ES2638196T3 - Método para la separación de células esporádicas a partir de fluidos corporales, y aparato para realizar dicho método - Google Patents
Método para la separación de células esporádicas a partir de fluidos corporales, y aparato para realizar dicho método Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un método para la separación de células esporádicas, presente en el fluido corporal de un paciente, capturándolas en un filtro de membrana que tiene aberturas menores que el diámetro de las células, en el que a partir de las células esporádicas presentes en dicho fluido corporal presentes en el primer lado del filtro de membrana, el fluido corporal libre de células esporádicas se extrae a través del filtro de membrana en virtud de la fuerza capilar en un material absorbente situado en contacto íntimo con el segundo lado de dicho filtro de membrana para obtener dichas células esporádicas capturadas sobre la membrana que permanecen mecánicamente y químicamente sin cambios y por lo tanto viables, lo que permite su posterior cultivo eficaz.
Description
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DESCRIPCION
Metodo para la separacion de celulas esporadicas a partir de fluidos corporales, y aparato para realizar dicho metodo
Campo de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo de separacion amable de celulas esporadicas viables (celulas raras) de fluidos corporales tales como sangre, de efusiones malignas (ascitis, derrame pleural), lfquido de lavado bronco alveolar, lfquido de lavado peritoneal y lfquido amniotico. Utilizando el presente metodo es posible aislar, por ejemplo, CTC, celulas tumorales circulantes y celulas tumorales diseminadas (DTCs, celulas tumorales diseminadas), celulas endometriales y celulas trofoblasticas circulantes (CFTC, trofoblasto fetal circulante), permitiendo la posterior deteccion, cuantificacion, caracterizacion y especialmente cultivo.
Antecedentes de la invencion
Las lesiones metastasicas son la causa mas comun de muerte en pacientes con carcinomas (Birchmeier, 1996). Durante las metastasis, las celulas tumorales se separan del tumor primario y entran en el torrente sangumeo directamente o a traves del sistema linfatico, migrando a los organos secundarios y desarrollando un deposito metastasico. La deteccion de CTC en pacientes con carcinoma metastasico se asocia con un peor pronostico (Zharo 2011, Zhang 2012, Wang 2011). A pesar de su gran importancia clmica, todavfa no se ha realizado una caracterizacion molecular de CTCs. Esto puede atribuirse a una frecuencia extremadamente baja de CTC en comparacion con el numero de celulas sangumeas. Los CTCs son generados por el proceso de transicion epitelial- mesenquimal (EMT), que se caracteriza por la reduccion de la expresion de marcadores epiteliales y el aumento de la expresion de marcadores mesenquimales. Estos cambios promueven una mayor motilidad, invasion y resistencia a la terapia (Thiery 2002 Shook 2003 Christofori 2006 Jechlinger 2003). CTCs/DTCs representan una poblacion de celulas tumorales diseminadas a organos distantes con potencial para la creacion de focos micro-y macro- metastasicos. Algunas de las celulas tumorales de tumores primarios y/o CTCs y DTCs tienen propiedades de celulas madre (CSCs, celulas madre de cancer). La poblacion de celulas madre de cancer tiene la capacidad de auto regeneracion y es resistente al tratamiento, lo que significa un peor pronostico.
CTCs/CSCs tienen un enorme potencial en el diagnostico, la determinacion del pronostico, el seguimiento de la enfermedad efecto terapeutico y el riesgo (Mani 2008).
La diseminacion temprana del tumor a los ganglios linfaticos y la sangre se realiza mediante celulas tumorales circulantes (CTC) y celulas cancerosas diseminadas (DTCs). Los CTC se han descrito como que ocurren tambien en pacientes debido a la reseccion del tumor primario por la simple manipulando del tumor primario.
La deteccion de CTC es, sin duda, un factor pronostico en el cancer. La deteccion de CTCs puede utilizarse potencialmente para diagnosticar o como una alternativa a las biopsias invasivas para la deteccion temprana de la diseminacion metastasica del tumor y para establecer y controlar la efectividad de la terapia en pacientes individuales. La cantidad y las caractensticas de los CTC pueden ser un factor pronostico para la supervivencia o el factor predictivo de una respuesta terapeutica. La caracterizacion a largo plazo de CTCs puede proporcionar una oportunidad para evaluar mejor la respuesta fisiologica dinamica. Ademas, los cambios en el numero de CTC en comparacion con los cambios supervisados previamente detectados por imagenes sugieren que el analisis de CTC puede ser mas importante para la evaluacion de la supervivencia que los metodos de imagen.
En general, hay una evidencia valida de valor pronostico adverso de CTC detectados en cancer colorrectal metastasico, cancer de prostata, cancer de ovario, cancer de mama. Tambien hay estudios sobre la importancia de los CTC en la formacion de tromboembolismo venoso. En pacientes con cancer de mama metastasico y con CTC detectados (n > 1) en sangre periferica, se observo una incidencia de trombosis hasta cuatro veces mayor que la de pacientes sin CTC (Mego 2009). Los CTCs estan posiblemente implicados en la activacion de la coagulacion a traves de la expresion y liberacion de factores tisulares (Davila 2008). Los CTC estan presentes en la sangre en una cantidad muy pequena de aproximadamente una celula por diez mil millones de celulas sangumeas (Pantel 2001, Ziegelschmidt 2005).
Las tecnologfas actualmente disponibles utilizan diferentes metodos para la deteccion de CTC: una separacion por gradiente de densidad, una separacion inmuno-magnetica, una separacion inmuno-magnetica de gradiente. Estos metodos son espedficos para las celulas y mas amables que los metodos de filtracion a presion, pero al unirse el anticuerpo interactua con los receptores y antfgenos en la membrana celular y, por lo tanto, los CTC/DTCs autenticos y viables son diffciles de seleccionar.
La presencia de celulas esporadicas tambien puede ser detectada indirectamente por RT-PCR, pero este enfoque es a menudo limitado por una baja expresion de marcadores espedficos de tumores y la no especificidad de los antfgenos tfpicos de cTc y DTC (Andreopoulou 2012). Ademas, se ha demostrado un alto grado de discrepancia en
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la expresion de antfgenos de superficie entre tumores primarios y CTC/DTC, lo que sugiere una gran falta de fiabilidad en el uso de estos marcadores para la separacion de CTCs/DTCs.
Dado que el tamano de las celulas CTC esporadicas separadas en la mayona de los tumores epiteliales es mucho mayor que el tamano de las celulas sangumeas, una de las maneras eficientes de la separacion de CTCs se basa en el proceso de filtracion a traves de un filtro de membrana, en donde las celulas separadas permanecen en la membrana y otras celulas pasan a traves de la membrana (Paterlini-Brechot et al., 2007, Vona 2000). El uso de un metodo de separacion basado en tamanos de CTCs/DTCs permite la deteccion y separacion de CTCs/DTC sin dependencia de antfgenos de superficie y receptores, cuya expresion vana durante una enfermedad de cancer.
Los metodos de filtracion usados recientemente incluyen un proceso de filtracion acelerado por presion o por vacm (Mikulova, 2011); el gradiente de filtracion se crea asf cambiando la presion. La desventaja comun de los metodos de filtracion es que hay una acumulacion de un precipitado, y una precipitacion en filtro de membrana, causando la obstruccion del filtro, lo que conduce a la captura de las celulas sangumeas en el precipitado. En consecuencia, el precipitado y las celulas sangumeas deterioran considerablemente la capacidad de evaluar la presencia de las celulas esporadicas en el filtro bajo el microscopio. Las celulas sangumeas capturadas pueden eliminarse parcialmente por lavado, sin embargo, el precipitado permanece en el filtro. Por esta razon, se deben anadir agentes anticoagulantes adicionales en el aparato de filtrado (no solo en el tubo durante el muestreo de sangre). Una desventaja fundamental, como con la mayona de los otros metodos, es danar la viabilidad de las celulas, por lo que las celulas no suelen dividirse mas y su posterior cultivo es imposible.
Los documentos WO 2006/116327 A1 y US 2012/0178097 A1 describen filtros de membrana para la separacion de celulas tumorales circulantes viables (CTC), que son filtros biocompatibles hechos de parileno o policarbonato de tamano de poro de 5 a 40 micrometres.
Los documentos US 2010/324449 A1 y US 5114350 A describen filtros que hacen contacto con un material absorbente.
Todos los metodos utilizados actualmente tienen tambien otras desventajas, por ejemplo, requieren analisis de grandes volumenes de sangre, una gran proporcion de trabajo de laboratorio, una evaluacion demorada (el procesamiento de la muestra tarda varias horas), o costosos equipos y reactivos utilizados y/o los metodos carecen de confiabilidad, sensibilidad, eficiencia, especificidad y estandarizacion necesarios para los metodos de deteccion CTCs y DTCs.
Por lo tanto, sena deseable un metodo para separar celulas, especialmente celulas esporadicas de fluidos corporales, siendo reproducible dicho metodo, mostrando una buena evaluacion de la presencia de celulas esporadicas en el filtro bajo un microscopio, que no es exigente en el tiempo de procesamiento, equipo y personal de operacion, que es barato incluso en un numero bajo de muestras ensayadas, y que no requiere reactivos caros con vencimiento limitado. En el proceso de separacion no debe producirse ninguna interaccion con receptores y antfgenos. El proceso debe ser sutil a las celulas con el fin de analizar la seleccion de celulas viables y CTCs/DTC autenticos y utilizar dichas celulas en experimentos posteriores in vitro e in vivo, posiblemente.
Ademas, sena deseable un dispositivo fabricado facilmente, para llevar a cabo el proceso de aislamiento de forma reproducible, siendo asequible para la mayona de los laboratorios, adecuado para el manejo esteril de material potencialmente patologico. Dicho dispositivo debe proporcionar una posibilidad de deteccion y/o cuantificacion y/o cultivo posterior de celulas separadas en un filtro de membrana, y puede estar disponible como una variante desechable o reutilizable.
Resumen de la invencion
Se eliminaron las deficiencias de los metodos anteriores y se cumplieron los requisitos establecidos mediante un metodo de separacion de celulas esporadicas de fluidos corporales de organismos humanos y animales de acuerdo con la presente invencion utilizando un filtro de membrana colocado en un contacto mtimo con un material absorbente.
Se descubrio que, en contraste con la filtracion de presion/vacm, durante la filtracion utilizando la fuerza capilar (capilaridad) la coagulacion de protemas a partir de fluidos corporales tales como sangre o plasma sangumeo se produce en un grado mmimo, por lo que no es necesario un anticoagulante adicional al anticoagulante (EDTA) anadido al tubo de toma de sangre para una recoleccion de sangre normal. Si ya existe un coagulo en el fluido corporal, la dilucion por pequenas cantidades de una solucion reguladora tal como PBS es suficiente para prevenir la coagulacion. En consecuencia, el filtro de membrana no esta obstruido (particularmente al principio de la filtracion, como ocurre normalmente en la filtracion de presion/vacm), y la separacion es mas suave, mas rapida y completa.
Una cantidad mas baja del precipitado provoca una cantidad inferior de celulas sangumeas tales como globulos rojos retenidos en dicho precipitado, en donde tanto el precipitado como tal y las celulas sangumeas destruyen la deteccion de la presencia de las celulas esporadicas en el filtro. Obviamente, la evaluacion correcta de la presencia
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de celulas esporadicas es crucial; el tiempo de filtracion se puede ajustar facilmente mediante el area de filtracion utilizada, es decir, el area del filtro de membrana y del material absorbente
Ademas, se encontro que las celulas esporadicas capturadas en la membrana permanedan mecanicamente y qmmicamente inalteradas y por lo tanto viables, lo que permite su posterior cultivo eficaz, lo que no es practicable por otros metodos, desde la perspectiva de los resultados actuales.
Ademas, se encontro que para la dilucion del fluido corporal o para el aclarado de celulas esporadicas en el filtro respectivamente, el medio de cultivo tal como RPMI puede ser utilizado directamente para aumentar la tasa de exito de la separacion (y tambien del cultivo, si el objetivo es tambien cultivar las celulas esporadicas), mientras que la velocidad de separacion en el filtro de membrana, asf como la viabilidad celular se mantienen.
El fluido corporal filtrado libre de las celulas esporadicas pasa a traves de los orificios del filtro de membrana, en donde se capturan los elementos mayores que los agujeros en el filtro de membrana (el tamano tfpico de las celulas sangumeas es inferior a 6 |im y el de las celulas esporadicas por encima de 10 |im).
Las celulas esporadicas separadas se alojan debido a su tamano en el filtro de membrana, cuya membrana puede ser separada del material absorbente, teniendo la membrana todavfa fijada en el soporte. En otra realizacion, la membrana puede ser posteriormente removida completamente del soporte.
El flujo de fluidos corporales, libres de celulas esporadicas, a traves de la membrana se acelera continuamente en virtud de la fuerza capilar que aspira el lfquido en el material absorbente. No hay sobrepresion antes del filtro y no hay subpresion (vado) detras del filtro aplicado al fluido corporal filtrado durante la filtracion. El fluido es aspirado solamente por la fuerza capilar, sin la necesidad de ninguna regulacion, a velocidad apropiada a traves del filtro al material absorbente. (En este contexto, no se tiene en cuenta la presion hidrostatica ejercida sobre el filtro por la altura de la columna de fluido corporal). La cantidad de la fuerza capilar provoca la filtracion continua del fluido, sin ningun tipo de obstruccion antes o sobre el filtro de membrana, como se observa frecuentemente, por ejemplo, en metodos que utilizan vado detras del filtro o una sobrepresion antes del filtro.
La ventaja de la solucion de acuerdo con la invencion es una alta eficacia de captura de celulas esporadicas incluso de baja concentracion y aceleracion del proceso de separacion, asf tambien la velocidad de deteccion y el aumento de la eficiencia de cultivo. Cuando se utiliza el metodo de acuerdo con la invencion, no se observa interaccion de celulas esporadicas con receptores y antigenos, y por lo tanto es posible seleccionar CTCs/DTCs autenticos y viables, los cuales pueden usarse entonces en experimentos in vitro e in vivo. El metodo permite mantener las celulas filtradas en condiciones vitales muy buenas para un analisis posterior. No se necesita equipo de laboratorio especial. El metodo permite el procesamiento de volumenes relativamente grandes de sangre u otros fluidos corporales (por ejemplo, 50 ml).
En consecuencia, la presente invencion proporciona un metodo para la separacion de celulas esporadicas presentes en el fluido corporal del paciente por su captura en un filtro de membrana que tiene aberturas menores que el diametro de las celulas, en donde a partir de las celulas esporadicas presentes en dicho fluido corporal presentes en el primer lado del filtro de membrana, el fluido corporal libre de celulas esporadicas se extrae a traves del filtro de membrana en virtud de la fuerza capilar en un material absorbente situado en un contacto mtimo con el segundo lado de dicho filtro de membrana.
Las celulas esporadicas presentes en el fluido corporal son, por ejemplo, celulas tumorales circulantes, celulas tumorales diseminadas, celulas endometriales y celulas trofoblasticas fetales circulantes.
El fluido corporal es cualquier fluido obtenido directamente (por recoleccion) o indirectamente (con tratamientos posteriores de cualquier tipo) del cuerpo humano o animal. Se selecciona preferiblemente del grupo de sangre central o periferica, medula osea, fluido asdtico, derrame pleural, lfquido de lavado peritoneal y lfquido amniotico.
El objeto de prueba puede ser preferiblemente un paciente con cancer primario o enfermedad metastasica.
La muestra de ensayo tambien se puede recoger con exito de un animal que ha sido aprobado como un modelo experimental metastasico.
En otra realizacion, la sangre periferica es sangre periferica anticoagulada, tal como sangre recogida en un tubo de recogida de sangre regular que comprende anticoagulante tal como EDTA.
Si el fluido corporal comprende precipitado antes de la separacion, el fluido corporal filtrado se diluye preferiblemente con una solucion reguladora apropiada, tal como PBS (solucion salina fisiologica con solucion reguladora fosfato) y/o TrypLE™ con el fin de disolver el precipitado y hacer la filtracion/separacion mas facil.
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La invencion, sin embargo, no excluye el uso de ningun metodo conocido para prevenir la formacion de coagulos de sangre durante la recoleccion de sangre. Un ejemplo es una carga gradual y opcionalmente disolucion enzimatica (por ejemplo, usando TrypLE™, Invitrogen), sin embargo, preferiblemente la disolucion no se usa.
Para mejorar la filtracion en caso de presencia de precipitados de sangre, la sangre periferica puede diluirse adicionalmente mediante solucion de PBS o por el medio de cultivo. Con el fin de eliminar los precipitados sangurneos y otras impurezas gruesas, la sangre u otros fluidos corporales tambien pueden filtrarse a traves de un tamiz con el tamano de poro de, por ejemplo, 0.1 mm, que se lava luego varias veces con PBS. A continuacion, se carga el volumen residual de sangre. Finalmente, el tubo colector de sangre se enjuaga con PBS, cuyo volumen se filtra a traves del tamiz.
Las celulas esporadicas separadas pueden entonces enjuagarse sobre el filtro para una mejor evaluacion del microscopio, por ejemplo, por la solucion reguladora tal como PBS o por un medio tal como RPMI. En comparacion con la filtracion al vado, el metodo segun la invencion proporciona beneficios sustanciales en todos los aspectos.
Las celulas separadas pueden analizarse posteriormente, por ejemplo, microscopicamente, preferiblemente despues de tincion inmunohistoqmmica u otra, cuantificadas (por ejemplo, microscopicamente, manualmente o automaticamente) o cultivadas o procesadas de otro modo. En otras realizaciones, se lleva a cabo una deteccion y/o cuantificacion y/o cultivo de las celulas separadas despues de la separacion, directamente sobre el filtro de membrana o en un recipiente de cultivo.
Los filtros con celulas esporadicas pueden almacenarse durante mas tiempo congelados, secados o fijados por metodos convencionales en uso para ser analizados posteriormente.
Como ya se ha indicado, especialmente en el caso en el que se planifica el posterior cultivo de celulas esporadicas, el fluido corporal puede ser diluido directamente por el medio de cultivo utilizado en el subsiguiente cultivo de celulas separadas antes de la separacion, tal como medio RPMI, aumentando con ello el mdice de exito de la filtracion y el subsiguiente cultivo.
El cultivo subsiguiente de celulas esporadicas se puede llevar a cabo de manera convencional en una incubadora a 37°C y 5% de CO2 en un plato de cultivo convencional o una botella de plastico o de vidrio al lavar las celulas del filtro. Para este proposito, por ejemplo, el filtro se enjuaga con 2 x 1 ml del medio RPMI, y el medio con celulas se transfiere a una placa de 24 concavidades, donde las celulas pueden cultivarse directamente sobre la superficie de la placa de plastico o sobre el cubreobjetos del microscopio insertado. Se prefiere el cultivo de cubreobjetos si se requiere inmunohistoqmmica e inmunofluorescencia de las celulas.
El cultivo se lleva a cabo preferiblemente insertando el filtro que contiene las celulas capturadas al medio de cultivo en un plato de cultivo, o vertiendo el medio de cultivo al filtro con las celulas capturadas, insertado en el plato de cultivo.
En otra realizacion preferida, el cultivo se lleva a cabo transfiriendo el filtro de membrana montado en el soporte descrito a continuacion, inmediatamente despues de la separacion, por ejemplo, en una placa de cultivo de 6 concavidades con un medio de crecimiento anadido en cada concavidad. Las celulas se pueden cultivar entonces como un cultivo tisular estandar.
En una realizacion de la invencion, un fluido corporal es el fluido corporal de pacientes con melanoma, cancer de mama, canceres del tracto gastrointestinal tales como cancer gastrico, cancer de colon, cancer de pancreas y cancer de Idgado; tumores urogenitales y tumores de tejidos blandos tales como tumores de cabeza y cuello y otros tumores solidos.
El metodo y el aparato de la presente invencion pueden usarse, por ejemplo, para separar celulas tumorales circulantes (CTC) de sangre periferica o central, celulas tumorales del tracto gastrointestinal (esofago, estomago, intestino grueso y delgado, Idgado, pancreas, vesfcula biliar y vfas biliares), tumores del sistema urogenital (ovario, endometrio, prostata, vejiga, tesdculos), tumores del sistema respiratorio (pulmon, mediastino, tracto respiratorio superior), tumores del sistema neuroendocrino, tumores oseos, tumores de cabeza y cuello, tumores de mama, tumores metastasicos sin localizacion primaria y otros tumores solidos menos frecuentes.
El metodo y aparato de acuerdo con la presente invencion tambien se pueden utilizar para enfermedades hematopoyeticas seleccionadas, tumores neuroendocrinos, diseminacion de celulas tumorales de ascitis, de derrame pleural, de esputo, de lavados (lavados bronco-alveolares, lavados de peritoneo y cavidad toracica, lavados de retroperitoneal, etc.), para las celulas endometriales circulantes y diseminadas (de sangre y de lavados).
Una utilizacion importante tambien se aplica a la separacion de celulas trofoblasticas fetales circulantes (CFTCs) de la sangre, o lfquido amniocentrico, porque los CFTC estan presentes en la sangre materna periferica desde la quinta semana de gestacion y no permanecen en la circulacion sangmnea despues del final del embarazo (Bianchi et al., 1996). CFTC son por lo tanto fuente muy atractiva de ADN/ARN para el examen mediante un diagnostico no
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invasivo prenatal (PNDNI). Al comparar las pruebas basadas en la CFTC y la coriocentesis, se ha confirmado la sensibilidad diagnostica y la especificidad del 100% para la prueba con base en CFTC. La caractenstica basica por la cual las celulas CFTC difieren de las celulas sangumeas es su tamano (las celulas CFTC alcanzan un tamano estandar de 10 |im y mas). Informes actuales indican que una mujer embarazada tiene un 99% de probabilidad de que cada celula del tamano mas de 15 |im de tamano, la celula es de origen embrionario, por lo tanto, CFTC (Mouawia, 2012). Debido a la nueva metodologfa, ahora es posible separar de forma reproducible CFTC no danado y utilizarlos para un analisis posterior.
La deteccion de CTCs y DTCs puede llevarse a cabo en modelos de tumor animal, y CTCs/DTCs pueden ser detectados en individuos con mas de un tipo de tumor.
Despues de la separacion, las celulas pueden ser procesadas tanto por metodos de inmunohistoqmmica como por metodos de una sola celula para la expresion genica.
La invencion proporciona ademas un aparato para llevar a cabo la separacion de una mezcla de celulas esporadicas presentes en el fluido corporal de un paciente mediante los metodos descritos anteriormente, comprendiendo dicho aparato un filtro de membrana colocado en un contacto mtimo con un material absorbente.
La geometna de la membrana implica generalmente el tamano, la forma y la densidad de los poros de la membrana. La eficacia del filtro de membrana se puede optimizar de este modo ajustando el tamano, la forma y la densidad de los poros de la membrana. Se selecciona una construccion de la membrana que prefiere la captura del tumor y celulas esporadicas sobre las celulas sangumeas. El filtro de membrana es preferiblemente una membrana que capta celulas esporadicas de dimensiones superiores a 10 |im y transmite elementos de sangre del tamano de hasta 6 |im, es decir, teniendo la membrana el tamano de poro de 7-10 |im, por ejemplo 8 |im o un valor similar, por ejemplo, dentro del intervalo de ±1 |im declarado por el fabricante. El filtro de membrana esta hecho preferiblemente de un material biocompatible tal como policarbonato, que ofrece las ventajas de flexibilidad y biocompatibilidad.
Minimizar los efectos de la coagulacion y aumentar la velocidad de filtracion puede lograrse adicionalmente usando un filtro mas grande con la mayor superficie filtrante disponible. Se pueden utilizar, por ejemplo, membranas de policarbonato con un tamano de poro de 8 |im con un diametro de membrana de 25 mm.
El termino "contacto mtimo" se refiere a un contacto tan estrecho del filtro de membrana y del material absorbente que no afecta la accion capilar a traves de la membrana en el material absorbente, es decir, un acceso de aire a la interfase entre la membrana y el material absorbente, que esta en contacto directo con el lfquido filtrado solo a traves de los poros de la membrana, se evita durante la operacion. Esto puede lograrse, por ejemplo, empujando los bordes de la membrana, o la membrana sujetada en un aparato adecuado, a la superficie del material absorbente, o empujando los bordes de la membrana montados en un soporte adecuado bajo ligera presion en la superficie flexible del material absorbente.
El material absorbente tiene una capacidad de absorcion suficiente y es capaz de absorber suavemente todos los elementos sangumeos y otros elementos que estan presentes en el fluido corporal de viscosidad variable y el absorbente consiste principalmente en pulpa, papel fino, fibras textiles o combinaciones de los mismos en particular.
El volumen del fluido corporal filtrado esta limitado por la capacidad de succion del material absorbente y por su volumen. Por lo tanto, el tamano y/o el volumen del aparato y las caractensticas del material absorbente pueden adaptarse al uso pretendido. Ventajosamente, usando un unico aparato se puede filtrar un volumen de 50 ml y mas. El metodo y el aparato funcionan incluso desde un volumen mmimo de sangre, tal como menos de 1 ml, sin embargo, con un volumen creciente de fluido corporal filtrado, aumenta la probabilidad de capturar las celulas esporadicas.
El aparato de acuerdo con la invencion preferiblemente comprende ademas un recipiente hueco abierto superior e inferior para recibir una mezcla de celulas esporadicas presentes en el fluido corporal, en donde la periferia inferior del recipiente esta en contacto estrecho con al menos una parte del primer lado superior de la membrana y en donde al menos una parte del segundo lado inferior de la membrana esta en contacto mtimo con el material absorbente de manera que la membrana separa el espacio interior del recipiente de dicho material absorbente. El borde superior del recipiente puede ampliarse preferiblemente para obtener un embudo y/o dicho borde puede estar provisto de un tamiz para eliminar los coagulos ya presentes en la sangre, etc.
Por la razon anterior, Para conseguir el area de filtracion maxima al menos parte del primer lado de la membrana y al menos parte del segundo lado de la membrana se colocan uno contra el otro sobre la zona mas grande que maximiza el area de contacto entre el material absorbente y las celulas esporadicas presentes en el fluido corporal, separados por una membrana.
En otra realizacion, el material absorbente esta dispuesto en un recipiente colector de base provisto de una tapa superior, en el que la tapa desde arriba de un soporte de membrana circunferencial se acopla de forma liberable, y
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en donde dicho soporte, por medio de un anillo de presion, sujeta de forma liberable la membrana a lo largo de su circunferencia y en donde al deposito por encima del soporte se puede fijar firmemente a lo largo de la circunferencia de dicho soporte. El aparato esta disenado preferiblemente para un unico uso, pero no se excluye ni una realizacion del aparato para reutilizar todos los elementos excepto la membrana y el material absorbente.
Descripcion de los dibujos
La figura 1 ilustra una realizacion de un aparato de filtro en dos vistas
La figura 2 muestra una realizacion de un aparato de filtro en una vista expandida (el material absorbente no se muestra)
La figura 3 ilustra una realizacion de fijacion de la membrana en el soporte
La figura 4 muestra un cultivo celular in vitro de CTCs separados de sangre periferica de pacientes con cancer de prostata, CTCs crecidos en un filtro de membrana
La figura 5 muestra el cultivo in vitro de CTCs en el filtro de membrana, el metodo de tincion de May-Grunwald se ha utilizado para analisis hematologicos
La figura 6 ilustra el procesamiento de las celulas separadas por inmunohistoqmmica (CTCs aislados de sangre de un paciente con cancer de prostata metastasico tenido por anticuerpo contra la pan-citoqueratina)
La figura 7 muestra un par de CTCs separados que, en el curso del cultivo, penetraron el filtro en el fondo de las concavidades de cultivo (se uso el metodo de tincion de May-Grunwald para el analisis).
EJEMPLOS
Abreviaturas:
CTCs celulas tumorales circulantes DTCs celulas tumorales diseminadas CFTC celulas trofoblasticas fetales circulantes NI-PND diagnostico no invasivo prenatal
PBS solucion reguladora de fosfato con NaCl 0.15 M, solucion salina esencialmente regulada FBS suero bovino fetal
EDTA la quelacion 2, acido etilendiaminotetraacetico Ejemplo 1
Determinacion de celulas tumorales circulantes en cancer de prostata de la sangre periferica de pacientes sometidos a extirpacion quirurgica del tumor primario
5-10 ml de sangre periferica se recoge durante la cirugfa en un tubo colector con EDTA (por ejemplo, Vacuette K3E (REF 456 036), S-monovette K3E (REF 02.1066.001). La sangre se procesa inmediatamente o se almacena a 4°C durante un maximo de 24 horas.
La sangre periferica se aplica gradualmente por la pipeta al recipiente 3 del aparato para realizar la filtracion. La sangre presente en el primer lado de la membrana 1 se filtra a traves del filtro de membrana 1 del diametro de 25 mm constituida por una membrana de policarbonato (PCTE) con un tamano de poro de 8 micras (GE, policarbonato, 8.0 micras, 25 mm), en donde el filtro de membrana 1 esta en contacto mtimo con el material absorbente 2, la pulpa (Pur-Zellin Hartmann). El proceso de filtracion dura aproximadamente 5 min, dependiendo del volumen de la sangre filtrada y de la viscosidad de la sangre.
Ademas, es posible proceder de varias maneras:
Despues de la filtracion, el filtro de membrana 1, fijado en un soporte 6 y que comprende CTCs aislados, se transfiere a una concavidad de una placa de cultivo de 6 concavidades en la que el medio de crecimiento RPMI (4 ml), RPMI (Sigma R8758), enriquecido con FBS (F2442, Sigma) y antibioticos (penicilina-estreptomicina (P4458,
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Sigma), anfotericina (A2942), Sigma). Las celulas capturadas se cultivan entonces como cultivo de tejido normal durante al menos 14 dfas a 37°C, 5% de CO2, con un intercambio de medio cada 3 d^as.
El cultivo celular en crecimiento se tino de acuerdo con el protocolo estandar de tincion inmunohistoqmmica de May- Grunwald y una fotograffa de microscopio de luz invertida se muestra en la figura 4.
La figura 5 muestra una disposicion similar de una variacion de la tincion por inmunofluorescencia de CTC en cancer de prostata (pan-citoqueratina-FITC, Sigma), cubierta con Prolong Gold™ con DAPI).
2. Despues de la filtracion, el filtro de membrana 1 que contiene CTCs aislados se enjuaga con 1 ml de medio y dicho medio con las celulas lavadas del filtro se transfiere a continuacion a una placa de 24 concavidades donde se superpone sobre una lamina de microscopio colocada en el fondo de la concavidad (Assistent, N.1001, 12 mm de diametro). Las celulas crecen directamente sobre el portaobjetos del microscopio, lo que facilita la manipulacion durante la tincion inmunohistoqmmica y el posterior analisis inmunohistoqmmico, al menos 14 dfas a 37°C, en una atmosfera de CO2 al 5%, con cambio medio cada 3 dfas.
3. Despues de la filtracion, el filtro de membrana 1 que contiene CTCs aislados se enjuaga con 1 ml del medio, el medio con las celulas de la membrana se transfiere a continuacion por pipeta en camaras de cultivo (Nunc® Lab- Tek® ChamberSlideTM (4 camaras) para la microscopfa confocal (el sistema de captura de video en tiempo real Time-lapse imaging, Leica) y luego se cultivo como cultivo de tejidos normales al menos 14 dfas a 37°C, 5% de atmosfera de CO2, con cambio medio cada 3 dfas.
En todos los ejemplos mencionados anteriormente, el cultivo de las celulas esporadicas en la membrana y las celulas esporadicas lavadas de la membrana se llevo a cabo sin ningun problema. Del mismo modo, el cultivo de celulas de otros tipos de tumores aislados por el metodo de la presente invencion se llevo a cabo sin ningun problema. Por el contrario, el cultivo exitoso de celulas esporadicas, separadas de fluidos corporales de pacientes por metodos conocidos en la tecnica, tanto en una membrana como sin la membrana, no se ha evidenciado todavfa.
4. Despues de la filtracion y el enjuague de las celulas esporadicas capturadas en el filtro por los 2 ml de RPMI, el filtro de membrana 1 montada en un soporte que contiene CTCs aislados se tine directamente mediante el protocolo de tincion estandar de May-Grunwald y se evalua la presencia de celulas esporadicas bajo el microscopio.
Ejemplo 2
Determinacion de celulas tumorales diseminadas en el cancer de ovario metastasico del derrame pleural
Las celulas tumorales diseminadas del derrame pleural extrafdas de un paciente con cancer de ovario metastasico se separaron de la siguiente manera: la efusion se aplico mediante una pipeta al recipiente 3 del aparato de filtracion. La efusion en el primer lado de la membrana 1 se filtra a traves del filtro de membrana 1 de 25 mm de diametro hecha de una membrana de policarbonato (PCTE) con un tamano de poro de 8 pm como en el ejemplo 1, en donde el material absorbente 2, pulpa (Pur-Zellin, Hartmann) es inmediatamente adyacente al filtro de membrana 1. Las celulas se fijaron al filtro y se analizaron como manchas hematologicas de sangre, se tineron mediante el protocolo de tincion estandar de May-Grunwald y se evaluaron bajo el microscopio.
Ejemplo 3
Aparatos para la filtracion
Una realizacion del aparato para realizar la filtracion mostrada en las figuras 1-3 comprende un filtro de membrana 1 de policarbonato, con un tamano de poro de 8 pm, cuyo material 2 absorbente consiste en pulpa que esta en contacto mtimo, desde el lado inferior de dicha membrana. El aparato incluye ademas un recipiente 3 hueco de arriba y abajo para recibir una mezcla de celulas esporadicas presentes en el fluido corporal. Para un vertido mas facil de lfquidos, el borde superior del recipiente 3 se ensancha para formar un embudo. La periferia inferior del recipiente 3 esta en contacto estrecho con el primer lado superior de la membrana 1 y el segundo lado inferior de la membrana 1 esta en contacto mtimo con el material 2 absorbente, de manera que la membrana 1 separa el espacio interior del recipiente 3 de dicho material 2 absorbente.
El material 2 absorbente esta dispuesto en un recipiente 4 colector de base provisto de una tapa 5 superior, en cuya tapa un soporte 6 de membrana circunferencial se acopla de forma liberable desde arriba. El soporte 6 es movil verticalmente con respecto a la tapa 5 y por lo tanto tambien al material 2 absorbente, que permite el contacto mtimo del filtro de membrana 1 con el material 2 absorbente, o el empuje del anillo de presion 7 en el material 2 absorbente respectivamente para un contacto perfecto de la membrana 1 y del material 2 absorbente. El soporte 6 sujeta la membrana 1 a lo largo de su circunferencia por medio del anillo 7 de presion, de manera que pueda soltarse de forma liberable utilizando una rosca, de modo que el conjunto del soporte 6, el filtro de membrana 1 y el anillo 7 de presion pueden ser retirados del aparato en su conjunto y las celulas capturadas pueden tenirse o cultivarse
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directamente sobre la membrana 1. El recipiente 3 esta unido de manera liberable mediante una conexion de bayoneta al soporte 6 a lo largo de su circunferencia.
Ejemplo 4
Comparacion de dos tipos de tecnologfa de filtro en relacion con la presencia de un precipitado
El objetivo del experimento fue comparar la filtracion de celulas sangumeas que contienen celulas esporadicas aceleradas por vado con la filtracion usando fuerzas de capilaridad de acuerdo con la invencion en relacion con una evaluacion de la presencia de celulas esporadicas recogidas en el filtro de membrana, que depende principalmente de la presencia de un precipitado y de elementos residuales de celulas sangumeas en el filtro de membrana.
Ambos procedimientos utilizan una membrana con un tamano de poro declarado de 7-8 |im y un material absorbente como en el ejemplo 1. Con el fin de conseguir unos tiempos de filtracion aproximadamente iguales se utilizaron filtros de diferentes tamanos - se uso el filtro con un diametro de 7 mm para la filtracion al vado y el filtro de diametro de 25 mm para una filtracion usando fuerzas capilares.
El mismo volumen de 2 ml de sangre obtenido como en el ejemplo 1 de un paciente con cancer de prostata se filtro a traves de los dos sistemas de membrana a temperatura ambiente, con los tiempos 87 s de filtracion para la filtracion usando el sistema de vado y 97 s para la filtracion usando fuerzas capilares de acuerdo con la invencion.
En el caso de la filtracion al vado se ha observado una frecuencia de precipitacion sangumea en los filtros, lo que hizo imposible evaluar la presencia de celulas esporadicas en el filtro durante la microscopfa. Cuando se utiliza el metodo de filtracion por fuerzas capilares de acuerdo con la invencion, no hay precipitado presente en el filtro.
Ejemplo 5
Comparacion de dos tipos de tecnologfa de filtro desde el punto de vista del enjuague
Se uso la misma configuracion que en el ejemplo 4, excepto que la muestra de sangre se tomo de un paciente con cancer de mama. Debido a que frecuentemente se encontro formacion de coagulos durante la filtracion a vado en este tipo de muestras, lo que condujo a una evaluacion diffcil debido principalmente a los globulos rojos atrapados en el precipitado, los filtros se lavaron con 2 ml adicionales de medio de crecimiento (RPMI) despues de la filtracion de sangre.
Como era de esperar, el precipitado permanecio en el filtro despues de la filtracion a vado, pero el enjuague ayudo a eliminar el residuo de globulos rojos, y por lo tanto la evaluacion global de la presencia de celulas esporadicas en el filtro despues del enjuague con RPMI es mejor que en el caso sin enjuagar. La filtracion total y el tiempo de aclarado del filtro con un medio RPMI fue de 4 min 37 s.
Despues de utilizar las fuerzas capilares para la filtracion, el filtro mostro una mejor evaluacion incluso sin aclarado que el filtro despues del uso del vado. La evaluacion de la presencia de celulas esporadicas en el filtro despues del enjuague con RPMI mejoro adicionalmente y fue mejor que la evaluacion del filtro enjuagado usando vado. El tiempo total de filtracion y enjuague para el filtro con medio RPMI fue de solo 39 s en este caso.
En consecuencia, se confirmo la ventaja del uso de fuerzas capilares para la separacion por filtracion de celulas esporadicas, tanto en vista de la aparicion de coagulos, como tambien en vista de la evaluacion de la presencia de celulas esporadicas. Ademas, se observo una reduccion en el tiempo de filtracion en la etapa de enjuague con medio RPMI.
Claims (14)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Uso de un metodo para la separacion de celulas esporadicas, presente en el fluido corporal de un paciente, capturandolas en un filtro de membrana que tiene aberturas menores que el diametro de las celulas, en el que a partir de las celulas esporadicas presentes en dicho fluido corporal presentes en el primer lado del filtro de membrana, el fluido corporal libre de celulas esporadicas se extrae a traves del filtro de membrana en virtud de la fuerza capilar en un material absorbente situado en contacto mtimo con el segundo lado de dicho filtro de membrana para obtener dichas celulas esporadicas capturadas sobre la membrana que permanecen mecanicamente y qmmicamente sin cambios y por lo tanto viables, lo que permite su posterior cultivo eficaz.
- 2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque las celulas esporadicas presentes en el fluidocorporal son celulas tumorales circulantes, celulas tumorales diseminadas, celulas endometriales y celulastrofoblasticas fetales circulantes.
- 3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque el fluido corporal se selecciona de sangreperiferica o central, medula osea, fluido ascftico, derrame pleural, lfquido de lavado peritoneal, lavado broncoalveolar y lfquido amniotico.
- 4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho fluido corporal es un fluido corporal de pacientes con melanoma, cancer de mama, tumores del tracto gastrointestinal tales como carcinoma gastrico, carcinoma de colon, carcinoma de pancreas y carcinoma de hngado; tumores urogenitales y tumores de tejidos blandos tales como tumores de cabeza y cuello y otros tumores solidos.
- 5. El uso de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizado porque la sangre periferica se recoge como sangre periferica anticoagulada.
- 6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque antes de la separacion el precipitado que contiene el fluido corporal se diluye con una solucion reguladora, particularmente con PBS, con el fin de disolver el precipitado.
- 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque despues de la separacion, se lleva a cabo la deteccion y/o cuantificacion y/o cultivo de las celulas separadas en el filtro de membrana o las celulas expulsadas del filtro de membrana en un recipiente de cultivo.
- 8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizado porque antes de la separacion el fluido corporal se diluye con un medio de cultivo, RPMI en particular, para aumentar el exito del cultivo subsiguiente.
- 9. Un aparato para la separacion de celulas esporadicas, presentes en el fluido corporal de un paciente, capturandolas en un filtro de membrana que tiene aberturas menores que el diametro de las celulas, en el que a partir de las celulas esporadicas presentes en dicho fluido corporal presentes en el primer lado del filtro de membrana, el fluido corporal libre de celulas esporadicas se extrae a traves del filtro de membrana en virtud de la fuerza capilar en un material absorbente situado en un contacto mtimo con el segundo lado de dicho filtro de membrana, para obtener dichas celulas esporadicas capturadas sobre la membrana permaneciendo mecanica y qmmicamente inalteradas y por lo tanto viables, lo que permite su posterior cultivo eficaz., caracterizado porque dicho aparato comprende un recipiente (3) hueco abierto superior e inferior para recibir una mezcla de celulas esporadicas presentes en el fluido corporal, en donde la periferia inferior del recipiente (3) esta en contacto estrecho con al menos una parte del primer lado superior de la membrana (1), teniendo dicha membrana el tamano de poro de 7-10 pm y estando hecha de un material biocompatible, y en donde al menos una parte del segundo lado inferior de la membrana (1) esta en contacto mtimo con el material (2) absorbente de manera que la membrana (1) separa el espacio interior del recipiente (3) de dicho material (2) absorbente.
- 10. El aparato de acuerdo con la reivindicacion 9, caracterizado porque el material (2) absorbente esta dispuesto en un recipiente (4) colector de base provisto de una tapa (5) superior, en cuya tapa un soporte (6) de membrana circunferencial se acopla de forma liberable desde arriba, y en donde dicho soporte (6), por medio de un anillo (7) de presion, retiene de forma liberable la membrana (1) a lo largo de su circunferencia y en donde el deposito (3) desde arriba del soporte (6) se puede fijar hermeticamente a lo largo de la circunferencia de dicho soporte (6).
- 11. Aparato segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizado porque el filtro de membrana (1) tiene un tamano de poro de 8 pm.
- 12. El aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el filtro de membrana(1) esta hecho de policarbonato.
- 13. El aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el material absorbente(2) esta constituido por celulosa, papel fino, fibras textiles o una combinacion de las mismas.
- 14. El uso de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizado porque para llevar a cabo la deteccion y/o cuantificacion y/o cultivo, las celulas separadas son transferidas sobre el filtro de membrana (1) fijada en un soporte (6) de la reivindicacion 10.
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