HUT77472A

HUT77472A - Célzott T-limfociták

Info

Publication number: HUT77472A
Application number: HU9800346A
Authority: HU
Inventors: Bradley Michael John Stringer
Original assignee: Cellfactors Plc
Priority date: 1994-11-16
Filing date: 1995-11-16
Publication date: 1998-05-28
Also published as: CZ289455B6; DE69529473T2; WO1996015238A1; PT792354E; JPH10511542A; DE69529473D1; EP0792354A1; MX9703535A; CA2203934A1; AU687271B2; KR970707280A; AU3875495A; ATE231550T1; NZ295418A; CZ144297A3; DK0792354T3; ES2191065T3; EP0792354B1; GB9423085D0

Description

A nemzetközi közzététel száma:—WOA jelen találmány tárgyát célzott T-limfociták és azok alkalmazása képezi, pontosabban heterológ α és β Tsejt antigén receptor polipeptidekkel rendelkező célzott citotoxikus T-limfociták, amik MHC-re korlátozott specifitást biztosítanak a betegséget okozó célsejtekkel szemben.

< ^980⁰³^⁶

S.B.G. & K.

Nemzetközi Szabadalmi Iroda

9 Q11 / 9 7.P H-1062 Budapest, Andrássy út 113.

Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323

Célzott T-limfociták

STRINGER, Bradley, Michael, John, CARDIFF, NAGYBRITANNIA

A bejelentés napja: 1995. 11. 16.

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/GB95/02691

A nemzetközi közzététel száma: WO • · • ·

A jelen találmány tárgyát célzott T-limfociták és azok alkalmazása képezi, pontosabban heterológ a és β Tsejt antigén receptor polipeptidekkel rendelkező célzott citotoxikus T-limfociták, amik MHC-re korlátozott specifitást biztosítanak a betegséget okozó célsejtekkel szemben.

Az immunrendszer számos különböző sejttípust és molekulát tartalmaz, az egész testben eloszolva. Egészséges egyedekben az immunrendszer megvéd a támadó patogénekkel, parazitákkal és olyan sejtekkel szemben, amelyek fertőzöttek, vagy rákosak.

Az immunrendszer számos alapvető tulajdonságainak sejtszintű alapja (beleértve az immunológiai memóriát, specifitást és a válaszok sokféleségét) a limfocita. A limfociták két osztályba sorolhatók: B-limfociták (vagy B-sejtek), amelyek végül felelősek a humorális válaszok létrehozásáért (ezt oldható ellenanyagok közvetítik) és T-limfociták (vagy T-sejtekj, amelyek végül felelősek a sejtek által közvetített válaszok generálásáért.

A T-limfocitákat fel lehet osztani többek között citotoxikus T-limfocitákra (amelyek azonosítják és elpusztítják a fertőzött, aberráns vagy rosszindulatú célsejteket) és segítő limfocitákra (amelyek serkentik, összegyűjtik és aktiválják az egy immunválasz kialakításában szerepet játszó nagyszámú sejttípust).

A T-limfociták a T-sejt receptorokon (a továbbiakban TcR-ek) keresztül ismerik fel a célsejteket. A TcR-ek általában nem kötődnek csak egy antigénhez. A TcR-ek ehelyett inkább az antigéneket a fő hisztokompatibilitási komplexnek egy I-es vagy ΙΙ-es génje által kódolt sejtfelszíni glikoprotein komplex részeként ismerik fel (a továbbiakban csak MHC I-es osztály vagy MHC ΙΙ-es osztály néven említjük). A citotoxikus T-limfociták az antigéneket általában az MHC I-es osztállyal kapcsolódva ismerik fel, míg a segítő T-limfociták az antigéneket általában az MHC ΙΙ-es osztállyal kapcsolatban ismerik fel.

Ennek eredményeképpen a T-limfocita célsejt felismerés olyan célsejtekre korlátozódik, amelyek képesek bemutatni az antigént egy adott gazdafehérjével együtt (lásd az I-es vagy ΙΙ-es osztályba tartozó MHC molekulákat). A T-limfociták fő szerepét ezek után abban láthatjuk, hogy monitorozzák a sejtfelszíneket a testben, és az aberráns, fertőzött vagy rosszindulatú sejtek azonosíthatók (vagy kimutathatók, a segítő T-sejtek esetében), és végül eliminálhatók.

A T-sejt receptor (TcR)

A TcR egy fehérjekomplex, egy olyan típusú, amely két diszulfid híddal összekötött polipeptid láncot tartalmaz (az a és β láncokat), amik a T-limfocita sejt felszínén más molekulákkal asszociálódnak. A TcR a és β láncai elegendőek ahhoz, hogy egy T-limfocitát mind antigén, mind MHC (akár I-es akár ΙΙ-es osztálybeli) specifitással lássanak el: tehát a TcR-nek csak az a és β komponenseire van szükség ahhoz, hogy teljesen meghatározzák a duális (azaz mind MHC mind antigén) T-limfocita specifitást.

Az a és β láncok konstans és variábilis régiókat tartalmaznak, amelyek homológok az immunglobulin V és C régiókkal, és a megfelelő struktúrgének olyan DNS átrendeződéseken esnek át, amelyek emlékeztetnek az immunglobulin gének átrendeződéseire. Az immunglobulinok és a TcR-ek strukturális repertoárja valójában hasonló (körülbelül 10¹² per egyed) .

A TcR a és β láncait kódoló géneket klónozták és azonosították [Robertson: Natúré 317, 768-771 (1985)3 .

Emellett a TcR a és β lánc géneket egyik T-sejtből átvitték egy másik T-sejtbe, hogy eltérő specifitású Tsejt kiónt hozzanak létre [ Dembic és mtsai: Natúré 320,

232-238 (1986)] .

A TcR-ek klonálisan oszlanak meg: az egyes T-limfociták TcR-jei csak egy egészség determinánsra specifikusak (bár lehet többszáz vagy többezer ugyanolyan fajtájú TcR minden egyes sejten). így tehát minden egyes T-limfocita normális körülmények között monovalens a TcR által közvetített kötődésre nézve.

• ·

Az a és β láncok számos egyéb molekulához kapcsolódnak, beleértve a CD3 komplex fehérjéit és a kapcsolódó zéta és éta peptideket. A TcR-CD3 komplex átvisz egy jelet a TcR-ről a T-limfocita belsejébe, ha felismeri a megfelelő peptid-MHC komplexet, és ezzel hozzájárul a Tsejt aktiváláshoz.

Aberráns génexpresszió, betegség és a T-sejt válasza

Egy egyednek az egészsége többezer különböző, koordinált és szigorúan szabályozott gén expressziójától függ. A génexpresszió aberrációja vagy megváltozása ennek következtében számos különböző betegséget eredményezhet, beleértve a rákot, AIDS-et és a különböző autoimmun betegségeket .

Számos különböző faktor okozhat aberráns génexpressziót. Például az endogén gének expressziója, vagy az általuk kódolt fehérjék szerkezete mutáció révén megváltozhat. Egy ilyen mutáció lehet spontán, de gyakran a környezetben található karcinogén anyagok okozzák. Egy másik változat szerint az egyed sejtjeibe exogén genetikai anyag bejuttatása (például vírusfertőzés révén) a génexpresszió mintázatainak elromlását, a normális körülmények között csendes gének aktiválódását és/vagy idegen (azaz például virális) fehérjék termelődését eredményezheti .

• ··

A génexpresszió indukált aberrációi következményeinek egyik fontos példája a tumorképződés. A tumorképződés a legtöbb rákra jellemző, és a tumorok annak következtében jönnek létre, hogy a szomatikus sejtekben az onkogének mutációira és a tumorszuppresszor génekre felügyelő endogén fehérjék szerkezete megváltozik vagy a fehérje túlexpresszálódik. Például bizonyos típusú emlőtumor képződése a HER-2/neu protoonkogén amplifikálódásából és túlexpressziójából származik.

A betegségnek a szervezet szintjén való fellépése mellett az aberráns génexpresszió egy másik fenotípusos következménye a neoantigének képződése lehet. A továbbiakban a neoantigén szakkifejezés nemcsak a mutáns vagy idegen aminosav szekvenciákból származó új antigéneket jelenti, hanem az új antigéneket is, amik a normális körülmények között csendes vad-típusú gének expressziójából származnak, vagy a normális körülmények között viszonylag gyengén expresszálódó vad-típusú gén expressziój ából.

A neoantigének termelése eredményezheti a sejtfelszíni antigének megváltozását, amely változások viszont egy immunválaszt indukálhatnak. Például onkogén termékek elleni ellenanyagokat találtak rákos betegek szérumában, valamint számos modellrendszerben citotoxikus T-limfocitákat mutattak ki, amelyek felismerik és eliminálják a tumorsej teket.

··· • ·

Az egy citotoxikus T-limfocita válasz beindítására képes sejtfelszíni antigének megváltozása lehet annak következménye, hogy a mutáns, idegen vagy túlexpresszálódó fehérje intracellulárisan processzálódik, és ennek következtében peptid-fragmensek képződnek, amik a sejt felszínén mutatódnak be, egy olyan peptid-MHC I-es osztályú komplex részeként, amely képes felismerni a citotoxikus T-limfocitákat. ílymódon a T-limfociták képesek felismerni és eliminálni az aberráns sejteket.

A sejtfelszíni antigének megváltozása mellett a fehérje túlexpresszió, az idegen (azaz például vírus-eredetű) , vagy mutáns fehérje termelődése végül exogén neoantigének (azaz például vírusrészecskék vagy fragmensek) megjelenését eredményezheti. Ezeket membránhoz kötött immunglobulinok ismerhetik fel a B-limfociták felszínén, internalizálják, processzálják, majd ezután segítő T-sejt antigénekként mutatják be MHC ΙΙ-es osztályú molekulákkal képezett komplex formájában a B-sejt felszínén. Egy Bsejt, amely ilymódon mutatja be az antigéneket, egy segítő T-sejttel ismerhető fel egy specifikus Tcr-peptidMHC ΙΙ-es osztályú kölcsönhatás útján, majd arra serkenthető, hogy plazmasejtté alakuljon, amely nagy mennyiségben szekretál oldható ellenanyagokat, amelyek az exogén antigénekre specifikusak. ílymódon a segítő T-limfociták serkenthetik a humorális immunválaszt és indirekt módon aktiválnak nagyszámú különböző immunsejt típust.

• ·· • · · · * · · • ······· ···· ·· ·· · ··

Számos közleményben írnak le tumorspecifikus vagy tumorhoz kötődő neoantigéneket. Például az ERBB2 receptor túlexpressziója számos humán emlő- és petefészek rákhoz kapcsolódik, és emellett az ERBB2-eredetű neoantigének megjelenését eredményezi a sejtek felszínén. A vastagbélrákban az adenomatosis polyposis coli gén (APC) általában korai mutáción esik át. Jóllehet a mutáció gyakran egyszerűen egy stopkodon beszúrását eredményezi (amely leállítja a transzlációt, és ezáltal csonkított APC fehérje keletkezését eredményezi), számos esetben a mutáció egy leolvasási keret-eltolási mutáció, ami új fehérjeszekvenciák és potenciálisan egyedi antigének keletkezését eredményezi. Ha egyszer intracellulárisan processzálódott és az MHC fehérjékhez kötődött, akkor az antigének bemutathatok a sejtek felszínén és a T-limfociták felismerhetik.

Számos más esetben az endogén fehérjék szerkezeti megváltozása vagy az endogén fehérjék túlexpressziója várhatóan ezen fehérjék intracelluláris processzálódásának megváltozását eredményezi, valamint neoantigének bemutatását eredményezi az MHC fehérjékkel a sejtek felszínén .

Az aberráns génexpresszió előzőkben említett következményei ellenére, a fertőzött, aberráns vagy rosszindulatú sejtek leküzdésére létrehozott immunválasz gyakran nem megfelelő. Jóllehet ennek a kudarcnak az okai még nem teljesen ismertek, azt gondolják, hogy az immunrendszer • · «· d · ·. * «· • * « « · · <· · *

t. <··· » · · « ?·«·<!«· • > »· ·> * ** gyakran szövet-specifikus antigénként kezeli a neoantigéneket, és ugyanúgy tolerálja is őket. Emellett a neoantigének általában az I-es osztályú MHC által vezérelt processzáláshoz a peptideknek csak minor forrását jelentik, és így a neoantigén processzálás és prezentáció rendkívül kis hatásfokú. Végezetül úgy tűnik, hogy az immunogenicitást részben annak a szövetnek a típusa határozza meg, amelyben a neoantigén expresszálódik, és így úgy tűnik, hogy a tolerancia nagyobb lehet (és/vagy a processzálás és a prezentáció kevésbé hatékony) bizonyos szövettípusokban.

Számos megközelítési módot dolgoztak ki arra, hogy hatékonyabb immunválaszt generáljanak aberráns, fertőzött vagy rosszindulatú sejtcélpontokkal· szemben. Például azt javasolták, hogy a rosszindulatú sejtekből származó antigéneket használjanak vakcinaként tumorspecifikus, sejtek által közvetített immunitás indukálására.

Újabban adoptív immunterápiát javasolnak a rákos megbetegedés kezelésére. Ez a kezelési mód az antitumor aktivitással rendelkező immunsejteknek a rákos betegekbe való átvitelén alapul. A használt immunsejtek rákos betegekből származnak, tenyésztik őket, majd a szövettenyészetben való elszaporodás után visszajuttatják őket.

Az immunterápiában használt sejtek közé tartoznak a limfokin-aktivált ölősejtek, a tumorba beszűrődő limfoci10 ·« - * ·♦ „ · » * ·· ·« ·*» ·· • 4 · * · · · *· ·* « ·* ták és a citotoxikus T-limfocitákból származó, in vitro érzékenyített limfociták.

A limfokin aktivált ölősejtek citolitikus sejtek, amelyek nagyszámú különböző célsejttel képesek reagálni. Ezek nem MHC-re korlátozódok, és mind az egészséges, mind a tumorsejteket lizáltatják. Az ezeknek a sejteknek a használatán alapuló terápiáknak tehát az a hátrányuk, hogy a tumorsejtek elpusztítását a normál szövetek jelentős károsodása is kíséri.

A tumorba beszűrődő limfociták tumorszövetekből származnak. Sokkal hatékonyabbak mint a limfokin-aktivált ölősejtek, és viszonylag specifikusak arra a tumorra, amelyből származnak, és ezáltal elkerülhető a normál szöveteknek a limfokin-aktivált ölősejteknél tapasztalható szelektív eltávolítása. Azonban ezek a sejtek csak nagyon korlátozott mértékben hozzáférhetők, mivel a tumorszövetekben való természetes előfordulásuktól és in vitro elszaporításuktól függ. Tehát az ezeknek a sejteknek a felhasználásán alapuló terápiák az eseteknek csak kis részében elérhetőek.

Jóllehet az előzőkben említett immunterápiák mindegyikéről kimutatták, hogy bizonyos mértékben képes előidézni a tumorok, regresszióját, terápiás választ csak néhány esetben figyeltek meg (és még akkor is a kezelt betegeknek csak kis részénél mutatkozott meg).

• · · • · • ·

Moritz és munkatársai azt javasolták, hogy a limfociták által közvetített tumor-terápia hatékonyságát úgy lehet fokozni, ha in vitro manipuláljuk a citotoxikus Tlimfociták felismerési specifitását, és így meghatározott tumor-specifitással látjuk el őket [Moritz és mtsai:

Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91,

4318-4322 (1994)] . Moritz és munkatársai úgy közelítették meg ezt a problémát, hogy megkerülték a TcR-alapú (és ezáltal MHC-korlátozott) specifitást egy teljesen szintetikus pszeudoreceptor létrehozásával, ami egy egyláncú ellenanyagot tartalmaz (a kötési specifitás biztosítására) egy csuklón keresztül egy TcR-komplex zéta lánchoz kapcsolva. A szintetikus pszeudoreceptort hordozó citotoxikus T-sejtekről kiderült, hogy MHC-független felismeréssel rendelkeznek, amit az ellenanyag komponens tesz specifikussá.

Azonban úgy tűnik, hogy a teljesen szintetikus pszeudoreceptor használata nem biztosít elég hatékony szignál-transzdukciót a T-sejt aktivitás során. Emellett, mivel a Moritz és munkatársai által leírt, megcélzott citotoxikus T-limfociták felismerési specifitása független az MHC-től, a limfociták sejtfelszín-letapogatási hatékonysága valószínűleg károsodik. Végezetül a szintetikus pszeudoreceptor maga is képes nemkívánt immunválasz keltésére.

A jelen találmány tárgyát másfelé irányzott T-limfociták képezik, például adoptív immunterápiában való felhasználás céljából, amelyek nem expresszálnak teljesen szintetikus pszeudoreceptorokat, hanem ehelyett a TcReken keresztül irányzódnak, amelyeknek a szerkezete lényegében hasonlít a normál TcR-ek szerkezetére. Ennek következtében megőrződik a normál szignál-transzdukciós bioszintézis út, és minimalizálódik a nemkívánt immunválaszok kockázata. Emellett a megcélzott találmány szerinti T-sejtek MHC-korlátozottak, és így hatékonyan képesek letapogatni a sejtek felszínét aberráns antigéneket keresve.

Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát célzott citotoxikus T-limfociták képezik, amelyek heterológ a és β polipeptideket tartalmaznak, amely heterológ polipeptidek a limfocitának MHC I-es osztályra korlátozott specifitást biztosítanak a betegséget okozó célsejtekkel szemben.

A továbbiakban a heterológ a és β Tcr polipeptidek szakkifejezés jelentése olyan a és β TcR láncok, amelyek normális körülmények között nem expresszálódnak a T-sejtekben. Az egyik megvalósítási mód szerint a heterológ TcR polipeptidek kimérák vagy szintetikus molekulák, amelyek rekombináns vagy teljesen szintetikus DNS expressziójából származnak. Más megvalósítási módok szerint a heterológ TcR polipeptidek közvetlenül vagy közvetve • · (azaz például egy TcR gén könyvtárból) egy másik Τ'sejtből származnak. A másik T-sejt maga is bármilyen forrásból származhat, mindaddig amíg a megkívánt specifitású TcR komponenseket expresszálja. A másik T-sejt például származhat ugyanabból a fajból (vagy éppen ugyanabból az egyedből), illetve származhat egy másik fajból. Lehet T-sejt hibridóma is.

A betegség-okozó célsejt irányába megnyilvánuló specificitásnak nem kell abszolútnak lennie. A jelen találmány céljaira elegendő ha a specifitás akkora, hogy a normál vagy a nem-beteg szövet bármilyen velejáró, autoimmun típusú eltávolítása tolerálható a beteg számára.

Olyan körülmények között például, amikor a betegséget okozó sejtek mind egy bizonyos szövethez tartoznak, ami önmagában nélkülözhető, az elegendő, ha a megcélzott T-limfocita hatékonyan specifikus arra a szövetre. Ez lehet a helyzet abban az esetben, amikor a megcélzott betegséget okozó sejtek rosszindulatú prosztatatumor sejtek - itt az is elegendő, ha a citotoxikus T-sejteket megfelelő specifitással célozzuk meg ahhoz, hogy eltávolítsuk mind a normál mind a rákos prosztatasejteket (miközben a többi szöveteket ez nem érinti, illetve kisebb és elfogadható mértékben távolítódnak el) . Egy másik példa a melanóma - jóllehet néhány melanóma-specifikus antigén megjelenik a retina, az agy és a belső fül bizonyos sejt··· • · ···· jeiben, és ezek a sejtek kevésbé érzékenynek látszanak a melanocita-specifikus antigén alapú immunterápiára.

Egy másik helyzet, amikor az abszolút specifitásra nincs feltétlenül szükség, akkor áll fenn, ha egy bizonyos tumornak megfelelő normális szövet rendkívül alacsony szinten expresszálja az MHC I-es osztályt, és ezáltal árnyékolja a citotoxikus T-sejt támadással szemben.

A betegséget okozó sejt szakkifejezést a továbbiakban széles értelemben alkalmazzuk, nemcsak azoknak a sejteknek a jelzésére, amelyek közvetlenül részt vesznek a betegségben (például a tumorsejtek vagy az autoimmun sejtek), hanem azoknak a sejteknek is a jelzésére, amelyek a betegség kifejlődésével állnak kapcsolatban, vagy amelyek segítik a kóros állapot előrehaladását vagy fennmaradását (például vírusfertőzött sejtek). Ennélfogva ez minden olyan sejtre vonatkozik, ami az adott egyed egészsége szempontjából aberráns vagy káros hatású.

A találmány szerinti megcélzott citotoxikus T-limfocita előnyösen rekombináns, amit például egy virális vektorral lehet transzdukálni.

A találmány szerinti megcélzott T-limfocita előnyösen monovalens a megcélzott sejtek szempontjából, egyetlen TcR fajtával rendelkezik, ami MHC I-es osztályú specifitást biztosít az egyetlen osztályba tartozó célsejteknek. Az ilyen monovalens limfocitákat például úgy lehet előállítani, hogy helyettesítjük (inkább mint kiegészítjük) a rezidens (vagy endogén) a és β láncokat heterológ a és β láncokkal, amelyek a kívánt specifitást biztosítj ák.

A találmány szerinti monovalens limfocitákat előállíthatjuk úgy is, hogy korlátozzuk vagy blokkoljuk az endogén TcR expresszióját, az elérhető sok különböző technika egyikével. Például a célzott inszerciós mutagenezis használható az endogén TcR gének elroncsolására.

A monovalens limfociták használatával elkerülhetjük azokat a problémákat, amik abból származnak, hogy helytelenül illeszkedő (és ennek következtében inaktív és/vagy nem-szelektív) a és β dimerek keletkeznek. Az ilyen inaktív dimerek képződése csökkenti a TcR-ek hatásos sejtfelszíni sűrűségét, ami akadályozhatja a a célsejt felismerését és a lízist. A találmány szerinti limfociták monovalenciájának biztosításával a TcR-ek sejtfelszíni sűrűsége biztosítható.

Azonban néhány esetben előnyös vagy kényelmes lehet, ha polivalens citotoxikus T-limfocitákat készítünk, amelyek két vagy több eltérő TcR típust tartalmaznak, amik MHC I-es osztály által korlátozott specifitást biztosítanak két vagy több osztályba tartozó célsejttel szemben. Az ilyen polivalens limfocitákat például úgy lehet előállítani, hogy a rezidens a és β láncokat a megkívánt specifitást biztosító, egy vagy több pár hete16 rológ a és β lánccal egészítjük ki (ahelyett hogy helyettesítenénk) . A találmány szerinti polivalens, becélzott citotoxikus T-limfociták különösen jól használhatók lehetnek olyan körülmények között, amikor arra van szükség, hogy két vagy több különböző osztályba tartozó célsejtet célozzunk meg.

Ha a jelen találmány szerinti megcélzott citotoxikus T-limfocita polivalens, akkor a heterológ a és β TcR polipeptideket előnyösen egyetlen fúziós fehérje formájában készítjük el. Ez megakadályozza rosszul illeszkedő (és emiatt inaktív és/vagy nem-szelektív) a és β dimerek képződését, és ezzel el lehet kerülni azt a problémát, amit az előzőkben ismertetett csökkent hatékonyságú sejtfelszíni TcR sűrűség okoz. A célsejtek előnyösen tumorsejtek, immunsejtek, amelyek hozzájárulnak egy autoimmun válaszhoz és/vagy egy patogénnel fertőzött sejtek (pontosabban vírusfertőzött sejtek). A különösen előnyös megvalósítási mód szerint a célsejtek HIV-vel fertőzött limfociták. Egyéb vírusfertőzés lehet a hepatitisz (azaz a hepatitisz B, C és NANB) valamint a vírus által indukált Burkitt féle limfóma.

A heterológ a és β TcR polipeptidek lehetnek kimérák, és tartalmazhatnak például egy immunglobulin variábilis domént vagy annak egy fragmensét. Az ilyen kiméra TcR-ek kihasználják az erős szerkezeti hasonlóságot a TcR a és β láncainak konstans és variábilis régiói és az immunglobulin V és C régiói között. Az ilyen kiméra a és β TcR polipeptidek alkalmazása különösen kényelmes lehet, ha a kívánt spécititással rendelkező immunglobulin hozzáférhető vagy könnyen beszerezhető (például ismert vagy vagy megjósolt T-sejt antigénekkel szemben készített ellenanyagok készítésével).

A találmány tárgya továbbá eljárás a találmány szerinti citotoxikus T-limfociták előállítására, ami a következő lépésekből áll: a) előállítunk egy vektort, amely tartalmaz egy DNS-t (azaz például egy donor citotoxikus T-limfocitából származó DNS-t), amely a betegséget okozó célsejtekre specifikus a és β TcR polipeptideket kódol, és b) egy recipiens citotoxikus T-limfocitát transzfektálunk az a) lépésben előállított vektorral, és így olyan rekombináns citotoxikus T-limfocitát állítunk elő, amely a betegséget okozó célsejtekre specifikus a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t tartalmaz, majd a

b) lépésben kapott rekombináns citotoxikus T-limfocita expresszálja az ot és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t, ezáltal a limfocitának I-es osztályú MHC-re korlátozott specifitást biztosít, és így a megcélzott sejtekre irányítj a.

Az a) lépésben kapott vektort a betegséget okozó célsejtekre specifikus a és β TcR polipeptidet kódoló DNS • · · · · ··· ·· ··· • · ·· · klónozásával, részekből való öszeállításával vagy kémiai szintézissel (azaz például szilárd fázis oligonukleotid szintézissel) állíthatjuk elő. Az a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t előnyösen az alábbiak szerint állíthatjuk elő: a) donor T-limfocitákat szerzünk, azaz például egy vérbankból, vérmintából vagy tumor biopsziából; b) a donor T-limfocita mintában feldúsítjuk a betegséget okozó célsejtekre specifikus citotoxikus T-limfocitákat, például úgy, hogy specifikusan indukáljuk a szaporodásukat, és/vagy specifikus klonális szaporítással; c) extraháljuk a kromoszómális DNS-t a donor citotoxikus Tlimf ocitákból; és d) izoláljuk a o és 3 TcR polipeptideket kódoló DNS-t, például primer-specifikus PCR amplifikálással.

A vektort a recipiens citotoxikus T-limfocitába megfelelő módszerrel juttathatjuk be. Számos különböző módszer ismert a szakterületen jártas szakember számára, beleértve az elektroporációval végzett transzfekciót, a protoplaszt fúziót vagy a virális (azaz például retrovirális) transzfekciót.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy, a találmány szerinti eljárásban használható módszer, amely vektor egy betegséget okozó sejtre specifikus a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t tartalmaz. A vektor DNS-ét előnyösen működés szempontjából egy expressziós elemhez vagy elemekhez kapcsolhatjuk, hogy ezzel biztosítsuk a TcR polipeptidek megfelelő mértékű expresszióját. Számos különböző expressziós elem használható, és az elemek bármilyen formájúak lehetnek, mindaddig, ameddig (legalábbis bizonyos körülmények között) vezérlik és/vagy kontrollálják azoknak a géneknek az expresszióját, amelyekhez működés szempontjából hozzá vannak kapcsolva. Az expressziós elem vagy elemek tartalmazhat(nak) például transzkripciós és/vagy transzlációs elemeket, tartalmazhatnak promotereket, riboszómális kötőhelyeket, fokozókat és szabályozó helyeket, beleértve az aktivátor és represszor (operátor) helyeket. Csak példaként említjük meg, hogy a találmányban használható expressziós elemeket azok közül választhatjuk ki, amelyek természetes körülmények között az a és/vagy a β TcR peptid génekkkel állnak kapcsolatban.

A találmány szerinti vektor egyszerűen egy virális vektor, amely például a majom 40-es víruson, adenovírusokon (azaz például humán adenovírusokon) , retrovírusokon és papillómavírusokon alapul.

A vektor tartalmazhat továbbá: a) pozitív szelekciós markert, ami lehet például neomicin-foszfotranszferáz, higromicin-főszfotranszferáz, xantinguanin-foszforiboziltranszferáz, a Herpes simplex vírus 1-es típusú timidinkináza, az adenin foszforibozil-transzferáz és a hipoxantin foszforibozil-transzferáz és/vagy b) a negatív szelekciós marker, ami lehet például a Herpes simplex vírus

1-es típusú timidin-kináza, az adenin foszforiboziltranszferáz, a higromicin-foszfotranszferáz és a hipoxantin foszforibozil-transzferáz.

A pozitív szelekciós marker megkönnyíti a transzfektált T-limfociták szelekcióját és/vagy azonosítását, míg a negatív szelekciós marker lehetővé teszi, ezután elimináljuk a transzfektált T-sejteket, akár in vivő akár in vitro (például· akkor, ha nemkívánatos mellékhatások keletkeznek) .

A plazmidok előállítási módszerei, amik lehetővé teszik, hogy olyan konstrukciókat állítsunk elő, amelyek révén például az a és β egységek expresszálódnak emlős sejtekben, pontosabban a genetikailag megváltoztatott citotoxikus T-limfocitákban, jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára.

Egy különösen előnyös vektor expresszálja mind az a mind a β láncot, egyetlen promoter vezérlésével.

Különösen előnyösek azok a promoterek, amelyek specifikusak a T-sejt és/vagy T-sejt prekurzor/kiindulási sejt-expresszióra, és a konstrukciókat egy poliovírus eredetű belső riboszómális belépési hellyel (IRES) lehet elválasztani. Az IRES lehetővé teszi, hogy két külön genetikai elem ugyanannak a promoter/fokozó elemnek a szabályozásával expresszálódjon, amit a szekvencia 5' végéhez illesztenek.

··· • ·

A vektor előnyösen lehet egy retrovírus vektor. Az emlős sejtek retrovirális transzdukciója nagyon hatékony, és használható arra, hogy humán sejteket génekkel transzdukáljunk, azaz például egy kiválasztott T-sejt receptor a és β láncaival. A retrovirális vektornak előnyösen van egy specifikus 3' LTR régiója. A megváltoztatandó sejtet a vektorral transzdukálva, valamint a vektornak a reverz transzkripciójával, aminek hatására provirális DNS keletkezik a gazdaszervezet genomjába való beillesztés céljából, az 5' LTR promoter/fokozó elem aktivitása elvész. Ez lehetővé teszi, hogy az expressziót a kiválasztott promoterek vezérlése alá helyezzük, és ezzel lehetővé váljék a citotoxikus T-sejt specifikus expresszió [ Yu,

S.F. és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83, 3194 (1986)] . Ha egy ilyen retrovirális vektorban a vektor mérete korlátozó tényező, akkor alternatív vektorok, azaz például adenovírus vektorok is szóba jöhetnek.

A megcélzott citotoxikus T-limfociták és a találmány szerinti vektorok a terápia különböző formáiban lelnek alkalmazásra, különösen az adoptív immunterápiában. A limfociták és a vektorok különösen jól használhatók az adoptív immunterápiában, az alábbi lépések alkalmazásával: a) citotoxikus T-limfocitákat távolítunk el egy betegből, és adott esetben szelektíven elszaporítjuk őket szövettenyészetben, b) az a) lépésben eltávolított cito• · · ···· ·· ·· · · toxikus T-limfocitákat transzfektáljuk a találmány szerinti vektorral, hogy így célzott citotoxikus T-limfocitákat állítsunk elő, és c) a b) lépésben kapott becélzott T-limfocitákat újra bejuttatjuk a betegbe.

Az előzőkben ismertetett módszerben az adoptív immunterápiában használt T-limfociták autológok. Ennek komoly előnyei vannak, mivel ez biztosítja, hogy a T-limfocitáknak megvannak a megfelelő ko-stimuláló és adhéziós faktorai, amik a betegbe való visszajuttatás után a megcélzott sejtek hatékony felismeréséhez szükségesek.

A terápia használható rákos betegeknél, AIDS betegeknél, autoimmun betegségben szenvedő egyedeknél vagy immunszuppresszált egyedeknél (például átültetett szervvel rendelkező egyednél), akik opportunista fertőzésben szenvednek.

A jelen találmány szerinti becélzott citotoxikus Tlimfociták és vektorok vakcinaként is alkalmazhatók, például olyan egyedeknél, akiket erősen fenyeget egy betegség. Az ilyen fenyegetettségben élő egyedekre példa lehet a betegségre genetikai vagy környezeti faktor miatt érzékeny egyed (azaz például rák, AIDS vagy hepatitisz) . Például a jelen találmány szerinti T-limfociták használhatók arra is, hogy a Rowland-Jones által leírt típusú

AIDS-szel szemben immunitást biztosítsanak [ Rowland-Jones és mtsai: Natúré Medicine 1(1), 59-64 (1995)] .

A találmányt az alábbiakban részletesebben ismertetjük a specifikus példákon keresztül, amik általunk gyakorlatilag hasznosíthatónak vélt leírásokat tartalmaznak (módosítással vagy anélkül). Ezeket a példákat nem azért adjuk meg, hogy bármilyen módon korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa

TcR klónozás

A T-sejt receptorok klónozása történetileg a számunkra érdekes receptort hordozó T-sejtből származó cDNS könyvtár készítésén alapul. Ez azt jelentette, hogy minden egyes T-sejt receptorhoz egy új cDNS könyvtárat kellett készíteni a klonális sejtvonalból, ami egy időigényes eljárás.

Azonban a T-sejt receptor két alegységének, az a-nak és a β-nak a két génje között vannak azonos szekvenciájú régiók. Ezek úgy ismertek mint konstans régiók, és minden a és β alegység génben megtalálhatók. Ezeknek a régióknak a szekvenciái a klónozott T-sejt receptor alegységek publikált adatai között találhatók meg, és ezeket összehasonlítva lehetséges a szekvencia-azonosság konstans régióinak azonosítása. Jóllehet ezeket a régiókat konstans régióknak hívják, az elemzés kimutatta, hogy van bizonyos variáció az ezidáig klónozott receptor alegységek

konstans régióiban. Azonban a konzisztens szekvenciák kis régiói azonosíthatók egy receptor alegységben.

Ezeknek a régióknak a felhasználásával lehetséges a teljes hosszúságú a és β alegység transzkriptum klónozása, az inverz polimeráz láncreakció (PCR) néven ismert módszerrel [ Ochman és mtsai: Genetics 120, 621-623 (1988)] . Ez a módszer azon alapul, hogy a mRNS-ből származó cDNS képes cirkularizációra, és a transzkriptum ismert szekvenciája alapján tervezett PCR primerekkel a teljes cDNS amplifikálható lánchosszabbítással a cirkularizált DNS nem jellemzett régiójában. Azonban a kapott PCR termékek nem adják a keresett szekvenciát a helyes orientációban, ennek következtében a PCR terméket klónozni kell ahhoz, hogy szekvenálni lehessen őket. A szekvencia adatok alkalmazásával láthatóvá lehet tenni a szekvenciát a helyes orientációban és normális PCR primerek tervezhetők azzal a céllal, hogy a teljes hosszúságú cDNS-t amplifikáljuk a helyes orientációban. Ezeket a cDNS kiónokat expressziós vektorokba lehet klónozni a további manipulációk céljából.

Mivel az inverz primereket egy konstans régió ellen terveztük, ezért ugyanazok a módszerek és primerek használhatók a különböző T-sejt kiónok esetében is. Ez jelentősen csökkenti a sejtszám szükségletet és fokozza a TcR klónozás sebességét és hatékonyságát.

• «

A módszert az alábbiakban foglalhatjuk össze (lásd

1-3. ábrákat):

1) Össz-RNS-t izolálunk a számunkra érdekes T-sejt kiónból, Trizol reagenst alkalmazva.

2) cDNS-t állítunk elő az össz-RNS-ből, reverz transzkripciót alkalmazva erre a célra, oligo dT-t használva primerként a transzkripcióhoz.

3) A második szál szintézisét DNS polimeráz I-gyel végezzük RNáz H jelenlétében, hogy a hibridizálódó mRNS szálban töréseket és lukakat hozzunk létre, ami a DNS szintéziséhez 3' -OH kezdőpontokat szolgáltat.

4) A cirkularizációt T4 DNS ligázzal végezzük kis koncentrációjú DNS oldatban, ami monomer körök keletkezését segíti elő.

5) A lineáris DNS-t eltávolítjuk exonukleáz Ill-as kezeléssel .

6) A kapott körbe zárt DNS alkalmazásával a számunkra érdekes transzkriptumokat inverz PCR-rel amplifikáljuk. Az inver primereket úgy tervezzük meg, hogy a cDNS-t először ellentétes irányban replikálják (amint az az 1. ábrán látható), és így lineáris termékeket kapjunk. Ezeket a termékeket azután normál POR módszerrel szaporítjuk.

7) A PCR termékeket agaróz gélen választjuk el, majd a legnagyobb csíkok közül néhányat kivágunk a gélből, és megtisztítjuk. A tisztított termékeket használjuk azután egy további PCR reakcióban. Azonban kontrollként normál PCR primereket tervezünk, hogy az egyik T-sejt receptor alegység konstans régiójának rövid szakaszát amplifikáljuk. Mivel az inverz PCR-ből kapott fragmensek konstans régiókat tartalmaznak, ha valóban T-sejt receptor alegységek, az ezeket a primereket alkalmazó normál PCR rövid fragmenseket amplifikál, amiket egy agaróz gélen tehetünk láthatóvá.

A fragmensekből amplifikálással nem kapunk normális PCR termékeket, ha a megfelelő normális primereket használjuk az amplifikálásra, mivel ezek nem reprezentálják a számunkra érdekes kiónokat, ezért ezeket eldobtuk.

8) A megmaradt kiónok TA vektorba klónozhatok (beszerezhető az Invitrogen-től) , ami egy plazmid vektor, ami a 3' adenilezési helyeken alapul, amik minden egyes replikációs ciklusban Taq polimerázzal jönnek létre, a PCR termék beépítésére. Azután kompetens baktériumokat transzformálunk a kapott plazmidokkal, majd a transzformánsokat az ampicillin rezisztencia alapján választjuk ki. Az inszerteket tartalmazó plazmidok megszakított lac Z gént tartalmaznak, ezért ha X--gal-t tartalmazó tápagarra helyezzük, akkor színtelenek.

9) Igazoló emésztéseket végzünk a kiválasztott kiónokból izolált plazmid-DNS-ek miniprepjein. A kiválasztott • · kiónokat azután elszaporítjuk és nagy mennyiségű plazmid DNS-t izolálunk az automatizált szekvenáláshoz.

10) Ha egyszer már megkaptuk a szekvencia-adatokat, akkor lehetséges, hogy megkülönböztessük a transzkriptum helyes orientációját, az ATG startkodon azonosításával (a részletesebb magyarázathoz lásd a 2. ábrát).

Ezeknek az adatoknak a felhasználásával azután lehetséges PCR primerek tervezése, hogy a T-sejt kiónból származó eredeti lineáris cDNS készítményből a teljes transzkriptumot amplifikáljuk. Ezeket azután számos különböző vektorba klónozhatjuk, beleértve az eukarióta expressziós vektorokat is.

Ezt a módszert számtalan T-sejt receptor alegység esetében alkalmazhatjuk, feltéve, hogy a megfelelő T-sejt kiónok hozzáférhetők, anélkül, hogy új primereket tervezése szükségessé válna (kivétel a teljes hosszúságú transzkriptum amplifikálása az eljárás végén). Emellett a teljes eljárást napok alatt végrehajthatjuk, a cDNS könyvtár előállításán alapuló eljárással szemben.

2. Példa

MAGE-1 melanóma antigénre célzott citotoxikus T-sejtek készítése

A MAGE-1 gén MZ2-E termékét felismerő citotoxikus Tlimfocitákat gyűjtünk, majd DNS-üket extraháljuk [ Chen és • · • · ·· • · · · mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences,

USA 91, 1004-1008	(1994); Van den	. Eunde és mtsai	: Int.
J. Cancer 44,	634-(	54 0 (1989) ; van	dér Bruggen	és	mtsai:
Science 254,	1643	-1647 (1991);	Traversari	és	mtsai:
Immunogenetics	35,	145-152 (1992);	Traversari	és	mtsai:

J. Exp. Med. 176, 1453-1457 (1992)] .

Komplementer DNS könyvtárat készítünk az extrahált DNS-ből, egy λ gtll vektor alkalmazásával. Az o és 3 láncokat kódoló komplementer DNS (cDNS) kiónokat azután izoláljuk, az o és 3 lánc konstans-régió hibridizációs próbák alkalmazásával [ Dembic és mtsai: Natúré 314, 271273 (1985); Snodgrass és mtsai: Natúré 315, 232-233 (1985)] . A használt eljárás hasonlít arra, amit Dembic és munkatársai írtak le [Dembic és mtsai: Natúré 320, 232238 (1986)] .

Mind az o mind a 3 lánc génjeit azután egy kozmád vektorba klónozzuk ugyanabban a transzkripciós orientációban, egy neomicin rezisztencia génnel, mint pozitív szelekciós markerrel együtt. A megfelelő expressziós elemeket funkcionálisan hozzákapcsoljuk az o és 3 kódoló szekvenciákhoz, hogy biztosítsuk a hatékony expressziót.

Az o és 3 láncokat tartalmazó kozmid vektort azután protoplaszt-fúzióval átvisszük egy megfelelő recipiens citolitikus T-sejt hibridómába, így kapunk egy, a MAGE-1 géntermékre specifikus rekombináns T-sejt hibridómát.

······*···· ···· ·· ·· * ··

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az előzőkben ismertetett módszer könnyen adaptálható egyéb TcR-ek kinyerésére és transzferére, és megfelelő módosításokkal alkalmazható bármelyik recipiens citotoxikus T-sejt populációban.

3. Példa

Genetikailag megváltoztatott humán T-limfociták előállítása, amelyek citotoxikus aktivitást mutatnak az influenza (Flu) vírust expresszáló sejtekkel szemben

Egy I-es osztályú MHC HLA-A2 véradótól származó humán perifériális vér mononukleáris sejteket (PBMC) izolálunk, majd in vitro tenyésztjük standard közegben olyan Flu peptidek jelenlétében, amelyekről ismert, hogy egy HLA-A2 korlátozott módon prezentálódnak. így tehát antigén-prezentáló sejteket készítünk.

Egy másik változat szerint antigén-prezentáló sejtek úgy hozhatók létre, hogy egy HLA-A2 korlátozott donorból izolált dendrites sejtek populációjához adunk peptidet.

A peptiddel végzett 24 órás inkubálás után a PBMCket CD4/CD8 sejtekhez adjuk, amelyek egy nemrég influenzával szemben immunizált donorból származnak, szintén HLA-A2 1-es osztályú korlátozott idiotípusúak. Az immunizált donorból származó CD4/CD8 sejt populációt határhigításban (100-ról 1 sejtre) mikrotiter lemezekre szélesztjük, majd 10-14 napig hagyjuk a prezentáló sejtek

·* jelenlétében, a megfelelő tápközeg-cseréket végrehajtva. A lemezeket azután átvizsgáljuk, T-limfociták expandáló telepeit keresve, amelyek aktivált CD4/CD8 sejteket prezentálnak, és amelyek képesek felismerni az antigén-prezentáló sejteket, valamint citotoxikusak velük szemben.

Az aktivált T-limfocitáknak ezeket az expandáló telepeit, amelyek képesek felismerni az influenza antigént, ha egy 1-es osztályú MHC által korlátozott módon mutatják be a sejtek, azután klónozzuk, és teljes T-sejt receptor a és β lánc szekvenciák izolálására használjuk, az 1. példában leírtak alapján.

Egy másik módszer szerint az a és β cDNS előállítására és izolálására használt, a szakterületen jártas szakember számára ismert eljárásokat alkalmazhatók.

Ha egyszer már izoláltuk, akkor az a és β láncok cDNS-ét arra használjuk, hogy egy nem-immun 1-es osztályú MHC HLA-A2 donorból származó T-sejteket megváltoztassunk. Ez a genetikailag megváltoztatott T-sejteknek azt a tulajdonságot biztosítja egy 1-es osztályú korlátozásnak megfelelő módon, hogy felismerjék az influenzával fertőzött sejteket és közvetíti a citotoxicitást a krómfelszabadulási vizsgálat alapján.

4. Példa

Olyan humán T-limfociták készítése, amiket úgy változtattunk meg, hogy citotoxikus aktivitást mutassanak egy,

• · a ras onkogén családba tartozó tagot expresszáló sejtekkel szemben

Egy 1-es osztályú MHC HLA-A2 véradóból származó humán teljes perifériális mononukleáris sejteket (PBMC) állítunk elő, majd in vitro körülmények között tenyésztjük standard közegben, Harvey ras vagy Kirsten ras vagy N-ras onkogén peptidek jelenlétében, amelyekről ismert, hogy egy HLA-A2 korlátozott módon prezentálódnak. így tehát antigént prezentáló sejtek jönnek létre.

Egy másik módszer szerint antigént prezentáló sejteket úgy állítunk elő, hogy az említett peptide(ke)t egy HLA-A2 korlátozott donorból származó dendrites sejtek populációjához adjuk hozzá.

A peptiddel végzett 24 órás inkubálás után a PBMCket hozzáadjuk CD4/CD8 sejtekhez, amik egy sorozat humán donorból származnak, és szintén HLA-A2 1-es osztályú MHC korlátozott idiotípusúak. A donorokból származó CD4/CD8 sejt-populációkat határhigításban (100-ról 1 sejtre) szélesztjük mikrotiter lemezekre, majd 10-14 napig hagyjuk állni a prezentáló sejtek jelenlétében, a megfelelő tápközeg-cseréket végrehajtva. A lemezeket azután átvizsgáljuk, hogy van-e rajtuk expandáló T-limfocita, ami aktivált CD4/CD9 sejteket reprezentál, amik képesek felismerni az antigént prezentáló sejteket, és citotoxikusak velük szemben.

Ezeket az aktivált T-limfocita expandáló telepeket, amelyek képesek felismerni a ras onkogén antigént ha a sejtek 1-es osztályú MHC-korlátozott módon prezentálják, azután klónozzuk és arra használjuk, hogy komplett T-sejt receptor a és β láncokat állítsunk elő, az előzőkben ismertetett módon.

Ha egyszer más izoláltuk, akkor az N-ras onkogénnek vagy a Harvey ras vagy a Kirsten ras onkogén peptidjei felismeréséhez kapcsolódó a és β láncok cDNS-ét arra használjuk, hogy egy nem-immun 1-es osztályú MHC HLA-A2 donorból származó T-sejteket változtassunk meg velük. Ez a genetikailag megváltoztatott T-sejteknek azt a képességet biztosítja, hogy a sejtekben felismerjék a ras onkogén aktiválást egy 1-es osztály szerint korlátozott módon, és sejtek által közvetített citotoxicitást biztosítsanak az ilyen sejtekkel szemben, a krómfelszabadulási vizsgálat alapján.

5. Példa

Olyan humán T-limfociták készítése, amiket úgy változtattunk meg genetikailag, hogy citotoxikus aktivitást mutassanak HÍV peptideket expresszáló sejtekkel szemben

Egy 1-es osztályú MHC HLA-B35 véradóból származó humán teljes perifériális mononukleáris sejteket (PBMC) állítunk elő, majd in vitro körülmények között tenyésztjük standard közegben, HÍV peptidek jelenlétében, • ·· ···· ·· • ·« amelyekről ismert, hogy egy HLA-B35 korlátozott módon prezentálódnak. így tehát antigént prezentáló sejtek jönnek létre.

Egy másik módszer szerint antigént prezentáló sejteket úgy állítunk elő, hogy az említett peptidet egy HLA-B35 korlátozott donorból származó dendrites sejtek populációjához adjuk hozzá.

A pepiiddel végzett 24 órás inkubálás után a PBMCket hozzáadjuk CD4/CD8 sejtekhez, amik egy sorozat humán donorból származnak, és szintén HLA-B35 1-es osztályú MHC korlátozott idiotípusúak. A donorokból származó CD4/CD8 sejt-populációkat határhigításban (100-ról 1 sejtre) szélesztjük mikrotiter lemezekre, majd 10-14 napig hagyjuk állni a prezentáló sejtek jelenlétében, a megfelelő tápközeg-cseréket végrehajtva. A lemezeket azután átvizsgáljuk, hogy van-e rajtuk expandáló T-limfocita, ami aktivált CD4/CD9 sejteket reprezentál, amik képesek felismerni az antigént prezentáló sejteket, és citotoxikusak velük szemben.

Ezeket az aktivált T-limfocita expandáló telepeket, amelyek képesek felismerni a HLA-B35 processzált HÍV antigént ha a sejtek 1-es osztályú MHC-korlátozott módon prezentálják, azután klónozzuk és arra használjuk, hogy komplett T-sejt receptor a és β lánc szekvenciákat állítsunk elő, az előzőkben ismertetett módon, vagy az a • · és β cDNS előállítására és izolálására a szakterületen jártas szakember számára ismert alternatív módszerekkel.

Ha egyszer más izoláltuk, akkor az a és β láncok cDNS-ét arra használjuk, hogy egy nem-immun 1-es osztályú MHC HLA-B35 donorból származó T-sejteket változtassunk meg velük. Ez a genetikailag megváltoztatott T-sejteknek azt a képességet biztosítja, hogy felismerjék a HIV-vel fertőzött sejteket egy I-es osztály szerint korlátozott módon, A sejtek által közvetített citotoxicitást a krómfelszabadulási vizsgálat alapján igazoljuk.

• · ··· ·· ·» · ··

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Célzott citotoxikus T-limfocita, amely hetero' i ς C ' -* í aVl 0 lóg a és β polipeptideket tartalmaz/ amely heterológ polipeptidek a limfocitán MHC I-es osztályra korlátozott specifitást biztosítanak a betegséget okozó sejtekkel szemben, és a T-limfocita monovalens, egyetlen TcR típussal rendelkezik, ami MHC I-es osztályra korlátozott specifitást biztosít célsejtek egyetlen osztályával szemben.
2. Az 1. igénypont szerinti célzott T-limfocita, amely rekombináns eredetű.
3.

A 2. igénypont szerinti T-limfocita, amit egy vi rális vektorral vrsztmkr'áh-.

Az előző igénypontok bármelyike szerinti citotoxikus T-limfocita, aholis a célsejtek^/ehetnek] tumorsejtek, immunsejtek, amelyek hozzájárulnak egy autoimmun válaszhoz és/vagy egy patogén szervezettel fertőzött sej tek.

5. A 4. igénypont szerinti célzott citotoxikus Tlimfociták, aholis a megcélzott sejtek humán melanóma sejtek, és a heterológ a és β polipeptidek specifitást biztosítanak: a) a MAGE-1 tumor antigénnel szemben; b) a MAGE-3 tumor antigénnel szemben; c) a MART 1/Aa tumor antigénnel szemben; d) a gplOO tumor antigénnel szemben és/vagy^yá^tirozináz tumor antigénnel szemben.

··· ·* ··· ·· · ♦ ·· • ·♦

6. A 4. igénypont szerinti célzott citotoxikus Tlimfocita, aholis a patogén egy vírus.

7. A 6. igénypont szerinti célzott citotoxikus Tlimfocita, aholis a megcélzott sejtek HIV-fertőzött limfociták.

8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti célzott citotoxikus T-limfocita, aholis a heterológ a és β TcR polipeptidek egyetlen fúziós fehérje formájában találhatók.

9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti célzott citotoxikus T-limfocita, aholis a heterológ a és β TcR polipeptidek kimérák.

10. A 9. igénypont szerinti célzott citotoxikus Tlimfocita, amelyben a kiméra TcR polipeptidek egy immunglobulin variáns^ dom^nt vagy annak fragmensét tartalmazzák .

11. ? Eljárás az előző igénypontok bármelyike szerinti célzott citotoxikus T-limfociták előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

-- ^:/olyan vektort állítunk elő, amely olyan nukleinsavat (azaz egy donor citotoxikus T-limfocitából származó DNSt) tartalmaz, amely a betegséget okozó célsejtekre specifikus a és β TcR polipeptideket kódol, és < egy recipiens citotoxikus limfocitát transzfektálunk az a) lépésben előállított vektorral, hogy így egy olyan ·«· ··» ·« · * rekombináns citotoxikus T-limfocitát állítsunk elő, amely a betegséget okozó célsejtekre specifikus a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t tartalmaz, aminek a hatására a b) lépésben keletkezett rekombináns T-limfocita a és β TcR polipeptidet kódoló DNS-t expresszál, ami a limfocitát az I-es osztályra korlátozódó specifitással rendelkezővé teszi, és ezáltal a célsejtre irányítja.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben kapott vektort a betegséget okozó célsejtekre specifikus a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t klónozással, összerakással vagy kémiai szintézissel (azaz például szilárd fázisú oligonukleotid szintézissel) állítjuk elő.

13. A 12. igénypont szetinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t a következő lépésekben klónozzuk:

donor T-limfocitákból, azaz például vérbankból, vérmintából vagy tumorbiopsziából mintát veszünk;

a donor T-limfociták mintájában dúsítjuk a betegséget okozó célsejtekre specifikus citotoxikus T-limfocitákat, például specifikusan indukált szaporodással

---------------és/vagy specifikus klonális expanzióval;

a donor citotoxikus T-limfocitákból kromoszómális

DNS-t extrahálunk; és • V • · · · · a ··· ·« ··“ izoláljuk az a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t, például primer-specifikus amplifikálással.

14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektort transzfektáljuk a recipiens citotoxikus T-limfocitába, elektroporációval, protoplaszt-fúzióval vagy virális (például retrovirális) transzfekcióval.

A

15/ A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti módszerrel előállítható célzott citotoxikus T-limfocita. Tö?) A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti módszerben használható vektor, amely egy betegséget okozó sejtre specifikus a és β TcR polipeptideket kódoló DNS-t tartalmaz, ί és a DNS ^például^jnűködés szempontjából hozzá lehet kapcsolva egy expressziós elemhez vagy expressziós elemekhez, és az expressziós elemet vagy expressziós

t.

elemeket az alábbiak közül választhatjuk ki: transzkripciós és/vagy transzlációs elemek, promoterek, riboszómális kötőhelyek, fokozok, szabályozó helyek (azaz például aktivátor és represszor (operátor) szekvenciák), és az a és/vagy β TcR peptid génekhez természetes körülmények között kapcsolódó expressziós elemek.

17. A 16. igénypont szerinti vektor, ami egy virális vektor, és például SV40-en, adenovírusokon (azaz például humán adenovírusokon) , retrovírusokon és papillómavíruson alapul.

·» ·» ·« i ♦ « * « * « ·<· »< ·*·

18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti vektor, ami tartalmaz még: a) pozitív szelekciós markert, ami lehet például neomicin foszfotranszferáz, higromicin foszfotranszferáz, xantinguanin foszforiboziltranszferáz, a Herpes simplex vírus 1-es típusú timidin kináz, adenin foszforiboziltranszferáz és hipoxantin foszforiboziltranszferáz és/vagy b) negatív szelekciós marker, ami lehet például Herpes simplex vírus 1-es típusú timidin kináz, O^enun^ foszforiboziltranszferáz, higromicin foszfotranszferáz és hipoxantin foszforiboziltranszferáz.

19. Az 1-10. vagy 15. igénypontok bármelyike szerinti célzott citotoxikus T-limfocita a terápiában való alkalmazás céljára, amely heterológ a és β polipeptideket tartalmazó TcR-rel rendelkezik, amely heterológ polipeptidek a limfocitán egy megcélzott sejttel szemben MHC Ies osztályra korlátozott specifitásal rendelkeznek.

y20.J Egy, a 19. igénypont szerinti célzott citotoxikus T-limfocita, vagy a 16-18. igénypontok bármelyike szerinti vektor alkalmazása egy adoptív immunterápiában használható gyógyszer előállításában.

21. Eljárás a 20. igénypont alkalmazására, azzal jellemezve, hogy az adoptív immunterápia a következő lépésekből áll:

a) citotoxikus T-limfociták eltávolítása egy betegből,
4 « · ο 4 · · * »4· 99 999

9 9 9 9 9

9999 »· ·« 9

99 • « ··

b) az a) lépésben eltávolított citotoxikus T-limfociták transzfektálása a 16-18. igénypontok bármelyike szerinti vektorral, célzott citotoxikus T-limfociták elő-