CZ290520B6 - Způsob získání kapalného extraktu ľraločí chrupavky, chrupavkový extrakt získaný tímto způsobem a kompozice obsahující tento chrupavkový extrakt a jejich pouľití - Google Patents
Způsob získání kapalného extraktu ľraločí chrupavky, chrupavkový extrakt získaný tímto způsobem a kompozice obsahující tento chrupavkový extrakt a jejich pouľití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290520B6 CZ290520B6 CZ19963141A CZ314196A CZ290520B6 CZ 290520 B6 CZ290520 B6 CZ 290520B6 CZ 19963141 A CZ19963141 A CZ 19963141A CZ 314196 A CZ314196 A CZ 314196A CZ 290520 B6 CZ290520 B6 CZ 290520B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cartilage
- extract
- molecular weight
- composition
- molecules
- Prior art date
Links
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 title claims abstract description 111
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 title claims abstract description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 14
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 12
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940007115 shark cartilage extract Drugs 0.000 claims description 5
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 43
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 34
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 34
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 30
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 9
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 241000251774 Squalus Species 0.000 description 4
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 7,12-dimethyltetraphene Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(C=CC=C1)C1=C2C ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- VFZRZRDOXPRTSC-UHFFFAOYSA-N DMBA Natural products COC1=CC(OC)=CC(C=O)=C1 VFZRZRDOXPRTSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010030348 Open-Angle Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NPNFCMZQTTWXHQ-UHFFFAOYSA-N [Zn].[Na].[K].[Mg].[Ca] Chemical compound [Zn].[Na].[K].[Mg].[Ca] NPNFCMZQTTWXHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003410 keratolytic agent Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- IBLKWZIFZMJLFL-UHFFFAOYSA-N 1-phenoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COC1=CC=CC=C1 IBLKWZIFZMJLFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 206010000503 Acne cystic Diseases 0.000 description 1
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000251729 Elasmobranchii Species 0.000 description 1
- 229940122858 Elastase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101001010513 Homo sapiens Leukocyte elastase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000001126 Keratosis Diseases 0.000 description 1
- 244000165082 Lavanda vera Species 0.000 description 1
- 235000002997 Lavandula Nutrition 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000251778 Squalus acanthias Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229940069521 aloe extract Drugs 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000842 anti-protozoal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-UHFFFAOYSA-O dimethyl-(3-sulfopropyl)-[3-[4-(3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoylamino]propyl]azanium Chemical compound OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 UMCMPZBLKLEWAF-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 239000003602 elastase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- MMMNTDFSPSQXJP-UHFFFAOYSA-N orphenadrine citrate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C=1C=CC=C(C)C=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 MMMNTDFSPSQXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000030393 positive regulation of fibroblast proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 201000006366 primary open angle glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940118605 shark preparation Drugs 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/10—Anti-acne agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Zp sob z sk n kapaln ho extraktu ralo chrupavky, spo vaj c v tom, e zahrnuje n sleduj c stupn : a) ralo chrupavky se homogenizuj v nedenaturuj c m vodn m roztoku, p°i kter m se ralo chrupavka redukuje na stice, jejich velikost je men ne nebo rovna 500 .mi.m, za vzniku sm si stic a surov ho kapaln ho extraktu; b) odd l se surov² kapaln² extrakt z uveden²ch stic; a c) d le se d l surov² kapaln² extrakt tak, e se z sk kone n² kapaln² extrakt, obsahuj c chrupavkov molekuly, maj c molekulovou hmotnost men ne nebo rovnou 500 000. Vyn lez se d le t²k chrupavkov ho extraktu p°ipraven ho uveden²m postupem, d le kompozic pro l en dermatologick²ch poruch nebo chorob, obsahuj c ch terapeuticky · inn mno stv chrupavkov ho extraktu ve spojen s farmaceuticky p°ijateln²m vehikulem. Vyn lez se rovn t²k topick kompozice pro l en psori zy nebo akn , jako i kompozic pro l en rakoviny.\
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká způsobu získání kapalného extraktu žraloci chrupavky, chrupavkového extraktu získaného tímto způsobem a kompozic obsahujících tento chrupavkový extrakt, které mají antiangiogenickou aktivitu a vliv na regresi tumorů. Vynález se dále týká kompozic pro léčení dermatologických poruch nebo chorob, jakož i topické kompozice pro léčení psoriázy nebo akné, a kompozice pro léčení rakoviny.
Dosavadní stav techniky
Chrupavka je avaskularizovaná tkáň a byla studována jako potenciální kandidát, obsahující antiangiogenické faktory. Je to také tkáň, která je relativně odolná k vývoji tumoru. Tumor spojený s chrupavkou, chondrosarkom, je většinou vaskularizovaný pevný tumor. Angiogeneze je jedním z důležitých faktorů ve vývoji tumoru. Oddělené pevné tumorové hmoty se objevují, jestliže tumorové buňky mohou provokovat sousední vaskulámí síť k expanzi k doplnění svých vyživovacích potřeb. Proto faktory zahrnuté ve stimulaci angiogeneze byly studovány pokud jde o jejich úlohu ve vývoji tumoru a antiangiogenické faktory jakož i jako léčiva, mající angiogenickou aktivitu byla také hodnocena jako nástroje pro kontrolu růstu nebo pro dosažení regrese tumorů.
Bylo objeveno, že scapulární chrupavka u telat obsahuje složky, které inhibují vaskularizaci pevných tumorů (Langer a spol., 1976). Pro její povzbuzující potenciál jako protitumorového činidla byly vyhledávány zdroje většího dodávání chrupavky.
Žraloci jsou živočichové, kteří jsou potenciálním zdrojem tohoto typu inhibitoru angiogeneze, protože jejich endoskelet je složen celý z chrupavky (6 % jejich tělesné hmotnosti proti 0,6 % u telat). Žraloci mají také zajímavý charakteristicky nízký sklon k vývoji tumorů. Bylo vypracováno mnoho hypotéz k vysvětlení tohoto nízkého sklonu k vývoji tumorů u žraloků. Marchalonis a spol. (1990) představili IgM protilátky schopné snadněji atakovat jakékoliv agresivní činidlo. McKinney a spol. (1990) ukázali, že žraloci mají makrofágy schopné diferenciace normálních buněk od neoplastických buněk a zničení posledně uvedených. Rosen a Woodhead (1980) uvedli tvrzení, že vzácnost tumorů u elasmobranchů (skupina, ke které patří žraloci a rejnoci) by mohla být způsobena vysokou iontovou silou jejich tkání, která je ekvivalentní vysoké tělesné teplotě. Za těchto podmínek tito autoři očekávají, že imunitní systém působí ke 100% imunologického dozoru. Moore a spol. (1993) objevili, že žralok produkuje aminosterol, mající antibakteriální a antiprotozoální vlastnosti. Konečně Lee a Langer (1983) aFolkman a Klagsburn (1987) zjistili, že žraloci produkují substanci, která inhibuje neovaskularizaci. Lee a Langer (op.cit.) izolovali tuto substanci její extrakcí ze žraločí chrupavky za denaturačních podmínek (guanidinová extrakce). Tento způsob extrakce je však velmi dlouhý (41 dnů) a mohl by generovat extrakty, mající denaturované faktory. Ačkoliv účinná substance izolovaná z telat má molekulovou hmotnost asi 16 000, stejná skupina výzkumníků neudala přesnou molekulovou hmotnost této látky nalezené u žraloků. Tato substance je definována pouze jako mající molekulovou hmotnost vyšší než 3 500. Oikwa a spol. (1990) aplikovali stejnou metodu extrakce jak popsal Lee a Langer, ale při daleko kratším trvání (2 dny místo 41 dnů). Substance izolovaná ze žraločí chrupavky Oikawou a spol. má molekulovou hmotnost v rozmezí od 1000 do 10 000. Schinitsky (US 4 473 551) popsal vodný extrakt surové práškované chrupavky, jehož frakce s mol. hmotností nad 100 000 má protizánětlivou aktivitu samotná nebo v kombinaci s glukosaminem. V tomto patentu není ani zmínka o tom, že by složka tohoto extraktu měla antiangiogenickou nebo protinádorovou aktivitu. Kuetner a spol. (US 4 473 551) izolovali polymorfonukleámí neutrofil (PMN), elastazový inhibitor z hovězí
-1 CZ 290520 B6 chrupavky. Tento inhibitor byl získán z vodného extraktu chrupavky, ze kterého byly zachyceny molekuly o molekulové hmotnosti větší než 50 000. Frakcionací na Sephacrylu S-200 bylo získáno mnoho frakcí, ze kterých byly spojeny ty, které demonstrovaly anti-elastazovou aktivitu. Účinná složka má izoelektrický bod 9,5 a mohla by mít molekulovou hmotnost asi 15 000. Kuetner a spol. (US 4 042 457) také zjistil, že hovězí chrupavka má složku o molekulové hmotnosti menší než 50 000, která má aktivitu inhibice buněčné proliferace bez jakékoliv aktivity, týkající se endotheliálního buněčného růstu. Spilburg a spol. (US 4 243 582) izolovali dva glykoproteiny o molekulové hmotnosti 65 000 a o pí 3,8 z hovězí chrupavky (guanidinextrakce), které vykazují anti-trypsinovou aktivitu a aktivitu inhibice endotheliálního buněčného růstu.
Telecí a žraločí chrupavky mnoho biologických aktivitjako je lysozymová aktivita, aktivita promotování buněčného růstu, inhibiční aktivita vůči typům I a IV kolagenázy a vůči proteázám jako je trypsin, chymotrypsin a plazmin.
Metody pro získání extraktů žraločí chrupavky jsou již známé. Některé z nich produkují práškovanou surovou chrupavku bez jakékoliv extrakce (US 5 075 112), jiné používají denaturační činidla jako je guanidin (US 4 143 582) nebo enzymatickou reakci pro odstranění jakýchkoliv muskulárních, nervových nebo vaskulárních struktur, obklopujících chrupavku, a organických rozpouštědel pro odstranění tuků (US 3 478 146, 4 350 682 a 4 656 137) a pro získání extraktu chrupavky, zatímco jiné jednoduše produkují vodné extrakty; ve vodě (US 4 473 551) nebo solné roztoky (US 4 746 729) chrupavky při odstranění nesolubilizovaného materiálu. Z posledních byly zadrženy specifické frakce o specifické molekulové hmotnosti pro další studie a čištění (viz diskuse výše).
Souhrnně, žraločí chrupavka je známá jako obsahující anti-angiogenickou složku(y) obecně testovanou ve vzorku králičí corneální kapsy nebo vzorku kuřecí chorioallantoické membrány (CAM). Až do současnosti byla celá práškovaná žraločí chrupavka testována přímo na tumorech in vivo, na lidských melanomových xenoimplantátech implantovaných do nahé myši (US 5 075 112), jakož i testována v CAM na svůj antiangiogenický účinek. Není však žádná zmínka o přímém účinku extraktu chrupavky na tumorové buňky.
Angiogeneze není pouze zahrnuta ve vývoji rakoviny. Mnoho chorob nebo stavů různých fyziologických systémů (uvedeno v závorkách) je závislých na angiogenezi a je možno uvést následující příklady: artritida a aterosklerotické plaky (kosti a vazy), diabetická retinopatie, neovaskulární glaukom, trachom a komeální implantová neovaskularizace (oko), psoriáza, skleroderm, hemangiom a hypertrofické zjizvení, vaskulámí adheze a angiofibrom (krevní systém). Proto by jakýkoliv nový antiangiogenický faktor mohl nalézt použití při léčbě těchto chorob, jakož i v terapii rakoviny.
Podstata vynálezu
Vynález se týká způsobu získání kapalného extraktu žraločí chrupavky, spočívající v tom, že zahrnuje následující stupně;
a) žraločí chrupavky se homogenizují v nedenaturujícím vodném roztoku, při kterém se žraločí chrupavka redukuje na částice, jejichž velikost je menší než nebo rovna 500 pm, za vzniku směsi částic a surového kapalného extraktu;
b) oddělí se surový kapalný extrakt z uvedených částic; a
c) dále se dělí surový kapalný extrakt tak, že se získá konečný kapalný extrakt, obsahující chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost menší než nebo rovnou 500 000.
-2CZ 290520 B6
Podle výhodného provedení postupu nedenaturující vodný roztok obsahuje vodu a uvedené stupně se provádějí při 4 °C, přičemž s výhodou stupeň a) se provádí po dobu 30 minut.
Podle jiného výhodného provedení jsou žraloci chrupavka a nedenaturující vodný roztok v poměru 1 kg vlhké hmotnosti chrupavky na 1 až 2 litry roztoku.
Předložený vynález se týká způsobu výroby extraktů, majících antiangiogenické vlastnosti (redukce plochy krevních cév pozorovaných in vivo na experimentálně vyvolaných tumorech), aktivitu,.potlačující tumor in vivo jakož i demonstrující přímý inhibiční vliv na tumorové buněčné linie. Tyto extrakty pocházejí z chrupavky žraloků nazývaných žralok obecný (Common Spiny Dog Fish) a černý žralok (Black Spiny Dog Fish) (Squalus acanthias). Tento způsob nezahrnuje jakékoliv denaturující rozpouštědlo nebo produkt a nezahrnuje použití jakýchkoliv enzymů. Zahrnuje získání směsi celé chrupavky ve vodném roztoku o neutrálním pH, výhodně čisté vodě, pak odstředění směsi a uchování pelety a supematantu pro další zpracování. Peleta se lyofilizuje a testuje na protinádorové a antiangiogenické aktivity in vivo a in vitro, s nebo bez supematantu. Supernatant byl zjištěn jako mající antiangiogenickou a tumor potlačující aktivitu in vivo. Složení supematantu bylo hodnoceno různými způsoby. Frakcionace tohoto supematantu vedla k charakterizaci některých z jeho účinných složek. Frakce byly testovány na jejich přímou in vitro aktivitu na rakovinových buněčných liniích. Proto se předpokládá, že nefrakcionovaný supernatant má takovou in vitro aktivitu. Lyofilizace podstatně ničí aktivitu těchto frakcí a mělo by být zdůrazněno, že je zřetelný rozdíl mezi pevnými a kapalnými extrakty ajejich frakcemi.
Tento vynález se také týká chrupavkového lyofilizátu nebo pevného extraktu, kapalného chrupavkového extraktu ajejich kapalných frakcí jakož i způsobu získání jich všech.
Nakonec se tento vynález týká použití chrupavkových extraktů při léčení na angiogenezi závislých chorob. Předběžné klinické pokusy ukázaly vliv farmaceutických kompozic, obsahujících koncentrovaný nefrakcionovaný kapalný extrakt na zlepšení stavu pacientů postižených na angiogenezi závislými chorobami. Byly z nich úspěšně testovány dermatologické choroby jako je psoriáza a jeden případ rakoviny prostaty. Akné, která je další dermatologickou chorobou není dokumentováno jako na angiogenezi závislá choroba a byla také s překvapením úspěšně léčena. Nadbytečná neovaskularizace je uznávaným rysem hypertrofického zajizvení u popálených pacientů. Kompozice, obsahující extrakt chrupavky podle předloženého vynálezu, jsou v současnosti testovány na zabránění tomuto jevu. Farmaceutické kompozice, obsahující jako účinnou složku kapalný chrupavkový extrakt jsou také objektem tohoto vynálezu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Předložený vynález bude snadněji pochopitelný z následujících specifických provedení, která jsou doplněna následujícími obrázky, jejichž účelem je vynález ilustrovat a ne omezovat jeho rozsah:
Obrázek 1 představuje inhibiční aktivitu stoupajících dávek žraločí chrupavky (pevný extrakt) na ZR75-1 a MCF-1 buňkách.
Obrázek 2 ilustruje křivky dávkové odezvy množství MCF-7 buněk měřeno jejich DNA obsahem za přítomnosti stoupajících koncentrací estradiolu s nebo bez dvou koncentrací chrupavkového lyofilizátu.
Obrázek 3a) a 3b) ukazuje porovnání jatemích sekcí krys, majících vyvinutou rakovinu mléčné žlázy, kterým byla podávána sondou kombinace chrupavkového lyofilizátu a supematantu a těch, kterým byla podávána pouze voda.
-3CZ 290520 B6
Obrázek 4a) a 4b) představují porovnání ledvinových sekcí krys s vyvinutou rakovinou mléčné žlázy, kterým byla podávána sondou kombinace chrupavkového lyofilizátu a supernatantu a těch, kterým byla podávána pouze voda.
Obrázek 5a) a 5b) představují porovnání plicních sekcí krys s vyvinutou rakovinou mléčné žlázy, kterým byla podávána sondou kombinace chrupavkového lyofilizátu a supernatantu a těch, kterým byla podávána pouze voda.
Obrázek 6a) a 6b) představují porovnání sekcí tumorů mléčných žláz krys s takovými vyvinutými tumory, kterým byla podávána sondou kombinace chrupavkového lyofilizátu a supernatantu a těch, kterým byla podávána pouze voda.
Obrázek 7 je histogram získaný z obrázků 6a) a 6b), ilustrující vliv chrupavkového extraktu na plochu krevních cév v tumorech.
Obrázek 8 představuje elektroforetický profil kapalných frakcí oddělených na Rotoforu za nedenaturujících podmínek; markéry molekulové hmotnosti se objevují nalevo, následuje vzorek surového permeátu před frakcionací, pro porovnání s izolovanými frakcemi.
Obrázky 9a) a 9b) ilustrují významné zlepšení stavu dvou pacientů postižených psoriázou, jednoho s hyperkeratózou 9a) a druhého bez hyperkeratózy 9b), při léčbě s topickou kompozicí, obsahující účinné množství koncentrovaného chrupavkového extraktu (spodní fotografie) ve srovnání s jejich počátečním stavem (horní fotografie).
Popis vynálezu
Po ulovení byla chrupavka získána ze zdravých žraloků „Black Spiny Dog Fish“ a „Common Spiny Dog Fish“. Jakékoliv svalové a spojovací tkáně byly odstraněny skalpely a žiletkami ošetřenými ethanolem. Chrupavka byla pak vakuově zabalena do plastových pytlů a zmražena na -20 °C před dalším použitím.
Příprava lyofilizované chrupavky
Chrupavka roztála při 4 °C. Chrupavka pak třikrát prošla otvory ethanolem ošetřeného masového mlýnu spolu se stejným množstvím (hmotnost/objem) vody, která byla čištěna inverzní osmózou a filtrována 0,1 pm filtrem pro získání první směsi. Mnoho vodných roztoků by mohlo být použito místo vody, pokud neutrální pH je zachováno pro vyloučení lýzy nebo denaturace složek chrupavky.
Tato směs byla pak homogenizována mícháním při maximální rychlosti v průmyslovém mísiči při 4 °C po deset minut. Zkapalnění tohoto homogenátu bylo dosaženo jeho podrobením se Polytron dezintegrátoru po 10 minut při 4 °C. V tomto stupni je zbytková velikost částic menší než 500 pm. Tato směs byla odstřeďována při 13 600 x g po 15 minut při 4 °C. Výsledná peleta byla lyofilizována 24 až 48 hodin. První frakce zde dále bude definována jako lyofilizát nebo pevný extrakt.
Supematant byl filtrován na 24 pm Whatman filtru pro odstranění částic náchylných k ovlivnění účinnosti na ultrafiltrační koloně. Filtrovaný materiál se pak ultrafiltruje při 4 °C na filtrační koloně s tangenciálním tokem, mající porozitu 500 000. Supematant byl sterilně filtrován na 0,22 pm filtru a rozdělen do sterilních nádob pro další použití. Tato frakce bude dále označována jako supematant nebo kapalný extrakt.
Alternativně byl vyvinut vysoce účinný postup pro získání lyofilizátu a supernatantu. Stupeň odstřeďování při 13 600 x g po 15 minut následovaný hrubou filtrací na Whatmanových filtrech
-4CZ 290520 B6 byl nahrazen odstřeďováním v CEPA odstředivce opatřené nylonovou kapsou porozity 30 pm při 3000 až 4000 x g. Tímto způsobem mohlo být odstředěno 20 kg/20 1 přípravku během 30 minut a poskytnuto 21 litrů supernatantu. Vodný objem je—větší než výchozí objem vody, což znamená, že byla získána i část vodného obsahu samotné chrupavky. Lyofilizát a supematant měly následující složení:
Lyofilizát:
lipidy proteiny vlhkost sodík draslík vápník hořčík zinek a železo stopy
Supematant:
lipidy proteiny vlhkost sodík draslík vápník hořčík zinek a železo stopy
0,10%' mg/ml2
98,8 %
33,6 mg/100 g3
39.2 mg/100 g 2,0 mg/100 g
1,1 mg/100 g (1,2 Měřeno podle předpisů publikovaných v AOAC Official (1984) sekce 16.219-220 a 2.055.
(3 Měřeno podle SAA postupu.
Obsah proteinu se hodnotí Kjeldahlovou metodou, která skutečně měří organický dusík (N). Organický dusík se převede na ekvivalentní protein za použití následující rovnice:
% N x 6,25 obsah proteinu (mg/ml) - ----------100
Karbohydráty nebyly detekovatelné, je možno předpokládat, že jsou v jednom nebo druhém extraktu, ale za tvorby proteoglykanů a/nebo mukopolysacharidů. Je možné, že tyto sloučeniny jsou zahrnuty v měřené hladině vlhkosti. Lyofilizát obsahuje neočekávanou hladinu vlhkosti, která byla měřena OH- skupinami. Protože 20% obsah vody je blízký procentům karbohydrátů normálně přítomným ve chrupavce, zatímco vlhkost lyofilizátu by mohla být blízká 0 %, zbývá tuto hypotézu ověřit.
Sterilita byla kontrolována za použití USP XXI1 specifikací u:
1) Laboratoire de génie sanitaire du Québec lne. 1090, 1'Escarbot, Centre Industriel St-Malo, Québec g 1 N 4J4, a
2) Northview Laboratories lne.
1880, Holste Road, Northbrook, IL, 60062 U. S. A.
FDA registration no. 14-18028.
-5CZ 290520 B6
Testy účinnosti:
Lyofilizát:
In vitro testy:
Tyto testy byly provedeny na hormonálně-dependentních rakovinových buněčných liniích MCF-7 a ZR75-1 (ATCC (R) čísla 22-HTB a 1500-CRL).
ZR75-1 buňky:
Bazální RPMI médium:
g RPMI 1640 bez fenolové červeni (Sigma R8755), 17,875 g Hepes (volná kyselina; Sigma H0763), 0,55 g pyruvátu sodného (Sigma P5280) a 0 g NaHCO3 byly míšeny v 5 1 čisté vody a upraveny na pH 7,40 pomocí NaOH.
Pokud není použit přímo, musí být roztok chráněn před světlem pro ochranu fotolabilních složek.
Tento roztok se filtruje, rozdělí do 500ml sterilních lahví a uchovává při 4 °C po dobu maximálně tří měsíců.
Buněčné kultivační udržovací médium:
Bazální RPI médium bylo doplněno 10% (obj./obj.) PBS (fetální hovězí sérum - fetal bovine sérum), 100 m.j, penicilinu g/50 pm sulfátu streptomycinu (Sigma P0906)ml média, 2 mM L-glutaminu (Sigma gl517) a 1 nM E2 (beta-estradiol Sigma E8875)
Experimentální médium:
Bazální RPMI médium bylo doplněno 5% FBSA (fetální hovězí sérum adsorbované na dextranu-aktivním uhlí), 2 mM L-glutaminu, 100 m.j. penicilinu g/50 pm sulfátu streptomycinu/m/média a 50 ng/ml inzulínu (Sigma). K. tomuto médiu byly přidávány zvyšující se koncentrace výše popsaného lyofilizátu jakož i různé koncentrace estradiolu (10-12 až-5 M).
MCF-7 buňky:
Bazální DME-F12 médium:
DME-F12 médium (bez hydrogenuhličitanu a bez fenolové červeni; Sigma) bylo rekonstituováno podle pokynů výrobce v čisté vodě. Najeden litr bylo přidáno 1,2 g hydrogenuhličitanu sodného a pH bylo upraveno na 7,40 pomocí NaOH/NaCl. Tento roztok byl filtrován, rozdělen do 500 ml sterilních lahví a uchováván při 4 °C po dobu nejvýše tří měsíců.
Buněčné kultivační udržovací médium:
Bazální DME-F12 médium bylo doplněno 10% (obj./obj.) FBS (fetální hovězí sérum - fetal bovine sérum), 100 m.j. penicilinu g/50 pm sulfátu streptomycinu/ml média, 2 mM L-glutaminu (Sigma) a 1 nM E2 (estradiol).
Pokusné médium:
Bazální DME-F12 médium bylo doplněno 5% FBSA (fetální hovězí sérum adsorbované na dextranu-aktivním uhlí), 2 mM L-glutaminu, 100 J penicilinu g/50 pm sulfátu streptomycinu ml
-6CZ 290520 B6 média a 50 ng/ml inzulínu (Sigma). Jak je popsáno pro ZR75-1,buňky byly lyofilizát a estradiol přidávány ve stejných koncentracích.
Příprava FBSA:
Fetální hovězí sérum bylo smíseno s 1 % (hmotn./obj.) dřevěným uhlím (uhlík odbarvený alkálií). K roztoku dřevěné uhlí-sérum byl přidán roztok dextranu T70 pro dosažení koncentrace 0,1 % (hmotn./obj.). Směs byla míchána přes noc při 4 °C. Po odstřeďování při 4 °C po 30 minut při lOOOOxg bylo sérum dekantováno, opět smíseno se stejnými podíly dřevného uhlí a dextranu, mícháno při teplotě místnosti tři hodiny a znovu odstřeďováno. Sérum pak bylo tepelně inaktivováno při 56 °C po 20 minut, sterilně filtrováno a rozděleno do sterilních kónických Falconových zkumavek.
ZR75-1 a MCF-7 buňky rostly do dosažení hustoty populace 20 000 buněk/jamka na 24-jamkových plácích nebo 150 000 buněk/jamka na 6-jamkových plácích, a byly zpracovány za přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací lyofilizátu jak byl připraven výše. Všechny pokusy byly provedeny trojmo. Kultivační média byla odebrána a nahrazena čerstvým médiem každé dva dny. Buňky rostly v inkubátoru za konstantně zvlhčované atmosféry, obsahující 5% oxidu uhličitého, při 37 °C po 17, 7, 3 nebo 3 dny, což odpovídá prvnímu, druhému, třetímu nebo čtvrtému pokusu. Inhibice buněčného růstu byla měřena přímým spočtením buněk nebo měřením celkového DNA obsahu jamky.
Koncentrace buněčná inhibice (%)
| lyofilizátu | MCF-7 | ZR75- |
| 1. pokus: 17 dní | ||
| 1 mg/ml | 1,5 | 2,00 |
| 5 mg/ml | 14,33 | 33,6 |
| 10 mg/ml | 62,66 | 90,8 |
| 2. pokus: 7 dní | ||
| 1 mg/ml | 3,73 | 0,97 |
| 5 mg/ml | 15,7 | 29,00 |
| 10 mg/ml | 68,37 | 66,00 |
| 3. pokus: 3 dny | ||
| 50 mg/ml | 95,8 | 95,00 |
| 100 mg/ml | 94,6 | 98,00 |
| 4. pokus: 3 dny | ||
| 10 mg/ml | 34,4 | 51,5 |
| 20 mg/ml | 62,5 | 70,5 |
| 50 mg/ml | 95,8 | 95 |
| 100 mg/ml | 94,6 | 98 |
Výše uvedená procenta inhibice buněčného růstu demonstrují, že lyofilizát může inhibovat dávkově závislým způsobem růst buněk těchto dvou buněčných linií.
Obrázek 1 ukazuje, že dávky 50 a lOOmg/ml lyofilizátu jasně provokují hypoplazii na těchto buněčných liniích po třech dnech od ošetření.
Obrázek 2 ukazuje, že za přítomnosti 10-12 až 10-9M estradiolu ošetřené buňky odpovídají podobně jako kontrolní buňky, nejsou-li stimulované těmito hormonovými dávkami. Nicméně nad 1 nM jsou kontrolní buňky silně stimulovány a koncentrace DNA dosahuje 3,75 pm za přítomnosti 10-7 M estradiolu (versus 0,69 pm v kontrole bez estradiolu). V buňkách ošetřených
-7CZ 290520 B6 se 30 a 50 mg/ml lyofilizátu, je DNA naměřená při této maximální stimulaci 1,9 a 1,8 pm. Obrázek 2 ukazuje, že afinitní konstanta (Km) ošetřených buněk pro estradiol je 3 a lókrát vyšší než hodnota Km kontrolních buněk, za přítomnosti 30 a 50 mg/ml. Toto znamená, že vyšší koncentrace estradiolu jsou nezbytné pro dosažení stejného růstu buněk, je-li přítomen chrupavkový lyofilizovaný pevný extrakt. Proto tento extrakt snižuje maximální odezvu (jejich 90% inhibice) a zvyšuje afinitní konstantu ošetřených buněk k estradiolu.
In vivo testy:
Čtyři sta 40 dnů starých samců krys Sprague-Dawley (zakoupeny od Charles River Co., St-Constant, Québec) byly navykány na své prostředí po 12 dnů. V této době bylo sondou podáno 20 mg DMBA/1 ml kukuřičného oleje (9,10-dimethyl-l,2-benzathracenu; dostupný od Sigma Chemical Co.). Tři měsíce po tomto ošetření 240 krys s vyvinutou rakovinou mléčné žlázy bylo vybráno a rozděleno do dvou skupin. První skupina zahrnuje pět podskupin krys. Krysám z ošetřené skupiny byla podávána denní dávka zvyšujících se koncentrací lyofilizátového extraktu ve 3 ml vody po osm týdnů,zatímco kontrolní skupina dostávala stejný objem vody. Druhá skupina byla tvořena čtyřmi podskupinami krys. Krysám z ošetřené skupiny byla také podávána denní dávka lyofilizátu ve 3 ml vody (asi 25 mg proteinu) kombinovaného s nebo bez supematantu po deset týdnů, zatímco kontrolní skupina dostávala stejný objem vody. Pouze jedné podskupině druhé skupiny krys ošetřených koncentrací 3000 mg/kg/den lyofilizátu a 3 ml supematantu byla také podána intraperitoneální (i.p.) injekce menší dávky supematantu (asi 8 mg proteinu v 1 ml vody).
Krysy měly hmotnost 151 až 175 g na začátku dvou pokusů a dostávaly potravu a pitnou vodu ad libitum. První skupina krys měla tumor průměrné velikosti 0,9 cm zatímco druhá skupina krys měla tumor průměrné velikosti 0,6 cm.
Výsledky jsou shrnuty dále:
Denní dávka chrupavkového extraktu podávána sondou
1. pokus: trvání 8 týdnů
500 mg/kg/den
1000 mg/kg/den
3000 mg/kg/den
5000 mg/kg/den
2. pokus: trvání 10 týdnů
3000 mg/kg/den
3000 mg/kg/den + 3 ml supematantu
3000 mg/kg/den + 3 ml supematantu + 1 ml inj. i. p. supematantu % inhibice tumorového růstu ( snížení průměru tumoru vs kontrola)
2%
4%
14%
15%
12%
18%
20%
Výsledky demonstrují, že lyofilizát obsahuje účinnou složku, která je absorbována v gastrointestinálním traktu a která měla vliv na velikost tumoru. Tento účinek by mohl mít přímý vliv na tumorové buňky nebo na anti-angiogenezí zprostředkovaný účinek.
Tyto výsledky také ukazují, že supematant má aktivitu, která se odráží doplňkovou redukcí velikosti tumoru asi 5% i když je velmi zředěný (množství přítomných proteinů ve 3 ml supematantu je asi 25 mg).
-8CZ 290520 B6
Histopatologie
Pro hodnocení netoxičnosti účinných molekul chrupavkového extraktu byla zvířata použitá ve výše uvedených in vivo pokusech usmrcena dekapitací a pro analýzu byly vyjmuty následující tkáně: játra, plíce, ledviny, srdce, mozek, svaly a mléčná žláza. Z těchto tkání byl odstraněn tuk a pak byly dva dny fixovány v Bouinově kapalině. Po dehydrataci v ethanolu byly fixované tkáně umístěny do parafinu. Byly získány jejich řezy a umístěny na sklíčka, vybarveny hematoxylinem a vizualizovány pod mikroskopem.
Histologické hodnocení ukazuje, že nejsou viditelné žádné škodlivé účinky při použití největších dávek lyofilizátu samotného (data neuvedena) nebo za použití lyofilizátu v kombinaci se supernatantem (viz obr. 3a a 3b. 4a a 4b, 5a a 5b).
Toto naznačuje, že lyofilizát a supematant mají selektivní aktivitu, potlačující velikost tumoru.
V rakovinové mléčné žláze (viz obr. 6a a 6b) bylo pozorováno důležité zmenšení plochy krevních cév. Antiangiogenní účinek těchto aktivních molekul je pak potvrzen výsledky, jak jsou ilustrovány a shrnuty v následujícím obrázku a histogramu:
Obrázek 7 ukazuje, že při použití kombinace lyofilizátu (p.o.)- supematantu (p.o. + i.p.) (viz obr. 6a a b), bylo pozorováno 55% snížení plochy krevních cév.
Zmenšení tumorové velikosti by mohlo být způsobeno důležitým zmenšením jeho vaskularizace, přímým vlivem na tumorové buňky nebo kombinací obou fenoménů. Anti-angiogenický účinek těchto extraktů je znázorněn výše. Přímý hypoplaziantní účinek byl pozorován in vitro na buňkách závislých na hormonech a zbývá jej potvrdit in vivo.
Protože výše uvedené výsledky ukazují, že supematant má zvýšený účinek proti a nad účinek lyofilizátu na ZR75-1 buňky, byly jeho složky dále hodnoceny.
Získání kapalných frakcí, obsahujících aktivní molekuly
Zraločí chrupavka byla získána a zpracována stejně jak je popsáno výše s výjimkou stupně koncentrace, který byl vypuštěn. Po odstředění byla peleta odložena a supematant byl zpracováván stejným způsobem jak je popsáno výše až do sterilní filtrace na 0,22 pm filtru.
Supematant zde dále bude označován jako surový permeát, např. produkt po ultrafiltraci.
Takto získaný surový permeát prošel FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography).
FPLC podmínky:
Kolona: Hiload 26 mm x 60 cm Sephacryl S-300,
FPLC systém: od Pharmacia.
Všechny vzorky byly filtrovány na 0,22 pm filtru před nanesením na kolonu. Eluční pufr byl fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS) filtrovaný a odplyňovaný 15 minut. Objem naneseného vzorku byl obvykle 3,2 ml (mohl být až 13 ml). Průtoková rychlost byla 1 ml/min. Byly shromažďovány frakce 10 ml. Eluované sloučeniny byly detekovány svojí UV absorbancí (280 nm). Kalibrační křivka byla získána za použití MW-GF-1000 kalibračního kitu od Sigmy, kalibrační vzorek měl stejný objem jako vzorek pro analýzu (3,2 ml). Eluční objem vzorku byl odvozen z grafu molekulové hmotnosti sloučenin z kalibračního kitu proti jejich elučnímu objemu, od kterého byl odečten prázdný objem kolony. Prázdný objem kolony byl získán vstřiknutím dextranové modři (MW = 2 000 000).
-9CZ 290520 B6
Frakce byly testovány na ZR75-1 buňkách na svoji aktivitu. Zajímavé frakce byly identifikovány a jejich charakteristiky byly potvrzeny další studií (zde dále).
Další charakterizace aktivních složek permeátu byla provedena na Rotofor (Biorad 170-2950; viz izoelektrofokalizace dále) a Amicon filtrech o různých dělicích hodnotách pro získání frakcí o molekulové hmotnosti mezi 10 000 až 30 000, 30 000 až 100 000 a více než 100 000.
Izoelektrofokal izace:
Příprava žraloci chrupavky: 46 ml permeátu 1 kg/1 bylo dialyzováno přes noc proti 4 litrům čisté vody, obsahující 5 % glycerinu při 4 °C za použití membrány Spectra póre č. 7 MWCO 3500 000 (Spectrum 132110). Dialyzovaný roztok byl smísen s 2,75 ml amfolytu (Pharmacie č. 80—1125— 87) pH 3,5 až 10,0 a 0,5 g látky (Sigma C3023; 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamonio]-lpropansulfonát). Objem byl upraven na 55 ml čistou vodou. Roztok byl vložen na Rotofor (Přístroj firmy BioRad Laboratories umožňující separaci pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy). Izoelektrofokalizace byla provedena při 4 °C, při konstantní výkonu 12 wattů (3000 xi napájení Biorad 165-0554), za konstantního vodního oběhu pro zajištění udržení teploty. Na počátku separace bylo napětí 380 voltů a intenzita proudu 31 mA. Po stabilizování intenzity proudu (na 14 mA) bylo napětí 870 voltů. Izoelektrofokalizace byla ukončena a bylo 20 odděleno 20 frakcí.
| Frakce | objem (ml) | pH |
| 1 | 3,7 | 3,56 |
| 2 | 2,1 | 4,01 |
| 3 | 2,2 | 4,18 |
| 4 | 2,3 | 4,31 |
| 5 | 2,2 | 4,63 |
| 6 | 2,1 | 5,03 |
| 7 | 2,5 | 5,30 |
| 8 | 2,1 | 5,50 |
| 9 | 2,4 | 5,81 |
| 10 | 2,5 | 6,26 |
| 11 | 2,3 | 7,00 |
| 12 | 2,4 | 7,29 |
| 13 | 2,4 | 7,64 |
| 14 | 2,5 | 7,94 |
| 15 | 2,3 | 8,32 |
| 16 | 2,5 | 8,62 |
| 17 | 2,4 | 8,94 |
| 18 | 2,9 | 9,30 |
| 19 | 3,1 | 9,88 |
| 20 | 3,6 | 10,71 |
Identifikace těchto proteinů byla provedena vyhodnocením jejich molekulové hmotnosti pomocí gelové elektroforézy (Laemmli, U. K. (1970) Nátuře (Lond.) 227:680).
Tyto frakce se čtyřikrát zředí nanášecím pufrem (viz Laemmli) a 8 mil podíly se podrobí elektroforéze za neredukujících podmínek. Obrázek 8 představuje elektroforetický profil každé frakce a materiálu před izoelektrofokalizací.
Všechny frakce byly naplněny do sterilních lahví pod laminámím tokem kloboučkem jejich průchodem přes sterilní Millipack-60 filtr, mající porozitu 0,22 pm.
| CZ 290520 B6 |
Obsah proteinu ve frakcích byl hodnocen pomocí Lowryho dávkové metody. Roztoky 1 kg/2 1 (vyjádřeno jako surová hmotnost chrupavky na litr permeátu) byly testovány na ZR75-1 buňkách při různých koncentracích v kultivačním mediu. Výsledky jsou shrnuty dále:
1. test:
Permeát byl lyofilizován a prošel FPLC. Nebyla detekována žádná hypoplaziantní aktivita (data neuvedena).
2. test: Testy byly provedeny na Rotofor frakcích: Identifikace proteinu
| Identifikované frakce | izoelektrický průměrná molekulová bod hodnota hmotnost (xl 03) |
| 7-8-9-10 7-8-9 12- 13-14 13- 14 | 5,30 až 6,26 5,78 29 ±1 5,30 až 6,26 5,68 60 ±1 7,29 až 7,94 7,62 48 ± 1 0,64 až 7,94 7,79 35 ± 1 |
3. test proveden na FPLC frakcích:
| Frakce 6a7 | molekulová hmotnost 1 až 2500 |
4. test proveden na 100 pm frakcích získaných na Amicon molekulových filtrech:
| Testovaná | molekulová hmotnost (MW) inhibice ZR75-1 buněčné kultury |
| 100 pg/ml 100 pg/ml 100 pg/ml 400 pg/ml | MW> 100 000 64% 30 000 <MW< 100 000 114% 10 000 < MW < 30 000 127% MW< 10 000 149% |
FPLC frakce 6 a 7 obsahují aktivní komponenty o velmi malé molekulové hmotnosti: 1 až 2500.
Hypoplaziantní účinek frakcí mohl být až 3 300krát vyšší, než byl pozorován u lyofilizátu. Výše uvedené výsledky ukazují, že lyofilizace podstatně ničí a/nebo inhibuje aktivitu proteinů obsažených v eluátu, zatímco se žádné takové odstranění neobjevuje při lyofilizaci pevného extraktu.
Další identifikace aktivních složek eluátu:
Aktivní frakce (testováno na ZR75-1 buňkách) se získají v následujícím rozmezí molekulových hmotností, stanoveno jiným typem čištění vycházejícím ze stejného permeátu (1 kg/1) na 10 mm průměr x 30 cm délka kolony Superose-12 za použití FPLC a rotoforového postupu popsaného výše. Byla zvolena průtoková rychlost 1 ml/min. 45 frakcí o 1 ml bylo odděleno.
| Frakce 20 až 21 | aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 70 000 až 120 000 |
| Frakce 22 | aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 60 000 až 70 000 |
| Frakce 29 až 32 | aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 35 000 až 46 000 |
| Frakce 34 až 35 | aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 29 000 |
- 11 CZ 290520 B6
Frakce 38 až 39 aktivita ve frakcích odpovídajících molekulové hmotnosti 1000 až 2500
Specifita
Za účelem hodnocení specifity aktivity na tumorových buňkách byl permeát získaný po ultrafiltraci testován na buňkách pocházejících z mesenchyma, lidských TENON fibroblastech (HTFs). které jsou normální fibroblasty.
B. In vitro
a. Pacienti
Byly použity HTFs ze dvou pacientů (jeden s neovaskulámím glaukomem, NVG, a druhý s primárním glaukomem s otevřeným úhlem, POAG).
b. Subkultivace a udržení HTFs
Každá konfluentní kultura prošla praním a rozložením s 0,5 ml 0,05% trypsinu/0,5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) po 5 až 10 minut při 37 °C. Pro neutralizaci trypsin/EDTA bylo pak přidáno 1,5 ml DME/F-12 media, obsahujícího 15% FBS.
Asociace buněk byla provedena triturací a přenesením do 25 cm2 T-lahví, do kterých bylo přidáno další médium, obsahující 10% FBS. Po dosažení konfluence byly HTFs převedeny do 75 cnť a eventuálně do 180 cm3 T-lahví. Když bylo získáno dost buněk, byly některé buňky použity pro dále popsané pokusy a jiné byly současně zmraženy pro uchování identických pasáží pro další experimenty.
c. Experimentální protokoly
Po dosažení konfluence byly buňky z jednoho pacienta rostoucí ve dvou nebo třech identických 180 cnť T-lahvích disociovány výše popsaným postupem. Po krátkém odstřeďování při nízké rychlosti byly spočteny pomocí ZMI Coulter Counteru 216013, opatřeném 256-Channelyzerem.
Pro všechny in vitro experimenty, které následují, bylo přibližně padesát tisíc buněk inokulováno v 1 ml DME/F-12 média, obsahujícího 1 % FBS do každé 16 mm misky a 12-jamkové plotny. Sedmnáct hodin (h) po vysetí byl přidán 1 ml čerstvého identického média doplněného 1 % FBS (absolutní“ kontroly). V závislosti na provedení experimentu (viz výše a níže) bylo nebo nebylo 1 % FBS médium doplněno gF (růstové faktory) nebo permeátem 1 kg/21 (hmotnost chrupavky/objem vody) roztoku a sterilně filtrováno. Tento den (den 0) byly také některé vzorky buněk spočteny pro stanovení účinnosti pokrytí (která by měla být rovna nebo větší než 95 %).
Čtyřicet hodin po začátku pokusů byly buňky promyty a disociovány výše uvedeným postupem a opět spočteny. Počet buněk byl vyjádřen jako procenta k hodnotě získané v „absolutní“ kontrole.
Každá „absolutní“ nebo pozitivní kontrola, obsahující 1% nebo 5% FBS a každá experimentální skupina, doplněná 1% FBS a s jednotlivým gF nebo chrupavkovým permeátem se provádí trojmo.
Každý pokus byl proveden na buňkách jednoho nebo dvou pacientů současně a byl opakován alespoň dvakrát.
Stimulace fibroblastové proliferace růstovými faktory (Gfs) nebo chrupavkovým permeátem byla porovnána s jeho stimulací 5% FBS.
-12CZ 290520 B6
V těchto experimentech byly gfs, prasečí PDFG (pPDFG) a lidský rekombinantní bFGF, Hr bFGF (dar od Dr. P. Prazeaua od Farmitalia Carlo Erba, Milán. Itálie) přidány v koncentracích 10 až 100 ng/ml v 1 % FBS. Čtyřicet hodin po započetí experimentu byly buňky dispergovány trypsinem-EDTA a spočteny na Coulter čítači. Hodnoty ze tří pokusů (sloupec 1, 2 a 3) se jeví pod jednou dvacetinou počtů na jamku.
Pacient B: Glaukom pohlaví: muž věk: 53 HTF
| Den 1 : | počet buněk na jamku: 46 170 DME/F12 - 1 % FBS - 1 % pen Střep |
| Den 0: | počet buněk na jamku: 65 214 DME/F12 - 1 % FBS - 1 % pen Střep |
| Den 1 : | počet buněk na jamku: 62 548 DME/F12 - 1 % FBS - 1 % pen Střep |
Den 2:
počet buněk na jamku: 46 170
Vzorek/plotna prům.
SEM % kontrolního růstu plotna č. 1
DME/F12
| 1 | den 0 | 3,019 | 2,862 | 2,853 | 65,214 | 71 | ||
| FBS | 2 | 1 % FBS den + 1 | 2,711 | 2,973 | 2,693 | 62,548 | 1,655 | |
| 3 | den + 2 1 % FBS | 2,284 | 2,400 | 2,191 | 51,333 | 1,655 | 100 | |
| 4 | den +2 | 3,084 | 2,834 | 3,115 | 67,446 | 1,627 | ||
| 5% FBS | ||||||||
| plotna č. 2 | DME/F12 | |||||||
| PDGF5 | kontrola (1 % FBS) | 2,558 | 2,181 | 2,216 | 51,931 | 2,199 | 100 | |
| 6 | 1 ng/ml 1 % FBS | 2,425 | 2,580 | 56,056 | 1,228 | 108 | ||
| 7 | 10 ng/ml | 4,080 | 3,975 | 4,282 | 92,116 | 1,648 | -ffi | |
| 1 % FBS | +++ | |||||||
| 8 | 100 ng/ml | 4,625 | 4,356 | 4,450 | 100,285 | 1,442 | -in | |
| 1 % FBS | +++ | |||||||
| plotna č. 3 | DME/F12 | |||||||
| b-FGF 9 | kontrola (1 % FBS) | 2,915 | 2,533 | 2,502 | 59,360 | 2,429 | 100 | |
| 10 | 1 ng/ml | 2,744 | 2,554 | 2,761 | 60,174 | 1,213 | 101 | |
| % FBS | 11 | 10 ng/ml | 3,606 | 3,143 | 3,193 | 74,234 | 2,683 | 125 |
| 1 % FBS | ||||||||
| 12 | 100 ng/ml 1 % FBS | 4,064 | 3,033 | 3,026 | 75,585 | 6,307 | 127 |
- 13 CZ 290520 B6 pokračování plotna č. 4 DME/F12
| chrupavka 13 | kontrola | 2,826 | 2,566 | 2,486 | 58,822 | 1,877 | 100 |
| (1 kg/21) (filtrovaný) | (1 % FBS) | ||||||
| 14 | Ιμΐ/ml 1 % FBS | 2,729 | 2,576 | 2,575 | 58,837 | 936 | 100 |
| 15 | ΙΟμΙ/ml 1 % FBS | 2,643 | 2,493 | 2.584 | 57,643 | 798 | 98 |
| 16 | 100 μΙ/ml | 2,918 | 2,883 | 2,766 | 58,483 | 2,461 | 99 |
% FBS ++ ++ P < 0,02 +++ P < 0,01 určeno Student-Fisherovým testem
Zatímco růstové faktory jako PDGF (z destiček získaný růstový faktor) a bFGF (bazický fibroblastový růstový faktor) ukazují stimulační aktivitu na HTFs, nebyl žádný účinek - ať pozitivní nebo negativní - pozorován, jestliže tyto buňky rostly za přítomnosti chrupavkového permeátu (1 kg/2 1). Nebyl pozorován žádný hypoplaziantní účinek. Toto naznačuje, že permeát má hypoplaziantní účinek, který je specifický k tumorovým buňkám s nedetekovatelným účinkem na normální buňky. Stejný chrupavkový extrakt neměl vliv na jiný typ fibroblastových buněk, HSF (lidské kožní fibroblasty; data neuvedena). I když nebyl testován, předpokládá se, že lyofilizát také nevykazuje žádný vliv na normální buňky.
Klinické pokusy:
Před předběžnými klinickými pokusy byl surový permeát získaný po ultrafiltraci 2 a 20násobně zahuštěn, za získání aktivního permeátu. Tyto hladiny koncentrace byly získány na filtrační koloně s tangenciálním tokem, mající porozitu 1000, která redukuje objem eluátu 2 a 20krát. Koncentrovaný permeát byl filtrován přes miliporový filtr o porozitě 0,22 pm. Jestliže chrupavka byla zpracována alternativní odstřeďovací metodou (použití CEPA odstředivky s membránou o porozitě 30 pm), bylo dosaženo desetinásobného zahuštění získaného koncentrovaného extraktu, majícího téměř 20násobně zahuštěný extrakt, např. 12 mg/ml (zlepšená metoda) místo 14mg/ml (provedení v laboratorním měřítku). Sterilní lOx zahuštěný permeát byl rozdělen na 7ml podíly (asi 85 mg proteinů) ve sterilních lahvích, zmražen na -80 °C přes noc a dále uchováván při -20 °C do použití. Hlavní rozdíl mezi surovým a koncentrovaným permeátem je v jejich koncentraci proteinů. Je třeba poznamenat, že metoda použitá pro stanovení obsahu proteinu měří obsah dusíku a nejen proteinů (Kjeldahlova metoda). Toto může vysvětlit, proč koncentrace proteinů se nezvyšuje úměrně hladině objemové koncentrace, jako je tomu obvykle v případě, kdy je obsah proteinu stanoven Lowryho metodou. Stupeň koncentrace je tak považován za umožňující permeaci vody jakož i sloučen dusíku s nízkou molekulovou hmotností.
Koncentrovaný permeát byl použit pro léčení na angiogenezi závislých chorob. Dva různé typy, představující choroby závislé na angiogenezi, byly testovány v praxi na lidech; první typ byla dermatologická porucha (psoriáza) a druhý typ byla rakovina (rakovina prostaty).
Z mnoha dermatologických chorob byly vybrány případy psoriázy. U testovaných psoriáz je důležité, že nebyl činěn žádný rozdíl mezi případy psoriázy komplikovanými hyperkeratózou a nekomplikovanými. Keratózová složka těchto chorob není podstatně ovlivněna per se koncentrovanou žraločí chrupavkou, zatímco naopak je angiogenická složka cílem volby pro tuto směs účinných složek. Dále uvedené příklady ilustrují a potvrzují toto zjištění.
- 14CZ 290520 B6
Pacient postižený rakovinou prostaty byl dobrovolník, na kterém byl zkoušen lOnásobně zahuštěný chrupavkový permeát. Tento pacient prošel sériemi postupných konvenčních terapií, které byly dočasně úspěšné. V poslední době začal požívat chrupavkový extrakt poté, co rakovina recidivovala.
Výsledky uvedené dále jsou velmi povzbuzující a poskytují předpoklad pro použitelnost surového permeátu a jeho frakcí při léčení všech chorob závislých na angiogenezi a nejen těch, které byly specificky testovány. Pokud má choroba angiogenickou složku, usuzuje se, že chrupavkový extrakt podle předloženého vynálezu bude účinný za té podmínky, že je obsažen v kompozici, obsahující jeho účinné množství a že tato kompozice je ve vhodné formě pro správné podání. Proto je třeba chápat, že předložený vynález není omezen na následující specifické kompozice, protože odborník v oboru by měl být schopen odvodit mnoho kompozic, jejichž volba závisí na způsobu podání a cílené chorobné tkáni. Kompozice mohou být podány různými způsoby, např. topicky, orálně, sublinguálně, rektálně, intravenózně, intramuskulámě, difúzí atd.
Psoriáza:
Byla vyrobena následující dermatologická kompozice a zkoušena na ověření její účinnosti u pacientů postižených psoriázou:
-Emulgade™ CLB 29 % (hmotn./hmotn.),
-20x surový permeát 69,5 % (hmotn./hmotn.),
-Germaben™ II 1 % (hmotn./hmotn.) a
-Lavandula angustifolia 0,5 % (hmotn./hmotn.).
Emulgade™ CLB, směs stearátových esterů, mastných alkoholů a neiontových emulgátorů (dostupná od Henkel Canada Ltd.) byla zahřívána na 65 až 79 °C za míchání. Zahřívání bylo ukončeno a směs byla dále míchána. Když směs dosáhla teploty 45 °C byl přidán olej Lavandula augustifolia a chránící činidla germaben™ II (diazonidylmočovina 30 %, methylparaben 11 %, propylparaben 3 % a propylenglykol 56 %; dostupný od Sutton Laboratories, NJ, USA). Jakmile teplota směsi dosáhla 30 °C, byl přidán chrupavkový extrakt. Takto získaná kompozice byl hladký nemastný krém; měněním množství procent Emulgade™ mohou být získány jiné formy dermatologických kompozic různé viskozity, podle příkazů výrobce (mléko, lotion, mast). Jiná vehikula nebo přísady je možno použít pro získání past, gelů a mnoha jiných forem transdermálního přípravku.
Výše uvedené formulace se podávají dvakrát denně během periody dvanácti týdnů panelu deseti pacientů (topická aplikace) postiženým psoriázou, kteří odpovídali na zkoušené běžné terapie, ale po určité době na ně nereagovali. Pro tuto studii byli pacienti rozděleni podle podobného a symetrického rozsahu psoriázy na obou stranách jedince. Tyto pokusy byly provedeny dvojitěslepým způsobem, kdy ani dermatolog ani pacienti nevěděli, která postižená strana byla ošetřena kompozicí, obsahující chrupavkový extrakt a která byla ošetřena kontrolní kompozicí. Významné zlepšení je pozorovatelné u pěti pacientů, jejich psoriáza nebyla komplikována hyperkeratózou; fotografie částí těla dvou pacientů jsou uvedeny na obr. 9a) a 9b). Na obr. 9a) je demonstrováno, že pacient postižený psoriázou s hyperkeratózou přesto vykázal velmi významnou redukci erythemu, spojenou s nulovým svěděním, po pouze jednom měsíci léčení. Hyperkeratóza zůstala nicméně důležitá. Fotografie druhého pacienta postiženého psoriázou nekomplikovanou hyperkeratózou (obr. 9b)) ukazují mnohem lepší zlepšení po třech měsících léčení. Protože psoriáza se jeví být multifaktoriální chorobou, předpokládá se, že odpověď pacientů závisí na důležitosti zahrnutí angiogenického faktoru do ustavení a při pokračování tohoto stavu. Je
-15 CZ 290520 B6 pravděpodobné, že lepší výsledky by mohly být dosaženy, je-li tento typ přípravku doplněn jinými terapeutickými činidly směrovanými k dalším zahrnutým faktorům (keratolytická činidla, protizánětlivá činidla, antihistaminika, imunosupresory atd.).
Toto doplnění může být provedeno změněním složení pro zahrnutí účinného množství například keratolytického činidla. Mělo by jej být také dosaženo odděleným podáním takového doplňujícího terapeutického činidla, současně nebo střídavě s podáním předložené topické formulace. Navíc doplňkovou medikaci není nutno podávat stejným způsobem.
Výše uvedená formulace nevykázala žádný systémový účinek (účinek je omezen na ošetřenou část) a žádný sekundární účinek přes vysoké podíly chrupavkového extraktu.
Akné:
když akné není podle znalostí vynálezců klasifikována jako choroba nebo porucha, mající angiogenickou složku, byli takto postižení pacienti přesto podrobeni testu s chrupavkovým extraktem. Pro pokusy na takto postižených pacientech byl připraven gel následujícího složení:
Carbopol™ 1,2 %, čištěná voda 77,2 %, NaOH 0,3 %, Phenoxetol™ 0,3 %, Tween 80™ 0,3 %, x chrupavkový extrakt 20,0 %, x extrakt Aloe 0,5 %.
Vysvětlivky: Carbopol™ je obchodní název pro karboxyvinyl polymery; Phenoxetol™ je obchodní název pro l-fenoxypropan-2-ol a Tween 80™ je obchodní název pro polyoxyetylen sorbitan monoleát.
x chrupavkový extrakt obsahuje 9 až 12 mg/ml proteinů. Tato formulace představuje významné zlepšení vzhledem ke kůži pacientů postižených více nebo méně těžkými formami akné (zánětlivá akné a kystická akné; data neuvedena).
Tyto překvapující výsledky mohou být způsobeny antiangiogenickým účinkem (toto odhaluje angiogenickou složku v akné), nebo mohou být způsobeny aktivními složkami, které mají jiný než antiangiogenický účinek. Je zde připomenuto, že stejný extrakt má alespoň jeden jiný účinek než antiangiogenický: přímý hypoplaziantní účinek byl demonstrován v rakovinových buněčných liniích.
Rakovina:
Jeden pacient postižený rakovinou prostaty byl podroben pokusu s lOnásobně koncentrovaným permeátem. Adenokarcinom byl diagnostikován v roce 1986. V této době byla provedena radioterapie. V roce 1991 byla PSA (prostatický sérový antigen) hladina 138 gg/l, zatímco normální přijatelná vyšší hranice je 4 pg/l. Pacient pak prošel úplně odlišnou terapií při kastraci spojené s anti-androgenní terapií (Euflex™). Toto ošetření bylo účinné během tří let, pak začala hladina PSA opět stoupat. Od června 1994 tento pacient požívá 10X permeát (denní sublinguální dávka asi 75 mg proteinu/7 ml destilované vody, ekvivalentní asi 1 až 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti/den). I kdyby bylo významné množství této dávky žvýkáno, je pravděpodobně absorbováno v gastrointestinálním traktu, jestliže výsledky získané v DMBA-ošetřených zvířatech (viz výše) jsou spolehlivé. PSA hladiny klesají od 12 do 0,9 pg/ml (poslední výsledky získané v prosinci 1994). Tento dávkový režim může být také modifikován v souladu se způsobem podání, biovyužitelností účinných složek a požadovanou agresivností, se kterou má patologie být kontrolována. V této době byla netoxičnost ověřena u krys (viz výše uvedené pokusy) a u lidí (data neuvedena).
-16CZ 290520 B6
V jiném in vivo experimentu provedeném na DMBA-ošetřených krysách bylo dávkové rozmezí kapalného extraktu asi 190 až 220 mg proteinů/kg tělesné hmotnosti, které pravděpodobně má velký podíl na redukci plochy rakovinových krevních cév (55% při kombinaci s mnohem větší dávkou lyofilizátu). Je tak uznáváno, že dávka asi 1 až asi 200 mg/kg tělesné hmotnosti je vhodným rozmezím průměrných dávek (ED50) pro léčení rakoviny redukcí nebo odstraněním angiogeneze.
Tyto výsledky ukazují velký potenciál chrupavkového kapalného extraktu při léčení chorob závislých na angiogenezi. Množství chrupavkového extraktu jakož i jeho formulace se mohou měnit pro splnění specifických potřeb. Předpokládá se, že frakce surového permeátu, které obsahují účinnou složku, budou také účinné. Tyto frakce čekají na další charakterizaci.
Je třeba poznamenat, na proteinové bázi, že topické formulace pro kůži mohou obsahovat široké rozmezí dávek chrupavkového extraktu. Ve dvou specifických kategoriích testovaných případů, například, poměr finální koncentrace ve formulacích pro léčení psoriázy versus akné je 4 až 5, zatímco poměr ředění permeátu je 35. Pro všechny předpokládané aplikace v chorobách závislých na angiogenezi (od oftalmických kapek po formulace dermatologické a léčiva rakoviny), se předpokládá, že minimální finální koncentrace surového permeátu by měla být velmi nízká (menší než 0,1 mg/ml). Toto nižší rozmezí dávek závisí na dostupnosti a permeaci účinných složek na místo působení jakož i účinném zachycení těchto složek a citlivosti nebo odezvě tkáně k angiogenickým inhibitorům. Vyšší hranice koncentrace finálního proteinu ve formulacích pro některé aplikace není v současnosti známá. Nejvyšší zkoušené finální koncentrace byly asi 9 mg/ml proteinů ve formulaci pro případy psoriázy a asi 12 mg/ml v dávkové jednotce 7 ml podávané v případě rakoviny prostaty. Protože surový permeát nemohl být lyofilizován bez ztráty své aktivity, uvažuje se, že nejvyšší dávka závisí na hranici koncentrace, kdy je možno zpracovat surový permeát, např. možnost ještě získat koncentrovaný sirup.
Požadovaný materiál:
- Mraznice.
- Chirurgické nástroje.
- Mlýn na maso.
- Plastové vaky.
- Průmyslový mísič (Waring 3rychlostní mísič dostupný od Fisher Scientific).
- Systém čištění vody (inverzní osmóza a 0,1 pm filtrace; Continental Water Systém, model PRE 2202, výr. číslo 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing Systém dostupný od Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Tento systém poskytuje apyrogenní vodu vysoké kvality.
- Přesné váhy Mettler, série AE od Fisher Scientific. Odstředivka Sorvall RC-285 od Du Pont Canada..
- Odstředivka CEPA.
- Nylonová kapsa porozity 30 pm.
- Autokláv (automatický parní sterilizátor Sanyo, model MAC 350P).
- Nalgene 500 ml kontejnery sterilizované při 132 °C po 10 minut a suší se 35 minut.
- Kónické filtry o porozitě 24 pm Whatman Reeve Angel.
- Ultrafiltrační kolona (dělení molekulové hmotnosti: 500 000 a 1000 je-li to vhodné; povrch 25 čtverečních stop; tok: 1301/minuta; tlak na vstupu: 206,84 kPa; tlak na výstupu: 34,47 kPa, od Koch Membrane Systems lne., Wilmington, MA, USA).
- Sanitární odstředivé čerpadlo (Monarch Industrie, model ACE-5100, typ A) pro poskytnutí toku 130 1/minuta.
- Sterilní komora (komora s laminámím tokem NuAire od Ingram & Bell),
- Millipack-60 0,22 pm sterilní filtry.
- Sterilní čiré nebo hnědé lahve.
- Zahušťovač DC-10 Amicon.
- 17CZ 290520 B6
Rotofor Biorad 170-2950.
- Amicon filtry' SIOY10, SIOY30 a SIOY100 s hodnotami dělení 10 000, 30 000 a 100 000. FPLC Pharmacia 216007 (počítač Pharmacia 216014).
- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia).
- Superose S—12 10 mm/30 cm (Pharmacia).
- Lyofilizér Labconco 10273 A.
Předložený vynález tak, jak zde výše byl popsán, mohou odborníci v oboru podle svých znalostí a schopností modifikovat nahrazením některých prvků tohoto vynálezu jejich ekvivalenty užívanými v praxi, kterými lze dosáhnout stejného cíle, aniž by byl narušen rozsah tohoto popisu. Tyto zřejmé variace jsou považovány za touto přihláškou pokryté.
Claims (29)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob získání kapalného extraktu žraločí chrupavky, v y z n a č uj í c í se tím, žea) žraločí chrupavky se homogenizují v nedenaturujícím vodném roztoku, při kterém se žraločí chrupavka redukuje na částice, jejichž velikost je menší než nebo rovna 500 pm, za vzniku směsi částic a surového kapalného extraktu;b) oddělí se surový kapalný extrakt z uvedených částic; ac) dále se dělí surový kapalný extrakt tak, že se získá konečný kapalný extrakt, obsahující chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost menší než nebo rovnou 500 000.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nedenaturující vodný roztok obsahuje vodu a uvedené stupně se provádějí při 4 °C.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že stupeň a) se provádí po dobu 30 minut.
- 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že žraločí chrupavka a nedenaturující vodný roztok jsou v poměru 1 kg vlhké hmotnosti chrupavky na 1 až 2 litry roztoku.
- 5. Způsob podle nároku l, vyznačující se tím, že se stupeň b) dělení provádí odstředěním.
- 6. Způsob podle nároku 1, vy zn ač u j í cí se t í m , že dále obsahuje stupeň d) spočívající vtom, že se zahustí konečný kapalný extrakt a získá se zahuštěný kapalný extrakt obsahující chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost mezi 1000 až 500 000.
- 7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále obsahuje stupeň d) spočívající ve frakcionaci finálního kapalného extraktu, za získání kapalné frakce uvedeného kapalného extraktu.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost mezi 1000 až 2500.-18CZ 290520 B6
- 9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a elektroforézou a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost 29 000 a izoelektrický bod5 5.3 až 6.26.
- 10. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a elektroforézou a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost 35 000 a izoelektrický bod io 7.64 až 7,94.
- 11. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a elektroforézou a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost 48 000 a izoelektrický bod15 7.29 až 7,94.
- 12. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a elektroforézou a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající molekulovou hmotnost 60 000 a izoelektrický bod20 5,30 až 6,26.
- 13. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající25 molekulovou hmotnost mezi 70 000 až 120 000.
- 14. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající30 molekulovou hmotnost mezi 60 000 až 70 000.
- 15. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající35 molekulovou hmotnost mezi 35 000 až 46 000.
- 16. Způsob podle nároku 7, vy zn ač u j í cí se t í m , že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající40 molekulovou hmotnost 29 000.
- 17. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že frakcionační stupeň se provádí separací pomocí preparativní izoelektrické elektroforézy a rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií a kde výsledná kapalná frakce obsahuje chrupavkové molekuly, mající45 molekulovou hmotnost mezi 1000 až 2500.
- 18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 6 a 7, vyznačující se tím, že stupně způsobu se provádějí při 4 °C.50
- 19. Kapalný extrakt žraločí chrupavky získaný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18.
- 20. Kompozice pro léčení dermatologických angiogenních poruch nebo chorob, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství chrupavkového extraktu podle nároku 19 ve spojení s farmaceuticky přijatelným vehikulem.-19CZ 290520 B6
- 21. Kompozice podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se t í m , že chrupavkový extrakt je přidán do dosažení konečné koncentrace chrupavkového proteinu 2 až 10 mg/ml kompozice.
- 22. Topická kompozice pro léčení psoriázy, vyznačující se tím, že obsahuje 10 mg chrupavkového extraktu podle nároku 19 na 1 ml kompozice, jako terapeuticky účinné složky ve spojení s farmaceuticky vhodným vehikulem.
- 23. Topická kompozice pro léčení akné, vyznačující se tím, že obsahuje 2 mg chrupavkového extraktu podle nároku 19 na 1 ml kompozice, jako terapeuticky účinné složky ve spojení s farmaceuticky vhodným vehikulem.
- 24. Kompozice pro léčení rakoviny, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství chrupavkového extraktu získaného způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 ve spojení s farmaceuticky vhodným vehikulem.
- 25. Kompozice podle nároku 24, vy zn a č u j í c í se t í m , že chrupavkový extrakt má konečnou koncentraci 75 mg proteinu na 7 ml vody.
- 26. Kompozice podle nároku 25, vyznačující se tím, že kompozice je ve formě vhodné pro sublinguální podávání.
- 27. Kompozice pro léčení chorob nebo stavů, zahrnujících jednu nebo více složek vybraných ze skupiny, zahrnující tumorovou proliferaci a angiogenezi, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství chrupavkového extraktu podle nároku 19 a farmaceuticky přijatelné vehikulum.
- 28. Použití extraktu žraločí chrupavky definovaného v nároku 19 pro přípravu léčiva na léčení angiogenních chorob nebo rakoviny.
- 29. Použití extraktu žraločí chrupavky získaného způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 pro přípravu léčiva na inhibici proliferace rakovinných buněk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23401994A | 1994-04-28 | 1994-04-28 | |
| US08/384,555 US5618925A (en) | 1994-04-28 | 1995-02-03 | Extracts of shark cartilage having an anti-angiogenic activity and an effect on tumor regression; process of making thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ314196A3 CZ314196A3 (en) | 1997-04-16 |
| CZ290520B6 true CZ290520B6 (cs) | 2002-08-14 |
Family
ID=26927471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19963141A CZ290520B6 (cs) | 1994-04-28 | 1995-04-21 | Způsob získání kapalného extraktu ľraločí chrupavky, chrupavkový extrakt získaný tímto způsobem a kompozice obsahující tento chrupavkový extrakt a jejich pouľití |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5618925A (cs) |
| EP (1) | EP0759765B1 (cs) |
| JP (1) | JPH09512563A (cs) |
| KR (1) | KR100378787B1 (cs) |
| CN (2) | CN1147305C (cs) |
| AT (1) | ATE224198T1 (cs) |
| BG (1) | BG62954B1 (cs) |
| BR (1) | BR9507552A (cs) |
| CA (1) | CA2188793C (cs) |
| CZ (1) | CZ290520B6 (cs) |
| DE (1) | DE69528258T2 (cs) |
| DK (1) | DK0759765T3 (cs) |
| ES (1) | ES2182900T3 (cs) |
| FI (1) | FI117375B (cs) |
| HU (1) | HU220784B1 (cs) |
| IS (1) | IS1975B (cs) |
| NO (1) | NO317674B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ284407A (cs) |
| PL (1) | PL181981B1 (cs) |
| PT (1) | PT759765E (cs) |
| RO (1) | RO114868B1 (cs) |
| RU (1) | RU2156132C2 (cs) |
| SI (1) | SI0759765T1 (cs) |
| WO (1) | WO1995032722A1 (cs) |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5618925A (en) * | 1994-04-28 | 1997-04-08 | Les Laboratories Aeterna Inc. | Extracts of shark cartilage having an anti-angiogenic activity and an effect on tumor regression; process of making thereof |
| US6380366B1 (en) * | 1994-04-28 | 2002-04-30 | Les Laboratoires Aeterna Inc. | Shark cartilage extract:process of making, methods of using and compositions thereof |
| US6028118A (en) * | 1996-08-08 | 2000-02-22 | Les Laboratoires Aeterna Inc. | Methods of using extracts of shark cartilage |
| US6025334A (en) * | 1994-04-28 | 2000-02-15 | Les Laboratoires Aeterna Inc. | Extracts of shark cartilage having anti-collagenolytic, anti-inflammatory, anti-angiogenic and anti-tumoral activities; process of making, methods of using and compositions thereof |
| PL188137B1 (pl) * | 1995-02-03 | 2004-12-31 | Aeterna Lab Inc | Zastosowanie wyciągu z chrząstki rekina |
| US5843920A (en) * | 1996-09-16 | 1998-12-01 | Biocell Technology, Llc | Anionic saccharides for extraction of anti-angiogenic protein from cartilage |
| US6379709B1 (en) * | 1997-02-20 | 2002-04-30 | Industrial Research Limited | Angiogenesis inhibitors and activators from shark cartilage |
| NZ337376A (en) * | 1997-03-11 | 2002-02-01 | Aeterna Lab Inc | Compositions for treating tumors containing shark cartilage extracts and anti-neoplastic agents |
| WO1999002548A1 (en) * | 1997-07-11 | 1999-01-21 | Cv Technologies Inc. | A preparation derived from shark cartilage for treatment of diseases related to excessive phf or excessive intracellular calcium |
| US5840342A (en) * | 1997-09-17 | 1998-11-24 | Raithaus; Lawrence R. | Shark liver extract for stimulating the immune system |
| FR2778558B1 (fr) | 1998-05-12 | 2001-02-16 | Oreal | Utilisation d'inhibiteur de metalloproteinases pour induire et/ou stimuler la croissance des cheveux ou des poils et/ou freiner leur chute |
| ATE276763T1 (de) | 1998-07-13 | 2004-10-15 | Univ Texas | Verwendung von antikörper gegen aminophospholipide zur krebsbehandlung |
| US20020009501A1 (en) * | 1998-07-23 | 2002-01-24 | Eric Dupont | Preparation of cartilage extracts using organic solvents |
| US6168807B1 (en) | 1998-07-23 | 2001-01-02 | Les Laboratoires Aeterna Inc. | Low molecular weight components of shark cartilage, processes for their preparation and therapeutic uses thereof |
| SI1107795T1 (en) | 1998-09-04 | 2003-06-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Thiomolybdate associated with at least one carbohydrate, and its use for preventing or treating diseases characterized by aberrant vascularization, such as cancer, wet type macular degeneration, rheumatoid arthritis |
| CN1064690C (zh) * | 1998-09-10 | 2001-04-18 | 中国人民解放军海军医学研究所 | 鲨鱼软骨血管生成抑制因子及其分离纯化方法 |
| US7361643B2 (en) | 2000-02-09 | 2008-04-22 | University Of Puerto Rico | Methods for inhibiting angiogenesis |
| AU1649802A (en) * | 2000-12-20 | 2002-07-01 | Ind Res Ltd | Shark meat extract |
| AUPR222300A0 (en) * | 2000-12-21 | 2001-01-25 | Life Therapeutics Limited | Electrophoresis device and method |
| US20030095981A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-05-22 | Kin-Ping Wong | Compositions containing an active fraction isolated from ganoderma lucidum and methods of use |
| US20030087830A1 (en) * | 2001-06-12 | 2003-05-08 | Eric Dupont | Low molecular weight components of cartilage, complexes of metals with amino acids, DI-peptides and analogs thereof; processes for preparation and therapeutic uses thereof |
| US6908627B2 (en) * | 2001-06-21 | 2005-06-21 | Mote Marine Laboratory | Conditioned media for inhibiting growth of tumor cells |
| US7309501B2 (en) * | 2001-06-21 | 2007-12-18 | Mote Marine Laboratory | Conditioned media to inhibit growth of tumor cells |
| US7504115B2 (en) | 2002-02-15 | 2009-03-17 | Ocean Nutrition Canada Limited | Shark cartilage extracts and use thereof for immunomodulation |
| RU2270023C2 (ru) * | 2002-02-20 | 2006-02-20 | Какухиро Ко., Лтд. | Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты) |
| EP2357009A1 (en) | 2002-07-15 | 2011-08-17 | Board of Regents, The University of Texas System | Duramycin peptide binding to anionic phospholipids and aminophospholipids conjugates and their use in treating viral infections |
| CN1761686B (zh) * | 2003-03-20 | 2010-04-28 | 细川密克朗集团 | 从软骨鱼类分离的蛋白多糖及其制造方法 |
| US7067123B2 (en) | 2003-04-29 | 2006-06-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Glue for cartilage repair |
| US7901457B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-03-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage allograft plug |
| ES2223291B1 (es) * | 2003-08-06 | 2006-03-16 | Bioiberica, S.A. | Nuevo uso terapeutico de condroitin sulfato. |
| US7824711B2 (en) | 2003-12-11 | 2010-11-02 | Isto Technologies, Inc. | Particulate cartilage system |
| ES2809302T3 (es) | 2004-01-22 | 2021-03-03 | Univ Miami | Formulaciones de coenzima Q10 para tratar tumores sólidos mediante administración intravenosa |
| CN100377741C (zh) * | 2004-02-23 | 2008-04-02 | 江卫世 | 注射用复方骨肽及其制备工艺 |
| US20050288796A1 (en) * | 2004-06-23 | 2005-12-29 | Hani Awad | Native soft tissue matrix for therapeutic applications |
| US20090319045A1 (en) | 2004-10-12 | 2009-12-24 | Truncale Katherine G | Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles |
| US7837740B2 (en) * | 2007-01-24 | 2010-11-23 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Two piece cancellous construct for cartilage repair |
| WO2006059236A2 (en) * | 2004-11-16 | 2006-06-08 | Aeterna Zentaris Inc. | Method of using cartilage extract for increasing blood parameters |
| US7815926B2 (en) * | 2005-07-11 | 2010-10-19 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Implant for articular cartilage repair |
| JP5292533B2 (ja) | 2005-08-26 | 2013-09-18 | ジンマー・インコーポレイテッド | インプラントおよび関節疾患の治療、置換および治療方法 |
| CA2623106C (en) | 2005-09-19 | 2013-12-24 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof |
| DE102006060247A1 (de) * | 2006-09-15 | 2008-03-27 | Ossacur Ag | Differenzierung von Stammzellen |
| US8163549B2 (en) | 2006-12-20 | 2012-04-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Method of obtaining viable small tissue particles and use for tissue repair |
| US8435551B2 (en) | 2007-03-06 | 2013-05-07 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects |
| AU2008240191B2 (en) | 2007-04-12 | 2013-09-19 | Zimmer, Inc. | Compositions and methods for tissue repair |
| ES2572356T3 (es) | 2007-11-09 | 2016-05-31 | Peregrine Pharmaceuticals Inc | Composiciones de anticuerpos dirigidos contra VEGF y procedimientos |
| EP2262469A4 (en) * | 2008-04-15 | 2013-12-04 | Immanence Integrale Dermo Correction Inc | SKIN CARE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THEIR USE |
| EP2633864A1 (en) | 2008-07-25 | 2013-09-04 | The Regents of the University of Colorado | Clip inhibitors and methods of modulating immune function |
| US20100274362A1 (en) * | 2009-01-15 | 2010-10-28 | Avner Yayon | Cartilage particle tissue mixtures optionally combined with a cancellous construct |
| CN101891811B (zh) * | 2010-05-28 | 2011-11-09 | 暨南大学 | 一种鲨鱼血管生成抑制因子及其生产纯化方法和应用 |
| CN101899104B (zh) * | 2010-05-28 | 2012-04-18 | 暨南大学 | 一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子小分子多肽及其生产纯化方法和应用 |
| RU2592850C2 (ru) * | 2011-01-19 | 2016-07-27 | Хиросаки Юниверсити | Способ крупномасштабного получения протеогликана |
| US20140178343A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Jian Q. Yao | Supports and methods for promoting integration of cartilage tissue explants |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| CN104894200B (zh) * | 2015-05-12 | 2020-10-30 | 浙江海洋学院 | 路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法 |
| KR101628982B1 (ko) | 2015-11-27 | 2016-06-09 | 김준혁 | 항종양 및 면역 증강용 건강식품 조성물 |
| EP3576726A1 (en) | 2017-02-06 | 2019-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to glutaminase inhibitors |
| CN109394786A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-03-01 | 西交利物浦大学 | 一种抗肿瘤的药物组合物 |
| WO2020203812A1 (ja) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | 学校法人慶應義塾 | 魚介類由来成分による低酸素応答制御 |
| US12194060B2 (en) | 2019-06-14 | 2025-01-14 | “12Life” Limited Liability Company (“I2Life” Llo) | Method for the production of iodinated proteins with a determinated iodine content |
| CN112986499A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-06-18 | 山西奥瑞生物材料有限公司 | 一种同种骨植入材料残余水量均匀度测定方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3478146A (en) * | 1965-02-26 | 1969-11-11 | Leslie L Balassa | Wound-healing cartilage powder extracting process |
| US4042457A (en) * | 1975-11-10 | 1977-08-16 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Preparation of tissue invasion inhibitor and method of treatment utilizing the inhibitor |
| US4822607A (en) * | 1976-10-29 | 1989-04-18 | Lescarden Ltd. | Anti-tumor agent and method |
| US4243582A (en) * | 1979-04-26 | 1981-01-06 | Monsanto Company | Novel glycoproteins from bovine cartilage |
| US4350682A (en) * | 1979-05-11 | 1982-09-21 | Lescarden Ltd. | Cartilage extraction processes and products |
| US4356261A (en) * | 1980-04-22 | 1982-10-26 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Anti-invasion factor containing cultures |
| US4473551A (en) * | 1982-08-23 | 1984-09-25 | Faxon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-inflammatory composition |
| US4486414A (en) * | 1983-03-21 | 1984-12-04 | Arizona Board Of Reagents | Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances |
| US4656137A (en) * | 1985-09-12 | 1987-04-07 | Lescarden Inc | Method of processing animal cartilage |
| US4749522A (en) * | 1985-10-31 | 1988-06-07 | Angio-Medical Corporation | Supercritical fluid extraction of animal derived materials |
| US4746729A (en) * | 1986-07-30 | 1988-05-24 | Kuettner Klaus E | Cartilage-derived leukocyte elastase-inhibitor |
| US5075112A (en) * | 1990-02-12 | 1991-12-24 | Cartilage Technologies Inc. | Method of and dosage unit for inhibiting angiogenesis or vascularization in an animal using shark cartilage |
| WO1994012510A1 (en) * | 1992-11-30 | 1994-06-09 | Lane I William | Processing shark cartilage |
| RU2019173C1 (ru) * | 1993-01-12 | 1994-09-15 | Яков Давидович Безман | Способ лечения подкожной фибросаркомы |
| RU2019180C1 (ru) * | 1993-01-12 | 1994-09-15 | Яков Давидович Безман | Средство для лечения подкожной фибросаркомы и способ его получения |
| EP1155689B1 (en) * | 1993-07-19 | 2006-09-20 | Angiotech Pharmaceuticals, Inc. | Anti-angiogenic stents and methods of their preparation |
| US5618925A (en) * | 1994-04-28 | 1997-04-08 | Les Laboratories Aeterna Inc. | Extracts of shark cartilage having an anti-angiogenic activity and an effect on tumor regression; process of making thereof |
-
1995
- 1995-02-03 US US08/384,555 patent/US5618925A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-21 DE DE69528258T patent/DE69528258T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-21 ES ES95916523T patent/ES2182900T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-21 PT PT95916523T patent/PT759765E/pt unknown
- 1995-04-21 PL PL95317076A patent/PL181981B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-04-21 CN CNB951934368A patent/CN1147305C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-21 JP JP8500104A patent/JPH09512563A/ja active Pending
- 1995-04-21 RU RU96123763/14A patent/RU2156132C2/ru active
- 1995-04-21 CZ CZ19963141A patent/CZ290520B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-04-21 BR BR9507552A patent/BR9507552A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-04-21 NZ NZ284407A patent/NZ284407A/en unknown
- 1995-04-21 SI SI9530630T patent/SI0759765T1/xx unknown
- 1995-04-21 HU HU9602975A patent/HU220784B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-04-21 WO PCT/CA1995/000233 patent/WO1995032722A1/en not_active Ceased
- 1995-04-21 CN CNA2004100397718A patent/CN1541656A/zh active Pending
- 1995-04-21 AT AT95916523T patent/ATE224198T1/de active
- 1995-04-21 CA CA002188793A patent/CA2188793C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-21 RO RO96-02058A patent/RO114868B1/ro unknown
- 1995-04-21 KR KR1019960706077A patent/KR100378787B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-21 DK DK95916523T patent/DK0759765T3/da active
- 1995-04-21 EP EP95916523A patent/EP0759765B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-10-08 US US08/727,300 patent/US5985839A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-25 NO NO19964547A patent/NO317674B1/no unknown
- 1996-10-25 IS IS4379A patent/IS1975B/is unknown
- 1996-10-28 BG BG100941A patent/BG62954B1/bg unknown
- 1996-10-28 FI FI964327A patent/FI117375B/fi active IP Right Grant
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ290520B6 (cs) | Způsob získání kapalného extraktu ľraločí chrupavky, chrupavkový extrakt získaný tímto způsobem a kompozice obsahující tento chrupavkový extrakt a jejich pouľití | |
| US6025334A (en) | Extracts of shark cartilage having anti-collagenolytic, anti-inflammatory, anti-angiogenic and anti-tumoral activities; process of making, methods of using and compositions thereof | |
| CA2212010C (en) | Extracts of shark cartilage, process of production and uses thereof | |
| AU719118C (en) | Extracts of shark cartilage having an anti-angiogenic activity and an effect on tumor regression; process of making thereof | |
| AU724654B2 (en) | Extracts of shark cartilage | |
| HK1015683B (en) | Extracts of shark cartilage | |
| MXPA98003419A (en) | Extracts of cartilago of shark that have activities anti-colagenolitica, anti-inflamatory, anti-angiogenica and anti-tumoral, processes to prepare them, methods of utilization and compositions of the mis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20070421 |