CZ2013456A3 - Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu - Google Patents
Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2013456A3 CZ2013456A3 CZ2013-456A CZ2013456A CZ2013456A3 CZ 2013456 A3 CZ2013456 A3 CZ 2013456A3 CZ 2013456 A CZ2013456 A CZ 2013456A CZ 2013456 A3 CZ2013456 A3 CZ 2013456A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- membrane
- absorbent material
- filter membrane
- sporadic
- Prior art date
Links
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 97
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims abstract description 42
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims abstract description 42
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 42
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 39
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims description 60
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 34
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 14
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 13
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 claims description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 7
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 7
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 210000005168 endometrial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 48
- 206010063045 Effusion Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 abstract description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 3
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 206010014522 Embolism venous Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010055114 Colon cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- NVTRPRFAWJGJAJ-UHFFFAOYSA-L EDTA monocalcium salt Chemical compound [Ca+2].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O NVTRPRFAWJGJAJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001296119 Panteles Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010029107 Respiratory Tract Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- -1 e.g. Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000000607 neurosecretory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000000574 retroperitoneal space Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000000251 trophoblastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/04—Cell isolation or sorting
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
Abstract
Způsob šetrné separace sporadických buněk z tělních tekutin, jako z krve, z maligních výpotků, bronchoalveolární laváže, peritoneální laváže a amniocentické tekutiny, je založený na filtraci přes filtrační membránu (1). Způsobem je možno izolovat např. cirkulující a diseminované nádorové buňky, buňky endometriální a cirkulující buňky trofoblastu, což umožní jejich následnou detekci, kvantifikaci a zejména kultivaci. Zařízení obsahuje filtrační membránu (1), na kterou bezprostředně přiléhá absorpční materiál (2), shora a zdola otevřený dutý zásobník (3), kde dolní obvod zásobníku (3) shora přiléhá alespoň na část membrány (1). Absorpční materiál (2) je umístěn v nádobě (4) opatřené horním víčkem (5), do kterého zasahuje obvodový držák (6), který pomocí přítlačného kroužku (7) drží membránu (1) po jejím obvodu.
Description
Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu
Oblast techniky
Předkládaný vynález představuje způsob šetrné separace sporadických buněk (rare cells) z tělních tekutin, jako z krve, z maligních výpotků (ascity, pleurální výpotek), bronchoalveolární laváže, peritoneální laváže a amniocentické tekutiny. Způsobem je možno izolovat např. cirkulující (CTC, circulating tumor cells) a diseminované nádorové buňky (DTC, disseminated tumor cells), buňky endometriální a cirkulující buňky trofoblastu (CFTC, circulating fetal trophoblast cells), což umožní jejich následnou detekci, kvantifikaci a zejména kultivaci.
Dosavadní stav techniky
Metastatické léze jsou nejčastější příčinou úmrtí u pacientů s karcinomy (Birchmeier 1996). Během procesu metastazování se nádorové buňky odpoutají od primárního tumoru a vstupují do krevního oběhu přímo nebo prostřednictvím lymfatického systému, migrují do sekundárních orgánů a vytváří zde metastatická ložiska. Detekce CTC je u pacientů s metastazujícími karcinomy spojena s horší prognózou (Zharo 2011, Zhang 2012, Wang 2011).
Přes jejich velký klinický význam chybí molekulární charakterizace CTC. Toto může být přičítáno extrémně nízké frekvenci CTC v porovnání s počtem krevních elementů. CTC jsou generovány epidermálněmezenchymální tranzicí (EMT), procesem charakterizovaným sníženou expresí epiteliálních markérů a zvýšenou expresí mezenchymálních markérů. Tyto změny podporují zvýšenou motilitu, invazivitu a odolnost vůči terapii nádorové buňky (Thiery 2002, Shook 2003, Christofori 2006, Jechlinger 2003). CTC/DTC představují populaci nádorových buněk šířených do vzdálených orgánů s možností následného vzniku mikro- a makrometastatických ložisek. Část nádorových buněk z primárních tumorů a/nebo CTC a DTC má vlastnosti kmenových buněk (CSC, cancer stem cells). Populace nádorových kmenových buněk má schopnost vlastní obnovy a svědčí o populaci rezistentní na léčbu s horší prognózou.
CTC/CSC mají obrovský potenciál v diagnostice, stanovení prognózy, monitorování onemocnění, terapeutického účinku a rizika (Maní 2008).
Časné šíření nádoru do lymfatických uzlin a krevní cestou je realizováno cirkulujícími nádorovými buňkami (CTC) a diseminovanými nádorovými buňkami (DTC). Bylo popsáno, že CTC se mohou u pacienta vyskytovat také následkem resekce primárního tumoru, takže k jejich uvolňování dochází manipulací s primárním nádorem.
Detekce CTC je nesporně prognostickým faktorem nádorového onemocnění. Detekce CTC může být potenciálně použita ke stanovení diagnózy, jako alternativa k invazivní biopsii, pro včasnou detekci metastatického šíření nádoru, a pro stanovování a monitorování efektivity terapie u jednotlivých pacientů. Množství a vlastnosti CTC mohou být prognostickým faktorem přežití, nebo prediktivním faktorem reakce na terapii. Dlouhodobé charakterizace CTC mohou poskytnout příležitost lépe posoudit dynamickou fyziologickou odpověď na léčbu. Rovněž změny v počtu CTC, předcházející změně nálezu při zobrazovacích metodách, naznačují, že analýza CTC může být významnější pro zhodnocení přežití než zobrazovací metody.
Obecně platné jsou důkazy o nepříznivé prognostické hodnotě CTC detekovaných u metastazujícího karcinomu tlustého střeva, karcinomu prostaty, karcinomu ovaria, karcinomu mléčné žlázy. Existují také studie týkající se významu CTC u vzniku žilního tromboembolismu. U pacientů s metastatickým karcinomem mléčné žlázy a detekovaným množstvím > 1 CTC v periferní krvi byl zaznamenán až čtyřikrát vyšší výskyt trombózy ve srovnání s pacienty bez výskytu CTC (Mego 2009). CTC by mohly být zapojeny do aktivace koagulace prostřednictvím exprese a uvolnění tkáňových faktorů (Davila 2008). CTC se vyskytují v krvi ve velmi malém množství přibližně jedné buňky na deset miliard krevních buněk (Pantel 2001, Ziegelschmidt 2005).
Současné dostupné technologie používají různé metody detekce CTC: separace za pomocí hustotního gradientu, imunomagnetické separace, a imunomagnetické gradientově separace. Tyto metody jsou specifické a k buňkám šetrnější než tlakové filtrační metody, ale při vazbě na protilátku dochází k interakci s receptory a antigeny na buněčné membráně, tudíž je obtížné vyselektovat autentické a životaschopné CTC/DTC.
Přítomnost sporadických buněk může být rovněž detekována nepřímo pomocí RT-PCR, ale tento přístup je často omezován nízkou expresí nádorově specifických markérů a nespecifitou antigenů typických pro CTC a DTC (Andreopoulou 2012). Navíc byla prokázána vysoká míra nesouladu v expresi povrchových antigenů mezi primárními nádory a CTC/DTC, což naznačuje velkou nespolehlivost při užití těchto markérů při separaci CTC/DTC.
Vzhledem k tomu, že velikost separovaných sporadických buněk CTC u většiny epiteliálních nádorů je mnohem vetší než velikost krevních buněk, je jeden z velmi účinných způsobů separace CTC založený na principu filtrace přes filtrační membránu, kdy separované buňky zůstávají na membráně a ostatní buňky prochází přes membránu (Paterlini-Brechot et al. 2007, Vona 2000). Metodou separace založenou na velikosti je možno detekovat a separovat CTC/DTC bez závislosti na povrchových antigenech a receptorech, jejichž exprese se během nádorového onemocnění mění.
Používané filtrační metody zahrnují filtraci urychlenou tlakem nebo vakuem (Mikulova, 2011); filtrační gradient je tedy vytvářen změnou tlaku. Společnou nevýhodou filtračních metod je, že dochází ke hromadění sraženin a srážení na filtrační membráně s ucpáváním filtru, což vede k zachycování krevních elementů ve sraženině. Sraženina a krevní elementy pak značně zhoršují hodnotitelnost přítomnosti sporadických buněk na filtru pod mikroskopem. Zachycené krevní elementy lze sice částečně odstranit promytím, sraženina však na filtru zůstává. Z tohoto důvodu je nutné přidávat další antikoagulační činidla i ve filtračním zařízení (nejen ve zkumavce při odběru). Zásadní nevýhodou, stejně jako u většiny jiných metod, je poškození životaschopnosti buněk, takže buňky se zpravidla dále nedělí a po izolaci není možná jejich následná kultivace.
Všechny v současnosti používané metody mají i různé další nevýhody, např. vyžadují pro analýzu velké objemy krve, velký podíl laboratorní práce, časovou náročnost vyhodnocování (zpracování vzorků trvá několik hodin), nebo jsou finančně nákladná používaná zařízení a reagencie, a/nebo metody postrádají spolehlivost, senzitivitu, efektivitu, specificitu a standardizaci nezbytnou pro rutinní detekční metody CTC a DTC.
Bylo by tedy potřeba mít k dispozici způsob separace buněk, zejména sporadických buněk z tělních tekutin, který je reprodukovatelný, vykazuje dobrou hodnotitelnost přítomnosti sporadických buněk na filtru pod mikroskopem, je nenáročný na dobu zpracování, zařízení a obsluhující personál, nenákladný i při nižším počtu vzorků, a který by nevyžadoval drahé reagencie s omezenou exspirací. Při způsobu separace by nemělo docházet k interakci s receptory a antigeny, a měl by být šetrný vůči buňkám, aby bylo možno vyselektovat autentické a životaschopné buňky jako CTC/DTC, a tyto dále použít v experimentech in vitro a případně in vivo.
Dále je zapotřebí výrobně jednoduché zařízení pro reprodukovatelné provádění tohoto způsobu, které bude cenově dostupné pro každou laboratoř, bude vyhovovat pro sterilní práci s potenciálně patologickým materiálem, bude poskytovat možnost následné detekce a/nebo kvantifikace a/nebo kultivace separovaných buněk na filtrační membráně, a které může být ve variantě pro jednorázové nebo opakované použití.
Podstata vynálezu
Nedostatky dosavadního stavu techniky odstraňuje a vytyčené požadavky splňuje způsob separace sporadických buněk a zařízení na separaci sporadických buněk z tělních tekutin lidských i zvířecích organismů dle předmětného vynálezu využívající filtrační membránu, na kterou bezprostředně přiléhá absorpční materiál.
Bylo zjištěno, že na rozdíl od tlakové/podtlakové filtrace při použití způsobu využívajícího kapilárních sil (vzlínavosti) dochází v průběhu 5 filtrace ke srážení proteinů z tělních tekutin jako je krev nebo krevní plazma v minimální míře, takže kromě antikoagulantu (EDTA) přidávaných ve zkumavce při běžném odběru se nemusí přidávat další antikoagulační činidlo. Pokud je již sraženina v tělní tekutině přítomná, postačuje naředění malým množstvím pufru jako je PBS. V důsledku toho se 10 neucpává filtrační membrána (zejména na počátku filtrace, jak se běžně stává u tlakové/podtlakové filtrace) a separace je plynulejší a úplná.
Nižší množství sraženiny je spojeno s nižším množstvím krevních elementů, jako červených krvinek, zachycených v této sraženině, přičemž platí, že jak samotná sraženina, tak krevní elementy znesnadňují 15 vyhodnocení přítomnosti sporadických buněk na filtru. Je zřejmé, že klíčové je právě kvalitní vyhodnocení přítomnosti sporadických buněk; čas potřebný k přefiltrování lze poměrně snadno nastavit velikostí použité filtrační plochy, tj. plochy membrány a absorpčního materiálu.
Navíc bylo zjištěno, že sporadické buňky zachycené na membráně 20 zůstávají mechanicky i chemicky nezměněné a tedy životaschopné, takže mohou být následně efektivně kultivovány, co je z pohledu současných výsledků vědy pomocí jiných metod neproveditelné
Dále bylo zjištěno, že pro naředění tělní tekutiny, popřípadě promytí sporadických buněk na filtru, lze použít pro další zvýšení úspěšnosti 25 separace (a také kultivace, pokud je cílem sporadické buňky dále kultivovat) přímo kultivační médium jako je RPMI, přičemž rychlost separace na filtrační membráně stejně jako životaschopnost buněk zůstanou zachovány.
Filtrovaná tělesná tekutina prostá sporadických buněk přechází 30 přes otvory ve filtrační membráně, kde se zachycují elementy větší než otvory ve filtrační membráně (obvyklá velikost krevních elementů je do 6 gm a sporadických buněk nad 10 μιτι). Separované sporadické buňky uvíznou v důsledku jejich velikosti na filtrační membráně, která poté může být oddělena od absorpčního materiálu, přičemž je membrána stále upevněná v držáku. V jiném provedení je následně možné membránu od držáku úplně oddělit.
Přestup tělesné tekutiny, prosté sporadických buněk, přes membránu je plynule akcelerován vzlínavou silou, kterou je tekutina nasávána do absorpčního materiálu. Při filtraci není na filtrovanou tělesnou tekutinu vytvářen žádný tlak před filtrem a není rovněž používáno podtlaku za filtrem (vakua). Tekutina je pouze vzlínavou silou nasávána, 10 bez potřeby jakékoli regulace, vhodnou rychlostí přes filtr do absorpčního materiálu. (V této souvislosti se neuvažuje případný hydrostatický tlak vyvolaný na filtr sloupcem tělesné tekutiny). Velikost vzlínavé síly způsobuje kontinuální filtrování kapaliny, aniž by došlo k srážení před nebo na filtrační membráně, jak je často pozorováno například u metod 15 využívajících podtlak za filtrem nebo přetlaku před filtrem.
Výhodou řešení podle vynálezu je mj. vysoká efektivita v zachycování i nízce koncentrovaných sporadických buněk a urychlení separačního procesu a tím i rychlosti detekce a zvýšení efektivity kultivace. Při použití způsobu podle vynálezu nedochází k interakci 20 sporadických buněk s receptory a antigeny, a je tedy možno vyselektovat autentické a životaschopné CTC/DTC a tyto dále použít v experimentech in vitro a následně in vivo. Způsob umožňuje filtrované buňky udržet ve velmi dobrém vitálním stavu pro další analýzy. V běžné laboratoři není potřeba žádné zvláštní vybavení. Způsob umožňuje zpracování relativně 25 velkého objemu krve nebo jiné tělesné tekutiny (např. 50 ml).
Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob separace sporadických buněk přítomných v tělní tekutině pacienta jejich zachycením na filtrační membráně s otvory menšími než je průměr buněk, při kterém se ze směsi 30 sporadických buněk přítomných v tělní tekutině na první straně membrány přes membránu nasává zfiltrovaná tělní tekutina prostá sporadických buněk působením kapilárních sil do absorpčního materiálu bezprostředně přiléhajícího k druhé straně membrány.
Sporadickými buňkami přítomnými v tělní tekutině jsou například cirkulující nádorové buňky, diseminované nádorové buňky, endometriální buňky a cirkulující fetální buňky trofoblastu.
Tělní tekutina je jakákoli tekutina získaná přímo (odběrem) nebo nepřímo (tedy s následnými úpravami jakéhokoli typu) z těla člověka nebo zvířete. S výhodou je vybrána ze skupiny periferní nebo centrální krev, kostní dřeň, ascitická tekutina, pleurální výpotek, peritoneální laváž a amniocentická tekutina.
Testovaným objektem může být zejména pacient s primárně 10 detekovaným nádorovým onemocněním nebo s onemocněním metastatickým.
Testovaný vzorek může být úspěšně odebrán i zvířeti, které je schváleným experimentálním metastatickým modelem.
Periferní krví je v dalším provedení odebraná nesrážlivá periferní 15 krev, např. krev odebraná do běžné odběrové zkumavky s antikoagulantem jako je EDTA.
Jestliže tělní tekutina již před separací obsahuje sraženiny, výhodně se pro rozpuštění sraženiny a usnadnění filtrace/separace ředí vhodným pufrem, jako je PBS (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem) a/nebo 20 TrypLE™.
Vynález ovšem nevylučuje ani použití známých způsobů pro prevenci vytváření krevních sraženin, které vznikly při odběru krve. Příkladem je postupné nanášení a případně enzymatické rozpouštění (např. pomocí TrypLE™, Invitrogen), ale výhodně se rozpouštění 25 nepoužívá.
V případě přítomnosti krevních sraženin je také možné pro zlepšení filtrace navíc periferní krev naředit roztokem PBS nebo kultivačním médiem. Krev, popř. jiná tělní tekutina mohou být také pro odstranění sraženin a jiných hrubých nečistot před separací filtrovány přes sítko o 30 velkosti otvorů např. 0,1 mm, které se potom několikrát promyje PBS. Pak se nanese zbytkový objem krve. Závěrem se krevní zkumavka vypláchne PBS, jehož objem se přefiltruje přes sítko.
Separované sporadické buňky mohou být pro zlepšení mikroskopické hodnotitelnosti na filtru promyty, např. pufrem jako PBS nebo médiem jako RPMI. Proti vakuové filtraci se při tomto kroku dosahuje způsobem podle vynálezu podstatného zlepšení ve všech ohledech.
Separované buňky mohou pak být dále analyzovány např. mikroskopicky, výhodně po imunohistochemickém nebo jiném barvení, kvantifikovány (např. mikroskopicky ručně nebo automaticky), případně kultivovány nebo jinak zpracovány. V jiných provedeních se následně po separaci provede detekce a/nebo kvantifikace a/nebo kultivace separovaných buněk přímo na filtrační membráně nebo v kultivační nádobě.
Filtry se sporadickými buňkami mohou být pro pozdější analýzu také delší dobu uchovávány ve zmrazeném stavu, sušené nebo fixované obvyklými způsoby používanými v oboru.
Jak již bylo uvedeno, zejména v případě, kdy se předpokládá následná kultivace sporadických buněk, se tělní tekutina před separací může ředit přímo kultivačním médiem použitým při následné kultivaci separovaných buněk, jako je např. médium RPMI, čímž se dále zvýší úspěšnost filtrace a následně také kultivace.
Následná kultivace sporadických buněk se může provádět obvyklým způsobem v inkubátoru při teplotě 37 °C a 5% CO2, v běžné kultivační misce nebo lahvi z plastu nebo skla po spláchnutí buněk z filtru. Ktomu účelu se např. filtr opláchne 2 x 1 ml média RPMI a médium s buňkami se přenese do 24 jamkové destičky, kde se buňky mohou kultivovat přímo na ploše plastové desky nebo na vloženém mikroskopickém krycím sklíčku. Kultivace na sklíčku je preferována v případě, že je zájem o imunohistochemickou a imunofluorescenční analýzu buněk.
Kultivace se výhodně provádí vložením filtru se zachycenými buňkami do kultivačního média v kultivační misce nebo přilitím kultivačního média k filtru se zachycenými buňkami vloženému v kultivační misce.
V dalším výhodném provedení se kultivace provádí přenesením membránového filtru upevněného v držáku, popsaném níže, bezprostředně po separaci například do 6-jamkové kultivační desky s růstovým médiem přidaným v jamce. Buňky je možné následně kultivovat jako běžnou tkáňovou kulturu.
Tělní tekutinou je v jednom provedení vynálezu tělní tekutina pacientů s melanomem; karcinomem prsu; nádory gastrointestinálního traktu jako je karcinom žaludku, tlustého střeva, pankreatu a jater; urogenitálními tumory a tumory měkkých tkání jako nádory hlavy a krku; a jinými solidními tumory.
Způsob a zařízení podle vynálezu jsou využitelné například pro cirkulující nádorové buňky CTC z periferní nebo centrální krve, buňky nádorů gastrointestinálního traktu (jícnu, žaludku, tlustého a tenkého střeva, jater, pankreatu, žlučníku a žlučových cest), nádorů urogenitálního systému ovaria, endometria, prostaty, močového měchýře, varlat), nádorů respiračního systému (nádory plic, mediastina, horních cest dýchacích), nádorů neuroendokrinního systému, nádorů kostí, nádorů hlavy a krku, nádorů mléčné žlázy, metastatických nádorů bez primární lokalizace a jiných méně častých solidních nádorů.
Způsob a zařízení podle vynálezu jsou dále využitelné pro vybraná onemocnění krvetvorby, neuroendokrinní tumory, diseminované nádorové buňky z ascitu, pleurálního výpotku, sputa, z laváží (bronchoalveolární laváže, laváží peritoneální a hrudní dutiny, retroperitonea apod.), pro cirkulující a diseminované endometriální buňky (z krve a z laváží).
Významné využití se týká také separace cirkulujících fetálních buněk trofoblastu (CFTC) z krve, popř. amniocentické tekutiny, neboť CFTC jsou přítomny v periferní krvi matky od 5. týdne gestace a po ukončení těhotenství v krevním oběhu nepřetrvávají (Bianchi et al., 1996). Pro neinvazivní prenatální diagnostiku (NI-PND) jsou tedy CFTC velmi atraktivním zdrojem DNA/RNA k vyšetření. Porovnáním testů založených na CFTC a choriocentéze se potvrdila 100% diagnostická senzitivita i specificita pro testování na bázi CFTC. Základní vlastností, kterou se CFTC buňky liší od buněk krevních je jejich velikost (CFTC buňky dosahují standardně velikosti 10 pm a více). Aktuální práce uvádějí, že u těhotné ženy je s 99% pravděpodobností každá buňka nad 15μΜ embryonálního původu, čili CFTC (Mouawia, 2012). Díky předkládané nové metodologii je možné reprodukovatelně separovat nepoškozené 5 CFTC a využít je pro další analýzy.
Může se provádět detekce CTC a DTC u zvířecích nádorových modelů a je možná detekce CTC/DTC u jedinců s více než jedním typem nádoru.
Buňky mohou být po separaci zpracovány imunohistochemickými 10 metodami i jednobuněčnými (single cell) metodami pro genovou expresi.
Předmětem vynálezu je dále zařízení pro provádění separace směsi sporadických buněk přítomných v tělní tekutině pacienta způsoby popsanými výše, které obsahuje filtrační membránu, ke které 15 bezprostředně přiléhá absorpční materiál.
Geometrie membrány obecně zahrnuje velikost, tvar a hustotu otvorů na membráně. Účinnost membránového filtru může být tedy optimalizována úpravou velikosti, tvaru a hustoty otvorů na membráně. Volí se taková konstrukce membrány, která upřednostňuje zachycení 20 nádorových a sporadických buněk před buňkami krevními. Filtrační membrána je taková membrána, která zachytí sporadické buňky o rozměrech kolem 10 pm a propouští krevní elementy s velikostí do 6 pm, tedy s velikostí pórů 7-10 pm, např. 8 pm nebo obdobná hodnota např. v rozmezí ± 1 pm deklarovaná výrobcem. Filtrační membrána je vhodně 25 vyrobena z biologicky kompatibilního materiálu, např. polykarbonátu, který nabízí výhody flexibility i biokompatibility.
Minimalizace vlivu sraženin a zvýšení rychlosti filtrace je dále možné dosáhnout použitím většího filtru a využitím co největší dostupné filtrační plochy. Použitelné jsou například membrány z polykarbonátu 30 s velikostí pórů 8 pm o průměru 25 mm.
Termínem „bezprostředně přiléhá“ se rozumí tak těsný kontakt filtrační membrány a absorpčního materiálu, že není narušeno kapilární vzlínání přes membránu do absorpčního materiálu, tedy zejména při provozu je zabráněno přístupu vzduchu do rozhraní mezi membránou a absorpčním materiálem, který je tak s filtrovanou kapalinou ve styku pouze přes otvory v membráně. To lze dosáhnout např. přimáčknutím okraje membrány, popř. upnutého do vhodného zařízení, k povrchu absorpčního materiálu, nebo vmáčknutím okraje membrány upevněného v držáku mírným tlakem do pružného povrchu absorpčního materiálu.
Absorpční materiál má dostatečnou absorpční schopnost a je schopen plynule absorbovat i všechny krevní a jiné elementy nacházející se ve filtrované tělní tekutině různé viskozity, a zejména je tvořen buničinou, jemným papírem, textilními vlákny nebo jejich kombinací.
Objem přefiltrované tělní tekutiny je limitován nasávací kapacitou absorpčního materiálu a jeho objemem. Velikost zařízení a/nebo objem a vlastnosti absorpčního materiálu mohou být proto přizpůsobeny zamýšlenému použití. Výhodně je pomocí jednoho zařízení možné zfiltrovat objemy tekutin 50 ml i více. Způsob a zařízení fungují již od minimálního objemu krve, jako méně než 1 ml, ovšem se zvětšujícím se objemem přefiltrované tělní tekutiny stoupá pravděpodobnost záchytu sporadických buněk.
Zařízení podle vynálezu dále výhodně obsahuje shora a zdola otevřený dutý zásobník pro pojmutí směsi sporadických buněk přítomných v tělní tekutině, kde dolní obvod zásobníku těsně shora přiléhá na alespoň část první strany membrány, a kde k alespoň části druhé strany membrány zdola bezprostředně přiléhá absorpční materiál, takže membrána odděluje vnitřní prostor zásobníku od absorpčního materiálu. Horní okraj zásobníku může být ve výhodném provedení rozšířen za získání nálevky a/nebo může být opatřen sítkem pro odstranění sraženin již přítomných v krvi apod.
Z výše uvedeného důvodu dosažení maximální filtrační plochy leží uvedená alespoň část první strany membrány a uvedená alespoň část druhé strany membrány co největší plochou proti sobě, tedy je dosaženo co největší styčné plochy směsi sporadických buněk přítomných v tělní tekutině a absorpčního materiálu, ovšem oddělených membránou.
V dalším provedení je absorpční materiál umístěn v jímací podstavné nádobě opatřené horním víčkem, do kterého shora rozebíratelně zasahuje obvodový držák membrány, který pomocí přítlačného kroužku těsně rozebíratelně nebo nerozebíratelně drží membránu po jejím obvodu, a na držák je po jeho obvodu shora těsně upevnitelný zásobník. Zařízení je nejvýhodněji v provedení pro jednorázové použití, není ale vyloučeno ani provedení zařízení pro opakované použití všech prvků kromě membrány a absorpčního materiálu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje jedno provedení filtračního zařízení ve dvou pohledech z boku
Obr. 2 znázorňuje provedení filtračního zařízení v rozloženém stavu (absorpční materiál není ukázán)
Obr. 3 znázorňuje jedno provedení upevnění membrány v držáku
Obr. 4 znázorňuje in vitro kulturu CTC buněk separovaných z periferní krve pacienta s karcinomem prostaty narostlých na membránovém filtru Obr. 5 znázorňuje in vitro kulturu CTC buněk na filtru, barvených MayGrůnwaldovou metodou a analyzovaných jako hematologické krevní nátěry
Obr. 6 znázorňuje zpracování separovaných buněk imunohistochemickými metodami (CTC izolované z krve pacienta s karcinomem prostaty barvené protilátkou vůči pan-cytokeratinu)
Obr. 7 znázorňuje dvojici separovaných CTC, které v průběhu kultivace prorostly filtrem na spodní část kultivační jamky (barveno MayGrůnwaldovou metodou).
Příklady provedení vynálezu
Vysvětlení zkratek:
CTC cirkulující nádorová buňka
DTC diseminovaná nádorová buňka
CFTC cirkulující fetální buňky trofoblastu
NI-PND neinvazivní prenatální diagnostika
PBS fosfátový roztok s 0,15M NaCl, v podstatě pufrovaný fyziologický roztok
FBS fetální bovinní sérum
EDTA Chelaton 2, kyselina ethylendiamintetraoctová
Příklad 1
Stanovení cirkulujících nádorových buněk u karcinomu prostaty z periferní krve u pacientů podstupujících chirurgické odstranění primárního tumoru
5-10 ml periferní krve se odebere během chirurgického výkonu do zkumavky s EDTA (např. Vacuette K3E (REF 456036), S-Monovette K3E (REF 02,1066,001). Krev se zpracuje okamžitě nebo se uskladní při 4°C maximálně 24 h.
Periferní krev se postupně nanese pipetou do zásobníku 3 zařízení pro provádění filtrace. Krev přítomná na první straně membrány 1 se filtruje přes filtrační membránu 1 o průměru 25 mm tvořenou polykarbonátovou membránou (PCTE) s velikostí pórů 8 mikrometrů (GE, Polycarbonate, 8.0 Micron, 25mm), přičemž na filtrační membránu 1 těsně bezprostředně přiléhá absorpční materiál 2, buničina (Pur-Zellin, Hartmann). Filtrační proces trvá v závislosti na filtrovaném objemu krve a její hustotě ca 5 min.
Dále je možné postupovat několika způsoby.
1. Po provedení filtrace se filtrační membrána 1 upevněná v držáku 6 obsahující izolované CTC přenese do jedné jamky 6-jamkové kultivační destičky, kde se do jamek přidá růstové medium RPMI (4 ml, RPMI (R8758 Sigma), obohacené o FBS (F2442, Sigma) a antibiotika (Penicilin-Streptomycin (P4458, Sigma), Amphotericin (A2942), Sigma). Buňky se následně kultivují jako běžná tkáňová kultura min. 14 dnů, při teplotě 37 °C, v atmosféře 5% CO2, s výměnou média každé 3 dny.
Narostlá kultura buněk byla barvena standardním protokolem MayGrůnwaldova imunohistochemického barvení a fotografie ze světelného invertovaného mikroskopu je ukázána na obr. 4.
V obdobném uspořádání je na obr. 5 ukázána varianta imunofluorescenčního barvení CTC u karcinomu prostaty (pancytokeratin- FITC, Sigma), překryto Prolong Gold™ s DAPI).
2. Po provedení filtrace se filtrační membrána 1 obsahující izolované CTC opláchne 1 ml média, médium s buňkami z filtru se pak přenese do 24-jamkové destičky, kde je na dně jamky umístěno mikroskopické sklíčko (Assistent, N.1001, průměr 12 mm). Buňky poté rostou přímo na mikroskopickém skle, které usnadňuje další manipulaci při imunohistochemickém barvení a následné imunohistochemické analýze, min. 14 dnů, při teplotě 37 °C, v atmosféře 5% CO2, s výměnou média každé 3 dny.
3. Po provedení filtrace se filtrační membrána obsahující izolované CTC opláchne 1 ml média, médium s buňkami z filtru se pak přenese pipetou do kultivačních komůrek (Nunc® LabTek® Chamber Slide™ (4 komůrky) pro účely konfokální mikroskopie (systém pro zachytávání videa v reálném čase Time -lapse imaging, Leica) a následně kultivují jako běžná tkáňová kultura min. 14 dnů, při teplotě 37 °C, v atmosféře 5% CO2, s výměnou média každé 3 dny.
Ve všech předcházejících případech probíhaly kultivace sporadických buněk na membráně i buněk smytých z membrány bez problémů. Stejně tak probíhají bez problémů i kultivace buněk z jiných typů nádorů izolovaných způsobem podle vynálezu. Naopak kultivace sporadických buněk separovaných z tělních tekutin pacientů s použitím způsobů známých ze stavu techniky na membráně i bez membrány nebyly dosud doloženy.
4. Po provedení filtrace a promytí sporadických buněk zachycených na filtru 2 ml RPMI se filtrační membrána 1 upevněná v držáku 6 obsahující izolované CTC přímo barví standardním protokolem May-Grůnwaldova barvení a přítomnost sporadických buněk vyhodnocuje pod mikroskopem.
Příklad 2
Stanovení diseminovanych nádorových buněk u metastatického onemocnění karcinomu ovaria z pleurálního vypotku
Diseminované nádorové buňky z pleurálního výpotku odebraného pacientce s metastatickým onemocněním karcinomu ovaria byly separovány následovně: výpotek byl nanesen pipetou do zásobníku 3 zařízení pro provádění filtrace. Výpotek na první straně membrány 1 se filtruje přes filtrační membránu 1 o průměru 25 mm tvořenou polykarbonátovou membránou (PCTE) s velikostí pórů 8 mikrometrů jako z příkladu 1, přičemž na filtrační membránu 1 těsně bezprostředně přiléhá absorpční materiál 2, buničina (Pur-Zellin, Hartmann). Buňky byly fixovány na filtru a analyzovány jako hematologické krevní nátěry, barveny MayGrůnwaldovým barvením a analyzovány pod mikroskopem
Příklad 3
Zařízení pro provádění filtrace
Jedno provedení zařízení pro provádění filtrace ukázané na obr. 1-3 obsahuje polykarbonátovou filtrační membránu 1, s velikostí pórů 8 pm, ke které zdola bezprostředně přiléhá absorpční materiál 2 tvořený buničinou. Zařízení dále obsahuje shora a zdola otevřený dutý zásobník 3 pro pojmutí směsi sporadických buněk přítomných v tělní tekutině. Pro snadnější nalití tekutiny je horní okraj zásobníku 3 rozšířený, takže tvoří nálevku. Dolní obvod zásobníku 3 těsně shora přiléhá k první horní straně membrány 1, a ke druhé spodní strany membrány 1 zdola bezprostředně přiléhá absorpční materiál 2, takže membrána 1 odděluje vnitřní prostor zásobníku 3 od absorpčního materiálu 2.
Absorpční materiál 2 je umístěn v podstavné nádobě 4 opatřené horním víčkem 5, do kterého shora rozebíratelně zasahuje obvodový držák 6 filtrační membrány 1_. Držák 6 je vůči víčku 5 a tedy i absorpčnímu materiálu 2 vertikálně posuvný, čímž se umožní bezprostřední přilehnutí filtrační membrány 1 k absorpčnímu materiálu 2, popř. zamáčknutí 10 přítlačného kroužku 7 do absorpčního materiálu 2 pro dokonalý kontakt membrány 1 a absorpčního materiálu 2. Držák 6 pomocí přítlačného kroužku 7 těsně rozebíratelně pomocí závitu drží membránu 1 po jejím obvodu, takže sestavu držáku 6, filtrační membrány 1 a přítlačného kroužku 7 lze ze zařízení vyjmout jako celek a zachycené buňky přímo na 15 membráně barvit nebo kultivovat. Na držák 6 je po jeho obvodu shora pomocí bajonetového spoje těsně upevnitelný zásobník 3.
Příklad 4
Porovnání dvou druhů filtrační technologie z hlediska přítomnosti sraženiny
Cílem experimentu bylo porovnání filtrace krve s obsahem sporadických buněk urychlované vakuem s filtrací použitím vzlínavé síly podle vynálezu z hlediska hodnotitelnosti přítomnosti sporadických buněk zachycených na filtrační membráně, která závisí zejména na přítomnosti sraženiny a 25 zbytkových krevních elementů na filtrační membráně.
Oba postupy pracují s membránou s deklarovanou velikostí pórů 7-8 pm a absorpčním materiálem jako v příkladu 1. Aby bylo dosaženo přibližně srovnatelné doby filtrace, byly použity různé velikosti filtru - průměr filtru 7 mm u vakuové filtrace a průměr filtru 25 mm u filtrace použitím vzlínavé 30 síly.
Přes oba membránové systémy byl při laboratorní teplotě filtrován stejný objem 2 ml krve získané jako v příkladu 1 pacienta s karcinomem prostaty, přičemž doba filtrace byla u vakuového systému 87 s a u filtrace s použitím vzlínavé síly podle vynálezu 97 s.
V případě vakuové filtrace byl pozorován častý výskyt krevných sraženin na filtrech, které znemožňovaly vyhodnocení přítomnosti sporadických buněk na filtru v průběhu mikroskopování. Při použití filtrace podle vynálezu pomocí vzlínavé síly nebyla na filtru přítomna žádná sraženina.
Příklad 5
Porovnání dvou druhů filtrační technologie z hlediska vlivu promytí
Bylo použito stejné uspořádání jako v příkladu 4 s tím rozdílem, že vzorek krve byl odebrán pacientce s karcinomem prsu. Protože jsme se u tohoto typu vzorků často setkávali se vznikem sraženin při vakuové filtraci, což vedlo k obtížné hodnotitelnosti zejména vlivem červených krvinek zachycených ve sraženině, po přefiltrování krve byly filtry ještě navíc promyty 2 ml růstového média (RPMI).
Podle očekávání zůstávaly na filtru po vakuové filtraci sraženiny, ale promytí pomohlo odstranit zbytek červených krvinek, a tak celková hodnotitelnost přítomnosti sporadických buněk na filtru po promytí RPMI je lepší než v případě bez promytí. Celková filtrace a promytí filtru médiem RPMI trvala v 4 min a 37 s.
Po použití vzlínavé síly pro filtraci vykazoval filtr i bez promytí lepší hodnotitelnost než filtr po použití vakua. Hodnotitelnost přítomnosti sporadických buněk na filtru po promytí RPMI se ještě zlepšila a byla lepší než hodnotitelnost promytého filtru po použití vakua. Celková filtrace a promytí filtru médiem RPMI trvala v tomto případě pouze 39 s.
Byla tedy potvrzena výhodnost použití vzlínavé síly pro filtrační separaci sporadických buněk jak po stránce výskytu sraženin, tak hodnotitelnost přítomnosti sporadických buněk. Při kroku promývání médiem RPMI bylo pozorováno navíc snížení doby filtrace.
Literatura:
Andreopoulou et al. Comparison of assay methods for detection of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: AdnaGen AdnaTest BreastCancer Select/Detect™ versus Veridex CellSearch™ system. Int J
Cancer, 2012, 130(7):1590-7
Bianchi et al. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), pp. 705-708
Birchmeier C. Epithelial-mesenchymal transitions in cancer progression.
Acta Anat (Basel), 1996, 156:217-26
Christofori G. New signalis from the invasive front. Nature, 2006, 441:44050
Davila et al. Tissue factor-bearing microparticles derived from tumor cells: impacton coagulation activation. J Thromb Haemost, 2008, 6(9):1517-24
Jechlinger et al. Expression profiling of epithelial plasticity in tumor progression. Oncogene, 2003, 22:7155-69
Mikulova V et al. Methods for detection of circulating tumour cells and their clinical value in cancer patients. Folia Biol (Praha). 2011 ;57(4): 151-61.
Ma et al. Meta-analysis of circulating tumor cells as a prognostic marker in 20 lung cancer. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(4):1137-44
Mani et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell, 2008, 133:704-15
Mego et al. Circulating tumour cells are associated with increased risk of venous thromboembolism in metastatic breast cancer patients. Br J
Cancer, 2009b, 101(11):1813-6
Mouawia H et al. Circulating trophoblastic cells provide genetic diagnosis in 63 fetuses at risk for cystic fibrosis or spinal muscular atrophy. Reprod Biomed Online. 2012 Nov;25(5):508-20.
Pantel K, Otte M. Occult micrometastasis: enrichment, identification and characterization of single disseminated tumor cells. Semin Cancer Biol, 2001, 11:327-37
Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett, 2007, 253:180-204 Shook et al. Mechanisms, mechanics and function of epithelialmesenchymal transitions in early developement. Meeh Dev, 2003, 120(11):1351-83
Thiery JP. Epithelial-mesenchymal trasnsitions in tumor progeression. Nat Rev Cancer, 2002, 2:442-54
Vona et al. Isolation by size of epithelial tumor cells: A new method for immunomorphological and molecular characterisation of circulatin tumor cells. Am J Pathol, 2000, 156:57-63
Wang et al. A higher number of circulating tumor cells (CTC) in peripheral blood indicates poor prognosis in prostate cancer patients--a metaanalysis. Asian Pac J Cancer Prev, 2011, 12(10):2629-35
Zhao et al. The prognostic role of circulating tumor cells (CTCs) detected by RT-PCR in breast cancer: a meta-analysis of published literature. Breast Cancer Res Treat, 2011, 130(3):809-16
Zhang et al. Meta-analysis of the prognostic value of circulating tumor cells in breast cancer. Clin Cancer Res, 2012, 18(20):5701-10
Ziegelschmidt et al. Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood. Crit Rev Clin Lab Sci, 2005, 42:155-96
Claims (15)
- Patentové nároky1. Způsob separace sporadických buněk přítomných v tělní tekutině pacienta jejich zachycením na filtrační membráně s otvory menšími než je průměr buněk, vyznačující se tím, že ze sporadických buněk přítomných v tělní tekutině na první straně filtrační membrány se přes filtrační membránu nasává zfiltrovaná tělní tekutina prostá sporadických buněk působením kapilárních sil do absorpčního materiálu bezprostředně přiléhajícího ke druhé straně filtrační membrány.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sporadickými buňkami přítomnými v tělní tekutině jsou cirkulující nádorové buňky, diseminované nádorové buňky, endometriální buňky a cirkulující fetální buňky trofoblastu.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že tělní tekutina je vybrána ze skupiny periferní nebo centrální krev, kostní dřeň, ascitická tekutina, pleurální výpotek, peritoneální laváž a amniocentická tekutina.
- 4. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že tělní tekutinou je tělní tekutina pacientů s melanomem; karcinomem prsu; nádory gastrointestinálního traktu jako je karcinom žaludku, tlustého střeva, pankreatu a jater; urogenitálními tumory a tumory měkkých tkání jako nádory hlavy a krku; a jinými solidními tumory.
- 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že periferní krví je odebraná nesrážlivá periferní krev.
- 6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že tělní tekutina obsahující sraženiny se pro rozpuštění sraženiny před separací ředí pufrem, zejména PBS.
- 7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že následně po separaci se provede detekce a/nebo kvantifikace a/nebo kultivace separovaných buněk na filtrační membráně nebo buněk spláchnutých z filtrační membrány v kultivační nádobě.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že tělní tekutina se pro zvýšení úspěšnosti následné kultivace před separací ředí kultivačním médiem, zejména RPMI.
- 9. Zařízení pro provádění způsobu podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje filtrační membránu (1), ke které bezprostředně přiléhá absorpční materiál (2).
- 10. Zařízení podle nároku 9 vyznačující se tím, že filtrační membrána (1) má velikost pórů 8 μίτι.
- 11. Zařízení podle kteréhokoli z nároků 9 až 10, vyznačující se tím, že filtrační membrána (1) je vyrobena z polykarbonátu.
- 12. Zařízení podle kteréhokoli z nároků 9 až 11, vyznačující se tím, že absorpční materiál (2) je tvořen buničinou, jemným papírem, textilními vlákny nebo jejich kombinací.
- 13. Zařízení podle kteréhokoli z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje shora a zdola otevřený dutý zásobník (3) pro pojmutí směsi sporadických buněk přítomných v tělní tekutině, kde dolní obvod zásobníku (3) těsně shora přiléhá na alespoň část první strany membrány (1), a kde k alespoň části druhé strany membrány (1) zdola bezprostředně přiléhá absorpční materiál (2), takže membrána (1) odděluje vnitřní prostor zásobníku (3) od absorpčního materiálu (2).
- 14. Zařízení podle nároku 13, vyznačující se tím, že absorpční materiál (2) je umístěn v podstavné nádobě (4) opatřené horním víčkem (5), do kterého shora rozebíratelně zasahuje obvodový držák (6) membrány, který pomocí přítlačného kroužku (7) těsně rozebíratelně drží membránu (1) po jejím obvodu, a na držák (6) je po jeho obvodu shora těsně upevnitelný zásobník (3).
- 15. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se pro provedení detekce a/nebo kvantifikace a/nebo kultivace přenášejí separované buňky na filtrační membráně (1) upevněné v držáku (6) podle nároku 14.
Priority Applications (22)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-456A CZ2013456A3 (cs) | 2013-06-14 | 2013-06-14 | Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu |
| JP2016518839A JP6595461B2 (ja) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | 孤発性細胞（Ｓｐｏｒａｄｉｃ ｃｅｌｌｓ）を体液から分離するための方法、および前記方法を実行するための装置 |
| HRP20171242TT HRP20171242T1 (hr) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Postupak odjeljivanja sporadičnih stanica iz tjelesnih tekućina i uređaj za primjenu navedenog postupka |
| PCT/CZ2014/000052 WO2014198242A1 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method |
| AU2014280654A AU2014280654A1 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method |
| DK14728812.0T DK3008162T3 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | PROCEDURE FOR SEPARATING SPORADIC CELLS FROM BODY FLUIDS AND DEVICE FOR CARRYING OUT THE PROCEDURE |
| KR1020157036962A KR20160019475A (ko) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | 체액으로부터의 산발성 세포를 분리하는 방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치 |
| PL14728812T PL3008162T3 (pl) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Sposób separacji sporadycznych komórek z płynów ustrojowych i aparat do realizowania wspomnianego sposobu |
| HUE14728812A HUE033929T2 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | A method of isolating sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said process |
| RS20170816A RS56214B1 (sr) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Postupak za izdvajanje sporadičnih ćelija iz telesnih tečnosti i aparat za izvođenje pomenutog postupka |
| SM20170390T SMT201700390T1 (it) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Procedimento per la separazione di cellule sporadiche da fluidi corporei, ed apparecchiatura per attuare il procedimento suddetto |
| EP14728812.0A EP3008162B1 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method |
| SI201430343T SI3008162T1 (sl) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Postopek za separacijo sporadičnih celic iz telesnih tekočin, in naprava za izvedbo omenjenega postopka |
| BR112015030965-8A BR112015030965B1 (pt) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | método para separação de células esporádicas a partir de fluidos corporais, e aparelho para executar o método citado |
| ES14728812.0T ES2638196T3 (es) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Método para la separación de células esporádicas a partir de fluidos corporales, y aparato para realizar dicho método |
| PT147288120T PT3008162T (pt) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Método para separação de células esporádicas de fluidos corporais e aparelho para levar a cabo o referido método |
| CA2914652A CA2914652A1 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method |
| LTEP14728812.0T LT3008162T (lt) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Būdas, skirtas sporadinių ląstelių išskyrimui iš kūno skysčių, ir aparatūra minėto būdo atlikimui |
| US14/897,103 US20160122704A1 (en) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Method for separation of sporadic cells from body fluids, and apparatus for carrying out said method |
| EA201592174A EA032557B1 (ru) | 2013-06-14 | 2014-05-06 | Способ сепарации спорадических клеток из органических жидкостей и аппарат для осуществления указанного способа |
| CY20171100886T CY1119249T1 (el) | 2013-06-14 | 2017-08-22 | Μεθοδος για τον διαχωρισμο των σποραδικων κυτταρων απο σωματικα υγρα, και συσκευη για εκτελεση της εν λογω μεθοδου |
| AU2019202122A AU2019202122A1 (en) | 2013-06-14 | 2019-03-27 | Method for Separation of Sporadic Cells from Body Fluids, and Apparatus for Carrying Out Said Method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-456A CZ2013456A3 (cs) | 2013-06-14 | 2013-06-14 | Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2013456A3 true CZ2013456A3 (cs) | 2014-12-29 |
Family
ID=50897311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-456A CZ2013456A3 (cs) | 2013-06-14 | 2013-06-14 | Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160122704A1 (cs) |
| EP (1) | EP3008162B1 (cs) |
| JP (1) | JP6595461B2 (cs) |
| KR (1) | KR20160019475A (cs) |
| AU (2) | AU2014280654A1 (cs) |
| BR (1) | BR112015030965B1 (cs) |
| CA (1) | CA2914652A1 (cs) |
| CY (1) | CY1119249T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2013456A3 (cs) |
| DK (1) | DK3008162T3 (cs) |
| EA (1) | EA032557B1 (cs) |
| ES (1) | ES2638196T3 (cs) |
| HR (1) | HRP20171242T1 (cs) |
| HU (1) | HUE033929T2 (cs) |
| LT (1) | LT3008162T (cs) |
| PL (1) | PL3008162T3 (cs) |
| PT (1) | PT3008162T (cs) |
| RS (1) | RS56214B1 (cs) |
| SI (1) | SI3008162T1 (cs) |
| SM (1) | SMT201700390T1 (cs) |
| WO (1) | WO2014198242A1 (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101808060B1 (ko) * | 2014-09-29 | 2017-12-14 | 주식회사 싸이토젠 | 혈중세포 검사차량 |
| KR101808044B1 (ko) * | 2014-09-29 | 2017-12-14 | 주식회사 싸이토젠 | 이동식 혈중세포 검사장치 |
| KR101766450B1 (ko) * | 2015-04-30 | 2017-08-08 | 주식회사 싸이토젠 | 표적 세포 회수 방법 |
| WO2018029858A1 (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 日立化成株式会社 | 血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法 |
| WO2018030547A1 (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 日立化成株式会社 | 血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法 |
| WO2018047311A1 (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 日立化成株式会社 | 血中循環癌細胞を検出するための前処理剤 |
| CN109596828A (zh) * | 2017-09-30 | 2019-04-09 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种微球增强的尺寸分离芯片及其制备方法与应用 |
| CN108325388A (zh) * | 2018-04-18 | 2018-07-27 | 武汉芯生生物科技有限公司 | 一种用于分离循环肿瘤细胞的滤器 |
| CZ2018309A3 (cs) | 2018-06-26 | 2020-01-02 | Cellpeutics Sp. Z O.O. | Autologní vakcína a způsob přípravy vakcíny a monitorování pacienta |
| US11890616B2 (en) | 2019-03-26 | 2024-02-06 | The Curators Of The University Of Missouri | Microfluidic device for capture of micrometer scale objects and methods of using the device |
| CN111733072B (zh) * | 2020-06-08 | 2023-06-30 | 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 | 一种循环肿瘤细胞筛选分离装置及方法和应用 |
| CN111979098B (zh) * | 2020-09-11 | 2025-07-29 | 安徽贝铭生物科技有限公司 | 一种细胞过滤器 |
| RU2757639C1 (ru) * | 2021-02-12 | 2021-10-19 | Общество с ограниченной ответственностью «ЭНЕРДЖИН» | Способ выделения опухолевых клеток из периферической крови |
| CN114921414B (zh) * | 2022-07-22 | 2022-09-27 | 北京和沛生物科技有限公司 | 一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法 |
| CN115876551B (zh) * | 2022-12-20 | 2023-08-11 | 杭州迪安生物技术有限公司 | 一种高过滤性的细胞制片用过滤膜筒 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4491012A (en) * | 1982-10-04 | 1985-01-01 | Nuclepore Corp. | Method for measuring erythrocyte deformability |
| JPH02129531A (ja) * | 1988-11-09 | 1990-05-17 | Michirou Shibazaki | 捕捉染色方法および捕捉染色装置 |
| US5114350A (en) * | 1989-03-08 | 1992-05-19 | Cholestech Corporation | Controlled-volume assay apparatus |
| FI91977C (fi) * | 1991-01-24 | 1994-09-12 | Orion Yhtymae Oy | Menetelmä mikro-organismien määrittämiseksi ja erottamiseksi |
| AU7474394A (en) * | 1993-07-19 | 1995-02-20 | Aprogenex, Inc. | Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization |
| US6852527B2 (en) * | 2002-06-06 | 2005-02-08 | Inovyx, Inc. | Apparatus and method for the measurement of cells in biological samples |
| EP1888238B1 (en) * | 2005-04-21 | 2014-08-13 | California Institute of Technology | Parylene membrane filters |
| FR2923151B1 (fr) * | 2007-11-02 | 2010-09-03 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif de prelevement sanguin comportant au moins un filtre . |
| US20120107925A1 (en) * | 2009-03-20 | 2012-05-03 | Mo Huang Li | Devices for separating cells and methods of using them |
| JP5771934B2 (ja) * | 2010-10-01 | 2015-09-02 | コニカミノルタ株式会社 | 細胞染色方法及び細胞染色用キット |
| KR101254675B1 (ko) * | 2010-10-25 | 2013-04-15 | 주식회사 싸이토젠 | 세포 채집 장치 |
-
2013
- 2013-06-14 CZ CZ2013-456A patent/CZ2013456A3/cs unknown
-
2014
- 2014-05-06 PL PL14728812T patent/PL3008162T3/pl unknown
- 2014-05-06 HR HRP20171242TT patent/HRP20171242T1/hr unknown
- 2014-05-06 WO PCT/CZ2014/000052 patent/WO2014198242A1/en not_active Ceased
- 2014-05-06 ES ES14728812.0T patent/ES2638196T3/es active Active
- 2014-05-06 US US14/897,103 patent/US20160122704A1/en not_active Abandoned
- 2014-05-06 CA CA2914652A patent/CA2914652A1/en not_active Abandoned
- 2014-05-06 BR BR112015030965-8A patent/BR112015030965B1/pt active IP Right Grant
- 2014-05-06 KR KR1020157036962A patent/KR20160019475A/ko not_active Ceased
- 2014-05-06 PT PT147288120T patent/PT3008162T/pt unknown
- 2014-05-06 LT LTEP14728812.0T patent/LT3008162T/lt unknown
- 2014-05-06 RS RS20170816A patent/RS56214B1/sr unknown
- 2014-05-06 JP JP2016518839A patent/JP6595461B2/ja active Active
- 2014-05-06 EA EA201592174A patent/EA032557B1/ru unknown
- 2014-05-06 AU AU2014280654A patent/AU2014280654A1/en not_active Abandoned
- 2014-05-06 DK DK14728812.0T patent/DK3008162T3/en active
- 2014-05-06 SI SI201430343T patent/SI3008162T1/sl unknown
- 2014-05-06 EP EP14728812.0A patent/EP3008162B1/en active Active
- 2014-05-06 SM SM20170390T patent/SMT201700390T1/it unknown
- 2014-05-06 HU HUE14728812A patent/HUE033929T2/en unknown
-
2017
- 2017-08-22 CY CY20171100886T patent/CY1119249T1/el unknown
-
2019
- 2019-03-27 AU AU2019202122A patent/AU2019202122A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112015030965B1 (pt) | 2021-01-05 |
| JP2016526376A (ja) | 2016-09-05 |
| EA032557B1 (ru) | 2019-06-28 |
| ES2638196T3 (es) | 2017-10-19 |
| AU2014280654A1 (en) | 2015-12-17 |
| SI3008162T1 (sl) | 2017-10-30 |
| EP3008162B1 (en) | 2017-05-31 |
| EP3008162A1 (en) | 2016-04-20 |
| SMT201700390T1 (it) | 2017-09-07 |
| LT3008162T (lt) | 2017-09-11 |
| EA201592174A1 (ru) | 2016-04-29 |
| PT3008162T (pt) | 2017-08-25 |
| KR20160019475A (ko) | 2016-02-19 |
| PL3008162T3 (pl) | 2017-10-31 |
| DK3008162T3 (en) | 2017-09-11 |
| HRP20171242T1 (hr) | 2017-10-20 |
| HUE033929T2 (en) | 2018-01-29 |
| WO2014198242A1 (en) | 2014-12-18 |
| JP6595461B2 (ja) | 2019-10-23 |
| AU2019202122A1 (en) | 2019-04-18 |
| CA2914652A1 (en) | 2014-12-18 |
| US20160122704A1 (en) | 2016-05-05 |
| RS56214B1 (sr) | 2017-11-30 |
| CY1119249T1 (el) | 2018-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2013456A3 (cs) | Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu | |
| KR101630110B1 (ko) | 말초 순환 종양 세포 또는 희소 세포 분리용 디바이스 및 말초 순환 종양 세포 또는 희소 세포 분리 방법 | |
| DK2542689T3 (en) | Method for isolating target cells | |
| ES2666594T3 (es) | Procedimiento para diagnosticar un cáncer invasivo | |
| CN110456034B (zh) | 一种循环肿瘤细胞的检测方法 | |
| CN104531529A (zh) | 用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法 | |
| JP2002536635A (ja) | 体液から腫瘍細胞を濃縮するか又は除去する方法及びかかる目的に適したキット | |
| Adams et al. | Precision microfilters as an all in one system for multiplex analysis of circulating tumor cells | |
| CN105891165A (zh) | 一种分离外周血中稀有细胞的方法及试剂盒 | |
| US20190078153A1 (en) | Method of analyzing genetically abnormal cells | |
| CN104807996A (zh) | 细胞表面标志分子用于检测肝癌循环肿瘤细胞的用途 | |
| EP3199638B1 (en) | Cancer cell detection method using living body derived cells | |
| Bu et al. | Enhancement of isolation sensitivity for the viable heterogeneous circulating tumor cells swelled by hypo-osmotic pressure | |
| WO2008155398A1 (en) | Separation method of biological objects relative to their viscoelastic properties | |
| AU2016395556B2 (en) | Method for detecting or separating/obtaining circulating tumor cell employing cell proliferation method | |
| WO2021010369A1 (ja) | ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法 | |
| WO2025129182A1 (en) | Screening samples for subclinical indicia of cancer | |
| Zhou et al. | Combined device of microporous filter membrane and immunofluorescence for detection and characterization of circulating tumor cells of musculoskeletal sarcomas | |
| CN121718495A (zh) | 一种肉瘤循环肿瘤细胞的捕获、鉴定与体外培养方法 | |
| RO133995A2 (ro) | Procedeu de selecţie a celulelor tumorale circulante de adenocarcinom de colon pentru analiza prin citometrie în flux |