JPH10101700A - 改善された特性を有するアプロチニン変異体 - Google Patents
改善された特性を有するアプロチニン変異体Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 改善された酵素阻害的、免疫学的および薬物
動態的特性を有するアプロチニン変異体の提供。 【解決手段】 ｐＨ７で＋３〜−３の正味の荷電を有し
かつ結合領域にアミノ酸Ａｒｇ１５もしくはＡｒｇ１５
−Ａｌａ１７を有するアプロチニン変異体、およびこの
アプロチニン変異体のひとつ以上を含む医薬。
動態的特性を有するアプロチニン変異体の提供。 【解決手段】 ｐＨ７で＋３〜−３の正味の荷電を有し
かつ結合領域にアミノ酸Ａｒｇ１５もしくはＡｒｇ１５
−Ａｌａ１７を有するアプロチニン変異体、およびこの
アプロチニン変異体のひとつ以上を含む医薬。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は改善された酵素阻害的、
免疫学的および薬物動態的特性を有するアプロチニン変
異体およびそれらの調製法に関する。
免疫学的および薬物動態的特性を有するアプロチニン変
異体およびそれらの調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウシ膵トリプシンインヒビター（ＢＰＴ
Ｉ）ともまた呼ばれるアプロチニンは、クニッツ(Kunit
z)タイプのセリンプロテアーゼインヒビターファミリー
に属する。阻害可能なセリンプロテアーゼのスペクトル
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン
および血漿カリクレインを包含する（ゲプハルド(W. Ge
bhard)、チェッシェ(H. Tschesche)とフリッツ(H. Frit
z)、プロテアーゼ インヒビターズ(Protease Inhibito
rs)、バレット(Barrett)とサルヴェセン(Salvesen)
（編）、エルゼビア サイエンス パブリシング(Elsev
ier Science Publ.) BV 375-387、1986）。
Ｉ）ともまた呼ばれるアプロチニンは、クニッツ(Kunit
z)タイプのセリンプロテアーゼインヒビターファミリー
に属する。阻害可能なセリンプロテアーゼのスペクトル
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン
および血漿カリクレインを包含する（ゲプハルド(W. Ge
bhard)、チェッシェ(H. Tschesche)とフリッツ(H. Frit
z)、プロテアーゼ インヒビターズ(Protease Inhibito
rs)、バレット(Barrett)とサルヴェセン(Salvesen)
（編）、エルゼビア サイエンス パブリシング(Elsev
ier Science Publ.) BV 375-387、1986）。
【０００３】アプロチニンは58アミノ酸から成る。この
タンパク質の三次元構造はＸ線構造解析およびＮＭＲ分
光学の助けを借りて解明された（ウロダワー(Wlodawer)
ら、J. Mol. Biol. 198(3)、469-480、1987；ワグナー
(Wagner)ら、J. Mol. Biol. 196(1)、227-231、1987；
バーント(Berndt)ら、バイオケミストリー(Biochemistr
y) 32(17)、4564-4570、1993）。
タンパク質の三次元構造はＸ線構造解析およびＮＭＲ分
光学の助けを借りて解明された（ウロダワー(Wlodawer)
ら、J. Mol. Biol. 198(3)、469-480、1987；ワグナー
(Wagner)ら、J. Mol. Biol. 196(1)、227-231、1987；
バーント(Berndt)ら、バイオケミストリー(Biochemistr
y) 32(17)、4564-4570、1993）。
【０００４】トラシロール［Trasylol］（商標）の商品
名で、天然のアプロチニンは当初、膵炎の治療に採用さ
れた。トラシロール［Trasylol］（商標）は今日、心臓
外科手術で使用される。なぜなら、臨床試験が、アプロ
チニンでの治療がこのタイプの手術中の輸血の必要性を
有意に低下させかつ術後の出血の低減につながることを
示しているからである（ロイストン(D. Royston)、J. C
ardiothorac. Vasc. Anesth. 6; 76-100、1992）。
名で、天然のアプロチニンは当初、膵炎の治療に採用さ
れた。トラシロール［Trasylol］（商標）は今日、心臓
外科手術で使用される。なぜなら、臨床試験が、アプロ
チニンでの治療がこのタイプの手術中の輸血の必要性を
有意に低下させかつ術後の出血の低減につながることを
示しているからである（ロイストン(D. Royston)、J. C
ardiothorac. Vasc. Anesth. 6; 76-100、1992）。
【０００５】阻害特異性を規定する位置15のアミノ酸の
置換が改善された阻害特性を有する有用なアプロチニン
変異体につながることが示唆されている（ドイツ特許第
3 339 693号明細書）。導入されるアミノ酸に依存し
て、この方法で例えば膵からもしくは白血球からのエラ
スターゼを阻害する強力な阻害剤が産生され得る。
置換が改善された阻害特性を有する有用なアプロチニン
変異体につながることが示唆されている（ドイツ特許第
3 339 693号明細書）。導入されるアミノ酸に依存し
て、この方法で例えば膵からもしくは白血球からのエラ
スターゼを阻害する強力な阻害剤が産生され得る。
【０００６】アプロチニンおよび位置15の置換により産
生される変異体の阻害特性もまた、阻害されるべき標的
のプロテアーゼと阻害剤分子との間の接触領域中のさら
なるアミノ酸残基により決定されることも示唆されてい
る。これらはとりわけ、位置14、16、17、18、19、34、
38および39の付加的なアミノ酸残基を包含する。接触領
域のこの範囲のこれらのアミノ酸残基のひとつもしくは
それ以上の置換による改善された特性を有するアプロチ
ニン変異体が、とりわけ、例えば以下の特許出願すなわ
ちWO 89/01968、WO 89/10374、EP 0 307 592、EP 683 2
29に記述された。
生される変異体の阻害特性もまた、阻害されるべき標的
のプロテアーゼと阻害剤分子との間の接触領域中のさら
なるアミノ酸残基により決定されることも示唆されてい
る。これらはとりわけ、位置14、16、17、18、19、34、
38および39の付加的なアミノ酸残基を包含する。接触領
域のこの範囲のこれらのアミノ酸残基のひとつもしくは
それ以上の置換による改善された特性を有するアプロチ
ニン変異体が、とりわけ、例えば以下の特許出願すなわ
ちWO 89/01968、WO 89/10374、EP 0 307 592、EP 683 2
29に記述された。
【０００７】興味深いことに、当該物質の物理化学的特
性を規定するアミノ酸置換により、アプロチニンおよび
その変異体の薬物動態特性を改善することが可能であっ
た。
性を規定するアミノ酸置換により、アプロチニンおよび
その変異体の薬物動態特性を改善することが可能であっ
た。
【０００８】かように、当該分子の正味の正荷電を減少
させることにより、腎結合を有意に低下させることが可
能であった。このタイプの変異体は特許出願WO 92/0611
1に記述された。
させることにより、腎結合を有意に低下させることが可
能であった。このタイプの変異体は特許出願WO 92/0611
1に記述された。
【０００９】より良好な工業的調製可能性の理由から、
ある場合には当該阻害剤分子のＮ末端への修飾を実施す
ることが都合がよい。こうした修飾はＮ末端の短縮もし
くは伸長またはひとつもしくはそれ以上のアミノ酸の欠
失であり得る。Ｎ末端を修飾されたアプロチニン変異体
はEP 419 878に記述された。
ある場合には当該阻害剤分子のＮ末端への修飾を実施す
ることが都合がよい。こうした修飾はＮ末端の短縮もし
くは伸長またはひとつもしくはそれ以上のアミノ酸の欠
失であり得る。Ｎ末端を修飾されたアプロチニン変異体
はEP 419 878に記述された。
【００１０】
本発明によるアプロチニン変異体 本特許出願で開示されるアプロチニン変異体は以下の特
徴により区別される。
徴により区別される。
【００１１】すなわち、 １．活性の特性を改善するための、当該分子の活性中心
のひとつもしくはそれ以上のアミノ酸の置換 ２．免疫学的および薬物動態的特性を改善する目的によ
る、正味の正荷電を減少させるようなアミノ酸の置換 ３．工業的調製可能性の理由のためのＮ末端アミノ酸配
列の修飾。
のひとつもしくはそれ以上のアミノ酸の置換 ２．免疫学的および薬物動態的特性を改善する目的によ
る、正味の正荷電を減少させるようなアミノ酸の置換 ３．工業的調製可能性の理由のためのＮ末端アミノ酸配
列の修飾。
【００１２】挙げられる特徴のひとつのみをそれぞれ含
有するアプロチニン変異体は上に引用される特許出願に
記述された。本発明によるアプロチニン変異体は今や上
述の特徴の２個もしくは３個をそれらの分子構造中に併
せもつ。そのアミノ酸配列はいくつかの変異体の例とし
て図面中に示される。
有するアプロチニン変異体は上に引用される特許出願に
記述された。本発明によるアプロチニン変異体は今や上
述の特徴の２個もしくは３個をそれらの分子構造中に併
せもつ。そのアミノ酸配列はいくつかの変異体の例とし
て図面中に示される。
【００１３】本発明によるアプロチニン変異体は、しか
しながら、図１に指定される例に制限されない。本発明
によるアプロチニン変異体は、Ｎ末端伸長Ala(-2)-Gln
(-1)のある、位置２に天然のアミノ酸残基プロリンのあ
る、正の荷電をもつ他のアミノ酸の中性のもしくは負に
荷電したアミノ酸残基による置換のある、または、他の
中性アミノ酸の負に荷電したアミノ酸残基による置換の
ある、変異体もまた包含する。ここでのアミノ酸残基の
置換の選択は、生理学的ｐＨで、好ましくは＋２から−
２までの範囲の低減された正味の正荷電を有する物質を
産生するという方針に従う。Ｎ末端の伸長もしくは短縮
または欠失を包含する挙げられるアミノ酸配列での変化
は、相互にいずれかの所望される組み合わせで利用され
得る。本発明によるアプロチニン変異体は、かように上
述の特徴の組み合わせを含有し、かつ生理学的ｐＨで低
減された正味の正荷電を有する全ての化合物を包含す
る。
しながら、図１に指定される例に制限されない。本発明
によるアプロチニン変異体は、Ｎ末端伸長Ala(-2)-Gln
(-1)のある、位置２に天然のアミノ酸残基プロリンのあ
る、正の荷電をもつ他のアミノ酸の中性のもしくは負に
荷電したアミノ酸残基による置換のある、または、他の
中性アミノ酸の負に荷電したアミノ酸残基による置換の
ある、変異体もまた包含する。ここでのアミノ酸残基の
置換の選択は、生理学的ｐＨで、好ましくは＋２から−
２までの範囲の低減された正味の正荷電を有する物質を
産生するという方針に従う。Ｎ末端の伸長もしくは短縮
または欠失を包含する挙げられるアミノ酸配列での変化
は、相互にいずれかの所望される組み合わせで利用され
得る。本発明によるアプロチニン変異体は、かように上
述の特徴の組み合わせを含有し、かつ生理学的ｐＨで低
減された正味の正荷電を有する全ての化合物を包含す
る。
【００１４】驚くべきことに、挙げられる特徴の２個も
しくは３個の組み合わせは、個々の特徴の発現の獲得の
みならず、いくつかの場合にはその増強にさえつながる
ようである。さらに、例えば免疫学的、薬物動態的およ
び表面結合的な特性に関する有意の新規の物質特性を奏
することが可能であった。この新規変異体は、アプロチ
ニンを使用して産生されているヒトおよびウサギのポリ
クローナル抗血清との低下された反応を示す。この新規
変異体が、アプロチニンに比較して明白に低下された免
疫原性の挙動を有する、すなわち、それらが低下された
免疫応答を誘導することがさらに見出された。本発明に
よる変異体が、アプロチニンに比較して血球からのヒス
タミンのより低い放出を誘導することを示すことがさら
に可能であった。この新規変異体はアプロチニンに比較
して明白により低い腎への蓄積をさらに示す。酵素の速
度論的阻害定数（Ｋi値）は、当該分子本体の多数の変
化にもかかわらず、当該分子のより以前の変異に比較し
て驚くほど改善されている。
しくは３個の組み合わせは、個々の特徴の発現の獲得の
みならず、いくつかの場合にはその増強にさえつながる
ようである。さらに、例えば免疫学的、薬物動態的およ
び表面結合的な特性に関する有意の新規の物質特性を奏
することが可能であった。この新規変異体は、アプロチ
ニンを使用して産生されているヒトおよびウサギのポリ
クローナル抗血清との低下された反応を示す。この新規
変異体が、アプロチニンに比較して明白に低下された免
疫原性の挙動を有する、すなわち、それらが低下された
免疫応答を誘導することがさらに見出された。本発明に
よる変異体が、アプロチニンに比較して血球からのヒス
タミンのより低い放出を誘導することを示すことがさら
に可能であった。この新規変異体はアプロチニンに比較
して明白により低い腎への蓄積をさらに示す。酵素の速
度論的阻害定数（Ｋi値）は、当該分子本体の多数の変
化にもかかわらず、当該分子のより以前の変異に比較し
て驚くほど改善されている。
【００１５】本発明は、かように、ｐＨ７で＋３ないし
−３の正味の荷電を有しかつアミノ酸Arg15もしくはArg
15-Ala17をもつアプロチニン変異体に関する。好まれる
変異体は＋２ないし−２の正味の荷電を有するもの、と
りわけ好ましくは＋１ないし−１の荷電を有するもので
ある。
−３の正味の荷電を有しかつアミノ酸Arg15もしくはArg
15-Ala17をもつアプロチニン変異体に関する。好まれる
変異体は＋２ないし−２の正味の荷電を有するもの、と
りわけ好ましくは＋１ないし−１の荷電を有するもので
ある。
【００１６】これらのアプロチニン変異体は血漿カリク
レイン、組織カリクレインおよびプラスミンの阻害に適
する。
レイン、組織カリクレインおよびプラスミンの阻害に適
する。
【００１７】加えて、これらのアプロチニン変異体は修
飾されたＮ末端配列を有し得る。
飾されたＮ末端配列を有し得る。
【００１８】かように、Ｎ末端の伸長もしくは短縮をも
つ、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸をもつアプロチ
ニン変異体が意図される。
つ、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸をもつアプロチ
ニン変異体が意図される。
【００１９】好まれるアプロチニン変異体は、DesPro2-
Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-ア
プロチニン、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-
Asn41-Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser1
7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、DesP
ro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプ
ロチニンおよびDesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr2
6-Asn41-Glu53-アプロチニンから成る群に由来するもの
である。
Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-ア
プロチニン、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-
Asn41-Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser1
7-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、DesP
ro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプ
ロチニンおよびDesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr2
6-Asn41-Glu53-アプロチニンから成る群に由来するもの
である。
【００２０】これらのアプロチニン変異体は位置２にア
ミノ酸プロリンもまた持ち得る。
ミノ酸プロリンもまた持ち得る。
【００２１】本発明はまたこれらのアプロチニン変異体
のひとつもしくはそれ以上を含む医薬にも関する。
のひとつもしくはそれ以上を含む医薬にも関する。
【００２２】記述される新規のプロテアーゼ阻害剤は、
例えば心臓外科手術でもしくは移植医学での異種関節形
成関節置換でのような比較的複雑な外科手術法の結果と
してもまた血漿酵素系の活性化が広範囲のもしくは集中
的な血液の異種表面との接触により起こるような疾患状
態の治療に適する。
例えば心臓外科手術でもしくは移植医学での異種関節形
成関節置換でのような比較的複雑な外科手術法の結果と
してもまた血漿酵素系の活性化が広範囲のもしくは集中
的な血液の異種表面との接触により起こるような疾患状
態の治療に適する。
【００２３】当該阻害剤は増大された出血のリスクを伴
う手術（例えば心臓手術、骨および関節の外科手術）で
の血液損失を低減させる。それらは、ショック、多外傷
ならびに頭蓋および脳の外傷、敗血症、汎発性血管内凝
固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全症、リウマチ性関節障
害および喘息のようなカリクレイン系の関与をともなう
炎症性障害の症例の治療に適する。それらはプラスミン
の阻害により侵襲的な腫瘍の増殖および転移を防止す
る。そられはまた、ブラジキニン合成の阻害による痛み
および浮腫の療法、ならびに卒中の治療にもまた適す
る。それらは透析療法、ならびに、炎症性障害、凝固お
よび増大された出血のリスクを防止する人工器官にもま
た適する。
う手術（例えば心臓手術、骨および関節の外科手術）で
の血液損失を低減させる。それらは、ショック、多外傷
ならびに頭蓋および脳の外傷、敗血症、汎発性血管内凝
固症候群（ＤＩＣ）、多臓器不全症、リウマチ性関節障
害および喘息のようなカリクレイン系の関与をともなう
炎症性障害の症例の治療に適する。それらはプラスミン
の阻害により侵襲的な腫瘍の増殖および転移を防止す
る。そられはまた、ブラジキニン合成の阻害による痛み
および浮腫の療法、ならびに卒中の治療にもまた適す
る。それらは透析療法、ならびに、炎症性障害、凝固お
よび増大された出血のリスクを防止する人工器官にもま
た適する。
【００２４】本発明によるアプロチニン変異体の調製法 本発明によるアプロチニン変異体を調製するには、遺伝
子工学の方法を採用するのが都合がよい。習慣的な分子
生物学の方法を使用してこれを行うのに、それぞれの場
合で考慮されるアプロチニン変異体の合成のための遺伝
子工学的情報が、適する微生物発現生物体に導入され
る。組み換え微生物が醗酵され、適する条件の選択によ
り、異種遺伝情報が発現される。発現されたアプロチニ
ン変異体がその後、培養培地から得られる。
子工学の方法を採用するのが都合がよい。習慣的な分子
生物学の方法を使用してこれを行うのに、それぞれの場
合で考慮されるアプロチニン変異体の合成のための遺伝
子工学的情報が、適する微生物発現生物体に導入され
る。組み換え微生物が醗酵され、適する条件の選択によ
り、異種遺伝情報が発現される。発現されたアプロチニ
ン変異体がその後、培養培地から得られる。
【００２５】本発明によるアプロチニン変異体の産生に
適する宿主生物体は細菌、酵母もしくは真菌であり得
る。発現は細胞内的に、もしくは適する分泌系を使用し
て細胞外的に遂げられ得る。当該アプロチニン変異体は
正確にプロセシングされ得るか、またはペプチドもしく
はタンパク質に融合され得る。
適する宿主生物体は細菌、酵母もしくは真菌であり得
る。発現は細胞内的に、もしくは適する分泌系を使用し
て細胞外的に遂げられ得る。当該アプロチニン変異体は
正確にプロセシングされ得るか、またはペプチドもしく
はタンパク質に融合され得る。
【００２６】アプロチニン変異体の発現に適する系は、
EP 683 229、WO 89/02463、WO 90/10075および既に上で
挙げられたそれらの多様な他の特許出願に記述されてい
る。 発明を実施するための方法 酵素 使用される酵素（制限エンドヌクレアーゼ、仔ウシ小腸
からのアルカリフォスファターゼ、Ｔ4ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびＴ4 ＤＮＡリガーゼ）はベーリンガ
ー マンハイム(Boehringer Mannheim)およびギブコ(GI
BCO)／ＢＲＬから得られ、また、製造元の説明書に従っ
て使用された。
EP 683 229、WO 89/02463、WO 90/10075および既に上で
挙げられたそれらの多様な他の特許出願に記述されてい
る。 発明を実施するための方法 酵素 使用される酵素（制限エンドヌクレアーゼ、仔ウシ小腸
からのアルカリフォスファターゼ、Ｔ4ポリヌクレオチ
ドキナーゼおよびＴ4 ＤＮＡリガーゼ）はベーリンガ
ー マンハイム(Boehringer Mannheim)およびギブコ(GI
BCO)／ＢＲＬから得られ、また、製造元の説明書に従っ
て使用された。
【００２７】分子生物学的技術 例えば、大腸菌(E. coli)からのプラスミドＤＮＡの単
離（いわゆるミニプレップ）およびプラスミドＤＮＡで
の大腸菌(E. coli)の形質転換のようなルーチンのクロ
ーニング業務は、サンブルック(Sambrook)ら（モレキュ
ラー クローニング、コールド スプリング ハーバー
(Molecular Cloning Cold Spring Harbor)、1989）に従
って実施した。形質転換に採用された宿主生物体は大腸
菌(E. coli)株ＤＨ５α（ギブコ(GIBCO)／ＢＲＬ）であ
った。より大量のプラスミドＤＮＡを単離するために、
キアジェン(Qiagen)チップ（キアジェン(Qiagen)）を使
用した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出は、製
造元（ジェノメッド(Genomed)）の詳細に従いジェット
ソーブ(Jetsorb)の助けを借りて実施した。
離（いわゆるミニプレップ）およびプラスミドＤＮＡで
の大腸菌(E. coli)の形質転換のようなルーチンのクロ
ーニング業務は、サンブルック(Sambrook)ら（モレキュ
ラー クローニング、コールド スプリング ハーバー
(Molecular Cloning Cold Spring Harbor)、1989）に従
って実施した。形質転換に採用された宿主生物体は大腸
菌(E. coli)株ＤＨ５α（ギブコ(GIBCO)／ＢＲＬ）であ
った。より大量のプラスミドＤＮＡを単離するために、
キアジェン(Qiagen)チップ（キアジェン(Qiagen)）を使
用した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出は、製
造元（ジェノメッド(Genomed)）の詳細に従いジェット
ソーブ(Jetsorb)の助けを借りて実施した。
【００２８】「部位特異的突然変異誘発」実験のための
オリゴヌクレオチドならびにＰＣＲおよび配列決定反応
のためのプライマーは、アプライド バイオシステムズ
(Applied Biosystems)からの「380Ａ ＤＮＡ合成装
置」を使用して調製した。突然変異誘発実験は、ファル
マシア バイオテック(Pharmacia Biotech)からのキッ
ト（「ユニーク部位削除突然変異誘発」）を使用し、デ
ン(Deng)とニコロフ(Nickoloff)（デン(Deng)ら、Anal.
Biochem. 200、81-88、1992）の方法に従って実施し
た。全てのベクター構築物および突然変異誘発実験は、
「ＡＢＩ 373Ａシークェンサー」（アプライド バイ
オシステムズ(Applied Biosystems)）上での、蛍光ラベ
ルされたターミネーターを使用するTaq サイクルＤＮ
Ａ配列決定により確認した。
オリゴヌクレオチドならびにＰＣＲおよび配列決定反応
のためのプライマーは、アプライド バイオシステムズ
(Applied Biosystems)からの「380Ａ ＤＮＡ合成装
置」を使用して調製した。突然変異誘発実験は、ファル
マシア バイオテック(Pharmacia Biotech)からのキッ
ト（「ユニーク部位削除突然変異誘発」）を使用し、デ
ン(Deng)とニコロフ(Nickoloff)（デン(Deng)ら、Anal.
Biochem. 200、81-88、1992）の方法に従って実施し
た。全てのベクター構築物および突然変異誘発実験は、
「ＡＢＩ 373Ａシークェンサー」（アプライド バイ
オシステムズ(Applied Biosystems)）上での、蛍光ラベ
ルされたターミネーターを使用するTaq サイクルＤＮ
Ａ配列決定により確認した。
【００２９】サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyc
es cerevisiae)の形質転換 酵母細胞、例えば株ＪＣ34.4Ｄ（ＭＡＴα、ｕｒａ３−
52、ｓｕｃ２）を10mlのＹＥＰＤ（２％グルコース、２
％ペプトン、１％ディフコ(Difco)酵母抽出物）中で培
養し、そしてＯ．Ｄ．600nmが0.16ないし0.8で採集し
た。細胞を５mlの溶液Ａ（１Mソルビトール、10mMビシ
ンｐＨ8.35、３％エチレングリコール）で洗浄し、0.2m
lの溶液Ａに再懸濁し、そして−70℃で保存した。
es cerevisiae)の形質転換 酵母細胞、例えば株ＪＣ34.4Ｄ（ＭＡＴα、ｕｒａ３−
52、ｓｕｃ２）を10mlのＹＥＰＤ（２％グルコース、２
％ペプトン、１％ディフコ(Difco)酵母抽出物）中で培
養し、そしてＯ．Ｄ．600nmが0.16ないし0.8で採集し
た。細胞を５mlの溶液Ａ（１Mソルビトール、10mMビシ
ンｐＨ8.35、３％エチレングリコール）で洗浄し、0.2m
lの溶液Ａに再懸濁し、そして−70℃で保存した。
【００３０】プラスミドＤＮＡ（５μg）およびキャリ
ヤーＤＮＡ（ニシン精子からの50μg）を凍結細胞に添
加した。細胞をその後、37℃で５分間振とうすることに
より融解した。1.5mlの溶液Ｂ（40％ＰＥＧ 1000、200
mMビシンｐＨ8.35）の添加後、細胞を30℃で60分インキ
ュベーションし、1.5mlの溶液Ｃ（0.15M塩化ナトリウ
ム、10mMビシンｐＨ8.35）で洗浄し、そして100μl中に
再懸濁した。プレートに広げるの(plating-oout)を２％
アガーを含む選択培地上で実施した。形質転換体を30℃
で３日のインキュベーションの後に得た。
ヤーＤＮＡ（ニシン精子からの50μg）を凍結細胞に添
加した。細胞をその後、37℃で５分間振とうすることに
より融解した。1.5mlの溶液Ｂ（40％ＰＥＧ 1000、200
mMビシンｐＨ8.35）の添加後、細胞を30℃で60分インキ
ュベーションし、1.5mlの溶液Ｃ（0.15M塩化ナトリウ
ム、10mMビシンｐＨ8.35）で洗浄し、そして100μl中に
再懸濁した。プレートに広げるの(plating-oout)を２％
アガーを含む選択培地上で実施した。形質転換体を30℃
で３日のインキュベーションの後に得た。
【００３１】 醗酵のための栄養培地 １．ＳＤ２培地： バクト(Bacto)酵母窒素源 6.7g/l グルコース* 20g/l ＫＨ2ＰＯ4 6.7g/l ｐＨ6.0 ２．ＳＣ５培地： グルコース* 20g/l ディフコ(Difco)酵母抽出物 20g/l ＫＨ2ＰＯ4 6.7g/l (ＮＨ4)2ＳＯ4 2.0g/l ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ 1.0g/l 微量元素溶液ＳＬ４ 1.0ml/l ｐＨ6.0 微量元素溶液ＳＬ４： チトリプレックス(Titriplex)III 5g/l ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ 2g/l ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ 0.1g/l ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ 0.03g/l Ｈ3ＢＯ3 0.3g/l ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ 0.2g/l ＣｕＣｌ2×２Ｈ2Ｏ 0.01g/l ＮｉＣｌ2×６Ｈ2Ｏ 0.02g/l Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ 0.03g/l *＝別個にオートクレーブされる。
【００３２】 ３．醗酵槽培地： グルコース* 2.0g/l 大豆ペプトン 25.0g/l ＫＨ2ＰＯ4 1.4g/l ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ 1.0g/l 塩化チアミン 5.1mg/l イノシトール 20mg/l 微量元素溶液 ３ml/l ビタミン溶液 ３ml/l (ＮＨ4)2ＳＯ4 3.8g/l ｐＨ5.5 供給溶液： グルコース* 530g/l (ＮＨ4)2ＳＯ4 5.0g/l ＫＨ2ＰＯ4 2.9g/l ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ 3.8g/l 塩化チアミン 13mg/l イノシトール 70mg/l 微量元素溶液 6.8ml/l ビタミン溶液 6.8ml/l 微量元素溶液： ＦｅＣｌ2×６Ｈ2Ｏ 13.5g/l ＺｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ 2.0g/l Ｈ3ＢＯ3 0.5g/l ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ 2.0g/l ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ 1.9g/l Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ 2.0g/l ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ 1.0g/l 濃塩酸 100ml/l *＝別個にオートクレーブされる。
【００３３】 ビタミン溶液： リボフラビン 0.42g/l パントテン酸カルシウム 5.9g/l ニコチン酸 6.1g/l 塩酸ピリドキシン 1.7g/l ビオチン 0.06g/l 葉酸 0.04g/l 作業保存物の調製 ストック保存物を使用し、１l三角フラスコ中の200mlの
ＳＤ２培地に１％濃度に接種した。この培養系を振とう
器（260rpm）上で28℃で72時間インキュベーションし
た。各２mlをその後保存容器に満たしそして液体窒素中
で凍結させた。
ＳＤ２培地に１％濃度に接種した。この培養系を振とう
器（260rpm）上で28℃で72時間インキュベーションし
た。各２mlをその後保存容器に満たしそして液体窒素中
で凍結させた。
【００３４】振とう器フラスコでの醗酵 プレ培養系として、200mlのＳＤ２培地に１lフラスコ中
で作業保存物を１％に接種し、そして振とう器（260rp
m）上で28℃で72時間発酵させた。予備培養系を使用し
て、本培養系（１lフラスコ中200mlのＳＣ５培地）に１
％濃度に接種し、そして28℃で振とう器上、72〜96時間
インキュベーションした。
で作業保存物を１％に接種し、そして振とう器（260rp
m）上で28℃で72時間発酵させた。予備培養系を使用し
て、本培養系（１lフラスコ中200mlのＳＣ５培地）に１
％濃度に接種し、そして28℃で振とう器上、72〜96時間
インキュベーションした。
【００３５】10lバイオリアクターでの発酵 予備培養系として、200mlのＳＤ２培地に、１lフラスコ
中で作業保存物を１％濃度に接種し、そして振とう器
（260rpm）上で28℃で72時間発酵させた。10l醗酵槽中
の本培養系を、96時間の経過中、給餌されるバッチの発
酵として実施した。使用された栄養培地は醗酵槽培地で
あり、また、開始時の体積は７lであった。この醗酵槽
に200mlの予備培養系を接種した。
中で作業保存物を１％濃度に接種し、そして振とう器
（260rpm）上で28℃で72時間発酵させた。10l醗酵槽中
の本培養系を、96時間の経過中、給餌されるバッチの発
酵として実施した。使用された栄養培地は醗酵槽培地で
あり、また、開始時の体積は７lであった。この醗酵槽
に200mlの予備培養系を接種した。
【００３６】醗酵条件： 温度：28℃ 攪拌器の回転速度：500rpm 通気：10l/分 ｐＨ：5.5 上部空間圧：200mbar ７時間の醗酵時間の後、供給を開始した。供給速度は呼
吸指数（ＲＱ）（ＲＱ＝形成されるＣＯ2／消費される
酸素）を介して制御した。ＲＱが＞1.15の値に上昇する
場合は供給速度を低下させ、それが＜1.05の値に下落す
る場合は供給速度を増加させた。
吸指数（ＲＱ）（ＲＱ＝形成されるＣＯ2／消費される
酸素）を介して制御した。ＲＱが＞1.15の値に上昇する
場合は供給速度を低下させ、それが＜1.05の値に下落す
る場合は供給速度を増加させた。
【００３７】規則的な間隔で、サンプルを醗酵槽から取
り出し、そして細胞増殖を700nmでの吸光度の測定によ
り決定した。加えて、上清中のBay 19-8757の濃度を活
性測定により決定した。
り出し、そして細胞増殖を700nmでの吸光度の測定によ
り決定した。加えて、上清中のBay 19-8757の濃度を活
性測定により決定した。
【００３８】醗酵終了時に、ｐＨを50％（ｗ／ｖ）クエ
ン酸の添加により3.0に低下させ、そして醗酵槽を70℃
で10分間加熱した。細胞をその後、7,500×gでの遠心分
離により分離し、そして上清をタンパク質精製のため引
き渡した。
ン酸の添加により3.0に低下させ、そして醗酵槽を70℃
で10分間加熱した。細胞をその後、7,500×gでの遠心分
離により分離し、そして上清をタンパク質精製のため引
き渡した。
【００３９】タンパク質化学分析のための材料 配列分析は、アプライド バイオシステムズ(Applied B
iosystems)（フォースターシティ、ＵＳＡ）からのタン
パク質シークェンサー モデル473Ａを使用して実施し
た。標準的配列決定プログラムを使用した。シークェン
サー、様々な配列決定プログラムおよびＰＴＨ検出シス
テムは、操作の手引（タンパク質配列決定システム モ
デル473Ａ ユーザーズ マニュアル(1989)、アプライ
ド バイオシステムズ(Applied Biosystems)、フォスタ
ーシティ、ＣＡ94404、ＵＳＡ）に詳細に記述される。
iosystems)（フォースターシティ、ＵＳＡ）からのタン
パク質シークェンサー モデル473Ａを使用して実施し
た。標準的配列決定プログラムを使用した。シークェン
サー、様々な配列決定プログラムおよびＰＴＨ検出シス
テムは、操作の手引（タンパク質配列決定システム モ
デル473Ａ ユーザーズ マニュアル(1989)、アプライ
ド バイオシステムズ(Applied Biosystems)、フォスタ
ーシティ、ＣＡ94404、ＵＳＡ）に詳細に記述される。
【００４０】当該シークェンサーの操作のための試薬お
よびＰＴＨ検出のためのＨＰＬＣカラムはアプライド
バイオシステムズ(Applied Biosystems)から得た。
よびＰＴＨ検出のためのＨＰＬＣカラムはアプライド
バイオシステムズ(Applied Biosystems)から得た。
【００４１】ＨＰＬＣ分析は、ヒューレット パッカー
ド(Hewlett Packard)（ドイツ−ヴァルトブロン）から
のＨＰ 1090 ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。
バッカーボンド(Backerbond)（ドイツ−グロースゲラ
ウ）からのＲＰ−18 ＨＰＬＣカラム（250mm×4.6mm、
５μの材料、孔径300オングストローム）を分離に使用
した。
ド(Hewlett Packard)（ドイツ−ヴァルトブロン）から
のＨＰ 1090 ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。
バッカーボンド(Backerbond)（ドイツ−グロースゲラ
ウ）からのＲＰ−18 ＨＰＬＣカラム（250mm×4.6mm、
５μの材料、孔径300オングストローム）を分離に使用
した。
【００４２】キャピラリー電気泳動 モデル270Ａ−Ｈ
Ｔはアプライド バイオシステムズ(Applied Biosystem
s)（フォースターシティ、ＣＡ94404、ＵＳＡ）からで
あった。概して、サンプルは、様々な時間間隔で流体力
学的に注入した。使用されたキャピラリーカラム（50μ
m×72cm）はアプライド バイオシステムズ(Applied Bi
osystems)からであった。
Ｔはアプライド バイオシステムズ(Applied Biosystem
s)（フォースターシティ、ＣＡ94404、ＵＳＡ）からで
あった。概して、サンプルは、様々な時間間隔で流体力
学的に注入した。使用されたキャピラリーカラム（50μ
m×72cm）はアプライド バイオシステムズ(Applied Bi
osystems)からであった。
【００４３】アミノ酸分析はエッペンドルフ ビオトロ
ニク(Eppendorf Biotronik)（ドイツ−マインタール）
からのアミノ酸分析計 ＬＣ3000で実施した。ビオトロ
ニク(Biotronik)からのわずかに修正された標準的分離
プログラムを使用した。この分離プログラムおよび当該
分析計の機能は装置の手引に詳細に記述される。
ニク(Eppendorf Biotronik)（ドイツ−マインタール）
からのアミノ酸分析計 ＬＣ3000で実施した。ビオトロ
ニク(Biotronik)からのわずかに修正された標準的分離
プログラムを使用した。この分離プログラムおよび当該
分析計の機能は装置の手引に詳細に記述される。
【００４４】分子量はクラトス／シマヅ(Kratos/Shimad
zu)（ドイツ−デュイスブルク）からのＭＡＬＤＩ Ｉ
システムで測定した。ＳＤＳ電気泳動はファルマシア(P
harmacia)（ドイツ−フライブルク）からの電気泳動シ
ステムで実施した。
zu)（ドイツ−デュイスブルク）からのＭＡＬＤＩ Ｉ
システムで測定した。ＳＤＳ電気泳動はファルマシア(P
harmacia)（ドイツ−フライブルク）からの電気泳動シ
ステムで実施した。
【００４５】速度論的データの決定はＳＬＴ（ドイツ−
クライルスハイム）からのマイクロタイタープレートリ
ーダーで実施した。マイクロタイタープレートの洗浄は
ダイナテック(Dynatec)（ドイツ−デンケンドルフ）か
らの洗浄装置で実施した。
クライルスハイム）からのマイクロタイタープレートリ
ーダーで実施した。マイクロタイタープレートの洗浄は
ダイナテック(Dynatec)（ドイツ−デンケンドルフ）か
らの洗浄装置で実施した。
【００４６】酵素および基質はカルバイオケム(Calbioc
hem)（ドイツ−バードゾーデン）からであった。全ての
他の化学物質および試薬はメルク(Merck)（ドイツ−ダ
ルムシュタット）もしくはシグマ(Sigma)（ドイツ−ダ
イゼンホーフェン）からであった。96穴プレートはグラ
イナー(Greiner)より得た。
hem)（ドイツ−バードゾーデン）からであった。全ての
他の化学物質および試薬はメルク(Merck)（ドイツ−ダ
ルムシュタット）もしくはシグマ(Sigma)（ドイツ−ダ
イゼンホーフェン）からであった。96穴プレートはグラ
イナー(Greiner)より得た。
【００４７】ポリクローナルウサギ抗アプロチニン抗体
はウサギでのアプロチニンでの免疫により生じさせた。
ヒトポリクローナル抗アプロチニン抗体はアプロチニン
で治療した患者から生じた。
はウサギでのアプロチニンでの免疫により生じさせた。
ヒトポリクローナル抗アプロチニン抗体はアプロチニン
で治療した患者から生じた。
【００４８】タンパク質化学分析 Ｎ末端配列分析 水に溶解された１−３nmolのプロテアーゼ阻害剤を、ポ
リブレンとプレインキュベーションしたシークェンサー
シート上に負荷した。このタンパク質を迅速通常シーク
ェンサーサイクルを使用して配列決定した。ＰＴＨアミ
ノ酸を、50pmolのＰＴＨ標準品の助けを借りてオンライ
ンＨＰＬＣにより同定した。
リブレンとプレインキュベーションしたシークェンサー
シート上に負荷した。このタンパク質を迅速通常シーク
ェンサーサイクルを使用して配列決定した。ＰＴＨアミ
ノ酸を、50pmolのＰＴＨ標準品の助けを借りてオンライ
ンＨＰＬＣにより同定した。
【００４９】アミノ酸分析 200μgのタンパク質を200μlの６N塩酸に溶解し、そし
て166℃で１時間加水分解した。このサンプル約１nmol
をアミノ酸分析計に加えた。アミノ酸の量を５nmolの標
準品により決定した。
て166℃で１時間加水分解した。このサンプル約１nmol
をアミノ酸分析計に加えた。アミノ酸の量を５nmolの標
準品により決定した。
【００５０】ＳＤＳゲル電気泳動 ＳＤＳゲル電気泳動はレムリ(Laemmli)の条件に従って
実施した。10μgのプロテアーゼ阻害剤を10〜20％濃度
のＳＤＳゲルを使用して分析し、そして銀染色（メリル
(Merril)ら）により可視化した。
実施した。10μgのプロテアーゼ阻害剤を10〜20％濃度
のＳＤＳゲルを使用して分析し、そして銀染色（メリル
(Merril)ら）により可視化した。
【００５１】レムリ(U.K. Laemmli)、ネイチャー(Natur
e) 227、680-685(1970)。
e) 227、680-685(1970)。
【００５２】メリル(C.R. Merril)、デュナウ(M.L. Dun
au)、ゴールドマン(D. Goldmann)、Anal. Biochem. 10
0:201-207 (1981)。
au)、ゴールドマン(D. Goldmann)、Anal. Biochem. 10
0:201-207 (1981)。
【００５３】キャピラリー電気泳動 ８ngのプロテアーゼ阻害剤をガラスカラム（長さ72cm、
内径50μm）上でのキャピラリー電気泳動により調べ
た。条件：電流密度90μA、カラム温度25℃、100nMリン
酸緩衝液ｐＨ3.0、検出210nm、加圧下に３秒負荷する。
内径50μm）上でのキャピラリー電気泳動により調べ
た。条件：電流密度90μA、カラム温度25℃、100nMリン
酸緩衝液ｐＨ3.0、検出210nm、加圧下に３秒負荷する。
【００５４】逆相クロマトグラフィー ５nmolのプロテアーゼ阻害剤をベイカーボンド(Bakerbo
nd)のＲＰ−18 ＨＰＬＣカラム（５μの材料、4.6mm×
250mm、孔径300オングストローム）上でクロマトグラフ
ィーした。使用された溶出液はアセトニトリル／ＴＦＡ
濃度勾配であった。条件：流速0.7ml/分、カラム温度40
℃、検出40℃、溶媒Ａ 0.1％ＴＦＡ、溶媒Ｂ 0.1％Ｔ
ＦＡ／60％アセトニトリル、濃度勾配：０分０％Ｂ、10
分０％Ｂ、70分100％Ｂ、80分０％Ｂ。
nd)のＲＰ−18 ＨＰＬＣカラム（５μの材料、4.6mm×
250mm、孔径300オングストローム）上でクロマトグラフ
ィーした。使用された溶出液はアセトニトリル／ＴＦＡ
濃度勾配であった。条件：流速0.7ml/分、カラム温度40
℃、検出40℃、溶媒Ａ 0.1％ＴＦＡ、溶媒Ｂ 0.1％Ｔ
ＦＡ／60％アセトニトリル、濃度勾配：０分０％Ｂ、10
分０％Ｂ、70分100％Ｂ、80分０％Ｂ。
【００５５】分子量決定 １μgのプロテアーゼ阻害剤をＭＡＬＤＩ技術を使用し
て分析した。使用されたマトリックスはシナピン酸であ
った。質量較正のための標準タンパク質はウシインスリ
ン、チトクロームＣおよびメリチンであった。
て分析した。使用されたマトリックスはシナピン酸であ
った。質量較正のための標準タンパク質はウシインスリ
ン、チトクロームＣおよびメリチンであった。
【００５６】タンパク質含量 タンパク質含量はＢＣＡ法に従い測定される。この方法
では、Ｃｕ2+は存在するタンパク質により反応され、ビ
シンコニン酸と錯体を形成するＣｕ1+イオンを与える。
これは560nmで吸収する。
では、Ｃｕ2+は存在するタンパク質により反応され、ビ
シンコニン酸と錯体を形成するＣｕ1+イオンを与える。
これは560nmで吸収する。
【００５７】凍結乾燥されたタンパク質を平衡水分含量
とし、そして１mg/mlの濃度で0.9％塩化ナトリウム溶液
に溶解する。一連の希釈物を調製する。1000μlのＢＣ
Ａ試験試薬（ピアース(Pierce)）を50μlのサンプル溶
液に添加し、そして試験管を栓でしっかりと閉じ、さら
に60℃で正確に30分間インキュベーションする。氷浴中
で５分間このサンプルを冷却した後、測定を25℃の温度
および560nmの波長で実施する。
とし、そして１mg/mlの濃度で0.9％塩化ナトリウム溶液
に溶解する。一連の希釈物を調製する。1000μlのＢＣ
Ａ試験試薬（ピアース(Pierce)）を50μlのサンプル溶
液に添加し、そして試験管を栓でしっかりと閉じ、さら
に60℃で正確に30分間インキュベーションする。氷浴中
で５分間このサンプルを冷却した後、測定を25℃の温度
および560nmの波長で実施する。
【００５８】活性：（トリプシン阻害試験、滴定法によ
る） 活性を、修飾されたＦ．Ｉ．Ｐ．トリプシン阻害試験に
従って測定する。Bayy 19-8757は、トリプシンが触媒す
るＮα-ベンゾイル-Ｌ-アルギニンエチルエステル（Ｂ
ＡＥＥ）の加水分解を阻害する。この反応で遊離される
カルボキシル基をアルカリ滴定により測定する。トリプ
シンの残余の活性が活性化合物の阻害活性の尺度であ
る。
る） 活性を、修飾されたＦ．Ｉ．Ｐ．トリプシン阻害試験に
従って測定する。Bayy 19-8757は、トリプシンが触媒す
るＮα-ベンゾイル-Ｌ-アルギニンエチルエステル（Ｂ
ＡＥＥ）の加水分解を阻害する。この反応で遊離される
カルボキシル基をアルカリ滴定により測定する。トリプ
シンの残余の活性が活性化合物の阻害活性の尺度であ
る。
【００５９】凍結乾燥されたタンパク質を平衡水分含量
とし、１mg/mlの濃度で0.9％塩化ナトリウム溶液に溶解
し、そして一連の希釈物を調製する。２mlの緩衝液（20
0mM塩化カルシウムを含有する15mMホウ酸緩衝液、ｐＨ
8.0）および0.8mlのトリプシン溶液（２mg/ml）を１ml
のサンプル溶液に添加し、そしてこの混合物を25℃で５
分間インキュベーションする。0.2mlのＢＡＥＥ溶液
（6.8mg/ml）をその後添加し、そして水酸化カリウムの
消費を５分間の経過中に測定する。
とし、１mg/mlの濃度で0.9％塩化ナトリウム溶液に溶解
し、そして一連の希釈物を調製する。２mlの緩衝液（20
0mM塩化カルシウムを含有する15mMホウ酸緩衝液、ｐＨ
8.0）および0.8mlのトリプシン溶液（２mg/ml）を１ml
のサンプル溶液に添加し、そしてこの混合物を25℃で５
分間インキュベーションする。0.2mlのＢＡＥＥ溶液
（6.8mg/ml）をその後添加し、そして水酸化カリウムの
消費を５分間の経過中に測定する。
【００６０】ウサギもしくはヒトのポリクローナル抗ア
プロチニン抗体と当該プロテアーゼ阻害剤との交差反応
の測定 カップリング緩衝液に溶解された0.5〜10ngのプロテア
ーゼ阻害剤もしくはアプロチニンを、４℃で一夜マイク
ロタイタープレートに結合させた。穴を各回200μlの洗
浄緩衝液で４回洗浄し、そして100μlのブロッキング溶
液をその後添加した。このプレートにふたをし、そして
37℃で１時間インキュベーションした。上に記述される
ような洗浄の後、ポリクローナルウサギ抗アプロチニン
抗体（ＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ中0.2μg/ml）もしく
はポリクローナルヒト抗体（ＰＢＳ緩衝液中１％ＨＳＡ
中20μg/ml）を添加した。プレートにふたをし、そして
37℃で１時間インキュベーションし、さらにその後上に
記述されるように洗浄した。100μlのビオチニル化され
た抗ウサギもしくは抗ヒト抗体（25μl＋10mlのＰＢＳ
緩衝液中１％ＢＳＡもしくは１％ＨＳＡ）をその後添加
し、そしてこの混合物を37℃で１時間インキュベーショ
ンした。このプレートを上に記述されるように洗浄し、
そして100μlのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ
複合体（50μl＋10mlのＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡもし
くは１％ＨＳＡ）をその後、各穴に添加した。プレート
にふたをし、そして37℃で１時間インキュベーション
し、さらにその後上に記述されるように洗浄した。
プロチニン抗体と当該プロテアーゼ阻害剤との交差反応
の測定 カップリング緩衝液に溶解された0.5〜10ngのプロテア
ーゼ阻害剤もしくはアプロチニンを、４℃で一夜マイク
ロタイタープレートに結合させた。穴を各回200μlの洗
浄緩衝液で４回洗浄し、そして100μlのブロッキング溶
液をその後添加した。このプレートにふたをし、そして
37℃で１時間インキュベーションした。上に記述される
ような洗浄の後、ポリクローナルウサギ抗アプロチニン
抗体（ＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ中0.2μg/ml）もしく
はポリクローナルヒト抗体（ＰＢＳ緩衝液中１％ＨＳＡ
中20μg/ml）を添加した。プレートにふたをし、そして
37℃で１時間インキュベーションし、さらにその後上に
記述されるように洗浄した。100μlのビオチニル化され
た抗ウサギもしくは抗ヒト抗体（25μl＋10mlのＰＢＳ
緩衝液中１％ＢＳＡもしくは１％ＨＳＡ）をその後添加
し、そしてこの混合物を37℃で１時間インキュベーショ
ンした。このプレートを上に記述されるように洗浄し、
そして100μlのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ
複合体（50μl＋10mlのＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡもし
くは１％ＨＳＡ）をその後、各穴に添加した。プレート
にふたをし、そして37℃で１時間インキュベーション
し、さらにその後上に記述されるように洗浄した。
【００６１】基質の反応をＴＭＢ基質＋ペルオキシダー
ゼ溶液（１＋１；穴あたり100μl）で実施した。反応は
穴あたり100μlの２Mリン酸を使用して10分後に停止
し、そして吸収を450nmで測定した（対照570nm）。
ゼ溶液（１＋１；穴あたり100μl）で実施した。反応は
穴あたり100μlの２Mリン酸を使用して10分後に停止
し、そして吸収を450nmで測定した（対照570nm）。
【００６２】溶液： １．インキュベーション緩衝液：15nM炭酸ナトリウム、
35mM炭酸水素ナトリウム、ｐＨ9.6 ２．サンプル緩衝液：サンプルは適する濃度でインキュ
ベーション緩衝液に溶解した。
35mM炭酸水素ナトリウム、ｐＨ9.6 ２．サンプル緩衝液：サンプルは適する濃度でインキュ
ベーション緩衝液に溶解した。
【００６３】３．洗浄溶液：ＰＢＳ中0.1％（ｖ／ｖ）
トゥイーン(Tween) 20。
トゥイーン(Tween) 20。
【００６４】４．ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ中３％
（ｗ／ｖ）ＢＳＡもしくはＨＳＡ。
（ｗ／ｖ）ＢＳＡもしくはＨＳＡ。
【００６５】
実施例１ 組み換えDesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu3
1-Asn41-Glu53-アプロチニン分泌のための酵母発現ベク
ターの調製法 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニン遺伝子の調製に使用される出発材料
はDesPro2-Arg15-Ala17遺伝子であり、これを制限酵素H
indIIIおよびBamHIによりベクターｐＵＣ１８中にクロ
ーニングした。得られるベクター（ｐＥＭ6.6.Ｌ）を、
Ｕ．Ｓ．Ｅ．処置（ファルマシア バイオテック(Pharm
acia Biotech)）に従い、突然変異誘発プライマーＡお
よびScaI/MluIＵ．Ｓ．Ｅ．選択プライマーで二本鎖突
然変異誘発反応にかけた。突然変異誘発プライマーＡは
以下の配列を有した： プライマーＡ ５’ＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＡ
ＣＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＡＴＧ
ＧＡＡＡＣＴＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＡＧ３’。
1-Asn41-Glu53-アプロチニン分泌のための酵母発現ベク
ターの調製法 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニン遺伝子の調製に使用される出発材料
はDesPro2-Arg15-Ala17遺伝子であり、これを制限酵素H
indIIIおよびBamHIによりベクターｐＵＣ１８中にクロ
ーニングした。得られるベクター（ｐＥＭ6.6.Ｌ）を、
Ｕ．Ｓ．Ｅ．処置（ファルマシア バイオテック(Pharm
acia Biotech)）に従い、突然変異誘発プライマーＡお
よびScaI/MluIＵ．Ｓ．Ｅ．選択プライマーで二本鎖突
然変異誘発反応にかけた。突然変異誘発プライマーＡは
以下の配列を有した： プライマーＡ ５’ＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＡ
ＣＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＡＴＧ
ＧＡＡＡＣＴＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＡＧ３’。
【００６６】このプライマーはDesPro2-Arg15-Ala17ア
プロチニン遺伝子中に変異Asn41およびGlu53を創製す
る。このクローンの分析を酵素ScaIおよびSphIを使用す
る制限酵素切断により実施した。所望される配列はクロ
ーンｐＥＭ31.8.ＬのＤＮＡ配列決定により付加的に確
認した。この遺伝子（Ser10-Asp24-Thr26-Glu31）の
５’領域でのさらなる置換を、プライマーＢおよびｐＥ
Ｍ31.8.ＬプラスミドＤＮＡから開始する「逆24merＭ１
３」プライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借りて生
成した。プライマーＢは以下の配列を有した： プライマーＢ ５’ＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＧＧ
ＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＣＧＴＴＡＣ
ＴＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＧＴ
ＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＡＴＡＣＧＧＣ３’。XhoI
認識配列に下線が引かれる。
プロチニン遺伝子中に変異Asn41およびGlu53を創製す
る。このクローンの分析を酵素ScaIおよびSphIを使用す
る制限酵素切断により実施した。所望される配列はクロ
ーンｐＥＭ31.8.ＬのＤＮＡ配列決定により付加的に確
認した。この遺伝子（Ser10-Asp24-Thr26-Glu31）の
５’領域でのさらなる置換を、プライマーＢおよびｐＥ
Ｍ31.8.ＬプラスミドＤＮＡから開始する「逆24merＭ１
３」プライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借りて生
成した。プライマーＢは以下の配列を有した： プライマーＢ ５’ＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＧＧ
ＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＴＣＡＴＣＣＧＴＴＡＣ
ＴＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＧＴ
ＧＴＧＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＡＴＡＣＧＧＣ３’。XhoI
認識配列に下線が引かれる。
【００６７】ＰＣＲ混合物は、総体積100μl中に、20ng
のｐＥＭ31.8.ＬプラスミドＤＮＡ、20pmolの「逆24mer
Ｍ１３」プライマー、60pmolのプライマーＢ、200μMの
ｄＮＴＰｓ、１×ＰＣＲ反応緩衝液II（パーキン エル
マー(Perkin Elmer)）、４mM塩化マグネシウムおよび2.
5UのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン エルマー(Pe
rkin Elmer)）を含有した。「サイクル」条件は、94℃
で３分、各場合94℃で１分、55℃で１分および72℃で１
分そしてその後72℃で５分間インキュベーション、の30
サイクルであった。ＰＣＲ混合物を１：５に希釈し、そ
してベクターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitroge
n)）と連結した。この連結混合物を使用し、大腸菌(E.
coli)ＤＨ５α細胞を形質転換した。陽性のクローン
を、酵素XhoIおよびBamHIでの制限酵素切断後に同定
し、そしていくつかのクローンを配列決定した。クロー
ンｐＥＳ9.10.Ｌが、所望される配列を含有し、そして
さらなる研究に採用された。
のｐＥＭ31.8.ＬプラスミドＤＮＡ、20pmolの「逆24mer
Ｍ１３」プライマー、60pmolのプライマーＢ、200μMの
ｄＮＴＰｓ、１×ＰＣＲ反応緩衝液II（パーキン エル
マー(Perkin Elmer)）、４mM塩化マグネシウムおよび2.
5UのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン エルマー(Pe
rkin Elmer)）を含有した。「サイクル」条件は、94℃
で３分、各場合94℃で１分、55℃で１分および72℃で１
分そしてその後72℃で５分間インキュベーション、の30
サイクルであった。ＰＣＲ混合物を１：５に希釈し、そ
してベクターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitroge
n)）と連結した。この連結混合物を使用し、大腸菌(E.
coli)ＤＨ５α細胞を形質転換した。陽性のクローン
を、酵素XhoIおよびBamHIでの制限酵素切断後に同定
し、そしていくつかのクローンを配列決定した。クロー
ンｐＥＳ9.10.Ｌが、所望される配列を含有し、そして
さらなる研究に採用された。
【００６８】大腸菌(E. coli)／酵母シャトルベクター
（例えばｐＡ202）を酵母分泌ベクターの構築に使用し
た。このベクターでは、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-As
p24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの配列が酵
母α因子のプレプロ配列に連結される。
（例えばｐＡ202）を酵母分泌ベクターの構築に使用し
た。このベクターでは、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-As
p24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの配列が酵
母α因子のプレプロ配列に連結される。
【００６９】ベクターｐＡ202は大腸菌(E. coli)および
酵母のための選択可能なマーカー遺伝子としてアンピシ
リン耐性遺伝子（ｂｌａ）およびＵＲＡ３遺伝子をも
つ。このベクターのさらに不可欠な要素は、Ｃｏｌ Ｅ
１および２μ複製開始点（ｏｒｉ）である。ＲＥＰ３遺
伝子座もまたこの領域に位置する。1200bpのEcoRI-Hind
III断片が、ＭＦα１プロモーターおよび酵母α因子前
駆体タンパク質のＮ末端プレプロ配列をもつ（カージャ
ン(Kurjan)とヘルスコヴィッツ(Herskowitz)、セル(Cel
l) 30、933-943、1982）。修飾されたDesPro2-Arg15-ア
プロチニンｃＤＮＡのHindIII-BamHI断片としての導入
により、α因子プレプロ配列内のＫｅｘIIプロテアーゼ
の認識部位（「Lys-Arg」)を再度調製した（欧州特許EP
0 419 878号）。
酵母のための選択可能なマーカー遺伝子としてアンピシ
リン耐性遺伝子（ｂｌａ）およびＵＲＡ３遺伝子をも
つ。このベクターのさらに不可欠な要素は、Ｃｏｌ Ｅ
１および２μ複製開始点（ｏｒｉ）である。ＲＥＰ３遺
伝子座もまたこの領域に位置する。1200bpのEcoRI-Hind
III断片が、ＭＦα１プロモーターおよび酵母α因子前
駆体タンパク質のＮ末端プレプロ配列をもつ（カージャ
ン(Kurjan)とヘルスコヴィッツ(Herskowitz)、セル(Cel
l) 30、933-943、1982）。修飾されたDesPro2-Arg15-ア
プロチニンｃＤＮＡのHindIII-BamHI断片としての導入
により、α因子プレプロ配列内のＫｅｘIIプロテアーゼ
の認識部位（「Lys-Arg」)を再度調製した（欧州特許EP
0 419 878号）。
【００７０】DesPro2-Arg15-アプロチニン配列の３’端
に、当該ベクターは酵母ＵＲＡ３遺伝子のBamHI-SalI断
片をもち、これはこの位置で転写の終止シグナルとして
機能する（ヤーガー(Yarger)ら、Mol. Cell. Biol. 6、
1095-1101、1986）。
に、当該ベクターは酵母ＵＲＡ３遺伝子のBamHI-SalI断
片をもち、これはこの位置で転写の終止シグナルとして
機能する（ヤーガー(Yarger)ら、Mol. Cell. Biol. 6、
1095-1101、1986）。
【００７１】180bpのＤＮＡ断片を、ベクターｐＥＳ9.1
0.ＬからXhoIおよびBamHIで切り出し、アガロースゲル
電気泳動により精製し、そして、これもまたXhoIおよび
BamHIで切断されかつ脱リン酸化されたベクターｐＡ202
中にクローニングした。このクローニングにより、ベク
ターｐＡ202中のDesPro2-Arg15-アプロチニンがDesPro2
-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-
アプロチニンにより置き換えられる。酵母細胞（ＪＣ3
4.4Ｄ）をこのクローニングで生じるベクターｐＥＳ13.
10.Ｌを使用してクローニングした。
0.ＬからXhoIおよびBamHIで切り出し、アガロースゲル
電気泳動により精製し、そして、これもまたXhoIおよび
BamHIで切断されかつ脱リン酸化されたベクターｐＡ202
中にクローニングした。このクローニングにより、ベク
ターｐＡ202中のDesPro2-Arg15-アプロチニンがDesPro2
-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-
アプロチニンにより置き換えられる。酵母細胞（ＪＣ3
4.4Ｄ）をこのクローニングで生じるベクターｐＥＳ13.
10.Ｌを使用してクローニングした。
【００７２】例えば構造性のＧＡＰＤＨもしくは誘導性
のＧＡＬ 10プロモーターのような異なるプロモーター
をもつ他の大腸菌(E. coli)／酵母シャトルベクターが
類似の様式で調製され得、そしてDesPro2-Ser10-Arg15-
Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの
分泌にもまたつながり得る。
のＧＡＬ 10プロモーターのような異なるプロモーター
をもつ他の大腸菌(E. coli)／酵母シャトルベクターが
類似の様式で調製され得、そしてDesPro2-Ser10-Arg15-
Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの
分泌にもまたつながり得る。
【００７３】加えて、例えば染色体が自律複製する区分
（ａｒｓ）のような酵母の他の複製開始点をもつシャト
ルベクターを採用することももちろんまた可能である。
（ａｒｓ）のような酵母の他の複製開始点をもつシャト
ルベクターを採用することももちろんまた可能である。
【００７４】ＵＲＡ３遺伝子以外の適する選択可能なマ
ーカー遺伝子は、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ３もしくはＴ
ＲＰ１遺伝子のような、栄養要求性の酵母変異体を無機
栄養性とするのを手助けする遺伝子である。加えて、そ
れらの産物が例えばアミノグリコシドＧ４１８のような
様々な抗生物質に抵抗性を分け与える遺伝子ももちろん
また採用され得る。
ーカー遺伝子は、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ３もしくはＴ
ＲＰ１遺伝子のような、栄養要求性の酵母変異体を無機
栄養性とするのを手助けする遺伝子である。加えて、そ
れらの産物が例えばアミノグリコシドＧ４１８のような
様々な抗生物質に抵抗性を分け与える遺伝子ももちろん
また採用され得る。
【００７５】例えばメチル栄養性の酵母ピキア パスト
リス(Pichia pastoris)もしくはハンセヌラ ポリモル
ファ(Hansenula polymorpha)のような他の酵母もまた、
適するベクターでの形質転換の後、DesPro2-Ser10-Arg1
5-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン
を産生し得る。
リス(Pichia pastoris)もしくはハンセヌラ ポリモル
ファ(Hansenula polymorpha)のような他の酵母もまた、
適するベクターでの形質転換の後、DesPro2-Ser10-Arg1
5-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン
を産生し得る。
【００７６】実施例２ 天然のＮ末端配列「Arg-Pro-Asp」をもつ組み換えSer10
-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロ
チニンの分泌のための酵母発現ベクターの調製法天然の
Ｎ末端配列「Arg-Pro-Asp」をもつSer10-Arg15-Ala17-A
sp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの分泌を
可能にする酵母発現ベクターの調製のため、α因子のプ
レ配列をもつＭＦα１プロモーターおよびアプロチニン
遺伝子の５’末端（制限酵素XhoIの認識配列まで）を最
初にＰＣＲにより増幅しそしてクローニングした。使用
されたプライマーは以下の配列を有した： プライマーＣ： ５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡ
ＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧ３’。
-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロ
チニンの分泌のための酵母発現ベクターの調製法天然の
Ｎ末端配列「Arg-Pro-Asp」をもつSer10-Arg15-Ala17-A
sp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの分泌を
可能にする酵母発現ベクターの調製のため、α因子のプ
レ配列をもつＭＦα１プロモーターおよびアプロチニン
遺伝子の５’末端（制限酵素XhoIの認識配列まで）を最
初にＰＣＲにより増幅しそしてクローニングした。使用
されたプライマーは以下の配列を有した： プライマーＣ： ５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡ
ＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧ３’。
【００７７】EcoRV認識配列に下線がつけられる。
【００７８】プライマーＤ： ５’ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣ
ＴＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＡＡ
ＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡ
ＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＡＴＡＴ
Ｔ３’。
ＴＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＡＡ
ＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡ
ＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＡＴＡＴ
Ｔ３’。
【００７９】XhoI認識配列に下線がつけられる。
【００８０】ＰＣＲ混合物は、総体積50μl中に、200ng
のｐＡ202プラスミドＤＮＡ、0.2μMのプライマーＣ、
0.2μMのプライマーＤ、200μMのｄＮＴＰｓ、１×ＰＣ
Ｒ反応緩衝液11（ストラタジーン(Stratagene)、オプテ
ィ−プライム［Opti-Prime］（商標））および2.5UのTa
q ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン エルマー(PerkinEl
mer)）を含有した。「サイクル」条件は、94℃で１分、
各場合94℃で１分、50℃で１分および72℃で２分そして
その後72℃で５分間インキュベーション、の30サイクル
であった。ＰＣＲ混合物を１：５に希釈し、そしてベク
ターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitrogen)）と連
結した。この連結混合物を使用し、大腸菌(E. coli)Ｄ
Ｈ５α細胞を形質転換した。陽性のクローンを酵素EcoR
Iでの制限酵素切断後に同定し、そしていくつかのクロ
ーンを配列決定した。クローンｐＩＵ20.11.Ｌをさらな
る研究に採用した。
のｐＡ202プラスミドＤＮＡ、0.2μMのプライマーＣ、
0.2μMのプライマーＤ、200μMのｄＮＴＰｓ、１×ＰＣ
Ｒ反応緩衝液11（ストラタジーン(Stratagene)、オプテ
ィ−プライム［Opti-Prime］（商標））および2.5UのTa
q ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン エルマー(PerkinEl
mer)）を含有した。「サイクル」条件は、94℃で１分、
各場合94℃で１分、50℃で１分および72℃で２分そして
その後72℃で５分間インキュベーション、の30サイクル
であった。ＰＣＲ混合物を１：５に希釈し、そしてベク
ターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitrogen)）と連
結した。この連結混合物を使用し、大腸菌(E. coli)Ｄ
Ｈ５α細胞を形質転換した。陽性のクローンを酵素EcoR
Iでの制限酵素切断後に同定し、そしていくつかのクロ
ーンを配列決定した。クローンｐＩＵ20.11.Ｌをさらな
る研究に採用した。
【００８１】大腸菌(E. coli)／酵母シャトルベクター
ｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン(Invitrogen)）を、Se
r10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプ
ロチニン配列が酵母α因子プレ配列に直接連結される酵
母分泌ベクターの構築に使用した。ベクターｐＹＥＳ２
をまず、制限酵素SspIおよびBamHIで切断し、脱リン酸
化しそしてゲルで精製した。ベクターｐＹＥＳ２上に存
在するＧＡＬ１プロモーターおよびｆ１ ｏｒｉはこの
方法で除去される。約1030bpのＤＮＡ断片をベクターｐ
ＩＵ20.11.ＬからEcoRVおよびXhoIで切り出し、アガロ
ースゲル電気泳動により精製し、そしてベクターｐＥＳ
9.10.Ｌからの約180bpのXhoIおよびBamHIの断片と一緒
に、SspIおよびBamHIで切断されたベクターｐＹＥＳ２
中にクローニングした。この連結混合物を使用して大腸
菌(E. coli)ＤＨ５α細胞を形質転換した。陽性のクロ
ーンを同定しそして酵素XhoIでの制限酵素切断後に配列
を決定した。酵母細胞（ＪＣ34.4Ｄ）を、このクローニ
ングから生じるベクターｐＩＵ28.11.Ｌを使用して形質
転換した。発現ベクターｐＩＵ28.11.Ｌはもはやα因子
プロ配列を含有しないため、Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-
Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンのプロセシング
は、シグナルペプチダーゼにより独占的に起こり、ま
た、ＫｅｘIIプロテアーゼによる切断と独立である。
ｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン(Invitrogen)）を、Se
r10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプ
ロチニン配列が酵母α因子プレ配列に直接連結される酵
母分泌ベクターの構築に使用した。ベクターｐＹＥＳ２
をまず、制限酵素SspIおよびBamHIで切断し、脱リン酸
化しそしてゲルで精製した。ベクターｐＹＥＳ２上に存
在するＧＡＬ１プロモーターおよびｆ１ ｏｒｉはこの
方法で除去される。約1030bpのＤＮＡ断片をベクターｐ
ＩＵ20.11.ＬからEcoRVおよびXhoIで切り出し、アガロ
ースゲル電気泳動により精製し、そしてベクターｐＥＳ
9.10.Ｌからの約180bpのXhoIおよびBamHIの断片と一緒
に、SspIおよびBamHIで切断されたベクターｐＹＥＳ２
中にクローニングした。この連結混合物を使用して大腸
菌(E. coli)ＤＨ５α細胞を形質転換した。陽性のクロ
ーンを同定しそして酵素XhoIでの制限酵素切断後に配列
を決定した。酵母細胞（ＪＣ34.4Ｄ）を、このクローニ
ングから生じるベクターｐＩＵ28.11.Ｌを使用して形質
転換した。発現ベクターｐＩＵ28.11.Ｌはもはやα因子
プロ配列を含有しないため、Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-
Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンのプロセシング
は、シグナルペプチダーゼにより独占的に起こり、ま
た、ＫｅｘIIプロテアーゼによる切断と独立である。
【００８２】実施例３ サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)の醗酵 サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)の発現株を上に記述されるように醗酵させた。
e)の醗酵 サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)の発現株を上に記述されるように醗酵させた。
【００８３】実施例４ 中性のｐＨで正味の荷電のないアプロチニン誘導体の精
製 １．適する精製方法の概観 醗酵後、細胞を遠心分離により分離し、そして残る上清
を、残存する細胞を除去するため、濾過する。
製 １．適する精製方法の概観 醗酵後、細胞を遠心分離により分離し、そして残る上清
を、残存する細胞を除去するため、濾過する。
【００８４】細胞を含まない上清を濃クエン酸の添加に
よりｐＨ３に調整する。この溶液は、８mS/cmより小さ
い導電率を確立するために精製水で適切に希釈されなく
てはならない。その後、この溶液を陽イオン交換カラム
に適用する。このカラムは以前に酸性の緩衝液で平衡化
されている。未結合の物質を、開始する緩衝液での十分
な洗浄により除去する。生成物を塩濃度勾配の助けを借
りて溶出する。得られるフラクションを、逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびプロテア
ーゼ阻害を測定する生物学的活性試験の助けを借りて、
それらの生成物含量についてさらに調べる。当該生成物
を含有するフラクションを合わせ、そして調製的ＲＰ−
ＨＰＬＣカラムに直接適用する。このカラムは以前に酸
性の緩衝液で平衡化した。未結合のタンパク質を、開始
する緩衝液でカラムを洗浄することにより除去する。生
成物を有機溶媒の濃度勾配の助けを借りて溶出する。フ
ラクションを再度、既に上に記述されたようにそれらの
生成物含量についてさらに調べ、そして生成物を含有す
るフラクションを合わせる。達成される生成物の純度に
依存して、第二のＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で合わせられ
たフラクションを精製することが必要になるかもしれな
い。条件は既に記述されるそれらと本質的に同じであ
る。得られる生成物溶液を注入目的のために水で希釈
し、そして適する量に分配しそして凍結乾燥する。
よりｐＨ３に調整する。この溶液は、８mS/cmより小さ
い導電率を確立するために精製水で適切に希釈されなく
てはならない。その後、この溶液を陽イオン交換カラム
に適用する。このカラムは以前に酸性の緩衝液で平衡化
されている。未結合の物質を、開始する緩衝液での十分
な洗浄により除去する。生成物を塩濃度勾配の助けを借
りて溶出する。得られるフラクションを、逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびプロテア
ーゼ阻害を測定する生物学的活性試験の助けを借りて、
それらの生成物含量についてさらに調べる。当該生成物
を含有するフラクションを合わせ、そして調製的ＲＰ−
ＨＰＬＣカラムに直接適用する。このカラムは以前に酸
性の緩衝液で平衡化した。未結合のタンパク質を、開始
する緩衝液でカラムを洗浄することにより除去する。生
成物を有機溶媒の濃度勾配の助けを借りて溶出する。フ
ラクションを再度、既に上に記述されたようにそれらの
生成物含量についてさらに調べ、そして生成物を含有す
るフラクションを合わせる。達成される生成物の純度に
依存して、第二のＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で合わせられ
たフラクションを精製することが必要になるかもしれな
い。条件は既に記述されるそれらと本質的に同じであ
る。得られる生成物溶液を注入目的のために水で希釈
し、そして適する量に分配しそして凍結乾燥する。
【００８５】上に記述される方法と組み合わせられ得
る、中性のｐＨで正味の荷電のないアプロチニン誘導体
の他の精製方法は、セファロースに固定されたトリプシ
ン上のアフィニティクロマトグラフィーおよびゲル浸透
クロマトグラフィーである。
る、中性のｐＨで正味の荷電のないアプロチニン誘導体
の他の精製方法は、セファロースに固定されたトリプシ
ン上のアフィニティクロマトグラフィーおよびゲル浸透
クロマトグラフィーである。
【００８６】２．DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Th
r26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの精製 10lの醗酵からの材料を以下の過程に従い精製した。醗
酵が完了した後、醗酵槽の内容物を濃クエン酸を使用し
てｐＨ３に調整し、そして70℃で10分間加熱した。細胞
をその後遠心分離（15分、7500×ｇ、ヘリーオス(Herae
us)遠心分離器）により除去し、そして得られた上清を
濾過した（８μmないし0.2μm、ミリポア(Millipore)、
ドイツ）。この段階から、上清はさらなる使用まで−18
℃で凍結することにより保存され得る。当該溶液をその
後、精製水の添加により８mS/cmより小さい導電率まで
希釈し、そしてＳＰ−セファロース ＦＦカラム（ファ
ルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）に適用した。こ
のカラムは以前に50mMクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液、ｐＨ３で平衡化されていた。未結合のタンパク質を
同じ緩衝液で集中的に洗浄することにより除去した。生
成物をその後、塩濃度勾配（１M塩化ナトリウム）の助
けを借りて溶出した。得られるフラクションを、逆相高
速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ４）の
助けを借りて、およびプロテアーゼ阻害活性を試験する
ことにより、それらの生成物含量について調べた。所望
される生成物を含有するフラクションを合わせた。
r26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの精製 10lの醗酵からの材料を以下の過程に従い精製した。醗
酵が完了した後、醗酵槽の内容物を濃クエン酸を使用し
てｐＨ３に調整し、そして70℃で10分間加熱した。細胞
をその後遠心分離（15分、7500×ｇ、ヘリーオス(Herae
us)遠心分離器）により除去し、そして得られた上清を
濾過した（８μmないし0.2μm、ミリポア(Millipore)、
ドイツ）。この段階から、上清はさらなる使用まで−18
℃で凍結することにより保存され得る。当該溶液をその
後、精製水の添加により８mS/cmより小さい導電率まで
希釈し、そしてＳＰ−セファロース ＦＦカラム（ファ
ルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）に適用した。こ
のカラムは以前に50mMクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝
液、ｐＨ３で平衡化されていた。未結合のタンパク質を
同じ緩衝液で集中的に洗浄することにより除去した。生
成物をその後、塩濃度勾配（１M塩化ナトリウム）の助
けを借りて溶出した。得られるフラクションを、逆相高
速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ４）の
助けを借りて、およびプロテアーゼ阻害活性を試験する
ことにより、それらの生成物含量について調べた。所望
される生成物を含有するフラクションを合わせた。
【００８７】生成物溶液をその後、まず、以前に0.1％
トリフルオロ酢酸／水で平衡化されていたＲＰ−ＨＰＬ
Ｃカラム（ソース(Source) 15ＲＰＣ、ファルマシア(P
harmacia)、スウェーデン））に直接適用した。未結合
のタンパク質を同じ緩衝液で集中的に洗浄することによ
り除去した。生成物を直線的アセトニトリル濃度勾配
（０〜70％）の助けを借りて溶出した。得られたフラク
ションを再度、上に記述された方法を使用して生成物含
量について調べ、そし生成物を含有したそれらを合わせ
た。
トリフルオロ酢酸／水で平衡化されていたＲＰ−ＨＰＬ
Ｃカラム（ソース(Source) 15ＲＰＣ、ファルマシア(P
harmacia)、スウェーデン））に直接適用した。未結合
のタンパク質を同じ緩衝液で集中的に洗浄することによ
り除去した。生成物を直線的アセトニトリル濃度勾配
（０〜70％）の助けを借りて溶出した。得られたフラク
ションを再度、上に記述された方法を使用して生成物含
量について調べ、そし生成物を含有したそれらを合わせ
た。
【００８８】最終的な精製のために、生成物を含有する
溶液を注入目的のため水で希釈し、そして第二のＲＰ−
ＨＰＬＣカラム（ヴァイダック(Vydac) Ｃ８、ヴァイ
ダック(Vydac)、ＵＳＡ）に適用した。このカラムは以
前に0.1％トリフルオロ酢酸／水で平衡化されていた。
未結合のタンパク質を同じ緩衝液で集中的に洗浄するこ
とにより除去した。生成物を直線的アセトニトリル濃度
勾配（０〜70％）の助けを借りて溶出した。得られたフ
ラクションを再度、上に記述された方法を使用して生成
物含量について調べ、そして生成物を含有したそれらを
合わせた。
溶液を注入目的のため水で希釈し、そして第二のＲＰ−
ＨＰＬＣカラム（ヴァイダック(Vydac) Ｃ８、ヴァイ
ダック(Vydac)、ＵＳＡ）に適用した。このカラムは以
前に0.1％トリフルオロ酢酸／水で平衡化されていた。
未結合のタンパク質を同じ緩衝液で集中的に洗浄するこ
とにより除去した。生成物を直線的アセトニトリル濃度
勾配（０〜70％）の助けを借りて溶出した。得られたフ
ラクションを再度、上に記述された方法を使用して生成
物含量について調べ、そして生成物を含有したそれらを
合わせた。
【００８９】得られた生成物溶液を注入目的のため水で
希釈し、適する量（20、10、１および0.2mg）に分配
し、凍結乾燥しそして分析した。
希釈し、適する量（20、10、１および0.2mg）に分配
し、凍結乾燥しそして分析した。
【００９０】実施例５ DesPro-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-G
lu53-アプロチニンを使用するヒト血漿カリクレインの
Ｋiの決定 １単位のヒト血漿カリクレインを緩衝液（0.05Mトリス
／0.1M塩化ナトリウム、0.05％トゥイーン(Tween) 2
0；ｐＨ8.2）で16mlに希釈した。この酵素溶液200μl
を、低減する体積の試験緩衝液（250、240、230、220、
200、180、170、150、100および50μl）と混合し、そし
てその後アッセイ緩衝液中の増加する量の阻害剤を添加
した（10、20、30、50、70、80、100、150、200および2
50μl；濃度0.7μg/μl）。
lu53-アプロチニンを使用するヒト血漿カリクレインの
Ｋiの決定 １単位のヒト血漿カリクレインを緩衝液（0.05Mトリス
／0.1M塩化ナトリウム、0.05％トゥイーン(Tween) 2
0；ｐＨ8.2）で16mlに希釈した。この酵素溶液200μl
を、低減する体積の試験緩衝液（250、240、230、220、
200、180、170、150、100および50μl）と混合し、そし
てその後アッセイ緩衝液中の増加する量の阻害剤を添加
した（10、20、30、50、70、80、100、150、200および2
50μl；濃度0.7μg/μl）。
【００９１】酵素／阻害剤溶液を室温で４時間プレイン
キュベーションした。各溶液180μlをその後マイクロタ
イタープレートの穴に添加し、そして20μlの基質溶液
と混合した。吸収の変化を405nmで10分間測定した。酵
素反応速度を測定し、そしてＫi値をこれからビース(Bi
eth)の方法（バイオケミカル メディシン(Biochemical
Medicine) 32:387-97(1984)）に従って算出した。
キュベーションした。各溶液180μlをその後マイクロタ
イタープレートの穴に添加し、そして20μlの基質溶液
と混合した。吸収の変化を405nmで10分間測定した。酵
素反応速度を測定し、そしてＫi値をこれからビース(Bi
eth)の方法（バイオケミカル メディシン(Biochemical
Medicine) 32:387-97(1984)）に従って算出した。
【００９２】基質ストック溶液：ＤＭＳＯ中0.1M 基質溶液： アッセイ緩衝液中１×10-3M Ｓ-23
02 アッセイ緩衝液： 0.05Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、0.1M塩化ナトリウム、0.05％トゥイーン
(Tween) 20、ｐＨ8.2、ベンジルアルコール１ml/l 酵素プラスミン、第XIa因子、ウシトリプシンおよびキ
モトリプシンとの複合体形成の速度論的定数を同じ処置
により決定した。基質は、プラスミンについてクロモジ
ムＰＬ、第XI因子についてＨＤ-Pro-Phe-Arg-pＮＡ、ト
リプシンについてＳ−2444、およびキモトリプシンにつ
いてSuc-Phe-Leu-Phe-pＮＡであった。
02 アッセイ緩衝液： 0.05Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、0.1M塩化ナトリウム、0.05％トゥイーン
(Tween) 20、ｐＨ8.2、ベンジルアルコール１ml/l 酵素プラスミン、第XIa因子、ウシトリプシンおよびキ
モトリプシンとの複合体形成の速度論的定数を同じ処置
により決定した。基質は、プラスミンについてクロモジ
ムＰＬ、第XI因子についてＨＤ-Pro-Phe-Arg-pＮＡ、ト
リプシンについてＳ−2444、およびキモトリプシンにつ
いてSuc-Phe-Leu-Phe-pＮＡであった。
【００９３】実施例６ DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニンのタンパク質化学的特徴づけの結果 プロテアーゼ阻害剤DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-
Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンを、遺伝子工学
により修飾された酵母生物体による分泌により調製し
た。それを、様々なクロマトグラフィー過程により酵母
上清から均一になるまで精製した。クローニングされた
配列をもつ阻害剤の同一性を以下のタンパク質分析的研
究により示す。
Glu53-アプロチニンのタンパク質化学的特徴づけの結果 プロテアーゼ阻害剤DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-
Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンを、遺伝子工学
により修飾された酵母生物体による分泌により調製し
た。それを、様々なクロマトグラフィー過程により酵母
上清から均一になるまで精製した。クローニングされた
配列をもつ阻害剤の同一性を以下のタンパク質分析的研
究により示す。
【００９４】Ｎ−末端配列分析 当該プロテアーゼ阻害剤を57段階にわたり完全に配列決
定した。以下の一覧は決定されたタンパク質の配列を示
す。これはクローニングされた配列と同一である。
定した。以下の一覧は決定されたタンパク質の配列を示
す。これはクローニングされた配列と同一である。
【００９５】
【表１】
【００９６】DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-
Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの57段階にわたる配列
分析。
Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの57段階にわたる配列
分析。
【００９７】アミノ酸分析 アミノ酸分析はタンパク質の特徴づけの重要な定量的パ
ラメータである。タンパク質含量のほかに、既知の一次
構造の場合には個々のアミノ酸の数が決定される。DesP
ro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu5
3-アプロチニンのアミノ酸分析は一次構造からの理論値
とよい一致にある（表１）。
ラメータである。タンパク質含量のほかに、既知の一次
構造の場合には個々のアミノ酸の数が決定される。DesP
ro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu5
3-アプロチニンのアミノ酸分析は一次構造からの理論値
とよい一致にある（表１）。
【００９８】表１ DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニンのアミノ酸分析、残基数はAla＝7に
基づく。
Glu53-アプロチニンのアミノ酸分析、残基数はAla＝7に
基づく。
【００９９】 アミノ酸 残基数 理論値 CysSO3H 5.28 6 Asp 6.27 6 Thr 3.49 4 Ser 1.58 2 Glu 4.25 4 Gly 6.16 6 Ala 7.00 7 Val 0.98 1 Met 1.10 1 Ile 1.66 2 Leu 1.89 2 Tyr 2.49 3 Phe 4.11 4 Lys 1.05 1 Arg 4.73 5 Pro 3.23 3 *) システインおよびメチオニンは過ギ酸酸化により決
定された（Metはメチオニンスルホンとして） 逆相クロマトグラフィー 化学的に結合された逆相上のタンパク質のＨＰＬＣクロ
マトグラフィーでは、使用される相への結合はタンパク
質の疎水的相互作用を介して起こる。タンパク質は固定
相へのそれらの結合の強さに従って有機溶媒（移動相）
により置き換えられる。この理由のため、この方法はタ
ンパク質の純度の評価についてのよい基準である。DesP
ro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu5
3-アプロチニンはＲＰ−18相から単一ピークとして溶出
する。単離されたプロテアーゼ阻害剤が非常に清浄であ
ることが示された。
定された（Metはメチオニンスルホンとして） 逆相クロマトグラフィー 化学的に結合された逆相上のタンパク質のＨＰＬＣクロ
マトグラフィーでは、使用される相への結合はタンパク
質の疎水的相互作用を介して起こる。タンパク質は固定
相へのそれらの結合の強さに従って有機溶媒（移動相）
により置き換えられる。この理由のため、この方法はタ
ンパク質の純度の評価についてのよい基準である。DesP
ro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu5
3-アプロチニンはＲＰ−18相から単一ピークとして溶出
する。単離されたプロテアーゼ阻害剤が非常に清浄であ
ることが示された。
【０１００】ＣＥクロマトグラフィー キャピラリー電気泳動は、電場でのペプチドおよびタン
パク質の荷電に基づくそれらの分離を可能にする。この
場合の分離の質は使用される緩衝液、ｐＨ、温度および
添加物に依存する。採用されるキャピラリーは50〜100
μmの内径を有するいわゆる「溶融シリカ」カラムであ
る。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-As
n41-Glu53-アプロチニンを電場中、「溶融シリカ」カラ
ム上で分離した。電気泳動パターンは幅の狭いピークを
示す。
パク質の荷電に基づくそれらの分離を可能にする。この
場合の分離の質は使用される緩衝液、ｐＨ、温度および
添加物に依存する。採用されるキャピラリーは50〜100
μmの内径を有するいわゆる「溶融シリカ」カラムであ
る。DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-As
n41-Glu53-アプロチニンを電場中、「溶融シリカ」カラ
ム上で分離した。電気泳動パターンは幅の狭いピークを
示す。
【０１０１】分子量決定 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニンの分子量は、ＭＡＬＤＩ技術を使用
して6223ダルトンであると決定された。この場合、測定
された分子量は、測定方法の正確さの限度内の6215ダル
トンの理論値とよい一致にある。シナピン酸がマトリッ
クスとして採用された。
Glu53-アプロチニンの分子量は、ＭＡＬＤＩ技術を使用
して6223ダルトンであると決定された。この場合、測定
された分子量は、測定方法の正確さの限度内の6215ダル
トンの理論値とよい一致にある。シナピン酸がマトリッ
クスとして採用された。
【０１０２】ＳＤＳゲル電気泳動 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニンをＳＤＳ電気泳動により還元および
非還元の条件下で分析した。それは約6.5kDの範囲のバ
ンドを示す。
Glu53-アプロチニンをＳＤＳ電気泳動により還元および
非還元の条件下で分析した。それは約6.5kDの範囲のバ
ンドを示す。
【０１０３】実施例７ 酵素のDesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-
Asn41-Glu53-アプロチニンとの複合体形成のｋi値の測
定 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニンの阻害定数を様々な酵素について測
定した。表２はｋi値を示す。
Asn41-Glu53-アプロチニンとの複合体形成のｋi値の測
定 DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニンの阻害定数を様々な酵素について測
定した。表２はｋi値を示す。
【０１０４】表２：DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-
Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの、酵素血漿カ
リクレイン、第XIa因子、ウシキモトリプシンおよびウ
シトリプシンとの複合体形成の阻害定数 実施例８ 当該プロテアーゼ阻害剤のウサギもしくはヒトのポリク
ローナル抗アプロチニン抗体との相互作用 組み換え法により調製されたプロテアーゼ阻害剤を、ウ
サギもしくはヒトのポリクローナル抗アプロチニン抗体
を使用して、それらの交差反応性についてさらに調べ
た。様々なプロテアーゼ阻害剤の変異体はアプロチニン
抗血清と非常に弱い相互作用を示すのみであることが見
出された。
Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンの、酵素血漿カ
リクレイン、第XIa因子、ウシキモトリプシンおよびウ
シトリプシンとの複合体形成の阻害定数 実施例８ 当該プロテアーゼ阻害剤のウサギもしくはヒトのポリク
ローナル抗アプロチニン抗体との相互作用 組み換え法により調製されたプロテアーゼ阻害剤を、ウ
サギもしくはヒトのポリクローナル抗アプロチニン抗体
を使用して、それらの交差反応性についてさらに調べ
た。様々なプロテアーゼ阻害剤の変異体はアプロチニン
抗血清と非常に弱い相互作用を示すのみであることが見
出された。
【０１０５】なお、本発明の主要な特徴もしくは態様を
以下に挙げる。
以下に挙げる。
【０１０６】１．ｐＨ７で＋３ないし−３の正味の荷電
を有しかつ結合領域にアミノ酸Arg15もしくはArg15-Ala
17をもつアプロチニン変異体。
を有しかつ結合領域にアミノ酸Arg15もしくはArg15-Ala
17をもつアプロチニン変異体。
【０１０７】２．セリンプロテアーゼ阻害のための上記
１によるアプロチニン変異体。
１によるアプロチニン変異体。
【０１０８】３．修飾されたＮ末端配列を有する上記１
もしくは上記２によるアプロチニン変異体。
もしくは上記２によるアプロチニン変異体。
【０１０９】４．Ｎ末端の伸長もしくは短縮を有する
か、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸を有する、上記
１もしくは上記２によるアプロチニン変異体。
か、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸を有する、上記
１もしくは上記２によるアプロチニン変異体。
【０１１０】５．DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Th
r26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-
Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、
DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr2
6-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-Ar
g15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-アプロチニン、Se
r10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプ
ロチニン、Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu5
3-アプロチニン、Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu3
1-Asn41-Glu53-アプロチニン、Ser10-Arg15-Ala17-Thr2
6-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンおよびSer10-Arg15-
Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-アプロチニンからなる
群からのアプロチニン変異体。
r26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-
Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、
DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-
Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr2
6-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニン、DesPro2-Ser10-Ar
g15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-アプロチニン、Se
r10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-アプ
ロチニン、Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu5
3-アプロチニン、Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu3
1-Asn41-Glu53-アプロチニン、Ser10-Arg15-Ala17-Thr2
6-Glu31-Asn41-Glu53-アプロチニンおよびSer10-Arg15-
Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-アプロチニンからなる
群からのアプロチニン変異体。
【０１１１】６．上記の１ないし５によるアプロチニン
変異体のひとつもしくはそれ以上を含む薬物。
変異体のひとつもしくはそれ以上を含む薬物。
【０１１２】７．外科手術、血液損失の低減、ならびに
多外傷、ショックおよび炎症での使用の薬物の産生のた
めの上記の１ないし５によるアプロチニン変異体の使
用。
多外傷、ショックおよび炎症での使用の薬物の産生のた
めの上記の１ないし５によるアプロチニン変異体の使
用。
【０１１３】
出願人：バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 発明の名称：改善された特性を有するアプロチニン変異
体 整理番号：９７０６０９５ 出願日：平成９年７月２２日 優先権番号：１９６２９９８２.９ 優先日：平成８年７月２５日 配列の数：５ 配列番号１： 配列の長さ：６９ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ 起源： 生物名：プライマーＡ 配列： GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAG ACTGCATGGA AACTTGCGGT 60 GGTGCTTAG 69 配列番号２： 配列の長さ：９３ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：プライマーＢ 配列： TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT CTACGATGCA 60 ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTCGTATAC GGC 93 配列番号３： 配列の長さ：３８ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源： 生物名：プライマーＣ 配列： GGGATATCTA TTGATAAGAT TTAAAGGTAT TTGACAAG 38 配列番号４： 配列の長さ：９９ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：プライマーＤ 配列： GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA AGACAGCAGT 60 GAAAATAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAATC GTTTATATT 99 配列番号５： 配列の長さ：５７ 配列の型： アミノ酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：アプロチニン変異体 配列： Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala 1 5 10 15 Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30 Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45 Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
体 整理番号：９７０６０９５ 出願日：平成９年７月２２日 優先権番号：１９６２９９８２.９ 優先日：平成８年７月２５日 配列の数：５ 配列番号１： 配列の長さ：６９ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ 起源： 生物名：プライマーＡ 配列： GGCTGCAGAG CTAACCGTAA CAACTTCAAA TCCGCGGAAG ACTGCATGGA AACTTGCGGT 60 GGTGCTTAG 69 配列番号２： 配列の長さ：９３ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：プライマーＢ 配列： TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT CTACGATGCA 60 ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTCGTATAC GGC 93 配列番号３： 配列の長さ：３８ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源： 生物名：プライマーＣ 配列： GGGATATCTA TTGATAAGAT TTAAAGGTAT TTGACAAG 38 配列番号４： 配列の長さ：９９ 配列の型： ヌクレオチド 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：プライマーＤ 配列： GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA AGACAGCAGT 60 GAAAATAGAT GGAATCTCAT TCTTTTAATC GTTTATATT 99 配列番号５： 配列の長さ：５７ 配列の型： アミノ酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：アプロチニン変異体 配列： Arg Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala 1 5 10 15 Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe 20 25 30 Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu 35 40 45 Asp Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55
【図１】本発明に従う特定のアプロチニン変異体をアミ
ノ酸の一文字記号で表したアミノ酸配列図。
ノ酸の一文字記号で表したアミノ酸配列図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 キエルド・ノリス デンマーク・デイケイ−2900ヘレルプ・ア ールマンスアレ34 (72)発明者 ビゴ・デイネス デンマーク・デイケイ−2900シヤルロツテ ンルンド・コレギーハベン32 (72)発明者 レイフ・ノルクスコブ−ラウリツツエン デンマーク・デイケイ−4733タツパーノ エ・ストランドバイエン80 (72)発明者 ニールス・デイール・クリステンセン デンマーク・デイケイ−2300コペンハーゲ ン エス・コングボルマースベイ８
Claims (2)
- 【請求項１】 ｐＨ７で＋３ないし−３の正味の荷電を
有しかつ結合領域にアミノ酸Arg15もしくはArg15-Ala17
を有するアプロチニン変異体。 - 【請求項２】 請求項１記載のアプロチニン変異体のひ
とつもしくはそれ以上を含む医薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19629982.9 | 1996-07-25 | ||
| DE19629982A DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10101700A true JPH10101700A (ja) | 1998-04-21 |
Family
ID=7800774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9210197A Pending JPH10101700A (ja) | 1996-07-25 | 1997-07-22 | 改善された特性を有するアプロチニン変異体 |
Country Status (37)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6482798B2 (ja) |
| EP (1) | EP0821007B1 (ja) |
| JP (1) | JPH10101700A (ja) |
| KR (1) | KR980009283A (ja) |
| CN (1) | CN1172116A (ja) |
| AR (1) | AR008783A1 (ja) |
| AT (1) | ATE260975T1 (ja) |
| AU (2) | AU2870197A (ja) |
| BG (1) | BG101787A (ja) |
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| CO (1) | CO4890857A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ236797A3 (ja) |
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| ES (1) | ES2217350T3 (ja) |
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| HU (1) | HUP9701290A3 (ja) |
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| US6974188B2 (en) * | 2003-08-13 | 2005-12-13 | Cosco Management, Inc. | Chair with pivotable chair back |
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