CZ289455B6 - Cílený cytotoxický T-lymfocyt, způsob jeho výroby, vektor pro pouľití v tomto způsobu a vakcína - Google Patents
Cílený cytotoxický T-lymfocyt, způsob jeho výroby, vektor pro pouľití v tomto způsobu a vakcína Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289455B6 CZ289455B6 CZ19971442A CZ144297A CZ289455B6 CZ 289455 B6 CZ289455 B6 CZ 289455B6 CZ 19971442 A CZ19971442 A CZ 19971442A CZ 144297 A CZ144297 A CZ 144297A CZ 289455 B6 CZ289455 B6 CZ 289455B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- lymphocyte
- cytotoxic
- tcr
- cells
- vector
- Prior art date
Links
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 130
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 44
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 36
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 14
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 4
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 4
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 3
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 2
- -1 phosphoribosyl Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Natural products O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 abstract 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 50
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 11
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 8
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 4
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 3
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 3
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 3
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 2
- 108010004141 HLA-B35 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 206010072082 Environmental exposure Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010083312 T-Cell Antigen Receptor-CD3 Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000037913 T-cell disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- WNKZOJNKBOBRAY-UHFFFAOYSA-N cdba Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1.O1C(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC(C(O)C2O)C(COC)OC2OC(C(C2O)O)C(COC)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2COC WNKZOJNKBOBRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000005853 oncogenic activation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
- A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
- A61K40/4244—Enzymes
- A61K40/4253—GTPases, e.g. Ras or Rho
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
- A61K40/4267—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K40/4268—MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/46—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
C len² cytotoxick² T-lymfocyt, jeho TcR obsahuje heterologn .alfa. a .beta. polypeptidy, p°i em tyto heterologn polypeptidy poskytuj lymfocytu omezenou specifitu MHC t° dy pro c lov bu ky, kter zp sobuj chorobu, p°i em T-lymfocyt je monovalentn a m jeden druh TcR, poskytuj c omezenou specifitu MHC t° dy I pro jednu t° du c lov²ch bun k. Zp sob v²roby c len²ch cytotoxick²ch T-lymfocyt spo v v tom, e (a) vytvo° se vektor, obsahuj c DNA s v²hodou DNA odvozenou od d rce cytotoxick ho T-lymfocytu k duj c .alfa. a .beta. TcR polypeptidy specifick pro c lov bu ky, kter zp sobuj chorobu, (b) transfektuje se recipientn cytotoxick² T-lymfocyt vektorem, z skan²m ve stupni (a), pro produkci rekombinantn ho cytotoxick ho T-lymfocytu, kter² m DNA k duj c .alfa. a .beta. TcR polypeptidy specifick pro c lov bu ky, zp sobuj c chorobu, p°i em rekombinantn cytotoxick² T-lymfocyt ze stupn (b) exprimuje DNA, k duj c .alfa. a .beta. TcR polypeptidy poskytuj c lymfocytu omezenou specifitu MHC t° dy I, a t m jej zam °uj na c lov bu ky. Vektor pro pou it v uveden m zp sobu zahrnuj c DNA k duj c .alfa. a .beta. TcR polypeptidy specifick pro bu ky zp sobuj c chorobu, s v²hodou DNA operativn spojenou s expresn m elementem nebo s expresn mi elementy, p°i em tento expresn element nebo tyto expresn elementy jsou voleny nap° klad z transkrip n ch a/nebo transla n ch element , promotor , m st nesouc ch ribozom, pomocn²ch prvk , regula n ch m st, s v²hodou aktiv torov²ch a represorov²ch m st a expresn ch element p°irozen spojen²ch s .alfa. a/nebo .beta. TcR peptidov²mi geny.\
Description
Vynález se týká cílených cytotoxických T-lymfocytů a jejich použití, zejména cílených cytotoxických T-lymfocytů, které mají heterologní a a β T-buněčné antigenní receptorové polypeptidy, které jsou MHC-omezeně specifické vůči cílovým buňkám, které jsou příčinou chorob. Vynález se rovněž týká vektoru pro použití v uvedeném způsobu výroby a vakcíny obsahující cílený cytotoxický T-lymfocyt.
Dosavadní stav techniky
Imunitní systém zahrnuje řadu různých buněčných typů a molekul, rozložených v organismu. Zdravé jedince imunitní systém chrání a zabraňuje invazi patogenů, parazitů a buněk, které se změnily na infekční nebo rakovinné.
Buněčným základem pro část základních vlastností imunitního systému je lymfocyt. Lymfocyty se dělí na dvě třídy: B-lymfocyt (nebo B-buňka), který je odpovědný za humorální odpovědi (zprostředkované rozpustnými protilátkami) a T-lymfocyt (nebo T-buňka), který je odpovědný za buňkami přenášené odpovědi.
T-lymfocyty se dále dělí na inter alia cytotoxické T-lymfocyty (které identifikují a zabíjejí infikované, aberantní nebo maligní cílové buňky) a pomocné T lymfocyty (které stimulují, rekrutují a aktivují široké spektrum typů buněk potřebných při vytváření imunitní odpovědi).
T-lymfocyty rozpoznávají cílové buňky pomocí T-buněčných receptorů (jak je zde dále rozvedeno, TcR). TcR samy obecně nezpůsobují přenos k antigenu. Spíše lze říci, že TcR rozpoznávají antigen jako část glykoproteinového komplexu na buněčném povrchu, který je kódován geny třídy I nebo třídy II hlavního histaminkompatibilního komplexu (dále v textu označováno jako MHC = major histocompatibility complex, a to MHC třídy I aMHC třídy II). Cytotoxické T lymfocyty obecně rozpoznávají antigeny ve spojení s MHC třídy I, zatímco pomocné T lymfocyty obecně rozpoznávají antigeny ve spojení s MHC třídy II.
Výsledkem je, že rozeznání cílových buněk T-lymfocyty je omezeno jen na cílové buňky, schopné vystavit antigen ve spojení s určitým navázaným proteinem (viz struktura molekuly MHC třídy I a třídy II). Primární roli T-lymfocytu lze proto spatřovat v monitoringu buněčného povrchu těles za účelem rozpoznání (nebo detekce v případě pomocných T buněk) a následujícího zničení aberantních, infikovaných nebo maligních buněk.
T buněčný receptor (TcR)
TcR je proteinový komplex, jehož jeden typ je tvořen dvěma disulfidovými zesíťovanými polypeptidickými řetězci (a řetězec a β řetězec) které jsou spojeny na buněčném povrchu T-lymfocytu s jinými molekulami, a a β řetězce TcR jsou schopny vybavit T-lymfocyt specifitou pro MHC i pro antigeny (třídy I nebo II). Proto se pro definování duální (t.j. MHC a antigenové) specifity požadují pouze a a β komponenty.
a a β řetězce zahrnují stálé a variabilní úseky, které jsou homologní s úseky imunoglobulinu V a C a odpovídající strukturální geny mají uspořádání DNA odpovídající podobným imunoglobulinovým genům. Strukturní repertoár imunoglobulinů aTcRjsou si podobné (asi 1012 na jedince).
Geny, kódující a a β řetězce TcR již byly klonovány a sekvencovány (viz např. Robertson (1985), Nátuře 317, 768-771) Také TcR a a β řetězce již byly přeneseny zjedné T-buňky do jiné za účelem získání klonu T buňky s jinou specifítou (viz např. Dembic et al., 1986, Nátuře 320, str. 232 až 238).
TcR se klonálně distribuují: TcR každého T lymfocytu jsou specifické pro právě jeden antigenní determinant (lze si představit, že na každé buňce mohou být stovky a tisíce stejných druhů TcR). Proto je každý T lymfocyt normálně z hlediska TcR-zprostředkovaných vazeb monovalentní.
Uvedené a a β řetězce jsou připojeny k několika jiným molekulám, včetně proteinů CD3 komplexu a asociovaných zeta a eta peptidů. TcR-CD3 komplex přenáší signál z TcR do vnitřku T lymfocytu pokud TcR rozpozná hledaný komplex peptid-MHC, a tím uvede buňku do aktivace.
Exprese aberantních genů, onemocnění a odezva T buňky
Zdraví jedince závisí na koordinované a citlivě regulované expresi mnoha tisíc různých genů. Aberace a alterace exprese genů, dokonce i když je velmi malá, může proto vést k mnoha různým nemocem, mezi které patří rakoviny, a různé poruchy autoimunity.
Aberantní genovou expresi mohou způsobit různé faktory. Tak například může být alterována mutací exprese endogenních genů nebo struktur proteinů jimi kódovaných. Takové mutace mohou být spontánní, ale často jsou indukovány karcinogeny přítomnými v prostředí. Zavedení exogenního genetického materiálu do buněk jedince může mít za následek disurpci genové expresní matrice, aktivaci normálně tichých genů a/nebo syntézu cizích (například virových) proteinů.
Jedním z důležitých příkladů konsekvence indukovaných aberací genové exprese je vytváření nádoru. Vytvoření nádoru charakterizuje většinu rakovin a nádory vznikají nadměrnou abnormální expresí HER-2/neu protoonkogenu. Kromě vzniku choroby na organické úrovni může být dalším fenotypovým důsledkem změněné exprese genu také produkce neoantigenů. Výraz neoantigen se zde používá v takovém významu, že zahrnuje nejen nové antigeny vycházející z mutantu nebo z cizích sekvencí aminokyselin, ale také nové antigeny vycházející z exprese normálního tichého genu divokého typu, nebo z nadměrné exprese genů divokého typu, které jsou normálně exprimovány v relativně bezvýznamném měřítku.
Produkce neoantigenů může mít za následek alterace antigenů na povrch buňky, a tyto alterace mohou zase vyvolat imunitní odpověď. Tak například v séru pacientů s tumorem byly nalezeny protilátky řízené proti onkogenním produktům acytotoxické T-lymfocyty, které rozpoznávají a eliminují nádorové buňky byly demonstrovány na mnoha modelových systémech.
Alterace v antigenech na buněčném povrchu, schopných triggerovat cytotoxické T-lymfocyty může vést k následné intracelulámí změněné činnosti mutanta. Vznikají cizí nebo chybně exprimované proteiny a peptidové fragmenty, které se mohou promítnout na buněčném povrchu jako část komplexu peptidů MHC třídy I, rozpoznatelných cytotoxickými T-lymfocyty. Touto cestou mohou být aberantní buňky rozpoznány a zneškodněny T-lymfocyty.
Kromě alterace antigenů na povrchu buňky, chybné exprese proteinů cizích (například viry změněných) nebo mutantních proteinů může způsobit vznik exogenních neoantigenů (např.
-2 CZ 289455 B6 virových částic nebo fragmentů), které mohou být rozpoznány membránově vázanými imunoglobuliny na povrchu B-iymfocytů, intemalizovaných, změněných a podmíněně přítomných jako pomocné T-buněčné antigeny v podobě komplexu s molekulami MHC třídy II na povrchu Bbuněk. B-buňka, na které je přítomen antigen v důsledku tohoto mechanismu, může být rozpoznána pomocnou T-buňkou přes interakci specifického TcR-peptidu MHC třídy II a dále stimulována k vývoji sekrece velkých množství rozpustných protilátek, specifických pro exogenní antigeny, do buněčné plazmy. Touto cestou mohou pomocné T-lymfocyty stimulovat humorální imunitní odpověď a nepřímo aktivovat velké množství typů imunitních buněk.
Je popsáno velké množství typů tumor-specifických nebo s tumorem spojených neoantigenů. Tak například abnormální exprese ERBB2 receptorů je spojena s mnoha lidskými rakovinami prsu a vaječníku a také je známo, že má za následek vznik ERBB2-derivátů na buněčném povrchu. Při rakovině tlustého střeva je gen adenomatosis polyposis coli (APC) obvykle napřed zasažen mutací. Jelikož tato mutace často a snadno způsobuje vstup stop kodonu (který zakončuje překlad, který má za následek produkci rozšířeného APC proteinu), v mnoha případech spočívá mutace v rámcovém posunu, který má za následek vytváření nových proteinových sekvencí a popřípadě jedinečných antigenů. Takovéto antigeny, které byly intracelulámě vytvořeny a jsou navázány na MHC proteiny, se mohou vyskytnout na povrchu buňky a mohou být rozpoznány Tlymfocyty.
V mnoha případech by se tedy mohlo očekávat, že strukturální aberace nebo abnormální exprese endogenních proteinů bude mít za následek alteraci intracelulámího vytváření těchto proteinů a vznik neoantigenů ve spojení s MHC proteiny na povrchu buňky.
V rozporu s touto shora popsanou představou imunologických následků exprese aberantního genu, přirozená imunitní odpověď, zajišťující boj proti nakaženým, aberantním nebo maligním buňkám je velmi často neadekvátní. Přestože příčinám, proč dochází k tomuto selhání, plně nerozumíme, je možné vysvětlení takové, že mnohé neoantigeny jsou imunitním systémem často považovány za tkáňově-specifické antigeny a tudíž tolerovány stejným způsobem. Navíc neoantigeny jsou tvořeny jen minoritně zdrojem peptidů pro MHC-třídy I, které řídí vytváření, a tak vznik a projevy neoantigenů mohou být extrémně neúčinné. Závěrem z toho je, že imunogenicita je determinována zčásti tkáňovým typem, ve kterém se neoantigen exprimuje, a z toho je vidět, že tolerance může být větší (a/nebo vznik a uplatnění méně účinné) u určitých typů tkání.
Pro dosažení efektivnějších imunitních odpovědí vůči aberantním, infekčním nebo maligním buněčným cílům bylo až dosud vyvinuto několik přístupů. Například bylo navrženo použít antigenů z maligních buněk jako vakcín k vyvolání tumor-specifícké, buněčně-vázané imunity.
Nověji byla navržena jako metoda léčení rakoviny adoptivní imunoterapie. Tento způsob léčení spočívá v přenesení imunitních buněk s protinádorovou aktivitou do těla pacienta, který trpí rakovinou. Vhodné imunitní buňky se odvozují od pacienta s rakovinou, kultivují, a po namnožení pomocí tkáňové kultury se reintrodukují.
Buňky, používané při adoptivní imunoterapii, zahrnují lymfokin-aktivované killerové buňky, tumorem infiltrované lymfocyty a in vitro senzibilované lymfocyty odvozené od cytotoxických lymfocytů.
Lymfokin-aktivované killerové buňky jsou cytolytické buňky, které reagují se širokým spektrem cílových buněk. Nejsou MHC-specifické a rozkládají jak nádorové, tak i normální buňky. Terapeutické postupy, založené na použití těchto buněk, mají proto tu nevýhodu, že zabíjení nádorových buněk je doprovázeno signifikantním ohrožením normálních tkání.
Nádor-infiltrující lymfocyty jsou odvozeny od nádorových tkání. Jsou účinnější než lymfokinaktivované killerové buňky a relativně specifické pro tumory, ze kterých pocházejí, čímž se
-3 CZ 289455 B6 odstraňují problémy plynoucí z neselektivního napadání normálních tkání, spojené s použitím lymfokin-aktivovaných killerových buněk. Nicméně dostupnost těchto buněk je často omezena, což je závislé na jejich přírodním výskytu v nádorové tkáni a jejich expanzi in vitro. Proto léčebné metody, založené na použití těchto buněk, by byly použitelné jenom pro určitý počet případů.
Přestože každá z adoptivních immunoterapií, která byla shora diskutována, se ukázala být schopna způsobit do určité míry regresi nádoru, terapeutický efekt byl pozorován jen v několika málo případech (a tak se projevily na pouhém zlomku pacientů).
Bylo navrženo (Moritz et al. (1994), PNAS, 91, str. 4318-4322) vylepšení účinnosti lymfocytové terapie nádorů úpravou rozpoznávací speficity cytotoxických T-lymfocytů in vitro s cílem obdařit je specificitou vůči definovaným nádorovým buňkám. Moritz et al. přistupují k tomuto problému náhradou TcR specifity (MHC-omezené) plně syntetickým pseudoreceptorem zahrnujícím protilátku s jedním řetězcem (pro poskytnutí příslušné specifity) spojeným (přes otočný řetězec) s TcR-komplexem zeta. Cytotoxické T-buňky nesoucí tento syntetický pseudoreceptor vykazují, jak bylo zjištěno, schopnost rozpoznávání nezávisle na MHC se specifitou, kterou propůjčuje navázaná protilátková komponenta.
Přesto však dochází k tomu, že použití plně syntetického pseudoreceptoru má za následek pokles účinnosti signálu a snížení aktivity T-buněk. Dalším problémem je, že specifíta rozpoznávání cílových cytotoxických T-lymfocytů popsaná Moritzem et al. je sice nezávislá na MHC, ale účinnost skenování buněčného povrchu lymfocyty je většinou snížená. Závěrem je třeba ještě uvést, že syntetický pseudoreceptor může sám vyvolat nežádoucí imunitní reakci.
Úkolem předloženého vynálezu je získat alternativní cílené T-lymfocyty pro použití například při adoptivní imunoterapii, které nemají plně syntetické pseudoreceptory, ale místo toho jsou cíleny pomocí takových TcR, jejichž struktura je v podstatě podobná struktuře normálních TcR. Normální cesta signálu je proto chráněna a rizika nežádoucí imunitní odpovědi jsou minimalizována. Kromě toho nejsou cílené T-buňky podle vynálezu MHC-omezené, takže mohou účinně skenovat povrchy buněk na aberantní antigeny.
Podstata vynálezu
V souladu s tím, tento vynález řeší cílený cytotoxický T-lymfocyt, jehož TcR obsahuje heterologní a a β polypeptidy, přičemž tyto heterologní polypeptidy poskytují lymfocytu omezenou specifítu MHC třídy I pro cílové buňky, které způsobují chorobu, přičemž T-lymfocyt je monovalentní a má jeden druh TcR, poskytující omezenou specifítu MHC třídy I pro jednu třídu cílových buněk.
Cílený cytotoxický T-lymfocyt je s výhodou rekombinantní a je transdukován virovým vektorem. Cílený cytotoxický T-lymfocyt, jehož cílové buňky zahrnují nádorové buňky, imunitní buňky, vyvolávající autoimunní reakci a/nebo buňky infikované patogenem.
Dalším aspektem vynálezu je cílený cytotoxický T-lymfocyt jehož cílové buňky zahrnují lidské melanomové buňky a heterologní a a β polypeptidy poskytují specifítu pro:
(a) antigen nádoru MAGE-1, (b) antigen nádoru MAGE-3, (c) antigen nádoru MART 1/Aa, (d) antigen nádoru gplOO a/nebo (e) tyrosinázový nádorový antigen.
-4CZ 289455 B6
Výraz heterologní a a β TcR polypeptidy je míněn tak, že znamená a a β TcR řetězce, které nejsou normálně v T-buňce exprimovány. Podle jednoho z možných provedení jsou heterologními TcR polypeptidy chiméry nebo syntetické molekuly odvozené od exprese rekombinantní nebo plně syntetické DNA. V jiném provedení jsou heterologní TcR polypeptidy přímo nebo nepřímo odvozeny od jiných T-buněk. Tyto T-buňky mohou být samy odvozeny od jakéhokoliv zdroje, přičemž podmínkou je exprese TcR komponentů s požadovanou specifitou. Například může jít o další T-buňky, pocházející ze stejného druhu (nebo dokonce ze stejného jedince), nebo z jiných druhů. Může to také být hybridom T-buňky.
Specifita proti choroboplodným cílovým buňkám nemusí být absolutní. Pro účely vynálezu je dostačující, jestliže pacient snáší všechny další ablace autoimunního typu směřující vůči normálním nebo nepatologickým tkáním.
Tak například v případě, že všechny patogenní buňky jsou z jedné tkáně, která je sama o sobě postradatelná, postačuje, když cílený T-lymfocyt je účinně specifický pro tuto tkáň. Takovýmto případem jsou například patologické cílové buňky maligního nádoru prostaty - zde postačí, jestliže cytotoxické T-buňky jsou cíleny se specifitou, dostačující ke zničení obou tkání prostaty, tedy jak normální, tak i rakovinné tkáně prostaty (přičemž ostatní tkáně nejsou napadány nebo jsou ničeny v menším a snesitelném rozsahu). Jiným příkladem je melanom - třebaže se některé specifické antigeny vyskytují v některých buňkách sítnice, mozku a vnitřního ucha, jeví se tento typ jako méně senzitivní na imunoterapii založenou na antigenech, specifických pro melanocyty.
Jinou situací, kdy absolutní specifita není vyžadována, je, pokud zbytek normální tkáně, připojený k určitému nádoru, exprimuje MHC třídy I v extrémně malém měřítku, čímž by stínil nádor před atakem cytotoxických T-buněk.
Výraz patologická buňka se zde používá v širokém významu a znamená nejen ty buňky, které jsou přímo postiženy chorobou (například nádorové buňky nebo autoimunitní buňky) ale také ty buňky, které jsou spojeny s postupem nemoci nebo které pomáhají či udržují chorobný stav (například buňky infikované viry). Proto tento výraz zahrnuje každou buňku, která je aberantní a ohrožuje zdraví individua jakoukoliv cestou. Ve stejném významu se jinde i v předchozím textu používá výrazů buňka, způsobující nemoc či choroboplodná buňka nebo patogenní buňka.
Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle vynálezu je s výhodou rekombinantní, například transdukovaný virovým vektorem.
Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle vynálezu je s výhodou vůči cílovým buňkám monovalentní a má jen jeden druh TcR, poskytující omezenou specifitu MHC třídy I pro jednu třídu cílových buněk. Takové monovalentní lymfocyty se dají generovat například náhradou (raději než doplněním) rezidentního (nebo endogenního) a a β řetězce geny s heterologními a a β řetězci, nesoucími požadovanou specifitu.
Monovalentní lymfocyty podle vynálezu mohou být také generovány sestupnou regulací nebo blokováním exprese endogenních TcR některou z mnoha dostupných metod. Tak například k přerušení endogenních TcR genů lze použít metodu cílené mutageneze.
Použitím monovalentních lymfocytů se eliminuje problém vzniku směsných (a proto neúčinných a/nebo neselektivních) a a β dimerů. Tvorba takových neaktivních heterodimerů povrchovou aktivitu TcR snižuje nebo zabraňuje rozpoznání a rozklad cílových buněk. Zajištěním monovalentnosti lymfocytů podle vynálezu se optimalizuje hustota TcR na povrchu buňky.
-5CZ 289455 B6
Nicméně za určitých okolností může být výhodné nebo běžné vytváření polyvalentních cytotoxických T-lymfocytů, které mají dva nebo i více rozlišovacích druhů TcR, které dohromady přinášejí omezenou specifitu MHC třídy I. Tyto polyvalentní lymfocyty mohou být generovány například doplněním (raději než náhradou) rezidentních a a β řetězců jedním nebo více páry heterologních a a β řetězců nesoucích požadovanou specifitu. Polyvalentní cílené cytotoxické Tlymfocyty podle vynálezu mohou být konkrétně použitelné v těch případech, kdy je nutno zasáhnout dvě odlišné třídy cílových buněk nebo více odlišných tříd cílových buněk.
Pokud je cílený cytotoxický T-lymfocyt podle vynálezu polyvalentní, vytvoří se heterologní a a β TcR polypeptidy výhodně jednou fúzí polypeptidu. Tento způsob předchází vzniku a a β dimerů atak řeší problémy spojené se snížením účinné hustoty TcR na buněčném povrchu, zmíněné již vpředu.
Mezi cílové buňky zejména patří nádorové buňky, imunitní buňky, projevující autoimunitní reakci a/nebo buňky, infikované patogenem (a konkrétně virově infikované buňky). V konkrétním výhodném provedení patří mezi cílové buňky HTV-infikované lymfocyty. Jinými virovými infekcemi, které sem patří, mohou být infekční žloutenky (např. hepatitis B, C aNANB) a virově indukovaný Burkittův lymfom.
Heterologní a a β TcR polypeptidy mohou mít charakter chimér a může mezi ně patřit například imunoglobulin, ato jak jeho celek tak jeho část. Tyto chimérické TcR využívají značné strukturální podobnosti mezi konstantními a variabilními úseky a a β řetězců TcR a V a C úseky imunoglobulinu. Použití takovýchto chimérických a a β TcR polypeptidů může zejména připadat v úvahu jestliže je imunoglobulin, vykazující požadovanou specifitu, dostupný či rychle dostupný (například připojením protilátek ke známým nebo předvídatelným T-buněčným antigenům).
Podle vynálezu se připravují shora uvedené cílené cytotoxické T-lymfocyty způsobem, který zahrnuje stupně:
(a) vytvoření vektoru, obsahujícího DNA (například DNA odvozenou od dárce cytotoxického Tlymfocytu) kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro patogenní cílové buňky a (b) transfekci cytotoxického T-lymfocytu s vektorem získaného ve stupni (a) pro produkci rekombinantního cytotoxického T-lymfocytu, který má DNA kódování a a β TcR polypeptidů specifické pro patogenní cílové buňky, přičemž rekombinantní cytotoxický T-lymfocyt ze stupně (b) exprimuje DNA kódující a a β TcR polypeptidů poskytující lymfocytu MHC třídy I omezenou specifitu a tím zaměření na cílové buňky.
Vektor ze stupně (a) se dá získat klonováním, sestavením nebo syntézou (například na nukleotidu v pevné fázi) DNA, kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro patogenní cílové buňky. Výhodně lze klonovat DNA kódující a a β TcR polypeptidy takto:
a) získá se od dárce vzorek T-lymfocytů, což lze provést například z krevní banky, krevního vzorku nebo z biopsie nádoru,
b) vzorek T-lymfocytů se obohatí pro získání cytotoxických T-lymfocytů, které mají specifitu pro patogenní cílové buňky, což lze provést například specificky vyvolanou proliferací a/nebo specifickou klonální expanzí,
c) ze získaných cytotoxických T-lymfocytů od dárce se extrahuje chromozomální DNA a
d) izoluje se DNA kódující a a β TcR polypeptidy, například primámě-specifickou PCR amplifikací.
-6CZ 289455 B6
Vektor se dá zavést do cytotoxického T-lymfocytu jakoukoliv vhodnou metodou. Odborníkům v oboru je známo více různých metod, používaných k tomuto účelu. Patří mezi ně transfekce elektroporací, fuze protoplastů nebo virová (například retrovirová) transfekce.
Vynález se dále týká vektoru pro použití ve způsobu podle vynálezu, přičemž tento vektor obsahuje DNA kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro patogenní cílové buňky. DNA tohoto vektoru může být s výhodou spojena s expresním elementem nebo s více elementy, které zabezpečují expresi TcR polypeptidů v použitelném množství. Pro tento účel lze použít širokou škálu elementů a tyto elementy mohou mít nejrůznější podobu. Mohou být dokonce (za určitých okolností) vyrobeny pro přímou a/nebo kontrolovanou expresi genů, s kterými jsou operativně spojeny. Exprimující element nebo elementy mohou například být transkripční a/nebo translační elementy a zahrnují promotory, ribozomy nesoucí místa, pomocná a regulační místa včetně aktivačních a represorových míst. Jenom jako příklad jsou jako expresní elementy pro použití ve způsobu podle vynálezu uvedeny přírodní asociáty s a a β TcR peptidovými geny.
Obvykle je vektorem podle vynálezu virový vektor, který je například založen na simském viru 40, adenovirech (například lidský adenovirus), retrovirech a papilomovém viru.
Vektor může dále obsahovat:
a - pozitivně selektovatelný markér, jímž může být například člen zvolený ze skupiny zahrnující neomycin fosfotransferázu, hygromycin fosfotransferázu, xanthinquanin fosforibosyl transferázu, thymidinkinázu viru Herpes simplex typu 1, adeninfosforibosyltransferázu a hypoxanthinfosforibosyltransferázu a/nebo b - negativně selektovatelný markér, jímž může být například člen skupiny, zahrnující thymidinkinázu viru Herpes simplex typu 1, adeninfosforibosyltransferázu, hygromycinfosfotransferázu a hypoxanthinfosforibosyltransferázu.
Použití pozitivně selektovatelného markéru zahrnuje selekci a/nebo identifikaci transfektovaného T-lymfocytu a přítomnost negativně selektovatelného markéru umožňuje následnou eliminaci transfektovaných T-buněk in vivo nebo in vitro (například jestliže vzniká nežádoucí strana).
Způsoby přípravy plazmidu, stejně jako konstrukcí, které umožní transkripci a translaci např. a a β jednotek v savčích buňkách, konkrétně v přeměněných cytotoxických T-lymfocytech, jsou odborníkům v oboru dobře známy.
Konkrétní výhodný vektor exprimuje a i β řetězce pod kontrolou jediného promotoru. Zejména výhodné jsou promotory specifické pro T-buňky a/nebo expresi prekurzor/progenitor T-buněk a tyto konstrukce mohou být odděleny vnitřním ribozomálním vstupním místem (intemal ribosomal entry site, zkratka IRES), odvozeným od polioviru. Toto IRES může exprimovat dva oddělené genetické elementy pod kontrolou stejného promotorového/podpůmého elementu, který je umístěn na 5 konci sekvence.
Vektorem může být výhodně vektor retroviru. Retrovirální transdukce savčích buněk je velmi účinná a lze ji použít pro transdukci lidských buněk geny jako jsou a a β řetězce vybraných receptorů T-buněk. Retrovirový vektor má výhodně specifické 3 LTR zrušení. Při transdukci buňky vektorem a reverzní transkripci vektoru za účelem vytvoření provirální DNA pro následné vpravení do genomu měněné buňky, může dojít ke ztrátě aktivity 5 LTR promotoru/podpůmého elementu. To pak umožňuje expresi ovládat selektivními promotory a tak dosáhnout specifické exprese cytotoxických T-buněk (Yu SF et al. 1986 PNAS USA 83, 3194). Pokud je velikost
-7CZ 289455 B6 vektoru v případě zmíněného retrovirového vektoru příliš omezena, lze alternativně použít jiné vektory, jako jsou adenovirové vektory.
Cílené cytotoxické T-lymfocyty a vektory podle vynálezu nalézají použití při různých formách terapie a zejména při adoptivní imunoterapii. Lymfocyty a vektory lze zejména použít při adoptivní imunoterapii, která se provádí postupem, zahrnujícím obecně následující kroky:
(a) odebrání cytotoxických T-lymfocytů pacientovi a případně nakultivování většího množství těchto lymfocytů metodou tkáňové kultury, (b) transfekce cytotoxických T-lymfocytů, odebraných v předcházejícím stupni (a), vektorem podle vynálezu pro získání cílených cytotoxických T-lymfocytů, (c) reintrodukce cílených cytotoxických T-lymfocytů ze stupně (b) pacientovi.
V tomto shora popsaném způsobu jsou T-lymfocyty, používané při adoptivní imunoterapii autologní. To má určité výhody, neboť zajišťuje, že mají terapeutické cytotoxické T-lymfocyty správné kostimulační a adhezní faktory nezbytné pro efektivní rozpoznání cílových buněk po reintrodukci v pacientovi.
Terapie může být použita u pacientů s rakovinou. AIDS, u jedinců trpících chorobami autoimunity nebo u jedinců se sníženou imunitou (například při transplantaci orgánu) pro zabránění příležitostné infekci.
Cílené cytotoxické lymfocyty a vektory podle vynálezu také nalézají použití jako vakcíny, například pro profylaktické použití u jedinců s vysokým rizikem onemocnění. Příklady takových rizikových jedinců jsou jedinci predisponovaní dědičně nebo jedinci ohrožení vlivem prostředí (např. rakovinou, AIDS typu popsaného Rowlandem-Jones et al., 1995, Nátuře Medicíně, Vol. 1 (1), str. 59 až 64.
Vynález je dále popsán v dalších podrobnostech pomocí specifických příkladů doporučených postupů, které jsou dle mínění autorů praktické (s modifikacemi či bez modifikací). Tyto příklady nejsou v žádném směru míněny jako omezující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: TcR klonování
Klonování T-buněk se historicky vztahuje k vytvoření cDNA knihoven zT-buněk, nesoucích receptor, který je předmětem zájmu. To znamená, že pro každý receptor T-buňky byla vytvořena nová knihovna z vhodné klonální linie, což je postup, zabírající čas.
Nicméně, mezi geny dvou podjednotek T-buněčných receptorů, a a β, jsou oblasti, jejichž sekvence jsou identické. Tyto oblasti jsou známé jako konstantní úseky a nalézají se v každém genu a a β podjednotky. Tyto sekvence lze nalézt pro tyto regiony v publikovaných údajích o podjednotkách receptorů klonovaných T-buněk a jejich srovnáním je možno identifikovat konstantní oblasti se shodnými sekvencemi. Přestože se tyto oblasti nazývají konstantními regiony, analýza ukázala, že pro účely klonování jsou mezi konstantními oblastmi určité variace. Nicméně uvnitř každé podjednotky receptorů lze nalézt a identifikovat malé oblasti konzistentních sekvencí.
-8CZ 289455 B6
S použitím těchto sekvencí je možno nakloňovat celou délku a a β podjednotky transkripcí metodou známou jako inverzní polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction, zkratka PCR), která je popsaná v publikaci Ochman et al., Genetics (1988), 120:str. 621 až 623. Tento způsob je založen na schopnosti cDNA, odvozené od mRNA, cirkulovat a s pomocí PCR primérů, navržených proti známým sekvencím přepisu, amplifíkovat celý řetězec cDNA prodlužováním podél necharakteristického regionu cirkulované DNA. Bohužel výsledné PCR produkty se nezískávají s požadovanými sekvencemi a s požadovanou orientací, a proto je třeba klonovat PCR produkty sekvencováním. S použitím údajů o sekvencích je možno zviditelnit sekvence ve správné orientaci a navrhnout podle nich normální PCR priméry aby amplifikovaly plnou délku cDNA řetězce ve správné orientaci. Tyto cDNA klony pak mohou být nakloňovány do expresních vektorů pro jejich další manipulaci.
Pokud mohou být inverzní priméry navrženy proti konstantnímu regionu, může být stejné metodiky a stejných primérů použito pro různé klony T-buněk. Tento postup výrazně snižuje náročnost na počet buněk a zvyšuje rychlost a účinnost TcR klonování.
Způsob lze shrnout následovně (viz obr. 1 až 3):
1) Celá RNA se izoluje z klonu T-buňky pomocí triazolového činidla.
2) Z celé RNA se vyrobí cDNA reverzní transkripcí s použitím Oligo dT jako primérů pro transkripci.
3) Syntéza druhého řetězce se provede pomocí DNA polymerázy 1 za přítomnosti RN-ázy H pro vytvoření značek a míst v hybridizovaném řetězci mRNA, která obsahují 3-startovací místa pro syntézu DNA. Cirkulace se provede T4DNA ligázou s rozpuštěnou DNA o koncentraci, umožňující přednostně vznik monomemích cyklů.
Lineární cDNA se pak odstraní zpracováním pomocí exonukleázy III.
S použitím výsledné uzavřené cyklické cDNA se pak potřebné přepisy pořídí amplifikací pomocí metody inverzní PCR. Inverzní priméry jsou v takovém případě navrhovány jako počáteční replikáty cDNA v opačných směrech (jak je znázorněno na obr. 1) a poskytují lineární produkty. Tyto produkty pak replikují podle očekávání při normální PCR metodě.
PCR produkty se oddělí na agarózovém gelu a několik největších proužků se z gelu oddělí a přečistí. Přečištěné produkty se pak použijí pro další PCR reakci. Kromě toho se jako kontrolní experiment použijí normální PCR priméry navržené tak, aby amplifikovaly krátkou délku konstantního úseku receptorových podjednotek T-buňky, který se používá. Jelikož fragmenty získané z inverzní PCR musejí obsahovat konstantní úseky, musí normální PCR s použitím těchto primérů (pokud jde skutečně o přepisy podjednotek receptorů T-buněk) amplifíkovat krátké fragmenty, které lze zviditelnit na agarózovém gelu. Fragmenty, které neposkytují normální PCR produkty, jsou-li amplifikovány s použitím vhodných normálních primérů, nepředstavují užitečné klony a jsou odstraněny.
Zbývající fragmenty se mohou klonovat do TA vektoru (přístupného v Invitrogenu), což je plazmidový vektor, který umožňuje navázat na 3-adenylační místa, vytvořená při každém cyklu polymerace pomocí Tag polymerázy, PCR produkt. Pomocí získaných plazmidů se pak transformují vhodné bakterie a transformované bakterie se podrobí testu na rezistenci na ampicilin. Plazmidy s vloženými geny mají přerušený lac Z gen a proto jsou bílé na živném agaru s obsahem X-gelu.
-9CZ 289455 B6
Ověřovací výběr se provádí z mini-preparátů plazmidů DNA z vybíraných klonů. Vybrané klony se pak namnoží a připraví se větší množství plazmidových vzorků pro automatické sekvencování.
Pokud se již jednou sekvenční data získají, je možno seznat správnou orientaci přepisu identifikací startovního kodonu ATG (viz obr. 2, který to jasněji vysvětluje). S použitím těchto dat je pak možno zvolit PCR priméry pro amplifikaci celého přepisu z originálního lineárního vzorku cDNA z klonu T-buňky. Ty mohou být klonovány do mnoha vektorů, včetně eukaryotických expresních vektorů.
Tuto metodiku lze použít pro neomezený počet podjednotek receptorů T-buněk, pokud jsou vhodné klony T-buněk dostupné, bez nutnosti navrhování nových primérů (s výjimkou amplifikace přepisu o plné délce, kdy se použijí na konci postupu). Je třeba připomenout, že celý postup lze provést v několika dnech ve srovnání s týdny, které jsou zapotřebí v případě vytváření cDBA knihovny.
Příklad 2: Konstrukce cytotoxických T-buněk cílených na antigen MAGE-1 melanomu
Byly získány cytotoxické T-lymfocyty, schopné rozpoznat MAGE-1 genový produkt MZ2-E viz například publikace:
Cheng et al. 1994, PNAS 91, str. 1004 až 1008, Van den Eynde et al. 1989, Int. J.Cancer, 44, str. 634 až 640, van der Bruggen et al. 1991, Science, 254, str. 1643 až 1647, Traversari et al. 1992, Immunogenetics, 35, str.145 až 152, Traversari et al. 1992, J. Exp. Med. 176, str. 1453 až 1457) a byla extrahována jejich DNA.
Z extrahované DNA byla vytvořena komplementární knihovna, přičemž bylo použito vektoru gtll. Komplementární DNA klony, kódující a a přetěžce, pak byly izolovány pomocí hybridizační zkoušky a a β řetězce konstantního úseku, která je popsána například v publikacích:
Dembic et al. (1985) Nátuře 314, str. 271 až 273 a Snodgrass et al. (1985) Nátuře 315, str. 232 až 233. Použitý postup byl podobný tomu, který je popsán v Dembic et al (1986) Nátuře 320, str. 232 až 238.
Geny pro oba a a β řetězce pak byly klonovány do kosmidového vektoru ve stejné přepisované orientaci, spolu s genem rezistentním proti neomycinu jako pozitivním selekčním markérem. Vhodné expresní elementy byly funkčně napojeny na a a β kódující sekvence, aby byla zajištěna účinná exprese.
Kosmidový vektor obsahující a a β řetězce pak byl přenesen protoplastovou fůzí do vhodného příjemce - cytolytického T-buněčného hybridomu, čímž se získal rekombinantní T-buněčný hybridom se specifitou pro MAGE-1 genový produkt.
Tyto kroky může uskutečnit odborník v oboru, který také může snadno shora popsaný postup upravit pro získávání a transfer jiných TcR a použít při vhodné modifikaci na libovolné populace příjemců - cytotoxických T-buněk.
Příklad 3: Namnožení geneticky upravených lidských T-lymfocytů pro expresi cytotoxické aktivity proti buňkám exprimujícím virus chřipky (Flu).
Byly získány lidské celé mononukleámí buňky periferální krve (zkratka PBMC podle anglického periferal blood mononuclear cells) odvozené od třídy 1 MCH HLA-A2 krevního dárce.
- 10CZ 289455 B6
Tyto buňky byly kultivovány in-vitro ve standardním prostředí za přítomnosti Flu peptidů, o kterých je známo, že jsou přítomny v HLA-A2 v restrikční podobě. Tím byly vytvořeny buňky prezentující antigen.
Alternativně se mohou buňky, na kterých je přítomen antigen, získat přidáním peptidů k populaci dendritických buněk, izolovaných z HLA-A2 omezeného dárce.
Po 24 hodinách inkubace s peptidem byly PBMC přidány k CD4/CD8 buňkám odvozeným od lidského dárce, čerstvě imunizovaného proti chřipce, opět HLA-A2 omezeného idiotypu. CD4/CD8 buněčná populace odvozená od imunizovaného dárce byla nanesena v zředění (100 ku 1 buňce) v mikrotitrových množstvích na plotny a ponechána v přítomnosti působících buněk po dobu 10 až 14 dnů přičemž bylo v potřebném rozsahu měněno živné prostředí. Poté byl posouzen růst kolonií T-lymfocytů, které představují aktivované CD4/CD8 buňky schopné rozpoznat buňky, na kterých je přítomen antigen a být vůči těmto buňkám cytotoxické.
Tyto rostoucí kolonie aktivovaných T-lymfocytů, schopné rozpoznat antigen chřipky, je-li přítomen na buňkách ve třídě 1 MHC omezené podobě, pak byly klonovány a použity k přípravě kompletního T-buněčného receptoru o sekvencích a a β řetězců jak je popsáno v předcházejícím příkladě 1. Alternativně lze použít jiných metod pro přípravu a izolaci a a β cDNA, které jsou odborníkům v oboru dostatečně známé.
Pokud byly již jednou izolovány, byly cDNA a a β řetězců poté použity k úpravě T-buněk odvozených od neimunitní třídy 1 MHC HLA-A2 dárce. Tím získají geneticky změněné T-buňky schopnost rozeznat chřipkou infikované buňky v podobě omezené na třídu 1 a přenášet cytotoxicitu jak je stanoveno testem na uvolňování chrómu.
Příklad 4: Namnožení lidských T-lymfocytů geneticky změněných tak, aby exprimovaly cytotoxickou aktivitu proti buňkám, exprimujícím některý ze členů rodiny ras onkogenů.
Byly získány lidské celé mononukleámí buňky periferální krve (zkratka PBMC podle anglického periferal blood mononuclear cells) odvozené od třídy 1 MCH HLA-A2 krevního dárce. Tyto buňky byly kultivovány in-vitro ve standardním prostředí za přítomnosti Harvey ras nebo Kirsten ras nebo N-ras onkogenních peptidů, o nichž je známo, že jsou přítomny v HLA-A2 omezené podobě. Tím byla vytvořena buňka, na které je přítomen antigen.
Alternativně lze vytvořit buňky nesoucí antigen přidáním uvedeného peptidu(ů) k populaci dendritických buněk izolovaných z HLA-A2 omezených buněk dárce.
Po 24 hodinách inkubace s peptidem byly PBMC přidány k CD4/CD8 buňkám odvozeným od lidského dárce, opět HLA-A2 třídy I-omezeného idiotypu. CD4/CD8 buněčná populace odvozená od imunizovaného dárce byla naplátována v zředění (100 ku 1 buňce) v mikrotitrových plotnách a ponechána v přítomnosti působících buněk po dobu 10 až 14 dnů, přičemž bylo v potřebném rozsahu měněno živné prostředí. Poté byl na plotnách posouzen růst kolonií T-lymfocytů, které představují aktivované CD4/CD8 buňky schopné rozpoznat buňky, na kterých je přítomen antigen a být vůči těmto buňkám cytotoxické.
Tyto rostoucí kolonie aktivovaných T-lymfocytů, schopné rozpoznat antigen ras, je-li přítomen na buňkách ve třídě 1 MHC omezené podobě, pak byly klonovány a použity k přípravě kompletního T-buněčného receptoru o sekvencích a a β řetězců, jak je popsáno v předcházejícím příkladě 1. Alternativně lze použít jiných metod pro přípravu a izolaci a a β cDNA, které jsou odborníkům v oboru dostatečně známé.
-11 CZ 289455 B6
Pokud byly již jednou izolovány, byly cDNA a a β řetězce přenášející rozpoznání Harvey ras nebo Kirsten ras nebo N-ras onkogenních peptidů poté použity k úpravě T-buněk odvozených od neimunitní třídy 1 MHC HLA-A2 dárce. Tím získají geneticky změněné T-buňky schopnost rozeznat ras onkogenní aktivaci v podobě omezené třídou 1 a přenášet cytotoxicitu jak je stanoveno testem na uvolňování chrómu.
Příklad 5: Namnožení lidských T-lymfocytů geneticky změněných tak, aby exprimovaly cytotoxickou aktivitu proti buňkám, exprimujícím některý ze členů rodiny ras onkogenů.
Byly získány lidské celé mononukleámí buňky periferální krve (zkratka PBMC podle anglického periferal blood mononuclear cells) odvozené od třídy 1 MHC HLA-B35 krevního donoru. Tyto buňky byly kultivovány in-vitro ve standardním prostředí za přítomnosti HTV peptidů, o kterých je známo, že jsou přítomny v HLA-B35 omezené podobě. Tím byla vytvořena buňka, na které je přítomen antigen.
Alternativně lze vytvořit buňky nesoucí antigen přidáním uvedeného peptidu(ů) k populaci dendritických buněk izolovaných z HLA-35 omezených buněk dárce.
Po 24 hodinách inkubace s peptidem byly PBMC přidány k CD4/CD8 buňkám odvozeným od lidského dárce s předpokládanou HTV imunitou, opět HLA-35 třídy 1 MHC omezeného idiotypu. CD4/CD8 buněčná populace odvozená od imunizovaného dárce byla naplátována v zředění (100 ku 1 buňce) na mikrotitrových plotnách a ponechána v přítomnosti působících buněk po dobu 10 až 14 dnů, přičemž bylo v potřebném rozsahu měněno živné prostředí. Poté byl na plotnách posouzen růst kolonií T-lymfocytů, které představují aktivované CD4/CD8 buňky schopné rozpoznat buňky, na kterých je přítomen antigen a být vůči těmto buňkám cytotoxické.
Tyto rostoucí kolonie aktivovaných T-lymfocytů, schopné rozpoznat antigen zpracovaný HLAB35, je-li přítomen na buňkách ve třídě 1 MHC omezené podobě, pak byly klonovány a použity k přípravě kompletního T-buněčného receptoru o sekvencích a a β řetězců jak je popsáno v předešlém textu. Alternativně lze použít jiných metod pro přípravu a izolaci a a β cDNA, které jsou odborníkům v oboru dostatečně známé.
Pokud byly již jednou izolovány, byly cDNA αββ řetězců poté použity kúpravě T-buněk odvozených od neimunitní třídy 1 MHC HLA-A2 dárce. Tím získají geneticky změněné T-buňky schopnost rozeznat chřipkou infikované buňky v podobě omezené na třídu 1 a přenášet cytotoxicitu jak je stanoveno testem na uvolňování chrómu.
Claims (23)
1. Cílený cytotoxický T-lymfocyt, jehož TcR obsahuje heterologní a a β polypeptidy, přičemž tyto heterologní polypeptidy poskytují lymfocytu omezenou specifitu MHC třídy I pro cílové buňky, které způsobují chorobu, přičemž T-lymfocyt je monovalentní a má jeden druh TcR, poskytující omezenou specifitu MHC třídy I pro jednu třídu cílových buněk.
2. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle nároku 1, který je rekombinantní.
3. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle nároku 2, který je transdukován virovým vektorem.
- 12 CZ 289455 B6
4. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle některého z předcházejících nároků, jehož cílové buňky zahrnují nádorové buňky, imunitní buňky, vyvolávající autoimunní reakci a/nebo buňky infikované patogenem.
5. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle nároku 4, jehož cílové buňky zahrnují lidské melanomové buňky a heterologní a a β polypeptidy poskytují specifitu pro:
(a) antigen nádoru MAGE-1, (b) antigen nádoru MAGE-3, (c) antigen nádoru MART 1/Aa, (d) antigen nádoru gplOO a/nebo (e) tyrosinázový nádorový antigen.
6. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle nároku 4, kde patogenem je virus.
7. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle nároku 6, jehož cílové buňky zahrnují HlV-infíkované lymfocyty.
8. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle některého z předcházejících, nároků, kde heterologní a a β TcR polypeptidy jsou vytvořeny jako jeden fuzní polypeptid.
9. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle některého z předcházejících nároků, jehož heterologní a a β TcR polypeptidy jsou chimérické.
10. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle nároku 9, jehož heterologní a a β TcR polypeptidy zahrnují imunoglobulinovou variabilní doménu nebo její fragment.
11. Způsob výroby cílených cytotoxických T-lymfocytů podle některého z předchozích nároků, vyznačující se t í m , že zahrnuje následující stupně:
(a) vytvoří se vektor, obsahující nukleonovou kyselinu, s výhodou DNA odvozenou od dárce cytotoxického T-lymfocytu, kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro cílové buňky, které způsobují chorobu, (b) transfektuje se recipientní cytotoxický T-lymfocyt vektorem, získaným ve stupni (a), pro produkci rekombinantního cytotoxického T-lymfocytu, který má DNA kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro cílové buňky, způsobující chorobu, přičemž rekombinantní cytotoxický T-lymfocyt ze stupně (b) exprimuje DNA, kódující a a β TcR polypeptidy poskytující lymfocytu omezenou specifitu MHC třídy I, a tím jej zaměřují na cílové buňky.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že vektor se ve stupni (a) vytvoří klonováním, spojováním nebo syntézou, s výhodou oligonukleotidovou syntézou v pevné fázi. DNA kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro cílové buňky způsobující chorobu.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m, že se klonuje DNA, kódující a a β TcR polypeptidy, takto:
a) získá se vzorek T-lymfocytů dárce, s výhodou z krevní banky, krevního vzorku nebo z biopsie nádoru,
-13CZ 289455 B6
b) vzorek T-lymfocytů dárce se obohatí o cytotoxické T-lymfocyty, které mají specifitu pro cílové buňky způsobující chorobu, což se provede specificky vyvolanou proliferací a/nebo specifickou klonální expanzí,
c) ze získaných cytotoxických T-lymfocytů dárce se extrahuje chromozomální DNA a
d) izoluje se DNA kódující a a β TcR polypeptidy, s výhodou PCR amplifikací pomocí specifického priméru.
14. Způsob podle některého z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že vektor se transfektuje do recipientního cytotoxického T-lymfocytu elektroporací, protoplastovou fúzí nebo virovou, s výhodou retrovirovou, transfekcí.
15. Cílený cytotoxický T-lymfocyt vyrobitelný některým ze způsobů podle kteréhokoliv z nároků 11 až 14.
16. Vektor pro použití ve způsobu podle některého z nároků 11 až 14 zahrnující DNA kódující a a β TcR polypeptidy specifické pro buňky způsobující chorobu, s výhodou DNA operativně spojenou s expresním elementem nebo s expresními elementy, přičemž tento expresní element nebo tyto expresní elementy jsou voleny například z transkripčních a/nebo translačních elementů, promotorů, míst nesoucích ribozom, pomocných prvků, regulačních míst, s výhodou aktivátorových a represorových (operátorových) míst a expresních elementů přirozeně spojených s a a/nebo β TcR peptidovými geny.
17. Vektor podle nároku 16, který je virovým vektorem, založeným s výhodou na opičím viru 40 - SV 40, adenoviru, s výhodou lidském adenoviru, retroviru nebo papillomovém viru.
18. Vektor podle nároku 16 nebo 17, dále obsahující:
a) pozitivně selektovatelný markér, jímž je s výhodou markér zvolený ze skupiny zahrnující neomycin fosfotransferázu, hygromycin fosfotransferázu, xanthinquanin fosforibosyl transferázu, thymidinkinázu viru Herpes simplex typu 1, adeninfosforibosyltransferázu a hypoxanthinfosforibosyltransferázu a/nebo
b) negativně selektovatelný markér, jímž je s výhodou markér ze skupiny, zahrnující thymidinkinázu viru Herpes simplex typu 1, adeninfosforibosyltransferázu, hygromycinfosfotransferázu a hypoxanthinfosforibosyltransferázu.
19. Cílený cytotoxický T-lymfocyt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 nebo 15, který má TcR obsahující heterologní a a β polypeptidy, které poskytují lymfocytu omezenou specifitu MHC třídy I pro cílové buňky, pro použití při léčení.
20. Použití (a) cíleného cytotoxického T-lymfocytu, jak je definován v nároku 19, nebo (b) vektoru podle některého z nároků 16 až 18, pro přípravu léčiva pro použití v adoptivní imunoterapii.
21. Použití podle nároku 20, při kterém léčivo je určené pro léčení rakoviny, AIDS, poruchy autoimunity nebo snížené imunity.
- 14CZ 289455 B6
22. Použití (a) cíleného cytotoxického T-lymfocytu, jak je definován v nároku 19, nebo (b) vektoru podle některého z nároků 16 až 18, pro přípravu vakcíny pro použití v imunoterapii nebo v profylaxi, s výhodou pro použití při léčení nebo při prevenci AIDS.
23. Vakcína, vyznačující se t í m , že obsahuje cílené cytotoxické T-lymfocyty podle některého z nároků 1 až 10 nebo 15, a dále s výhodou obsahuje farmaceuticky použitelný excipient.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9423085A GB9423085D0 (en) | 1994-11-16 | 1994-11-16 | Targeted T lymphocytes |
| PCT/GB1995/002691 WO1996015238A1 (en) | 1994-11-16 | 1995-11-16 | Targeted t lymphocytes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ144297A3 CZ144297A3 (en) | 1997-10-15 |
| CZ289455B6 true CZ289455B6 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=10764464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19971442A CZ289455B6 (cs) | 1994-11-16 | 1995-11-16 | Cílený cytotoxický T-lymfocyt, způsob jeho výroby, vektor pro pouľití v tomto způsobu a vakcína |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0792354B1 (cs) |
| JP (1) | JPH10511542A (cs) |
| KR (1) | KR970707280A (cs) |
| AT (1) | ATE231550T1 (cs) |
| AU (1) | AU687271B2 (cs) |
| CA (1) | CA2203934A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ289455B6 (cs) |
| DE (1) | DE69529473T2 (cs) |
| DK (1) | DK0792354T3 (cs) |
| ES (1) | ES2191065T3 (cs) |
| GB (1) | GB9423085D0 (cs) |
| HU (1) | HUT77472A (cs) |
| MX (1) | MX9703535A (cs) |
| NZ (1) | NZ295418A (cs) |
| PT (1) | PT792354E (cs) |
| WO (1) | WO1996015238A1 (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7276488B2 (en) | 1997-06-04 | 2007-10-02 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Vector system |
| EP1717248A1 (en) * | 1997-06-04 | 2006-11-02 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Tumor targeted vector |
| JP2003515323A (ja) | 1999-11-18 | 2003-05-07 | オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド | 抗 体 |
| IL162111A0 (en) | 2001-12-22 | 2005-11-20 | 4Antibody Ag | Method for the generation of generically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologo |
| US7994298B2 (en) | 2004-09-24 | 2011-08-09 | Trustees Of Dartmouth College | Chimeric NK receptor and methods for treating cancer |
| CN101287831B (zh) | 2005-09-13 | 2013-05-15 | 国立大学法人三重大学 | T细胞受体和编码该受体的核酸 |
| JP5292550B2 (ja) * | 2007-03-23 | 2013-09-18 | 静岡県 | Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子及びα鎖遺伝子 |
| US9273283B2 (en) | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
| WO2011059836A2 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient t cell compositions |
| US12492376B2 (en) | 2009-10-29 | 2025-12-09 | The Trustees Of Dartmouth College | T-cell receptor-deficient T cell compositions |
| US9833476B2 (en) | 2011-08-31 | 2017-12-05 | The Trustees Of Dartmouth College | NKP30 receptor targeted therapeutics |
| ES2719495T5 (en) | 2012-05-07 | 2025-09-10 | Dartmouth College | Anti-b7-h6 antibody, fusion proteins, and methods of using the same |
| CN106103711A (zh) | 2013-11-21 | 2016-11-09 | 组库创世纪株式会社 | T细胞受体和b细胞受体库分析系统及其在治疗和诊断中的应用 |
| CN110627895B (zh) * | 2018-06-25 | 2021-03-23 | 北京大学 | 肺癌特异性tcr及其分析技术和应用 |
| WO2023039242A2 (en) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | Achelois Biopharma, Inc. | Multivalent interferon particles compositions and methods of use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4873190A (en) * | 1984-06-13 | 1989-10-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Heterodimeric T lymphocyte receptor |
| ATE161850T1 (de) * | 1989-07-19 | 1998-01-15 | Connetics Corp | T-zell-rezeptor-peptide als heilmittel für autoimmune und bösartige krankheiten |
| JPH06507384A (ja) * | 1991-01-22 | 1994-08-25 | ザ イミューン レスポンス コーポレイション | 特定のｔ細胞群による病理的応答により生じる疾患に対するワクチン投与および方法 |
-
1994
- 1994-11-16 GB GB9423085A patent/GB9423085D0/en active Pending
-
1995
- 1995-11-16 CA CA002203934A patent/CA2203934A1/en not_active Abandoned
- 1995-11-16 KR KR1019970703277A patent/KR970707280A/ko not_active Ceased
- 1995-11-16 JP JP8515856A patent/JPH10511542A/ja not_active Ceased
- 1995-11-16 MX MX9703535A patent/MX9703535A/es unknown
- 1995-11-16 NZ NZ295418A patent/NZ295418A/en unknown
- 1995-11-16 DE DE69529473T patent/DE69529473T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-16 EP EP95937931A patent/EP0792354B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-16 AU AU38754/95A patent/AU687271B2/en not_active Ceased
- 1995-11-16 ES ES95937931T patent/ES2191065T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-16 HU HU9800346A patent/HUT77472A/hu active IP Right Revival
- 1995-11-16 WO PCT/GB1995/002691 patent/WO1996015238A1/en not_active Ceased
- 1995-11-16 PT PT95937931T patent/PT792354E/pt unknown
- 1995-11-16 CZ CZ19971442A patent/CZ289455B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-11-16 DK DK95937931T patent/DK0792354T3/da active
- 1995-11-16 AT AT95937931T patent/ATE231550T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10511542A (ja) | 1998-11-10 |
| EP0792354B1 (en) | 2003-01-22 |
| HUT77472A (hu) | 1998-05-28 |
| MX9703535A (es) | 1997-08-30 |
| GB9423085D0 (en) | 1995-01-04 |
| DK0792354T3 (da) | 2003-05-19 |
| CA2203934A1 (en) | 1996-05-23 |
| ES2191065T3 (es) | 2003-09-01 |
| CZ144297A3 (en) | 1997-10-15 |
| DE69529473T2 (de) | 2004-01-08 |
| AU3875495A (en) | 1996-06-06 |
| PT792354E (pt) | 2003-06-30 |
| NZ295418A (en) | 2000-02-28 |
| ATE231550T1 (de) | 2003-02-15 |
| AU687271B2 (en) | 1998-02-19 |
| EP0792354A1 (en) | 1997-09-03 |
| DE69529473D1 (de) | 2003-02-27 |
| KR970707280A (ko) | 1997-12-01 |
| WO1996015238A1 (en) | 1996-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7194230B2 (ja) | クローディン－１８．２－特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ | |
| JP7451858B2 (ja) | クローディン６特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ | |
| CN112236447B (zh) | 具有mage-b2特异性的t细胞受体及其用途 | |
| JP6625705B2 (ja) | 抗原特異的ｔ細胞受容体およびｔ細胞エピトープ | |
| CZ289455B6 (cs) | Cílený cytotoxický T-lymfocyt, způsob jeho výroby, vektor pro pouľití v tomto způsobu a vakcína | |
| EP3730515B1 (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| WO2005102383A1 (en) | Antigen specific t cell therapy | |
| TW201927812A (zh) | 醫藥重組受體組成物及方法 | |
| MXPA97003535A (en) | Lymphocytes dirigi | |
| Siebels et al. | Simultaneous ligation of CD5 and CD28 with monoclonal antibodies restores impaired immunostimulatory function in human renal cell carcinoma | |
| HK40037307B (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| HK40049189A (en) | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK40049189B (en) | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK40026429A (en) | Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK40037307A (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| HK40026429B (en) | Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK40011474B (en) | Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK40011474A (en) | Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| Ikeda et al. | Generation of human tumor-specific, HLA class I-restricted Th1 and Tc1 | |
| HK1250331B (en) | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK1247626B (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| HK1246802B (en) | Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes | |
| HK1246802A1 (en) | Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20041116 |