CZ220196A3 - Bioconjugate complexes - Google Patents

Description

Vynález se týká oblasti přípravy biokonjugátú a konkrétněji skupiny komplexů fenylboronových kyselin vhodných pro konjugaci biologických makromolekul a způsobu přípravy a použití takových komplexů.

Dosavadní stav techniky · nebo s jinými molekulami včetně radionukiidů, toxinů,

Bíokonjugace je popisný termín pro spo j o vání· dvou nebo více různých molekul pomocí chemických nebo biologických způsobů, při kterém je alespoň jednou molekulou biologická makromolekula. Bíokonjugace zahrnuje konjugaci proteinů, peptidů, poíysacharidů, iektinú, hormonů, nukieových kyselin, liposomů a buněk, mezí sebou poskytujícími vhodné vlastnosti, haptenů, inhibitorů, fiuoroforů, ligandů atd. Za speciální případ bíokonjugace se považuje rovněž imobilízace biologických makromolekul, při které se makromolekula konjuguje, buď reverzibilně nebo ireverzibilně, s nerozpustným nosičem. Bíokonjugace se hojně, používá, v biochemickém, -imunochemickém a molekulárně bio logickém výzkumu. Existuje celá· řada· použ-ití- — bíokonjugace a patří mezi ně afinitní chromatografie, afiriitní cytochemie, hístocnemie, patologická sondová detekce, diagnostika, signální amplifikace, imunologické testy, hybridomaticke techniky, blotovací techniky, bibáfinitní senzory, genová sondová detekce, zesíťující činidla, afinitní cílení, afinitní perturbace, cílené podávání léčiv, fůsogenní réakční činidla, imobiiizáční ^v*r'ěakčhí činidla? ^£elaktivní' vyhledávání, selektivní eliminace, kapalinová cytometrie a cytoicgická sondová detekce. Mezi systémy dosavadního stavu techniky pro přípravu biokonjugátú patří systémy Avidin-3iotin a Digoxigenin-anti-Digoxigenin.

O fenylboronových kyselinách je známo, že vstupuji do interkací s řadou polárních molekul, které mají potřebné funkční skupiny. Je známo, že se buď s neutrální fenylboronovcu kyselinou nebo s fenylboronátovým ,aníontem vvrvářejí různě stabilní komplexy včetně 1,2-diolů, 1,3-diolů, 1, 2-hydroxykyselin, 1,3-hydroxykyselin, 1,2-hydroxyiaminů, 1,3-hydroxylaminů, 1,2-diketonů a 1,3-diketonů. Imcbilizovanou fenyiboronovou kyselinu lze použít jako v chromatografii pro selektivní získání biologických molekul s odpovídajícími funkčními skupinami z komplexních vzorků. Mnohé důležité biologické molekuly, včetně glycidů, -kat echo laminu prostaglandinů,.. ribonukleosidů a,, steroidů, obsahují potřebné funkční skupiny a lze je tudíž izolovat tímto způsobem.

enyiboronová kyselina, podobně jako kyselina orthoboritá, je Lewisovou kyselina, a ionizuje ne pomocí přímé deprotonace, ale hydratací fenviboronátováho aniontu (pK₄ kyselina je třikrát silnější orthoboritá. Ionizace fenylboronově kyseliny je důležitým faktorem v komplexaci v tom, že ionizací bor přechází z trojboké koordinace (s průměrnými vazebnými úhly 120° a vazby l,37.10'^l° m) na tetraedricky (s průměrnými vazebnými úhly 109° a za vzniku tetraedrického = 3,36). Fenvlboronová než kvselina.

kyselinou průměrnými délkami koordinovaný anion průměrnými délkami vazby 1,43.10

m)

Žádoucí by bylo vytvoření systémů používajících fenylboronově kyseliny s hodnotami pK_a nižšími než je tato hodnota u '(.3-aminofenyl)boronové kyseliny (pK_a = 8,75) (která je nejbežněji komerčně dostupným derivátem), jelikož by to umožnilo.zachycení řady bíomolekul za fyziologických podmínek (pH 7,2), a tím by se podstatně rozšířil rozsah sloučenin vhodných pro analýzu pomocí této metody. Mezi reprezentativní fenylboronově kyseliny, které mají hodnoty pK₄ nižší než (3-aminofenyl)boronová kvselina patří následující sloučeniny:

pK₄ = 9, 20 pK₄ = 9,20

pK₄ = 7,30· ρΚ₄, = 7,15 . V současné době je známo, _ že_ sloučeniny s _;cis- nebo'·, koaxiálními 1,2-diolovými. a 1,3-dioíovými funkčními skupí- . námi, a zejména .glycidý; tvoří komplexy s imobilizovaným . fenylboronátovým' aniontem za vzniku cyklických esterů pouze za. alkalických vodných podmínek. Je známo, že okyselením1,2-diolových a 1,3-diolových komplexů se uvolní sloučenina obsahující diolové ' skupiny, pravděpodobně v důsledku hydrolýzy cyklického . esteru, která je vyvolána kruhovým, pnutím souvisejícím s pětičlenným cyklickým esterem baronově kyseliny obsahujícím trojboce koordinovaný bor. Je známo, že koplanární aromatické 1,3-dioíy, jako 1,8-dihydroxvnáftaleň, tvoří komplexy dokonce i za kyselých podmínek diky stabilitě šestičlenných cyklických esterů baronových kyselin proti hydolýze. Je rovněž známo, ze substituované fenoly s »

if.

připojenými l·,3-hydroxylamídovými, 1,3-hydroxyamídinovými a 1, 3-hydroxyoximovými zbytky tvoří komplexy reverzibilně s borátcvým pufrem, za alkalických vodným podmínek, analogickým způsobem, jakým tvoří komplexy fenyiboronové kyseliny.

?řes rozsáhlý výzkum v oblasti biokonjugace a velké množství investic do této oblasti nebyla dosud využívána selektivita fenvlboronové kyseliny pro umožnění konjugace biologických makromolekul navzájem nebo s jinými molekulami, které přinášejí vhodné vlastnosti. Kromě toho je nové použití imobilizovaných komplexotvornýcn zbytků, které mohou -selektivně 'tvořit..-komplexy,.se. zbytky fenylboronoyých kyselin. Toto použití je obzvláště zajímavé například v případě, kdy je zbytek fenylbcronové kyseliny navázán na biologickou makromolekulu, .jako je protilátka, která se pak muže navazat na komplexotvořný zbytek využitím selektivity zbytku fenylborohové kvselinv k tomuto komclexotvornému zbvtku.

Podstata vynálezu

Následující termíny mají v tomto'textu tyto významy:

Bioaktívní látka označuje sloučeninu výhodně vybranou,’ aniž by se však jednalo o Omezující výčet, ze souboru zahrnujícího proteiny, peptidy, polysacharidy, hormony, nukleové kyseliny, liposomy, buňky, léčiva, radionuklidv, toxiny, hapteny, inhibitory, fluorofory, ligandy a protilátky (například monoklonální protilátky vykazující specifičnost “WV****?* —η-, -i,' -I 1 I -i x“i Ί TI pro.....epítopý’ na“ Iconkřétni 'popů 1 ači^ isůně k/' nap ří k 1’ači* kón.kré t ni populaci hematopoetických buněk, zejména protilátky anti-CD34). Bioaktívní látkou může být rovněž pevný nosič, jak je definován níže. Obecně jsou bioaktivními látkami typicky ty sloučeniny, které poskytují biokonjugátovým komplexům biologickou účinnost nebo detekční schopnosti. Pokud je bioaktívní látka navázána na semikonjugát nebo biokonjugátový komplex podle vynálezu (například odpovídá zbytkům ΞΑΞ, SAS', SAS* nebo BAS*' v obecných vzorcích I - X, XIII, XV, XX _ a XXI uvedených níže), naoríklad po reakci s elektrofiíním nebo nukleofilním reaktivním zbytkem (například odpovídajícím symbolu R v obecných vzorcích XI, XII, XIV, XVI nebo XVII uvedených níže), může popřípadě dále obsahovat zbytek výše uvedeného elektrofilního nebo nukleořiíního reaktivního zbvtku.

Pevný nosič (solid phase support) označuje pevný, nerozpustný povrch nebo částici vhodnou pro navázání k ' činidlu tvořícímu komplexy s řenylborcnovými kyselinami nebo reakčnímu· činidlu-na- bázi - fenylboronové-' kyseliny,'--jak'- je definováno dále (například kovové nebo plastové kuličky, například popřípadě potažené glycidem nebo proteinem pro usnadnění navázáni·: k činidlům.:' tvořícím:.....komplexy s.

fenyibc.ro novými' kyselinami nebo reakčním· . činidlům .na bázi fenyiborcncvé kyseliny, jak j sou' definována . dále.), například, vhodnou pro použiti v systému izolace nebo čistění nebo v testovacím, systému,, například, systému... používajícím., .monov klonální.· protilátku .navázanou, na pevný·' nosič·' ve- formě .

biokonj.ugátevého . komplexu,. j ak...j e definován,, dále ... .

» . , ...„Činidlo tvořící komplex s fenylboronovou kyselinou označuje'činidlo obsahující zbytek tvořící komplex s fenylbóronovou 'kyselinou· a reaktivní zbytek vhodný pro navázání zbytku tvořícího komplex . s fenylboronovou¹ kyselinou k bioaktivní látce nebo .pevnému nosiči.

Reakční činidlo na bázi fenylboronové ·. kyseliny označuje činidlo obsahující zbytek fenylboronové kyseliny a

P reaktivní zbytek vhodný pro navázání zbytku fenylboronové kyseliny k bioaktivní. látce. .

Zesilující činidlo na bázi fenylboronové kyseliny označuje činidlo obsahující dva zbytky fenylboronových kyselin oddělené spojovací skupinou.

Semikonjugát tvořící komplex s fenylboronovou kyselinou označuje bioaktivní látku nebo pevný nosič s připojeným zbytkem tvořícím komplex s fenylborcnovou kyselinou, kterýžto semikonjugát se získá reakcí bioaktivní látky nebo pevného nosiče s činidlem tvořícím komplex s fenylbcronovou kyselinou.

Semikonjugát fenylboronové kyseliny označuje bioaktivní látku s připojeným zbytkem fenylboronové kyseliny, kterýžto semikonjugát se získá reakcí bioaktivní látky s reakčním činidlem na bázi fenylboronové kyseliny.

Biokonjugátový komplex označuje biokonjugát spojující ďvě bioaktivní látky'(které mohou být stejné nebo rozdílné)^ nebo bioaktivní látku a pevný nosič, přičemž vazba obsahuje alespoň jeden atom boru, například alespoň jeden komplexfenylboronové kyseliny, například produkt vytvořený reakci'semikonjugátu tvořícího komplex s fenylbcronovou kyselinou 5=· semikonjugátem fenylboronové kyseliny,.nebo produkt vytvořený reakcí semikonjugátu tvořícího komplex s fenylborcnovou' kyselinou se zesíťujícím činidlem na bázi fenylboronové’ kyseliny.

.. .-.^-Obecně- jsou biokonjugátovými- komplexy podle vynálezu například, sloučeniny, níže uvedených, obecných, ' vzorců .1. až X, shrnuj ícího· obecného-vzo-rce-A...... - ... ---..................— ......'......

BAS-L-Bc-L' - (Bc' -L) _a-BAS ' (A!

ve kterém

BAS a BAS' představují bioaktivní látky, které mohou být stejné nebo rozdílné,

L, L' a L znamenají spojovací skupiny, které mohou být stejné nebo rozdílné a například odpovídající skupinám 2, Z', Z*, Z*', Y a Y* v obecných vzorcích I až X,

3c a Bc' představují komplexy fenylboronových kyselin, které mohou být stejné nebo rozdílné, obecného vzorce D-E nebo E-D, kde

D -znamená- zbytek fenylboronove kyseliny, například výhodně odvozený od derivátu nebo analogu . . fenylboronové kyseliny, a. - . .

E představuje zbytek tvořící komplex s fenyíboronovou kyselinou, například výhodně odvozený od derivátu nebo analogu salicyiové kyseliny, a n má hodnotu 0 nebo 1.

Pokud ΞΑ3 představuje pevný nosič, výhodně 3c znamená skupinu.-E-D-, . nebo-Za-i-n^-má·*· hodnotu --1,--anebo/a -BAS/ .znamená protilátku. '

Vvnále-z ... tudíž’ oooisuie -novou s kun i nu biokonj.ugázcvých komplexů, odvozených,, cd. komplexů · fenylboronových. kyselin, a· zpús.ob přípravy a použiti takových biokonjugátových-komplexů.Podle vynálezu, na rozdíl od- systémů Avldin-Hiozin 'a Digoxigenin-anti-Digoxigenin z dosavadního stavu techniky, jsou využity ' komplexy .fenylboronových kyselin, pro usnadnění: chemické konjugace - '.bidaktivni ylátky. bez použití ir. terme.řz diárních biologických makromolekul.. ..-Biokonjugátové” komplexy spojující dvě'/bioaktivní 'látky,, vs .kterých je bor y^ komplexus 'dusíkem, -který je - zase navázán- přes·'-''spojovací⁷ žbytěk''na ^; bioaktivn-í:.látku, jsou znázorněny například obecnými ¹vzorci 1' až VI: - , -

-3AS¹ (I) ¹ Biokonjugátcvými komplexy, .ve kterých komoiexv obecného vzorce sou h

je vybrán ze síry, skupinu kde alkyl o: délce 1 až 4 uhlíku, příče souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom : NE, skupiny M-alkyl, N-aryl a NCK.-aryl, rnačuje uhlovodíkový zbytek, například o atomy uhlíku, například o délce až 6 atomů mž řetězce mohou být rozvětvené, a aryl je vybrán ze souboru zahrnujícího substituované aromatická kruhy aromatické kruhy, aromatické kruhy, a kondenzované je vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NK, CE-, alkylové skupiny a arylové skupiny, kde alkylová.._rskupina--označuje uhlovodíkový ^zbytek, například o délce 2 až. £ atomů uhlíku, a arylová skupina je vybrána ze souboru zahrnujícího aromatické kruhy, substituované aromatické kruhy a kondenzované aromatické kruhy,

Z*, které mohou být stejné nebo vždy spojovací skupinu vybranou z alkylové řetězce a polyetherové, glykoiové, řetězce o délce od ekvivalentů, přičemž řetězec v obsahovat tednu nebo nekoli rozdílné, představují; e souboru zahrnujícího například polyethylen1 do 16 uhlíkových sobě popřípadě mužek amidových nebo /a;p disulfidových vazeb, a

-BAS-a- BAS*- známe na j-í-s-te j-n-é- nebo-rozd-íiné-b-i-oak-t-i-vní--l-á-t-k-y-.- —

Biokonjugátcvými komplexy obecného vzorce I ' jsou výhodně komplexy, ve kterých ··* q- - -j_e vybrán ze-souboru zahrnuj íčího atom -kyslíku, skupinu

NH a NCjHj,

Y představuje atom kyslíku nebo skupinu CE.,

Za Z* jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího skupiny (CH.!_a, kde n má hodnotu 1 až 5, a skupiny (CH.CE.O) _a , kde n' má hodnotu 2 až 4, nebo/a

BAS a BAS* jsou dvě rozdílné bioaktivní látky, například ;dna z nich je pevným nosičem a druhá protilátkou.

B i o kc n jug á tovými.

komplexy obecných,, vzorců' „II., a. III. .jsou komplexy,, ve· kterých ..

·>·?*.

Q·, a..Qí.yj sou.,nezávisle, ^na .sobě „vybrány ze' souboru, zahrnuj íciho atom' kysliku, atom siry, skupinu ·ΝΗ,.skupiny .N-alkyl, li- . ;

N-ařvli~a ' NCH.-aryí/ . kde alkyl.· označuje-, uhlovodíkový zbytek, například o délce 1 až 4 .atomy uhlíku,'nebo o délce až 6 atomů uhlíku,··· přičemž' řetězce - mohou j-b-ýt rozvětvené, a aryl -je vybrán*'že . souboru zahrnujícího aromatické kruhy, substituované aromatické kruhy a kondenzované aromatické kruhy, '4

Y'a Yjsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru' zahrnuj íciho atom kyslíku, skupinu NH, CH,, aikylové skupiny, a aryiové skupiny, kde alkylová skupina označuje uhlovodíkový zbytek, například o‘ délce 2 ¹ až δ atomů uhlíku, . a arylová·. .skupina je· vybrána ze souboru

LO zahrnujícího aromatické kruhy, substituované aromatické kruhy a kondenzované aromatické kruhy, každý ze symbolu Z, Z' a Z^ir představuje vždy spojovací skupinu vybranou ze souboru zahrnujícího alkyiová řetězce a polyetherové, například polyethylenglykolové, řetězce o délce od 1 do 15 uhlíkových ekvivalentů, přičemž řetězec v sobě popřípadě muže obsahovat jednu nebo několik amidových nsno/a disulfidových vazeb, a

BAS a BAS' znamenají stejné nebo rozdílné bioaktivní látky.

Výhodně,· pokud jsou BAS a BAS' stejné., jsou Q a· Q'., Y a Y' a Z a Z' rovněž stejné.

Y a Y' jsou vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku skupinu ČHj,

Z, Z' a Z’ mohou být stejné nebo rozdílné a jsou vybrány ze • souboru zahrnuj ícího.,,.-skupiny (.CHjU, kde n má hodnotu 1 -až- 5,· a-skupiňy- (CH.CH.O-) _a-,- kde n.' má., hodnotu.. 2 . až.. _4,.

nebo/a skupiny BAS jsou buďto stejnými bioaktivními látkami nebo jedna ze skupin BAS představuje pevný nosič zatímco druhá znamená bioaktivní látku jinou než pevný nosič, například protilátku.

Q.J - .Z*-3AS* (IV)

Ύ

I

Z—3AS

X

-11vzorce IV jsou

Bickonjugátovými komplexy obecného komplexy, ve kterých

X je vybrán ze souboru zahrnujícího methvlovou skuoínu a fenvlovou skuoínu, atom vodíku, je vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NH, Crh, aíkylové skupiny a arylové skupiny, kde alkylová skupina označuje uhlovodíkový zbytek, například o délce 2 až 6 atomů uhlíku nebo o délce až 6 atomu uhlíku, a arvlová skupina je vybrána ze souboru zahrnujícího aromatické kruhy, substituované aromatické kruhy a kondenzované aromatické kruhy, skupiny 2 a Z* mohou .být stejné nebo rozdílné a představují vždy spojovací skupinu vybranou.ze souboru zahrnujícího aíkylové. řezězce a polyethe.rové, například ..polyethylenglykolové, řetězce, o délce cd. i do 15 uhlíkových ekvivalentů; přičemž řetězec v sobě popřípadě může obsahovat jednu nebo několik amidových nebo/a di sul řádových vazeb., a skupiny SAS a· BAS’, znamenají stejné 'nebo', rozdílné bioaktivní. látkv.

Biokonjugáďovými'' komplexy-’; obecného vzorce' IV’'jsou·' výhodně komplexy, ve kterých

X je vybrán, aniž by šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího atom vodíku a fenylovou skupinu, »*·' · - X

Y je výhodně vybrán, aniž by šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího atom kyslíku a skupinu CH., skupiny Z a Z*' mohou být stejné vybrány, aniž by šlo o zahrnujícího skupiny (CH-) skupiny (CH-CH.O)_a , kde n' skupiny SAS a BA.S’ jsou různými .nebo rozdílné a jsou výhodně omezující výčet, ze souboru _a, kde n má hodnotu 1 až 5,.. a má hodnotu 2 až 4, nebo/a bioaktivními látkami, výhodně jedna z nich představuje pevný nosič a druhá znamená bioaktivni látku jinou než pevný nosič, například protilátku.

(v)

- ' Biokorij-ugátovými-.komplexy· obecných, vzorců V a VI -jsou komplexyž ve kterých ' . *

X a X^J jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího atom vodíku, methylovou skupinu a fenylovou skupinu,

Y a Y' jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru, zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NH, CH_;, alkylové skupiny a aryiové skupiny, kde alkylové skupina označuje uhlovodíkový zbytek, například o délce 2 až 6 atomů uhlíku, nebe o délce až 6 atomů uhlíku, a arylová skupina je vybrána ze souboru zahrnujícího aromatické kruhy, substituované aromatické kruhy a kondenzované aromatické kruhy, skupiny Z, Z' a Z* znamenají spojovací skupiny nezávisle na --sobě vyhrané ze souboru zahrnujícíhoalkylové řetězce a polyetherovš, například polyethylenglykolové, řetězce o délce od 1 do 16 uhlíkových ekvivalentu, přičemž řetězec v sobě popřípadě může obsahovat jednu nebo několik amidových nebo/a disulřidových vazeb, přičemž skupina Z* jé navázána na dva' zbytky fenylboronových kyselin, a skupiny BAS a BAS' znamenají stejné nebo. rozdílné bioaktivní látky.

Výhodně, pokud jsou BAS a 3AS' stejné, jsóu Z.a Z', Y a Y' a X a X' rovněž stejné. ' ,

Biokonjugátovými komplexy ' obecných, vzorců., výhodně komplexy, ve kterých.	V a v:, jsou
» X a X' jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru atom vodíku a fenvlovou skupinu,	zahrnuj ícího
Y' a Y' jsou nezávisle na. sobě vybrány, ze souboru atom kyslíku .a skupinu .CK2, .	zahrnuj ícího
Z, Z', a Ζζ,-jsou nezávisle na, sobě vybrány	ze souboru

zahrnujícího skupiny (CH₂)_a,. kde n . má hodnotu 1 až 3, a skupiny (CH₂CH₂O)_a·, kde' nd má hodnotu 2 až-4, nebo/a skupiny BAS á BAS' jsou' budto stejné - nebo jedna z nich představuje pevný nosič a . druhá „znamená bioaktivní látku.jinou než pevný nosič,.například protilátku.

Mezi biokonjugátové komplexy podle. vynále’zu rovněž patří komplexy, ve kterých je . alespoň jedna z bioaktivních i!, ' . . ' <b« · látek navázána na benzenový kruh zbytku tvořícího' komplex s fenylboronovou kyselinou, například jako je tomu v obecných vzorcích VII až X.

I .fi

HAS’ (VII)

Hiokcnj ugátovými komplexy obecného vzorce VIZ jsou komplexy, ve kterých w je vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NH, skupiny N^alkvl, NC₄H₅, N-aryí, NCrú-aryl, NCřúCH.QH, ''· NCOCHjCH-OH,' NOH, NO-alkyl- a •NOCK₂-aryl,· kde—alkyl označuje uhlovodíkový zbytek, například o délce I až 4 *

atomv uhlíku, nebe o délce až 6 atomu uhlíku, přičemž retezce menou ;vc iinearnz m rozvez vane, aryr je vybrán

S GU.CC Zlí zanr^ujicizc substituované aromatické aromatické kruhy, arema z ic ke :<r uny ,_r kruhv a kondenzované je vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom siry, skupinu NH, skupiny N-alkyl, N-aryl a NCH.-aryl? kde alkyl a ary! mají výše definovaný význam, ·Z -a - Z* jsou -stejné- nebo . rozdílné a - představují vždy spo jovací - - skupinu - vybranou- - ze— soubo-ru—zahrnuj-íc-ího· --a-l-ky-lo-véřetězce a poíyetherové, ' například- polyethylengíykolové, řetězce o délce od 1 do 16 uhlíkových ekvivalentů, přičemž řetězec v sobě popřípadě může obsahovat' jednu nebo několik amidových a disuižidových vazeb, a jné nebo rozdílné bioaktivní látky.

komplexy obecného vzorce VII jsou rých ru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu

BAS a SAS* znamenají sze iokonj ugátovými výhodně komplexy, ve kte ví* je vybrán ze soutc

NH, NCH₃, NCjH₅, NCřhCH.OH, NCOCHhCK.QH, NOH a NOCK₃, znamená atom kvslíku,

Z a Z* jsou nezávisle na sobe vybrány ze souboru zahrnujícího skupiny (CH_;)_a, kde n má hodnotu 1 až 5, a skupiny (CH-CH-O) _a-, kde n' má hodnotu 2 až 4, nebo/a

SAS a 3AS^X jsou rozdílné ,bioaktivní látky, například jedna z nich je pevným nosičem a druhá bioaktivní látkou jinou než pevným nosičem, například protilátkou.

HAS’

(VIII)

Sickcnjugátcvými· komplexy obecného, vzorce- VILI. jso·.

komolexv, ve ktervch vvbrán. ze souboru zahrnujícího, atom kyslíku.,·, skupinu

NH, skupiny N-alkyl, NC₅H₅, N-aryi, NCH.-aryl, NCH.CH.OH, NCOCH-CH.OH, NOH, 'NO-alkyi a NOCH.-aryl, kde., alkyl·.

. označuje uhlovodíkový zbytek, například o. délce 1'až 4 vv-atomý uhlíku, ^nebo co^délcej^až · 6 atomů 'Uhlí ku,y.přičemž řetězce mohou být rozvětvené,· a ary! je vybrán ze souboru zahrnujícího aromatické kruhy, substituované' aromatické kruhy ákondenzované aromatické kruhy,

Q 'je- vyb-rán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom síry, skupinu NH, skupiny N-alkyl, N-aryl a NCH.-aryl·,.

kde alkyl a aryl mají výše definovaný význam,

Z a Z* a Z*' jsou stejné nebo rozdílné a představuji vždy spojovací skupinu vybranou ze souboru zahrnujícího alkylové řetězce a polvetherové, například polyethylengiykoiové, řetězce o délce od 1 do lc uhlíkových ₂ ekvivalentů, ořičemž řetězec v sobě .oooříoadě může obsahovat jednu nebo několik amidových a disulfidových vazeb, přičemž skupina Z je navázána na dva zbytky tvořící komolsxy s fenyl-boronovými kvselinami, a

AS* a BAS*' znamenají stejné nebo rozdílné bioaktivní látky.

tBiokonjugátovými komplexy obecného vzorce Vlil jsou výhodně komplexy, ve kterých

W je vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NH, NCH₃, NC_sH₅, NCH,CH₂OH, -NCOCH₂CH₂OH, NOH a HOCH,,

Q znamená výhodně atom kyslíku,

Z a Z* a Z*' jsou stejné nebo·-rozdílné a jsou výhodně vybrány ze souboru zahrnujícího skupiny {CH₂)_a, kde n má hodnotu 1 až 5, a skupiny (CH_;CH,O) _a., kde n' má hodnotu 2 až 4, nebc/a skupiny BAS a BAS* jsou buď stejné nebo jedna z nich představuje pevný nosič a druhá znamená bioaktivní látku jinou než pevný nosič, například protilátku.

17- Biokonjugátovými komplexy obecných vzorců IX a X jsou komplexy, ve kterých

W a W' jsou nezávisle na soče vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NH, skupiny N-alkyl, NC_SH₅, • N-arvl, NCH.-aryl, NCK-CH.OH, NCOCH.CH.OH, ' NOH, NO-alkyl a NOCH.-aryl, kde alkyl označuje uhlovodíkový zbytek, například o délce 1 až 4 atomy uhlíku, nebo o délce až

6. atomů uhlíku, přičemž řetězce 'mohou být popřípadě rozvětvené, a ary! 'je vybrán ze souboru zahrnujícího' aromatické kruhy, substituované aromatické, kruhy a kondenzované aromatické kruhy,

Q· a'··Q' ’ jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom síry, skupinu NH, skupiny.N-alkyl, N-ařvi ^: -a NCH.r-aryi, kde..' alkyl 'a ar.yl mají. výše definovaný význam,

Z, Z' a Z*-.znamenají' spojovací skupiny, nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího alkyíové řetězce a' ‘polyetherové, například polyethyleng.iykolové,, řetězce o délce od i. do . 16 uhlíkových- ekvivalentů, přičemž řetězec v sobě popřípadě:. může · ,cbsahovat.n j ednunebo. několik amidových a' .disulfidovýcn vazeb, ^přičemž '·' ěkupina. Z''navázána’ na .'dva ^:: zbytky ‘'fehýlboronových .· kyselin, a - ^r ,

BAS a BAS' znamenají stejné nebo rozdílné bioaktivní látky.

'Pokud jsou BAS a BAS' stejné, jsou W a W', Q a.Q'., a Z^ a Z' výhodně rovněž stejné. Biokonjugátovými komplexy obecných vzorců IX a X jsou výhodně komplexy, ve kterých

W a W' jsou nezávisle na sobe vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NK, NCHj, ' NC-H_S, NCH.CH.OH, NCOCH.CH.OH, NOH a NOČH„ ·Q znamená výhodné atom kyslíku,

Z, Z' a Z* jsou stejné nebo rozdílné a jsou výhodně vybrány ze souboru zahrnujícího skupiny (CH-)_a, kde n má hodnotu 1 až 5, a skupiny (CH-CH.O) _a-, kde n' má hodnotu 2 až 4, nebo/a skupiny BAS a BAS’ jsou buď stejné bioaktívní látky nebo jedna z nich představuje pevný nosič a druhá znamená bioaktívní látku jinou než pevný nosič, například protilátku.

Biokonjugátové komplexy . obsahující jediný komplex řeriylborónove ‘kyseliny, 'například jak je ' tomu v - obecných vzorcích I, IV a VII, se výhodně používají pro konjugaci dvou různých bíoaktlvních látek, například pro konjugaci enzymu s protilátkou pro použití v ElISA-testu, pro konjugaci sondy na ' oa;

nukleové kyseliny s fiuoroforem pro usnadnění detekce gencmcvé sekvence, pro konjugaci toxinu s monoklonální protilátkou pro použiti v cíleném podávání léčiv (targeted drug deiivery). Například lze takové biokonjugátové komplexy použít pro konjugaci protilátky (například monoklonální. protilátky schopné sa selektivně vázat na epitop·hematocoietické buňky, například protilátky anti-CD34) na pevnou fázi (například kovové'nebo plastové kuličky popřípadě potažené organickou látkou, například glycidem nebo proteinem), například v případě, že protilátku představuje skupina BAS a pevný povrch skupina BAS*, nebo v případě, že protilátku představuje skupina BAS* a pevný povrch skupina BAS·.

Biokonjugátové komplexy obsahující dva komplexy fenyiboronových kyselin, například jako je tomu- v obecných vzorcích II, III, v, VI, VIII, IX a X, se výhodně používají pro konjugaci stejných bíoaktlvních látek zesítením bíoaktlvních látek s připojenými zbytky fenyiboronových kyselin nebo zbytky tvořícími komplexy s fenylboronovými kyselinami do makromolekulárních agregátů. Agregáty tohoto typu obsahující enzymy jsou vhodné pro zvýšení detekčních limitů v SLISA-tes'tu a podobných testech, pomocí podstatného zvýšení efektivní koncentrace enzymu dostupného pro přeměnu bezbarvého substrátu na detekovatelný produkt. Podobně lze proteiny značené pomocí fluoroforů s připojenými zbytky tvořícími komplexy s fenvlboronovými kyselinami agregovat tímto způsobem pro zlepšení jejich vizuální nebo spektrofotometrické detekce. Agregáty obsahující nadbytečné připojené zbytky fenylboronových kyselin lze dále konjugovat s jinými i -a η ttí-1 Tmi 1 á Izírn i e» tů-m ·, řh Izt ř H v -í- -í τ m ί 1 A ,/t ?

V V U ·\ W Λ- V ti _L,iLL_t_ J, l_i Iw J\J J 411^ 4»AJ J «w * W· 4. LI 1-4. ÍLLk> XtlA y * .. s. .fenvlboronovými kyselinami (semikonjugáty tvořícími.komple- ' xy s fenvlboronovými kyselinami). Tento obecný postup je analogický přípravě testů sandwichového typu zahrnujících svstém Avidin-Biotin..

Lze rovněž použít zesíťující činidla na boronových kyselin, reakcí ve velkém nadbytku, odstraněním nadbytečného činidla, pro přeměnu látek s připojenými zbytky tvořícími komplexy bázi .fenyls následným bioaktivn.í.ch s fenviboronovými kyselinami., (semikonjugátů tvořících komplexy- s fenylborcno.vými kyselinami) na bioaktivni látky s připojenými zbytky fenylboronových kyselin (semikonjugáty fenylboronových kyselin') a naopak.

Obvykle je přítomný spojovací zbytek připojující bioaktivni látku na fenylovou část zbytku fenylboronové kyseliny (například¹ Z*nebo Z*' v obecném vzorci'I, VII nebo VIII nebo Z* v obecném vzorci XIV nebo XV, jak jsou uvedeny níže) . V některých případech však může mít bioaktivni látka takovou konfiguraci, která umožňuje navázání přímo na fenylovou část prostřednictvím elektrofilního nebo nukleofilního zbytku (R) v obecném vzorci XIV bez potřeby spojovací skupiny. Vynález se tedy dále týká, a zahrnuje je, sloučenin obecného vzorce I, VII, VIII, XIV nebo XV, kde není přítomen zbytek Z* nebo Z*'.

3iokonjugátové komplexy obecného- vzorce I až X se připraví buď v puřrovaných vodných roztocích, organických rozoouštědlech nebo vodných roztocích obsahujících organická rozpouštědla. Komplex se při teplotě místností vytvoří během několika minut. Příprava biokonjugátového komplexu není citlivá na podstatné změny v iontové síle, teplotě a přítomnosti cnaotropních činidel (činidel denaturujících proteiny), což je v rozporu se systémy představujícími dosavadní stav techniky, ve kterých musí být udržována struktura biologické makromolekuly pro uchováni potřebných vazebných vlastností. Ve většině případů jsou podmínky řídící vytváření^biokonjugátových komplexů pomocí zde popsaného systému omezeny na výběr vhodného omezení jsou vyvolána podmínkami životaschoonosti bioaktivní látky.

H, a jakákoli další utnvmi oro uchování

Vynález dále popisuje modifikaci bioaktivní látky pro účely zabudování zbytku tvořícího komplex s' fenylboronovou kyselinou pro následnou konjugaci s různými bioaktivnímí látkami s připojenými zbytky činidle vnocna fanvlboronových kyselin, například pro obecného vzorce VII, VIII, IX nebo X:

pripravu oiokonzugatu

i ve kterých mají skupiny W, Q, 2 a Z* význam definovaný v případě libovolného z obecných vzorců VII, Vlil, IX nebo X, výhodně ve kterých

W je vybrán ze souboru zahrnujícího arem vodíku, skupiny OH, NH_:, N*HCH₃, NHOH, a NKOCH₃,

Q je vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom síry a skupinu NH, nebo/a

Z a Z* znamenají spojovací skupiny nezávisle na sobě vybrané, ze souboru zahrnujícího alkylové a polyethylenglykolové

- ..řetězce -o délce ...od . 1 _.do. . 16 uhlíkových ekvivalentů, přičemž ' řetězec v sc-bě 'může obsahovat- amidové a disuífidové vazbv.

Skuoinou obecném vzorce XI je reaktivní elektrofilní nebe nukleofilní zbvtek vhodný pro reakci činidla tvořícího komplex s fsnylboronovou bioaktivní látkou. - .

1/·· .< v o c línou s

Reakčními činidly, obecných vzorců XI a XII j.sou výhodně činidla, ve kterých

W. .je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny OH, NHOH a . -NHCCHj, - nebc/a ' ' . ' · . '· - ' ; . Q představuje atom kyslíku.

Skupiny Z a Z* jsou 'výhodně vybrány ’ ze souboru zahrnujícího skupiny (CH.)_n, kde n má hodnotu 1 až 5, 'a skupiny (CH_:CH_;O) _a, kde n má hodnotu 2 až 4.

Reakčními činidly obecného vzorce XI jsou výhodně činidla, ve ktervch

R je vybrán, aniž by však .šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího aminoskupinu, hydrazidový zbytek, zbytek N-hydroxysukcinimidylesteru, zbytek N-hydroxysulfosukcinimidylesteru, isothiokyanátový zbytek, brom22 acetamidový zbytek, jodacetamidový, zbytek, maleinimidový zbytek a thiolový zbytek.

Reakcí reakčního činidla obecného ' vzorce XI· s bioaktivní látkou se získá semikonjugát s připojeným jedním nebo několika zbytky tvořícími komplexy s. fenylboronovými kyselinami obecného vzorce XIII

SAS —

OH .W

Π (xiii)

Q _·..

ve kterém

BAS představuje bioaktivní látku, a skupiny- w, Q a Z mají význam definovaný výše. v případě obecného vzorce VII.

Podobně lze reakční činidla na bázi tenylboronových kyselin, například činidlo obecného vzorce XIV (XIV!

--------------------- ------- -ΗΌ-Β---------ηΓ ve kterem

Z* představuje spojovací skupinu, jak je definována v případě libovolného ze vzorců I, IV, VII nebo Vlil, a znamená reaktivní elektrofilní nebo nukieofilní zbytek, jak je definován v případě obecného vzroce XI, připojit k bioaktivní látce pro získání semikonjugátu s připojeným jedním nebo několika zbytky fenylboronových kyselin obecného vzorce XV

BAS·

HO-B (XV) ve kterém

BAS* představuje bioaktivní látku, například stejnou nebo odlišnou .od bioaktivní' látky označené symbolem BAS, a

Z* má význam definovaný v případě obecného vzorce VII.

' ' Je třeba’upozornit, že semikonjugáty obecného vzorce'XV a jiná reakční činidla na bázi fenylboronových kyselin a semikonjugáty fenylboronových kyselin, jak jsou 'zde popsané, obsahuje. buď. tetraedrický fenylbořonátový anion za, alkalických.podmínek, nebo trojbokou fenylboronovou kyselinu za neutrálních nebe kyselých podmínek, například

HO

Z’-SAS’ 's

OH

X7 + 2H₂O

-H,0* .

a obě formy jsou považovány za

Popisována jsou fenylboronových kyselin

HO \

/

HO

\

.....OH zahrnuté do vynálezu rovněž zesíťující obecného vzorce XVI činidla

MÁÁMý

Η H \

OH na ' bázi (XVI) ve kterém

Z* představuje spojovací skupinu, jak je definována v případě libovolného z obecných vzorců II, V nebo IX, nebo obecného vzorce XVII

Z* představuje spojovací skupinu, jak případě libovolného z obecných vzorců je derinována v lII, VI nebo X. * ·«

Semikonjugát obecného · vzorce XIII, připravený z bioaktivní látky 3AS, který má připojené zbytky tvořící komplexy s fenylbcronovými kyselinami, může vytvořit komplex se semikonjugátem obecného vzorce XV, připraveným z druhé bioaktivní látky SAS*, který má připojené zbytky fenylboronových kyselin, pro získání biokonjugátu obecného vzorce VII. Tímto způsobem lze konjugovat biologické makromolekuly navzájem nebo s jinými funkčními látkami, . které . přinášejí užitečné vlastnosti.

Podobně mlže reakční Činidlo- obecného ' vzorce XII vytvořit komplex se semikonjugátem obecného vzorce XIV, připraveným z bioaktivní látky BAS*, pro získání biokonjugátu obecného vzorce VIII i Tímto způsobem lze k sobě navzájem konjugovat dvě nebo více stejných bioaktivních látek BAS*. Tento způsob lze- využít pro přípravu enzymových agregátů, které jsou vhodné pro vysoce citlivou detekci v ELISA-testuBiokonjugátv se připraví - pufrovaných vodných vodně-organických roztocích. Bíokcnjugáty se při te místnosti vytvoří během několika minut. Stabilita urč nebo letě tého

- 25 biokonjugátu při určitém pH je určovány substituenty W a Q. Biokoňjugáty obecných vzorců VII a VIII, ve kterých obě skupiny W a Q představuji vždy atom kyslíku,·· j-sou stabilní?-v kyselých vodných roztocích o přibližném pK méně než 4,5. Biokoňjugáty obecných vzorců Vil a VIII, ve kterých skupina. W. je vybrána ze souboru zahrnujícího skupiny NH a NCH₂, a skupina Q je vybrána ze souboru zahrnujícího atom kyslíku a atom. síry, jsou stabilní v pufrovaných alkalických vodných, roztocích 'v přibližném· rozmezí pH- od -3,5 do li,5. Podobně jsou biokoňjugáty obecných vzorců VII a VIII, ve kterých obě skupiny w a O představují vždy skupinu ΝΉ, stabilní .v .pufrovaných- -alkalických ...vodných .roztocích /v., .„.přibližném. rozmezí pH'od8,5 do 11,5/Biokoňjugáty Obecných vzorců VII a-·VIII; ve .kterých skupina W je vybrána ze souborů zahrnujícího skuoir.v NOH a' NGC3 a sxuprna ů 'je vyorana aj i. l zahrnujícího atom kysii.cu -a pufrovaných vodných roztocích od 2,5 do 11,5..

arem síry, jsou stabilní v v v širokém rozmezí oH přibližně

Siokonjugační reakce (komolexace fenylboranové kyseliny) není citlivá na podstatné změny v iontové síle,, teplotě, přítomnosti organických rozpouštědel a přítomnosti, •chaotropních činidel .(činidel dena.turuj ícícn proteiny), _λ což .. -je < v '^; rozporu /se '. systémy představujícími _: dosavadní < stav techniky, ve., kterých musí být udržována struktura- biologické.,,'*, makromolekuly . pro uchování .potřebných vazebných vlastností. . Ve většině případů jsou omezení řídící vytváření biokonjugátů pomocí- .zde ..* popsaného... systému , omezeny na omezení vyvolaná podmínkami nutnými pro uchování ‘životaschopnosti bioaktivní látky. ‘

Podle dalšího 'provedení vynález popisuje reakčníčinidla na bázi fenylboronových kyselin, například reakční činidla vhodná pro modifikaci bioaktivní látky pro účely zabudování zbytku tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou, například ' při přípravě bio.konjugážového komplexu ó

obecného vzorce I, II, III, IV, V nebo VI, například reakční činidla vybraná z činidel obecných vzorců XVIII nebo XIX

(XVIII)

V obecném vzorci XVIII mají symboly X, Y a Z význam definovaný v případě obecných vzorců IV, V nebo VI. Výhodnými činidly obecného vzorce XVIII jsou činidla, ve kterých

X je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, methylovou skupinu a fenylovou skupinu, nebo/a ' ' i ' *

Y' ' je vybrán'' ze souboru zahrnujícího atom kyslíku a skupinu Cřiy...... ................ .V obecném vzorci XIX mají -symboly Q, Y a Z význam definovaný v případě- obecných vzorců I, II nebo III. Výhodnými činidly obecného vzorce .XIX jsou .činidla, . ve kterých

Y je. vybrán ze souboru zahrnujícího atom kyslíku a skupinu CH-, nebo/a

Q znamená atom kyslíku.

V obou obecných .vzorcích XVIII a XIX skupina R představuje reaktivní elektrofilní nebo nukleofilní zbytek

27- vhodný pro reakci činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou s bioaktivní látkou.

alentů, výhodně 2'až.12 uhlíkových c v sobě může obsahovat jednu nebo disuífidových skupin, ' a výhodně kde n má hodnotu 2 až 6, nebo hodnotu 2 až 4. V obou z obecných

Reakčními činidly obecného vzorce XVIiI jsou nej výhodněji činidla, ve kterých

X je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku a methylovou skupinu, a

Y znamená atom kyslíku.'

Reakčními činidly obecného vzorce XIX jsou výhodně činidla, ve kterých Y znamená atom kyslíku.

V . obou--z :obecných-, vzorců' XVIII -a XIX- .je -skupina Z. výhodně vybrána ze souboru zahrnujícího alkylbvé 'řetězce a polyetherové, například polyethvlenglykolové,.řetězce o délce oč 1 do. 16 uhlíkových ekviv ekvivalentů, přičemž řetěze několik, amidových ňebo/a představuje skupinu (CH₂)_a, skupinu (CH_:CH_zO)_a, kde n má vzorců XVIII a XIX je skupina R výhodně vybrána, aniž by se jednalo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího hyčrazidový zbytek, isothiokyanátový zbytek, zbytek N-hydroxysukcinÁmídylesteru,^; zbytekN-ftydroxysulfosukcinimidylesteru, -zbytek imidátesteru, 2,2,2-trifluorethansulfonylový zbytek, bromacetamidový zbytek, jodacetamidový zbytek,' maleinimidový zbytek a ' zbytek' 2-kyanethyl-N,N-diisopropylfosforamiditesťeríi. '' '' ' . * .....

Reakční Činidla obecného vzorce XVIII nebo XIX se podrobí reakci s bioaktivní látkou BAS (nebo BAS*} nebo vytvoří'· odpovídající 'semikohjugát· obecného 'vzorce '. XX· respektive XXI

2.8

kde mají symboly X, Y a Z význam definovaný u obecného vzorce XVIII

kde mají-symboly Y, Z a Q význam definovaný u obecného vzorce XIX.

1.

Vynález tedy popisuje:

biokonjugátové komplexy jak jsou definovány naoříklad libovolného z obecných vzorců I až X;

2.

semikonjugáty tvořící komplexy s fenyiboroncvými kyselinami jak jsou definovány výše, například libovolného z obecných vzorců XIII, XX a XXI;

3.

semikonjugáty fenylboronových kyselin ji definovány výše, například obecného.vzorce,XV;

JSOU v 5.

-činidla--tvořící-'komplexy- ~s— fenylbcronovými' 'kyselinami· jak jsou definována výše, například libovolného z obecných vzorců XI,' XVIII a XIX;

reakČní činidla na .bázi fenylboronových. kyselin jak. jsou definována výše, například obecného vzorce XIV; a zesíťující Činidla na bázi fenylboronových kyselin jak jsou definována výše, například obecných vzorců XII, XVI a XVII.

Vynález dále popisuje použití výše uvedených sloučenin v libovolné z výše zmíněných aplikací pro biokonjugaci, zejména v testovacím nebo purifikačním systému na bázi protilátek; a použití výše uvedených semikonjugátu, zesíťujících činidel a činidel (například obecných vzorců· XI až XXI) pro přípravu biokonjugátových komplexů (například obecných vzorců I až X).

první bioaktívní látku

V konkrétním provedení vynález popisuje soupravu· nebo systém pro izolaci nebo puriřikaci buněk, například hematopoietických buněk, například buněk CD' 34⁺, ' kde se použije biokonjugátový komplex (libovolného z obecných vzorců I až X) spojující první a druhou bioaktívní látku, přičemž u je pevný nosič, například kovové nebo plastové kuličky-(p jrnym organicxym navázání k činidlu R v obecných vzzr bioaktívní látkou j rozeznat a naváže populaci buněk, popisuje způsob i popsány, který zah: požadované buňky Sz komplexem podle vy ;r jak ' j e “ popsána.,' -s'· cpřípaděpotažené -glycidem,. proteinem nebo . . i· materiálem pro usnadnění reaktivity a podle vynálezu, například.v místě symbolu cích XI., XIV, XVIII nebo XIX) a druhou, e protilátka, například protilátka schopná .t se na epitop přítomný 'na konkrétní apříklad buněk CD 34 ⁺ . Dále se rovněž zolace .nebo purifikace. buněk, jak jsou rnuje následující kroky: médium obsahující e uvede do styku s takovým, biókonjugátovým nálezu, který má druhou bíoaktivní látku, síě-ktívrií pro požadovanou populaci’buněk, takto ,. vyselektované buňky se oddělí z média ,a popřípadě ' se oddělí vyselektované buňky od biokonjugátového komplexu.

Biokonjugátové komplexy obecného vzorce I, IV nebo VII se připraví, pomoci'·'třístupňového způsobu, ve_kterém-se:(1) činidlo tvořící komplex s řenylboronovou kyselinou, například . obecného . vzorce XI, XVIII - nebo. XIX, výhodně odvozené od salicvlové' kyseliny,-' aminosalicyiové kyseliny nebe dithiosalicylové kyseliny, kondenzuje; s bioaktívní látkou pro přípravu semikonjugátu tvořícího komplex s řenylboronovou kyselinou, (2) reakční činidlo na bázi fenylboronové kyseliny, například odvozené od sloučeniny výhodně vybraná, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího (3-aminofenyl)boronovou kyselinu a {4-karboxyfenyl)beranovou kyselinu, například obecného vzorce XIV, kondenzuje s bioaktivní látkou pro přípravu semikonjugátu fenylboronové kyseliny, a (3} semikonjugát tvořící komplex s fenylboronovou kyselinou připravený jak je popsáno výše v bodě (1} a semikonjugát fenylboronové kyseliny, připravený jak je· popsáno výše v bodě (2), se podrobí vzájemné reakcipro ' získání. bibkonjugátového·.. komplexu, například obecného, vzorce I, IV nebo VII.

Biokcnjugátové komplexy obecných vzorců II, V nebo ±X se připraví dvoustupňovým·způsobem, ve kterém se:

(1) činidlo' tvořící komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XI, XVIII nebo XIX kondenzuje s bioaktivní látkou pro přípravu semikonjugátu tvořících komplexy s fenylboronovými kyselinami, a (2) semikonjugáty tvořící komplexy s fenylboronovými kyselinami připravené jak je popsáno výše v bodě (1) se ' ' podrobí ’ reakci ' se' zesíťujicím činidlem na bázi fenyi' boronové kyseliny výhodně odvozeným od (3-aminofen'yi) boronové kyseliny, například obecného vzorce XVI.

Biokonjugátové komplexy obecných vzorců III, VI nebo X se· připraví dvoustupňovým způsobem,—ve kterém se·: ......

(1! činidlo tvořící' komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XI, XVIII nebo XIX podrobí reakci s bioaktivní látkou pro přípravu semikonjugátu tvořících komplexy s fenylboronovými kyselinami, a (2) semikonjugáty tvořící komplexy s fenylboronovými kyselinami připravené jak je popsáno výše v bode (1) se podrobí reakci se zesíťujícím činidlem na boronové kyseliny výhodně odvozeným od i nylýboronová' kyseliny, například obecného pro získání požadovaného komplexu.

bázi

4-karboxyzevzorce- XVII',

Biokonjugátové komplexy obecného vzorce VIII se připraví dvoustupňovým způsobem, ve kterém se:

(1) reakční činidlo na bázi' fenylboronové kyseliny obecného vzorce* XIV podrobí reakci s bioaktivní látkou pro přípravu semikonjugátu obecného vzorce XV, a (2} semikonjugá.t obecného vzorce XV se podrobí reakci ’ se . - -ir-,·-' ..jljJ.T-U.· .·> ·./ ΛύΙ····' ' .· . . _ . ' · *.>«. * „,.· .· ÍM,..— zesíťujícím činidlem na bázi fenylboronové. kyseliny, výhodně odvozeným od salicylové kyseliny, aminosalícylové kyselinv nebo dithiosaličylové kyseliny, obecného vzorce. XII, .pro . získání .požadovaného komplexu.

Reakční činidla obecného vzorce XIV jsou odvozená .od derivátů a analogů fenylboronové kyseliny, například sloučenin, výhodně, vybraných, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího.’ (3-amino.fenyl).boronovou. kyselinu, (4-kar.boxyfenyl·.). boronovou .kyselinu a N- ( o-nitro-3-di- hydroxyborylfenyl}sukcinamovou kyselinu, (3-isothiokyanátofenyl) boronovou'..kyselinu, ,(.5-karboxy-3-isothiokyanatofenyl)boronovou kyselinu, {3-jodacetamiďofenyl)boronovou kyselinu, (3-maleinimidofenyl)boronovou kyselinu, sukcinimidylester (3-dihydrox'yborylfenyl) sukcinamové ' kyseliny a hydrazid (3-dihydroxyborylfenyl) sukcinamové- kyseliny,-' kteréžto sloučeniny lze komerčně získat nebo syntetizovat pomocí způsobů popsaných, nebo analogicky k způsobům popsaným například v

S./.Wen, M. D.,. Nowotnik, D. P., Malley, M. F., J. Z., Nunn,. A. D. a Eckelman, W. C. (1991) 2, 160 - 170, a Linder, K. E., Wen, M.

Ramalingam,' K., Sharkev, R. M., Yost, Nunn, A. D. a Eckelman, W. C. (1991) .Linder, K

Gougoutas, Bioconjugate Chem., D., Nowotnik, D. ? F., Narra, R. K.,

Bioconjugate Chem., 2, 407 - 415.

Reakční čin; obecného vzorce XVI ronové kyseliny s výhodně vybranou, souboru zahrnujícíh butvlester adipové propionyíchlorid a .dia na bázi fenylboronových kyselin ss připraví kondenzací (3-aminofenyl)boaktivovanou dikarboxylovou kyselinou, aniž by však šlo o omezující výčet, ze o sukcinyichlorid, adipoyichíorid, diisokyselíny, suberoyichlorid, 3,3'-dithio3,6,S-trioxaundekandioylchiorid a diisobutylester 3,5,9-trioxaundekandiové kyseliny, analogicky ke způsobům popsaným v Burnett, T. J., Peebies, H. C. a Hageman, J. H. (1980) Biochem. Biochys. Research Commun., 96, 157 - 162.

....Reakční činidla na bázi.fenylboronové kyseliny obecnéhovzorce XVII se připraví aktivací (4-karboxyfenyl)bcronové kyseliny N,N-dicykiohexylkarbodiimidem, s následující kondenzací s diaminem, výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezu-,.

jící vyčet, souboru zahrnujícího 1,4-butandiamin, ·, o-hexandiamin a 2,2.' -dithiodiaminoethan (H-NC:ň_;CH_;3SCK.CH_;NH_;) .

Blokonjugátové komplexy se připraví v pudrovaných •*s.

vodných roztocích, výhodně vybraných, aniž by však šlo o., omezující výčet, ze souboru zahrnující acetátové, citrátové, fosfátová a karbonátové pufry. 3orátovým pufrům a trisíhydroxymethyi)aminoethanovým pufrům (Tris-pufrům) je třeba se vyhnout z důvodů jejich, potenciálu pro komplexaci se zbytky_L tvořícími komplexy s fenyíboronovými kyselinami respektive zbytky fenylboronových kyselin. Biokonjugátový komplex se pří teplotě místnosti vytvoří během 1 až. 15 minut. Reakce není citlivá na změny v iontové síle v . rozmezí 0,.01., a.ž....2 mol.-Stabiíita komplexu se zvyšuje se zvyšující se teplotou, která je omezována pouze těkavosti pufru. Přidání organických rozpouštědel včetně acetonitrilu, methanolu, ethanolu,. isopropanoiu, butanolu, N,N-dimethylformamidu a dimethyisulfoxidu slouží k další stabilizaci biokonjugátů. Chaotropní Činidla (činidla denaturujicí proteiny) včetně močoviny, guanidin-nydrochiorídu a řormamidu rovněž slouží k další stabilizaci bickonjugátů, pokud je bioaktivní látka tolerantní vůči jejich přítomnosti. Biokonjugátové komplexy lze purí fíková t..edso lením, diaiýzpu, velikostně vytěsňující chromatcgrafií (size exclusion chromatography) a elektřoforézou. Biokonjugátové komplexy jsou stabilní po odstranění vody a lze je pro skladování lyofilizovat.

Ionizace fenyiboronové kyseliny je důležitým faktorem při vytváření biokonjugátového komplexu z toho důvodu, že ionizaci bor přechází z trojboké koordinace (s průměrnými vazebnými úhly 120° a průměrnými délkami vazby l,37.10^1Q m)' na tetraedricky koordinovaný anion (s průměrnými vazebnými úhly 109’· '-a'.....průměrnými délkami -vazby 1, 48.1O*¹⁰ m) . ' pK_a fenylboronových kyselin se liší a pohybuje se v> rozmezí přibližně od 5,2 do 9,2. Biokonjugátové komplexy 'obecných vzorců' I, III, . IV,' VI',. VII, Vlir a X odvezené' od- (4-karboxyfenyl)boronové kyseliny vykazují, přibližné hodnoty ρΚ₄, v rozmezí 5,5 až 7,5.' Biokonjugátové komplexy obecných vzorců I, II, IV, V, VI, VII a IX odvozené cd (3-aminofenyl)boronové' kyseliny vykazují přibližné hodnoty pK₄ v rozmezí.9,0 až 9,0. Komplexy obecných.'vzorců-I,‘ II,. IV, V, VII 'a IX odvozené od (3-amino-2-nitro'fsny.l·) boronové kyseliny, (3-amino-5-r.itrofenyl)boronové kyseliny nebo; (3-amino-6-nitrofenyl)boronové kyseliny-vykazují , střední ' hodnoty ;pK₄.- Jako obecné pravidlo platí, že pK₄ komplexů obecných vzorců I až X je přibližně jednu jednotku pK pod pK₄ fenyiboronové kyseliny, ze které byl komplex připraven.

Biokonjugátové komplexy obecných vzorců I, II a III (například ve kterých jsou Q a Q' výhodně vybrané ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom síry a skupinu NK, nebo/a Y a Y' jsou výhodně vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku a skupinu NH) , ve kterých je zbytek fenyiboronové .kyseliny odvozen od (3-aminofenyl)boronové kyseliny, jsou stabilní v pufrovaných alkalických vodných roztocích v přibližném rozmezí pH 9,5 až 11,5. Podobně jsou biokonjugátové komplexy obecných vzorců IV, V a VI (například ve'kterých jsou skupiny X a X' výhodně vybrány ze souboru zahrnujícího atom vodíku, methylovou skupinu a fenylovou skupinu nebo/a skupiny Y a Y'jsou výhodně vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku a ve kterých je zbytek fenylboronově kyseliny skupinu NH), odvozen od pufrovanvch (3-aminofenyl)boronové kyseliny, stabilní alkalických vodných roztocích v přibližném rozmezí pH 8,5 až 11,5. Toto rozmezí pH-stability vyplývá z požadavku, že pouze fenylboronátový anion poskytuje stabilní komplex. Nicméně při pH přes 11,5 je komplex nestabilní díky· bazicky- katalyzované hydrolýze. Biokonjugátové komplexy vykazující stabilitu pouze v alkalických, podmínkách- jsou vhodné pro reverzibilní konjugaci, přičemž biokonjugátový komplex může být rozpojen příslušnou úpravou pH.

i

Biokonjugátové komplexy obecných vzorců I, II a ΙΙΓ (například ve kterých skupiny Q, Q', Y a x výhodně znamenají atom kyslíku), ve kterých je zbytek fenyiboronové kyseliny odvozen buď od (3-aminofenyl)boronové kyseliny nebo (4-karboxvfenyl)boronové kyseliny, tvoří zvláštní případ, ve⁴ kterém jsou komplexy stabilní v pufrovaných vodných roztocích” v širokém přibližném rozmezí pH od 2,5 do 11,5. Má se za to/ že toto široké rozmezí pH-stabiiíty je následkem přítomnosti komplánárního 1,3-diolo-vého komplexotvorného zbytku, souvisejícího s enol-formou zbytku 2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny. Alternativně může být p'H-stabilita výsledkem nízkého účinného pK₄ fenylboronově kyseliny v komplexu, která je důsledkem reakce aniontu hydroxamové -kyseliny . (COtTCH) s fenyiboronovou kyselinou za vzniku dativni vazby, která vyplňuje vnějí elektronovou slupku atomu boru. Biokonjugátové komplexy tohoto rýpu se tvoří v podstatě irsverziblíním způsobem, jelikož je lze rozpojit pouze úpravou pří nad hodnotu 11,5 nebo pod 2,5, nebo kompetitivnl disociací s borátovým pufrem.

Semikonjugáty tvořící komplexy f e n y i bo roncvými kyselinami, ve kterých je bíoaktívní látkou protein, ize charakterizovat pomocí počtu připojených zbytků tvořících komplexy s fenylbořSnbvými kyselinami začleněných (stupeň substituce} na molekulu proteinu. Ma semikonjugáty lze působit nadbytkem fluoreskujícího reakčního činidla na bázi fenvlboronové kyseliny, v pufrovaném vodném roztoku příslušného pK, pro získání biokonjugátového komplexu obecného vzorce I, IV nebo VII, jak jsou definovány výše, ve kterých BAS* představuje fluoreskující zbytek. Podobně lze semikonjugáty fenylboronových kyselin charakterizovat reakcí s nadbytkem fluoreskujícího činidla tvořícího komplex s fenylboronovoíl···-—kyselinou/· --v~ pufrovaném vodném roztoku příslušného pH, pro získání biokonjugátových komplexů obecných vzorců I, IV nebo VII, ve kterých BAS* představuje fluoreskující zbytek..

Vhodné fluoreskující zbytky jsou výhodně' vybrány; aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnující fíurescein, rhodamn X, tetramethylrhodamin, Texas Red, fycoerythrin a allofyco.cyanin.· Po odstranění nadbytku činidla odsoiením., dial.ýzou nebo., velikostně .vytěsňujícíchr.omatografií ' se’ biokonjugátový komplex podrobí spektroskopické analýzy a zjistí se počet zbytků tvořících komplexy s fenylboronovými kyselinami nebo 'zbytků fenylboronových. kyselin, vypočítaný srovnáním .poměru absorpce při 280- nm, která označuje celkovou koncentraci proteinu, k absorpci při charakteristické vlnové délce fluoroforu (1^} . Semikonjugáty odvozené od jiných bioaktivních látek s vysokou molekulovou hmotnosti, které jsou vhodné pro pur.ifikaci odsoiením, diaiýzou nebo velikostně vytěsňující chromatografií, lze charakterizovat analogickým způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava reakčního činidla obecného vzorce XIV reaktivního s aminoskupinami, sukoinimidyiesteru N-(3-dihydroxyborylfenyl)sukcinamové kyseliny

5,00 g (0,05 mel) anhydridu kyseliny jantarové a 7,75 g (0,05 mol) (3-aminofenyl)boronové kyseliny se rozpustí ve 40 ml bezvodého pyridinu a poté se roztok nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Přidá se 20 ml vody a výsledný roztok se nechá stát pó dobu 1 hodiny. Produkt se poté zahustí na rotační odparce při teplotě 85 - 90 °C. Výsledný vodný roztok se zmrazí v suspenzi suchého ledu a acetonu a lyořilizuje se přes noc. Lyofilizovaný produkt se rozpustí v 50 ml vody a' okysel! se koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou přibližněna pH 1,0. Okyselený roztok se chladí v ledové lázni po dobu 1 hodiny a sraženina se izoluje filtrací. Sraženina se překrystaiuje z 200 ml vařící vody a suší se přes noc ver. vakuu nad peletami hydroxidu sodného, čímž se získá 8,60 g*. (výtěžek 70 %) N-(3-dihvdroxyboryifenyl)sukcinamové kyseliny.v

Produkt je při chromatografii. na tenké vrstvě za použití směsi’trichlormethanu, methanolu. a kyseliny octové v poměru 60 35'5 jakó” elučniho činidla homogenní, R_s činí 0,5.

Teplota táni činí 186 - 188 °C. Struktura se potvrdí pomocí ^XH-NMR (300 MHz) v perdeuterodimethylsulfoxidu.

16,0. g (0,0.63 mol) N-(3-dihydroxyborylfenyI) sukcinamové kyseliny se rozpustí v 80 ml suchého ' dimethylformamidu. K tomuto roztoku se přidá 14,3 g (0,069 mol) N,M-dicyklohexyikarbodiimidu a poté 3,05 g (0,070 mol) M-hydroxysukcinimidu,, Reakčni směs se míchá přes noc při teplotě místnosti. 2 roztoku se odfiltruje N,N-dicyklohexylmcčovina a filtrát se extrahuje 200 mi ethylacetátu. Extrakt se promyje 3x 400 ml vody a 400 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Vodná promývací kapalina se zpětně extrahuje 200 ml ethylacetátu, extrakty se smíchají, vysuší se nad bezvodým síranem sodným a zahustí, na- rotační-_ odparce,- čímž se - získá 12,5 g (výtěžek 57 %) sukcinimidvlesteru N-(3-dihydroxyborylfenyl)sukcinamové kyseliny. Pomocí chromatografíe na tenké vrstvě za použití směsi trichlormethanu, methanolu a kyseliny octové v poměru 85 : 10 : 5 jako elučního činidla se stanoví, že čistota produktu je 98 %, R_f činí 0,7. Struktura se potvrdí pomocí hl-NMR (300 MHz) v perdeuterodimethylsulfoxidu.

Příklad 2

Aplikace-reakčního činidla obecného, vzorce XIV .reaktivního s ami no s kup i n ami

Proteiny lze modifikovat pomocí reakčního činidla na bázi fenylboronové kyseliny obecného vzorce XIV reaktivního s aminoskupinámi reakcí s ε-aminoskupinami lvzinových zbytků v postranních řetězcích, pro získání semikonjugátu s připojenými zbytky fenylboronových kyselin kovalentne navázanými ť

na protein pomocí stabilních amidových vazeb. Jako rozpouštědla lze použít N,N-dimethylformamid a dímethylsulfoxid. Je .vhodné použít. mírně.. alkalické vodné pufry s ptí .v rozmezí 7,.8. až 8,9, a výhodně IQOmM· hydrogenuhličitanový pufr s pH 8’Ž2, pro zajištění, že amínoskupina je nepřekonávaná, přičemž se -minimalizuje hydrolýza N-hydroxysukcinimidylesteru. o aktivovaných N-hydroxysukcinimidylesterech bylo zjištěno, že. vstupují do- interakcí s fenylboronovými kyselinami v alkalických vodných roztocích, což vede k podstatnému sníženi jejích reaktivity. Pro překonání této překážky je třeba vodné reakce, na kterých se podílí sukcinimidylester N-(3-dihydroxyborylfenyl)sukcinamové kyseliny, provádět pouze za přítomnosti alespoň 10-násobného- molárního nadbytku ligandu tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou. Mezi sloučeniny, o kterých bylo zjištěno, že jsou vhodné z tohoto hlediska, patří manitol a katechol. Fenylboronátové komplexy dočasně připravené pro tento účel lze snadno- disocíoyat neutralizací,roztoku. Je třeba 'se vyhnout puf rum obsahujícím primární amin, včetně tris(hydroxymethyl)aminoethanu a glycinu, vzhledem k jejich potenciální reaktivitě. Na pevné nosiče s připojenými zbytky primárních aminů, včetně blotovacích membrán a mikrotitračnícn desek, lze navázat funkční skupiny reakcí s reakčními činidly na bázi fenylboronových kyselin obecného vzorce XIV, pro získání pevných nosičů s připojenými zbytky fenylboronových kyselin.

Příklad - 3

Příprava reakčního činidla obecného vzorce XrV reaktivního s thiolovými skupinami, (3-maieinimidofenyi)boronové kyseliny ·»*

400 ml ethylacetátu se ochladí i sco ve .azni na teplotu přibližně 'C. K tomuto ochlazenému rozcouštědlu se za míchání přidá 7,76 g maleinímidu a -poté 10,19 mi N-ethylmorfolinu. Z přikapávací nálevky se po kapkách přidá 6,26 mi methyi-chiorformiátu přiměřenou rychlostí, aby se teplota reakční směsi udržovala pod 3 °C. Po dokončení' přidávání se reakční směs míchá po dobu dalších 30 minut, přičemž.. —s.e. -teplota- --ud-r-žuj-e—pod-· -3--- °'C;'^_ Výsledná' směs’^- 'sě zfiltruje ' přes Búchnerovu nálevku a, sraženina se promyje malým objemem ethylacetátu. Filtrát a promývací kapalina se smíchají· a poté se promyjí 100' ml ledově chladné vody. Organická---fáze se vysuší nad bežvodým síranem sodným a poté se zahustí na rotační odparce. Produkt se -rozpustí v 75 ml směsi ethylacetátu a isopropyietheru -v poměru 40 : 60 (objem/objem) ve vodní lázni o teplotě '60 ’C a poté se nechá překrystaiovat při teplotě místnosti. Krystaly N-methoxykarbonylmaleinimidu se promyje 2x 20 ml isopropyietheru a poté se suší přes noc ve vakuu.

1,26 g (0,01 mol) (3-aminofenyi)boronové kyseliny se rozpustí v 50 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného rychlým ohřátím směsi na horké desce. Roztok se ochladí v ledové„.^lázni na teplotu přibližně 0 *C a , za intenzivního míchání se přidá 1,55 g (0,01 mel) N-mefhoxykarbonylmaleinimidu. Po uplynutí 10 minut se roztek naředi 200 ml vody a poté se míchá při teplotě místností po dobu 30 až 40 minut. Hodnota pří se upraví na přibližné 5,5 přidáním 1M kyseliny sírové a sraženina se izoluje filtrací. Sraženina se promyje 2x 50 mi 1M kyseliny sírové a poté se suší,..pře noc ve vakuu nad peletami hydroxidu sodného, čímž se získá 1,39 g (výtěžek 54 %) (3-maleinimidofenyl)boronové kyseliny. Struktura- se potvrdí pomocí hí-NMR (.300 MHz) v perdeuterodímethyIsulfoxidu.' ...........

Příklad. 4 ......

Aplikace’ reakčníhc činidla obecného thiolovými skupinami :rce XIV

L.utuvnmo s

Pomocí rěakčních činidel na bázi fenylboronových kyselin .obecného vzorce- XIV reaktivních s tnioiovými skupinami lze modifikovat proteiny obsahující, disulfidové vazby (.cystinové. zbytky), nebo cysteinové zbytky. Disulfidové vazby se ' v případě potřeby nejprve redukují reakcí- s

2-merkaptoeth'anolem nebo dithiothreitolem, v alkalickém redukčního činidla se odstraní a. protein se podrobí., reakci s kyselinou vodném pufru. Nadbytek dialýzou nebo odsclením (3-maleinimidofenvl·)boronovou az lOOmM fosfátovém pufru, o pH 7,0 až 7,5 po dobu 1 hodiny při teplotě 4 ’C, -čímž se získá semikonjugát s připojenými zbytky fenylboronových kyselin kovalentně nevázánými k proteinu. Na proteiny neobsahující thiolové zbytky lze navázat funkční skupiny reakcí s thioiačním činidlem, a poté modifikovat jak je popsáno výše. Mezi thiolační činidla, o kterých bylo zjištěno, že jsou vhodná pro tento účel, patří N-hydroxysuk40 cinimidyl-3-(2-pyridylthío)propionát, N-hydroxysukcinimidyl-3-acsfcvlthioacetát a 2-iminothiolan.

Příklad 5 příprava reakčního činidla obecného vzorce XIV reaktivního s aldehydovými skupinami, hydrazidu N-(3-dihydroxyborylfsnyl)sukcinamové kyseliny mi ’ methanolu se ochladí v ledové lázni na teplotu přibližně 0 ^eC . a pomalu se přidá 1 ml thionylchloridu. . K výslednému roztoku se za míchání přidá 1,25 g (0, 005 mol) N-(3-dihydroxyborylfenyl)sukcinamové kyseliny, připravené jak je popsáno v příkladu 1, a reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti. P-oztok se zahustí na rotační odparce, čímž se získá bílý krystalický materiál, který se /dvakrát koevaporuje z methanciu (2x 10 mi) pro odstranění zbytkového thionylchloridu. Produkt se rozpustí v 5 ml methanolu a přidá se 1- mí hydrazin-hydrátu. Výsledný roztok se míchá přes noc při teplotě místnoszi. V průběhu několika hodin se vytvořit sraženina. Sraženina se izoluje filtrací, promvje se studeným’’ methanoiem a suší se přes noc ve vakuu nad peletami hydroxidu * sodného·,, čímž. se získá 1,11. g {výtěžek 33 %) hydrazidu

N- (3-dihydroxyborylfenvl) sukcinamové, kys_eliny_... , Struktura. ..ae.n potvrdí pomocí ^XH-NMR (300 MHz) v perdeuterodimethylsulfoxidu.

,ř

Příklad -6 - ' ' ’ - '

Aplikace reakčního činidla obecného vzorce XIV reaktivního s aldehydovými skupinami

Gíykoproteiny, reakčním činidlem na reaktivním s aldehyde a zejména protilátky, lze konjugovat s bázi hydrazidu fenylboronové kyseliny ými skupinami, po ošetření proteinu 5 až 20mM roztokem jodistanu sodného v 0,1 až 0,5M natriumacetátovém pufru při pH 5 až 6, obsahujícím až 0,2 M chloridu sodného.,._při - teplot ě . 0 ^aC, po dobu od 30 minut do 4 hodin. Nadbytek jodistanu se odstraní odsolením,. a aktivovaný protein, s připojenými sousedícími aldehydovýmí zbytky vzniklými jodistanovou oxidací glycídových zbytků s

1,2-diolovými skupinami, se kondenzuje s reakčním činidlem na bázi hydrazidu’, po dobu od 1 do 24 hodin při teplotě· místnosti, čímž' se získá semikonjugát s připojenými zbytky, řenylboronových kyselin kovalentně navázanými na protein, pomocí vazby typu Schiffovy báze (iminového typu). Stabilitu ...vazby. na;, protein lze zvýšit, pokud, je to .žádoucí, mírnou * natriumkyanborohydrídovou redukcí Schiffovy báze na·odpovídající alkylamin.. Je důležité uvést,' že jodistanová .oxidace glykoproteinu aktivuje, protein-'pokud., jde o^!: reakci s reakčním činidlem, nybrazidového .typu, přičemž současně odstraňuje většinu přirozeně se vyskytujících zbytků tvořících komplexy s fenylboronovými - kyselinami (koaxiálních 1, 2-diolů) , · které se vyskytují v glykoproteinech'.

Příklad 6

Syntéza:,·' činidel ·-· tvořících ,, ^komplexy.; s fenylboronovými kyselinami obecného vzorce XI

Reakční činidla obecného' vzorce XI, ve kterých W je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny NH,, ,NHCH₃ a. NHOH,. a Q znamená atom kyslíku, jsou odvozena buď od 4-aminosalicylové kyseliny nebo 5-aminosalicylové kyseliny. 4- nebo 5-aminosalicylová kyselina se nejprve esterifíkuje, čímž se získá methyl-4-aminosalicylát, respektive methyl-5-aminosalicylát. Tento ester se neutralizuje a poté amiduje reakcí s aminem vybraným ze souboru zahrnujícího amoniak, methylamin a hydroxylamin, čímž se získá 4- nebo 5-aminosalicylamid obecného vzorce XXII

R·

’Λ (χχϊξ:

ve kterém R' představuje atom vodíku, W je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny NK., NHCHj a NHOH, a Q znamená atom kyslíku. Tato sloučenina se poté kondenzuje s aktivovanou karboxylovou kyselinou, výhodně vybranou, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího anhydrid kyseliny, jantarové, methylsukcinylchlorid, anhydrid kyseliny maleinové, , NTmethoxykarbonylmaleinímid, 3-brompropionylchlorid,

3-jodpropionylchlorid, jodacetylchlorič, bromacefylchlorid a chloracetylcnlorid, čímž se získá odpovídající 4- nebo 5-amidosalicylamid, ve kterém Q představuje atom kyslíku, w. znamená skupinu NH., NHCH. nebe NHCH, obecného vzorce Z-CO-, kde Z

CHjCH.COOK, CH.CH.COOCH₃, CHCHCOOK, CH.CK.3r, CH.CH.I, CH_:I, CH.Br nebo CH.C1.

a R se sz oředstavuŤ ne amidemí skucunú

Takové sloučeniny, zahrnujícího skupiny CH.

reakční činidla kterých Z” je vybrán ze souboru a CH.Br, jsou použitelné jako reaktivní s thiolovými skupinami, vhodná pro navázání zbytku tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou na’bioaktivní“ látku s ' připojenými thiólóvými' skupinami/ Takové sloučeniny, ve kterých Z představuje· skupinu CH=CHCOOH, lze dále funkcionalizovat uzavřením kruhu, čímž se získá maleinimidové reakční činidlo reaktivní s thiolovými skupinami, vhodné pro navázání zbytku tvořícího komplex s fenvíboronovou kyselinou na bioaktivní látku s připojenými thiolovými skupinami. Pokud Z znamená skupinu CH.CH.CCCCHj, lze tuto sloučeninu dále funkcionalizovat reakcí s hydrazin-hydrátem, čímž se získá hydrazidově reakční činidlo, ve kterém Z představuje skupinu CH.CH.CONHNH., vhodné pro navázání zbytku tvořícího komplex s fenvíboronovou kyselinou na bioaktívní látku s připojenými aldehydovými skupinami (které vznikají jodistanovou oxidací glycidových zbytku). Pokud, je 2 vybráno ze souboru zahrnujícího skupiny CH₂CH.Br a CK-CH.I, lze sloučeninu dále funkcionalizovat reakcí s kaliumthiolacetáte po odstranění chrá thiolovou skupinu, pro získání meziproduktu ze kterého se, ících skupin, získá sloučenina obsahující ve které' Z představuje skupinu CH.CK_ZSH.

Sloučeninu obsahující thiolovou skupinu lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2,2'-dithiodipyridin, 4,4'-dithiodipyridin, a 2,2'-dithiodi(3-nitropyridin), čímž se připraví reakční činidlo obsahující aktivovanou disulfidovou skupinu, ' vhodné pro navázání zbytku tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou na bioaktívní látku s připojenými thíciovými skupinami, pomocí štěpiteiné disulfidové vazbv.

Pokud je W v obecném vzorci XXII vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny NK, a NHCKj, a Z představuje s-kupinu CPhCPhCOOH, je možné zavedení dalších funkčních skupin'reakcí s dicykiohexylkarbcdiimidem a reakčním činidlem výhodně vybraným, - aniž. .by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího N-hydroxysukcinimid a N-hydroxysuifosukcinimid, čímž, se získá .aktivované esterové činidlo .vhodné pro. navázání zbytku tvořícího komplex s. fenylboronovou kyselinou ha bioaktívní látku s připojenými aminoskupinami. Aktivované estery obecného vzorce XXII, ve kterých W znamená skupinu vybranou ze souboru zahrnujícího skupiny .Nn. a NHCfí,, a. Z představuje skupinu CH-CPACO-NKS, jsou vhodnými meziprodukty pro přípravu· reakčních činidel obecného vzorce XI, kde Z znamená alkylový řetězec nebo polyethylenglykolový řetězec o délce alespoň 6 uhlíkových ekvivalentů.

Pote představují skuoinu NKOH, nelze takové sloučeniny rutinně použít pro přípravu reakčních činidel s aktivovanými esterovými zbytky, v důsledku problémů, které vznikají pokud je karboxylová skupina aktivovaná, v přítomnosti jak N-hydroxysukcinimidu tak skupiny benzohydroxamové kyseliny, jak souvisí s přítomností zbytku tvořícího komplex s řenylboronovou kyselinou. To představuje omezení, vzhledem k popularitě N-hydroxysukcinimidových činidel, a skutečnosti, že pouze reakční činidla obecného vzorce XI, ve kterých W je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny NHOH a NHOCHj tvoří stabilní komplexy v širokém rozmezí pH. K překonání tohoto omezení se použije alternativní způsob syntézy pro přípravu aktivovaných esterových činidel obecného vzorce XI, ve kterých W představuje skuinu NHOCH₃ a Q znamená atom kyslíku. 4-aminosalicylová kyselina nebo 5-aminosalicylová kyselina se kondenzuje s 'methylsukcínylchloridem, ’čímž se získá sloučenina obecného vzorce XXII, ve které W představuje hydroxyskupinu a Z znamená skupinu CH-CK,COOCH₃. Následující reakcí s N, N-karbonyldiímídazolem, po následuje přidání methoxyíamin-hydrochioridu, se sloučenina, ve které W představuje skupinu NHOCH₃ znamená skupinu CH_;CH_;COOCH₃. Alkalickou hydrolýzou esterové skupiny na karboxyiové skupině se získá sloučenina s volnou karboxylovou skupinou. Následující aktivací karboxyiové,g y a získá a Z' skuoinv reakcí a reakčním o omezující s dicyklohexylkarbodiimidem činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo výčet,· ²ze souboru- zahrnujícího ' N-hydroxysukcinimid ' a. N-hydroxysufřosukcinimiď, se · získá aktivované ' esterové činidlo, ve kterém'W představuje skupinu NHOCH₃ a Z znamená sukcinimidoxyskupinu, -vhodné pro- navázání Zbytku tvořícího komplex s řenylboronovou kyselinou na bioaktivní látku s připojenými amine skup i námi . Takové’ N-hydroxysukcinimidyl··estery jsou vhodnými meziprodukty pro přípravu reakčních činidel obecného vzorce XI, ve kterém Z představuje alkylový >

řetězec nebo poiyetnylenglykolový řetězec o délce alespoň- 6 uhlíkových ekvivalentů.

N-h ydr o xvsukc i nimid v1e s t e r v dále řunkcionalizovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 6-amino'nexanovou kyselinu, 4-aminobutanovóu kyselinu, N-terc.butoxykarbonyl-1,6-diaminohexan a N-terc.butoxykarbonyl-1,4-diaminobutan, čímž se získá, v případě potřeby po odstranění terc.butoxykarbonylové chránící skupiny, sloučenina s prodlouženou spojovací skupinou a buď koncovou karboxylovou skupinou nebo koncovou aminoskupinou. Výše uvedená reakční činidla s připojenými karboxylovými skupinami jsou vhodná pro přípravu činidel obsahujících estery N-hydroxysukcinimidu, estery N-hydroxysulfosukcinimidu a hydrazidy, s dlouhými.spojovacími skupinami, které jsou vhodné pro překonání sférického bránění, o kterém je známo, že je spojeno s biologickými makromolekulamis vysokou molekulovou hmotností. Podobně jsou výše uvedená reakční činidla s připojenými aminoskupinami vhodné pro přípravu sloučenin obsahujících, jodacetamidové zbytky, maleinimidcvé zbytky a aktivované disulřidové zbytky, s dlouhými spojovacími skupinami. Dále jsou výše uvedená reakční činidla buď s připojenými karboxylovými skupinami nebo připojenými aminoskupinami vhodnými meziprodukty pro přípravu pevných nosičů.

Příklad 7

Syntéza činidel . tvořících' komplexy s ‘fenylbororiovými kyselinami obecného vzorce XII ·

Reakční činidla obecného vzroce XII, ve kterých W je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny NH-, NHCH₃ a NHOH a Q. představuje atom kyslíku, jsou získána z buď 4- nebo 5-aminosalicylové kyseliny analogickým způsobem jako byl použit pro přípravu reakčních činidel obecného vzorce'XI. 4nebo 5-aminosalicylamid, připravený jak je popsáno výše, se kondenzuje s aktivovanou dikarboxylovou kyselinou výhodně vybranou, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího sukcínylchlorid, adipoylchlorid, diisobutyiester adipové kyseliny, subero.yichlorid, 3,3'-dithiopropionylchlorid, 3,6,9-trioxaundekandioylchlorid a diisobutylester 3, 6, 9-t.rioxaundekandiové kyseliny, čímž se získá sloučenina obecného vzorce XII, ve které W je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny NH₂, NKCK₃ a NHOH, Q představuje atom kyslíku, a skupina Z* je vybrána, aniž by vsak šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího skupiny (CH,) (CH₂)₄, (CH*)_S, (CH₂)₂SS(CH₂)₂ a CH. (OCK.CHJ.QCH..

Reakční činidla obecného vzorce XII, ve kterém W znamená skupinu NKOCH₃ a Q představuje atom kyslíku, se' připraví- alternativním způsobem syntézy, způsobem analogickým k přípravě reakčních činidel-obecného- vzorce XI, ve kterých W ' ’ znamená skupinu NHOCH₃. Buď 4- nebo 5-aminosalicylová kyselina se kondenzuje s aktivovanou dikarboxylovou kyselinou výhodně vybranou, aniž by však šlo o omezující výčet, ze *' r, .

souboru zahrnujícího sukcinylchloríd, adipoylehlorid, diisobutylester adipové kyseliny, suberoylchlorid, 3,3'-dithiopropionylchlorid- a 3, 6,9-trioxaundekandioylchlorid a diisobutylester 3,6,9-trioxaundekandiové kyseliny, čímž se- Získá sloučenina obecného vzorce XII, ve které hydroxyskupinu, Q znamená atom kyslíku a vybrána, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího, -skupiny (CH.)₂,- (CH.) ₄,- (CH.) _ir --. (CH,)’.SS (CH.·)'. a

CH₂.(.OCH_;CH₂.).₂OCH₂.............. ............... .........- ------- .. .....

W představuje

Z' skdcina

Následující ' reakcí sloučeniny obecného· vzorce XII, ve které W představuje hydroxyskupinu, Q znamená atom kyslíku a skupina Z* je vybrána, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího skupiny (CH.)., (CH.)₄, (CH_s)_á/ (CH₂),SS(CK.). a •CH.ÍOCH.CK.J.OCH., s N,N-karbonyldiimidazclem a poté' přidáním methoxylamin-hydrochldridu,' se. Získá sloučenina, ve které W představuje skupinu NKOCH₃ a skupiny Q a Z* mají výše definovaný význam.

Příklad 8

Příprava 4-amino-2-hydro.xybenzohydroxamové kyseliny . ..

100 ml absolutního methanolu a čerstvá koncentrovaná kyselina sírová se. za stálého míchání .opatrně smíchají v baňce s kulatým dnem o objemu 250 ml (exotermní průběh).

Přidá se 10,0 g (c5,.4.mmoi) 4-aminosalicylové kyseliny, čímž se získá.tmavý roztok, který se zahřívá k varu pod zpětným £ chladičem po dobu 6 hodin. Produkt se nechá vychladnout a poté se zahustí na rotační odparce na přibližně polovinu .původního objemu. V .této .době. se .objeví _pevná ..sraženina. ..... Koncentrát- se vylije do 400- ml vody a -výsledná suspenze, se . - titruje na přibližně pH 3 postupným přidáváním 5M hydroxidu

AÁr* ( i *.£1 \ -a mmrí ΓιΔτγγ á. n i t η 1 τ Λ i f~ a i: c,r\id τη,Δγί γ“ι přičemž s.e vyví jí clynnýoxid uhličitý.. Koncentrát., se .ochladí „ na ledu a výsledná sraženina s.e izoluje. ..filtrací’·. Filtrát s.e promyje studenou vodou a poté se .vysuší ve vakuu nad peletamihydroxidu sodného, čímž 'se získá 9,6 g (výtěžek- 83 %) methyl-4-aminosaiicyíátu,. ve’ formě ; světle ’ levandulového: prášku o teplotě tání 115 - 11.7 °C. Struktura., se potvrdí. .

pomocí-dt-NME v perdeuteroaoetc-nu :

^r' 'l '^JKě^::*.2;·&-; g'^:-’-'('40 mmol) - 'hydrdxylamin-hyďrdchibridú' a'20* g ledu seoptarně .přidá 4,0 g hydroxidu sodného v 16 ml vody.'

Po rozpuštění se přidá 0,4 g siřičitanu sodného a poté 3,35 g (20 mmol) methyl-4-aminosalicyiátu. Výsledný roztok se míchá po dobil, až 24 hodin při teplotě místnosti, ' přičemž' šé' průběh ‘ .>

reakce sleduje každých několik hodin pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi. Výsled- ' ný .roztok se.· ochladí na ledu a okyseli.se přidáním 25% kyseliny sírové. Sraženina- se začne tvořit při pH přibližně 6.

Hodnota pří se nakonec upraví na přibližně pH 4 a světle hnědá sraženina se izoluje filtrací. Produkt se vysuší ve vakuu nad oxidem fosforečným, čímž se získá 3,0 g (výtěžek 89 %)

4-amino-2-hydroxybenzohýdroxamové kyseliny o teplotě tání

130 - 131 *C. Struktura se potvrdí pomoci ^lH-NMR v perdeuterodimethylsulfoxidu.

4-amino-2-hydroxybenzohydroxamová” kyselina je klíčovým ¹ meziproduktem v přípravě reakčních -činidle obecných vzorců I a II, ve kterých X představuje skupinu MHOH a Y znamená atom kyslíku. Reakční činidla obsahující zbytky 2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny mohou tvořit biokonjugáty, které jsou » stabilní v pufrovaných vodných roztocích v přibližném rozmezí pH od 2,5 do 11,5.

*'

Příklad 9

Příprava činidla tvořícího komplex s fenyiboronovou kyselinou obecného vzorce XI reaktivního s aídehydovými skupinami

X ledem chlazenému míchanému roztoku 3,4 g {0,05 moll ~ 4-aminc-2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny, připravené jak je popsáno výše, ve 150 ml vody obsahujících 7,0 g (0,02 mol) hydrogenuhličitanu sodného se v průběhu 15 minut po kapkách přidá 9,0 g (0,06 mol) 3-methoxykarbonylpropionylchloridu. Roztok se míchá oři teplotě 0-5 ’C po dobu 1 hodiny a poté se okyselí studenou 6N kyselinou chlorovodíkovou. Sraženina se izoluje/a vysuší ; se - ve - vakuu, nad. peletami hydroxidu sodného, čímž se získá 13,5 g (výtěžek 96 %) surového M-4-(3-methoxykarbonylpropionamido)-2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny, která se použije bez dalšího čištění.

·” -K-roztoku -10---g (-0,035 mol) .-N-4- (ú-methoxykarbonyípro«, pionamido)-2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny v 50 ml methanolu se přidá 12 mi hydrazin-hydrátu. Reakce se nechá probíhat přes noc při teplotě místnosti, produkt se odfiltruje a promyje se etherem. Produkt se dvakrát překrystaluje z dimethylformamidu, čímž se získá 7,3 g (výtěžek 73 %) N-4-(3-hydrazidopropionamido)-2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny.

- .4 9

Příklad 10

Aplikace činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivního s aldehydovými skupinami

Glykoproteiny, a zej-ména protilátky, lze konjugovat s hydrazidovým činidlem tvořícím komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivním s aldehydovými skupinami, po ošetření proteinu 5 až 2OmM roztokem jodistanu sodného v.0,1 až .Q,.5M natriumacetátovém pufru při pH 5 až 6, obsahujícím až 0,2 M chloridu sodného, při teplotě 0 ^QC, po dobu od 30 minut do 4 hodin. Nadbytek jodistanu se odstraní diaiýzou nebo odsoiením, 'a aktivovaný protein, s připojenými, sousedícími aidehy-. dovými zbytky vzniklými jodistaňovou oxidací giycidových zbvtků se sousedícími koaxiálními 1, 2,— diodovými skuoinami,· -se kondenzuje s hydrazidovým· činidlem,, po dobu. od 1 do 24 hc-din při teplotě místnosti·,· čímž se získá -semikoňjugét s připojenými- zbytky tvořícími komplexy s fenylboronovými kyselinami kovalentně navázanými na protein pomocí vazby typu Schiffovy báze (iminového typu). Stabilitu vazby na protein lze. zvýšit, . pokud, je to. žádoucí, , mírnou natriumkyanb-oro- . hydridovou redukcí Schiffovy báž.e na odpovídající.alkylamin.

Je důležité uvést, že oxidace glykoprateinu jodistanem sočnýmaktivuje protein pokud jde o^r reakci s činidlem hydra židové.ho' ·’“ typu, 'přičemž současně odstraňuje většinu, přirozeně se’ vyskytujících zbytků tvořících komplexy s fenylboronovými kyselinami (koaxiálních. 1,2-diolů), které se vyskytují .v glykoproteinech. ' ¹

Příklad 11

Příprava činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XI reaktivního s thiolovými skupinami

K ledem chlazenému míchanému roztoku 10,0 g (0,073 mol)

5-aminosalicylamidu ve 300 mi vody obsahujících 42,0 g (0,5 mol) hydrogenuhličitanu sodného se v průběhu 15 minut po kapkách přidá 13,4 g (0,05 mol) jcdacetyichioridu. Roztok se míchá při teplotě 0-5 ’C po dobu 1 hodiny a poté se okyselí studenou 6N kyselinou chlorovodíkovou. Sraženina se izoluje a vysuší se ve vakuu nad peletami hydroxidu sodného, čímž se získá 21,3 g (výtěžek 9S %) surového 5-(jodacetamido)salicylamidu.

Příklad 12

Aplikace činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivního s thiolovými skupinami

Pomocí činidla tvořícího komplex renviboronovcu kyselinou reaktivního s thiolovými skupinami, jako je 5-(jodacetamido)saíicylamid, lze modifikovat proteiny obsahující disulfidové vazby (cystinové zbytky) nebo cystei.uové zbytky. Disulfidové vazby se v případě potřeby nejprve redukuji reakcí s 2-merkaptoethanoiem nebo dithiothreitolem, v důkladně odplvněném alkalickém vodném roztoku. Nadbytek redukčního, činidla se odstraní diaivzou nebo odsolením a orotain se

- * r>podrobí reakci s aikylačním činidlem v neutrálním vodném roztoku 'po dobu 1 ' hodiny při teplotě 4 ^:°C, čímž' se získá semikonjugát -s·· · připojenými ''zbytky “tvořícími“'komplexy s fenylboronovými kyselinami kovalentně navázanými k proteinu. Po dokončení reakce se -nadbytek činidla odstraní odsolením.

Příklad 13”

Příprava činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XI reaktivního s aminoskupinami

X ledem chlazenému míchanému roztoku 7,7 g (0,05 mol) 4-amin.osalicylové kyseliny, připravené jak je popsáno výše, ve 150 ml vody obsahujících 7,0 g (0,02 mol) hydrogenuhličitanu sodného se v průběhu 15 minut po kapkách přidá 9,0 g (0,06 mol) 3-mefhpxykarbonylpropionyichloridu. Roztok ' se míchá při teplotě 0-5 °C po dobu 1 hodiny a poté se okyselí studenou 6M kyselinou chlorovodíkovou. Sraženina se izoluje a vysuší se ve vakuu nad peletami hydroxidu sodného, čímž se získá 11,9 g (výtěžek 39 %) surové N-4-(3-methoxykarbonylpropionamico)salicylové kyseliny, která se dalšího čištění.

Z použije bez (0,036 mol) · kvselinv v

K intenzivně míchanému roztoku 10,0 g j.T— 4 — {3-methoxykarbonyloropionamido) salicylové 50 ml' tetrahydrofuranu se postupně -přidá 5-,84 g (-0,036 mol) ’ 1,1'-karbonvldiimidazolu a 3,0 g (0,035 mol) methoxylamin-hvdrochloridu. Nádoba se opatří sušící rourkou a reakční směs se intenzivně míchá po dobu 30 minut při. teplotě místnosti. Imidazolium-hydrochlorid, který se vyloučí, v průběhu reakce, se odstraní filtrací. Filtrát se zahustí na rotační odparce, čímž se získá jantarový olej, který se rozpustí v 10 ml teplého tetrahydrofuranu a poté se přidá ke 150 ml. 2N kyseliny sírové. Sraženina . se izoluje' filtrací,· prom.yje se. 2N kyselinou sírovou, promyje se vodou a poté se suší přes noc ve vakuu nad peletami hydroxidu sodného, čímž se získá 10,0' g..(výtěžek'94.%.)_:N-4'-(3-methoxykarbo_nylpropion-'_;·· amido)-2-hydroxy-0-methylbenzohydroxamové kyseliny.

.7,4 g (0,025 mol) N-4-(3-methoxykarbonylpropionamido)-2-hydroxy-O-methylbenzohydroxamové kyseliny se rozpustí ve 25 ml 0,2N methanoiického hydroxidu lithného. Roztok se míchá přes noc při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Methanol se odstraní na rotační odparce a zbytek se rozpustí ve 150 ml vody. Roztok'se okyselí 2N kyselinou sírovou na pH přibližně 2 a poté se extrahuje 100 ml etheru. Provede se druhá extrakce etherem a pozé se smíchané etherové extrakty vysuší nad bezvodým síranem sodným. Produkt se zahustí na rotační odparce a poté se suší přes noc ve vakuu nad oxidem fosforečným, čímž se získá 6,28 g (výtěžek 83 %) N-4-sukcinamido-2-hydroxy-0-methylbenzohydroxamové kyseliny.

5,65 g (0,02 mol) N“4-sukcinamido-2-hydroxy-0-methyibenzohydroxamové kyseliny se rozpustí v 50 mi horkého dimethylformamidu a nechá se ochladit na teplotu místnosti. K míchanému roztoku se. přidá 2,3 g (0,02 moí} N-hydroxysukcinimidu a poté čerstvě připravený roztok 4,1 g (0,02 mol) dicyklohexylkarbodiimidu v 10 ml dimethyiformamidu. Výsledná suspenze se míchá přes noc při teplotě místnosti. Z roztoku se odfiltruje dicyklohexylmočovina a filtrát se zahustí na rotační odparce na minimální objem. Zbytek se' vysráži s .etherem, sraženina se izoiuje filtrací, promyje se -.etherem, promyje se 2-propanolem, a poté se krátce suší ve vakuu nad oxidem fosforečným, čímž se získá 5,5 g (výtěžek 74 %);

sukcindimidylesteru N-4-sukcinamido-2-hydroxy-C—methyíbenzo^ hydroxamové kyseliny. Produkt se skladuje v mrazničce při teplotě -15 °C.

Příklad 14

Aplikace činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivního s aminoskupinami.

Proteiny lze .konjugovat s činidlem tvořícím komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivním s aminoskupinami reakci s ε-aminoskupinami lyzinových zbytků v postranních .řetězcích, pro získání semikonjugátů s připojeními zbytky tvořícími komplexy s fenylboronovými kyselinami kcvalentně navázanými na protein pomocí stabilních amidových vazeb. Je vhodné použít mírně alkalické vodné pufry s pK v rozmezí 7,3 až 8,3, pro zajištění, že aminoskupina je neprotonovaná, přičemž se minimalizuje hydrolýza N-hydroxysukcinimidyiesteru. Je nutné se vyhnout pufrům obsahujícím primární amin, včetně tris(hydroxymethyl)aminoethanu a glycinu, pro vyhnutí se křížové reaktivitě. Na pevné nosiče s připojenými zbytky primárních aminů lze navázat funkční skupiny analogickým způsobem reakcí' s činidly tvořícími komplexy . s fenylboronovými kyselinami, pro získání pevných nosičů s připojenými zbytky tvářícími komplexy s fenylboronovými kyselinami.

Přiklad 15

Příprava činidla.tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XII

6,4 g .(0,03a mol) 4-amino-2-hydroxybenzohydroxamové kyseliny se rozpustí'v 50 ml suchého dichlormethanu. Přidá se 5,3 ml (0,038 mol) triethylaminu .a.poté se v průběhu 2 hodin po kapkách přidá roztok 5,0 g (0,019 mol) 3,6,9-trioxaundakandioylehloridu v 50 ml suchého dichlormethanu. Filtraci,se odstraní triethyia.monium-hydrochiorid, filtrát se promyje dvakrát 100 ml vody, dvakrát 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 100 mí nasyceného roztoku chloridu sodného a vysuší se nad bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo se Odstraní na rotační odparce a zbytek se překrvstaíuje za- 100 ml methanolu, čímž se získá 6,0 g (výtěžek 61 %) bnezbarvých krystalů. Struktura se potvrdí pomocí ¹H-NMR v perdeuterodimethylsulfoxidu. .

Příklad ,16

Aplikace ,,činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XII .i·¹'·

Proteiny, které byly konjugovány s fenylboronovou kyselinou, ' lze zesítit účinkem .reakčního činidla obecného vzorce XII. Tento postup, je obzvláště vhodný pro přípravu proteinových agregátů, které jsou .vhodné pro- modifikaci stability a solubiiity proteinu. Kromě toho jsou enzymové agregáty, ' přioravsné zesítěním, vhodné pro zesílení citlivosti ELISA-testu. Tento princip je využíván v systému Avidin-Siotin použitím komplexů Avidin-Siotin (nazývaných ASC-komplexy) , kdy se nejprve po.už.ije .biotínylovaný enzym pro vytvoření komplexu s vysokou molekulovou hmotností s avidinem (zesíténím), před aplikací tohoto komplexu v ELISA-testu pro vysoce citlivou detekci biotinylované protilátky.

Příklad 17

Obecná syntéza činidel tvořících komplexy s fenylboronovými. kyselinami obecného vzorce XVIII

Reakční činidla obecného vzorce XVIII, například ve kterých X je vybrán ze souboru zahrnujícího atom vodíku, methylovou skupinu a fenylovou skupinu a Y znamená atom kyslíku, se připraví kondenzací N-hydroxyftalimidu se sloučeninou obecného vzorce R,-Z-R., kde R_L je vybrán ze souboru zahrnujícího atom bromu, chloru a jodu, a výhodně představuje atom bromu, R. je vybrán ze -souboru zahrnujícího atom bromu, chloru a jodu, skupinu CO,H a CO.CH₃, .a výhodně je vybrán ze souboru zahrnujícího atom bromu, skupinu CO.K a CO_;CK₃, a Z má význam definovaný pro obecný vzorec XVIII, například výhodně, znamená spojovací skupinu vybranou.’ ze souboru..zahrnujícího...alkylové. ř.e.tězce. a póly. etherové '.řetězce., o délce od 2 do 12 uhlíkových ekvivalentu, které v sobě mohou obsahovat amidové skupiny, a výhodně představuje skupinu (CH_z)_Il, kde n má hodnotu 2 až 6, nebo skupinu (CH,CH.O)_n, kde n má hodnotu 2 až 4.

(a) V počáteční reakci se sloučenina obecného vzorce R.-Z-R. zahřívá v dimethylformamidu s jedním ekvivalentem N-hydroxyftalimidu na teplotu' od 40 °C do 100 ’C, až se získá roztok. Tento roztok se poté nechá ochladit na teplotu místnosti a přidá se jeden ekvivalent triethylaminu, čímž dojde ke vzniku tmavě červeného zabarvení spojeného s přítomností N-hydrcxyftalimidového aniontu. Roztok se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 až 4 dnů, přičemž se průběh reakce sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Po dokončení reakce se přidá.'voda''pro'vysrážení produktu, který se p.romyjé vodou a vysuší při teplotě místnosti, čímž se získá produkt, ve kterém Rj_ představuje f talimidoskupinu a R- má výše definovaný význam. Produkt, ve kterém R. je vybrán ze souboru zahrnujícího atom bromu, chloru a jodu, se kondenzuje s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího činidla vzorců C_eH₄(CO)₂NK, CH₃COONa a CH₃COSK. Podmínky se mění v závislosti na požadovaném produktu, ale obecně se přidá i,i ekvivalentu

C₆H₄(CO),NK, CH₃COONa nebo CH₃COŠK a směs se zahřívá k varu pod zpětným chladičem v polárním rozpouštědle vybraném ze skupiny zahrnující kyselinu octovou, dimethyíformamid, methane·! a ethanol, po dobu od. I do 2 4' hodin.

(b) Produkt ze stupně .(a) se poté podrobí kyselinou katályzované hvdrolýze ftalimidoskupiny, takže se R, změní na skupinu NH, a r_z se acyluje na skupinu R₂Ac, kde zbytek’ K.AC je vybrán ze souboru zahrnujícího skupiny N(CO)_:C₅H₄, CCGCH., a SCOCHj, a Z má výše definovaný význam.. Kyselinou, katalyzovanou hydrolýzou ftalimidoskupiny, pokud R. znamená skupinu CQ_?CH₃, se . získá produkt, ve .kterém R_; je vybrán_ ze., souboru zahrnujícího skupiny CO.H a CO_zCHj, a Z má’ výše definovaný význam. Ftalimidoskupina se hydrolyzuje. krátkým zahříváním k varu pod zpětným chladičem po dobu od 15 do 50 minut v koncentrované. kyselině, chlorovodíkové,, koncentrované, kyselině chlorovodíkové v kyselině octová, '30% bromovodíkové' kyselině nebo 43% bromovodíkové kyselině. V každém případě se kyselina ftalová jako vedlejší produkt odfiltruje z výsledného roztoku, poté co se' nechá ochladit na teplotu místnosti. Objem se zmenši a produkt se neutralizuje hydroxidem sodným, hydrogenuhličitanem sodným nebo uhličitanem sodným. Extrakcí etherem nebo ethylacetátem a následným zahuštěním ve vakuu se získá produkt.

(c) Produkt ze stupně (bi se poté kondenzuje s reakčním činidlem vybraným zs souboru zahrnujícího salicylaldehyd, 2-hydroxyacetofenon a 2-hydro xydifeny.i keton, čímž se získají, odpovídající produkty s karbonimidoylovou skupinou v místě symbolu R_L. Kondenzace produktů s .reakčním činidlem vybraným ze souboru zahrnujícího salicylaldehyd, 2-hydroxyacetofenon a 2-hydroxydifenylketon se dosáhne zahříváním pod ' zpětným chladičem v methanolu nebo 90% ethanoiu na teplotu 50 *c po . dobu od 4 do 12 hodin, přičemž se postup reakce sleduje pomocí chromatografie na tenké vrstvě. Produkt se zahustí ve , vakuu, a poté se přes noc suší v exsikátoru.

(d) -‘ Z produktů^- ze stupně (c) se odstraní chránící’ ‘skupiny pomocí bází katalyzované hydrolýzy v teplém vodném uhličitanu draselném nebo hydroxidu sodném, za 3 až 24 hodin, čímž se získají produkty obecného vzorce P5, kde a Q mají výše“ definovaný význam. Produkt se okyselí kyselinou chlorovodíko- · vou, extrahuje se ethylacetátem, vysuší se nad bezvodým síranem hořečnatým a zahustí ve vakuu. Chránící skupina se odstraní reakcí s hydrazin-nydrátem v ethanoiu vroucím pod; zpětným chladičem za 12 - 49 hodin. Vysrážený ftalhydrazid se $ odfiltruje z rozteku, roztok se zahusti, produkt se extrahuje?; ethylacetátem, vysuší se nad bezvodým síranem hořečnatým a zahustí’ se·' ve' vakuu.' ''' ' ’ : .v - - - .

(e) Konečný produkt se připraví aktivací aminoskupin, hydroxyskupin, thiolových skupin nebo karboxylových skupin v produktech. Aminoskupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šio o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího anhydríd kyseliny bromoctové, anhydrid 'kyseliny jodoctové a anhydríd kyseliny maleinové. Kydroxyskupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šio o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid,· pentafiuorbenzensuífonylchlcrid, toluensulfonvlchlorid a 2-kvanethyi-N,N-diisopropylchlorfosforamidít. Thiolové skupi57 ny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2-thiopyridon, 4-thiopyridon a -'3-nitro-2-merkaptopyri-din. Karboxylové skupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným ze souboru zahrnujícího dicyklohexylkarbodiimid a l-ethyi-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid, za přítomnosti reakčního činidla výhodně vybraného, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího' N-hydroxysukcinimid ' a N-hydroxysulfosukcinimiď. Alternativně lze karboxylové skupiny esterifikovat alkoholem výhodně vybraným.

ΖΘ 50'CLkjQ ZLÍ ΗιιΙΓΓΪοΙ J J.C ihVianrtl λ nnhd Hála funkcionali-zovat reakcí s'· reakčním ..činidlem výhodně vybraným ze souboru zahrnujícího hydrazin-hyďrát a hydroxylamlň.

Produkty -obecného vzorce XVIII,' ve kterých X je vybránze souboru zahrnujícího, atom- vodíku, methy.lo.vou skupinu a fenyiovou skupinu, a Y představuje skupinu CK_:, se připraví jak je uvedeno, výše nahrazením N-hydroxyftalimidu kalium-ftalimidem v počátečním stupni syntézy.

Příklad .18

Obecná syntéza činidel tvořících komplexy s fénylboronovýmí kyselinami'.obecného· vzorce'XIX ' ' ^r (a) Reakční činidla, obecného vzorce XIX, kde Y představuje atom kyslíku, se připraví analogickým způsobem jako je popsán výše, přičemž stupně (a)· a (b) syntézy se provádějípřesně jak je popsáno v předcházejícím příkladu. Produkt ze stupně (b) předcházejícího příkladu se poté kondenzuje s reakčním činidlem výhodně vybraným, . aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2-acetoxybenzoylchloríd a 2-benzvloxybenzoylchiorid, čímž se získá odpovídající amid. Kondenzace produktů s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2-acetoxybenzoylchlorid a 2-benzyloxybenzoýlchlorid se' pro58 vádí mícháním v dichlormethanu obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, přičemž se průběh reakce sleduje pomocí chrcmatografže na tenkém vrstvě. Z roztoku se odfiltruje triethyiamonium-hydrochiorid. Filtrát se promyje vodou, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

(b) Z produktů z předcházejícího stupně se odstraní chránící skupiny (například se deacyíují na zbytku td) pomocí bází katalyzované hydrolýzy v teplém vodném uhličitanu draselném nebo hydroxidu sodném za 8 až 24 hodin. Produkt se .okyselí, kyselinou- chlorovodíkovou,· extrahuje se ethylacetátem, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu. Pokud byla v průběhu přípravy produktů použita acetoxylová chránící skupina pro ochranu fenoiické hydroxyskuoiny, odstraní se zde rovněž, čímž odpadne nutnost; následujícího stupně syntézy. Chránící skupina se odstraní reakcí s hydrazin-hydrátem (N.H,. xH.O) zahříváním k varu v ethanolu pod zpětným chladičem po dobu 12 až 43 hodin. Vysrážený ftalhydrazid se odfiltruje z roztoku, roztok se zahustí, produkt se extrahuje ethylacetátem, vysuší se nad bezvodvm síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

(c) . Z produktů ze stupně (b) se v případě potřeby odstraní další chránící skupiny, odstraněním benzyloxyloyých chránících skupin pomocí katalytické hydrogenace. Katalytická hydrogenace se provádí na palladiu na uhlí jako katalyzátoru v bezvodém absolutním ethanolu po dobu 2 až 12 hodin. Katalyzátor se odstraní filtrací a produkt se zahustí ve vakuu.

(d) Konečný produkt se připraví aktivaci aminoskupin, hydroxyskupin, thiciových skupin nebo karboxylových skupin v produktech. Aminoskupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího anhydrid kyseliny bromoctové, anhydrid kyseliny jodoctové a anhydrid kyseliny maleinové.

Kydroxyskupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2, 2,-'-2—trifiucretuansulzcnylchlorid, pentařluorbenzensulfcnylchlorid, toluensulfcnylchlorid a 2-kyaneťnyl-N,N-díisopropyíchlortosforamidit. Thiolové skupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným, aniž by však šlo o omezující výčet, ze souboru zahrnujícího 2-thiopyridon, 4-thiopyridon a 3-nitro-2-merkaptopyridin. Karboxylové skupiny lze aktivovat reakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným ze souboru zahrnujícího dicyklohexylkarbodiiiíiid a i-ethyl-3-(3-dím.ethylaminopropyl) karbodiimid, za přítomnosti-reakčního činidla výhodně vybraného, aniž by však šlo o omezující sukcinimid a Mkarboxyíové skupí: ze souboru zahrz funkcionalizovat : ze souboru zahrnu; není aktivace fi. řenolické hvdroxy poté odstranit b aktivovaná řoram žýčet, ze souboru zahrnujícího N-hydroxyhvdroxvsulfosukcinimid. .Alternativně lze y esterifikovat alkoholem výhodně vybraným. :jícího methanoi a ethancl a poté dále eakcí s reakčním činidlem výhodně vybraným ícího hydrazin-hydrát a hydroxyiamin. Pokud' .ální produktu kompatibilní s přítomností toupíny, lze produkty nejprve aktivovat a nizyloxylcvou chránící skupinu, pokud je zabiiní vůči katalytické hydrogenaci.

Produkty obecného vzorce XII, ve kterých Z- představuje skupinu CH-, se připraví jak. je uvedeno výše nahrazením N-hydroxyřtalimidu kalium-ftalimidem v počátečním stupni syntézy.

Příklad 19

Příprava činidla tvořícího komplex s řenylboronovou kyselinou obecného vzorce XVIII reaktivního s aldehydovými skupinami

V počátečním stupni syntézy se methyl-S-bromhexanoát kondenzuje s N-hydroxyftalimidem mícháním v dimethylřormamidu obsahujícím jeden ekvivalent triethylamínu po 'dobu 24 hodin.

Produkt se vysráží vylitím do vody, izoluje se filtrací, oromvje se vodou, vysuší se ve vakuovém exsikátoru a použije se bez dalšího čištění. ........

Ve druhém stupni syntézy se surový produkt získaný výše krátce zahřívá k varu pod zpětným chladičem ve směsi kyseliny octové a koncentrované kyseliny chlorovodíkové.' Po ochlazení se vysrážená kyselina ftalová odfiltruje z roztoku, filtrát se zahustí a poté se opakovaně koevaporuje s malými objemy vody pro odstranění stopových množství kyselin. Nakonec se aminooxy-hydrochloridový produkt neutralizuje hydrogenuhličitanem· sodným, extrahuje --se ethyl-acetátenp ’ vysuší- - -se- - nad bezvodým-síranem·· horečnatým a zahustí-se ve vakuu·. -

Ve třetím stupni syntézy se aminooxylový produkt získaný výše kondenzuje s jedním ekvivalentem 2-hydroxybenzaldehydu zahříváním k varu pod zpězným chladičem po dobu 6 hodin v 90% ethanoiu a poté se zahustí ve vakuu, čímž se získá aldoxim.

' ' Nakonec se k aldoximovému produktu získanému výše. přidá nadbytek hydrazin-hydrátu a směs se míchá přes noc v methanolu. Vysrážený hydrazid-aldoximový produkt se ochladí v ledová lázni, odfiltruje se z roztoku, znovu se rozpustí v methanolu a poté se zahustí ve vakuu.’

Příklad 20

Aplikace činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivního-s aldehydovými .skupinami ......

Giykoproteiny, a zejména monoklonální protilátky, lze konjugovat s hydrazidovým činidlem tvořícím komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivním s aldehydovými’ skupinami., po ošetření proteinu jodistanu sodným v alkalickém vodném roztoku po dobu I až 12 hodin. Nadbytek jodistanu se odstraní dialýzou nebo odsolením, a aktivovaný protein, s připojenými jodistanovou koaxiálními hydražidovým sousedícími aldehydovými zbytky vzniklými oxidací giycidových zbytků se sousedícími

1.2- diolovými skupinami, se kondenzuje s

Činidlem, po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, čímž se získá semikonjugát s připojenými zbytky' tvořícími komplexy s fenylboronovými kyselinami kovalentně navázanými na protein pomocí vazby typu Schiffovy báze. Stabilitu vazby na protein lze zvýšit natriumkyanborohydridovou redukcí Schiffovy báze na odpovídající amin. Je důležité uvést, že oxidace glykoproteinu jodistahem sodným aktivuje protein pokud jde o reakci s činidlem hydrazidového typu, přičemž současně odstraňuje většinu přirozeně se vyskytujících míst tvořících komplexy s fenylboronovými- kyselinami (koaxiálních

1.2- diolů), které se vyskytují v glykoproteinech.

Příklad .21

Příprava činidla tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XIX reaktivního s thiolovými skupinami

V počátečním, stupni, syntézy se 1,.2-bis-(-2-jodethoxy.).ethan- kondenzuje 3' N-hydroxyftalimidem zahříváním' k varu pod zpětným chladičem v dimethylformamidu - obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu po dobu 3 dnů. Produkt' sé vysráží vylitím do vody, izoluje se filtrací, p.romyje se vodou, vysuší se ve vakuovém exsikátoru a použije se bez dalšího čištění.

Ve druhém stupni syntézy se k surovém produktu získanému výše v absolutním etnanolu přidá nadbytek thioacetátu draselného -a výsledná žlutá' suspenze se zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí, zfiltruje a zahustí se ve vakuu. Suspenze se roztřepe mezi ethylacetát a vodu. Smíchané ethylacetátové vrstvy se prcmyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší se .nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

Ve třetím stupni syntézy se výše získaný produkt krátce zahřívá k varu pod zpětným chladičem ve směsi kyseliny octové a koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Po ochlazení se vysrážená kyselina ftalová odfiltruje z roztoku a filtrát se zahustí a poté se opakovaně koevaporuje s malými objemy vody pro odstranění stopových množství kyselin. Nakonec se aminooxy-hydrochlcridový produkt neutralizuje hydrogenuhlíčitanem sodným, extrahuje se ethylacetátem, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

Ve čtvrtém stupni syntézy se aminooxylový produkt získaný výše kondenzuje s jedním ekvivalentem 2-acetoxybenzoyl-chloridu mácháním po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti v dichlormethanu obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu, přičemž se průběh reakce sleduje pomocí chromatografie na tenké vrstvě. Z roztoku se odfiltruje triethylamonium-hydrochíorid, filtrát se promyje vodou, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

V pátém stupni syntézy se výše získaná 2-acetoxybenzo-. hydroxamová kyselina v absolutním methanolu důkladně odplyní dusíkem, přidá sě k němu jeden ekvivalent bezvodého uhličitanu draselného a výsledná žlutá suspenze se intenzivně míchá po dobu '12 hodin. Suspenze se zfiltruje a zahustí se ve vakuu. Nakonec se na výslednou merkapto-2-hydroxybenzohydroxamovou kyselinu působí roztokem (methoxykarbonyí)sulfenylchloridu v-suchém' odplyněném- methanolu- mícháním při' teplotě 0 °C po dobu 1 hodiny a metnanol se odstraní ve vakuu. Produkt se znovu rozpustí v odplyněném methanolu a působí se na něj jedním ekvivalentem 3-nitro-2-merkaptopyridinu mícháním při teplotě místnosti po dobu 12 hodin. Směs se zfiltruje pro odstranění nezreagovaného 3-nitro-2-merkaptopyridinu a produkt se zahustí ve vakuu.

Příklad 22

Aplikace, činidla tvořícího komplex s fenylbs.ro^QVOu kyselinou reaktivního s thiolovými skupinami

Proteiny obsahující disulfidové vazby lze konjugovat s činidlem tvořícím komplex s fenylboronovou kyselinou reaktivním s thiolovými skupinami. Disulfidové vazby se nejprve· 'redukují reakcí s 2-merkaptoethanolem nebo dithiothreitolem, v důkladně odplyněném alkalickém vodném roztoku. Nadbytek redukčního činidla se odstraní dialýzou nebo odsolením, a protein se podrobí reakci _s činidlem, reaktivním s thiolovými skupinami v důkladně odplýněhém alkalickém vodném roztoku v atmosféře dusíku přes noc při teplotě 4 ^eC, čímž se získá semiko.nj.ugát . s. připojenými. . zbytky tvořícími, komplexy s fenylboronovými. kyselinami, kovalentně navázánými k proteinu disulfidovými vazbami. Po dokončení reakce, se nadbytek činidla odstraní odsolením nebo thiolovou výměnnou chromatografií. Zbytky tvořící komplexy s. fenylboronovými kyselinami: .lze .odstranit., ze semikonjugátu redukcí disulfidové vazby, jak ýe popsáno- výše. Tímto způsobem lze štěpit, bioko.njugáty obsahující . semikonjugáty připravené .z činidel tvořících komplexy s fenylboronovými- kyselinami reaktivních' gthiolovými skupinami. - Příklad 23

Příprava činidla .tvořícího komplex s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XIX reaktivního s aminoskupinami

V počátečním stupni syntézy se 2-(2-(2-chloretnoxy)ethoxv]ethanol kondenzuje s N-hydroxyftalimidem zahříváním k varu pod zpětným, 'chladičem v dimethylformamidu obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu po dobu 2 dnů. Produkt se vysráží vylitím do vody, izoluje se filtrací, promyje se vodou, vysuší se ve vakuovém exsikátoru a použije se bez dalšího čištění.

Ve druhém stupni syntézy se' výše získaný surový produkt krátce zahřívá k varu pod zpětným chladičem ve směsi kyseliny octové a koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Po ochlazení se vysrážená kyselina ftalová odfiltruje z roztoku a filtrát se zahustí a poté se opakovaně koevaporuje s malými objemy vody pro odstranění stopových množství kyselin. Nakonec se aminooxy-hydrochloridový produkt neutralizuje hydrogenuhličítanem sodným, extrahuje se ethylacetátem, vysuší se nad s bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

Ve třetím stupni syntézy se hydroxyamínooxylový produkt získaný výše. kondenzuje s jedním ekvivalentem 2-benzyloxybenzoyl-chloridu mícháním po dobu i hodiny pří teplotě^ místnosti v dichlormethanu obsahujícím jeden ekvivalent-. «= triethylaminu, přičemž se průběh reakce sleduje pomoci. . , chromatografie na tenké vrstvě. Z roztoku se odfiltruje triethylamonium-hydrochíorid, filtrát se promyje vodou, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve « y.™>

vakuu. * — <> *

Ve čtvrtém stupni syntézy se výše získaná hydroxy-2-benzyloxybenzohydroxamová kyselina· kondenzuje s jedním

......ekvivalentem--2 ,-2-, 2-tri-f-luorethan'su'lfbriýlčhlbf iďú.'.mícháním . po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti v acetonitrilu obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu. Z roztoku se odfiltruje triethylamonium-hydrochíorid, filtrát se promyje vodou, vysuší se nad bezvodým síranem..horečnatým - a· -zahustí se ve . vakuu.

Nakonec se benzvloxylová chránící skupina odstraní katalytickou hydrogenací na palladiu na uhlí po dobu 8 hodin v bezvodém absolutním ethanolu. Katalyzátor se odstraní filtrací a produkt se zahustí ve vakuu.

Příklad 24

Aplikace. činidla .tvqřícíhcj komplex ,s . fsny.lboronqv.oiu«-k.yselinou reaktivního s amineskupinami

Proteiny lze konjugovat s činidly tvořícími komplexy s fenylboronovými kyselinami reaktivními s aminoskupinami reakcí s ε-amínoskupinami lyzinových zbytků v postranních řetězcích, pro získání· semikonjugátu s připojenými zbytky, tvořícími komplexy s fenylboronovými kyselinami kovalentně navázanými na protein pomocí stabilních sulfonamidových vazeb.· . Je . vhodné použít . alkalické -vodné ^pufry pro zajištění, že aminoskupina je neprotonovaná. 'Je nutné se vyhnout pufrům obsahujícím primární amin, včetně tris(hydroxymethyl) aminoethanu¹ a· gi.ycinu., pro, vyhnutí, sé. křížové reaktivitěNa pevné, nosiče- s připojenými zbytky primárních. aminů lze .navázat, funkční skupiny ’ analogickým způsobem -reakcí 5' činidly tvořícími komplexy s' fenylboronovými kyselinami, pro získání pevných nosičů s připojenými zbytky tvořícími komplexy s fenylbor.onoyými.. kyselinami.,,.

Příklad 25 . .. '

Příprava činidla tvořícího ' komplexy s fenylboronovou kyselinou obecného vzorce XIX reaktivního se syntetickými oligonukleotidy

V . počátečním stupni syntézy se 2-[2-(2-chloretho'xy)ethoxy]ethanol kondenzuje s N-hydroxyftalímidem zahříváním k varu ; pod.· zpětným chladičem v dimethylformamidu obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu po - dobu 2 dnů. Produkt se vysráží vylitím dc vody, 'izoluje se filtrací, promyje se vodou, vysuší se ve vakuovém éxsikátoru a použije se bez dalšího Čištění.

Ve druhém stupni syntézy se výše.získaný surový produkt krátce zahřívá k varu pod zpětným chladičem ve směsi kyseliny octové a koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Po ochlazení se vysrážená kyselina ftalová odfiltruje z roztoku a- filtrát se zahustí a poté se opakovaně koevaporuje s malými objemy vody oro odstranění stopových množství kyselin. Nakonec se aminocxy-hydrochloridový produkt neutralizuje hydrogenuhiičitanem sodným, extrahuje se ethylacetátem, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

Ve třetím stupni syntézy se hydroxyaminooxylový produkt získaný výše -kondenzuje s jedním ekvivalentem 2-acetoxybenzoyl-chloridu mícháním po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti v dicnlormethanu obsahujícím jeden ekvivalent triethylaminu, přičemž se průběh reakce sleduje pomocí chrcmatografie na tenké vrstvě. Z roztoku se odfiltruje triethyiamonium-hydrochlorid, filtrát se promyje vodou,, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým a zahustí se ve vakuu.

·?/·

Ve čtvrtém stupni syntézy se výše získaná hydrcxy-2-acetoxybenzohydroxamová kyselina kondenzuje s jedním ekvivalentem 2-kyanetnyl-N,N-diisopropylchlorfosforamičitem mícháním po dobu 1 hodiny při- .teplotě místnosti v acetonitrilu obsahujícím jeden ' ekvivalent triethylaminu. Z roztoku- -se--od-filt-ruj-e- triethylamonium^hydrochiOrid;' 'filtrát se promyje vodou, vysuší se nad bezvodým síranem horečnatým· a zahustí se ve vakuu.

V pátém stupni syntézy se výše získaná 2-kyanethyl-N,N-diis.opropylfosforami'dit-2-acetoxyběnzohydroxamová ’ kyselina rozpustí v acetonitirlu a umístí se pomocné nádržkyautomatizovaného syntetizéru oligonukleotidů. Produkt se kondenzuje s volným 5'-0K-koncem zmobilizovaného syntetického oligonukleotidu procházejícího syntézou pomocí pyridinem katalyzované reakce s 2-kyanethyl-N,N-diisopropylfosforamiditovým činidlem v acetonitrilu. Tímto způsobem se ukončí syntéza na pevné fázi. V konečném stupni syntézy se produkt odštěcí od skleněného pevného nosiče amonolýzou přes noc koncentrovaným hydroxidem amonným při teplotě od 50 do 60 °C. Amonolýza odštěpí produkt z pevného nosiče a rovněž odstraní-^všechny acylové chránící skupiny včetně acetoxyskupiny ve zbytku 2-acetoxybenzohydroxamové kyseliny. Produkt se zahustí odstraněním amoniaku na rotační odparce a poté ss vyčistí pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi.

Příklad 26 u·Aplikace -činidla tvořícího. komplex-S--fenyiboronovou-kyselinou' reaktivního se syntetickými oligonukleotidý .T,

Syntetické oligonukleotidý lze konjugova“ s '2-kyahethyl-N,N-diisopropylřosforamiditovými činidly tvořícími komplexy s fenylboronovýmí kyselinami v průběhu koncového stupně automatizované syntézy oligonukleotidů na pevné fázi, pro získání syntetických oligonukleotidů, které mají na 5'-konci připojené zbytky tvořící komplexy s fenylboronovýmí kvseiinami.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ N Á ?. .0 X Y

   1. Biokonjugátové komplexy obecného vzorce A =AS-L-Bc-L'-{3c ₃-ΞΑΞ

   Ί i¹ ve kterém

   BAS a BAS' představují bioaktivní látky, které mchcu bý· stejné nebo rozdílné,

   L, L' a L znamenají spojovací skupiny, které mohou být stejné nebo rozdílné, '

   Bc.a Bc' představují komplexy fenylboronových. kyselin, kters mohou byť stejné nebo rozdílné, obecného vzorce D-Ξ nebo 2-D, kde

   D znamená zbytek fenylbcronové kyseliny, a

   Ξ preos^:_svuja zbytex tvořící komplex s novou kyselinou, a má hodnotu O nebo 1, :envrocros tím, že Ξ neznamená glykosylovou skupinu.
2. 2. Biokonjugátové komplexy vybrané ze souboru zahrnujícího komplexy obecných vzorců I až X ______..

   í SUBSTITUTE SHEET •jb (IV)

   X

   X'

   - ·70

   i.*' BAS

   BAS¹

   -(VII)· - -

   Q ve kterých

   Q a Q' jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího atom kyslíku, atom síry, skupinu NH, skupiny N-alkyl, N—aryu a NClíj—aryl,

   Y a Y·' jsou nezávisle na sobě vybrány zé' souboru zahrnujícího atom kyslíku, skupinu NH, skupiny N-alkyl, alkylové skupiny a arylové skupiny.

   2, Z', Z* a Z*' představují spojovací skupiny nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího alkylové a polyeťherové řetězce o délce od 1 do 16 uhlíkových ekvivalentů, přičemž řetězec v sobě může obsahovat amidové a disulfidové.vazby,

   BAS, BAS^r, BA.5* a BA.3*' znamenají bioaktívní látky, které mohou být stejné nebo rozdílné,

   X a X' jsou nezávisle na sobě vybrány ze souboru zahrnujícího 'atom vodíku, methylovou skupinu a- fenylovou skupinu, a

   W a W' jsou nezávisle na sobě vybrány ze· souboru zahrnujícího atom- kyslíku, skupinu NH, skupiny N-alkyl, NC₆H_S, N-aryl, NCH_;-aryl, 'NCH,CH,OH, NCOCH_ZCH₂OK, NOH, NO-alfcyl a N0CH_;-aryl, •Λ» přičemž, pokud není uvedeno jinak, alkyl označuje uhlovodíkový zbytek o délce až 6 atomů uhlíku, a aryl je vybrán ze souboru zahrnujícího aromatické kruhy, substituované aromatické kruhy a kondenzované aromatické kruhy.
3. 3. Použiti semikonjugátú obecného vzorce XV fenylboranových kyselin

   2*—BAS·

   HO-b' ^(χΤ/) vs kterém máji symboly Z* a BAS* význam definovaný v nároku

   2, pro přípravu biokonjugátových komplexů podle nároku 1 nebo

   2.
4. 4. Semikonjugáty tvořící kompiexy g fenylboronov.ými' kyselinami vybrané ze souboru zahrnujícího semikonjugáty- obecných vzorců XIII,· XX a XXI- ·. ' . '

   4;

   (XX)

   SUBSTITUTE

   SB '-ρ ~r·. .

   1' ve kterých symboly Q, X, Y, 2 a BAS mají význam definovaný v nároku 2, a

   W*. je vybrán ze 'souboru zahrnujícího atom vodíku, hydroxyskupinu, skupiny NH-, NHČKj, NHOH a NKOCHj.
5. 5. řoužití reakčních činidel na bázi fenylboronové kvselinv obecného vzorce XIV

   Z’—A (XIV) · !>

   Z* má význam definovaný v nároku 2, a

   R ’ představuje elsktrofilni nebo nukleofiíní zbytek vhodný pro reakci s bioaktivní látkou, pro přípravy biologických kcnjugátú podle nároku 1 nebo 2.
6. 6. Činidla tvořící komplexy s fenylboronovými kyselinami vybraná .ze ‘souboru.zahrnujícího činidla obecných vzorců XI, xviii a XIX' o

   .A.

   W¹ (XI)

   SUBSTITUTE

   1 P.l·

   OH (XVIII) (XIX) ve kterých symboly Q, X, Y-a Z mají- význam definovaný v nároku 2,

   W* má význam, definovaný v nároku 4, a

   3. představuje elektrofilní nebo nukleofilni zbytek vhodný pro reakci s bioaktivní Látkou.

   v
7. 7. Fenylboroncvá zesíťující činidla obecného vzorce XII (XII) ve kterém symboly Q a Z* mají význam definovaný v nároku 2, a

   W* má význam definovaný v nároku 4.

   3. Použití zesíťujících činidel· na bázi fenylboronových kyselin obecného vzorce XVI nebo XVII

   SUBSTITUTE SHEET ve kterých Z* má význam definovaný v nároku 2, pro biokonjugátových komplexu pc-dle nároku 1 nebo 2.

   :raoravu
8. 9. Biokonjugátová komplexy nebo semikonjugáty podle libovolného z nároků 1 až 4, ve kterých je alespoň jednou bioaktivní látkou orotilátka.
9. 10. Souprava nebo systém pro izolaci požadované populace buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje biokonjugát nebo semikonjugát podle nároku 9.
10. 11. Způsob izolace požadované populace buněk, vyznačující se tím , že se médium obsahující buňky uvede do styku s biokonjugátovým komplexem podle nároku 9, ve kterém protilátka rozpoznává charakteristický epitop požadované populace buněk.a váže se na něj, a buňky se oddělí z média.