【発明の詳細な説明】
フェニルボロン酸錯体
本発明はバイオコンジュゲート製造の分野、更に具体的には、生物学的巨大分
子のコンジュゲーションに有用なフェニルボロン酸錯体のクラスおよびこのよう
な錯体の製造法および使用法に関する。
バイオコンジュゲーションは、分子種の少なくとも一つが生物学的巨大分子で
ある、２個またはそれ以上の異なる分子種を化学的または生物学的手段により結
合させることを意味する記述用語である。これは、タンパク質、ペプチド、ポリ
サッカライド、レクチン、ホルモン、核酸、リポソームおよび細胞をそれぞれ互
いに、または、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、発蛍光団、リガンド等を
含む有用な特性を加える分子種とのコンジュゲーションを含む。生物学的巨大分
子の固定化は、巨大分子を、可逆性であれ不可逆性であれ、不溶性支持体に結合
させる、バイオコンジュゲーションの特別な例と見なされている。バイオコンジ
ュゲーションは、生化学、免疫化学および分子生物学研究で広く使用されている
。バイオコンジュゲーションの適用は多く、親和性クロマトグラフィー、親和性
細胞化学、組織化学、病理学的プローブ検出、診断、信号増幅、免疫検定、ハイ
ブリドーマテクノロジー、ブロットテクノロジー、生物親和性センサー、遺伝子
プローブ検出、架橋剤、親和性ターゲティング、親和性振動、医薬送達、フソジ
ェニック(fusogenic)試薬、固定化試薬、選択的回収、選択的除去、フローサイ
トメトリーおよび細胞学的プローブ検出を含む。バイオコンジュゲートを製造す
るための当分野の状態は、アビジン−ビオチンおよびジゴキシゲニン−抗−ジゴ
キシゲニン系を含む。
フェニルボロン酸が、必須の官能性を有する広範囲の極性分子と相互作用する
ことは既知である。１,２−ジオール、１,３−ジオール、１,２−ヒドロキシ酸
、１,３−ヒドロキシ酸、１,２−ヒドロキシルアミン、１,３−ヒドロキシルア
ミン、１,２−ジケトンおよび１,３−ジケトンを含む変化する安定性の錯体は、
中性フェニルボロン酸またはフェニルボロン酸アニオンで形成することが既知で
ある。固定化フェニルボロン酸は、クロマトグラフィーにおいて、錯体サンプル
か
ら必須の官能性を有する生物学的分子を選択的に維持するように使用できる。炭
水化物、カテコールアミン、プロスタグランジン、リボヌクレオシドおよびステ
ロイドを含む多くの重要な生物学的分子は必須の官能性を有し、従ってこの方法
で単離できる。
フェニルボロン酸は、ホウ酸のようにルイス酸であり、直接脱プロトン化でな
く、水素添加によりイオン化され、四面体フェニルボロン酸アニオン(ｐＫa＝８
.８６)を得る。フェニルボロン酸はホウ酸より３倍強い酸である。フェニルボロ
ン酸のイオン化は錯化に重要な因子であり、それにおいて、イオン化により、ホ
ウ素は三角形の対等関係(平均角度１２０°および平均結合長さ１.３７Å)から
変化し、四面体対等アニオンになる(平均角度１０９°および平均結合長さ１.４
８Å)。ｐＫa値が(３−アミノフェニル)ボロン酸(ｐＫa８.７５)(最も普通に商
業的に入手可能な誘導体)のものより低いフェニルボロン酸を使用するシステム
の開発が、生理学的条件下(ｐＨ７.２)で種々の生物分子の保持を可能にし、そ
れにより本方法による分析に適した化合物の幅を実質的に広げるため、望まれる
。(３−アミノフェニル)ボロン酸より低いｐＫaを有する代表的フェニルボロン
酸は下記のものを含む：
シスまたは共軸１,２−ジオールおよび１,３−ジオール官能性を有する化合物
、および特に炭水化物は、アルカリ水性条件下でのみ固定化フェニルボロン酸ア
ニオンと複合し、環状エステルを形成することが現在知られている。１,２−ジ
オールおよび１,３−ジオール錯体の酸性化は、恐らく環状エステルの加水分解
により、ジオール含有種を放出することが知られ、それは三角形対等ホウ素を含
む５員環ホウ酸エステルに関連する環張力により誘発される。１,８−ジヒドロ
キシナフタレンのような同一平面芳香族１,３−ジオールは、６員環ホウ酸エス
テルの加水分解安定性のために酸性条件下でさえ安定であることが知られている
。ペンダント１,３−ヒドロキシルアミド、１,３−ヒドロキシアミジンおよび１
,３−ヒドロキシオキシム分子を有する置換フェノールは、ホウ酸塩緩衝液と、
アルカリ水性条件下で、フェニルボロン酸が錯化することが知られているのと同
様な方法で可逆的に錯体になる。
バイオコンジュゲーションに関するたくさんの研究および本分野におけるたく
さんの発明にもかかわらず、現在までフェニルボロン酸の選択性は、生物学的巨
大分子を互いにまたは有用な特性を加える他の分子種とコンジュゲーション可能
には開発されていない。更にフェニルボロン酸分子と選択的に錯化できる固定化
錯体分子の使用は新規である。この使用は、例えば、フェニルボロン酸分子が、
錯体分子へフェニルボロン酸分子の選択性を向けることにより錯体分子に結合で
きる、抗体のような生物学的巨大分子と結合している場合、特に興味深い。
本明細書で使用する限り、以下の用語は以下の意味を有する：
生物活性種は、好ましくはタンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、ホルモ
ン、核酸、リポソーム、細胞、医薬、放射性核種、毒素、ハプテン、阻害剤、発
蛍光団、リガンドおよび抗体(例えば特定の細胞集団、例えば特定の造血細胞集
団のエピトープに選択性を有するモノクローナル抗体、特に抗−ＣＤ３４抗体)
を含むが、これらに限定されないものから選択される化合物を意味する。生物活
性種は、下記に定義のように固相支持体であり得る。一般に、生物活性種は、集
合的に、バイオコンジュゲート錯体に生物学的活性または検出能力を付与させる
このような種である。生物活性種が、例えば、求電子または求核反応性分子(例
えば、下記式XI、XII、XIV、XVIまたはXVIIの「Ｒ」に対応)との反応により、本発
明のセミコンジュゲートまたはバイオコンジュゲート錯体(下記式Ｉ−Ｘ、XIII
、XV、XXおよびXXIの「ＢＡＳ」、「ＢＡＳ'」、「ＢＡＳ*」または「ＢＡＳ*'」に対応)
と結合している場合、所望により、上記求電子または求核反応性分子の残基を更
に含み得る。
固相支持体は、下記で定義のフェニルボロン酸錯化試薬またはフェニルボロン
酸試薬との架橋に適した、例えば、単離または精製系または検定系、例えば下記
で定義のバイオコンジュゲート錯体の形の固相支持体と結合したモノクローナル
抗体を使用した系で使用するのに適した、固体、不溶性表面または粒子（下記で
定義のフェニルボロン酸錯化試薬またはフェニルボロン酸錯化試薬との結合を促
進するために、例えば、所望により炭水化物またはタンパク質で被覆されていて
もよい、例えば、金属またはプラスチックビーズ)を意味する。
フェニルボロン酸錯化試薬は、フェニルボロン酸錯化分子およびフェニルボロ
ン酸錯化分子を生物活性種または固相支持体に添加するのに好適な反応性分子を
含む試薬を意味する。
フェニルボロン酸試薬は、フェニルボロン酸およびフェニルボロン酸錯化分子
を生物活性種に添加するのに好適な反応性分子を含む試薬を意味する。
フェニルボロン酸架橋試薬は、スペーサーにより分離された２個のフェニルボ
ロン酸分子を含む試薬を意味する。
フェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートは、生物活性種または固相支持体と
フェニルボロン酸錯化試薬との反応に由来するペンダントフェニルボロン酸錯化
分子を有する生物活性種または固相支持体を意味する。
フェニルボロン酸セミコンジュゲートは、生物活性種とフェニルボロン酸試薬
との反応に由来するペンダンドフェニルボロン酸分子を有する生物活性種を意味
する。
バイオコンジュゲート錯体は、２個の生物活性種(同一または異なり得る)また
は生物活性種と固相支持体の結合を意味し、結合は少なくとも一つのホウ素原子
、例えば少なくとも一つのフェニルボロン酸錯体；例えば、フェニルボロン酸錯
化
セミコンジュゲートとフェニルボロン酸セミコンジュゲートの反応により形成さ
れた産物またはフェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートとフェニルボロン酸架
橋試薬の反応により形成された産物を有する。
一般に、本発明のバイオコンジュゲート錯体は、例えば式Ａ
ＢＡＳ−Ｌ−Ｂc−Ｌ'−(Ｂc'−Ｌ")n−ＢＡＳ' （Ａ）
〔式中、ＢＡＳおよびＢＡＳ'は生物活性種(同一または異なり得る)；Ｌ、Ｌ'お
よびＬ"は架橋剤(同一または異なり得る；例えば、式ＩからＸのＺ、Ｚ'、Ｚ*、
Ｚ*'、ＹおよびＹ*に対応する)；ＢｃおよびＢｃ'は式Ｄ−ＥまたはＥ−Ｄのフ
ェニルボロン酸錯体(同一または異なり得る)であり、ここでＤはフェニルボロン
酸分子(例えば、好ましくはフェニルボロン酸の誘導体または類似体に由来する
もの)およびＥはフェニルボロン酸錯化分子(好ましくはサリチル酸の誘導体また
は類似体に由来するもの)、およびｎは０または１〕
で示される下記の式ＩからＸである。ＢＡＳが固相支持体である場合、好ましく
はＢｃはＥ−Ｄおよび／またはｎ＝１、および／またはＢＡＳ'は抗体である。
本発明は、従って、フェニルボロン酸錯体由来のバイオコンジュゲート錯体の
新規クラスおよびこのようなバイオコンジュゲート錯体の製造法および使用法を
提供する。本発明において、先行技術アビジン−ビオチンおよびジゴキシゲニン
−抗−ジゴキシゲニン系の代わりに、フェニルボロン酸錯体が、中間生物学的巨
大分子の使用なしに、生物活性種の化学的コンジュゲーションを行うために使用
される。ホウ素が、それ自身スペーサー基を経由して生物活性種に結合している
窒素と錯化している、２個の生物活性種を結合させるバイオコンジュゲート錯体
が、例えば式ＩからVIに記載される：
式Ｉで示されるバイオコンジュゲート錯体は、式中、ＱはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−
アルキル、Ｎ−アリールおよびＮＣＨ2−アリール(ここで、アルキルは、例えば
炭素原子１−４個の長さ、例えば６個までの炭素原子の長さであり、鎖は分枝で
あり得る炭化水素分子を意味し、アリールは芳香族環、置換芳香族環および融合
芳香族環から選択される)から選択される；基ＹはＯ、ＮＨ、ＣＨ2、アルキルお
よびアリール(ここで、アルキルは、例えば炭素原子２−６個の長さの炭化水素
分子を意味し、アリールは芳香族環、置換芳香族環および融合芳香族環から選択
される)から選択される；基ＺおよびＺ*(同一または異なり得る)は、炭素原子１
−１６と同等の長さのアルキル鎖およびポリエーテル(例えばポリエチレングリ
コール)鎖(ここで、鎖は、所望により１個またはそれ以上の中間アミドおよび／
またはジスルフィド結合を含み得る)から選択されるスペーサーを含む；および
ＢＡＳおよびＢＡＳ*は同一または異なる生物活性種であるものである。
式Ｉで示されるバイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基ＱがＯ、ＮＨおよ
びＮＣ6Ｈ5から選択される；基ＹがＯおよびＣＨ2から選択される；基Ｚおよび
Ｚ*が独立して(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'
＝２−４)から選択される；および／またはＢＡＳおよびＢＡＳ*は２個の異なっ
た生物活性種、例えばその中の一方が固相支持体および他方が抗体である。
式IIおよびIIIで示されるバイオコンジュゲート錯体は、式中、ＱおよびＱ'は
それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリールおよびＮＣＨ2−
アリール(ここで、アルキルは、例えば炭素原子１−４個の長さ、または６個ま
での炭素原子の長さであり、鎖は分枝であり得る炭化水素分子を意味し、アリー
ルは芳香族環、置換芳香族環および融合芳香族環から選択される)から選択され
る；基ＹおよびＹ'はそれぞれ独立してＯ、ＮＨ、ＣＨ2、アルキルおよびアリー
ル(ここで、アルキルは、例えば炭素原子２−６個の長さの炭化水素分子を意味
し、アリールは芳香族環、置換芳香族環および融合芳香族環から選択される)か
ら選択される；基Ｚ、Ｚ'およびＺ*は、それぞれ炭素原子１−１６と同等の長さ
のアルキル鎖およびポリエーテル(例えばポリエチレングリコール)鎖(ここで、
鎖は、所望により。１個またはそれ以上の中間アミドおよび／またはジスルフィ
ド結合を含み得る)を含むスペーサー；基Ｚ*に２個のフェニルボロン酸分子が結
合している；およびＢＡＳおよびＢＡＳ'は同一または異なる生物活性種である
。好ましくはＢＡＳおよびＢＡＳ'が同一である場合、ＱとＱ'、ＹとＹ'および
ＺとＺ'もまた同一である。
式IIおよびIIIで示されるバイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基Ｑおよ
びＱ'がＯ、ＮＨおよびＮＣ6Ｈ5から選択される；基ＹおよびＹ'がＯおよびＣＨ2
から選択される；基Ｚ、Ｚ'およびＺ*が同一または異なって(ＣＨ2)n(式中、ｎ
＝１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'＝２−４)から選択される；および
／またはＢＡＳ基は同一の生物活性種であるかまたは一方のＢＡＳが固相支持体
であり、他方が固相支持体ではない生物活性種、例えば抗体である。
式IVで示されるバイオコンジュゲート錯体は、式中、基ＸはＨ、ＣＨ3および
Ｃ6Ｈ5から選択される；基ＹはＯ、ＮＨ、ＣＨ2、アルキルおよびアリール(ここ
で、アルキルは、例えば炭素原子２−６個の長さ、または炭素原子６個までの長
さの炭化水素分子を意味し、アリールは芳香族環、置換芳香族環および融合芳香
族環から選択される)から選択される；基ＺおよびＺ*は、同一または異なって、
炭素原子１−１６と同等の長さのアルキル鎖およびポリエーテル(例えばポリエ
チレングリコール)鎖(ここで、鎖は、所望により、１個またはそれ以上の中間ア
ミドおよび／またはジスルフィド結合を含み得る)を含むスペーサー；およびＢ
ＡＳおよびＢＡＳ'は同一または異なる生物活性種である。
式IVで示されるバイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基ＸがＨまたはＣ6
Ｈ5から選択されるがこれらに限定されない；好ましくは基ＹがＯおよびＣＨ2か
ら選択されるがこれらに限定されない；基ＺおよびＺ*が同一または異なって、
好ましくは(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'＝２
−４)から選択されるがこれらに限定されない；および／またはＢＡＳとＢＡＳ*
は異なった生物活性種であり、好ましくは一方が固相支持体であり、他方が固相
支持体ではない生物活性種、例えば抗体であるものである。
式ＶおよびVIで示されるバイオコンジュゲート錯体は、式中、基ＸおよびＸ'
は、独立して、Ｈ、ＣＨ3およびＣ6Ｈ5から選択される；基ＹおよびＹ'は、独立
して、Ｏ、ＮＨ、ＣＨ2、アルキルおよびアリール(ここで、アルキルは、例えば
炭素原子２−６個の長さ、または炭素原子６個までの長さの炭化水素分子を意味
し、アリールは芳香族環、置換芳香族環および融合芳香族環から選択される)か
ら選択される；基Ｚ、Ｚ'およびＺ*は、同一または異なって、炭素原子１−１６
と同等の長さのアルキル鎖およびポリエーテル(例えばポリエチレングリコール)
鎖(ここで、鎖は１個またはそれ以上の中間アミドおよび／またはジスルフィド
結合を含み得る)から選択されるスペーサー；基Ｚ*に２個のフェニルボロン酸分
子が結合している；およびＢＡＳおよびＢＡＳ'は同一または異なる生物活性種
であるものである。好ましくは、ＢＡＳおよびＢＡＳ'が同一である場合、Ｚと
Ｚ'、ＹとＹ'およびＺおよびＺ'もまた同一である。
式ＶおよびVIで示されるハイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基Ｘおよび
Ｘ'が独立してがＨまたはＣ6Ｈ5から選択される；基ＹおよびＹ'が独立してＯお
よびＣＨ2から選択される；基Ｚ、Ｚ'およびＺ*が独立して(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝
１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'＝２−４)から選択される；および／
またはＢＡＳおよびＢＡＳ'は同一かまたは一方が固相支持体であり、他方が固
相支持体ではない生物活性種、例えば抗体であるものである。
本発明のバイオコンジュゲート錯体は、生物活性種の少なくとも一つがフェニ
ルボロン酸錯化分子のベンゼン環に結合している錯体、例えば式VIIからＸのよ
う
なものをまた含む。
式VIIで示されるバイオコンジュゲートは、式中、基ＷはＯ、ＮＨ、Ｎ−アル
キル、ＮＣ6Ｈ5、Ｎ−アリール、ＮＣＨ2−アリール、ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＣ
ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＯＨ、ＮＯ−アルキルおよびＮＯＣＨ2−アリール(ここで
、アルキルは、例えば炭素原子１−４個の長さ、または炭素原子６個までの長さ
の直鎖または分枝鎖であり得る炭化水素分子を意味し、アリールは芳香族環、置
換芳香族環および融合芳香族環から選択される)から選択される；基ＱはＯ、Ｓ
、ＮＨ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリールおよびＮＣＨ2−アリール(式中、アルキル
およびアリールは上記で定義の意味)；基ＺおよびＺ*は、同一または異なって、
炭素原子１−１６と同等の長さのアルキル鎖およびポリエーテル（例えばポリエ
チレングリコール)鎖(ここで、鎖は、所望により、１個またはそれ以上の中間ア
ミドおよび／またはジスルフィド結合を含み得る)から選択されるスペーサーを
含む；およびＢＡＳおよびＢＡＳ*は同一または異なる生物活性種であるもので
ある。
式VIIで示されるバイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基ＷがＯ、ＮＨ、
ＮＣＨ3、ＮＣ6Ｈ5、ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＣＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＯＨおよび
ＮＯＣＨ3から選択される；基ＱがＯ；基ＺおよびＺ*が独立して(ＣＨ2)n(式中
、ｎ＝１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'＝２−４)から選択される；お
よび／またはＢＡＳおよびＢＡＳ*は異なる生物活性種、例えば一方が固相支持
体であり、他方が固相支持体ではない生物活性種、例えば抗体であるものである
。
式VIIIで示されるバイオコンジュゲート錯体は、式中、基ＷはＯ、ＮＨ、Ｎ−
アルキル、ＮＣ6Ｈ5、Ｎ−アリール、ＮＣＨ2−アリール、ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、
ＮＣＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＯＨ、ＮＯ−アルキルおよびＮＯＣＨ2−アリール(こ
こで、アルキルは、例えば炭素原子１−４個の長さ、または６個までの炭素原子
の長さであり、鎖は分枝であり得る炭化水素分子を意味し、アリールは芳香族環
、置換芳香族環および融合芳香族環から選択される)から選択される；基ＱはＯ
、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリールおよびＮＣＨ2−アリール(式中、アル
キルおよびアリールは上記で定義の意味)；基Ｚ、Ｚ*およびＺ*'は、同一または
異なって、炭素原子１−１６と同等の長さのアルキル鎖およびポリエーテル(例
えばポリエチレングリコール)鎖(ここで、鎖は１個またはそれ以上の中間アミド
および／またはジスルフィド結合を含み得る)から選択されるスペーサーを含み
、基Ｚに２個のフェニルボロン酸錯化分子が結合している；およびＢＡＳ*およ
びＢＡＳ*'は同一または異なる生物活性種であるものである。
式VIIIで示されるハイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基ＷがＯ、ＮＨ、
ＮＣＨ3、ＮＣ6Ｈ5、ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＣＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＯＨおよび
ＮＯＣＨ3から選択される；基Ｑが好ましくはＯ；基Ｚ、Ｚ*およびＺ*'が、同一
または異なって好ましくは、(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n
,(式中、ｎ'＝２−４)から選択される；および／またはＢＡＳ*およびＢＡＳ*'
は同一か、または一方が固相支持体であり、他方が固相支持体ではない生物活性
種、例えば抗体であるものである。
式IXおよびＸで示されるバイオコンジュゲート錯体は、式中、基ＷおよびＷ'
はＯ、ＮＨ、Ｎ−アルキル、ＮＣ6Ｈ5、Ｎ−アリール、ＮＣＨ2−アリール、Ｎ
ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＣＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＯＨ、ＮＯ−アルキルおよびＮＯＣ
Ｈ2−アリール(ここで、アルキルは、例えば、炭素原子１−４個の長さ、例えば
、６個までの炭素原子の長さであり、鎖は分枝であり得る炭化水素分子を意味し
、アリールは芳香族環、置換芳香族環および融合芳香族環から選択される)から
選択される；基ＱおよびＱ'はＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリールおよ
びＮＣＨ2−アリール(式中、アルキルおよびアリールは上記で定義の意味)；基
Ｚ、Ｚ'およびＺ*は、独立して、炭素原子１−１６と同等の長さのアルキル鎖お
よびポリエーテル(例えばポリエチレングリコール)鎖(ここで、鎖は１個または
それ以上の中間アミドおよび／またはジスルフィド結合を含み得る)から選択さ
れるスペーサーであり、基Ｚ*に２個のフェニルボロン酸錯化分子が結合してい
る；およびＢＡＳおよびＢＡＳ'は同一または異なる生物活性種であるものであ
る。ＢＡＳおよびＢＡＳ'が同一である場合、好ましくはＷとＷ'、ＱとＱ'およ
びＺ
とＺ'も同一である。
式IXおよびＸで示されるバイオコンジュゲート錯体は、好ましくは基Ｗおよび
Ｗ'が独立してＯ、ＮＨ、ＮＣＨ3、ＮＣ6Ｈ5、ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＣＯＣＨ2
ＣＨ2ＯＨ、ＮＯＨおよびＮＯＣＨ3から選択される；基Ｑが好ましくはＯ；基Ｚ
、Ｚ'およびＺ*が、同一または異なって好ましくは、(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝１−
５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'＝２−４)から選択される；および／また
はＢＡＳおよびＢＡＳ'は同一生物活性種か、または一方が固相支持体であり、
他方が固相支持体ではない生物活性種、例えば抗体であるものである。
式Ｉ、IVおよびVIIのように一個のフェニルボロン酸錯体を有するバイオコン
ジュゲート錯体は、好ましくは、２個の異なる生物活性種をコンジュゲートする
ために、例えばELISA検定で使用するために酵素と抗体をコンジュゲートするた
めに、ゲノム配列の容易な検出のために核酸プローブを発蛍光団とコンジュゲー
トするために、標的医薬送達に使用するために毒素とモノクローナル抗体をコン
ジュゲートするために、使用する。例えば、このようなバイオコンジュゲート錯
体は、例えば、抗体がＢＡＳおよび固体表面がＢＡＳ*である場合、または抗体
がＢＡＳ*および固体表面がＢＡＳである場合、抗体(例えば造血細胞集団のエピ
トープに選択性を有するモノクローナル抗体、例えば、抗−ＣＤ３４抗体)を固
相(例えば、炭水化物またはタンパク質などの有機物質で被覆されていてもよい
、金属またはプラスチックビーズ)にコンジュゲートするために使用し得る。
例えば、式II、III、Ｖ、VI、VIII、IXおよびＸのように２個のフェニルボロ
ン酸錯体を有するバイオコンジュゲート錯体は、好ましくは、ペンダンドフェニ
ルボロン酸またはフェニルボロン酸錯化分子を有する生物活性種を交差架橋する
ことにより、同一の生物活性種をコンジュゲートし、巨大分子凝集体にするのに
使用する。酵素を含むこのタイプの凝集体は、無色物質を検出可能生産物に変換
できる酵素の有効な濃度を実質的に増加させることにより、ELISAおよび関連検
出の検出限界を増加させるために有用である。同様に、ペンダントフェニルボロ
ン酸錯体分子を有する発蛍光団標識タンパク質は、この方法で凝集し得、その可
視または分光光度検出を改善する。過剰のペンダントフェニルボロン酸分子を有
する
凝集体は、更に他のフェニルボロン酸錯化分子を有する生物活性種（フェニルボ
ロン酸錯化セミコンジュゲート)をコンジュゲートし得る。この一般的な研究は
、アビジン−ビオチン系を含むサンドイッチタイプ検定の製造と同様である。
フェニルボロン酸架橋試薬は、大過剰および続く過剰の試薬の除去により、ペ
ンダントフェニルボロン酸錯化分子を有する生物活性種(フェニルボロン酸錯化
セミコンジュゲート)を、ペンダンドフェニルボロン酸分子を有する生物活性種(
フェニルボロン酸セミコンジュゲート)に変換するために、およびその逆に使用
し得る。
通常、生物活性種をフェニルボロン酸分子に結合させるスペーサー分子(例え
ば、式Ｉ、VIIまたはVIIIのＺ*またはＺ*'または下記式XIVまたはXVのＺ*)が存
在する。しかしながら、ある場合、生物活性種は、式XIVの求電子または求核分
子(Ｒ)により、直接、スペーサーを必要とせず、フェニルとの結合が可能である
構造を有し得る。従って、本発明は、更に、Ｚ*またはＺ*'が存在しない式Ｉ、V
II、VIII、XIVまたはXVの化合物に関し、それを包含する。
式ＩからＸで示されるバイオコンジュゲート錯体は、緩衝化水性溶液、有機溶
媒および有機溶媒含有水性溶液中で製造する。錯体は、室温で数分以内に形成す
る。バイオコンジュゲート錯体の製造は、イオン強度、温度およびカオトロピッ
ク試薬(タンパク質変性物)の存在の明白な変化に非感受性であり、生物学的巨大
分子の構造が必要な結合特性を保持するために維持されなければならない、先行
技術システムと相いれない。ほとんどの場合、本明細書に記載のシステムにより
、バイオコンジュゲートの形を支配する束縛は、好適なｐＨの選択により限定さ
れ、更なるいかなる限定も、生物活性種の能力を維持するために必要な条件によ
り課せられら。
本発明は、ペンダントフェニルボロン酸分子を有する異なった生物活性種に続
いてコンジュゲートさせるために、例えば、式VII、VIII、IXまたはＸのバイオ
コンジュゲート製造において、フェニルボロン酸錯化分子を包含させる目的で生
物活性種を修飾するのに好適な試薬を更に提供する：
式中、基Ｗ、Ｑ、ＺおよびＺ*は式VII、VIII、IXまたはＸで定義の意味；好ま
しくはＷはＨ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、ＮＨＯＨおよびＮＨＯＣＨ3から選択
される；基ＱはＯ、ＳおよびＮＨから選択される；および／またはＺおよびＺ*
は、１から１６個の炭素原子と同等な長さであり、中間アミドおよびジスルフィ
ド結合を含み得る、アルキルおよびポリエチレングリコール鎖から独立して選択
されるスペーサーである。式XIの基Ｒは、フェニルボロン酸錯化試薬と生物活性
種の反応に好適な反応性求電子または求核分子である。
式XIおよびXIIは、好ましくは基ＷはＯＨ、ＮＨＯＨおよびＮＨＯＣＨ3から選
択され、および／または基ＱがＯであるものである。基ＺおよびＺ*は好ましく
は(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝１−５)および(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n,(式中、ｎ'＝２−４)か
ら選択されるものである。
式XIで示される試薬は、好ましくは基Ｒがアミノ、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミジルエステル
、イソチオシアネート、ブロモアセトアミド、ヨウドアセトアミド、マレイミド
お
よびチオール分子から選択されるが、これらに限定されない。一般式XIの試薬の
生物活性種との反応は、記号ＢＡＳは生物活性種、基Ｗ、ＱおよびＺは先に式VI
Iで定義したものである、式XIIIで示されるペンダントフェニルボロン酸錯化分
子(１個またはそれ以上)を有するセミコンジュゲートを提供する：
同様に、フェニルボロン酸試薬[例えば、式XIV：
式中、Ｚ*は式Ｉ、IV、VIIまたはVIIIで定義のスペーサーおよびＲは式XIで定
義の反応性求電子または求核分子]が生物活性種と結合し、式XVのペンダントフ
ェニルボロン酸分子(一個またはそれ以上)を有するセミコンジュゲートを提供す
る
式中、記号ＢＡＳ*は、例えば、ＢＡＳで示される生物活性種と同一または異
なる生物活性種を意味し、基Ｚ*は式VIIで定義のものである。
我々は、式XVで示されるセミコンジュゲートおよび他の本明細書に記載のフェ
ニルボロン酸試薬およびセミコンジュゲートが、アルカリ条件下で四面体フェニ
ルボロン酸アニオンを含むか、または中性または酸性条件下で三面体フェニルボ
ロン酸を含み、例えば
および両方の形が本発明に含まれるべきであることをここに記載する。
式XVI：
式中、Ｚ*は式II、ＶまたはIXで定義の架橋剤；または式XVII
式中、Ｚ*は式III、VIまたはＸで定義の架橋剤
のフェニルボロン酸架橋試薬もまた提供される。
生物活性種ＢＡＳから製造され、ペンダントフェニルボロン酸錯化分子を有す
る式XIIIのセミコンジュゲートは、第２の生物活性種ＢＡＳ*から製造され、ペ
ンダントフェニルボロン酸分子を有する式XVのセミコンジュゲートと錯体形成し
得、式VIIのバイオコンジュゲートを提供する。本方法において、生物学的巨大
分子は、他のものとコンジュゲートし得、または有用な特性を付与する他の官能
基とコンジュゲートし得る。
同様に、式XIIの試薬は、生物活性種ＢＡＳ*から製造された式XIVのセミコン
ジュゲートと錯体形成し得、式VIIIのバイオコンジュゲートを提供する。この方
法において、２個またはそれ以上の同一の生物活性種ＢＡＳ*が、他のものとコ
ンジュゲートし得る。この方法は、ELISAにおける高感受性検出に有用な酵素凝
集体の製造を開発し得る。
バイオコンジュゲートは、緩衝化水性または水性／有機溶液中で製造される。
バイオコンジュゲートは室温で数分以内に形成される。あるｐＨでのあるバイオ
コンジュゲートの安定性は、置換基ＷおよびＱにより決定される。式VIIおよびV
III(式中、ＷおよびＱの両方の基はＯ)は、ｐＨ約４.５以下の水性溶液で安定で
ある。式VIIおよびVIII(式中、基ＷはＮＨおよびＮＣＨ3から選択され、基Ｑは
ＯおよびＳから選択される)は、ｐＨ約８.５−１１.５の範囲の緩衝化アルカリ
水性溶液中で安定である。同様に、式VIIおよびVIII(式中、基ＷおよびＱの両方
がＮＨ)は、ｐＨ約８.５−１１.５の範囲の緩衝化アルカリ水性溶液中で安定で
ある。式VIIおよびVIII(式中、基ＷがＮＯＨおよびＮＯＣＨ3から選択され、基
ＱがＯおよびＳから選択される)のバイオコンジュゲートは、ｐＨ約２.５−１１
.５の広い範囲の緩衝化水性溶液中で安定である。
バイオコンジュゲーション反応(フェニルボロン酸錯化)は、イオン強度、温度
、有機溶媒の存在およびカオトロピック試薬(タンパク質変性物)の明白な変化に
非感受性であり、生物学的巨大分子の構造が必要な結合特性を保持するために維
持されなければならない、先行技術システムと相いれない。ほとんどの場合、本
明細書に記載のシステムにより、バイオコンジュゲートの形を支配する束縛は、
好適なｐＨの選択により限定され、更なるいかなる限定も、生物活性種の能力を
維持するために必要な条件により課せられる。
更なる態様において、本発明は、例えば、式Ｉ、II、III、IV、ＶまたはVIの
バイオコンジュゲート錯体の製造において、フェニルボロン酸錯化分子を包含さ
せる目的で生物活性種を修飾するのに好適な試薬、例えば、一般式XVIIIまたは
式XIXから選択される試薬である、フェニルボロン酸試薬を更に提供する：
式XVIIIにおいて、Ｘ、ＹおよびＺは式IV、ＶまたはIVで定義の意味。式XVIII
の好ましい試薬は、ＸがＨ、ＣＨ3およびＣ6Ｈ5から選択されるものおよび／ま
たはＹがＯおよびＣＨ2から選択されるものである。式XIXにおいて、Ｑ、Ｙおよ
びＺは式Ｉ、IIまたはIIIで定義の意味である。式XIXの好ましい試薬は、ＹがＯ
およびＣＨ2から選択され、および／またはＱがＯであるるものである。式XVIII
およびXIXの両方において、基Ｒはフェニルボロン酸錯化試薬と生物活性種の反
応に好適な反応性求電子または求核分子である。
一般式XVIIIの試薬は、最も好ましくは、基ＸがＨおよびＣＨ3から選択され、
基ＹがＯであるものである。一般式XVIは、好ましくは基ＹがＯである。式XVIII
およびXIXの両方において、基Ｚは好ましくは、炭素原子１−１６と同等な長さ
、好ましくは炭素原子２−１２と同等な長さであり、中間アミドおよび／または
ジスルフィド官能基を含み得、好ましくは(ＣＨ2)n(式中、ｎ＝２−６)および(
ＣＨ2Ｃ
Ｈ2Ｏ)n(式中、ｎ＝２−４)であるアルキル鎖またはポリエーテル(例えばポリエ
チレングリコール)鎖から選択されるものである。式XVIIIおよびXIXの両方にお
いて、基Ｒは好ましくはヒドラジド、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミジルエステル、イミ
デートエステル、２,２,２−トリ−フルオロエタンスルホニル、ブロモアセトア
ミド、ヨウドアセトアミド、マレイミドおよび２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホロアミデートエステル分子から選択されるがこれらに限定され
ない。
式XVIIIまたはXIXの試薬は、生物活性種ＢＡＳ(またはＢＡＳ*)と反応し、対
応する式XXおよびXXIのセミコンジュゲートをそれぞれ形成する：
式中、Ｘ、ＹおよびＺは式XVIIIで定義の意味
式中、Ｙ、ＺおよびＱは式XIXで定義の意味。
従って、本発明は：
１．例えば、式ＩからＸで先に定義したようなバイオコンジュゲート錯体；
２．例えば、式XIII、XXおよびXXIで先に定義したようなフェニルボロン酸錯化
セミコンジュゲート；
３．式XVで先に定義したようなフェニルボロン酸セミコンジュゲート；
４．例えば、式XI，XVIII、XIXで先に定義したようなフェニルボロン酸錯化試薬
；
５．例えば、式XIVで先に定義したようなフェニルボロン酸試薬；
６．例えば、式VII、XVIおよびXVIIで先に定義したようなフェニルボロン酸架橋
試薬;を提供する。
本発明は、更に、先に列記した前記化合物のバイオコンジュゲーション、特に
抗体基本検定または精製系のための使用；および前記セミコンジュゲート、架橋
剤および試薬(例えば、式XIからXXI)のバイオコンジュゲート錯体(例えば、式Ｉ
からＸ)の製造における使用を提供する。
具体的態様において、本発明は、第一および第二生物活性種に結合し、第一生
物活性種が固体支持体、例えば金属またはプラスチックビーズ(本発明の試薬と
の反応および結合を促進するために、例えば、式XI、XIV、XVIIIまたはXIXのＲ
において、炭水化物、タンパク質または他の有機材料で被覆されていてもよい)
であり、第二生物活性種が抗体、例えば特定の細胞集団、例えばＣＤ３４+細胞
に存在するエピトープを認識し結合できる抗体である、(式ＩからＸの)バイオコ
ンジュゲート錯体を含む、細胞、例えば造血細胞、例えばＣＤ３４+細胞の単離
または精製のためのキットまたはシステムを提供する；および更に所望の細胞を
含む媒体を、所望の細胞集団に選択的な記載したような第二生物活性種を有する
このような本発明のバイオコンジュゲート錯体と接触させ、このように媒体から
選択した細胞を分離し、所望により選択細胞をバイオコンジュゲート錯体から分
離する工程を含む、記載のような細胞を単離または精製する方法を提供する。
式Ｉ、IVまたはVIIのバイオコンジュゲート錯体は：
(１)好ましくはサリチル酸、アミノサリチル酸またはジチオサリチル酸由来の、
例えば式XI、XVIIIまたはXIXのフェニルボロン酸錯化試薬を、生物活性種と縮合
し、フェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートを製造する；
(２)例えば、式XIVの、好ましくは(３−アミノフェニル)ボロン酸および(４−カ
ルボキシ−フェニル)ボロン酸から選択されるが、これらに限定されない化合物
由来のフェニルボロン酸試薬を生物活性種と縮合し、フェニルボロン酸セミコン
ジュゲートを製造する；
(３)上記(１)のように製造したフェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートおよび
上記(２)に記載のように製造したフェニルボロン酸セミコンジュゲートを互いに
反応させ、式Ｉ、IVまたはVIIのバイオコンジュゲート錯体を提供する
である３工程により製造する。
式II、ＶまたはIXのバイオコンジュゲート錯体は：
(１)式XI、XVIIIまたはXIXのフェニルボロン酸錯化試薬を、生物活性種と縮合し
、フェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートを製造する；
(２)上記(１)のように製造したフェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートを、例
えば式XVIの、好ましくは(３−アミノフェニル)ボロン酸由来のフェニルボロン
酸架橋剤と反応させる
である２工程により製造する。
式III、VIまたはＸのバイオコンジュゲート錯体は：
(１)式XI、XVIIIまたはXIXのフェニルボロン酸錯化試薬を生物活性種と反応させ
、フェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートを製造する；
(２)上記(１)のように製造したフェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートを、例
えば式XVIIの、好ましくは(４−カルボキシフェニル)ボロン酸由来のフェニルボ
ロン酸架橋剤と反応させ、所望の錯体を提供する
である２工程により製造する。
式VIIIのバイオコンジュゲート錯体は：
(１)式XIVのフェニルボロン酸試薬を生物活性種と反応させ、式XVのセミコンジ
ュゲートを製造する；
(２)式XVのセミコンジュゲートを、例えば式VIIの、好ましくはサリチル酸、ア
ミノサリチル酸またはジチオサリチル酸由来のフェニルボロン酸架橋剤と反応さ
せ、所望の錯体を提供する
である２工程により製造する。
式XIVの試薬は、フェニルボロン酸誘導体および類似体、例えば好ましくは、
商業的に入手可能であるか、または、例えば、Linder, K.E., Wen, M.D., Nownt
nik, D.P., Malley, M.F., Gougoutas, J.Z., Nunn, A.D.およびEckelman, W.C.
(1991)Bioconjugate Chem., 2, 160-170およびLinder, K.E., Wen, M.D., Nowot
ni
k, D.P., Ramalingam, K., Sharkey, R.M., Yost, F., Narra, R.K., Nunn,. A.
D.およびEckelman, W.C.(1991)Bioconjugate Chem., 2, 407-415により記載の方
法により、または同様に製造できる、(３−アミノフェニル)ボロン酸、(４−カ
ルボキシフェニル)ボロン酸、およびＮ−(６−ニトロ−３−ジヒドロキシボリル
フェニル)サクシンアミド酸、(３−イソチオシアナートフェニル)ボロン酸、(５
−カルボキシ−３−イソチオシアナートフェニル)ボロン酸、(３−ヨウドアセト
アミドフェニル)ボロン酸、(３−マレイミドフェニル)ボロン酸、(３−ジヒドロ
キシボリルフェニル)サクシンアミド酸サクシンイミジルエステルおよび(３−ジ
ヒドロキシボリルフェニル)サクシンイミド酸ヒドラジドから選択され、また、
これらに限定されない化合物に由来する。
式XVIのフェニルボロン酸試薬は、Burnett，T.J.，Peebles，H.C.およびHagem
an，J.H.(1980)Biochem.Biophys.Research Commun.，96，157-162に記載の方法
と同様に、(３−アミノフェニル)ボロン酸と活性化ジカルボン酸、好ましくは塩
化サクシニル、塩化アジポイル、アジピン酸ジイソブチルカルボネート、塩化ス
ベロイル、塩化３,３'−ジチオプロピオニルおよび塩化３,６,９−トリオキサウ
ンデカンジオイルおよび３,６,９−トリオキシウンデカンジオン酸ジイソブチル
カルボネートから選択され、またはこれらに限定されない化合物との縮合により
製造する。
式XVIIのフェニルボロン酸試薬は、Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
による(４−カルボキシフェニル)ボロン酸の活性化、続いて、好ましくは１,４
−ブタンジアミン、１,６−ヘキサンジアミンおよび２,２'−ジチオジアミノエ
タン(Ｈ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＳＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2)から選択されるジアミンと縮合する
ことにより製造する。
バイオコンジュゲート錯体は、好ましくは酢酸、クエン酸、リン酸および炭酸
緩衝液から選択されるがこれらに限定されない緩衝化水性溶液中で製造する。ホ
ウ酸塩およびトリス緩衝液は、それぞれフェニルボロン酸錯化分子およびフェニ
ルボロン酸分子への錯化の可能性のため、避けるべきである。バイオコンジュゲ
ート錯体は、室温で１−１５分以内に形成される。反応は、０.０１−２モルの
範囲で非感受性である。錯体の安定性は温度の上昇により増加し、緩衝液の揮発
性によってのみ限定される。アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプ
ロパノール、ブタノール、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルフ
オキシドを含む有機溶媒の添加は、更にバイオコンジュゲートを安定化するのに
働く。尿素、グアニジンヒドロクロリドおよびホルムアミドを含むカオトロピッ
ク試薬(タンパク質変性物)も、生物活性種がそれらの存在に耐性であれば、また
バイオコンジュゲートを更に安定化するのに働く。バイオコンジュゲート錯体は
、脱塩、透析、サイズ排除クロマトグラフィーおよび電気泳動により精製し得る
。バイオコンジュゲート錯体は、水の除去に安定であり、貯蔵のために凍結乾燥
できる。
フェニルボロン酸のイオン化は、バイオコンジュゲート錯体形成において重要
な因子であり、すなわちイオン化ホウ素は、その三角形の対等関係(平均角度１
２０°および平均結合長さ１.３７Å)から変化し、四面体対等アニオンになる(
平均角度１０９°および平均結合長さ１.４８Å)。フェニルボロン酸は、ｐＫa
値が約５.２−９.２の範囲で変化する。４−(カルボキシフェニル)ボロン酸由来
の一般式Ｉ、II、IV、VI、VIIおよびＸのバイオコンジュゲート錯体は、約６.５
−７.５の範囲のｐＫaを有する。(３−アミノフェニル)ボロン酸由来の一般式Ｉ
、III、IV、VI、VII、VIIIおよびＸのバイオコンジュゲート錯体は、約８.０−
９.０の範囲のｐＫa値を有する。(３−アミノ−２−ニトロフェニル)ボロン酸、
(３−アミノ−５−ニトロフェニル)ボロン酸または(３−アミノ−６−ニトロフ
ェニル)ボロン酸由来の式Ｉ、II、IV、Ｖ、VIIおよびIXの錯体は、中間ｐＫa値
を有する。概して、一般式ＩからＸの錯体のｐＫaは、錯体が製造されるフェニ
ルボロン酸よりも約１ｐＨ単位低い。
フェニルボロン酸分子が(３−アミノフェニル)ボロン酸由来である、式Ｉ、II
およびIII(例えば、式中、ＱおよびＱ'は好ましくはＯ、ＳおよびＮＨから選択
される；および／またはＹおよびＹ'は好ましくはＯおよびＮＨから選択される)
のバイオコンジュゲート錯体は、ｐＨ約８.５−１１.５の範囲の緩衝化アルカリ
水性溶液中で安定である。同様に、フェニルボロン酸分子が(３−アミノフェニ
ル)
ボロン酸由来である、一般式IV、ＶおよびVI(例えば、式中、基ＸとＸ'は好まし
くはＨ、ＣＨ2およびＣ6Ｈ5から選択される、および／または基ＹとＹ'は好まし
くはＯおよびＮＨから選択される)は、ｐＨ約８.５−１１.５の範囲の緩衝化ア
ルカリ水性溶液中で安定である。この範囲のｐＨ安定性は、フェニルボロン酸ア
ニオンのみが安定な錯体になるという必要性に由来する。それにもかかわらず、
ｐＨ１１.５以上で、塩基触媒加水分解のため、錯体は不安定である。アルカリ
条件下でのみ安定に存在するバイオコンジュゲート錯体は、可逆的コンジュゲー
ションに有用であり、それによりバイオコンジュゲート錯体は好適なｐＨの調節
により分離し得る。
フェニルボロン酸分子が(３−アミノ−フェニル)ボロン酸および(４−カルボ
キシフェニル)ボロン酸に由来する、式Ｉ、IIおよびIII(例えば、式中、Ｑ、Ｑ'
、ＹおよびＹ'は好ましくはＯである)のバイオコンジュゲート錯体は、錯体がｐ
Ｈ範囲約２.５−１１.５の広い範囲で安定な特別の例を作る。この広い範囲のｐ
Ｈ安定性は、２−ヒドロキシベンゾヒドロキサン酸分子由来のエノールに関連す
る共平面１,３−ジオール錯化分子の存在に由来するものであると考えられる。
あるいは、ｐＨ安定性は、ホウ素原子の外部電子殻を充填する与格結合を形成す
るヒドロキサン酸アニオン(ＣＯＮ−ＯＨ)とフェニルボロン酸の反応由来の錯体
のフェニルボロン酸の低作用ｐＫaに由来し得る。このタイプのバイオコンジュ
ゲート錯体は、１１.５以上のｐＨまたは２.５以下のｐＨに調節することにより
のみ、またはホウ酸塩緩衝液との競合分離によりのみ分離し得るため、本質的に
は不可逆的方法で形成される。
生物活性種がタンパク質であるフェニルボロン酸錯化セミコンジュゲートは、
タンパク質当たりに包含されているペンダントフェニルボロン酸錯化分子の数(
置換度)に関して特徴付され得る。セミコンジュゲートは、好適なｐＨの緩衝化
水性溶液中の過剰の蛍光フェニルボロン酸試薬と処理し得、先に定義した式Ｉ、
IVまたはVII(ＢＡＳ*は蛍光分子)のバイオコンジュゲート錯体を提供する。同様
に、フェニルボロン酸セミコンジュゲートは、好適なｐＨの緩衝化水性溶液中で
、過剰の蛍光フェニルボロン酸錯化試薬との反応により特徴付され得、式Ｉ、IV
また
はVII(式中、ＢＡＳ*は蛍光分子)のバイオコンジュゲート錯体を提供する。
好適な蛍光分子は、好ましくは、フルオレッセイン、ローダミンＸ、テトラメ
チルローダミン、テキサス・レッド、フィコエリスリンおよびアロヒコシアニン
から選択されるが、これらに限定されない。脱塩、透析またはサイズ排除クロマ
トグラフィーにより過剰の試薬を除去した後、バイオコンジュゲート錯体を分光
光度分析に付し、フェニルボロン酸錯化分子またはフェニルボロン酸分子の数を
、全タンパク質濃度を意味する２８０nmの吸収比率を、発蛍光団(Ｉmax)に特徴
的な波長の吸収と比較することにより計算した。脱塩、透析またはサイズ排除ク
ロマトグラフィーによる精製に適した他の高分子量生物活性種由来のセミコンジ
ュゲートは、同様の方法により特徴付し得る。実施例Ｉ：
式XIVのアミン反応性試薬の製造
Ｎ−(３−ジヒドロキシボリルフェニル)サクシンアミド酸、サクシンイミジルエ
ステル
コハク酸無水物(５.００グラム、０.０５モル)および(３−アミノフェニル)ボ
ロン酸(７.７５グラム、０.０５モル)を無水ピリジン(４０ml)に溶解し、次いで
一晩室温に放置する。水(２０ml)を添加し、得られる溶液を１時間放置する。次
いで、生産物を回転エバポレーターで８５−９０℃で濃縮する。得られる水性溶
液をドライアイスアセトンスラリー中で凍結させ、一晩凍結乾燥する。凍結乾燥
生産物を水(５０ml)に溶解し、濃縮ＨＣｌでｐＨ約１.０まで酸性化する。酸性
化溶液を氷浴で冷却し、沈殿を濾過により回収する。沈殿を沸騰水(２００ml)か
ら再結晶し、一晩真空でＮａＯＨペレットで乾燥させ、Ｎ−(３−ジヒドロキシ
ボリルフェニル)サクシンアミド酸８.６０ｇ(収率７０％)を得る。ＴＬＣ(ＣＨ
Ｃｌ3／ＣＨ3ＯＨ／ＣＨ3ＣＯＯＨ；６０：３５：５)による均質性、Ｒｆ＝０.
５。融点１８６−１８８℃。構造は、ｄ6−ＤＭＳＯ中の３００ＭＨｚ、1Ｈ Ｎ
ＭＲで確認した。
Ｎ−(３−ジヒドロキシボリルフェニル)コハク酸(１６.０グラム、０.０６３
モル)を乾燥ＤＭＦ(８０ml)に溶解する。この溶液に、Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシル
カルボジイミド(１４.３グラム、０.０６９モル)、続いてＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミド(８.０５グラム、０.０７０モル)を添加する。反応物を一晩室温で撹拌
する。Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルウレアを溶液から濾取し、濾液を酢酸エチル(２
００ml)で抽出する。抽出物を水(３×４００ml)および飽和ＮａＣｌ(４００ml)
で洗浄する。水洗浄物を酢酸エチル(２００ml)で逆抽出し、抽出物を合わせ、無
水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、回転エバポレーターで濃縮してＮ−(３−ジヒドロキ
シボリルフェニル)サクシンアミド酸、サクシンイミジルエステル１２.５グラム
(収率５７％)を得る。純度はＴＬＣ(ＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ／ＣＨ3ＣＯＯＨ；８
５：１０：５)、Ｒｆ＝０.７により９８％と推測される。構造は、ｄ6−ＤＭＳ
Ｏ中の３００ＭＨｚ、1Ｈ ＮＭＲで確認した。実施例II：
一般式XIVのアミン反応性試薬の適用
タンパク質は、式XIVのアミン反応性フェニル試薬により、リジン残基の側鎖
ε−アミノ基の反応により修飾し得、安定なアミド結合によりタンパク質と共有
結合しているペンダントフェニルボロン酸分子を有するセミコンジュゲートを得
る。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルフオキシドが選択される
溶媒である。ｐＨ範囲７.８−８.８で、好ましくは１００mＭ炭酸水素緩衝液、
ｐＨ８.２である緩和なアルカリ水性緩衝液が、アミノ基が非保護であることを
確実にするが、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステルの加水分解を最小にす
るように使用する。活性化Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステルは、アルカ
リ水性溶液中でフェニルボロン酸と相互作用し、その反応性の著しい減少を齎す
ことが観察されている。この制限を撃ち破るために、Ｎ−(３−ジヒドロキシボ
リルフェニル)サクシンアミド酸、サクシンイミジルエステルを含む水性反応は
、少なくとも１０倍モル過剰のフェニルボロン酸錯体配位子の存在下でのみ行わ
なければならない。この点に関して有用であることが判明している化合物は、マ
ンニトールおよびカテコールを含む。この目的に一時的に好ましいフェニルボロ
ン酸錯体は、本溶液の中和により容易に分離する。トリスおよびグリシンを含む
第１級アミン含有緩衝液は、その可能性のある反応性のため、避けなければなら
ない。ブロッティングメンブランおよびマイクロタイタープレートを含む、ペン
ダント第１級アミン分子を有する固相支持体は、式XIVのフェニルボロン酸試薬
との反応により官能化し得、ペンダントフェニルボロン酸分子を有する固相支持
体を得る。実施例III：
一般式XIVのチオール反応性試薬の製造
(３−マレイミドフェニル)ボロン酸
酢酸エチル(４００ml)を氷浴で約０℃に冷却する。マレイミド(７.７６グラム
)続いてＮ−エチルモルホリン(１０.１９ml)を撹拌しながらこの冷却溶媒に加え
る。メチルクロロホルメート(６.２６ml)を、温度を３℃以下に維持するために
好適な速度で付加漏斗から滴下する。添加が完了した後、反応物を更に３０分、
温度を３℃以下に維持したまま撹拌する。得られる混合物をブッフナー漏斗で濾
過し、沈殿を少量の酢酸エチルで洗浄する。濾液および洗浄液を集め、次いで氷
冷水(１００ml)で洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、次いで回転エバ
ポレーターで濃縮する。この生産物を、６０℃の水浴中、酢酸エチルおよびイソ
プロピルエーテル(４０：６０v/v、７５ml)に溶解し、次いで室温で再結晶させ
る。Ｎ−メトキシカルボニルマレイミドの結晶をイソプロピルエーテル(２×２
０ml)で洗浄し、次いで一晩真空で乾燥する。
(３−アミノフェニル)ボロン酸(１.２６グラム、０.０１モル)を、混合物をホ
ットプレートで短時間過熱することにより飽和ＮａＨＣＯ3(５０ml)に溶解する
。溶液を氷浴で約０℃まで冷却し、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド(１.５５
グラム、０.０１モル)を激しく撹拌しながら添加する。１０分後、溶液を水(２
００ml)で希釈し、室温で３０−４０分撹拌する。ｐＨを、１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を添
加することにより約５.５に調節し、沈殿を濾過により回収する。沈殿物を１Ｍ
Ｈ2ＳＯ4(２×５０ml)で洗浄し、次いで一晩真空でＮａＯＨペレット上で乾燥
させ、(３−マレイミドフェニル)ボロン酸１.３９グラム(収率６４％)を得る。
構造は、ｄ6−ＤＭＳＯ中の３００ＭＨz、1Ｈ ＮＭＲで確認した。実施例IV：
一般式XIVのチオール反応性試薬の適用
ジスルフィド結合(シスチン残基)またはシステイン残基を含むタンパク質を式
XIVのチオール反応性フェニルボロン酸試薬で修飾し得る。ジスルフィド結合は
、必要であれば、最初、アルカリ水性緩衝液中、２−メルカプトエタノールまた
はジチオスレイトールとの反応により還元する。過剰の還元剤を透析または脱塩
により除去し、２５−１００mＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７.０−７.５中の(３−マ
レイミドフェニル)ボロン酸と、１時間４℃で反応させ、タンパク質と共有結合
しているペンダントフェニルボロン酸分子を有するセミコンジュゲートを得る。
チオール分子を欠くタンパク質は、チオール化試薬との反応により官能性にし得
、次いで上記のように修飾し得る。この目的に有用であることが証明されている
チオール化試薬は、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル３−(２−ピリジルジチオ)
プロピオネート、Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテー
トおよび２−イミノチオランを含む。実施例Ｖ：
一般式XIVのアルデヒド反応性試薬の製造
Ｎ−(３−ジヒドロキシボリルフェニル)サクシンアミド酸ヒドラジド
メタノール(１０ml)を約０℃に氷浴で冷却し、チオニルクロリド(１ml)をゆっ
くり加える。得られる撹拌した溶液に、実施例Ｉのように製造したＮ−(３−ジ
ヒドロキシボリルフェニル)サクシンアミド酸(１.２５グラム、０.００５モル)
を加え、反応物を一晩室温で撹拌する。溶液を回転エバポレーターで濃縮し、白
色結晶物質を得、それを２回メタノール(２×１０ml)で共蒸発させ、残っている
チオニルクロリドを除去する。生産物をメタノール(５ml)に溶解し、ヒドラジン
ハイドレート(１ml)を添加する。得られる溶液を一晩室温で撹拌する。沈殿が数
時間以内に形成される。沈殿を濾過して回収し、冷メタノールで洗浄し、真空で
ＮａＯＨペレット上で乾燥してＮ−(３−ジヒドロキシボリルフェニル)サクシン
アミド酸ヒドラジド１.１１グラム(収率８８％)を得る。構造は、ｄ6−ＤＭＳＯ
中の３００ＭＨz、1Ｈ ＮＭＲで確認した。実施例VI：
一般式XIVのアルデヒド反応性試薬の適用
糖タンパク質および特に抗体は、タンパク質を０.１−０.５Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ５−６中の、０.２Ｍまでの塩化ナトリウムを含む５−２０mＭメタ
ペリオデートナトリウム(ＮａＩＯ4)から、０℃で３０分−４時間処理した場合
、アルデヒド反応性フェニルボロン酸ヒドラジド試薬とコンジュゲートし得る。
過剰のペリオデートを脱塩により除去し、１,２−ジオール分子を有する炭酸水
素残基のペリオデート酸化ペンダンド結合アルデヒド分子を有する活性化タンパ
ク質をヒドラジド試薬と、１−２４時間室温で縮合させ、シッフ塩基(イミン)型
結合によりタンパク質に共有結合しているペンダントフェニルボロン酸分子を有
するセミコンジュゲートを得る。タンパク質へのこの架橋の安定性は、所望によ
り、シッフ塩基を緩和な炭酸水素ナトリウム還元により対応するアルカリアミン
にすることにより増加し得る。糖タンパク質のペリオデート酸化がヒドラジド型
試薬へのタンパク質の反応を活性化させるが、同時に糖タンパク質に関連する天
然発生フェニルボロン酸錯化分子(共軸１,２−ジオール)のほとんどを除去する
ことは重要である。実施例VI：
一般式XIのフェニルボロン酸錯化試薬の製造
基ＷはＮＨ2、ＮＨＣＨ3およびＮＨＯＨから選択され、基ＱはＯである一般式
XIは、４−アミノサリチル酸または５−アミノサリチル酸由来である。４−また
は５−アミノサリチル酸は、最初にエステル化して４−アミノサリチル酸メチル
または５−アミノサリチル酸メチルをそれぞれ得る。エステルを中和し、次いで
アンモニア、メチルアミンおよびヒドロキシルアミンから選択されるアミンとの
反応によりアミド化し、式XXII：
式中、Ｒ'はＨ、ＷはＮＨ2、ＮＨＣＨ3およびＮＨＯＨから選択され、ＱはＯで
示される４−または５−アミノサリチル酸を得る。この化合物を次に、好ましく
は無水コハク酸、メチルサクシニルクロリド、無水マレイン酸、Ｎ−メトキシカ
ルボニルマレイミド、３−ブロモプロピオニルクロリド、３−ヨウドプロピオニ
ルクロリド、ヨウドアセチルクロリド、ブロモアセチルクロリドおよびクロロア
セチルクロリドからなる群から選択されるがこれらに限定されない活性化カルボ
ン酸と縮合し、対応する４−または５−アミドサリチルアミド(式中、ＱはＯ；
ＷはＮＨ2、ＮＨＣＨ3またはＮＨＯＨ；およびＲは式Ｚ"−ＣＯ−(ここで、Ｚ"
はＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＣＨ3、ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨ、ＣＨ2Ｃ
Ｈ2Ｂｒ、ＣＨ2ＣＨ2Ｉ、ＣＨ2Ｉ、ＣＨ2ＢｒおよびＣＨ2Ｃｌ)のアミド)を得る
。
Ｚ"がＣＨ2ＩおよびＣＨ2Ｂｒから選択されるこのような化合物は、フェニル
ボロン酸錯化分子を、ペンダントチオール基を有する生物活性種に結合させるの
に好適なチオール反応性試薬として有用である。Ｚ"がＣＨ＝ＣＨＣＯＯＨであ
るこのような化合物は、閉環により更に官能化され、フェニルボロン酸錯化分子
をペンダントチオール基を有する生物活性種に結合させるのに好適なチオール反
応性マレイミド試薬を得る。Ｚ"がＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＣＨ3である場合、化合物は
更にヒドラジンハイドレートとの反応により官能化され、ペンダントアルデヒド
基(炭水化物のペリオデート酸化に由来)を有する生物活性種にフェニルボロン酸
錯化分子を結合させるのに好適な、Ｚ"がＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＮＨ2であるヒドラ
ジド試薬を得る。Ｚ"がＣＨ2ＣＨ2ＢｒおよびＣＨ2ＣＨ2Ｉから選択される場合
、チオール酢酸カリウムにより更に官能化し得、中間体を得、をれを脱保護して
Ｚ"がＣＨ2ＣＨ2ＳＨであるチオール含有化合物を得る。チオール含有化合物は
、好ましくは２,２'−ジチオジピリジン、４,４'−ジチオジピリジンおよび２,
２'−ジチオジ(３−ニトロピリジン)から選択されるが、これらに限定されない
試薬との反応により活性化し得、フェニルボロン酸錯化分子をチオール基を有す
る生物活性種にジスルフィド結合の開裂を経由して結合させるのに好適な活性化
ジスルフィド含有試薬を製造する。
式XXII中のＷがＮＨ2およびＮＨＣＨ3から選択され、基Ｚ"がＣＨ2ＣＨ2ＣＯ
ＯＨである場合、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)および、好ましくは
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド(ＮＨＳ)およびＮ−ヒドロキシスルホサクシンイ
ミド(ＳＮＨＳ)から選択されるが、これらに限定されない試薬との反応により更
に官能化でき、フェニルボロン酸錯化分子を、ペンダントアミン基を有する生物
活性性種と結合させるのに好適な活性化エステル試薬を提供する。式XXII(式中
、ＷはＮＨ2およびＮＨＣＨ3から選択され、Ｚ"はＣＨ2ＣＨ2ＣＯ−ＮＨＳ)の活
性化エステルは、基Ｚは少なくとも６炭素原子と同等な長さであるアルキル鎖ま
たはポリエチレングリコール鎖を含むものである式XIの試薬の製造のための有用
な合成中間体である。
ＷがＮＨＯＨである場合、カルボン酸基がフェニルボロン酸錯化分子に関連す
るＮＨＳおよびベンゾヒドロキサミン酸の両方の存在により活性化される場合に
起こる問題のため、このような化合物は活性化エステル分子を有する試薬を製造
するために慣用的には用いることはできない。これは、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミド試薬の人気、およびＷはＮＨＯＨおよびＮＨＯＣＨ3から選択されるもの
である式XIの試薬のみが広範囲のｐＨ範囲にわたる錯体の安定性を形成するとい
う事実による制限を示す。この制限に打ち勝つために、別の合成経路が、基Ｗは
ＮＨＯＣＨ3およびＱはＯである式XI活性化エステル試薬を合成するために用い
られる。４−アミノサリチル酸または５−アミノサリチル酸をメチルサクシニル
クロリドと縮合させ、基ＷはＯＨであり、基Ｚ"はＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＣＨ3である
式XXIIの化合物を得る。続く、メトキシルアミンヒドロクロリド添加後のＮ,Ｎ
−カルボニルジイミダゾール(ＣＤＩ)との反応により、ＷがＮＨＯＣＨ3および
Ｚ'がＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＣＨ3である化合物を得る。カルボン酸エステル基のアル
カリ加水分解は、遊離カルボン酸基を有する化合物を得る。ＤＣＣおよび、好ま
しくはＮＨＳおよびＳＮＨＳから選択されるがこれらに限定されない試薬との反
応によるカルボン酸基の活性化は、ペンダントアミン基を有する生物活性種にフ
ェニルボロン酸錯化分子を結合させるのに好適な、ＷがＮＨＯＣＨ3およびＺ"が
サクシンイミドキシである活性化エステル試薬を得る。このようなＮ−ヒドロキ
シサクシンイミジルエステルは、Ｚは少なくとも６炭素原子と同等な長さである
アルキル鎖またはポリエチレングリコール鎖を含むものである式XIの試薬の製造
に有用な合成中間体である。
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルエステルは、更に、好ましくは６−アミノカ
プロン酸、４−アミノ酪酸、Ｎ−第３級ブトキシカルボニル−１,６−ジアミノ
ヘキサン(Ｎ−Ｂoc−１,６−ジアミノヘキサン)およびＮ−Ｂoc−１,４−ジアミ
ノブタンからなる群から選ばれるが、これらに限定されない試薬との反応により
官能化し得、必要であればＢoc保護基を除去した後、伸張スペーサーおよび末端
カルボン酸または末端アミン基を有する化合物を得る。ペンダントカルボン酸基
を有する上記試薬は、高分子量の生物学的巨大分子に関連して知られている立体
障害に打ち勝つために有用である、長いスペーサーを有するＮＨＳエステル、Ｓ
ＮＨＳエステルおよびヒドラジド含有試薬の製造に有用である。同様に、ペンダ
ントアミン基を有する上記試薬は、長いスペーサーを有する化合物を含むヨウド
アセトアミド、マレイミドおよび活性化ジスルフィドの製造に有用である。加え
て、ペンダントカルボン酸基またはペンダンドアミノ基を有する上記試薬は、固
相支持体の製造のための有用な合成中間体である。実施例VII：
式XIIのフェニルボロン酸錯化試薬の合成
基ＷがＮＨ2、ＮＨＣＨ3およびＮＨＯＨおよび基ＱがＯである式XIIの試薬は
、
４−または５−アミノサリチル酸から、式XIの試薬を製造するのに用いたのと同
様の方法で由来する。前記のように製造した４−または５−アミノサリチル酸を
、好ましくは塩化サクシニル、塩化アジポイル、アジピン酸ジイソブチルカルボ
ネート、塩化スベロイル、塩化３,３'−ジチオプロピノイル、塩化３,６,９−ト
リオキサウンデカンジオイルおよび３,６,９−トリオキサウンデカンジオン酸ジ
イソブチルカルボネートから選択されるが、これらに限定されない活性化カルボ
ン酸と縮合し、基ＷはＮＨ2、ＮＨＣＨ3およびＮＨＯＨおよび基ＱはＯおよびＺ
*は、(ＣＨ2)2、(ＣＨ2)4、(ＣＨ2)6、(ＣＨ2)2ＳＳ(ＣＨ2)2およびＣＨ2(ＯＣ
Ｈ2ＣＨ2)2ＯＣＨ2からそれぞれ選択されるが、これら限定されないものである
式XIIの化合物を得る。
基ＷがＮＨＯＣＨ3およびＱがＯである式XIIの試薬は、基ＷがＮＨＯＣＨ3で
ある式XIの製造と同様の別の合成経路で製造する。４−または５−アミノサリチ
ル酸を、好ましくは塩化サクシニル、塩化アジポイル、アジピン酸ジイソブチル
カルボネート、塩化スベロイル、塩化３,３'−ジチオプロピノイル、塩化３,６,
９−トリオキサウンデカンジオイルおよび３,６,９−トリオキサウンデカンジオ
ン酸ジイソブチルカルボネートから選択されるが、これらに限定されない活性化
カルボン酸と縮合し、基ＷはＯＨおよび基ＱはＯおよびＺ*は、(ＣＨ2)2、(ＣＨ2
)4、(ＣＨ2)6、(ＣＨ2)2ＳＳ(ＣＨ2)2およびＣＨ2(ＯＣＨ2ＣＨ2)2ＯＣＨ2から
それぞれ選択されるが、これら限定されないものである式XIIの化合物を得る。
ＷはＯＨであり、ＱはＯであり、Ｚ*は、(ＣＨ2)2、(ＣＨ2)4、(ＣＨ2)6、(Ｃ
Ｈ2)2ＳＳ(ＣＨ2)2およびＣＨ2(ＯＣＨ2ＣＨ2)2ＯＣＨ2からそれぞれ選択される
が、これら限定されないものである式XIIの化合物をＣＤＩと反応させ、続いて
メトキシルアミンヒドロクロリドを添加することにより、基ＷがＮＨＯＣＨ3お
よび基ＱとＺ*が前記で定義の化合物を得る。実施例VIII：
４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸の製造
無水メタノール(１００ml)および新鮮な濃縮Ｈ2ＳＯ4を、撹拌しながら注意深
く２５０ml丸底フラスコで合わせる(発熱)。４−アミノサリチル酸(１０.０グラ
ム、６５.４mmol)を加えて暗色溶液を産生し、それを６時間還流下加熱する。生
産物を冷却し、次いで回転エバポレーターで元の量の約半分まで濃縮する。この
時点で固体沈殿が現れる。濃縮物を水４００mlに注ぎ、得られる懸濁液を、固体
Ｎａ2ＳＯ4に続いて５Ｎ ＮａＯＨを段階的に注ぐことにより(ｐＨ６.５まで)
、ｐＨ約３まで滴定し、ＣＯ2ガスの発生を伴う。濃縮物を氷で冷し、得られる
沈殿を濾過により回収する。濾液を冷水で洗浄し、真空でＮａＯＨペレット上で
乾燥し、薄ラベンダー色粉末(m.p.１１５−１１７℃)の４−アミノサリチル酸メ
チル９.６グラム(収率８８％)を得る。構造は、ｄ6−アセトン中の1Ｈ ＮＭＲで
確認した。
水１６ml中のＮａＯＨ(４グラム)をヒドロキサミンヒドロクロリド(２.８グラ
ム、４０mmo1)および氷２０グラムに注意深く加える。溶解後、Ｎａ2ＳＯ3(０.
４グラム)、続いて４−アミノサリチル酸メチル(３.３５グラム、２０mmol)を添
加する。得られる溶液を２４時間まで室温で撹拌し、反応の進行を数時間毎にＨ
ＰＬＣで追跡する。得られる溶液を氷で冷却し、２５％Ｈ2ＳＯ4を添加すること
により酸性化する。沈殿は、最初にｐＨ約６で形成される。ｐＨを最後に約４に
調節し、薄褐色沈殿を濾過により回収する。生産物を真空でＰ2Ｏ5で乾燥し、４
−アミノ−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸(m.p.１８０−１８１℃)３.０ｇ(収
率８９％)を得る。構造は、ｄ6−ＤＭＳＯ中の1Ｈ ＮＭＲで確認した。
４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸は、基ＸがＮＨＯＨ、基Ｙ
がＯである一般式ＩおよびIIの両方の試薬の製造における重要な合成中間体であ
る。２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸分子を有する試薬は、ｐＨ約２.５−
１１.５の範囲の緩衝化水性溶液中で安定なバイオコンジュゲートを形成できる
。実施例IX：
式XIのアルデヒド反応性フェニルボロン酸錯化試薬の製造
上記のように製造した、ＮａＨＣＯ3(７.０グラム、０.０２モル)含有水１５
０ml中の４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸(８.４グラム、０.
０５モル)の氷冷、撹拌溶液に、塩化３−カルボメトキシプロピオニル(９.０グ
ラム、０.０６モル)を１５分にわたり滴下する。０−５℃で１時間撹拌後、溶液
を冷却６Ｎ ＨＣｌで酸性化する。沈殿を回収し、真空でＮａＯＨペレット上で
乾燥させ、粗Ｎ−４−(３−カルボメトキシプロピオンアミド)−２−ヒドロキシ
−ベンゾヒドロキサム酸１３.５グラム(収率９６％)を得、それを更に精製する
ことなく使用する。
メタノール５０ml中のＮ−４−(３−カルボメトキシプロピオンアミド)−２−
ヒドロキシベンゾキサム酸(１０グラム、０.０３５モル)の溶液にヒドラジンハ
イドルート(１２ml)を添加する。反応を一晩室温で進行させ、生産物を濾過し、
エーテルで洗浄する。生産物を２回ジメチルホルムアミドから再結晶させ、Ｎ−
４−(３−ヒドラジドプロピオンアミド)−２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸
７.３グラム(収率７８％)を得る。実施例Ｘ：
アルデヒド反応性フェニルボロン酸錯化試薬の適用
糖タンパク質および特に抗体は、タンパク質を０.１−０.５Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ５−６中の、０.２Ｍまでの塩化ナトリウムを含む５−２０mＭメタ
ペリオデートナトリウム(ＮａＩＯ4)から、０℃で３０分−４時間処理した場合
、アルデヒド反応性フェニルボロン酸錯化ヒドラジド試薬とコンジュゲートし得
る。過剰のペリオデートを透析または脱塩により除去し、結合共軸１,２−ジオ
ール分子を有する炭酸水素残基のペリオデート酸化由来のペンダンド結合アルデ
ヒド分子を有する活性化タンパク質をヒドラジド試薬と、１−２４時間室温で縮
合させ、シッフ塩基(イミン)型結合によりタンパク質に共有結合しているペンダ
ントフェニルボロン酸錯化分子を有するセミコンジュゲートを得る。タンパク質
上のこの架橋の安定性は、所望により、シッフ塩基を緩和な炭酸水素ナトリウム
還元により対応するアルカリアミンにすることにより増加し得る。糖タンパク質
のペリオデート酸化が、ヒドラジド型試薬へのタンパク質の反応を活性化させる
が、同時に糖タンパク質に関連する天然発生フェニルボロン酸錯化分子(共軸１,
２−ジオール)のほとんどを除去することは重要である。実施例XI：
チオール反応性フェニルボロン酸錯化試薬の製造
ＮａＨＣＯ3(４２.０グラム、０.５モル)含有水３００ml中の５−アミノサリ
チルアミド(１０.０グラム、０.０７３モル)の氷冷、撹拌溶液に、塩化ヨウドア
セチル(１８.４グラム、０.０９モル)を１５分にわたり滴下する。０−５℃で１
時間撹拌後、溶液を冷６Ｎ ＨＣｌで酸性化する。沈殿を回収し、ＮａＯＨペレ
ッ
ト上で真空乾燥し、粗５−(ヨウドアセトアミド)サリチルアミド２１.３グラム(
収率９６％)を得る。実施例XII：
チオール反応性フェニルボロン酸錯化試薬の適用
ジスルフィド結合(シスチン残基)またはシステイン残基を含むタンパク質を５
−(ヨウドアセトアミド)−サリチルアミドのようなチオール反応性フェニルボロ
ン酸錯化試薬で修飾し得る。ジスルフィド結合は、必要であれば、最初、完全に
脱気したアルカリ水性緩衝液中、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイ
トールとの反応により還元する。過剰の還元剤を透析または脱塩により除去し、
タンパク質を中性水性溶液中でアルキル化試薬と、１時間４℃で反応させ、タン
パク質と共有結合しているペンダントフェニルボロン酸分子を有するセミコンジ
ュゲートを得る。反応終了後、過剰の試薬を脱塩により除去する。実施例XIII：
式XIのアミン反応性フェニルボロン酸錯化試薬の製造
上記のように製造した、ＮａＨＣＯ3(７.０グラム、０.０２モル)含有水１５
０ml中の４−アミノアミノサリチル酸(７.７グラム、０.０５モル)の氷冷、撹拌
溶液に、塩化３−カルボメトキシプロピオニル(９.０グラム、０.０６モル)を１
５分にわたり滴下する。０−５℃で１時間撹拌後、溶液を冷却６Ｎ ＨＣｌで酸
性化する。沈殿を回収し、真空でＮａＯＨペレット上で乾燥させ、粗Ｎ−４−(
３−カルボメトキシプロピオンアミド)−サリチル酸１１.９グラム(収率８９％)
を得、それを更に精製することなく使用する。
テトラヒドロフラン５０ml中の激しく撹拌しているＮ−４−(３−カルボメト
キシプロピオンアミド)サリチル酸(１０.０グラム、０.０３６モル)の溶液に、
１,１'−カルボニルジイミダゾール(５.８４グラム、０.０３６モル)およびメト
キシルアミンヒドロクロリド(３.０グラム、０.０３６モル)を段階的に加える。
容器に乾燥管を付け、反応物を室温で３０分激しく撹拌する。反応の間に分離す
るイミダゾリウムヒドロクロリドを濾過により除去する。濾液を回転エバポレー
ターで濃縮し、琥珀色油状物を得、それを温テトラヒドロフラン１０mlに溶解し
、次いで２Ｎ Ｈ2ＳＯ4１５０mlを加える。沈殿を濾過により回収し、２Ｎ Ｈ2
ＳＯ4で洗浄し、水で洗浄し、次いで一晩ＮａＯＨペレット上で乾燥し、Ｎ−４
−(３−カルボメトキシプロピオンアミド)−２−ヒドロキシ−Ｏ−メチルベンゾ
ヒドロキサム酸１０.０グラム(収率９４％)を得る。Ｎ−４−(３−カルボメトキ
シプロピオンアミド)−２−ヒドロキシ−Ｏ−メチルベンゾヒドロキサム酸(７.
４グラム、０.０２５モル)を０.２Ｎ メタノール性ＬｉＯＨ２５mlに溶解する
。溶液を室温で窒素下一晩撹拌する。メタノールを回転エバポレーターで除去し
、残渣を水１５０mlに溶解する。２Ｎ Ｈ2ＳＯ4により溶液のｐＨを約２まで酸
性化し、エーテル１００mlで抽出する。エーテルへの２回目の抽出後、合わせた
エーテル抽出物を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥する。生産物を回転エバポレーターで濃
縮し、次いで一晩真空でＰ2Ｏ3で乾燥し、Ｎ−４−サクシンアミド−２−ヒドロ
キシ−Ｏ−メチルベンゾヒドロキサム酸６.２８グラム(収率８９％)を得る。
Ｎ−４−サクシンアミド−２−ヒドロキシ−Ｏ−メチルベンゾヒドロキサム酸
(５.６５グラム、０.０２モル)を温ジメチルホルムアミド５０mlに溶解し、室温
に冷却する。撹拌している溶液に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド(２.３グラム
、０.０２モル)、続いて新たに調整したジメチルホルムアミド１０ml中のジシク
ロヘキシルカルボジイミド(４.１グラム、０.０２モル)を加える。得られる懸濁
液を一晩室温で撹拌する。ジシクロヘキシルウレアをこの溶液から濾取し、濾液
を回転エバポレーターで最少量まで濃縮する。残渣をエーテルで沈殿させ、沈殿
を濾過により回収し、エーテルで洗浄し、２−プロパノールで洗浄し、真空でＰ2
Ｏ3で短く乾燥し、Ｎ−４−サクシンアミド−２−ヒドロキシ−Ｏ−メチルベン
ゾヒドロキサム酸サクシンイミジルエステル５.６グラム(収率７４％)を得る。
生産物を−１５℃の冷凍庫に保存する。実施例XIV：
アミン反応性化フェニルボロン酸錯化試薬の適用
タンパク質は、アミン反応性フェニルボロン酸錯化試薬により、リジン残基の
側鎖ε−アミノ基の反応によりコンジュゲートし得、安定なアミド結合によりタ
ンパク質と共有結合しているペンダントフェニルボロン酸錯化分子を有するセミ
コンジュゲートを得る。ｐＨ範囲７.８−８.８である緩和なアルカリ水性緩衝液
が、アミノ基が非保護であることを確実にするが、ＮＨＳエステルの加水分解を
最小にするように使用する。トリスおよびグリシンを含む第１級アミン含有緩衝
液は、その可能性のある反応性のため、避けなければならない。ペンダント第１
級アミン分子を有する固相支持体は、フェニルボロン酸錯化試薬との反応により
官能化し得、ペンダントフェニルボロン酸錯化分子を有する固相支持体を得る。実施例XV：
式XIIのフェニルボロン酸錯化試薬の製造
４−アミノ−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸(６.４グラム、０.０３８モル)
を乾燥ジクロロメタン５０mlに溶解する。トリエチルアミン(５.３ml、０.０３
８モル)を添加し、続いて、乾燥ジクロロメタン５０ml中の３,６,９−トリオキ
サウンデカンジオイルクロリド(５.０グラム、０.０１９モル)を２時間にわたり
滴下する。トリエチルアンモニウムヒドロクロリドを濾過により除去し、濾液を
水(２×１００ml)、飽和ＮａＨＣＯ3(２×１００ml)、飽和ＮａＣｌ(１００ml)
で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥する。溶媒を回転エバポレーターで除去し、残
渣をメタノール(１００ml)から再結晶し、無色結晶６.０グラム(収率６１％)を
得る。構造式はｄ6−ＤＭＳＯ中の1Ｈ ＮＭＲスペクトルで確認した。実施例XVI：
式XIIのフェニルボロン酸錯化試薬の適用
フェニルボロン酸にコンジュゲートしているタンパク質は、式XIIの試薬の反
応により架橋し得る。この工程は、タンパク質安定性および溶解性の特性を修飾
するのに有用であるタンパク質凝集体の製造に特に有用である。更に、架橋によ
り製造される酵素凝集体は、ELISAの感受性の増幅に有用である。この原則は、
錯体をELISAに導入する前に、ビオチニル化抗体の高感受性検出のために、ビオ
チニル化酵素を使用し、最初にアビジンとの高分子量錯体を(架橋により)形成す
る、アビジン−ビオチン錯体(ＡＢＣ錯体と呼ばれる)を使用することによるアビ
ジン−ビオチン系を開発する。実施例XVII：
式XVIIIのフェニルボロン酸錯化試薬の一般的合成
例えば、ＸがＨ、ＣＨ3およびＣ6Ｈ5から選択され、ＹがＯである式XVIIIの試
薬は、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドと一般式Ｒ1−Ｚ−Ｒ2(式中、Ｒ1はＢｒ、Ｃ
ｌおよびＩから選択され、好ましくはＢｒであり、Ｒ2はＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＣＯ2
ＨおよびＣＯ2ＣＨ3から選択され、好ましくはＢｒ、ＣＯ2ＨおよびＣＯ2ＣＨ3
から選択され、Ｚは式XVIIIで定義の意味、例えば好ましくは炭素原子２−１２
と同
等な長さのアルキル鎖またはポリエーテル鎖から選択されるスペーサーであり、
中間アミド官能性を有し得、好ましくは(ＣＨ2)n(ここで、ｎ＝２−６)または(
ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n(ここで、ｎ＝２−４)である)を縮合することにより製造する。
(ａ)最初の反応において、一般式Ｒ1−Ｚ−Ｒ2の化合物は１当量のＮ−ヒドロ
キシフタルイミド含有ジメチルホルムアミド中４０℃−１００℃に、溶液が得ら
れるまで加熱する。次いで、溶液を室温まで冷却し、１当量のトリエチルアミン
を添加し、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドアニオンに関連する濃赤色物が産生する
。溶液を室温で１−４日間撹拌し、反応の進行を薄層クロマトグラフィー(ＴＬ
Ｃ)で追跡する。反応終了後、水を添加し、生産物を沈殿させ、水で洗浄し、室
温で乾燥し、Ｒ1がフタルイミドおよびＲ2が先に定義の化合物を得る。Ｒ2がＢ
ｒ、ＣｌおよびＩから選択される生産物を、好ましくはＣ6Ｈ4(ＣＯ)2ＮＫ、Ｃ
Ｈ3ＣＯＯＮａおよびＣＨ3ＣＯＳＫからなる群から選択されるが、これらに限定
されない試薬と縮合させる。条件は所望の生産物の選択に依存するが、一般には
Ｃ6Ｈ4(ＣＯ)2ＮＫ、ＣＨ3ＣＯＯＮａまたはＣＨ3ＣＯＳＫの１.１当量を、酢酸
、ジエチルホルムアミド、メタノールまたはエタノールから選択される極性溶媒
中で１−２４時間還流することにより添加することを含む。
(ｂ)次いで、(ａ)の生産物を、Ｒ1はＮＨ2およびＲ2はＲ2Ａｃにアシル化され
、Ｒ2ＡｃはＮ(ＣＯ)2Ｃ6Ｈ4、ＯＣＯＣＨ3およびＳＣＯＣＨ3から選択され、Ｚ
は先に定義の通りであるように、フタルイミド基の酸触媒加水分解に付す。Ｒ2
がＣＯ2ＣＨ3である場合のフタルイミド基の酸触媒加水分解は、Ｒ2がＣＯ2およ
びＣＯ2ＣＨ3から選択され、Ｚが先に定義のものである生産物を得る。フタルイ
ミド基は、濃塩酸、酢酸中の濃塩酸、３０％ヒドロホウ酸または４８％ヒドロホ
ウ酸中で１５−６０分、短く還流する。各場合、室温に冷却後、フタル酸副産物
を得られる溶液から濾過する。用量を減少し、生産物をＮａＯＨ、ＮａＨＣＯ3
またはＮａ2ＣＯ3で中和する。エーテルまたは酢酸エチルによる抽出および続く
真空での濃縮により、生産物を得る。
(ｃ)次いで、(ｂ)の生産物を、サリチルアルデヒド、２−ヒドロキシアセトフ
ェノンおよび２−ヒドロキシジフェニルケトンら選択される試薬と縮合し、対応
す
るＲ1がカルボンイミドイルである生産物を得る。サリチルアルデヒド、２−ヒ
ドロキシアセトフェノンおよび２−ヒドロキシジフェニルケトンから選択される
試薬との縮合は、メタノールまたは９０％エタノール中で、６０℃で４−１２時
間還流することにより行い、反応の進行をＴＬＣにより追跡する。製品は真空で
濃縮し、デシケーター中で一晩乾燥する。
(ｄ)(ｃ)の製品を、Ｋ2ＣＯ3またはＮａＯＨの温溶液中の８−２４時間の塩基
触媒加水分解により脱保護し、Ｒ3およびＱが先に定義の一般式Ｐ５の生産物を
得る。この生産物をＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、無水ＭｇＳＯ4で
乾燥し、真空で濃縮する。保護基をヒドラジンハイドレートと、１２−４８時間
エタノール還流中反応させることにより除去する。沈殿フタルヒドラジドを溶液
から濾取し、溶液を濃縮し、生産物を酢酸エチルで抽出し、無水ＭｇＳＯ4で乾
燥し、真空で濃縮する。
(ｅ)最終生産物を、この生産物に関連するアミノ、ヒドロキシ、チオールまた
はカルボン酸を活性化することにより製造する。アミノ基は、好ましくはブロモ
酢酸無水物、ヨウド酢酸無水物およびマレイン酸無水物から選択されるが、これ
らに限定されない試薬との反応により活性化する。ヒドロキシ基は、好ましくは
２,２,２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド、ペンタフルオロベンゼンス
ルホニルクロリド、トルエンスルホニルクロリドおよび２−シアノエチル−Ｎ,
Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミデイトからなる群から選択されるが、こ
れらに限定されない試薬との反応により活性化する。チオール基は、２−チオピ
リドン、４−チオピリドンおよび３−ニトロ−２メルカプトピリジンからなる群
から選択されるが、これらに限定されない試薬との反応により活性化する。カル
ボン酸基は、好ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシス
ルホサクシンイミドから選択されるがこれらに限定されない試薬の存在下、好ま
しくはジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−エチル−３−(３−ジメチル
アミノプロピル)カルボジイミドから選択される試薬と反応させることにより活
性化し得る。あるいは、カルボン酸基は、好ましくはメタノールおよびエタノー
ルから選択されるアルコールとエステル化し得、次いで好ましくはヒドラジンハ
イドレートおよびヒドロキシルアミンから選択される試薬と反応させることによ
り更に官能化する。
ＸはＨ、ＣＨ3およびＣ6Ｈ5から選択され、ＹがＣＨ2である一般式XVIIIの生
産物は、合成の最初の工程におけるフタルイミドカリウムをＮ−ヒドロキシフタ
ルイミドに置換して、前記に概説の通り製造する。実施例XVIII：
式XIXのフェニルボロン酸錯化試薬の一般的合成
(ａ)ＹはＯである一般式XIXの試薬は、上記と同様の方法で製造し、工程(ａ)
および(ｂ)の進行は完全に前実施例に記載の通りである。次いで、前記実施例(
ｂ)の生産物を、好ましくは２−アセトキシベンジルクロリドおよび２−ベンジ
ルオキシ−ベンゾイルクロリドから選択されるが、これらに限定されない試薬と
縮合させ、対応するアミドを得る。好ましくは２−アセトキシベンジルクロリド
および２−ベンジルオキシ−ベンゾイルクロリドから選択される試薬との縮合は
、１当量のトリエチルアミンを含むジクロロメタンを、１時間室温で撹拌するこ
とにより達成し、反応の進行をＴＬＣで追跡する。トリエチルアンモニウムヒド
ロクロリドを溶液から濾取する。濾液を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で洗浄し、
真空濃縮する。
(ｂ)前工程の生産物を、８−２４時間の温Ｋ2ＣＯ3またはＮａＯＨ中の塩基触
媒加水分解により脱保護(例えば、Ｒ2の脱アシル)する。生産物をＨＣｌで酸性
化し、酢酸エチルで抽出し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。アセトキ
シ保護記載のを、生産物の製造中のヒドロキシ基の保護基として使用した場合、
この時点でまた除去し得、以下の合成工程の必要性を排除する。保護基を、還流
エタノール中のヒドラジンハイドレート(Ｎ2Ｈ2・ＸＨ2Ｏ)と１２−４８時間反
応させる。沈殿フタルヒドラジドを溶液から濾取し、溶液を濃縮し、生産物を酢
酸エチルで抽出し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
(ｃ)工程(ｂ)の生産物を、必要であれば、ベンジルオキシ保護基を触媒水素添
加により除去することにより更に脱保護する。触媒的水素添加は、無水エタノー
ル中のパラジウム炭素触媒で、２−１２時間行う。触媒を濾過により除去し、真
空濃縮する。
(ｄ)最終生産物を、この生産物に関連するアミノ、ヒドロキシ、チオールまた
はカルボン酸基を活性化することにより製造する。アミノ基は、好ましくはブロ
モ酢酸無水物、ヨウド酢酸無水物およびマレイン酸無水物から選択されるが、こ
れらに限定されない試薬との反応により活性化する。ヒドロキシ基は、好ましく
は２,２,２−トリフルオロエタンスルホニルクロリド、ペンタフルオロベンゼン
スルホニルクロリド、トルエンスルホニルクロリドおよび２−シアノエチル−Ｎ
,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミデイトからなる群から選択されるが、
これらに限定されない試薬との反応により活性化する。チオール基は、２−チオ
ピリドン、４−チオピリドンおよび３−ニトロ−２−メルカプトピリジンからな
る群から選択されるが、これらに限定されない試薬との反応により活性化する。
カルボン酸基は、好ましくはＮ−ヒドロキシサクシンイミドおよびＮ−ヒドロキ
シスルホサクシンイミドから選択されるがこれらに限定されない試薬の存在下、
好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−エチル−３−(３−ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミドから選択される試薬と反応させることによ
り活性化し得る。あるいは、カルボン酸基は、好ましくはメタノールおよびエタ
ノールから選択されるアルコールとエステル化し得、次いで好ましくはヒドラジ
ンハイドレートおよびヒドロキシルアミンから選択される試薬と反応させること
により更に官能化する。最終生産物を活性化が、フェノル性ヒドロキシル基の存
在と矛盾する場合、次いで生産物は最初に活性化し、ベンジルオキシ保護基を続
いて除去するが、ただし、活性化形は触媒水素添加に安定である。
基ＺがＣＨ2である一般式XIIは、工程におけるフタルイミドカリウムをＮ−ヒ
ドロキシフタルイミドに置換して、前記に概説の通り製造する。実施例XIX：
一般式XVIIIのアルデヒド反応性フェニルボロン酸錯化試薬の製造
合成の最初の段階で、６−ブロモヘキサノエートメチルをＮ−ヒドロキシフタ
ルイミドと、１当量のトリエチルアミン含有ジメチル−ホルムアミド中で２４時
間撹拌することにより縮合させる。生産物を水に注ぐことにより沈殿し、濾過に
より回収し、水で洗浄し、真空デシケーターで乾燥させ、更に精製することなく
使用する。
合成の第２の工程において、上記で得た粗生産物を短く酢酸および濃塩酸の混
合物中で還流する。冷却後、沈殿フタル酸を溶液から濾過し、濾液を濃縮し、次
いで繰り返し少量の水と共蒸発させ、酸の痕跡を除去する。最後に、アミノオキ
シヒドロクロリド生産物をＮａＨＣＯ3で中和し、酢酸エチルで抽出し、無水Ｍ
ｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第３の工程において、上記で得たアミノオキシ生産物を、１当量の２−
ヒドロキシベンズアルデヒトと、９０％エタノール中で６時間還流することによ
り縮合し、次いで真空濃縮し、アルドキシムを得る。
最後に、上記で得たアルドキシム生産物を過剰のヒドラジンハイドレートで、
一晩メタノール中で撹拌することにより処理する。沈殿ヒドラジンアルドキシム
生産物を氷浴で冷却し、溶液から濾取し、メタノールに溶解し、次いで真空濃縮
する。実施例XX：
アルデヒド反応性フェニルボロン酸錯化試薬の適用
糖タンパク質および特に抗体は、タンパク質をアルカリ水性溶液中メタペリオ
デートナトリウムから、１−１２時間処理した場合、アルデヒド反応性フェニル
ボロン酸錯化ヒドラジド試薬とコンジュゲートし得る。過剰のペリオデートを透
析または脱塩により除去し、結合共軸１,２−ジオール分子を有する炭酸水素残
基のペリオデート酸化由来のペンダンド結合アルデヒド分子を有する活性化タン
パク質をヒドラジド試薬と、１時間室温で縮合させ、シッフ塩基型結合によりタ
ンパク質に共有結合しているペンダントフェニルボロン酸錯化分子を有するセミ
コンジュゲートを得る。タンパク質上のこの架橋の安定性は、所望により、シッ
フ塩基を緩和な炭酸水素ナトリウム還元により対応するアルカリアミンにするこ
とにより増加し得る。糖タンパク質のペリオデート酸化が、ヒドラジド型試薬へ
のタンパク質の反応を活性化させるが、同時に糖タンパク質に関連する天然発生
フェニルボロン酸錯化分子(共軸１,２−ジオール)のほとんどを除去することは
重要である。実施例XXI：
一般式XIXのチオール反応性フェニルボロン酸錯化試薬の製造
合成の最初の段階で、１,２−ビス−(２−ヨウド−エトキシ)エタンをＮ−ヒ
ドロキシフタルイミドと、１当量のトリエチルアミン含有ジメチル−ホルムアミ
ド中で３日間撹拌することにより縮合させる。生産物を水に注ぐことにより沈殿
し、濾過により回収し、水で洗浄し、真空デシケーターで乾燥させ、更に精製す
ることなく使用する。
合成の第２の工程において、上記で得た無水エタノール中の粗生産物を過剰の
チオ酢酸カリウムで処理し、得られる黄色懸濁液を１時間加熱還流する。混合物
を冷却し、濾過し、真空濃縮し、スラリーを酢酸エチルと水の間で分配する。合
わせた酢酸エチル層を飽和水性ＮａＨＣＯ3溶液、水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で
乾燥し、真空濃縮する。
合成の第３の工程において、上記で得たアミノオキシ生産物を、酢酸と濃塩酸
の混合物中で短く還流する。冷却後、沈殿フタル酸を溶液から濾取し、濾液を濃
縮し、次いで少量の水と繰り返し共蒸発させ、酸の痕跡を除去する、最後に、ア
ミノオキシヒドロクロリド生産物をＮａＨＣＯ3で中和し、酢酸エチルで抽出し
、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第４の工程において、上記で得たアミノオキシ生産物を１当量の２−ア
セトキシベンゾキルクロリドと、１時間、室温で、１当量のトリエチルアミン含
有ジクロロメタン中で撹拌することにより縮合し、反応の進行をＴＬＣで追跡す
る。トリエチルアンモニウムヒドロクロリドを溶液から濾取し、濾液を水で洗浄
し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第５の工程において、上記で得た無水メタノール中の２−アセトキシベ
ンゾヒドロキサム酸生産物を、窒素で完全に脱気し、１当量の無水Ｋ2ＣＯ3で処
理し、得られる黄色懸濁液を激しく１２時間撹拌した。懸濁液を濾過し、真空濃
縮する。最後に、メルカプト２−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸生産物を乾燥
、脱気したメタノール中で０℃で１時間撹拌することにより、(メトキシカルボ
ニル)スルフェニルクロリドで処理し、メタノールを真空で除去する。生産物を
再び脱気メタノールに溶解し、１当量の３−ニトロ−２−メルカプトピリジンで
、
室温で１２時間撹拌することにより処理する。混合物を濾過し、未反応３−ニト
ロ−２−メルカプトピリジンを除去し、生産物を真空濃縮する。実施例XXII：
チオール反応性フェニルボロン酸錯化試薬の適用
ジスルフィド結合を含むタンパク質をチオール反応性フェニルボロン酸錯化試
薬でコンジュゲートし得る。ジスルフィド結合は、最初、完全に脱気したアルカ
リ水性緩衝液中、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールとの反応
により還元する。過剰の還元剤を透析または脱塩により除去し、完全に脱気した
アルカリ水性溶液中、チオール反応性試薬と、窒素下１時間４℃で反応させ、タ
ンパク質と共有結合しているペンダントフェニルボロン酸分子を有するセミコン
ジュゲートを得る。反応終了後、過剰の試薬を脱塩またはチオール交換クロマト
グラフィーにより除去する。フェニルボロン酸錯化分子は、上記のようにジスル
フィド結合を換言することによりセミコンジュゲートから除去し得る。この方法
において、チオール反応性フェニルボロン酸錯化試薬から製造したセミコンジュ
ゲートを有するバイオコンジュゲートが開裂し得る。実施例XXIII：
一般式XIXのアミン反応性フェニルボロン酸錯化試薬の製造
合成の最初の段階で、２−[２−(２−クロロエトキシ)エトキシ]エタノールを
をＮ−ヒドロキシフタルイミドと、１当量のトリエチルアミン含有ジメチルホル
ムアミド中で２日間撹拌することにより縮合させる。生産物を水に注ぐことより
沈殿し、濾過により回収し、水で洗浄し、真空デシケーターで乾燥させ、更に精
製することなく使用する。
合成の第２の工程において、上記で得た生産物を、酢酸と濃塩酸の混合物中で
短く還流する。冷却後、沈殿フタル酸を溶液から濾取し、濾液を濃縮し、次いで
少量の水と繰り返し共蒸発させ、酸の痕跡を除去する、最後に、アミノオキシヒ
ドロクロリド生産物をＮａＨＣＯ3で中和し、酢酸エチルで抽出し、無水ＭｇＳ
Ｏ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第３の工程において、上記で得たヒドロキシアミノオキシ生産物を１当
量の２−アセトキシベンゾキルクロリドと、１時間、室温で、１当量のトリエチ
ルアミン含有ジクロロメタン中で撹拌することにより縮合し、反応の進行をＴＬ
Ｃで追跡する。トリエチルアンモニウムヒドロクロリドを溶液から濾取し、濾液
を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第４の工程において、上記で得たヒドロキシ２−ベンジルオキシベンゾ
ヒドロキサム酸生産物を、１当量の２,２,２−トリフルオロエタンスルホニルク
ロリドと、１当量のトリエチルアミン含有アセトニトリル中で１時間撹拌するこ
とにより縮合する。トリエチルアンモニウムヒドロクロリドを溶液から濾取し、
濾液を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
最後に、ベンジルオキシ保護基を、無水エタノール中の８時間のパラジウム炭
素の触媒水素添加により除去する。触媒を濾過により除去し、生産物を真空濃縮
する。実施例XXIV：
アミン反応性化フェニルボロン酸錯化試薬の適用
タンパク質は、アミン反応性フェニルボロン酸錯化試薬により、リジン残基の
側鎖アミノ基の反応によりコンジュゲートし得、安定なスルホンアミド結合によ
りタンパク質と共有結合しているペンダントフェニルボロン酸分子を有するセミ
コンジュゲートを得る。アルカリ水性緩衝液を、アミノ基が非保護であることを
確実にするために使用しなければならない。トリスおよびグリシンを含む第１級
アミン含有緩衝液は、その可能性のある反応性のため、避けなければならない。
ペンダント第１級アミン分子を有する固相支持体は、フェニルボロン酸錯化試薬
との反応により官能化し得、ペンダントフェニルボロン酸錯化分子を有する固相
支持体を得る。実施例XXV：
一般式XIXの合成オリゴヌクレオチド反応性フェニルボロン酸錯化試
薬の製造
合成の最初の段階で、２−[２−(２−クロロエトキシ)エトキシ]エタノールを
をＮ−ヒドロキシフタルイミドと、１当量のトリエチルアミン含有ジメチルホル
ムアミド中で２日間撹拌することにより縮合させる。生産物を水に注ぐことより
沈殿し、濾過により回収し、水で洗浄し、真空デシケーターで乾燥させ、更に精
製することなく使用する。
合成の第２の工程において、上記で得た生産物を、酢酸と濃塩酸の混合物中で
短く還流する。冷却後、沈殿フタル酸を溶液から濾取し、濾液を濃縮し、次いで
少量の水と繰り返し共蒸発させ、酸の痕跡を除去する、最後に、アミノオキシヒ
ドロクロリド生産物をＮａＨＣＯ3で中和し、酢酸エチルで抽出し、無水ＭｇＳ
Ｏ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第３の工程において、上記で得たヒドロキシアミノオキシ生産物を１当
量の２−アセトキシベンゾキルクロリドと、１時間、室温で、１当量のトリエチ
ルアミン含有ジクロロメタン中で撹拌することにより縮合し、反応の進行をＴＬ
Ｃで追跡する。トリエチルアンモニウムヒドロクロリドを溶液から濾取し、濾液
を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する。
合成の第４の工程において、上記で得たヒドロキシ２−アセトキシベンジルオ
キシベンゾヒドロキサム酸生産物を、１当量の２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイ
ソクロロホスホアミデイトと、１当量のトリエチルアミン含有アセトニトリル中
で１時間撹拌することにより縮合する。トリエチルアンモニウムヒドロクロリド
を溶液から濾取し、濾液を水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮する
。
合成の第５の工程において、上記で得た２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプ
ロピルホスホロアミデート−２−アセトキシベンゾヒドロキサム酸をアセトニト
リルに溶解し、自動オリゴヌクレオチド合成装置の補助的貯蔵場所に置く。生産
物を、ピリジン触媒反応により、アセトニトリル中で２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ
−ジイソプロピルホスホロアミド試薬により合成を行う、固定化合成オリゴヌク
レオチドの遊離５'−ＯＨ末端と縮合する。固相合成はこの方法で終結する。合
成の最後の段階において、生産物を、一晩、５０−６０℃で、濃アンモニアヒド
ロキシドによりアンモニア融解することによりガラス固相支持体から開裂させる
。アンモニア融解は、生産物を固相支持体から除去し、２−アセトキシベンゾヒ
ドロキサム酸官能性に関するアセトキシ基を含むすべてのアシル保護基を除去す
る。生産物をアンモニアの急速真空(speedvac)により除去して濃縮し、次いで逆
相高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で精製する。実施例XXVI：
合成オリゴヌクレオチド反応性フェニルボロン酸錯化試薬の適用
合成オリゴヌクレオチドは、自動固相オリゴヌクレオチドの最後の段階間に、
２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミデイトフェニルボロン
酸錯化試薬と縮合でき、５'−ペンダンドフェニルボロン酸錯化分子を有する合
成オリゴヌクレオチドを得る。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９６年２月６日
【補正内容】
請求の範囲
１．式Ａ：
ＢＡＳ−Ｌ−Ｂc-Ｌ'−(Ｂc'−Ｌ")n−ＢＡＳ' (Ａ)
〔式中、ＢＡＳおよひＢＡＳ'は生物活性種(同一または異なり得る)；Ｌ、Ｌ'お
よびＬ"は架橋剤(同一または異なり得る)；ＢｃおよびＢｃ'は式Ｄ−ＥまたはＥ
−Ｄのフェニルボロン酸錯体(同一または異なり得る)であり、ここでＤはフェニ
ルボロン酸分子およびＥはフェニルボロン酸錯化分子、およびｎは０または１で
あるか、Ｅはグリコシルではない〕
で示されるバイオコンジュゲート錯体。
２．式ＩからＸ：
〔式中、ＱおよびＱ'は、独立してＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール
およびＮＣＨ2−アリールから選択される；ＹおよびＹ'は、独立してＯ、ＮＨ、
Ｎ−アルキル、アルキルおよびアリールから選択される；基Ｚ、Ｚ'、Ｚ*および
およびＺ*'は、独立して炭素原子１−１６と同等の長さのアルキル鎖およびポリ
エーテル鎖から選択され得るスペーサーであり、当該鎖は中間アミドおよびジス
ルフィド結合を含み得る；ＢＡＳ、ＢＡＳ'、ＢＡＳ*およびＢＡＳ*'は同一また
は異なる生物活性種；ＸおよびＸ'は、独立してＨ、ＣＨ3およびＣ6Ｈ5から選択
される；ＷおよびＷ'は、独立してＯ、ＮＨ、Ｎ−アルキル、ＮＣ6Ｈ5、Ｎ−ア
リール、ＮＣＨ2−アリール、ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＣＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＮＯ
Ｈ、ＮＯ−アルキルおよびＮＯＣＨ2−アリールから選択される；特記しない限
り、アルキルは炭素原子６個までの炭化水素を意味し、アリールは芳香族環、置
換芳香族環および融合芳香族環から選択される〕より選択されるバイオコンジュ
ゲート錯体。
３．式XV
〔式中、Ｚ*およびＢＡＳ*は請求項２で定義の意味〕
のフェニルボロン酸セミコンジュゲートの、請求項１または２のバイコオコンジ
ュゲート錯体の製造における使用。
４．式XIII、XXおよびXXI
〔式中、Ｑ、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＢＡＳは請求項２で定義の意味、Ｗ*はＨ、ＯＨ
、ＮＨＣＨ3、ＮａＯＨおよびＮＨＣＯ3から選択される〕
から選択されるフェニルボロン酸錯化セミコンジュゲート。
５．式XIV
〔式中、Ｚ*は請求項２で定義の意味、およびＲは生物活性種との反応に好適な
求電子または求核分子〕
のフェニルボロン酸試薬の、請求項１または２の生物学的コンジュゲートの製造
における使用。
６．式XI、XVIIIおよびXIX
〔式中、Ｑ、Ｘ、ＹおよびＺは請求項２で定義の意味、Ｗ*は請求項４で定義の
意味、およびＲは生物活性種との反応に好適な求電子または求核分子〕
から選択されるフェニルボロン酸錯化試薬。
７．式XII
〔式中、ＱおよびＺ*は請求項２で定義の意味およびＷ*は請求項４で定義の意味
〕のフェニルボロン酸架橋試薬。
８．式XVIまたはXVII
〔式中、Ｚ*は請求項２で定義の意味〕
のフェニルボロン酸架橋試薬の、請求項１または２のバイオコンジュゲート錯体
の製造における使用。
９．少なくとも一つの生物活性種が抗体である、請求項１から４に記載のバイ
オコンジュゲート錯体またはセミコンジュゲート。
１０．請求項９記載のハイオコンジュゲートまたはセミコンジュゲートを含む
、所望の細胞集団を単離するためのキットまたはシステム。
１１．細胞含有媒体を請求項９記載のバイオコンジュゲート錯体と接触させ、
細胞を媒体から分離する工程を含み、抗体が所望の細胞集団のエピトープ特性を
認識し、結合するものである、所望の細胞集団を単離する方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ０８／１８８，９５８
(32)優先日 1994年１月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／１８９，１７６
(32)優先日 1994年１月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ
，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，
ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＬ，Ｎ
Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ
，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ