CZ264092A3 - Recombinant virus of chicken-pox - Google Patents

Description

Tento vynález se týká rekombinantního viru drůbežích neštovic (PPV), specifických vektorů, nových silných promotorů, nových hostitelských kmenů PPV a také způsobu rekombinantní přípravy proteinů.

lb lb

Dosavadní stav techniky

Vir drůbežích neštovic, typický člen virů ptačích neštovic, má typickou strukturu neštovicového viru. Molekulová hmota virového genomu je oiýíadována na 200 až 240 000 000.

Neštovice ptáků, i když ; . jsou celosvětově rozšířeny, nejsou považovány za obecný zdravotní problém, protože oblast hostitelů virů ptačích neštovic je omezena na ptáky, a vylučuje savce. Po infekci hostitele začíná replikace virové DNA, po syntéze časných proteinů, mezi 60 a 96 hodinami po infekci a následuje syntéza pozdních proteinů. K sestavení infekčních virionů dochází mezi 72 a 96 .hodinami.

K růstu PPV v tkáňové kultuře buněk dochází u fibro- . blastových buněk kuřecího zárodku (CEP), u kožních (dermálních) buněk kuřecího zárodku a u fibroblastových buněk kachního zárodku (DÍEP). Virový, cyklus je v tkáňové kultuře podobný a zdá se být v kultuře rychlejší než u ptáků. V buňkách. GED začíná replikace DNA mezi 12 a 16 hodinou, infekční virové částice se objevují poprvé po 16 hodinách a jejich počet stoupá giž do 48 hodin po infekci.

Pro virus vakcínie (W), typický člen viru skupiny neštovic, (Panicali a Paoletti: Proč. Nati. Acad. Sci., 79.

4927 až 4931 (1982) a také Mackett a spol.í Proč. Nati.

Acad. Sci. 79« 7415 až 7419 (19θ2).) byla podle uvedených citací vyvinuta I známá {technika | jako . in vivo rekombinace, která umožňuje inzerci cizí DNA do genomu viru vakcínie místně specifickou rekombinací. Tato technika vede k v

- 2 — použití viru vakcínie jako eulcary o tického expresního vek- ·-toru pro vytvoření živých rekombinantních vakcín. Konstrukce rekombinantních virů. neštovis se obvykle provádí insercí cizích genů do oblastí virového genomu, které nejsou podstatné pro růst v buněčné kultuře. Fro rekombinantní viry vakcínie je takovým nepodstatným místem (NES) gen thymidinkinasy (tk), který navíc umožňuje výběr tk-negativních rekombinantních virů.

Při konstruování rekombinantního PPV se používají stejné zásady jako jsou ty, které jsou popsány u rekombinantního viru vakcínie. Je popsáno několik nepodstatných míst zahrnují cí gen thymidinkinasy viru drůbežích neštovic u kmene EFV-M3 (Boyle a Coupar: PCT/srpen 1987: 00323» Boyle a Coupař: Virus Res. 10, 343 (1988)··), oblast s fragmentem PvuII o 900 párech nukleotidů přírodního viru kmene PP-1 (Taylor a spol.: Vaccine 6, 4-97 až 503 a 503 až 5θ8 (1988).) á intergenová oblast mezi otevřenou čtecí oblastí orf 7a otevřenou čtecí oblastí orf 9 (Drillien a spol.: Virology 160, 203 až'209 (1987), Spehner a spol.: J. Virol. 64,

527 až 533 (1990).).

V nedávné době několik skupin popsalo konstrukci rekombinantů PPV. Noboru a spol. popisují v evropském patentu 284 416 četná genomová insertní místa, která nejsou podstatná' pro růst PPV v tkáňové kultuře. Paoletti popisuje v PCT/WO 89/03429 vektory pro přípravu PPV rekombinantů. Objevili expresí genů kódujících cizí antigeny pod kontrolou různých promotorů vakcínie. Dále pak Binns a spol. v PCT/WO 90/04633 popisují četné PFV promotory používající dočasnou analýzu s β-galaktosidasou. Dreillen a Spehner popisují v v evropském patentu č. 314 569 konstrukci PPV rekombi,ant)Sů obsahujících gen, který ' íkoduje spálový P protein za kontroly promotorem vakcínie. Tento gen byl vložen do PFV genomu v místě, které není podstatné pro růst v tkáňové kultuře.

Cohen a Panicalli v PCT/W0-90/02191 popisují rekombinantní vir drůbežích neštovic, který je schopen expresí poskytovat imunogenní protein pathogenů. Tento rekombinantní PPV poskytuje živou vakcínu pro drůbež a další zvířata.

Podstata vynálezu

Autoři tohoto vynálezu si uvědomili, že přítomnost neporušeného genu thimidin-kinasy je v PPV kmenu HP1.441 potřebná pro to, aby se získaly stabilní rekombinanty s předpověditelnými genomy.

Až do dnešní doby nebylo vědecky objasněno do jakého rozsahu je tk-gen podstatný pro různé PPV-kmeny. Pro překonání této nejistoty autoři tohoto vynálezu zkoumali další místa pro vložení cizí DNA. Zjistili, že intergenová oblast ajézi neporušeným tk-genem a 3'otevřenpu čtecí oblastí je výhodným místem pro insercí. Podle tohoto vynálezu se získávají také nové PPV hostitelské kmeny, které byly modifikovány tak, aby obsahovaly thymidin-kinasový gen viru vakcínie a lacZ gen E.coli, jako nové ne-podstatné místo. Tím je umožněno použít jakýkoliv insertní plasmid, který nese oblasti obklopující tk viru vakcínie. Podle tohoto vynálezu se také získávají nové silné promotory a četné výhodné plasmidové konstrukce.

Aby se ukázaly výhody podle tohoto vynálezu, byly zkonstruovány PPV insertní plasmidy, které jako místo inserce genu cizího markéru používají buč neporušený gen virové thymidin-kinasy nebo intergenovou oblast mezi neporušeným tkgenem a 5'otevřenou čtecí oblastí. Analýza genomových struktur rekombinantů odvozených od obou typů pokusů ukázala, že stabilní rekombinanty s předpověditelnými genomy byly získány pouze v přítomnosti neporušeného genu thymidinkinasy. Tento výsledek jasně ukazuje, že PPV tk-gen je podstatný ve své celistvosti pro růst viru v buněčné kultuře.

pPP-ÚV2 a pPP-UV2-PT. Zkratky mají následující významy: PPV-tkznamená gén thymidin-kinasy viru drůbežích neštovic,

W-tk znamená gen thymidin-kinasy viru. vakcínie, Pil znamená promotor hlavního pozdního polypeptidú viru vakcínie o molekulové hmotě 11 000, P7.5 znamená polypeptid viru vakcínie

- o molekulové hmotě 7 500, lacZ znamená E.coli gen kódující ί» β-galaktosidasu (šipky označují směry transkripce).

. * Obrázky 2A až 20: Southernova blotová analýza PPV rekombinantů odvozených od insertního plasmidu pPP-UV2-PT. Celková DNA byla připravena z infektovaných buněk, rozštěpena působením EcoRI, oddělena na 1% agarosovém gelu a přenesena na nitrocelulosovou membránu. Membrána byla hybridizována ,^²P značenou.PPV tk-genovou sondou (obr. 2A), lacZ genovou sondou (obr. 2B) a protrombinovou genovou sondou (obr, 20). Pásy 1 až 5 ve všech obrázcích znamenají DNA z PPV rekombinantní f-PTl-blue v různých stadiích čištění plaku (5., 5.» 7·, 9. a 11. kolo). Pás 6 ukazuje jiný isolát, f-PT2-blue. Pásy 7, 8 a 9 ukazují isoláty PPV přírodního a dvou nezávislých bílých plaků (f-PT-white 1 a 2). Jako negativní kontrola jev pásu 10 uvedena fibroblastová DNA kuřecího zárodku, špička šipky na obrázku 2A směřuje na pás PPV přírodního tk-genu. Hodnoty uvedené na pravé straně odpovídají standardům v párech nukleotidů (pn).

Obrázek 5á: Struktura tk-místa přírodního a mutovaného viru. Jsou ukázána umístění PPV tk-genu ve fragmentu EcoRI o 5500 párech nukleotidů a ve fragmentu BamHI/Clal o 2480 párech nukleotidů (Jediné místo Ncol ve středu kódující oblasti tk-genu bylo použito pro zkonstruování insertního vektoru pPP-DV2.), Bezprostředně po směru vlákna tk-genu byla intergenová oblast modifikována a zvětšena oligonukleotidem řízenou mutagenesí. Zůstalo tak 5'orf a samotný tk. b -gen neporušeny. Současně byl zaveden transkripční stop signál a několik vhodných restrikčních míst.

Obrázek 53: Sekvence PPV přírodního typu a modifikované intergenová oblasti. Modifikovaná intergenová oblast je přítomna v rekombiantním plasmidu pTKm a v jeho derivátech.

Obrázek 4A a 4B: Konstrukce PPV insertních plasmidu

- 5 pTKmsPll-gpt, pTKm-VVtka a pTKm-VVtkb. Podrobnosti konstrukce jsou popsány v experimentální části. sPll znamená syntetický pozdní promotor viru vakcínie odvozený od promotoru hlavního pozdního polypeptidu vakcínie o molekulové hmotě 11 000, 3' orf znamená otevřenou čtecí odast po směru vlákna tk-genu viru drůbežích neštovie, gpt znamená E.coli gen kódující enzym xanthin-guanin-fosforibosyl-transferasu.

Další zkratky znamenají stejně jako je to shora uvedeno v popisu obrázku 1. Šipky označují směr transkripce.

Oblast 5í Southernova blotová analýza DNA rozštěpené působením EcoRI ekombinantů f-sPllč.l a PPV přírodního typu virové DNA. A): Blot je hybridizován PPV tk-genovou sondou. Pás 1 znamená DNA PPV rekombinantů f-sPll č.l, pás 2 znamená DNA PPV přírodního typu viru HP1.441, pás 3 znamená lambda DNA rozštěpenou působením Hind III. B): Blot byl hybridizován sondou gpt-genu. Pás 1 znamená lambda DNA rozštěpenou působením Hind III, pás 2 znamená DNA PPV rekombinantů f-sPll č.l, pás 3 znamená DNA PPV přírodního typu viru HP1.441. C) : Blot byl hybridizován sondami lacZ genu a fágové lambda DNA. Pás 1 znamená lambda DNA rozštěpenou působením HindlII, pás 3 znamená DNA PPV přírodního typu viru HP1.441,. a pás 2 znamená DNA PPV rekombinantu f-sPll č.l (Hodnoty uvedené na pravé straně znamenají standardy v párech nukleotidů (pn>).

Obrázeky 6A až 60: Southernova blotová analýza DNA FPV rekombinantů f-TK2a a f-TK2b. Bloty byly hybridizovány sondou PPV tk-genu (obrázek 6A), sondou W-tk-genu (obrázek 6B) a sondou lacZ genu a lamda DNA (obrázek 60). Pásy 1 znamenají PPV přírodní DNA (HP1.441) rozštěpenou působením Pstl, pásy 2 znamenají f-TK2a DNA'rozštěpenou působením Pstl, pásy 3 znamenají f-TK2b DNA rozštěpenou působením Pstl. pásy 4 znamenají FPV DNA přírodního typu (HP1.441) rozštěpenou působením Clal, |ásy 5 znamenají f-TE2a DNA rozštěpenou působením Clal, pásy 6 znamenají f-TK2b DNA rozštěpenou působením Clal, pásy 7 znamenají PPV DNA přírodního typu (HP1.441) rozštěpenou působením EcoRI, pásy 8 znamenají f-TK2á DNA rozštěpenou působením EcoRI, pásy 9 znamenají

- 6 f-TK2b DNArozštěpenou působením EcoEI, pásy 10 znamenají ’ markerovou DNA, pásy 11 znamenají pTKm-Wtka DNA rozštěpenou působením EcoRI, pásy 12 znamenají pTKm-VVSkb DNA rozštěpenou působením EcoRI, pásy 15 znamenají pTKm-Wtka DNA rozštěpenou působením Glal, pásy 14 znamenají pTKm-Wtkb DNA rozštěpenou působením Glal a pásy 15 znamenají pTKm-VVfcka DNA rozštěpenou působením Pstl.

Obrázek 6D: Jsou uvedeny restrikční mapy štěpení hostitelského kmene f-TK2a viru drůbežích neštovic enzymy EcoEI, Pstl a Glal. Čísla označuji předpokládanou velikost fragmentů v tisících párů nukleotidů (pn). PPV-tk znamená gen thymidin-kinasy viru drůbežích neštovic, W-tk znamená gen thymidin-kinasy viru vakcínie^ sPll znamená syntetický Pil promotor, lacZ znamená E. coli lacZ gen a šipky označují směr transkripce.

Obrázek SS: Na tomto obrázku jsou uvedeny restrikční mapy štěpení hostitelského kmene F-TK2b viru drůbežích neštovic enzymy EcoEI, Pstl a Clal. Další informace a zkratky jsou uvedeny v popisu obrázku 6D.

Obrázek 7: Schematické znázornění oblasti kolem místa PFV thymidin-kinasy (tk) přírodního typu viru a nových PFV hostitelských kmenů f-TK2a a f-TK2b. PPV hostitelské kmeny vložily do intergenové oblasti mezi PPV tk-gen a 5'-otevřenou čtecí oblast (orf) dva nové inserty, tk-gen viru vakcínie (W-tk) a lacZ gen E.coli (lacZ). Šipky označují směs transkripce příslušných genů.

Obrázek 8: Konstrukční schéma promotorové části plasmidů pEP-Zl a pFP-Z2I. Tyto plasmidy byly zkonstruovány tak, jak je to uvedeno v grafu a jak je to popsáno v experimentální části. PPV-tk znamená gen thymidin-kinasy viru drůbežích neštovic, P7.5 znamená promotor genu proteinu viru vakcínie o molekulové hmotě 7 5θθ» PH znamená promotor genu polypeptidů viru vakcínie o molekulové hmotě 11 000, ssDNA znamená jednovláknovou DNA a šipky označují směr transkripce.

- 7 Obrázek 9: Schéma konstrukce insertních plasmidů viru vakcínie pTZgpt-P2a a PTZgpt-P2b. Podrobnosti konstrukce jsou uvedeny v grafu a popsány v experimentální čgtsti. Část použitých zkratek je uvedena v popisu obrázku 1, gpt znamená gen kódující E. coli xanthin-guanin-fosforibosyltransferasu a šipky označují směr transkripce.

Obrázek 10f: Sekvence PPV P2 promotoru a prvních deset kodonů genu P2. Zbytek A iniciačního kodonu (tučným typem) byl definován jako poloha +1. V polohách -6 až -2 je přítomna střední část sekvence pozdního promotoru viru vakcínie a v polohách -19 až -13 je přítomen stop kodon, stop signál časné PNA vakcínie. Sekvence, které se podobají minimálně v 11 nukleotidech kritické oblasti Časného promotoru, vakcínie o 16 párech nukleotidů, jsou podotčeny. Oblast proti směru vlákna jde až do polohy -174. Oblast po směru Vlákna (30 nukleotidů sekvence kódující gen P2) se rozkládá od polohy +1 do polohy ί+3θ·

Obrázek 10B: Sekvence Nsil-EcoEI fragmentu obsahující promotor PPV P2, gen P2 a oblast po směru, vlákna· Pro podtržené části viz popis u obrázku 10A. Oblast proti směru vlákna sahá až do polohy -1?4. Sekvence kódující gen P2 se rozkládá od polohy +1 do polohy +399 a kóduje 133 aminokyselin. ,·. Vypočtená molekulová hmota genu P2 je 14 806* Oblast po směru vlákna (413 párů nukleotidů) je bohatá na A a T a neobsahuje otevřené čtecí oblasti kódující proteiny větší než proteiny o molekulové hmotě 4 000.

Obrázek 11: Srovnání promotoru P2 s jinými promotory viru neštovic. Histogram ukazuje hladiny exprese β-galaktosidasy indukované různými koncentracemi promotor viru neštovic-lacZ. Byly připraveny cytoplasmové extrakty buněk CV-1 infektovaných označenými rekombinantními viry a byla analyzována jejich enzymová aktivita podle postupu, který je popsán v experimentální části. Hladiny exprese různých rekombinantů byly srovnávány se standardní hladinou vPls,3 (100 %)_v

Obrázek 12: SDS-PAGE analýza buněk CV-1 infektovaných různými rekombinanty vakcínie. 3uňky byly infektovány podle postupu, který je popsán v experimentální části. Byly při pra· = vény celkové rozpustné proteiny. Různá množství (5 /ul a .

t* 10 /Ul) těchto proteinů byla analyzována na 10% polyakrylamidovém gelu. Pásy 1 a 2 ukazují protein indukovaný přírod. ním virem vakcínie, pásy 5 a 4 ukazují proteiny indukované rekombinantem vakcínie vFlsP, pásy 5 a 6 ukazují proteiny indukované virem vP2a, pásy 7 a 8 ukazují proteiny induτν* ' kované W rekombiantem vP2b a pasy 9 a 10 ukazuji proteiny indukované VV rekombinantem vart. Referenční vir vEls(3 (pásy 5 a 4) indukuje nový protein v oblasti mol^ňlové hmoty 117 000 (nižší šipka), který nemůže být detegován v buňkách infektovaných přírodním virem (pásy 1 a 2). Napojený protein 3-galaktosidasa/P2 gen získaný s rekombinanty vP2a a vP2b (pásy 5 až 8) má molekulovou hmotu asi 1J0 000 (horní šipka)

Obrázek IpA: Schéma konstrukce insertního plasmidů pPSgpt. Tyto plasmidy byly zkonstruovány postupem podle obrázku. Vysvětlení použitých zkratek je uvedeno při poperu obrázku 1.

Obrázek 1JB: Schéma násobného klonovacího místa pPSgpt. Translační stop kodony jsou uvedeny tučným typem písma.

Stop signál časné transkripce viru neštovic je podtržen.

Obrázek 14A: Konstrukce insertních plasmidů pP2mxgpt obsahujících mutované sekvence P2 promotoru (mx). Oligonukleotidy kódující buň přírodní nebo mutovanou P2 promotorovou * sekvenci byly ligovány do pPSgpt. E.coli lacZ gen byl umístěn po směru vlákna různých promotorů. Vytvořily se tak promotorové testovací plasmidy pP2jjígpt<^:-lacZ/P2mx.T a P2mx.2 = = syntetické linkerové sekvence kódující P2 promotor. Vysvětlení dalších zkratek je uvedeno v popíšu obrázku 1.

Obrázek 14B: Sekvence násobného klonovacího místa insertního plasmidů pP2mxgpt. Počáteční kodon a stop kodon translace jsou uvedeny tičným písmem. Stop signál časné transkripce viru neštovic je podtržen.

- 9 Obrázek 15 í Struktura přírodních a mutovaných, promotorů P2.

Obrázek 16: Srovnání 0-galaktosidasových aktivit indukovaných mutanty promotoru P2 v infektovaných buňkách CV-1 a to a) pozdní promotorové aktivity a b) časn^ promotorové aktivity.

Obrázek 17-A: Konstrukční schéma insertních plasmidú viru vakcínie pTZgpt-Fls a pTZgpt-PUM. Tyto plasmidy byly zkonstruovány podle popisu, který je uveden v experimentální části, tk znamená gen thymidin-kinasy viru vakcínie, P7.5 znamená promotor genu proteinu viru vakcínie o molekulové hmotě 7 500, Pil znamená promotor genu proteinu viru vakcínie o molekulové hmotě 11 000, PUM znamená mutovaný Pil promotor, fl ori znamená počátek rJíikace fl, gpt znamená

E.coligpt gen (kódující enzym xanthin-.guanin-.fosforibosyl-transferasu) á MCS znamená násobné klonovací místo.

Obrázek 1?B: Schéma konstrukce promotorových testovacích vektorů pTZgpt-sPll, pTZgpt-s4b a pTZgpt-sart (pTZgpt-sPx). FPV-tk znamená gen thymidin-kinasy viru drůbežích neštovic, P7.5 znamená promotor genu proteinu viru vakcínie o molekulové hmotě 7 500, -sPx označuje příslušné sekvence syntetického linkeru sPll, S4b a sart použité pro zkonstruování promotorů, gpt znamená E.coli gpt gen (kódující enzym xanthin-guanin^fosforibosyl-transferasu) a šipky označují směr transkripce.

Obrázek 18: Struktura promotorových oblastí. Je ukázána nukleotidové sekvence oblastí mutovaného promotoru. Jsou označeny souhlasné sekvence pozdního promotoru viru vakcínie (tenká čára), kodony iniciace translace (silnémčáry) a poloha několika restrikcích míst. Pllwt známená přío/rdní sekvenci promotoru Pil, Pllm znamená mutovanou Pil sekvenci, sPll znamená syntetickou mutovanou Pil sekvenci, s4b znamená syntetický PPV 4b promotor a sart znamená syntetický (umělý) pozdní promotor.

Obrázek 19: Srovnání hladin exprese 3-galaktosida?y indukovaných různými konstrukcemi promotorového lacZ genu

- 10 viru vakcinie. Hladiny exprese různých, rekombinantů jsou srovnány se standardní hladinou νΡΙεβ (100 %).

Tento vynález se tedy týká rekombinantního insertniho plasmidu viru drůbežích neštovic (PPV), vyznačujícího se tím, že intergenová oblast 3?iezi PPV tk-genem a 3*otevřenou čtecí obhastí , (3'orf) je zvětšena. Vytvoří se'tak jedno nebo více jedinečných restrikčních míst. Insercí cizí DNA do této intergenové oblasti zůstává PPV tk-gen neporušen a kóduje celou thymidin-kinasu (TK). Shora uvedená zvětšená intergenová oblast může například obsahovat následující sekvenci:

tk-gen

5TNT Γ ř Clal '

Smál tL_J

Asp718 zvětšená intergen.oblast

TATTGACAAAATAGTTAAATGAATATATGAAAGTACATTATACACGGAATGGAG r . » zvětšená intergenová oblast 5*orf

Tato modifikace přírodní intergenové oblasti se může získat místně specifickou mutagenesi.

Rekombinantní PFV schopný expresí poskytovat cizí protein (cizí proteiny) se připravuje integrací DNA sekvence kódující cizí protein (cizí proteiny) do virového genomu drůbežích neštovic. Tato cizí DNA sekvence se integruje do PPV genomu in vivo rekombinací mezi insertní plasmid nesoucí cizí DNA sekvenci a obklopující sekvence PPV genomu.' Tento insertní plasmid obsahuje alespoň cizí DNA sekvenci napojenou na promotor viru drůbežích neštovic nebo jiných neštovic umístěnou mezi DNA sekvence, které jsou homologní se shora uvedenou intergenovou oblastí a obklopujícími sekvencemi. ^selektovatelný insertní plasmid tedy obsahuje alespoň: á) přírodní nebo syntetický promotor viru neštovic, napojený na cizí DNA sekvenci, která má být získávána expresí, b) druhý promotor viru neštovic napojený na gen kódující ma^rer nebo indikátor pro výběr (selekci) rekombinantního PPV, c) DNA sekvence PPV obklopující konstrukci prvků ad a) a ad b) na obou koncích (5*a 3')» uvedené obklou/pjící sekvence jsou homologní se sekvencemi proti směru vlákna i po směru vlákna zvětšené intergenové oblasti.

Shoha uvedený plasmid s výhodou dále obsahuje replikon pro replikaci v prokaryotickém hostiteli a gen kódující selektovatelný markér nebo indikátor pro selekci v transformovaném prokaryotickém hostiteli.

Promotory používané ve shora uvedeném plasmidu a také také v rekombinantním PPV jsou promotory viru neštovic, zvláště PFV promotory. Pro účinnou expresi cizího proteinu je výhodné, aby promotor byl bezprostředně přilehlý ke kódující sekvenci jizích DMA sekvencí.

Většina z dosud zkonstruovaných VV rekombinantů používá klonované W promotory pro vnesení cizího genu, o který se jedná. In vivo rekombinace transkripční jednotky sestávající z klonovaného W promotoru a cizího genu do ne-podstatného místa VV genomu obvykle vede k duplikaci promotorových prvků. a může vést k sekundárním rekombinacím, k segregaci a k nestabilitě rekombinantů. Pro zkonstruování geneticky stabilních rekombinantů viru neštovic je tedy žádoucí použít buÚ nehomologní nebo krátké specifické virové promotory, které kontrolují transkripci cizího genu.

Výhodným P^í¹ promotorem je P2 promotor (obrázek 10B).^: Tento promotor obsahuje ve své části proti směru vlákna několik kritických časných oblastí následovaných souhlasnou sekvencí pozdního promotoru. Funkční analýza potvrdila, že P2 promotor je aktivní časně a pozdně v cyklu života viru.Síla nového PPV promotoru byla srovnávána s několika známými silnými promotory viru neštovic v rekombinantech viru vakcínie. Bylo zjištěno, že P2 promotor patří mezi jeden z nejsilnějších přírodních promotorů ve W infektovaných buňkách.

Při pokusu optimalizovat P2 promotor byla zkonstruována serie mutantů (obrázek 15). Ve všech mutacích je odstraněna sekvence napojení genu P2 a iniciační kodon genu lacZ je umístěn tak, že přiléhá k‘signálu pozdního promotoru TAAAT. V mutaci mO (TAAATG AAT TCC) ATG genu lacZ je

- 12 přímo napojen se středovou sekvencí pozdního.promotoru.

Tím se deletuje C zbytek v poloze -1 sekvence P2 přírodního typu markéru, která zlepšuje účinnost pozdního promotoru.

Tato struktura se nachází v mnoha pozdních promotorech. Předpokládá se, že je optimálním spojením pozdního pro mot oru a iniciačního kodonu (Davidson A. J. a Moss B.: J. Mol,

Biol. 210, 749 <1989).).

Mutant ml (TAAACATG AAT TGC) má ATG genu lacZ přímo napojen s ATG domnělého genu P2.

Mutace m2 byla zkonstruována pro studium významu kritických oblastí časného promotoru nacházejících se proti směru vlákna oblasti pozdního promotoru. Mutovaný promotor m2 má stejnou strukturu jako ml až na to, že časný RNA stop _signál ve funkčně důležité na T bohaté oblasti proti směru vlákna motifu pozdního promotoru byl inaktivován inserci TTG do polohy -18.

Výhodnými FPV promotory jsou tedy P2 promotor, který má DNA sekvenci odvoditelnou z obrázku 10A a jeho funkční *’ ekvivalenty. Experimentální data, pokud jde o sílu promotoru, jsou uvedena na obrázku 16.

Po těchto promotorových oblastech s výhodou následuje násobné klonovací místo (MCS), které umožňuje inserci cizích genů.

P2 gen a oblast po směru vlákna byly charakterizovány, sekvenační analýzou (obrázek 10B). Gen P2 kóduje 133 aminokyselin. Vypočtená molekulová hmota je 14 306. Oblast po směru vlákna (415 párů nukleotidů) je bohatá na A a T a neobsahuje otevřené čtecí oblasti kódující proteiny větší než o molekulové hmotě 4 000, tj· tato oblast genomu je prevděpodobně ne-kodují oblast. Oblast po směru vlákna genu P2 je tedy novým ne-podstatným místem, které může být použito pro vložení cizích genů do FPV genomu.

Výhodné plasmidy obsahují geneticky prvky, které u- 13 možňují výběr rekombinantního FPV. Tyto prvky obsahují gen kódující selektovatelný markér nebo indikátor společně s promotorem viru neštovic, který kontroluje expresi uvedeného genu v rekombinanthím viru. Tento promotor a tento markér nebo indikátor genu jsou umístěny mezi obklopujícími PPV sekvencemi, takže jsou kointegrovány do PPV genomu. Rekombinantní PPV se pak může vybrat na základě toho, že při expresi dochází k expresi markéru nebo indikátoru.

Výhodným genem pro identifikaci je E. coli lacZ gen, který kóduje enzym 3-galaktosiďasu. Způsofcy identifikace, které jsou založeny na expresi tohoto .emayrnu, jsou diskutovány v literatuře. Mezi selekční metody patří selekce resistencí «a léčivo, například selekce genem kódujícím xanthin-guanin-fosforibosyl-transferasu, která uděluje resistencí na mykofenolovou kyselinu*

Plasmidy podle tohoto vynálezu také kódují s výhodou replikon pro replikaci v prokarytickém hostiteli a rovněž i gen kódující selektovatelný indikátor nebo markér, který umožňuje selekci a amplifikaci v prokaryotickém hostiteli, jako je například E. coli. Tento replikon lze získat z jaké_ hokoliv prokaryotického plasmidu, jako je například pBR322. Selektovatelným markérem může být gen, který uděluje resisstenci na antibiotika.

Specifické plasmidy podle tohoto vynálezu mohou být zkonstruovány náhradou genu lacZ insertního plasmidu pTKm-sPll-gpt cizím genem, který nás zajímá.

DNA plasmidy obsahující DRA sekvenci, která má být získávána expresí spolu s geny markéru nebo indikátoru, jsou obklopeny příslušnými FPV sekvencemi, které umožňují rekombinaci s PFV a integraci obklopených genů do PPV genomu. K této rekombinaci dochází v cytoplasmě eukaryotické hostitelské buňky. Příslušné hostitelské buňky pro rekombinaci vyžadují, aby 1) byly infektovatelné FPV a 2) byly transfektovatelné DRA vektorem. Příklady takových buněk jsou fibroblasty kuřecího zárodku a dermální (kožní) buňky kuřecího zárodku.

- 14 Při rekombianci in vivo se buňky nejdříve infektují FPV, načež se transfektují insertním plasmidem. Virové infekce se dosáhne standardními technikami infekce eukaryotických buněk FPV. Potom se buňky transfektují insertním plasmidem jákýmikoliv konvenčními třansfekčnimi technikami.

Po infekci a následné transfekci se buňky inkubují za standardních podmínek a vir se nechá replikovat. Během této doby dochází k in vivo re kombinaci mezi homolognimi PPV sekvencemi insertního vektoru a FPV takže se sekvence cizí DNA vloží do FPV genomu.

η»

Rekombiantní FPV se-pak vybere pomocí vloženého markéru nebo indikátoru, např. E. coli lacZ genem, který expresí poskytuje β-galaktosidasu. Jestliže se použije chromogenní substrát pro tento enzym, například 5-brom-4-chlor-3indolyΙ-β-D-galaktosid, rekombinantní viry se detegují jako modré plaky.

Podle jiného podstatného uspořádáni tohoto vynálezu rekombinantní FPV obsahuje insertní místo ve shora uvedené intěrgenové oblasti tk-genu viru vakcínie, které slouží jako ne-podstatné místo (NES) pro inserci jedné nebo více sekvencí cizí DNA.

Jako výhodná modifikace uvedený rekombinantní FPV obsahuje ve shora uvedené zvětšené intergenové oblasti gen selekčního markéru a/nebo reporterový gen a W-tk-gen v jakémkoliv jiném žádoucím pořadí.

Nejvýh^énější modifikace sestávají z rekombinantních virů drůbežích neštovic, které ve zvětšené intergenové oblasti obsahují inserci tk-genu viru vakcínie a gen lacZ. Genomové struktury takových dvou .nových hostitelských kmenů jsou uvedeny na obrázku 7. Jako ne-podstatné místa pro vložení cizích genů je možné použít tk-gen bud drůbežích neštovic nebo viru vakcínie. Kmeny f-TK2a a f-TK2b se liší pouze v orientaci tk-genu viru vakcínie. Toto umožňuje inserui homologní rekombinace cizích genů, o které jde, ve

- 15 dvou orientacích. To může být výhodné při studiu transkripčních interferenčních jevů.

Jelikož shora uvedená modifikace nového EPV hostitelského kmene obsahuje dva neporušené tk-geny, je možné použít pro inserci cizí DNA kterýkoliv z nich. To umožňuje aplikaci rozsáhlé oblasti plasmidů, které mají bud. TW tk nebo W tk obklopující sekvenci.

Tento vynález tedy obsahuje rekombinantní PPV, který byl získán homologní rekombinací shora uvedeného nového PFV hostitelského kmene a jakéhokoliv zde popsaného plasmidů, který, umožňuje inserci cizí DNA bud do PPV tk-genu nebo do W tk-genu.

Jak bylo shora popsáno, rekombinantní EPV, který je schopen expresí poskytovat cizí protein (proteiny), se produkuje integrací DNA sekvence kódující uvedený cizí protein (uvedené cizí proteiny) do PFV genomu. To se provádí in vivo rekombinací insertním vektorem jak shora popsáno. Specifické vektory podle tohoto vynálezu se mohou zkonstruovat pomocí insertních plasmidů pTZgpt-Pls nebo pTZgpt-PUM jak je to uyedeno na obrázku 17A a pP2mxgpt jak je to uvedeno na obrázku 14A.

Konstrukce pTZgpt-Fls (obrázek 17A) představuje plasmid, který je výhodný při srovnání s dříve používaným pLasmidem . pTKgpt-Pls (horní část obrázku 17A) v tom, že počátek replikace fl (flori) byl zaveden substitucí pTZ části v miste pUC části (PvuII fragmenty). Inserce fl ori umožňuje produkci jednovláknové DNA, jak je to vyžadováno pro sekvenování a pro in vitro mutagenesi. Při této cestě jsou reklonovací pokusy do vektorů M13, které.spotřebovávájí Čas, zbytečnými.

V plasmidů pTZgpt-PUM (obrázek 17A) je Pil konvenční oblast pozdního promotoru TÁAATGAATTC mutována apřevedena na následující sekvenci: TAAATAAAGAATTC; tato konstrukce je výhodná v tom, že tyto geny se mohou získávat expresí za kontroly jejich vlastními kodony (ATG) iniciace translace.

- 16 •Plasmid pTZgpt-dP (obrázek 17A) obsahuje vedle obklopujících W tk sekvencí a genu gpt pod kontrolou promotoru P7.5 jediné místo Hpal. Toto místo vhodně slouží pro inseroi různých kazet promotor-cizí gen.

Insertní plasmidy pP2m0gpt, pP2mlgpt, pP2m2gpt (pP2mxgpt, obá^rzek 14A) směřují cizí gen, který se jedná, do tk-genu viru vakcínie nových hostitelských kmenů viru drůbežích neštovic (obrázek 7). Zkratka P2mx znamená mutované P2 promotory, jak je to popsáno na obrázku 15· Tyto insertní plasmidy jsou vhodné pro expresi otevřených čtecích oblastí, kterým chybí jejich vlastní translační iniciační a terminační kodony, ve vysokých hladinách. Translační stop kodony, které ukončují translaci ve všech třech čtecích oblastech, jsou dodávány plasmidy. Další vlastností násobných klonovacích , míst plasmidů pP2m0gpt, p?2mlgpt a pP2m2gpt je traňl^^ní stop signál, který končí expresi časného genu viru neštovic.

ΐ Sekvence násobného klonovacího místa je uvedena na obrázku 14B.

Plasmid pFSgpt (obrázek 15A) směřuje cizí gen, o který se jedná, do tk-genu viru vakcínie nových hostitelských použit í kmenů virů drůbežích neštovic (obrázek 7). Muže být pro ^s’klonování kazety cizí gen promotoru - vir neštovic. Plasmid pPSgpt rovněž poskytuje translační stop kodony a časný transkripční stop signál viru neštovic. Tato sekvence násobného klonovacího místa je uvedena na obrázku 153.

Plasmidy pTZgpt-sPx (obrázek Í7B) jsou promotorové testovací plasmidy, které byly zkonstruovány pro testování různých syntetických promotorů (zde označených jako sPx). Zkratka sPx může mít následující vyznamy: a) sPll = syntetický W Pil promotorový mutant, b) s4b = syntetický PPV 4b promotorový mutant, c) sart == syntetický promotorový mutant.

Shora uvedené promotor y obsahují silné pozdní promotory, které jsou aktivní ve W stejně jako PPV. Tyto promotory mohou být vyštěpeny s nebo bez reporterového genu (lacZ) a mohou být tedy klonovány do různých vektorových

- 17 systémů. Tyto další promotory zvětšují souhrn dostupných promotorů a umožňují násobnou expresi. Jsou výhodné také v tom, že oblasti, které jsou homogenní s virovým genomem, jsou omezeny spíše na kratší sekvence, což je skutečnost, která snižuje možnost rekombinací a tedy snižuje nestabilitu rekombinantních virů.

Jak bylo shora popsáno, rekombinantní PPV, který se používá pro expresi cizího proteinu (cizích proteinů), se získává in vivo homologní rekombinací.

Tento vynález obsahuje také způsob exprese cizího proteinu. Tento způsob sestává z infektování příslušných hostitelských buněk rekombinantním PPV podle tohoto vynálezu. Hostitelské buňky se pak kultivují, aby se umožnila exprese žádaného proteinu. Protein se pak isoluje konvenčními způsoby.

Vhodnými buňkami nebo buněčnou kulturou jsou fibroblastové buňky kuřecího zárodku nebo kožní (dermální) kuřecí fibroblastové buňky.

.Jakýkoliv žádaný protein může být získán expresí pomocí shora uvedeného rekombinantního PPV v dostatečných množstvích. Zvláště důležité je, aby došlo k expresi proteinů, které vyžadují post-translační modifikaci tak, jak to provádějí hostitelské buňky. Takovými proteiny jsou například faktory II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, ΧΙΉ; protein C, protein S, von Willebranduv fakrot, plasminogen a jeho deriváty, v nichž je jedna nebo více aminokyselin nahrazena, deletována nebo vložena, částečné sekvence a jejich aktivované formy, apolipoproteiny, jako jsou například apoAl a apoAII, a virové antigeny, jako je například sntigen hepatitidy B, antigeny viru hepatitidy C, antigeny viru hepatitidy E, antigeny viru encefalitidy pocházející .od klíštěte (THE), antigeny HIV, HSV a celé nebo částečné sekvence takových antigenů, které způsobují černý kašel, tetanus, malarii, onemocnění drůbeže, Markovu chorobu, ILT, infekční ch^oby, bronchitidu, kokcidiosu a Newcastlovu nemoc, shora uvedené antigeny jsou užitečné jako vakcíny.

- 18 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsoby a materiály .

ií

1.1 Vir a buňky

Vir drůbežího moru kmen HP1 .(Mayr a Ivíalicki: Zentralblatt f. Veterinarmedizin, Reihe B, 13, 1 až 12 (1966).) a zeslabený kmen HP1-441 (pasážové číslo 441 HP1) byly laskavě dodány profesorem A. Mayrem z Mnichova. Primární fibroblasty kuřecího embrya (CEP) byly připraveny podle postupu, který je uveden v evropském patentovém spisu č. 0 338 807·. Buňky byly nechány růst v tkáňovém kultivačním mediu 199 (TOM 199, Gibco BRL) doplněném o 5 % plodového telecího sera, glutamin a antibiotika. Vir vakcínie (ATCC č. VR 119, kmen WR) byl laskavě poskytnut Dr. B. Mossem. Tento vir byl replikován v buňkách CV-1 a vyčištěn způsobem podle Macketta a spol. (v D. M. Glover (red.) (1985): DNA Cloning: A Practical Approach, IRL'press, Oxford,). Buněčná linie ledvin africké zeléné opice (ATCC č. CCL 70) byla získána z Amei^Pan Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

1.2 Čištění viru drůbežích neštovic

Čištění se v podstatě provádí podle JokliXa (Virology

18, 9 až 18 (1962).) s následujícími modifikacemi: Mono2 ._ vrstvy CEP (dvacet baněk pro kultivaci buněk (75 cm )) byly infektovány 1 pfu (plak tvořící jednotka) na buňku a inkubávány čtyři až pět dnů při teplotě + 37 °C s 5 % oxidu uhličitého. Buňky byly naškrabány do medie, odstředovány dvacet minut při 2000 otáčkách za minutu v odstře*, divče H6000A-rotor Sorwall RC3G . Peleta se suspenduje v ^fr 5 nl 10mM Tris, pH 9, sonikuje (působí se ultrazvukem), doplní se 1/10 objemu 2,5% trypsinem a inkubuje se třicet minut při + 37 °0. Aby se vytvořily pelety extracelulárního viru supernatant se odstřeňuje při 17 000 otáčkách za minutu dvě hodiny při + 4 °C v odstředivce Beckaan type 19 rotor. Trypsinizované buňky ’ a virová peleta supernatantu buněčné kultury se spojí, nanesou se na polštář 36% sa^řcarosy a odstřelují se osmdesát minut při 13 500 otáčkách za minutu

- 19 v odstředivce Beckman SW2S rotor při + 4 °G. Peleta se resuspenduje v 1 ml lmM Tris, pH 9, nechá'se na ní působit ultrazvuk, převrství se na 20 až 40% sacharosový gradient a odstřeluje se při 12 000 otáčkách za minutu 50 minut při teplotě + 4 °G. Dva virové pásy (intracelulární a extracelulární formy viru) se spojí. Přidají se dva objemy lOmM Tris, pH 9» Virová peleta se isoluje po odstřelování při 15 5θθ otáčkách za minutu po dobu 60 minut a resuspenduje se v 500 /ul lmM Tris a lmM chloridu sodného, pH 9·

1.3 Infetjkování buněk a analyzová plaků

Analýza plaků se provádí na konfluentních monovrstp vách GBP (v miskách pro kultivaci buněk, 60 cm , přibližně θ p

6.10° buněk, nebo na deskách se šesti jamkami, 10 cm ,

1.10^ buněk na jamku) nebo CV-1 buněk na deskách se šesti jamkami (10 cm , 1,10 buněk na jamku). Virová suspense se . nechá adsorbovat na buňkách v objemu 0,6 ml TGM 199 s občasným zatřepáním jednu hodinu. Suspense se odstraní odpipetováním a nahradí se převrstvením vrstvou sestávající z DMEM bez .sera, antibiotik a 1 % nízkotající agarosy (DMA, Gibro BPuL). PPV-plaky titrova.né na GEP-buňky se obarví 50 yUg/ml neutrální červeně (Sigma) pátý nebo šestý den infekce.

Plaky viru vakcinia titrované na GV-l buňky byly obarveny 50 /Ug/ml neutrální červení třetí den infekce.

1.4 In vivo rekombinace

Λ

CEP buňky nebo GV-l buňky (v 60cm^ miskách pro tkáňové kultury) se infektují jednou plak tvořící jednotkou (pfu) na buňku HP1-441 nebo W. Vir se adsorbuje jednu hodihu při + 37 °C ve'2,5 ml TOM 199· Potom se medium odpipetuje a infektované monovrstvy se převrství, sraženinou DNA-Ca-fosforečnan obsahující 20 ug plasmidové DNA a 5 /Ug HP1-441 nebo W přírodní DNAv Hepes pufrovaném solném roztoku na konečný objem 1 ml podle Grahama ^amV^an der Eba (Virology .

52, 456 až 46? (1973)·). Po třiceti$utové inkubaci za teploty 'místnosti še přidá 9 ml TGM 199 a v inkubaci se pokraču je další čtyři hodiny při teplotě + 37 °0. Medium se nahradí 10 ml čerstvého TGM 199 a desky se inkubují dva dny.. Potom se buňky naškrabou do media a pelety se lysuji třemi po sobě následujícími cykly zmrazení a roztátí. Progenový vir se

- 20 pak analyzuje na přítomnost rekombinantů.

1.5 Selekce a čištění plaků rekombinantů

1.5·1 Testování modrých plaků

Viry s inserty lacZ genu se identifikují testováním modrých plaků podle způsobu popsaného Ghkrabartym a spol. (Mol. Cell. Biol. 2» 3405 až 3409 (1983)·) s následujícími modifikacemi: CEF-buňky (v 60cm“ miskách pro tkáňové kultury) nebo CV-1 buňky (na deskách se šesti jamkami) se infektují virovým surovým zásobním roztokem odvozeným od rekombinantních pokusů a převrství se DMEM bez sera obsahujícím 1 % LMA. Po pěti až šesti dnech u CEF a po třech dnech u CV-1 se monovrstvy obarví drufkým převrstvením vrstvou, která sestává z 1% EMA ve fosforečnanem pufrovaném solném

4-chlor-3-indolyΙ-β-D-galaktosidu (X-gal)* Modré plaky se ” objevily asi po čtyřech až dvanácti hodinách.

1.5«2 gpt-selekce

Rekombiantní FPV viry s gpt-genovými inserty byly identifikovány na základě jejich resistence na mykofenolovou kyselinu (MPA) v podstatě tak, jak to popisují Falkner a Moss (J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988).) s následujícími modifikacemi: monovrstvy CEF buněk byly infektovány rekombinantním viremá převrstveny DMEM doplněným o 125 /Ug/ml xanthinu, 5 až 25 /Ug/ml MPA a 1 % EMA. Po pěti až šesti dnech byly plaky zviditelněny vybavením druhým převrstvením vrstvou obsahující 1 % DMA v PBS obsahujícím 30 ^ug/ml neutrální červeně. V případě převrstvení gpt- a lacZ positivních rekombinantů vrstva obsahovala dále 600 /Ug/ml X-gal. Plaky byly několikrát přečištěny. Monovrstvy CV-1 buněk byly infektovány rekombinantním virem vakcínie a převrstveny DMEM doplněným 250 /Ug/ml xanthinu, 15 /Ug/ml hypoxanthinu, 25 /Ug/ml MPA a 1 % LHA. Po dvou až třech dnech se plaky zviditelní obarvením druhou vrstvou, která sestává z 1 % MPA v PBS obsahujícím 50 ^ug/ml neutrální červeně a 600 /Ug/ml X-gal. Plaky byly několikrát přečištěny.

1.6 Analýza přechodné exprese

Analýzy byly prováděny v podstatě podle toho, jak popisuje Cochran a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 19 až 23 (1935)·) θ modifikovány následujícím způsobem: Konfluentní monovrstvy CV-1 buněk (asi 1.10' buněk) byly infektovány 5 nebo 10 plak tvořícími.⁷:;jednotkami přírodního viru vakcínie a transfektovány 30 /Ug plasmidové DNA ve formě DNA-Ca-precipitátu připraveného podle Grahama a. van der Eba (Virology 52, 4-56 až 457 (1973).). Buňky se isolují 24 hodin po infekci odstřelováním a resuspendováním ve 100 /úl PBS. Cytoplasmové extrakty infskicovaných buněk byly připraveny působením ultrazvuku a analyzovány na β-galaktosidasovou aktivitu.

1.7 β-Galaktosidasové analýzy

......Konfluentní monovrstvy CV-1 buněk (8.10 buněk) byly infektovány 10 plak tvořícími jednotkami. . rekombign^ňů vakcínie, isolovány 24 hodin po infekci odstřelováním a resuspendovány ve 100 /úl PBS. Pro přípravu cytoplasmových extraktů byly buňky rozbity trojnásobným opakováním cyklu zmrazení a .rohatí a působením ultrazvuku. Proteinové extrakty byly. kvantitativně vyhodnoceny podfe Bradforda (Anal. Biochem. 72, 248 až 254 (197θ)·); Enzymatické analýzy byly prováděný v podstatě podle toho, jak to popsal Miller (v Experimente in Molecular Genetics”, Cold Spring Barbor 'Lab orátory , Oold Spring Barbor, New York, 352 až 355 (1972).) s následující modifikací: Všechna reakční činidla byla předem ohřátá na 28 °C, lysáty byly uchovávány v ledu. Reakce se provádí v 770 /Ul 1 x Z pufru (0,6M hydrogenfosforečnan sodný, 0,4M dihydrogenfosforečnan sodný, O,1M chlorid draselný, 0,01M síran hořečnatý, 0,5M β-merkaptoethanol, pB 7). Přidá se 200 ^ul chromogenního substrátu o-nitrofenyl-3-D-galaktopýranosidu ONPG, 4 fflg/ml v O,1M fosforečnanovém pufru, pB 7,0). Reakční směs se nechá reagovat přidáním 30 /ul zředěného buněčného extraktu (1 : 100).

Po třech minutách za teploty místnosti se analýzy přenesou do BecAa^nova fotometru DU8. Optická hustota byla zaznamenávána patnáct minut při 420 /um při 28 °C vzhledem k PBS vzorku. Výsledky byly potvrzeny vyhodnocením polyakrylamido22 . _. vých gelů UV-Vis densitometrem (Hirschmann)....... ... .,

1.8 Sekvenování

Sekvence byly stanovovány sekvenační sestavou T7 polymerase sequencing kit” (Pharmacia) dideoxymetodou (Sanger * a Coulson: J. Mol. Biól. 94, 441 (1975)·) specifickými primery. Zkonstruování plasmidů bylo prováděno podle standard* nich technik jak je to popsáno Sambrookem a spol. (Molecular Cloning, Gold Spring Harbor Laboratory, 1989.).

Příklad 2 . , .

Konstrukce insertních plasmidů - . _

21«, Plasmid pPPtk5

Jako první stupeň byl klonován gen PPV thymidin-kinasy následujícím způsobem’: DNA viru drůbežích neštovis rozštěpená působením EcoRI (kmen HP1, Mnichov) se klonuje do EcoRI místa vektoru pTZ19R (Pharmacia). Plasmid, který obsahuje tk-gen, označený pEPtk5, byl identifikován hybridizací kolonií na filtru pomocí oligonuk^eotidové sd^Ly: 5'-CAG TTA TTG TGG CCG CGC TTA ACG GTG A-3*. Plasmid obsahoval EcoRI fragment o 5 500 párech nukoeotidů.

2.2 Plasmid pPPtklO.4

Plasmid pPPtk5 se rozštěpí působením Clal, BamHI a Seal, nechá se zreagovat s Klenowovou polymerasou a liguje se s vektorem pTZ19R, který byl zpracován z PvuII, EcoRI a fosfotásou. Výsledný plasmid, pPPtklO.4 měl BamHI-Clal insert o 2 480 párech nukleotidů, který obsahuje tk-gen viru b drůbežích neštovic (Boyle a spol.: Virology 156. 355 až 556 (1987).)·

2.3 Plasmid pPP-UV2i

Do jedinečného místa Ncol v tk-kodující oblasti plasmidu pPPtklO.4 se vloží SspI fragment o 2 300 párech nukleotidů z plasmidu pUVl (Palkner a spol.: Nucl. Acids Res.

15, 7192 (1987). Tento fragment obsahuje Pll-promotor (Bertholet a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 2096 až 2100 (1985).), 97.5 promotor (Cochran a spol.: J.'Virol. 54,

- 25 50 až 57 (1985).) a 5'-část lacZ genu.

2.4 Plasmid pFP-UV2

Klonování plasmidu pFP-UV2 se ukončí vložením fragmentu lacZ o 2500 párech nukleotidů (5'část genu lacZ) do meziproduktu - plasmidu pPP-UV2i.

2.5 Plasmid pFP-UV2-PT

V následujícím pokusu se cDNA sekvence pro protrombin klonuje do plasmidu pPP-TJV2. Tento pokus se provádí tak, že se vystřihne EcoRI fragment z plasmidu pPT č. 12 o 2 000 párech nukleotidů, který je popsán v evropské patentové přihlášce č. 90 101 6£5.θ· tfplná lidská protrombinová cDNA se pak klonuje do.vektoru pPP-UV2, který se předem nechá zreagovat s EcoRI a fosfatasou. V této konstrukci počáteční kodon translace protrombinové cDNA je přesně napojen na přirozeně se vyskytující počáteční kodon promotoru hlavního pozdního polypeptidú 11K viru vakcínie. Výsledný plasmid byl označen pFP-UV2-PT.

2.6 Plasmid pTKm

Tento plasmid byl zkonstruován z plasmidu pPPtklO.4 oligonukleotidem.řízenou mutagenesí fosfothioátovým postupem (Amersham, lne.). Mutagenní přiměř, který byl použit pro zvětšení a modifikování intergenové oblasti genu PPV thymidin-kinasy, měl sekvenci: 5'-TTA CAC TAA ACC GGT ACC CGG GAT CGA TAA AAA CCT TAA TTA CTA-5'· Struktura mutace byla potvrzena sekvenováním pomocí primeru 5 '-CCATTCCGTG TATAATGTAC-5', který je umístěn 46 párů nukleotidů po směru vlákna pozměněné sekvence.

2.7 Plasmid pPP-ZsPll

V plasmidu pPP-Z21 (viz 2.15) je lacZ gen obklopen několika restrikčními místy, ale neobsahuje sekvence promotoru. Do míst Pstl a Smál plasmidu pPP-Z21 se po směru vlákna lacZ genu vloží syntetický promotor (modifikovaná verse promotoru Pil vakcínie) ligací syntetického linkeru, který sestává z anelovaných oligonukleotidů I a II (oligonukleotid I: 5'-GCC TAT TTA TAG CAT AGA AAA AAA CAA AAT GAA ATT TTA CTA TAT TTT TAT ATA GAT ATA TTC TAA CCC-5', oligo- 24 nukleotid II: 5-GGG TTA GAA TAT’ATG TAT GTA AAA ATA TAG- TAG AAT TTC ATT TTG TTT TTT TCT ATG CTA TAA ATA GGC TGC A-5').

2.8 Piesnid pTKm-sPll

Fragment SrnaΙ/BaII o 5 5θΟ párech nukleotidů obklopující E.coli lacZ gen regulovaný syntetickým pozdním promotorem vakcínie se připraví z plasmidú pFP-ZsPll a vloží se do vektoru pTKm linearizovaného působením SmsI. Výsledný plasmid byl označen pTKm-sPll.

2.9 Plasmid pTKm-sPll-gpt ”

Plasmid pTKm-sPll se linearizuje působením Smál. Potom se liguje s kazetou Hpal-Dra I P7.5-gP't gen o 1 100 párech nukleotidů vystřiženou z plasmidú pTKgpt-Fls ...

(Falkner a Moss.: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988).).

~ Výsledný plasmid se označí pTKm-sPll-gpt.

V<*‘ · 4u »: · tr 2.10 Plasmid pTKm^VVtka a b

Tyto plasmidy se zkonstruují vložením úplného genu thymidin-kinasy viru vakcínie připraveného jako Dra I fragment o 1 100 párech nukleotidů z pGS50 (Mackett a Smith: J. Gen.

..... Virol. 62., 2067 až 2082 (1986).) do Smál linearizovaného ' vektoru pTKm-sPll. Výsledné plasmidy se označí pTKm-Wtka a b.

2.11 Plasmid M15mpl8-UVl

Jako první stupeň se Pstl/Saul fragment o 1 200 párech nuklet/oidů odvozený od insertního vektoru pFP-UV2 (viz 2.4) subklonuje do plasmidú Ivíl53ipl3. Tento fragment obsahuje promotory genů viru vakcínie kódující 11K (Pil, Bertholet a spol.i Proč. Bati. Acad. Sci. JSA 32, 2096 až 2100 (1985).), 7.5K polypeptid (Ρ7.5» Cochran a spol.: J. Virol. 54, 50 až 57 (I935).) a část lacZ genu. Výsledný plasmid se označí K15mpl3-UVl.

2.12 Plasmid M15mpl3-Eco2

Pro zavedení druhého ScoSI místa 7 párů nukleotidů proti směru vlákna ATG lacZ genu plasmidú M15mpl3_UVl se použije oligonukleotidem řízené mutagenese (Amersham, lne.).

Vytvoří se tak meziprodukt - plasmid M15mpl8-Eco2. Mutagenní

- 25 primer, který se použije pro změnu oblasti lacZ proti směru vlákna měl sekvenci: 5'-ACC ATA TGT AAG GAA TTC CTT AGA TAA-3'.

2.15 Plasmid pEP-UV2-Eco2

Modifikovaný Pstl/Sául promotorový fragment, připravený z plasmidu M13mpl8-Eco2, se vloží do pEP-U2, který se rozštěpí působením Pstl a Saul. Výsledný vektor se označí pPP-UV-2-Eco2.

2.14 Plasmid pPP-Zl

Plasmid j3FP-Zl se zkonstruuje tak, že se vynechá (deletuje) EcoRI Ρ11/Ρ7·5 fragment o 900 párech nukleotidů z plasmidu pEP-HY£-Bco2. Tím se umístí násobné klonovací místo bezprostředně proti směru vlákna lacZ genu.

2.15 Plasmid pPP-Z21

Plasmid pPP-Z21 zkonstruujeme tak, že se zavede sekven_ ce syntetického linkeru (5'-CGA. TTG GCC AGG ATC CGT CGA CAG GCC TAT-3,' doplňkové vlákno: 5>CGA TAG GCC TGT CGA OGG ATC_x CTG GCC AÁT-3*) do vektoru pEP-Zl, který se částečně rozštěpí působením Clal. Tato modifikace umožňuje jednoduché vy štěpení lacZ genu.2.16 Plasmid pFP-2

Tento plasmid se isoluje z banky zkonstruované insercí náhodných fragmentů PFV-DNA (HP1-441) rozštěpené působením SspI a EcoRV do plasmidu pEP-Zl linearizovaného působením Smál.

Plasmid pEP-ZP2 (2.17)

EcoRI/Nsil fragment o 600 párech nuldieotidů obsahující P2 promotorovou aktivitu se připraví z plasmidu pFP-2. 4'ento fragment se ligu je s vektorem pFP-Z21, který se linéarizuje působením EcoRI a Pstl.

2.18 Plasmidy pTZgpt-P2a a pTZgpt-P2b

Tyto plasmidy se zkonstruuují tak, že se vloží kazeta P2-lacž gen odvozená od plasmidu pEP-ZP2 (Smal/Stul fragment o 3 700 párech nukleotidů do plasmidu pTZgpt-dP (viz £.27), který se linearizuje působením Hpal. Výsledné vektory se 'označí pTZgpt-P2a a pTZgpt-P2b.

- 26 2_o 19 Plasmid pFSpO --- - - - —V prvním stupni se plasmid pTZ19& (Pharmacia) rozštěpí působením Pvu II. Deletuje se tak fragment o 3^9- párech nukleotidů obsahující násobné klonovací místo a přilehlé sekvence. Tento vektorový fragment se liguje s fragmentem tk-genu vakcínie o 1 100 párech nuk eotidů, který se připraví z plasmidů pGS50 rozštěpením působením Dral. Výsledný plasmid se označí pFS50.

2.20 Plasmid pFS51

Plasmid pFS50 se rozštěpí působením Olal a EcoBI a liguje se se syntetickým linkerem (P-MCS1 a 2). Tento vektor byl označen pFS51. Oligonukleotidy,· které byly použity pro konstrukci linkeru, měly tyto sekvence: P-MCS1: 5'-CGA GCA GGTG CAT ATG AGG OCT GGA TCC CGG GTC GAC GCG GCC GCT AACTGA GTG ATT TTT CTC-3'a P-MCS2: 5'-AAT TC-A GAA AAA TCA GTC AGT TAG CGG CCG CGT CGA CCC GGG ATC CAG GCC TCA TAT GCA GCT GCT—3'· t

2.21 Plasmid pFSgpt

Plasmid pFSgpt se generuje subklonováním kazety P7.5-gpt gen o 980 párech nukleotidů, která se připravuje z plasmidů pTKgpt-Fls (Falkner a Moss: J. Virol. 62, 13^9 až 1854 (1988).) rozštěpením působením Ndel a Dral, do plasmi£u pFS31 rozštěpeného působením PvuII/lTdel.

2.22 Plasmid pP2m0gpt

Syntetické oligonukleotidy kódující mutovaný mO P2 promotor se anelují a vloží násilným klonováním do vektoru pFSgpt linearizovaného působením Ndel/BamEE. Nukleotidové sekvence těchto oligonukleotidů jsou následující: mO.l:

5'-TAC GGC TTG GTA TAG CGG ACA ACT AAG TAA TTG TAA AGA AGA

AAA

CGA

AAC

TAT

CAA

AAC

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA AAG AAT

ATA

AAT

AAT

CCT

GTA

TTT

TAG

TTT

AAG

TAA

CAG

TAA

AAT AAT

GAG

TAG

AAA

ATA

CTA

TT'^1

TTT

ATA

GCC

TAT

AAA

TGA

ATT

CG-3za m0.2

5'-GATC

CGA

ATT

CAT

TTA

TAG

GCT

ATA

AAA

AAT

AGT

ATT TTC

TAC

TCA

TTA

TTT

TAC

TGT

TAC

TTA

AAC

TAA

AAT

ACA

GGA

TTA TTT

ATA

TTC

TTT

TTT

GTA

TCA

TTT

CAT

AAA

CGG

TTT

TGA

TAG

TTT CGT

TTT

CTT

CTT

TAC

AAT

TAC

TTA

GTT

GTC

CGG

TAT

AGC

AAG

CCG-3'.

Vý-

sledný plasmid byl označen pP2m0gpt.

- 27 2.25 Plasmid. pP2mlgpt

Při konstrukci pP2mlgpt se sekvence syntetických, linkerů ml.l a ml„2 anelují a ligují s vektorem pPSgpt, který se linearizuje působením NdeI/3amHI. Tyto oligonukleotidy měly následující sekvence: ml.l: 5'-TAC GGC TTG GTA TAG

CGG	ACA	AGT	AAG TAA	TTG TAA AGA AGA AAA CGA	AAG TAT CAA	AAO
CGT	TTA	TGA	AAT GAT	AGA AAA AAG AAT ATA AAT	AAT CGT GTA	TTT
TAG	TTT	AAG	TAA CAG	TAA AAT AAT GAG TAG AAA	ATA OTA TTT	TTT
ATA	GCG	TAT	AAA TGA	TGA GG-5'a ml.2: 5'-GAT	CGG AAT TCA	TGA
TTT	A TA	GGC	TAT AAA	AAA TAG TAT TTT OTA OTO	ATT ATT TTA	CTG
TTA	CTT	AAA	OTA AAA	TAO AGG ATT ATT TAT ATT	CTT TTT TCT	ATO
ATT	TOA	TAA	ACG GTT	TTG ATA GTT TCG TTT TCT	TCT TTA CAA	TTA
CTT	AGT	TGT	CCG OTA	TAC CAA GOC 0-5*· Vý^edný plasmid 1	byl
označen	pP2mlgpt.

2.24 Plasmid pP2m2gpt

Vektor pP2m2gpt se vytvoří ligaci anelovaných oligonukleotidů m2.1 á m2.2 s plasmidem pPSgpt rozštěpeným působením Ndel/BamHI. Oligonukleotidy použité pro klonováni měly následující sekvence: m2.1: 5*-TAC GGC TTG GTA TAG CGG

ACA

ACT

AAG

TAA

TTG

TAA

AGA

AGA

AAA

CGA

AAC

TTT

CAA

AAC

CGT

TTA

TGA

AAT

GAT

AGA

AAA

AAG

AAT

ATA

AAT

AAT

GCT

GTA

TTT

TAG

TTT

AAG

TAA

CAG

TAA

AAT

AAT

GAG

TAG

AAA

ATA

CTA

TTT

TGT

TTT

ATA

GOC

TAT

AAA

TCA

TGA

ATT

CG-5', sekvence

m2.2: 5'

'-GATC

CGA

ATT

CAT

GAT

TTA

TAG

GCT

ATA

AAA

CAA

AAT

AGT

TTT

TTC

TAC

TCA

TTA

TTT

TAC

TGT

TAC

TTA

AAC

TAA

AAT

ACA

GGA

TTA

TTT

ATA

TTC

TTT

TTT

CTA

TCA

TTT

CAT

AAA

CGG

TTT

TGA

TAG

TTT

CGT

TTT.

CTT

CTT

TAC

AAT

TAC

TTA

GTT

GTC

GGC

TAT

ACC

AAG

CCG—5'·

Ten-

to plasmid byl označen pP2m2gpt.

2.25 Plasmidy pP2m0gpt-lacZ, p.p2mlgpt-lacZ a pP2m2gpt-lacZ

CpP2xgp t-la Č Z )

Zkonstruování plasmidů pP2m0gpt-lacZ, pP2mlgpt-lacZ a pP2m2gpt-lacZ se provede vložením E.coli lacZ genu jako EcóRI-BalI fragmentu o 5 200 párech nukleotidů (odvozeného od plasmidů pPP-Z21) do vektorů pP2m0gpt, pP2mlgpt a pP2m2gpt, které se lineárizují působením EcoSI a Smál.

- 28 2.26 Plasmid pTZgpt-Fls .......... ~

Inssrtní vektor pTZgpt-Fls viru vakcínia se zkonstru- . uje tak, se nahradí PvuII ffagment o 2 400 patech nukleotidů (původně odvozený od plasmidu pUG 13) z plasmidu pTEgpt-Fls (Falkner a Moss.: J. Víro!· 62, 1849 až 1854 (1988).) PfúII fragmentem o 2 500 párech nukleotidů z plasmidu pTZ19P (Pharmacia, lne.). Vedle genu ampicilinové resistence a počátku replikace plasmidu (také přítomného v PvuII fragmentu o 2 400 párech nukleotidů) byl tímto klonováním vložen do pTKgpt-Fls počátek replikace bakteriofágu fl

2.27 Plasmid pTZgpt-dP

Promotor Pil z plasmidu pTZgpt-Fls se deletuje rozštěpením působením Pstl a Hpal. Velký vektorový fragment se liguje s Hpal lirfery (5^Z-GGTTAACC-3^Z, Pharmacia, lne.). Výsledný plasmid se označí pTZgpt-dP.

2.28 Plasmid M13mpl8-UV3

Plasmid M13mpl8-UV3 se zkonstruuje oligonukleotidem řízenou in vitro mutagenesi (Pharmacia, lne.) Pil promotoru do vektoru M13nipl8-UVl (viz 2.11). Oligonukleotid, který se používá pro změnu promotorové oblasti, má sekvenci: 5'-TAGCTATAA ATAAAGAATT CGTGGAG-3*.

2.29 Plasmid pTZgpt-PUM

..... Rekombinantní plasmid viru vakcínie pTZgpt-ΡΙΙΜ se zkonstruuje tak, že se Hind III/Asp718 fragment o 600 párech nukleotidů, zpracovaný s Klenowovou polymerasou odvozený od M13mpl8-UV3, vloží do plasmidu pTZgpt-dP rozštěpeného působením Hpal. Tento fragment obsahuje mutovaný Pil promotor (PUM).

2.3Ο Plasmid pFP-ZsPll

Oligonukfeotidy sPll(3) a sPll(4) se anelují a klonují do vektoru pFP-ZŽSl (viz 2.15) rozštěpeného působením Smál s Pstl. Sekvence sPll(3) a sPll(4) byly: 5'-GCGTATTTAT AGGATAGAAA AAAACAAAAT GAAATTCTAC TATATTTTIA GATACATATA TTCTAACCC-3* a 5'-GGGTTAGAAT ATATGTATGT AAAAATATAG TAGAATTTCA ŤTTTGTTTTT TTCTATGCTA TAAATAGGCT GCA-3'. Výsledný plasmid se označí pFP-ZsPll.

- 29 2ο31 -Plasmid. pTZgpt-sFLl

Plasmid. pFP-ZsPll se rozštěpí působením Smal/Ball. Fragment o 3 300 párech nukleotidů obsahující sekvenci syntetického promotoru navázaného na lacZ gen byl klonován do insertního místa vektoru viru vakcínie pTZgpt-dP (viz 2.27)o Výsledný plasmid byl označen pTZgpt-sPll.

2.32 Plasmid pFP-Zs4b

Oligonukleotidy s4b(3) a s4b(4) se anelují a klonují do vektoru pFP-Z21 (viz 2.15) rozštěpeného působením Smál/ /Pstl. Sekvence óligonukleotidů s4b(3) a s4b(4) byly:

5'-GCGTATTTAT ATTTGATAC-T TŤTTTACTTG TAAGGTATCA AAATAAGTAC CTAAAGAGAG CTAACCCC-3' a 5'~GGGGTTACGT CTCTTTAGGT ACTTATTTTG ATACGTTACA AGTAAAAAAC TATCAAATAT AAATAGGCTG CA-3'· Výsledný plasmid se označí píP-Zs4b.

2.33 Flasmid pTZgpt-s4b

Plasmid pFP-Zs4b se rozštěpí působením Smal/Ball. Fragment o 3 300 párech nukleotidů obsahující sekvenci syntetického promotoru navázaného na lacZ gen byl klonován do insertního vektoru viru vakcínie pTZgpt-dP (viz 2.27)· Výsledný plasmid se označí pTZgpt-s4b.

2.34- Plasmid pFP-Zsart

...... Oligonukleotidy sart(3) a sart(4) se anelují a klonují do vektoru pFP-Z21 (viz 2.15) rozštěpeného' působením Smál a Pstl. Sekvence oligonukleotidů. byly: sart(3) : 5'-θΟΟ TATTTAT ATGGCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGCTTC CC-3'a sart(4):

5'-GGGAAGGTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC ATATAAATAG GCTGCA-3'. Výsledný plasmid se označí pFP-Zsart.

2.35- Plasmid pTZgpt-sart

Plasmid pFP-Zsart se rozštěpí působením Smal/Ball. Fragment o 3300 párech nukleotidů obsahující sekvenci syntetického promotoru navázaného na lacZ gen byl klonován, do insertního vektoru viru vakcínie pTZgpt-dP (viz 2.27)· Výsledný plasmid se označí pTZgpt-sart.

Rekombinantní viry vFlsP, vPll, vPllm, v4b a vart

- 30 byly odvozeny od rekombinantních plasmidů. pTKgptP10 (Palkner a Moss: J. Virol. 62, 1849 až 1854 (1988).), pTZgpt-sPll, pPllm-lacZ (T. Langmann: Diplomová práce ha Universitě ve Vídni, 1991) a pTZgpt-s4b a pTZgpt-sart.

Příklad 3

Význam genu thymidin-kinasy viru drůbežích neštovic pro růst v buněčné kultuře

3.1 Konstrukce PPV insertního plasmidů pPP-UV2 a pPP-U2-PT . U prvních typů konstruovaných plasmidů, pPP-UV2 a pPP-UV2—PT, se sekvence kódující tk gen viru drůbežích neštovic rozštěpí na dva fragmenty insercemi cizího genu , Plasmid pPP-U2 má podobnou strukturu jako insertní plasmid pUVl viru vakcínie (Palkner a spol.: Nucl. Acids Res. 15» 7192 (1987).). V pUVl je E.coli lacZ reporterový gen řízen čashým/pozdním P7.5 promotorem viru vakcínie (Cochran a spol.: J. Virology 54, 3θ a ž 37 (1985)·)· Promotor hlavního pozdního UK polypeptídu viru vakcínie (Bertholet a spol·: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 2096 až 2100 (1985)·) je následován násobným klonovacím místem a slouží jako regulační prvek cizího genu, který má být vložen. Obě složky jsou ob_klopeny sekvencemi tk-genu vakcínie (obrázek IA). Plasmid pPP-UV2 má stejné uspořádání lacZ repoíerového genu a promotorů. Je však obklopen sekvencí tk-genu viru drůbežích neštovic (obrázek IA). Inserce pPP-UV2 do genomového tk-místa EPV in vivo rekombinace povede, jako v případě pUVl, k inaktivaci virového tk-genu. Při konstruování tohoto plasmidů se kazeta promotor-lacZ gen z pUVl klonuje ve dvou stupních do jedinečného místa Ncol v PPV tk-genu, jako je to uvedeno na obrázku IA. Při konstruování rekombinantního plasmidů pPP-UV2-PT se cDNA lidského protrombinu vloží do .vektoru pPP-UV2 po směru vlákna 11K promotoru vakcínie. Plasmid pPP-UV2-PT se použije pro zkonstruování první řady PPV rekombinantů.

3.2 Genomová charakterizace PPV rekombinantů odvozených od pEP-UV2-PT

Aby bylo možné studovat funkční vlastnosti plasmidů

- 51 pFP-UV2-PT, byl proveden pokus iv vivo rekombinace ve fibroblastečh kuřecího embrya. Vzhledem k přítomnosti lacZ reporterového genu lze rekombinantní vir identifikovat testováním modrých plaků. Bylo vybráno několik modrých plaků. Plaky byly třikrát vyčištěny. Southernova hybridizace celkové DNA z buněk infektovaných FPV rekombinanty sondou FPV tk-genu a lacZ genu však odhalila, že nebyly pozorovány předpověděné pásy (jeden nový pás s asi 3 3®Q páry nukleotidů a lacZ genem a dva pásy s asi 1 900 a 8 500 páry nukleotidů se sondou FPF- tk-genu). Místo toho byl nalezen složitý komplex pásů včetně pásu přírodního tk-genu. Pro další krok čištění plaků a Southernovu analýzu byl vybrán jeden typický virový isolát označený f-PTl blue. S původními třemi čištěními isolátu přes plak celkem jedenáct čištění isolátu přes plak nezměnilo významně složitost komplexu pásů. Ve sloupcích 1 až 5 na obrázku 2A a obrázku 2B je ukázána Southernova analýza virových DNA třetí, pátý,'sedmý, devátý a jedenáctý stupeň čištění pásů po'zviditelnění sondou FPV tk-genu (obrázek 2A) a sondou lacZ genu (obrázek

2B). Jiný isolát, f-PT2 blue, vykazova ale nikoliv identický systém DNA pásů (obrázek 2A a 2B, sloupec 6).

Během všech stupňů nebo kol čištění přes plak byly často pozorovány bílé plaky. Dva bílé plaky, f-PTl a 2 vřhite, byly analyzovány společně s isoláty f-PT blue.'Hybridizovaly sondu lacZ genu, ale nevyvinuly modrou barvu (obrázek 2B, sloupce 8 a 9). Hybridizace. sondou FPV tk-genu odhalila ve všech případech přítomnost přírodního tk-genu (obrázek 2A, pásy 1 až 9» špička šipky). FPV přírodní kontrola je vidět na sloupci 7 a negativní kontrola (DNA. fibroblastů kuřecího embrya) ve sloupci 10. Pro demonstrování toho, že tyto nečekané objevy neexistují díky částečnému štěpení EcoSI, byl stejný blot jako je blot uvedený na obrázku 2Ax. hybridizován sondou genu protrombinu. Jak bylo ukázáno ha obrázku 20, ve všech případech (vyjma sloupce, ě; tyto větší pásy mohou existovat díky složitějšímu rekombihačnímu průběhu v genomu f-PT2 blue) byl detegován pouze jeden pás., pás protrombinu s 2 000 páry nukleotidů. To ukazuje, že restrikční štěpení bylo úplné. Složité pásy, které jsou vidět

- 32 částečnému štěpení virové DNA, ’ale odrážejí slaitečnost, že inaktivací virového tk-genu insertním plasmidem pFP-UV2-FT nelze získat genomově monoklonální rekombinant drůbežích neštovic.

5.3 Konstrukce PPV insertního plasmidu pTKm-sPll-gpt

Aby bylo možné zkontrolovat hypotézu, že tk-gen je podstatným v PPV kmenu HP1.441, zkonstruuje se nový insertní plasmid, pTKm. Místo inserce cizího genu v tomto plasmidu je umístěno v intergenová oblasti mezi tk-genem a otevřenou čtecí oblastí po směru vlákna tk-genu (5'orf). Přírodní intergenová oblast mezi tk-genem a 3'orf neobsahuje jedinečná restrikční místa pro inseroi cizích genů. Tato oblast tedy byla modifikována jak ukazuje obrázek 5· Místně řízenou mutagenesí byl bezprostředně po směru vlákna stop kodonu ,'tk-genu zaveden časný transkripční stop signál vakcínie (Rohrmann G. a spol. s Cell 46, 1029 (1986).) a jedinečná restrikční místa Clal, Smala Asp718. Do této modifikované zvětšené intergenové oblasti plasmidu pTKm byly. ve dvou stupních vloženy kazeta syntetický Pil promotor-lacZ gen a kazeta P7»5-gpt gen. Získaný plasmid byl označen pTKm-sPll-gpt (obrázek 4). Tento plasmid obsahuje lacZ gen pro testování modrých plaků a gpt-rgen jako selekční markér. Po integraci do virového genomu nebude štěpit a desaktivovat PPV tk-gen.

3.4 Rekombinantní vir drůbežích neštovic s neporušeným

PPV tk-genem . .

Plasmid pTKm-sPll-gpt se postupně použije pro zkonstruování PPV rekombinantů in vivo rekombinací ve fibroblastech kuřecího zárodku. Všechny plaky, které se získají pod gpt-selekcí, se také barvily modře v přítomnosti X-gal v převrstvené vrstvě. Bylo nutné pouze dvojí čištění plaků (pod gpt-selekcí), aby se získaly virové isoláty. Potom se jeden z isolátů označený f-sPllč.l, nechá růst ve velkém měřítka, a vyčistí se. Virová DNA rekombinantů z přírodního viru se rozštěpí působením EcoRI, rozdělí se na agarosovém gelu a analyzuje se Southernovým blotováním. Na obrázku 5A až 5C byly použity, různé sondy. Jednotlivé pásy znamenají: A) hybridizace FFV tk-sondou genu. Pás 1 znamená DNA FFV

- 33 rekombinantu f-sPll č. 1, pás 2 znamená DNA PPV přírodního viru HP1.441, pás 5 znamená lambda DNA rozštěpenou působením HindlII. B) Hybridizace sondou gpt-genu. Pás 1 znamená lambda DNA rozštěpenou působením HindlII, pás 2 znamená DNA PPV rekombinantu f-sPll č. 1, pás 5 znamená DN# FPV přírodního viru HP 1.441. C) Hybridizace sondami lacZ genu a fágové lambda DNA. Pásl znamená lambda DNA rozštěpenou působením HindlII, pás 2 znamená DNA PPV rekombinantu f-sPll Č. 1, pás 5 znamená DNA PPV přírodního viru HP1.441. Hodnoty, které jsou uvedeny vpravo pro srovnání znamenají standardy v tisících párů nukleotidů. Na obrázku 5A byly restrikční fragmenty hybridizovány sondou PPV tk-genu. V rekombinantní DNA jsou viditelné dva nové fragmenty o 5 200 párech nukleotidů a 4 700 párech nukleotidů (pás 1). U kontroly je viditelný tk-pás přírodního typu o 5 5θ0 párech nukleotidů. Po hybridizaci sondou gpt-genu (obrázek 5B) byl získán fragment o 5 200 párech nukleotidů (pás 2), který obsahuje část tk-genu a gpt-sekvence, zatímco u viru přírodního typu nebyl pozorován žádný signál (pás 5)· A konečně, hybridizace sondami lacZ genu a fágu lambda (obrázek 50) odhalila lacZ gen o 4 700 párech nukleotidů obsahující fragment rekombinantního viru (pás 2) a markér (pás 1). A opět - vir přírodního typu (pás 5) nehybridizoval. Z tohoto pokusu lze vyvodit, že intergenová oblast mezi PPV tk-genem a 5'orf je ne-podstatná a že neporušený tk-gen umožňuje čištění příslušných PPV rekombinantů.

5.5 Nové PPV hostitelské kmeny: f-TK2a a f-TK2b

Z technických a biologických důvodů je obtížnější a více času potřebující zkonstruovat rekombinantní PPV. Před vložením genu, o který se jedná, do PPV, se proto obvykle zkonstruuje rekombinant podobného viru vakcínie, aby se studovala funkce příslušného genu. Aby bylo možné používat ^ejné insertní plasmidy vakcínie také pro zkonstruování rekombinantů drůbežích neštovic, tk-gen viru vakcínie spolu s E.coli lacZ genem se vloží do intergenové oblasti tk-genu a 5'orf viru drůbežích neštovic. Plasmidy pTKm-Wtka a pTEm-Wtkb se zkonstruují klonováním funkčního VV tk-genu da? meziproduktu - do plasmidu pTKm-sPll (obrázek 4). Po rekombinaci pTKm-Wtka abs PPV přírodním virem se vytvoří dva nové FFV hostitelské kmeny (pojmenované f-TK2a a fTK2b). Nový hostitelský kmen tedy obsahuje dva funkční tk-geny a lacZ gen. Všechny se mohou používat jako nové-nepodstatné ,₌ místa s.příslušnými insertními plasmidy jako. substráty pro rekombinaci. Southernova blotová analýza nových kmenů je uvedena na obrázku. 6A až 60. DNA. přírodního viru HP1.441, dva /rekombinanty a plasmidy pTKm-VVtka a pTXm-Wtkb sé rozštěpí restrikčními enzymy Pstl, Ulál a EcoRI, rozdělí se na 1% agarosovém gelu a přenesou se na nitrocelulosu. Bloty na obrázcích 6A až 6G se hybridizUjí sondou FFV-tk-genu.(obrázek 6A), sondou tk-genu viru vakcínie (obrázek 6B)a sondami lacZ'genu a lambda DNA (obrázek 60). Ve všech štěpeních lze pozorovat předpověděné sestavy pásů (váz obrázek 6D a 6E). V případě špětení působením Clal malé hybridizující fragmenty o asi 5θθ párech nukleotidů a 700

I párech nukleotidů v pásech 5 a 6 na obrázku 6B nejsou vidět ^II při štěpení původních plasmidů působením Clal (pásy 13 a 14. na obrázku 6B). Je tomu tak proto, že plasmidové DNA še isolují z E.coli kmene HB101, kmene, který methyluje příslušné Clal místo. Při kontrolních pokusech bylo toto místo štěpi* telhé, jestliže se DNA připraví z E.coli kmene negativního ^!t na Dam methylaci.•3%'Příklad 4

Časný/pozdní promotor víru drůbežích neštovic v rekombinantech viru vakcínie

4.1 Identifikace promotorů drůbežích neštovic

Transkripční jednotka, která sestává z promotoru viru vakcínie a z kódující sekvence lacZ genu, je aktivní v buňkách E.coli. Výsledkem je fenotyp bakteriálních kolonií, které rostou v. přítomnosti chromogenního substrátu X-gal, positivní na β-galaktosidasu. Tento jev byl pozorován, jestliže se pracuje s insertními plasmidy vakcínie, které obsahují E.coli lacZ gen v lacZ negativních E.coli kmenech (Chakrabarti a spol.: Mol. Cell Biol. 2» 3403 až 3409 (1985)®)· Jelikož promotorové sekvence FPV'a vakcínié jsou funkčně ekvivalentní (Boy le a Coupars J. Gen. Virol.

- 35 67« 1591 až 1600 (1986), Taylor a spol.: Vaccine 6, 497 až 503 (1988).), měly’bý být aktivní v E.coli také promotory drůbežích, neštovic. Na základě toho byla vypracována strategie identifikace prvků promotoru DNA viru drůbežích neštovic.

Jako první stupeň se zkonstruují plasmidy pEP-Zl a pFP-Z21 (obrázek 8). Oba. plasmidy obsahují bezpromotorový lacZ gen. Jako rodičovský plasmid byl vybrán plasmid pFP-UV2. Obsahuje E.coli lacZ gen kontrolovaný Ρ7·5 promotorem viru vakcínie, Pil promotorem a násobným klonovacím místem pro účely klonování a je obklopen tk-sekvencemi viru drůbežích neštovic. Pro deletování promotorů vakcínie se zavede nové místo EcoRI, 7 párů nuk. proti směru vlákna iniciačního kodonu lacZ genu. Štěpení působením EcoRI a opětovná ligace vede k plasmidů pFP-Zl, který obsahuje jedinečná restrikční místa přilehlá k bezpromotorovému lacZ genu. V dalším stupni se DNA kmene HP1-441 viru drůbežích neštovic rozštěpí působením, restrikčníčh .endonukleas SspI a EcoRI a klonuje se do jedinečného místa Smál přilehlého k lacZ genu plasmidu pFP-21 (obrázek 9)· Tyto plasmidy se. transfektují do E.coli kmene NM352 negativního na β-galaktosidasu a vysejí se na agarové desky obsahující ampicilin a X-gal. Nechají se růst přes noc. U malého procenta kolonií se vyvine .modrá barva i Některé kolonie se vyberou. Plasmidová DNA se analyzuje analýzou přechodné exprese v CV1.1 buňkách na expresi genu specifického pro vir vakcínie (data neuvedena). Plasmidové. DNA indukovaly (plasmidové DNA indukovaly) různá množství β-galaktosidasové aktivity analýzou přechodné exprese ve vakcínií. Pro další analýzu se vybere klon, který má nejvyšší účinnost (klon c. 2), promotor se označí ”P2 a plasmid se'označí pFP-2 (obrázek 9)·

4.2 Struktura promotoru P2 viru drůbežích neštovic

DNA P2 promotorového insertu o 2 500 párech nukleotidů z plasmidů pFP-2 se analyzuje restrikčním mapováním. Bylo zjištěno, že EcóRI/NsiJfragment o 560 párech nukleotidů je vedle lacZ genu a že tedy by měl obsahovat promotorové sekvence. Tento fragment se vloží do plasmidů pFP-221, derivátu plasmidů pEP-Zl, který má na 3'konci lacZ gen a

- 36 polylinkerový insert (obrázek 8). ~ Kazeta promotorového lacZ ~ genu se pak . vystřihne a klonuje se do jediného místa

Hpal plasmidu pTZgpt-dP. Výsledkem jsou plasmidy pTZgpt-P2a a pTZgpt-P2b (obrázek 9). Jelikož_ orientace transkripční jednotky přomotorůvého cizíc^o genu může ovlivnit hladinu transkripce, oba plasmidy byly použity pro další výzkumy. Sekvenování promotorovéno insertx se ^povádí pomocí plasmidu pTZgpt-P2a jako templátu. Primární struktura promotoru a prvních deset kodonů P2 genu je uvedena na obrázku 10A.

5'-Nepřekládaná oblast má délku 174 párů nukleotidů a začíná v místě Nsil. Proti směru vlákna iniciačního kodbnu je přítomna šachovaná promotorové konvenční sekvence viru neštovic TAAAT (obrázek 10A, polohy -6 až -2), která je typická pro pozdní promotory, ale nachází se také v některých časných promotorech. Uvnitř oblasti prvních 174 párů nukleotidů proti směru vlákna je přítomno také několik “kritických časných oblastí” následovaných stop signálem“časné . transkripce (TTTTTNT). Stop signál časné transkripce se překrývá s funkčně důležitou oblastí bohatou na T pozdních promotorů.

P2-lacZ transkripční jednotka v plasmidu pTZgpt-P2a je napojený gen. Po iniciačním kodonů následuje 360 párů nukleotidů P2-genu napojeného ve fázi s 39 nukleotidy 5' nepřekládané oblasti a kódující oblasti lacZ genu (data' nejsou uvedena). Vypočtená molekulová hmota napojeného genu je 133 000.

4.3 Srovnání síly P2 pron&oru s jinými promotory viru neštovic

Pro zkonstruování rekombinantů vP2a a vP2b viru vakcínie se použijí plasmidy pTZgpt-P2a a pTZgpt-P2b. Síla P2 profl&oru v obou rekombinantech bylá srovnávána še silou jejich promotorů viru neštovic. Rekombinant vakcínie vPlsp (Palkner a Moss: J. Virol. 62, 1349 až 1854 (1988)·) obsahuje přírodní versi Pil promotoru vakcínie. Rekombinant vakcínie vart obsahuje modifikovanou versi syntetického pozdního promotoru, který je 1,4 krát silnější než Pil přírodní promotor. Ve všech virech je lacZ reporterový gen bezprostředně přilehlý k přírodním promotorům viru neštovic.

- 37 ^rro anal ýzu β-galaktosidasové aktivity se CV-l buňjky infektují viry tak, jek je to popsáno v -prvním příkladu. Obrázek 11 ukazuje enzymatické aktivity indukované různými virovými konstrukcemi v CV-l buňkách. Aktivita přírodního Pil promotoru v vFls3 byla definována jako 100 %. Je pozoruhodné, že ”b” orientace FPV P2 promotoru indukuje aktivitu 190 %. To ukazuje, že P2 prostor patří k nejsinějšim promotorům viru neštovic. Po dvacetičtyřhodinové inkubační periodě je β-galaktosidasová aktivita jedním z nejhojněji se vyskytujících proteinů. Jeho množství je asi 6,3 % z celkového množství rozpustných buněčných proteinů. Pekombinantní vir, který má a” orientaci P2 promotoru, indukoval 15θ % β-galaktosidaéové aktivity, což je asi 5 % rozpustných buněčných proteinů. Bylo zjištěno, že vir vart indukuje 140 % β-galaktosidasové aktivity ve srovnání se standardními hodnotami indukovanými νΡΙεβ. Měřené β-galaktošidasové aktivity znamenají střední hodnotu ze tří.na sobě nezávislých měření, pokusů. Aby se potvrdily tyto hodnoty nezávislou druhou metodu,, rozdělí se dvacetičtyřhodinové extrakty infektovaných CV-l buněk na 10% polyakrylamidových, gelech a vyhodnotí se densitometrem. β-Galaktosidasová maxima byla kv§titativně vyhodnocována vzhledem k pásu o molekulové hmotě 42 000 jako vnitřnímu standardu (aktin). Hodnota, která se získá pro vFls3, opět slouží jako standardní hodnota 100 %. Data získaná tímto -vyhodnocením jsou v dobrém souladu s enzymaticky stanovenými daty aktivit, jak ukazuje následující tabulka.

Tabulka

vir	relativní exprese β-galaktosidasy (procenta β-galaktosidasy v rozpustných proteinech)
% aktivity	% vyhodnocení
vFls3	100 (3,3 %)	100
vP2a	150 (5,0 %)	I50
vP2b	190 (6,3	195
vart	140 (4,6 %)	ne s ta no vována

Pro ilustrování hojného výskytu β-galaktosidasy v buněčných extraktech 24 hodiny po infekci je na obrázku 12

- 33 ukázán pólyalm?ylamidový gel obarvený modří comassie obsahující veškeré rozpustné proteiny. Referenční vir, νΕΙεβ, a rekombinant vart indukují nový pás v oblasti molekulové hmoty 117 000 (viz pásy. 3, 4, 9 a -10,.. nižší šipka),-který není vidět u kontrolního přírodního viru (pásy 1 a 2).

Jak ukazuje sekvenační analýza, ,8-galaktosidasový napojený protein indukovaný viry vP2a a vP2b je větší než přírodní enzym, což prokazuje jeho charakter jako napojeného genu (pásy 5 až 3, horní šipka).

4.4 Optimalizace P2 promotoru

Při pokusu optimalizovat P2 genový promotor byl zkonstruován panel nových insertníoh plasmidů, které obsahují mutované P2 promotorové oblasti napojené na lacZ gen. Jako první stupeň se získá plasmid, který umožňuje prosté vložení dvouvláknových promotorových oligonukleotidů a obsahuje minimální kazetu P7*5-gpt gen kvůli selekci. Zkonstruování tohoto plasmidu, pFSgpt, je uvedeno na obrázku 13« Do jedinečných míst tohoto plasmidu Ndel a BamHI se vloží různé mutované promotorové oligonukleotidy mO, ml a m2. Výsledné $ plasmidy se označí pP2m0gpt, pP2mlgpt a pP2m2gpt (pP2mx^, ob^ř^ek 14). V dalším stupni se E.coli lacZ gen umístí po směru vlákna promotorových sekvencí. To vede k plasmidům pP2m0gpt-lacZ, pP2mlgpt-lacZ a pP2m2gpt-lacZ (pP2mxgpt-lacZ, obrázek'14).

V mutovaném promotoru mO (TAAATG AAT TCC) je ATG lacZ genu přímo napojen na střední sekvenci pozdního promotoru. Dochází tak k deleci C-zbytku v poloze -1 přírodní P2 sekvence a tedy ke vzniku mutace, která by mohla zlepšit účinnost pozdního promotoru (obrázek 15). Tato struktura se nalézá v mnoha pozdních promotorech vakcínie a je považována za optimální souvislost pozdního promotoru a iniciačního kodonu.

V mutantu ml (TAAACATG AAT TCC) je druhý kodon lacZ genu přímo napojen na ATG zdánlivého P2 genu. V tomto mutantu je lacZ gen řízen P2 přirozeným promotorem (obrázek 15).

- 39 Mutace m2 byla zkonstruována proto, aby byla zkoumána úloha, kritických oblastí časného promotoru nacházejících se proti směru vlákna v oblasti P2 genu* Mutovaný promotor m2 má stejnou strukturu jako ml až na tom že stop signál časné SNA uvnitř funkčně důležité na T bohaté oblasti proti směru vlákna motifu pozdního promotoru byl desaktivován insercí TTG do polohy -18 (obrázek 15).

4.5 Vliv mutací na časnou a pozdní expresi β-gal ^,J-yto plasmidy byly použity pro zkonstruování rekombinantů viru vakcínie a pro infektování CV-1 buněk. Cytoplasmové extrakty byly analyzovány na β-galaktosidasovou aktivi tu»⁷ Výsledky jsou uvedeny na obrázku 16.

Ρ A Τ ΕΝ TOYS

Claims (2)

1. Ρ A Τ ΕΝ TOYS

   -ο TJ > ° ο < <=· 03 ί

   I <— 7- >

   2 třSr

   CD ><

   CO hJ σί

   Β > cn

   -J oo o

   t*

   Plasmid, vyznačující se tím , že obsahuje alepoó PPV tk-gen, po směru vlákna intergenovou oblast a následující 3' otevřenou čtecí oblast (3 'orf) viru drůbežích neštovic (PPV), kde uvedená intergeňová ofcrlast je modifikována tak, aby tvořila zvětšenou intergenovou oblast, která obsahuje jedno nebo více jedinečných restrikčních míst, což umožňuje inserci cizí DNA takovým způsobem, že PPV tk-gen zůstává neporušen a kóduje celou thymidin—kinasu (TK).

   2. Plasmid podle bodu 1, vy z n a č u jí c i se tím , že po sekvenci tk-genu následuje stop signál časné transkripce viru neštovic.

   3. Plasmid podle bodu 1, vyznačující se tím, že uvedená zvětšená intergenové oblast obsahuje následující sekvencí:

   AGTAATTAAGGTTTTTATCGATCCCGGGTACCGGTTTAGTGTAATAAATTTAAT

   I tk-gen

   STNT ^ř'UráT

   Smalt

   Asp?18 zvětšená iíe^en. oblast zvětšená intergenová oblast

   3'orf

   4. Plasmid podle bodu 1, vyznačující se tím, že je ho možné získat místně řízenou mutagenesí.

   5. Plasmid podle bodu 3j vyznačující se tím, že je ho možné získat-místně řízenou mutagenesí přírodní sekvence sekvencí primeru 5'-TTAOACTAAATCQ^ACCCGGGATCG ATAAAAAOOTTAATTACTA-3'· z~\

   6. Plasmid podole pffKm na obrázku 4A.

   7. Plasmid pro inserci cizí DNA do PPV in vivo homologní rekombinací, vyznačující se t i m , že

   - 41 se uvedený plasmid připravuje z plasmidu podle bodů 1 až 6 a obsahuje:

   a) přírodní nebo syntetický promotor viru neštovic napojený na cizí DNA sekvenci, která se expresuje,

   b) druhý promotor viru neštovic napojený na gen kódující markér nebo indikátor pro výběr (selekci) rekombinantniho PPV a

   c) DNA sekvence PFV obklopující konstrukci prvků podle ad a) a ad b) na obou 5* a 3* koncích, při čemž uvedené obklopující DNA sekvence jsou homologní se sekvencemi proti směru vlákna a po směru vlákna zvětšené intergenové oblasti.

   8'» Plasmid podle bodu 7, vyznačující se tím, že dále obsahuje replikon pro replikaci plasmidu v prokaryotickém hostiteli a gen kódující selektovatelný markér nebo indikátor pro selekci (výběr) plasmidu v transformovaném prokaryotickém hostiteli.

   9. Plasmid podle bodu 7 a 8, vyznačující se tím , že promotor je bezprostředně přilehlý ke kódující sekvenci cizího genu.

   ΙΟ.· Plasmid podle bodu 7 až 9, vyznačující se tím , že se jako promotor viru neštovic používá PPV P2 promotor, který má částečnou nebo úplnou sekvenci DNA jak níže uvedeno:

   Nsi -125

   ATGCATTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAC AACTAAGTAA TTGTAAAGAA_

   -99 -95 -86

   GAAAACGAAA CTATCAAAAC CGTTTATGAA ATGATAGAAA AAAGAATATA . .. _ . . -42

   AATAATCCTG TATTTTAGTT TAAGTAACAG TAAAATAATG AGTAGAAAAT

   - 4$ -1+1

   ACTATTTTTTATAGCCTATAAATC ATG GAA AAG AAA CTG ATT CAA

   GAG TAT GAA nebo jeho funkční ekvivalent.

   - 42 11. Plasmid. podle bodu. 7 až 10, v y z n a č u j i c i s e tím , že se jako promotor viru neštovic používá mutant FPV P2 promotoru, který má DNA sekvenci uvedenou na obráz ku 15.........

   12. Plasmid podle bodu 7, vyznačující se _P t i m , že se používá insertní plasmid pTKm-sPll-gpt z obrázku 4A, v němž lacZ gen je nahrazen DNA sekvencí, která má být expresována.

   13. Rekombinantní VPF pro expresi cizího proteinu nebo jako vakcína, který je získatelný in vivo rekombinací přírodního FPV plasmidem podle bodů. 7 až 12, i

   14. Rekombinantní FPV f-TK2a a f-TK2b jako hostitelský vir, vyznačující se tím , že obsahuje ale— spon neporušený FPV tk-gen a také W tk—gen, z nichž kterýkoliv může sloužit jako ne-podstatné místo (NES) pro inserci jedné nebo více cizích DNA sekvencí.

   15. Rekombinantní FPV podle bodu 14, vyznačující se tím , že dále obsahuje gen selekčního markéru a/nebo reportéru.

   16. Plasmid podle pTZgpt-P2a na obrázku 9.

   17. Plasmid podle pTZgpt-P2b na obrázku 9.

   1S. Plasmidypodle pP2m0gpt, pP2mlgpt a pP2m2gpt (pP2mxgpt) na obrázku 14A.

   sj)odle

   19. PlasmidYpES50 na obrázku 13A.

   >.podle _z

   20. PlasmidYpES51 na obrázku 13A.

   21. Plasmid podle pFSgpt na obrázku 13A.

   xpodle

   22. PlasmidVpTZgpt-Fls na obrázku 17A.

   Pí a amid podle .nTZgpt-PUM na obrázku 17A....... _

   - 43 24. Plasmid pro vložení cizí DNA a následnou integraci do hostitelských kmenů podle bodu 14 in vivo rekombinací, vyznačující se tím , že jde o jeden z pPSpl a pPSgpt na obrázku 13A, pP2mxgpt na obrázku 14A, pTZgpt-Fls a pTZgpt-PllM na obrázku 17A a

   b) pTKm-sPll-gpt na obrázku 4A, pTZgpt-P2a a pTZgpt-P2b na obrázku 9 a pTZgpt-sPx na obrázku. 17B, při čemž lacZ genové inserty v těchto plasmidech jsou nahrazeny DNA sekvencemi, které mají být expresovány.

   25. Plasmid podle bodu 24, vyznačující se tím , že sPx v konstrukci plasmidů pTZgpt-sPx znamená sPll, S4b nebo sart jak je to uvedeno na obrázku 18·

   26. Rekombinantní FPV pro expresi cizího proteinu nebo jako vakcína, který je získatelný in vivo rekombinací hostitelského kmene podle bodu 14 a kteréhokoliv z plasmidů podle bodu 24.

   27. In vitro kultura vertebrálních buněk, vyznačují cí se tím , že je infektovana , rekombinantním PF? podle bodu 13 nebo 26.

   28. In vitro kultura podle bodu 27, vyznačující se tím , že sestává z fibroblastových buněk kuřecího zárodu (GBP) nebo kožních (dermálních) buněk kuřecího zárodku (GED).

   29. Způsob rekombinantní přípravy proteinu, vyznačující se tím, že se vertebrální hostitelské buňky nebo buněčné kultury infektují rekombinantním virem podle kteréhokoliv z předcházejících bodů, při čemž iu vedený rekombinantní vir obsahuje DNA kódující uvdený protein a uvedený protein se isoluje.^

   30. Způsob podle bodu 29, vyznačující se tím , že dochází k expresi jednoho z následujících proteinů: faktor II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII a XIII, protein G, protein S, von «Ti Ile brand-faktor, áasminogen a jeho deriváty, v nichž jedna nebo více aminokyselin je substituováno, vynecháno nebo vloženo, částečných sekvencí a jejich aktivovaných forem, apoliproteiny, jako je například apoAI a apoAII, a virové antigeny, jako je například antigen(y) hepatitidy B, antigeny.viru hepatitidy 0, antigeny viru hepatitidy 3, antigenyVéncefalitidy přenášené klíštětem (T33), antigeny HIV, HSV a celé nebo částečné sekvence takových antigenů organismů, které způsobují pertusis (Černý kašel), tetanus, malarii, choroby drůbeže, Markovu chorobu, ΙΙΖΓ, infekční choroby, bronchitidu, kokcidiosu a Newcastlovu nemoc, shora uvedené antigeny jsou užitečné jako vakcíny.

   /

   31. Vakcína proti antigenům pathogenů infikujících ptáky a obratlovce, vyznačující se tím, že obsahují rekombinantní FPV podle bodů 13 až 15 a 26.

   32. DNA sekvence ?FV P2 promotoru podle bodu 10, její částečná sekvence nebo její funkční ekvivalenty.

   33. PNA sekvence obsahující FPV P2 promotor , P2 gem a 3* sekvenci jako uvedeno níže:

   Nsil -125

   ATGCATTTGT TAGAGCTTGG TATAGCGGAO AACTAAGTAA TTGTAAAGAA „99 „95 -36

   GAAAAOGAAA CTATCAAAAC CGTTTATGAA ATGATAGAAA AAAGAATATA

   AATAATGGTG TATTITAGTT TAAGTAACAG

   ---19 -1+1

   AGTATTTTTTATAGCGTATA AATCATGGAA —42

   TAAAATAATG AGTAGAAAAT

   AAGAAACTGA TTCAAGAGTA

   SGAAAAACTC

   TTATCTGCGA

   AAAGGCCAAG AGGGGAAAGA

   CC-AAGATATG CGTGGCAGAA

   TGTCTTTACG AGGGAGGTAC

   TGGAGAACAT GACTAAGTTA

   ATTAGTGACG

   TATTTAGAAC

   ATTGGCTGGA

   GGTAGTAGCA

   AAGCACCCAC

   - 45 CGAGAAGTCG GATATTGATA CGATGCCTCC TTCTAATGAT GCTGGTTGTG agccacagcc ccaacctagc c-aaagtaaac cagccgagca accctctccc

   GAACCCGAAA AAGACTCTTC TAGTAAACCA TCAGATCAAC CTACTCCCGA

   ACCCGAAAAA GC-CTCTTCTA GCAAACCCCG TACAGATATC TTTAGTGGTT

   TAGGTAATAA AGAAATTAAT TTTTGAAAGA ACTGTTGGAG CATTTATCCA

   ΑΤΑΤΤΑΤΤΑΤ TTAATTTAAA TGAATTGAGT TAATGTAATA ACTTTTTAGA

   TATATTTTGC TGTAGTCGGA AATAGGAAAT TAGCAAAAAA TAATGATTAT

   ΤΑΤΑΤΑΤΤΑΑ TGTTTTAACT TAATAATTAA TTTATAAAAT ATTTATTGTC

   ACATCCGTTC TTTATCACGT TATCGTACGT GGTAGGTAGT TATGGATGTŤ

   TTTATCATTA CTTTTTGTAA TGATAGTAAA : TAGTATGAGA

   GCAGATTTAA TTACTTCTGT GATATACAAT ACATGTATTA AGGATTACCC

   GCACCCAAAA ATAATATCGT GATGTGTAAT ΑΤΑΤΑΑΑΑΑΤ AAATACCATA .CTATATGTTT.ATATCACCAA tcatggtaaa aatagtgttt gtgatgaattc EcoRI nebo její částečná sekvence nebo její funkční ekvivalent.

   34. Rekombinantní PPV, vyznačující se tím, že 3'-oblast po směru vlákna PPV P2 genu se používá jako ne-podstatné místo pro inseroi cizí DNA.

   Zastupuje
2. 2<3o -