-3’,

   0,4 μΐ sondy EIF4a-Taq o sekvenci 5’-HEX-CATCAATACCACGAGCAAGCAGG-BHQl-3’, 0,4 μΐ sondy GapB-Taq o sekvenci 5’-HEX-ACATCAAGAAGGCTATCAAGGCTGCTTCC-BHQ1-3’,

   0,4 μΐ sondy TUBA-Taq o sekvenci 5’-Cy5-CGCATCGACCACAAGTTTGACCT-BHQ2-3’; a destilovaná voda doplňující reakční směs do konečného objemu 25 μΐ.