CZ236797A3 - Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, léčiva tyto látky obsahující a jejich použití - Google Patents
Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, léčiva tyto látky obsahující a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ236797A3 CZ236797A3 CZ972367A CZ236797A CZ236797A3 CZ 236797 A3 CZ236797 A3 CZ 236797A3 CZ 972367 A CZ972367 A CZ 972367A CZ 236797 A CZ236797 A CZ 236797A CZ 236797 A3 CZ236797 A3 CZ 236797A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- aprotinin
- arg15
- variants
- glu53
- ser10
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims abstract description 88
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims abstract description 55
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004221 Multiple Trauma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023637 Multiple injury Diseases 0.000 claims description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 3
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003827 Plasma Kallikrein Human genes 0.000 description 3
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical group O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001091365 Homo sapiens Plasma kallikrein Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- CFPQUJZTLUQUTJ-HTFCKZLJSA-N Ala-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](C)N CFPQUJZTLUQUTJ-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- TTXYKSADPSNOIF-IHRRRGAJSA-N Arg-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O TTXYKSADPSNOIF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OVQJAKFLFTZDNC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LFWOQHSQNCKXRU-UFYCRDLUSA-N Arg-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LFWOQHSQNCKXRU-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N Asn-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RVHGJNGNKGDCPX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WXASLRQUSYWVNE-FXQIFTODSA-N Asp-Cys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N WXASLRQUSYWVNE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 1
- BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N Butylate Chemical compound CCSC(=O)N(CC(C)C)CC(C)C BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N Cys-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N Cys-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- LWYUQLZOIORFFJ-XKBZYTNZSA-N Glu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O LWYUQLZOIORFFJ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 101710176219 Kallikrein-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 101710132360 Kunitz-type serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N L-methionine sulfone Chemical compound CS(=O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O UCUNFLYVYCGDHP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KWURTLAFFDOTEQ-GUBZILKMSA-N Leu-Cys-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KWURTLAFFDOTEQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101000708578 Milk vetch dwarf virus (isolate N) Para-Rep C3 Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- 102000057032 Tissue Kallikreins Human genes 0.000 description 1
- 102100034392 Trypsin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710119666 Trypsin-2 Proteins 0.000 description 1
- GAYLGYUVTDMLKC-UWJYBYFXSA-N Tyr-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GAYLGYUVTDMLKC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- -1 plasma kaliikrein Proteins 0.000 description 1
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012982 x-ray structure analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
Oblast techniky ΐ
j Vynález se týká variant aprotininu se zlepšenými enzymově inhibitorickými, imunologickými a farmakokinetickými vlastnostmi a jejich výroby.
Dosavadní stav techniky í’
Aprotinin, který je též označován jako hovězí pankreatický trypsinový inhibitor (BPTI) , patří ke skupině inhibitorů serinových proteáz Kunitzóva typu. Spektrum inhibovatelných serinových proteáz zahrnuje například trypsin, chymotrypsin, plasmin a plasmový kalikrein (V. Gebhard, H. Tschesche a H. Fritz, Proteinase Inhibitors, Barret and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV 357387, 1986) .
Aprotinin se skládá z 58 aminokyselin. Trojdimensionální struktura bílkoviny byla osvětlena pomocí rentgenové strukturní analysy a NMR-spektroskopie (Vlodawer a kol. , J.
. '1 ..... ''_Mol.._Biol___1.9.8_(.3.)_,_4.6.9^_4.8.0.,_19-8.7-;—Vagner-a-kol-.-,-J-..-Mo-l—— i f Biol. 196 (1), 227-231, 1987; Berndt a kol., Biochemistry 32 (17), 4564-4570, 1993).
Pod obchodním názvem Trasylol^ se původně používal přírodní aprotinin pro ošetření pankreatitidy. Jak ukázala klinická studia, je dnes Trasylol používán v srdeční s
chirurgii, neboť při ošetření aprotininem se signifikantně sníží při takovýchto operacích potřeba transfusí a vede to k redukci dodatečného krvácení (D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 6; 76-100, 1992) .
Mohlo být ukázáno, že při výměně inhibiční specifitu určující aminokyseliny v poloze 15 vede k hodnotným variantám aprotininu se zlepšenými inhibičními vlastnostmi (DE-PS 3 339 693) . Vždy podle zavedené aminokyseliny mohou být tímto způsobem vyrobené aktivní inhibitory, které inhibují například pankreatickou nebo leukocytární elastázu.
Později se ukázalo, že byly zjištěny inhibiční vlastnosti aprotininu a variant, vyrobených výměnou v poloze 15 , také výměnou dalších aminokyselinových zbytků v kontaktním regionu mezi inhibovanou cílovou proteasou a molekulou inhibitoru. K tomu patří především dodatečné aminokyselinové zbytky v poloze 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 a 39 . Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, získané výměnou jednoho nebo více takovýchto aminokyselinových zbytků v oblasti kontaktního regionu byly mimo jiné popsány například v následujících spisech : VO 89/01968 , VO 89/10374 , EP 0 307 592 a EP 683 229 .
Zajímavě mohou být zlepšeny farmakokinetické vlastnosti aprotininu a jeho variant výměnou aminokyselin, které určují fyzikálně chemické vlastnosti látky. Ťak se podařilo snížením celkového kladného náboje molekuly signifikantní snížení vazby v ledvinách. Takovéto varianty byly popsány ve spise VO 92/06111 .
Z důvodu lepší možností technické připravitelnosti je v určitých případech výhodné provedení modifikace na N-ter3 rainálním konci molekuly. Takovéto modifikace mohou být zkráceni, prodloužení nebo delece N-terminálního konce u jedné nebo několika aminokyselin. N-terminálně modifikované varianty aprotininu jsou popsané například v EP 419 878.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu jsou varianty aprotininu, které se vyznačují následujícími znaky :
1. Výměna jedné nebo více aminokyselin v aktivním centru molekuly pro zlepšení aktivitních vlastností;
2. Výměna aminokyselin pro snížení positivního netto-náboje s cílem zlepšení imunologických a farmakokinetických vlastností;
3. Modifikace N-terminální aminokyselinové sekvence z důvodu technické připravitelnosti.
Varianty aprotininu, které právě obsahují pouze jeden z uvedených znaků, jsou popsané ve výše uvedených spisech. Varianty aprotininu podle předloženého vynálezu sjednocují ve své molekulové struktuře dva nebo tři z výše uvedených znaků. Sekvence aminokyselin je pro některé varianty příkladně znázorněna na obr. 1 7 ~
Varianty aprotininu podle předloženého vynálezu se však neomezuj i pouze na příklady, uvedené na obr. 1 . K variantám aprotininu podle předloženého vynálezu patří také varianty s N-terminálním prodloužením Ala(-2)-Gln(-1j , s přirozeným aminokyselinovým zbytkem prolinem v poloze 2 , s výměnou jiných aminokyselin, nesoucích kladný náboj, za neutrální nebo záporně nabité aminokyselinové zbytky, nebo s výměnou j iných neutrálních aminokyselin za negativně nabité aminokyselinové zbytky. Volba výměny aminokyselinových zbytků sleduje princip získání látky, která by při fyziologické hodnotě pH měla redukovaný positivní netto-náboj, výhodně v oblasti +2 až -2 . Uvedené změny v aminokyselinové sekvenci včetně N-terminálního prodloužení nebo zkrácení nebo delece může být využito v libovolné vzájemné kombinaci. K variantám aprotininu podle předloženého vynálezu náleží tedy všechny sloučeniny, které vykazují kombinaci výše uvedených znaků a které mají při fyziologické hodnotě pH redukovaný positivní netto-náboj.
Překvapivě se ukázalo, že kombinací dvou nebo tří jmenovaných znaků dochází nejen k dosažení, ale také částečně dokonce k zesílení výraznosti jednotlivých znaků. Kromě toho může být dosaženo signifikantně nových vlastností substance, které se týkají například imunologických, farmakokinetických a povrchově vazných vlastností. Nové varianty vykazují sníženou reakci s polyklonálními lidskými a králičími antisery, která bývají vytvořena při použití aprotininu. Dále bylo zjištěno, že nové varianty mají značně snížené imunogenní chování ve srovnání s aprotininem, to znamená, že vyvolávají sníženou imunoresponsi, Dále bylo ukázáno, že varianty podle předloženého vynálezu indukují ve srovnání s áprotininěm__nížš’í ‘uvolňovaní’ Histáminu z'”krévriícK' buněk. Dále vykazují nové varianty podstatně nižší akumulaci v ledvinách ve srovnání s aprotininem. Enzymové kinetické inhibiční konstanty (Ki-hqdnoty) jsou překvapivě zlepšené přes velké množství změn v molekulové stavbě ve srovnání s původními variantami molekuly.
Předmětem předloženého vynálezu tedy jsou varianty aprotininu s netto-nábojem +3 až -3 při hodnotě pH 7 as aminokyselinami Arg 15 nebo Arg 15 - Ala 17 . Výhodné jsou takové, které mají netto-náboj +2 až -2 a obzvláště výhodně +1 až -1 .
Tyto aprotininové varianty jsou vhodné pro inhibici plasmatického kallikreinu, tkáňového kallikreinu a plasminu.
Navíc mohou mít tyto varianty aprotininu nměněnou. N-terminální sekvenci.
Tím jsou míněny varianty aprotininu s N-terminálním prodloužením nebo zkrácením nebo s deletovanými aminokyselinami na N-kónci.
Výhodné jsou varianty aprotininu ze skupiny zahrnující :
desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Serl7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinin.
Tyto varianty aprotininu mohou také nést aminokyselinu prolin v poloze 2 .
Vynález se také týká léčiv, obsahujících jednu nebo více těchto variant aprotininu.
I*'
Popsané nové proteinové inhibitory jsou vhodné pro ošetření stavů onemocnění, při kterých dochází - také v důsledku komplexního chirurgického postupu, například v srdeční chirurgii nebo při alloartroplastických náhradách kloubů v transplantační medicíně - k aktivaci plasmatických enzymových systémů vlivem rozlehlých nebo intensivních kontaktů krve s cizími povrchy.
Inhibitory redukují ztráty krve při operacích, které jsou spojené se zvýšeným risikem krvácení (například operace srdce, kostní a kloubová chirurgie) . Jsou vhodné při terapii šoků, polytraumatu, mozkového a lebečního traumatu, sepse, diseminované nitrocévní koagulopatii (DIC) , celkového selhání orgánů a zánětlivých onemocnění účastněných na kallikreinovém systému, jako jsou revmatická onemocnění kloubů a astma. Zabraňují invasivníu růstu tumorů a tvorbě metastáz inhibicí plasminu. Jsou vhodné také vlivem inhibice syntesy bradykininu k terapii bolestí a edemů, jakož i k ošetření případů mrtvice.
Jsou také použitelné při léčbě dialysou a při použití umělých orgánů, aby snižovaly záněty a koagulaci a aby zmírňovaly risiko krvácení.
Příprava variant aprotininu podle předloženého vynálezu
Pro přípravu variant aprotininu podle předloženého vynálezu je vhodné použít postupů genové techniky. K tomu še používají obvyklé metody molekulární biologie ve vhodných mikrobiálních expresních organismech, které zavádějí genově technickou informaci pro syntesu odpovídající varianty aprotininu. Rekombinantní mikroorganismus se fermentuje; volbou vhodných podmínek jsou dávány heterologní informace pro expresi. Exprimované deriváty aprotininu se nakonec získávají z kultivačního media.
Vhodné hostitelské organismy pro produkci variant podle předloženého vynálezu mohou být bakterie, kvasinky nebo houby. Exprese může probíhat intracelulárně nebo za použití vhodných sekrečních systémů extracelulárně. Varianty aprotininu mohou být exprimovány prostým procesem nebo navázané na peptidy nebo bílkoviny.
Vhodné systémy pro expresi variant aprotininu jsou popsány ve spisech EP 683 229 , VO 89/02463 a VO 90/10075, a v různých dále nebo výše uvedených spisech.
Metody provádění způsobu podle předloženého vynálezu
Enzymy
Použité enzymy (restrikčni endonukleázy, alkalická fosfatáza z telecích střev, T4 polynukleotidkináza a T4 DNA ligáza) byly odebírány od firem Boehringer Mannheim a Gibco/BRL a byly aplikovány podle předpisů výrobců.
Molekulárně biologické techniky
Rutinní klonovací práce, jako je například isolace filasmidové^DNA“ Π. co Γι' (ťakzvaný~ňrini pr ep) a“třaňšf oř^ mace E. coli plasmidovou DNA se.provádí podle Sambrooka a kol. (Molecular Cloning Cold Spring Harbor, 1989). Jako hostitelský organismus se používá E. coli kmen DH5a (Gibco/BRL) . Pro isolaci větších množství plasmidové DNA še používá Qiágeň-tipš (Qiagen) . Extrákcě fragmentů DNA z agarosového gelu se provádí pomocí Jetsorbu podle údajů výrobce (Genomed) ,
Oligonukleotidy pro site directed mutagenesis-experimenty a primery pro PCR-reakce a sekvencovací reakce se vyrobí pomocí 380 A DNA synthesizeru firmy Applied Biosystems . Pokusy na mutagenesi se provádějí podle postupu Denga a Nickoloffa (Deng a kol., Anal. Biochem.
200. 81-88, 1992) za použití kitů firmy Pharmacia Biotech (Unique Site Elimination Mutagenesis) . Všechny konstrukce vektorů a experimenty mutagenese byly potvrzeny pomocí Taq Cycle-DNA-sekvencování s fluorescenčně značenými terminátory na ABI 373 A Sequenceru (Applied Biosystems) .
Transformace Saccharomyces cerevisiae
Buňky kvasinek, například kmene JC34.4D (ΜΑΤα, ura3-52, suc2) se vnesou do 10 ml YEPD (2 % glukosa, 2 % pepton, 1 % Difco kvasničný extrakt) a pěstují se při O.D-óoo nm 0.16 až 0,8 . Buňky se promyji 5 ml roztoku A (1 M solbitol, 10 mM bicin pH 8,35, 3 % ethylenglykol) , resuspendují se v 0,2 ml roztoku A a skladují se při teplotě -70 °C .
Plasmidová DNA (5 pg) a carrier-DNA (50 pg DNA ze sperma sledů) se přidá ke zmraženým buňkám. Buňky se potom nechají roztát třepáním po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Popr'ítlavku__l'75mT_řožtók'u B—~’(40~ %*PĚG 3Ó00~, 200 mM bicin pH 8,35) se buňky inkubuji po dobu 60 minut při teplotě 30 °C , promyji se 1,5 ml roztoku C (0,15 M NaCl, 10 mM bicin pH 8,35) a resuspendují se ve .100 μΐ roztoku C . Naočkování se provádí na selektivní medium se 2 % agaru. Transformandy se získají po inkubaci po dobu 3 dnů při teplotě 30 °C .
| Živná | media pro fermentaci | |
| 1. | SD2-medium : | |
| Bacto Yeast Nitrogen Base | 6,6 g/l | |
| glukosa* | 20 g/l | |
| kh2po4 | 6,7 g/l pH | |
| 2, | SČ5-medium : | |
| glukosa | 20 g/l | |
| kvasničný extrakt Difco | 20 g/l | |
| kh2po4 | 6,7 g/l | |
| (nh4)2so4 | 2,0 g/l | |
| MgSO4 x 7 H20 | 1,0 g/l | |
| roztok stopových prvků SL4 | 1,0 ml/1 | |
| pH | ||
| Roztok stopových prvků SL4 : | ||
| Titriplex III | 5 g/l | |
| FeS04 x 7 H20 | 2 g/l | |
| ZnSO4 x 7 H20 | 0,1 g/l | |
| MnCl2 x 4 H20 | 0,03 g/l | |
| _ T— — - | ” H3B'°3 ' ”.....” | --------------ο-,-3-g/r- |
| CoCl2 x 6 H20 | 0,2 g/l | |
| CuCl2 x 2 H20 | 0,01 g/l | |
| NíC12 x 6 H20 | 0,02 g/l | |
| Na2Mo04 x 2 H20 | 0,03 g/l |
* = odděleně autoklávováno
3.
Ferraentační medium
| Glukosa* | 2,0 g/1 | |
| sojový pepton | 25,0 g/1 | |
| kh2po4 | 1.4 g/1 | |
| MgS04 x 7 H20 | 1,0 g/i | |
| thiaminchlorid | 5,1 mg/1 | |
| inositol | 1 f Λ | 20 mg/1 |
| roztok stopových | ř prvků | 3 ml/1 |
| roztok vitamínů | 3 ml/1 | |
| (NH4)2SO4 | 3,8 g/1 | |
| Živný roztok : | ||
| Glukosa* | 530 g/1 | |
| (NH4)2so4 | 5,0 g/1 | |
| kh2po4 | 2,9 g/1 | |
| MgS04 x 7 H20 | 3,8 g/1 | |
| thiaminchlorid. | 13 mg/1 | |
| inositol | 70 mg/1 | |
| roztok stopových | prvků | 6,8 ml/1 |
| roztok vitaminů | 6,8 ml/1 | |
| Roztok stopových | prvků : |
pH 5,5
FeCl3 x 6 H2O ZnCl2 x 4 H2O h3bo3
CoC12 x 6 H2O CUSÓ4 x 5 H20 Ná2Mo04 x 2 H2O
| 13, í | 5 g/1 |
| 2,0 | g/1 |
| 0,5 | g/1 |
| 2,0 | g/1 |
| 1,9 | g/1 |
| 2,0 | g/1 |
CaCl2 x 2 H20 1,0 g/1
HC1 konc. 100 ml/1 * - odděleně autoklávováno
Roztok vitaminů :
| Riboflavin | 0,42 g/1 |
| pantothenát vápenatý | 5,9 g/1 |
| kyselina nikotinová | 6,1 g/1 |
| hydrochlorid pyridoxinu | 1,7 g/1 |
| biotin | 0,06 g/1 |
| kyselina folová | 0,04 g/1 |
Výroba pracovních konzerv
Základní konzervou se 1% zaočkuje 200 ml SD2-media v jednolitrové Erlenmayerově baňce. Kultura se inkubuje na třepačce (260 otáček za minutu) po dobu 72 hodin při teplotě 28 °C . Potom se naplní vždy 2 ml do nádobek a zmrazí se v kapalném dusíku.
Fermentace v třepacích baňkách
Jako předkultura se 1% zaočkuje 200 ml SD2-media ________v., j.e.dno.litr.o.vé., baňce _ pracovní., konzervou, a_fermentuje .se _po._ ..
dobu 72 hodin při teplotě 28 °C na třepačce při 260 otáčkách za minutu. Touto předkulturou se 1% zaočkuji hlavní kultury (200 ml SC5-media v jednolitrových baňkách) a inkubují se po dobu 72 až 96 hodin na třepačce při teplotě 28 °C .
Fermentace v desetilitrových bioreaktorech
Jako předkultura se 1% zaočkuje 200 ml SD2-media v jednolitrové baňce pracovní konzervou a fermentuje se po dobu 72 hodin při teplotě 28 °C na třepačce při 260 otáčkách za minutu. Hlavní kultura v desetilitrovém reaktoru se kultivuje jako fed-batch fermentace po dobu 96 hodin. Jako živné medium se použije výše uvedené fermentační medium, startovací objem činí 7 1 . Fermentor se zaočkuje 200 ml předkultury.
Podmínky fermentace :
Teplota : 28 °C, otáčky míchadla : 500 otáček za minutu, vzdušnění : 10 1/min pH ; 5,5 tlak v hlavě fermentoru : 20 kPa
Po 7 hodinách fermentace se zahájí přídavek živin., Hodnoty přídavku živin jsou řízeny přes respirační-kvocienty' (RQ) (RQ = vytvořený oxid uhličitý/spotřebovaný kyslík).
Pokud stoupne RQ na hodnotu >1,15 , tak se přídavek živin sníží, pokud klesne na hodnotu <1,05 , tak se přídavek živin zvýší.
.... -----y- pravidelných intervalech se z-fermentoru--odebírají-----vzorky a zjišťuje se růst buněk měřením optické hustoty při 700 nm. Kromě toho se zjišťuje koncentrace Bay 19-8757 v roztoku měřením aktivity.
Na konci fermentace se hodnota pH sníží přídavkem 50% kyseliny citrónové (hmotnost/objem) na 3,0 a obsah fermentoru se zahřeje po dobu 10 minut na teplotu 70 °C. Buňky se potom oddělí odstředěním při 7500 g a získaný roztok se použije k vyčištění bílkovin.
Materiály pro proteinchemickou analytiku
Sekvenční analysy se provádějí pomocí proteinsekvenceru model 473A firmy Applied Biosystems (Forster City, USA) . Používá se standardní sekvencovací program. Sekvencer, různé programy skvencování, jakož i PTH-detekčni systém jsou detailně popsány v návodu k obsluze (User’s manual protein sequencing systém model 473 A)(1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404, USA).
Reagencie pro provoz sekvenceru a HPLC-sloupec pro PTH-detekci byly převzaty od Applied Biosystems.
HPLC-analysy se provádějí za pomoci HP 1090 HPLC-Systemu firmy Hewlett Packard (D-Valdbronn). Pro dělení se používá RP-18-HPLC-sloupec (250 mm x 4,6 mm, 5 μ-materiál, průměr pórů 3 x 10”^ mm) firmy Backerbond (D-Grop Gerau).
Pro kapilární elketroforesu se používá model 270 A-HT od firmy Applied Biosystems (Forster City, CA 94404, USA) . Vzorky se injikují zpravidla hydrodynamicky v různých časových intervalech. Použité kapilární sloupce (50 pm x 72
- em)- - j sou- od -Applied Biosystems-.- - -------———.
Analysy aminokyselin se provádějí pomocí analysátoru aminokyselin LC 3000 firmy Eppendorf Biotronik (D-Maintal). používá se lehce modifikovaný standardní dělící program firmy Biotronik. Programy dělení a funkce analysátoru jsou obšírně popsané v návodu k použití přístroje.
Molekulové hmotnosti se zjišťují pomocí systému MALDI I firmy Kratos/Shimadzu (D-Duisburg). SDR-elektroforesa se provádí pomocí systému elektroforesy firmy Pharmacia (D-Freiburg).
Zjišťování kinetických dat se provádí pomocí mikrotitračních destiček firmy SLT (D-Crailsheim). Mytí mikrotitračních destiček se provádí pomocí mycího přístroje firmy Dynatec (D-Denkendorf) .
Enzymy a substráty jsou od firmy Calbiochem (D-Bad Soden) . Všechny ostatní chemikálie jsou od firmy Merck (D-Darmstadt) nebo Sigma (D-Deisenhofen) . 96-jamkové destičky jsou od firmy Greiner.
Polyklonální králičí anti-aprotininové protilátky se získají z králíků imunisací aprotininem. Lidské polyklonální anti-aprotininové protilátky pocházejí od pacientů, ošetřených aprotininem.
Proteinchemická analytika
N-Terminální sekvencová analysa až 3 mmol proteázového inhibitoru se nasadí na - Šěqůenzersheet l,_, _který”byl-předinkubován· polybrenem--^-Pro—— ---- — tein se skvencuje v celkem normálním cyklu sekvencemi. PTH-aminokyseliny se identifikují za použití online-HPLC pomocí 50 pmol PTH-standardu.
Analysa aminokyselin
200 pg proteinu se rozpustí ve 200 μΐ 6 N kyseliny chlorovodíkové a hydrolysuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 166 °C . Asi 1 mmol vzorku se nanese do analysátoru aminokyselin. Množství aminokyselin se zjišťuje přes 5 mmol standard.
SDS gelová elektroforesa
SDS gelová elektroforesa se provádí v podmínkách dle Laemmli. 10 pg proteázového inhibitoru se analysuje v 10% ,až 20% SDS-gelu a detekuje se pomocí vybarvení stříbrem (Merril a kol.)
U.K. Laemmli, Nátuře 227, 680-685 (1970) ;
C.R. Merril, M.L. Dunau, D. Goldmann, Anal. Biochem. 100 : 201-207 (1981).
Kapilární elektroforesa ng proteázového inhibitoru se zkoumá pomoci kapilární elektroforesy na skleněném sloupci (délka 72 cm, vnitřní průměr 50 μπι) . Podmínky : proud 90 μΑ, teplota sloupce 25 °C , 100 nM fosfátový pufr pH 3,0 , detekce 210 nm, pod tlakem 3 vteřiny.
Reversní'fázová chromatograf±e ' ---------------- —- —- — 5 nmol proteázového inhibitoru se chromatografuje na sloupci Bakerbond RP-18-HPLC (materiál 5 μ, 4,6 nm x 250 mm, velikost pórů 3 x 10’^ mm) . Jako eluent se použije gradient acetonitril/TFA . Podmínky : rychlost toku 0,7 ml/min, teplota sloupce 40 °C , rozpouštědlo A 0,1 %
TFA , rozpouštědlo B 0,1 % TFA/60 % acetonitril; gradient: 0 min 0 % B , 10 min 0 % B , 70 min 100 % B , 80 min 0 % B .
Stanovení molekulové hmotnosti pg proteázového inhibitoru se analysuje technikou MALDI . Jako matrice se použije kyselina sinapinová. Jako standardní proteiny pro hmotnostní kalibraci se použije telecí insulin, cytochrom C a melittin.
Obsah proteinů
Obsah proteinů se stanovuje metodou BCA . Při této 2+ 1+ metodě se přemění přítomnými proteiny Cu ionty na Cu ionty, které tvoří s kyselinou bicinchoninovou komplex, absorbující při 560 nm .
Lyofilisovaný protein se převede do rovnovážného stavu vlhkosti a rozpustí se v koncentraci 1 mg/ml v 0,9% roztoku chloridu sodného. Připraví se zředbvací řada. K 50 pl* roztoku vzorku se přidá 1000 μΐ testovací reagencie BCA (Pierce) , reagenční zkumavka se pevně uzavře zátkou a ínkubuje se po dobu 30 inut při teplotě 60 °C . Po ochlazení vzorku v ledové lázni po dobu 5 minut se provádí měření při teplotě 25 °C a vlnové délce 560 nm.
Aktivita (trypsinový inhibiční test, titračně)
Aktivita se zjišťuje pomoci modifikovaného inhibičního testu trypsinu F.I.P.. Bay y 19-8757 inhibuje trypsinem katalysovanou hydrolysu Na-benzoyl-L-argininethylesteru (BAEE) . Karboxylové skupiny, uvolněné při reakci, se zjiš17 fuj i alkalimetrickou titrací. Zbytková aktivita trypsinu je mírou inhibiční aktivity účinné látky,
Lyofilisovaný protein se převede do rovnovážného stavu vlhkosti, rozpustí se v koncentraci 1 mg/1 v 0,9% roztoku chloridu sodného a připraví se zřeďovací řada. K 1 ml roztoku vzorku se přidají 2 ml pufru (15 mM borátového pufru, pH 8,0 se. 200 mM CaCl2) a 0,8 ml roztoku trypsinu (2 mg/ml) a směs se inkubuje po dobu 5 minut při teplotě 25 °C . Potom se přidá 0,2 ml roztoku BAEE (6,8 mg/ml) a měří se spotřeba KOH po dobu 5 minut.
Zjištění křížové reakce proteázového inhibitoru s polyklonálními králičími, popřípadě lidskými antiaprotininovými protilátkami
0,5 až 10 ng proteázového inhibitoru, popřípadě aprotininu, rozpuštěných v kopulačním pufru, se naváže přes noc při teplotě 4 °C na mikrotitrační destičku. Jamky se promyjí čtyřikrát vždy 200 μΐ promývacíhó pufru a potům se přidá 100 μΐ blokačního roztoku. Destička se přikryje a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C . Po promytí, jak bylo uvedeno výše, se přidá polyklonální králičí antiaprotininová protilátka (0,2 pg/ml v 1% BSA v PBS-pufru), popřípadě polyklonální lidská protilátka (20 —-gg/mi—v -1%- HSA v -PBS-pufruj-. —Destička se^zakryje -a-inku-— buje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a potom se promyje, jak je uvedeno výše. Nyní se přidá 100 μΐ biotinylované anti-králičí, popřípadě anti-lidské protilátky (25 μΐ + 10 ml 1% BSA , popřípadě 1% HSA v PBS-pufru) a inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C . Destička se promyje jak je výše uvedeno a přidá se do každé jamky 100 μΐ streptavidin-peroxidázového komplexu (50 μΐ + + 10 ml 1% BSA , popřípadě 1% HSA v PBS-pufru) . Destička se zakryje, inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a potom se promyje, jak je uvedeno výše.
Substrátová reakce se provádí s TBM-substrátem + roztokem peroxidázy (1:1; 100 μΐ pro jamku) . Reakce se ukončí po 10 minutách 100 μΐ pro jamku 2 M kyseliny fosforečné a měří se absorpce při 450 nm (reference 570 nm) .
Roztoky
Inkubační pufr :
Pufr pro vzorky :
nM Na2CO3, 35 mM NaHCOg, pH 9,6 vzorky se ve vhodné koncentraci rozpustí v inkubačním pufru
Promývací roztok :
0,1% (v/v)
Tween-20 v PBS
Blokační pufr :
3% (v/v) BSA v PBS.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Výroba kvasinkového expresního vektoru pro sekreci rekombinantního desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr2ó-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu
Jako výchozí materiál pro výrobu, genu desPro2-SerlO- Ar gl 5-Alal7-Asp24-Thr 26-Glu31-A$n41-Glu5 3-aprotininu slouží gen desPro2-Argl5-Alal7 , který byl klonován restrikčními enzymy HindiTI a BamHI do vektoru pUC18 . Resultující vektor (pEM6.6.L) se podrobí pomocí Mutagenese Primeru A a Scal/Mlul U.S.E. Selektionsprimeru dvoušroubovícové mutagenesní reakci podle postupu U.S.E (Pharmacia Biotech). Mutagenese Primer A má následuj ící sekvenci :
Primer A .1 i ’ GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGGAAACTTGC GGTGGTGCTTAG 3’ . Tento primer generuje mutace Asn41 a Glu53 v genu desPro2-Argl5-Alal7 aprotininu. Analysa klonů se provádí restrikčním štěpením pomocí enzymů Seal a Sphl. Požadovaná sekvence byla kromě toho potvrzena pomocí DNA-sekvencování klonu pEM31.8.L . Další výměny v 5'-oblasti genu (Serl0-Asp24-Thr26-Glu31) byly provedeny pomoci PCR-techniky za použití Primeru B a reversního 24-mer M13 ’ Primeru, když se vycházelo z pEM31.8.L plasmid DNA . Primer . B má následující sekvenci :
Primer B ’ TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACTTCTACG ATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACOGC 3’ . Xhol poznávací
~.sekvence-je podtržená-.- -....................— ·.....*·—
PCR-vsázka obsahuje 20 ng pEM31.8.L plasmid DNA , 20 pmol reversní 24-mer M13 ’ primeru, 60. pmol Primeru B , 200 μΜ dNTPs , 1 x PCR reakčního pufru II (Perkin Elmer), 4 mM chloridu hořečnatého a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Peřkin Elmer) v celkovém objemu 100 μΐ . Podmínky cyklu jsou :
min pří teplotě 94 °C , 30 cyklů vždy 1 min při teplotě 94 °C , 1 min při teplotě 55 °C a 1 min při teplotě 72 °C a následující pětiminutová inkubace při teplotě 72 °C. PCR-vsázka se zředí 1:5 a liguje se s vektorem pCRII (invitrogen) . Ligační vsázkou se transformují buňky E. coli DH5a . Positivní klony se identifikuji po restrikčním štěpení enzymy Xhol a BamHI a více klonů se sekvencuje.
Klon pES9.10.L obsahuje požadovanou sekvenci a používá se pro další práci.
Vektor E. coli/kvasinky (například pA202) se použije pro konstrukci kvasinkového sekrečního vektoru,, ve kterém je spojena sekvence desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu se, pre-pro-sekvencí alfa-faktoru kvasinek.
Vektor pA202 nese gen ampicilinové resistence (bia) a URA3 gen jako selektovatelný značkový gen pro E. coli a kvasinky. Další esenciální prvky vektoru jsou Col El a 2 μ původní bod replikace (ori) . REP3 Locus se nachází rovněž v tomto regionu. 1200 Bp veliký EcoRI-Hindl11-fragment nese MFal promotor a N-terminální pre-pro-sekvenci kvasinkového alfa-faktor-předchozího proteinu (Kurjan a Herskowitz, Cell 30, 933-934, 1982) . Zavedením modifikovaného desPro2-Argl5-aprotinin-cDNA jako HindlII-BamHI fragment se opět vyrobí rozeznávací místo pro KexII-proteázu . . ._(.’_Lys-Arg-.uvnitř -a-l-fa-faktor-pre-pro = sekvence (EP 0 419 878).
Na 3*-konci sekvence desPro2-Argl5-aprotininu nese vektor BamHI-Sáli fragment kvasinkového URA3 genu, který v této poloze funguje jako terminační signál pro transkripci (Yarger a kol., Mol. Cell. Biol. 6., 1095-1101, 1986) .
180 Bp veliký DNA-fragment se pomocí Xhol a BamHI odštěpí z vektoru pES9.10.L , vyčistí se elektroforesou na agarosovém gelu a klonuje se do rovněž pomocí Xhol a BamHI štěpeného a defosforylovaného vektoru pA202 . Tímto klonováním se nahradí desPro2-Argl5-aprotinin ve vektoru pA202 za desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Clu53-aprotinin. Buňky kvasinek (JC34.4D) se transformují vektorem pES13.10.L , resultujícím z tohoto klonování.
Jiné vektory E. coli/kvasinky s různými promotory, jako je například konstitutivní GAPDH nebo indukovatelný GAL 10 promotor, se mohou vyrobit obdobným způsobem a vedou rovněž k sekreci desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu.
Vedle toho jé samozřejmě také možné použít vektory s jinými původy replikace kvasinek, jako je například chromosomální autonomně replikovatelný segment (ars) .
Vhodné selektovatelné markerové geny jsou vedle UŘA3 genu takové geny, které auxotrofnímu mutantu kvasinky dopomáhají k prototrofii, jako jsou například geny LEU2 , HIS3 nebo TRPÍ . Kromě toho je možno také samozřejmě použít geny, jejichž produkty zprostředkovávají resistenci vůči různým antibiotikům, jako je například amnoglykosid G418 .
Jiné kvasinky, jako jsou například kvasinky Pichia pastoris nebo Hansehula polymorpha, jsou po transformaci vhodnými vektory rovněž schopné produkovat desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu3l-Asn41-Glu53-aprotinin.
Příklad 2
Výroba kvasinkového expresního vektoru pro sekreci rekombinantní ho Serl0-Argl5- Alal7-Asp24-Thr2ó-Glu31- Asn41 -Glu53-aprotíninu s přírodní N-terminální sekvencí ’Arg-Pro-Asp’
Pro výrobu kvasinkového expresního vektoru, který dovoluje sekreci Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu s přírodní N-terminální sekvencí ’A.rg-Pro-Asp ’ , se nejprve přes PCR ámplifikuje a klonuje MFal promotor s α-faktorem pre-sekvence a 5’-koncem genu aprotininu (až k rozpoznávací sekvenci restrikčního enzymu Xhol) . Použitý primer má následuj ící sekvenci :
Primer C ’ -GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG- 3 ’ . Rozpoznávací sekvence EcoRV je podtržena.
Primer D ’ -GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAACAAGAC AGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT-3 ’ . Rozpoznávací sekvence Xhol je podtržena.
PCR-vsázka obsahuje 200 ng pA202 plasmid DNA, 0,2 _ __μΜ. .primeru-C0-,-2- -μΜ-primeru-D200' μΜ tlNTPš ,- i x”PČR reakčního pufru 11 (Stratagene, opti-Prime ) a 2,5 U Taq DNA polymerázy (Perkin'Elmer) v.celkovém objemu 50 μΐ. Podmínky cyklu jsou : 1 min při teplotě 94 °C , 30 cyklů vždy 1 min při teplotě 94 °C , 1 min při teplotě 50 °C a 2 min při teplotě 72 °C a následující pětiminutová inkubace při teplotě 72 °C. PCR-vsázka se zředí 1 : 5 a liguje se s vektorem pCRII (invitrogen) . Ligační vsázkou se transformují buňky E. coli DH5« . Positivní klony se identifikují po restrikčním štěpení enzymem EcoRI a více klonů se sekvencuje. Klon pIU20.11.L se používá pro další práci.
Vektor E. coli/kvasinky pYES2 (invitrogen) se použije pro konstrukci kvasinkového sekrečního vektoru, ve kterém je spojena sekvence Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu přímo s pre-pro-sekvencí alfa-faktoru kvasinek. Nejprve se rozštěpí vektor pYES2 restrikčními enzymy SspI a BamHI , defúsforyluje se a čistí se gelovou chromatografií. Na vektoru pYES2 přítomný GAL1 promotor a fl ori se při tom odstraní. Asi 1030 Bp velký fragment DNA se pomocí EcoRV a Xhol odštěpí z vektoru pIU20.11.L , vyčistí se pomocí elektroforesy na agarosovém gelu a společně s asi 180 Bp velkým Xhol a BamHI fragmentem z vektoru pES9.10.L se klonují do vektoru pYES2 , rozštěpeného pomocí SspI a BamHI . Ligační vsázkou se transformují buňky E. coli DH5a . Positivní klony se identifikují a sekvencuji po restrikčním štěpení enzymem Xhol . Buňky kvasinek (JC34.4D) se transformují vektorem pIU28.11.L , resultujícím z tohoto lonování. Expresní vektor pIU28.11.L neobsahuje žádnou α-faktor pro-sekvenci, takže probíhá procesování Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu výhradně signální peptidázou a je nezávislé na štěpení... KexI.I proteázou-...... - .....
Příklad3
Fermentace Saccharomyces cerevisiae
Expresní kmen Saccharomyces cerevisiae se fermentuje jak je popsáno výše.
Příklad 4
Čištění derivátů aprotininu bez netto-náboje při neutrální hodnotě pH
1. Přehled vhodných postupů čištění
Po fermentaci se buňky oddělí odstředěním a zbylá kapalina se přefiltruje, aby se odstranily zbylé buňky.
Hodnota pH této kapaliny se nastaví pomocí koncentrované kyselinycitrónové na 3 . Roztok se musí vhodně zředit vyčištěnou vodou tak, aby byla nastavena vodivost nižší než 8 mS/cm . Potom se roztok nanese na sloupec kationtoměniče, který byl předem ekvilibrován kyselým pufrem. Nevázaný materiál se odstraní dostatečným promytím startovacím pufrem. Produkt se eluuje pomocí-gradientu soli. Získané frakce se zkouší na svůj obsah produktu pomocí reversní vysokotlaké kapalinové chromatografie (RP-HPLC) a biologickým testem aktivity, který stanovuje inhibici proteáz. Produkt obsahující frakce se spojí a přímo se nanesou na preparativní RP-HPLC sloupec, který byl předem ekvilibrován kyselýmpuf r.em..... „Nevázaný- protein -se ze sloupce odstraní -promytím startovacím pufrem a produkt se eluuje pomocí gradientu organických rozpouštědel. Frakce se potom znovu zkoušejí na obsah produktu jak je uvedeno výše a ty frakce, které obsahují produkt, se spojí. V závislosti na dosažené čistotě produktu může být nutné spojené frakce čistit přes druhý RP-HPLC sloupec. Podmínky jsou v podstatě stejné, jako je popsáno výše. Získaný roztok produktu se zředí vodou pro injekce, naplní se do vhodných nádob a lyofilisuji se.
Jiné metody pro čištění derivátů aprotininu bez netto-náboje při neutrální hodnotě pH , které se mohou kombinovat s výše popsanými procesy, je afinitní chromato; grafie na sepharose s imobilisovaným trypsinem a gelová permeační chromatografie.
2. Čištění desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu3l-Asn41-Glu53-aprotininu
Materiál z destilitrového fermentoru se čistí následujícím postupem. Po ukončení fermentace se hodnota pH obsahu fermentoru upraví pomocí koncentrované kyseliny citrónové na 3 a zahřívá se na teplotu 70 °C po dobu 5 minut. Potom se buňky odstraní odstředěním (15 minut,
7500 x g , odstředivka Heraeus) a získaná kapalina se přefiltruje (8 μπι až 0., 2 μιη, Millipore, BRD) . Z tohoto stupně se může filtrát zpracovat zmrazením při teplotě -18 °C pro další použití. Roztok se potom přídavkem vyčištěné vody zředí tak, aby vodivost byla nižší než 8 mS/cm a nanese se na sloupec SP-sépharosy FF (Pharmacia, Švédsko) , kteý byl předem ekvilibrován 50 nM citrát-NaOH pufru, pH 3 . Nenavázaný protein se odstraní intensivním
-------------- ...promýváním -stejným--puf-rem. - -Potom · se- produkt 'eluuje' pomocí' ' i gradientu soli (1 M NaCl) . Získané frakce se zkoušejí pomocí reversní vysokotlaké kapalinové chromatografie (RP-HPLC, C4) a testováním proteázové inhibiční aktivity na obsah produktu. Spojí se frakce, které obsahují požadovaný produkt.
Potom se roztok produktu přímo nanese na RP-HPLC sloupec (Source 15 RPC, Pharmacia, Švédsko) , který byl předem ekvilibrován 0,1% kyselinou trifluoroctovou ve vodě. Nenavázaný protein se odstraní intensivním promytím stejným pufrem. Produkt se eluuje pomocí lineárního acetontrilového gradientu (0 až 70 %) . Získané frakce se zkoušejí na obsah produktu znovu výše popsanými metodami a ty frakce, které obsahuj i produkt, se spoj í.
Pro závěrečné čištění se produkt obsahující roztok zředí vodou pro injekční účely a nanese se na druhý RP-HPLC sloupec (Vydac C8, Vydac, USA) , který byl předem ekvilibrován 0,1% kyselinou trif luoroctovou ve vodě. Nenavázaný protein se odstraní intensivním promytím stejným pufrem. Produkt se eluuje pomocí lineárního acetontrilového gradientu (0 až .70 %) . Získané frakce se zkoušejí na obsah produktu znovu výše popsanými metodami a ty frakce, které obsahují produkt, se spojí.
Získaný roztok produktu se zředí vodou pro injekce, naplní se do vhodných nádob (20, 10, 1 a 0,2 mg) , lyofi1 i suje se a analysuje.
Příklad 5
Stanovení hodnoty Ki lidského plasmového kallikreinu ponoci des Pr o - Ser 10 -Ar.gl 5.- Alal7 - Asp 24 -Thr 26 - Glu31 - Asn4 l·- Glu5 3 - aprotininu
Příklad :
jednotka lidského plasmového kallikreinu se zředí pufrem (0,05 M Tris-/0,l M NaCl, 0,05 % Tween-20; pH 8,2) na 16 ml . 200 μΐ tohoto roztoku enzymu se smísí se snižujícími se objemy testovacího pufru (250, 240, 230, 220, 200, 180, 170, 150, 100, 50 μΐ) a potom se přidá vzrůstající množství inhibitoru v assay pufru (10, 20, 30, 50,70,
80, 100, 150, 200 a 250 μΐ; koncentrace 0,7 gg/μΐ) .
Roztok enzym/inhibitor se předběžně inkubuje při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Potom se 180 μΐ z každého roztoku vnese do jamky mikrotitrační destičky a smísí se se 20 μΐ roztoku substrátu. Změna absorpce se měří při 405 nm po dobu 10 minut. Stanovuje se rychlost enzymové reakce a z té se počítá hodnota Ki podle metody Bietha (Biochemical Medicine 32 ; 387-397 (1984)).
Substrát Stock roztok': 0,1 M v DMSO roztok substrátu : 1 x 10’% S-2302 v assay-pufru assay-pufr : 0,05 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween-20; pH 8,2; 1 ml benzylalkohol/1 .
Kinetické konstanty komplexování s enzymovým plasminovým faktorem Xla, hovězím trypsinem a chymotrypsinem se stanovují stejnými postupy. Substráty jsou Chromozym PL pro plasmin, HD-Pro-Phe-Arg-pNA pro faktor XI , S-2444 pro trypsin a Suc-Phe-Leu-Phe-pNA pro chymotrypsin.
Příklad 6
Výsledky proteinchemické charakterisace desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu
Proteázový inhibitor desPro2-Ser!0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin se vyrobí pomocí genovými technikami změněného kvasinkového organismu sekreci, Z kapaliny nad kvasinkami se čistí různými chromatograf ickými postupy až do homogenity. Identitu inhibitoru s klonovanou sekvencí ukazují následující proteinově analytické zkoušky,
N-terminální sekvenční analysa
Proteázový inhibitor se úplně sekvencuje přes 57 stupňů. V následujícím je uvedena proteinová sekvence, která je identická s klonovanou sekvencí
Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg15
-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu29
-Cys-Glu-Thr - Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-Asn-Arg- Asn43
-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cýs-Gly-Gly57
-Ala
Sekvenční analysa desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr2ó- T.Glu3.1.^Asn41^Glu53-ap-rotin-inu p-řes.....5-7-stupňů -.—
Analysa aminokyselin
Analysa aminokyselin představuje důležitý kvantitativní parametr pro charakterisaci proteinu. Vedle obsahu proteinu se při známé primární struktuře zjišťuje počet jednotlivých aminokyselin. Analysa aminokyselin desPro2-Ser10-ArglS-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu je v dobrém souladu s teoretickými hodnotami z primární struktury, jak je patrno z tabulky 1 .
Tabulka 1
Analysa aminokyselin desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu Celé počty jsou vztaženy na Ala = 7 .
| Aminokyselina | celý počet | teor. počet | |
| CysSO3H | 5,28 | 6 | |
| Asp | 6,27 | 6 | |
| Thr | 3,49 | 4 | |
| Ser | 1,58 | 2 | |
| Glu | 4,25 | 4 | |
| Gly | 6,16 | 6 | |
| Ala | 7,00 | 7 | |
| Val | 0,98 | 1 | |
| Met | 1,10 | 1 | |
| Ile | 1,66 | 2 | |
| Leu | 1,89 | 2- | |
| Tyr | 2,49 | 3 | |
| Phe | 4 4,11 | 4 | |
| Lys | 1,05 | 1 | |
| Arg | 4,73 | ' 5 | |
| Pro | 3,23 | 3 |
*)' cystein a’métMónirfTsě' 'stanovuj ípó oxidaci' Kyselinou permravenči (Met jako methioninsulfon).
Reversní fázová chromatografie
Při HPLC-chromatografii proteinů na chemicky vázané reversní fázi dochází přes hydrofobní vzájemné působení proteinů k vazbě na použitou fázi. Proteiny se podle síly své vazby na stacionární fázi vytěsňují organickými rozpouštědly (mobilní fáze) . Z tohoto hlediska je tato metoda dobrým kriteriem pro určení čistoty proteinu. DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin je eluován jako jediný peak z RP-18-fáze. Ukázalo se, že isolovaný proteázový inhibitor je velmi čistý.
CE-chromat Ogr af i e
Kapilární elektroforesa dovoluje dělení peptidů a proteinů na základě jejich náboje v elektrickém poli. Úspěšnost dělení při tom závisí na pufru, hodnotě pH, teplotě a použitých additivech. Jako kapiláry se používají takzvané fused silica sloupce s vnitřním průměrem 50 až 100 μπ . DesPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr2ó-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin se dělí na fused silica sloupci v elektrickém poli. Elektroforeogram vykazuje štíhlý peak.
Stanoveni molekulové hmotnosti
Molekulová hmotnost desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24~ zThr26-Glu31- Asn41“Glu53'-'aprotinínu bylazj ištěna- pomoci - - r
MALDI-techniky 6223 Daltonů. Zjištěná molekulová hmotnost je při tom v dobrém souladu s teoretickou hodnotou 6215 Daltonů v rámci přesnosti metody měření. Kyselina sinapinová se použije jako matrice.
SDS-gelová elektroforesa
DesPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin se analysuje pomocí SDS-elektoforesy za redukujících a neredukujících podmínek. Vykazuje pásy v oblasti ca. 6,5 kD .
Příklad. 7
Stanovení Ki-hodnoty pro kompkexování enzymů s DesPro2dl·
-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininem
Inhibiční konstanty desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu se stanovují pro různé enzymy. V tabulce 2 jsou uvedené Ki-hodnoty
Tabulka 2
Inhibiční konstanty komplexování desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotininu s enzymy plasminem, plasmovým kaliikreinem, faktorem Xla, hovězím chymotrypsinem a hovězím trypsinem
| Enzym | hodnota Ki [M] |
| plasmový kallikrein | 2 x 1011 |
| plasmin | 5 x 1010 |
| faktor Xla | 5 x 101θ |
| trypsin | 2 x 10-11 |
| chymot ryps i n | 9 x ΙΟ9 |
Příklad 8
Vzájemné působení proteázových inhibitorů s polyklonálními králičími, popřípadě lidskými anti-aprotininovými protilátkami
Rekombinantně vyrobené proteázové inhibitory se zkoušejí na svoji křížovou aktivitu s polyklonálními králičími, popřípadě lidskými anti-aprotininovými protilátkami. Bylo zjištěno, že různé varianty proteázových inhibitorů vykazují pouze velmi slabé vzájemné působení s' aprotininovými antiséry.
Sekvenční protokol (1) Všeobecné údaje :
(i) Přihlašovatel :
| (A) | Jméno : | Bayer AG |
| (B) | ulice : | Bayerwerk |
| (C) | místo : | Leverkusen |
| (E) | stát : Německo | |
| (F) | poštovní | směrovací číslo |
| (G) | telefon | : 0214-3061455 |
| (H) | telefax | : 0214-303482 |
(ii) Název vynálezu : Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi (iii) Počet sekvencí : 5 (iv) Počítačově čitelná forma :
(A) Nosič dat : Floppy disk (B) počítač : IBM PC compatible (C) provozní systém : PC-DOS/MS-DOS (D) software : Patentln Release #1.0, verse #1.30B (EPA) (2) Údaje pro SEQ ID č.: 1 :
(i) Charakteristické znaky sekvence :
......(Aj--Délka--: -69-párů basí - - - -- *- - - - - - - — (B) druh : nukleotid (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (ví) Původ :
(A) Organismus : Primer A (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. : 1
GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAG ACTGCATGGA AACTTGCGGT GGTGCTTAG (2) Údaje pro SEQ ID č.: 2 :
(i) Charakteristické znaky sekvence :
(A) Délka : 93 párů basí (B) druh : nukleotid (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne
...... '(v'i')Puvód~ ' ·-···-··.- — (A) Organismus : Primer B (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. 2
TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT CTACGATGCA ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTOGTATAC GGC (2) Údaje pro SEQ ID č.: 3 :
(i) Charakteristické znaky sekvence :
(A) Délka : 38 párů basí (B) druh : nukleotid (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (vi) Původ :
(A) Organismus : Primer C (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. : 3
GGGATATCTA TTGATAACAT TTAAAGGTAT TTGACAAG (2) Údaje pro SEQ ID č.: 4 :
(i) Charakteristické znaky sekvence :
(A) Délka : 99 párů basí (B) druh : nukleotid (C) ' forma šroub o v'iče : jednoduchá'' šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : genom-DNA (iii) Hypoteticky : ne (iv) Antisense : ne (vi) Původ :
(A) Organismus : Primer D (xi) Popis sekvence : SEQ ID č. : 4
GGGCTCGAGG CAGAAACTCG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA 50 AGACAGCAGT CAAAATAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAACT CTTTATATT 99 (2) Údaje pro SEQ ID č.: 5 :
(i) Charakteristické znaky sekvence :
(A) Délka : 57 aminokyselin (B) druh : aminokyseliny (C) forma šroubovice : jednoduchá šroubovice (D) topologie : lineární (ii) Druh molekuly : peptid (v) Typ fragmentu : lineární (vi) Původ :
(A) Organismus : varianta aprotininu
| (xi) | Popis | sekvence | : SEQ ID č. | : 5 | ||||||||||
| Arg_ | Asp | Phe | Cys | Leu | Glu | Pro | Pro | Ser | Thr | Gly.. | Pro | Cys | Arg. | .Ala |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Ala | Ile | Ile | Arg | Tyr | Phe | Tyr | Asp | Ala | Thr | Ala | Gly | Leu | Cys | Glu |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Thr | Phe | Val | Tyr | Gly | Gly | cys | Arg | Ala | Asn | Arg | Asn | Asn | Phe | Lys |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ser | Ala | Glu | Asp | Cys | Met | Glu | Thr | Cys | Gly | Gly | Ala | |||
| 50 | 55 |
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Varianty aprotininu s netto-nábojem +3 až -3 při pH 7 as aminokyselinami ArglS nebo Argl5-Alal7 ve vazebném regionu.
- 2. Varianty aprotininu podle nároku 1 pro inhibici serinových přoteáz.
- 3. Varianty aprotininu podle nároku 1 nebo 2 se změněnou N-terminální sekvencí.
- 4. Varianty aprotininu podle nároku 1 nebo 2 s N-terminálním prodloužením nebo zkrácením nebo s deletovanými aminokyselinami v N-terminálu.
- 5. Varianty aprotininu ze skupiny zahrnující desPro2-Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-------aprotinin-;' — - - ............... --·· -........ — ...............desPro2-Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-Serl0-Argl5-Serl7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinín, desPro2-SerlO-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, desPro2-SerlO-Argl5-AlaT7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinin, Serl0-Argl5-Alal7-Ašp24-Thr26-Glu31-Asn4l-Glu53-aprotinin,Serl0-Argl5-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, Serl0-Argl5-Serl7-Asn24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin, SerlO-Argl5-Alal7-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinin a Serl0-Argl5-Alal7-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-aprotinin.
- 6. Léčivo, obsahující jednu nebo několik variant aprotininu podle nároků 1 až 5 .
- 7. Použití variant aprotininu podle nároků 1 až 5 pro výrobu léčiv pro použití v chirurgii pro snížení ztrát krve, při polytraumatu, šoku a zánětech.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19629982A DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ236797A3 true CZ236797A3 (cs) | 1998-02-18 |
Family
ID=7800774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ972367A CZ236797A3 (cs) | 1996-07-25 | 1997-07-24 | Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, léčiva tyto látky obsahující a jejich použití |
Country Status (37)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6482798B2 (cs) |
| EP (1) | EP0821007B1 (cs) |
| JP (1) | JPH10101700A (cs) |
| KR (1) | KR980009283A (cs) |
| CN (1) | CN1172116A (cs) |
| AR (1) | AR008783A1 (cs) |
| AT (1) | ATE260975T1 (cs) |
| AU (2) | AU2870197A (cs) |
| BG (1) | BG101787A (cs) |
| BR (1) | BR9704068A (cs) |
| CA (1) | CA2207071A1 (cs) |
| CO (1) | CO4890857A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ236797A3 (cs) |
| DE (2) | DE19629982A1 (cs) |
| DZ (1) | DZ2276A1 (cs) |
| EE (1) | EE9700177A (cs) |
| ES (1) | ES2217350T3 (cs) |
| HN (1) | HN1997000094A (cs) |
| HR (1) | HRP970384A2 (cs) |
| HU (1) | HUP9701290A3 (cs) |
| ID (1) | ID17508A (cs) |
| IL (1) | IL121361A0 (cs) |
| MA (1) | MA24279A1 (cs) |
| NO (1) | NO973426L (cs) |
| NZ (1) | NZ328402A (cs) |
| PE (1) | PE92298A1 (cs) |
| PL (1) | PL321341A1 (cs) |
| RU (1) | RU2197983C2 (cs) |
| SG (1) | SG71714A1 (cs) |
| SK (1) | SK101997A3 (cs) |
| SV (1) | SV1997000068A (cs) |
| TN (1) | TNSN97130A1 (cs) |
| TR (1) | TR199700688A2 (cs) |
| TW (1) | TW480271B (cs) |
| UA (1) | UA55380C2 (cs) |
| YU (1) | YU31697A (cs) |
| ZA (1) | ZA976585B (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19725014A1 (de) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Bayer Ag | Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten |
| US6974188B2 (en) * | 2003-08-13 | 2005-12-13 | Cosco Management, Inc. | Chair with pivotable chair back |
| WO2006042327A2 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-20 | Large Scale Biology Corporation | Plant-produced recombinant aprotinin and aprotinin variants |
| US20060218667A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-09-28 | Vojdani Fakhrieh S | Plant-produced recombinant aprotinin and aprotinin variants |
| USD533000S1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-12-05 | Atico International Usa, Inc. | Connector housing of an anti-pinching device of a folding chair |
| RU2408605C2 (ru) * | 2005-02-18 | 2011-01-10 | Анджиокем Инк. | Полипептид, способный преодолевать гематоэнцефалический барьер, и его конъюгат |
| WO2008077478A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Preparation and use of variants of the kunitz domain 2 of the human placental bikunin gene |
| WO2008110301A1 (de) * | 2007-03-13 | 2008-09-18 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Aprotinin-varianten mit verbesserten eigenschaften |
| DE102007056231A1 (de) | 2007-09-08 | 2009-03-12 | Bayer Healthcare Ag | Herstellung und Verwendung von Varianten humander Kunitz-Typ Protease-Inhibitoren (hKTPI) |
| BRPI1103921A2 (pt) | 2011-08-17 | 2013-08-06 | Mahle Metal Leve Sa | camisa de cilindro e liga de ferro fundido |
| CN118613493A (zh) * | 2022-01-05 | 2024-09-06 | 螺旋纳米技术公司 | 包含α-因子前原序列的组合物及其用途 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU560584B2 (en) | 1983-07-28 | 1987-04-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Homologues of aprotinin |
| US4595974A (en) * | 1984-09-10 | 1986-06-17 | Burroughs Corporation | Base drive circuit for a switching power transistor |
| GB2208511A (en) | 1987-08-07 | 1989-04-05 | Bayer Ag | Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology |
| US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
| DK225488D0 (da) * | 1988-04-26 | 1988-04-26 | Novo Industri As | Polypeptid |
| DK463887D0 (da) | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
| DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| US5231010A (en) | 1989-09-13 | 1993-07-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof |
| DE3930522A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
| IL99585A0 (en) * | 1990-10-01 | 1992-08-18 | Novo Nordisk As | Aprotinin analogues,their production and pharmaceutical compositions containing them |
| JPH07509229A (ja) * | 1992-07-13 | 1995-10-12 | コルバス・インターナショナル、インコーポレイテッド | ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子Ｘａの阻害因子 |
| KR100199565B1 (ko) * | 1994-08-19 | 1999-06-15 | 차동천 | 승화형 감열전사 기록용 수용지의 중간층 제조방법 |
-
1996
- 1996-07-25 DE DE19629982A patent/DE19629982A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-06-20 HN HN1997000094A patent/HN1997000094A/es unknown
- 1997-07-14 ES ES97111980T patent/ES2217350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 DE DE59711356T patent/DE59711356D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-14 EP EP97111980A patent/EP0821007B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 AT AT97111980T patent/ATE260975T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-07-15 HR HR19629982.9A patent/HRP970384A2/xx not_active Application Discontinuation
- 1997-07-17 AU AU28701/97A patent/AU2870197A/en not_active Abandoned
- 1997-07-17 US US08/896,322 patent/US6482798B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-21 SV SV1997000068A patent/SV1997000068A/es unknown
- 1997-07-22 BG BG101787A patent/BG101787A/xx unknown
- 1997-07-22 CA CA002207071A patent/CA2207071A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-22 ID IDP972548A patent/ID17508A/id unknown
- 1997-07-22 JP JP9210197A patent/JPH10101700A/ja active Pending
- 1997-07-22 IL IL12136197A patent/IL121361A0/xx unknown
- 1997-07-23 DZ DZ970126A patent/DZ2276A1/fr active
- 1997-07-23 YU YU31697A patent/YU31697A/sh unknown
- 1997-07-23 NZ NZ328402A patent/NZ328402A/xx unknown
- 1997-07-23 AR ARP970103329A patent/AR008783A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-07-24 TW TW086110514A patent/TW480271B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-07-24 KR KR1019970034643A patent/KR980009283A/ko not_active Ceased
- 1997-07-24 TN TNTNSN97130A patent/TNSN97130A1/fr unknown
- 1997-07-24 EE EE9700177A patent/EE9700177A/xx unknown
- 1997-07-24 PE PE1997000661A patent/PE92298A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-07-24 MA MA24733A patent/MA24279A1/fr unknown
- 1997-07-24 UA UA97073949A patent/UA55380C2/uk unknown
- 1997-07-24 SK SK1019-97A patent/SK101997A3/sk unknown
- 1997-07-24 BR BR9704068A patent/BR9704068A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-07-24 ZA ZA9706585A patent/ZA976585B/xx unknown
- 1997-07-24 HU HU9701290A patent/HUP9701290A3/hu unknown
- 1997-07-24 NO NO973426A patent/NO973426L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-07-24 CZ CZ972367A patent/CZ236797A3/cs unknown
- 1997-07-24 SG SG1997002627A patent/SG71714A1/en unknown
- 1997-07-24 RU RU97112745/14A patent/RU2197983C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-07-25 PL PL97321341A patent/PL321341A1/xx unknown
- 1997-07-25 CO CO97042648A patent/CO4890857A1/es unknown
- 1997-07-25 TR TR97/00688A patent/TR199700688A2/xx unknown
- 1997-07-25 CN CN97115348A patent/CN1172116A/zh active Pending
-
2001
- 2001-06-06 AU AU51787/01A patent/AU762041B2/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-09-23 US US10/252,967 patent/US20030096752A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stubbs et al. | The three-dimensional structure of recombinant leech-derived tryptase inhibitor in complex with trypsin: implications for the structure of human mast cell tryptase and its inhibition | |
| KR100788219B1 (ko) | 혈소판 부착 차단용 단백질 | |
| FI94876C (fi) | Menetelmä aprotiniinin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikalla ja menetelmään soveltuva DNA, ilmentämisplasmidi ja isäntäsolu | |
| JP3345420B2 (ja) | 新規のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体 | |
| EP0339942A2 (en) | Aprotinin analogues and process for the production thereof | |
| EP0621869B1 (en) | Human kunitz-type protease inhibitor variants | |
| US5332804A (en) | High molecular weight human angiogenic basic fibroblast growth factors | |
| CZ236797A3 (cs) | Varianty aprotininu se zlepšenými vlastnostmi, léčiva tyto látky obsahující a jejich použití | |
| WO1992007935A1 (en) | Glycosaminoglycan-targeted fusion proteins, their design, construction and compositions | |
| KR0169976B1 (ko) | 재조합 아프로티닌 변형체, 균일하게 프로세싱된 아프로티닌 변형체의 미생물을 이용한 유전공학적 제조 방법 및 그의 치료 용도 | |
| US20060269536A1 (en) | Inhibitor proteins of a protease and use thereof | |
| JP2002503958A (ja) | 改良された特性をもつアプロチニン変異体およびアプロチニン変異体のビクニン | |
| US5707831A (en) | Process for preparing recombinant aprotinin and recombinant aprotinin variants having the natural N-terminal sequence | |
| US5188943A (en) | Method of producing high molecular weight human fibroblast growth factors | |
| NZ219608A (en) | Minactivin (urokinase-type plasminogen activator inhibitor) peptides, dna coding it and its production via recombinant dna methods | |
| US20110200541A1 (en) | Recombinant preparation of bromelain inhibitors and bromelain inhibitor precursor | |
| HK1008224A (en) | Aprotinin variants having improved properties | |
| US20060246046A1 (en) | Modified tridegins, production and use thereof as transglutaminase inihibitors | |
| MXPA97005605A (es) | Variantes de aprotinina con propiedades mejoradas | |
| JPWO2003066089A1 (ja) | メグシンリガンド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |