CZ290755B6

CZ290755B6 - Způsob přípravy zesí»ovaného biokompatibilního polysacharidového gelového prostředku, tento prostředek a částečně zesí»ovaný tento prostředek

Info

Publication number: CZ290755B6
Application number: CZ1998129A
Authority: CZ
Inventors: Bengt Agerup
Original assignee: Q Med Ab
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-05-28
Publication date: 2002-10-16
Also published as: BR9609534B1; NO980213D0; JP3094074B2; DE69614391D1; DK0839159T3; NO980213L; PT839159E; EP0839159B1; TR199800072T1; KR100314488B1; PL324608A1; DE69614391T2; SK282431B6; BRPI9609534B8; HU220257B; EP0839159A1; AU700215B2; EA001500B1; ATE204000T1; SI0839159T1

Abstract

Zp sob p° pravy zes ovan ho biokompatibiln ho polysacharidov ho gelov ho prost°edku zes ov n m zes ovateln ho polysacharidu s polyfunk n m s ovac m inidlem spo vaj c v tom, e se - vytvo° vodn² roztok ve vod rozpustn ho, zes ovateln ho polysacharidu; - iniciuje zes ov n zes ovateln ho polysacharidu v p° tomnosti polyfunk n ho s ovac ho inidla; - stericky zabr n zes ovac reakci ukon en m p°ed v²skytem gelovat n , za vzniku aktivovan ho polysacharidu; a - znovu zavedou stericky odbra ovac podm nky pro aktivovan² polysacharid tak e se dokon toto zes ov n a do vzniku viskoelastick ho gelu. B hem p° pravy m e b²t do gelu uzav°ena medic nsky aktivn l tka. Meziprodukt zes ov n je dostate n stabiln .\

Description

Vynález se týká oblasti biokompatibilních polysacharidových gelových prostředků a zvláště nových způsobů pro zesíťování těchto prostředků a takto získaných nových gelových struktur. Nové struktury propůjčují zdokonalené vlastnosti proti dosud známým gelovým prostředkům, 10 stejně jako umožňují nové užití těchto prostředků, jako takových, tak těch, obsahujících aktivní složku.

Dosavadní stav techniky

Vodu vázající gely jsou široce používány v oblasti biomedicíny. Při použití biokompatibilních polymerů obecně je nízký stupeň zesíťování využíván k udržení biokompatibility. Avšak pro vlastní efekt využití aktivní složky je často žádána větší hustota gelu, ale v takových případech se biokompatibilita často ztrácí. Další cennou vlastností vodu vázajících gelů nebo hydrogelů je, že 20 peptidy a větší biologicky aktivní látky mohou být uzavřeny uvnitř a tak vytvoří trvale propustný (uvolňující) prostředek. Avšak praktické problémy jsou obsaženy v dosažení dostatečného času zadržení aktivní látky, poté kdy je aktivní látka propouštěna se stejnou rychlostí jako je rozpouštěna nebo uzavírána do prostředku. Dále jestliže takový gel byl při pokusu zhušťován k prodloužení času zadržení, mohl by bobtnat ve zvířecích tkáních, které jsou volně přístupné 25 vodě.

Jedním ze široce užívaných biokompatibilních gelů pro medicínské použití je kyselina hyalurová. Třebaže je přítomná v totožném prostředku v každém živém organismu, dává minimum reakcí možností pro pokročilé medicínské použití. V důsledku toho byla subjektem mnoha modi30 fikačních pokusů. Takže byla zesíťována činidly jako aldehydy, epoxidy, polyaziridylovými sloučeninami a divinylsulfony (Laurent a spol., Acta Chem. Scand 18 (1964) C. 1, s. 274; EPO 161 887B1;EP 0 265 116A4; a US 4 716 154).

V WO 87/07 898 byla objevena reakce polysacharidů s polyfunkčními epoxidy, odstranění 35 přebytku epoxidu a závěrečná sušící operace vede k filmu, prášku nebo k podobnému suchému produktu. Avšak není v něm žádný návrh pro zředění a pro následnou rekoncentraci vedoucí k žádané hustotě nebo konsistenci, která je pak částečně stálá.

V US 5 128 326 je popsáno množství modifikovaných hyalurových kyselin ajejich využití jako 40 depotních farmak. Popsaná metoda „nabití“ gelových přípravků je založena na difúzi aktivní látky do gelu a jejím následným uvolňováním z tohoto gelu se stejnou difuzní konstantou. Naproti tomu předkládaný vynález zahrnuje rozpuštění aktivní látky, následné zahuštění nebo zkoncentrování gelového prostředku až do té doby kdy neprobíhá žádná nebo velmi malá difúze.

VUS5399 351 jsou popsány směsi gelů a polymemí roztoky, tyto roztoky jsou používány k zlepšení Teologických vlastností gelu. Avšak také v tomto případě byly objeveny zpětně zhuštěné gely, např. od. 6. řad. 53-58.

Podstata vynálezu

Podle předkládaného vynálezu bylo neočekávaně nalezeno, že polysacharidové gelové prostředky, mající novou strukturu a tím nové vynikající vlastnosti, mohou být získány použitím nových technik pro jejich zesíťování. Nová technika zesíťování dovoluje mnohostranné řízení struktury a

-1 CZ 290755 B6 vlastností vyráběných polysacharidových gelových prostředků, což umožňuje připravit konečný prostředek na zakázku pro zamýšlený účel.

Podrobněji, jeden předmět předkládaného vynálezu je poskytnutí postupu pro přípravu zesíťovaného polysacharidového gelového prostředku, kde biokompabilita může být zachována i přes vysoký stupeň zesíťování nebo polymerizace.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí polysacharidového gelového prostředku s viskoelastickými vlastnostmi, i přes podstatný stupeň zesíťování.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí polysacharidového prostředku, který je více nebo méně nevratně zhuštěný nebo koncentrovaný tzn. který částečně nebobtná nebo jenom do limitovaného stupně při styku s vodou.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí polysacharidového gelového prostředku uzavírajícího biologicky aktivní látku pro použití tohoto jako trvale propustného prostředku nebo depotního prostředku.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí polysacharidového gelového prostředku obsahujícího různé biologicky aktivní látky pro použití medicínských nebo profytaktických prostředků pro různé účely.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí použití zmíněného prostředku pro výrobu medicínských nebo profylaktických prostředků a pro jejich podávání savcům, zvláště lidem.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí částečně zesíťovaného aktivovaného polysacharidového prostředku získaného jako intermediát v postupu podle vynálezu výše zmíněného, tento intermediát může být zesíťován in šitu a v jakékoli žádané pozici.

Podrobný popis vynálezu

Tyto a další předměty vynálezu jsou detailněji popsány dále. Podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu je takto získán postup pro přípravu zesíťovaného biokompatibilního gelového prostředku, přičemž tento postup zahrnuje:

- tvorbu vodného roztoku ve vodě rozpustných, zesíťovatelných polysacharidů;

- iniciaci síťování polysacharidů v přítomnosti polyfunkčního síťovacího činidla;

- sterické zabránění ukončení síťovací reakce před výskytem gelovatění, takto je získán aktivovaný polysacharid;

- a znovuzavedení stericky odbráněných podmínek pro aktivovaný sacharid tak, aby pokračovalo zesíťování tohoto až k viskoelastickému gelu.

Dále nový postup podle předkládaného vynálezu dovoluje zesíťování ve vodě rozpustných, zesíťovatelných polysacharidů alespoň ve dvou krocích nebo stupních, kde zesíťovací reakce je přerušena před zahájením gelovatění, přerušení je dosaženo sterickým bráněním zesíťovací reakce. Zesíťovací reakce pak pokračuje v druhém kroku znovuzavedením stericky odbráněných podmínek.

Takto, za prvé je neočekávaně nalezeno, že aktivovaný polysacharid je získán sterickou překážkou zesíťování nebo polymerizace, které může proto pokračovat pouze znovuzavedením stericky

-2CZ 290755 B6 odbráněných podmínek. Za druhé je také neočekávaně nalezeno, že polysacharidový gelový prostředek takto získaný, netvoří kompaktní, hustou strukturu, který by byl získán provedením odpovídající zesíťovací reakce v jednom jednoduchém kroku vedoucímu k plně zesíťovanému gelu, ale dosti viskoelastickému gelu. Kromě toho, jak bylo výše zmíněno, získaná nová gelová struktura podle předkládaného vynálezu představuje částečně nevratnou gelovou strukturu, která nebobtná do znatelného stupně při kontaktu s vodou, nebo s dalším vodním médiem. To obecně znamená, že nabobtnání je menší než 10 objemových procent objemu, který byl získán nárokovaným postupem.

Ačkoli vynález není spojen s jakoukoli teorií, je možné, že získaná nová gelová struktura podle předkládaného vynálezu je spíše kombinací zesíťování mezi existujícími polymemími řetězci a prodloužením existujících řetězců tím spíše než, že velmi hustá síť poskytuje velmi rigidní strukturu. Což může znamenat, že takový mechanismus je skutečností, protože viskoelastický gel je získatelný tímto vynálezem.

Zde užívaný termín „sterické bránění zesíťovací reakce“ by mohl být interpretován v širokém smyslu tj. nemusí být to nezbytně úplná zábrana, ale v mnoha případech spíše částečná překážka zmíněné reakce. Důležité je, že rychlost zesíťování je částečně redukována, což dává možnost závěrečné zesíťovací reakci probíhat na požadovaném reakčním místě.

Podobně termín „znovuzavedením stericky odbráněných podmínek“ by mohl být široce interpretován, což obecně znamená, že stericky odbráněné podmínky nemusí být přesně ty samé sterické podmínky, které byly použity při počáteční zesíťovací reakci. Tedy co je obecně důležité je, že stericky odbráněné podmínky dávají možnost probíhat rychlejším reakcím, než při stericky bráněných podmínkách.

Sterická zábrana zesíťovací reakce může být získána různými způsoby, ale výhodným provedením vynálezu, z tohoto hlediska, je reprezentováno případem, kde sterická zábrana obsahuje naředění vodního média, v kterém je zesíťovací reakce prováděna, pro dosažení nižší koncentrace polysacharidu v médiu.

Znovuzavedení stericky odbráněných podmínek je možné také různými způsoby, ale výhodným provedením vynálezu, z tohoto hlediska, je reprezentováno případem, který obsahuje odpaření vodního média, v kterém je zesíťovací reakce prováděna, pro dosažení vyšší koncentrace polysacharidu v médiu. Další výhodné provedení, z tohoto hlediska, je reprezentováno případem obsahujícím dialýzu vodního média, v kterém je zesíťovací reakce prováděna.

Podle výhodného provedení vynálezu, sterická zábrana zesíťovací reakce je dosažena před spotřebováním síťovacího činidla. To obecně také znamená, že znovuzavedení stericky odbráněných podmínek je iniciováno v přítomnosti nespotřebovaného síťovacího činidla.

Sterická zábrana zesíťovací reakce může být nastartována nebo vytvořena v rozsahu 50 až 90 % celkového času gelovatění použitého v procesu podle vynálezu, ohled je také brán na vhodnou elasticidu a konsistence pro další použití prostředku.

Tvůrčí myšlenka by mohla být aplikována na jakýkoli biokompatibilní polysacharid, který je zesíťovatelný a rozpustný ve vodném médiu. Tedy, termín „ve vodě rozpustný“ by mohl být interpretovaný v širokém smyslu, voda není nevyhnutelně nutná. Toto znamená, že vodný roztok znamená jakýkoli roztok, v kterém je voda hlavní komponentou. Preferovanou podskupinou polysacharidů ve spojení s vynálezem jsou glukosaminglukány, z kterých hyalurová kyselina je obzvláště zajímavý příklad.

Síťovací činidla užívaná ve spojení s vynálezem jsou jakákoli dříve známá síťovací činidla užitečná ve spojení s polysacharidy, s ohledem na zajištění, že jsou splněny nezbytné předpoklady biokompatibility. S výhodou jsou jakákoli síťovací činidla vybrána ze skupiny skládající se

-3CZ 290755 B6 z aldehydů, epoxidů, polyaziridových sloučenin, glycidyl etherů a divinylsulfonů. Z těchto glycidyl ethery reprezentují zvláště preferovanou skupinu, z které 1,4-butandioldiglycidylether může být povýšen na preferovaný příklad. V tomto spojení tak znamená, že „polyfunkční“ znamená difunkční.

Počáteční síťovací reakce může probíhat v přítomnosti polyfunkčního síťovacího činidla při různých hodnotách pH, zejména závisí zdali by mohla být zahájena etherová nebo esterová reakce. To s výhodou znamená, že síťovací reakce je zahájená v alkalickém pH zvláště nad pH 9 např. v rozmezí pH9 až 12, kde vznikají ethery. Pro vznik esterů síťovací reakce s výhodou probíhá v kyselém pH, zvláště při pH 2 až 6.

Jeden zajímavý aspekt vynálezu je reprezentován případem, kde připravený zesíťovaný gelový prostředek je použit jako takový, vynález umožňuje výrobu viskoelastického prostředku. Takový viskoelastický prostředek je například užitečný v oční chirurgii, jako synoviální náhrada, jako oční kapky, atd. a jak bylo uvedeno, výše předkládaný vynález činí možnou přípravu viskoelastických vlastností na zakázku právě pro takové použití. Tedy užitím sterické technologie podle předloženého vynálezu je možné získat prodloužením řetězce, zesíťování, atd. a více řídit proces než u předchozích technik s více nebo méně náhodnými reakčními místy napojení. Dále skrze tento fakt, že získané gely v souladu s vynálezem si neponechávají svůj původní objem v přítomnosti vodného média, nové produkty nezpůsobují žádné interferující a negativní objemové efekty v těchto nebo dalších medicínských použití.

V souladu s předkládaným vynálezem je také možné uzavřít do polysacharidového gelového prostředku jakoukoliv biologicky aktivní látku, pro kterou je polysacharidový gelový nosič žádaný nebo přijatelný. V tomto kontextu užívaná zředění-koncentrační technika v nárokovaném postupu umožňuje zavření biologicky aktivní látky před podstoupením polysacharidu stericky odbráněným podmínkám. Tedy, ačkoli stericky odbráněné podmínky obecně znamenají koncentrační operaci, taková operace znamená, že biologicky aktivní látka bude přítomna ve fázi, která je kompaktnější než látka, která bude uzavřena do nosiče. Jinými slovy biologicky aktivní látka může být zadržena mnohem déle v porovnání s předchozími známými gelovými zesíťovanými reakcemi. Tímto je možné získat lepší profil řízeného uvolňování pro aktivní látku.

Ve spojení s uzavřením biologicky aktivní látky do prostředku a přizpůsobení podmínek fyziologickému pH a iontovým podmínkám, je s výhodou vytvořen pro držení preparátu připraveného pro medicínské použití. Takové fyziologické nastavení je také preferováno, co se týče reakčních podmínek při druhém stupni postupu, kdy bylo nalezeno, že za právě těchto podmínek reakce probíhá velmi dobře.

Vynález by neměl být limitován v žádném jak pro biologicky aktivní látku tak v porovnáním užití látky v přednostních případech. Jinými slovy podmínka (druh) léčby může být rozhodující pro vybrání specifické látky.

Avšak zajímavé látky ve spojení s vynálezem mohou být vybrány ze skupiny hormonů, cytokináz, vakcín, buněk, tkáňových růstových látek. Unikátní kombinace vlastností nového gelového prostředku vynálezu činí toto extrémně výhodné ve spojení s těmito látkami, tj. zejména díky vynikajícím depotním vlastnostem a vlastnostem řízeného uvolňování a nebobtnajícím vlastnostem.

Jedna zajímavá skupina z biologicky aktivních látek jsou tkáňové růstové látky pro něž je polysacharidový gel vhodný nosič. Další detaily ohledně těchto produktů můžou být nalezeny v WO 94/21 199. Podrobněji, preferované tkáňové růstové látky obsahují polymer vybraný z kolagenu, škrobu, dextranomeru, polylaktidů a jejich kopolymerů a poly-p-hydroxybutyrátu a jeho kopolymerů.

-4CZ 290755 B6

Ve spojení s hormony, erytropoeitin a calcitonin jsou zvláště preferované. Způsob podle předloženého vynálezu také umožňuje uzavření biologicky aktivních látek chemickou reakcí s polysacharidovou gelovou strukturou, nebo se síťovacím činidlem, za předpokladu, že aktivní látka obsahuje funkční skupiny reaktivní s těmito skupinami. V takovém případě mohou být získány unikátní vlastnosti nebo kombinace vlastností např. rychlost uvolňování aktivní látky bude řízena degradací nebo rozkladem polymemí sítě, spíše než rozpouštěcí a migrační rychlostí pro látku ve vztahu s gelovou sítí.

Modifikace posledně zmíněné techniky v souladu s vynálezem znamená, že funkční skupiny aktivní látky nejdříve reagují se síťovacím činidlem pro polysacharid. Výhodně je použito to samé síťovací činidlo jako je použito pro zesíťování polysacharidu.

Od té doby co postup z předkládaného vynálezu poskytuje nové polysacharidové gelové prostředky nebo struktury, další aspekt vynálezu je reprezentován připraveným neobvyklým polysacharidovým gelovým prostředkem. S ohledem na to, rozsah ochrany zahrnuje nejen polysacharidový gelový prostředek připravený kdykoli dle popsaného postupu, ale také jakýkoli polysacharidový gelový prostředek, který je získatelný podobnou technikou.

Vyjádřeno jiným způsobem předložený vynález také poskytuje zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek, který je získávaný zesíťováním zesíťovatelného polysacharidu s polyfunkčním zesíťovacím činidlem ve dvou krocích. První zesíťovací krok je ukončený před vyskytnutím gelovatění sterickou zábranou zesíťovací reakce a druhý zesíťovací krok je zahájen znovuzavedením stericky odbráněných podmínek pro zesíťovací reakci, která pokračuje až k viskoelastickému gelu.

Všechny tyto rysy, které jsou prezentované jako výhodné nebo zajímavé znaky ve spojení s nárokovaným postupem jsou aplikovatelné také na polysacharidový gelový prostředek sám o sobě a nemusí být více opakovány.

Další aspekt vynálezu je reprezentován příkladem, kde meziprodukt je získán odložením konečného kroku zesíťovací reakce pomocí stericky odbráněnými podmínkami na pozdější stupeň nebo místo, například pro konečné použití prostředku. Tedy bylo nalezeno, že meziprodukt získaný po sterické zábraně zesíťovací reakce má takovou stabilitu, že je možné ukončení zesíťovací reakce v pozdějším stupni.

Vynález se také týká použití prostředku výše definovaného pro výrobu medicínského a profylaktického prostředku.

Další aspekt vynálezu je použití výše uvedeného prostředku pro výrobu medicínských a profylaktických prostředků pro jakékoli výše zmíněné specificky léčebné a terapeutické účely, výhodně pak pro aplikaci tkáňového růstu a hormonální léčbu savců, zejména lidí.

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude nyní ilustrován následujícími příklady, které jej však žádným způsobem neomezují.

-5CZ 290755 B6

Příklad 1

Aktivace polymeru

A) - za alkalických podmínek

Polysacharid ve formě 10 g hyalurové kyseliny připravené fermentací Streptokokem byl rozpuštěn v 100 ml 1 % NaOH pH > 9. Síťovací činidlo ve formě 1,4-butandiol diglycidyl etheru bylo přidáno o koncentraci 0,2 %. Roztok byl inkubován 4 hodiny při 40 °C.

B) - za kyselých podmínek

Experiment byl proveden jako v IA při kyselém pH mezi 2 až 6 přidáním 1 % kyseliny octové do roztoku jako náhrady viz 1 A.

Příklad 2

Příprava viskoelastického gelu

Inkubáty dle IA a 1B byly naředěny na objem, který je dvojnásobek žádaného objemu nebo 0,5 až 1 % a byly zneutralizovány. Gel byl rotačně odpařen do viskoelastického gelu.

Příklad 3

Příprava gelu obsahující dextranomemí částice

Inkubáty dle IA a 1B byly naředěny na 1 % koncentraci 20 g suchých dextranomemích částic bylo mícháno s roztokem, částice byly uzavřeny zesíťováním polymeru hyalurové kyseliny v několika minutách v důsledku koncentrace (zhušťování) hyalurové kyseliny, které je dosaženo absorpcí vody dextranomemími kuličkami.

Získané viskoelastické gely jsou stálé, autoklávovatelné a vhodné pro injektáž pomocí podkožních jehel.

Příklad 4

Příprava gelu obsahující erytropoeitin (EPO) pro použití jako depotního léku

Inkubát získaný v příkladu IA byl naředěn na koncentraci 1 % a pH bylo upraveno přidáním citrátového purfu, podle instrukcí výrobce (Ortho Biotech lne., Raritan USA), pro dobrou stabilitu ve vodném roztoku. 5 x 10⁶ IU, imunologických jednotek EPO bylo přidáno za míchání. Po odpaření roztoku na čtvrtinový objem, polymer byl zesíťovaný na depotní přípravek a 20 000 IU bylo získáno zpět.

Příklad 5

Příprava gelu obsahující calcitonin pro použití jako depotního léku

Calcitonin z lososa lOOIU/ml (Miacalcic® Sandoz) byl smíchán s 2% polymemím roztokem v souladu s experimentem 1B a roztok byl rotačně odpařen na koncentraci 5 % (250 IU/ml). Kůň

-6CZ 290755 B6 s chronickou kulhavostí v pravé přední noze byl léčen injekcí 2 ml s.c. týdně po dva týdny. Po šesti týdnech byl kůň zbaven bolestí. Sérum kalcia bylo sníženo pouze o 12 %.

Příklad 6

Příprava gelu obsahuj ící heparin k uvolňování v trvalé cestě

V naředěném aktivovaném polymeru dle příkladu 4 byl rozpuštěn v 5 % množství k polymeru. Obdržená směs byla ekvilibrovaná 1 hodinu, načež byla odpařena na čtvrtinový objem. Koagulace inhibující uvolňování z prostředku nebyla pozorována během 16 dní inkubace v fyziologickém roztoku.

Příklad 7

Příprava gelu s kovalentně vázaným heparinem v stericky řízené pozici

Aktivovaný gel dle příkladu 1 byl precipitován v methanolu za silného míchání. Získaný práškový precipitát byl sušen přes noc. Heparin byl aktivován v souladu s příkladem 1. Po inkubaci (4 hodiny při 40 °C) polymemí precipitát byl smíchán s roztokem aktivovaného heparinu. Směs byla inkubována přes noc a následující den byl gelový roztok neutralizován, vysrážen a promyt od reakčních zbytků.

Vytvořený gel byl schopný vázat růstový faktor, mezi jinými základní Fibroblastický růstový faktor (bFGF), ale neukazuje žádnou inhibici koagulace zdravé krve.

Příklad 8

Příprava gelu obsahující positivní nabité skupiny chitosanu

Inkubace směsi 7,5 g polymeru hyalurové kyseliny a 2,5 g chitosanu (See Cure® Protan) byla provedena v souladu s příkladem 1. Po rozpuštění a neutralizaci byl získán kopolymerizovaný viskoelastický roztok. Roztok měl hojivé podpůrné vlastnosti po aplikaci pro léčení přetrvávajících bolestí.

Příklad 9

Příprava stericky spojovaného gelu

7,5 g hyalurové kyseliny bylo aktivováno v souladu s příkladem IA. Stejným způsobem bylo aktivováno 2,5 g dextranu. Hyalurová kyselina byla precipitována v methanolu, precipitát pak smíchán s 500 ml naředěného 0,5 % roztoku dextranu. Po míchání a úpravě pH a koncentraci solí byl získán viskoelastický gel. 5 ml tohoto roztoku bylo zavedeno do pouzdra Achillovi šlachy, které opakovaně vykazovalo zánět ve formě bolestivosti a „skřípání“. Po čtyřech týdnech problémy Achillovi šlachy zmizely.

Příklad 10

Příprava gelu obsahující GMCSF pro použití jako depotního léku

Produkt byl připraven v souladu s příkladem 5, ale místo calcitoninu zde byl přidán Granulocyte makrofág - kolonie stimulačního faktoru, GMCSF (Leucomax®) 1 mg/g polymeru.

Příklad 11

Příprava gelu obsahující umrtvený virus typu chřipka A2

Příprava byla provedena jako v příkladu 4, ale místo EPO bylo na 100 ml zředěného aktivního 1 % polymemího roztoku přidáno 40960 HAU umrtveného viru koňské chřipky. Po čtyřnásobné koncentraci přípravek obsahoval 600 HAU na ml. Vakcinací více než 100 koní ve styku s epidemickou chřipkou bylo nalezeno, že prostředek je vysoce efektivní jako ochrana před infekcí, ochrana byla zachována po dlouhou dobu (více než 6 měsíců).

Příklad 12

Příprava čerstvého gelu obsahujícího suspenzi živých buněk ml fibroblastické kultury bylo smícháno se 100 ml neutralizovaného roztoku dle příkladu 1A. Směs byla okysličena a „sušena“ na poloviční objem. Byl získán viskoelastický roztok obsahující živé buňky.

Příklad 13

Příprava silně rozmělněného gelu obsahující malé peptidy

K aktivovanému gelu dle příkladu 1A bylo přidáno 5 mg peptidu obsahujícího 12 aminokyselin. Gel byl odpařen za míchání na 10% a suspendován v minerálním oleji. Po přidání methanolu byly suché gelové částice odfiltrovány a promyty od olejových zbytků.

Příklad 14

Příprava gelu obsahujícího silně rozmělněný gel s malými peptidy dle příkladu 13

K 1 % roztoku neutralizovaného polymeru aktivovaného dle příkladu 1A byly přidány mikročástečky z příkladu 13. Gel byl pak odpařen na polovinu svého objemu. Byl připraven homogenní, stabilní a vhodný pro injekci gel obsahující jemně rozptýlené mikročástečky.

Příklad 15

Příprava gelu obsahující sférické polymethylmethakrylátové (PMMA) kuličky mající velikost 40 až 120 pm

K 5 g polymeru rozpuštěného na 1 % a neutralizovaného dle příkladu 1A bylo přidáno 100 mg kuliček polymethylmethakrylátu (PMMA). Odpařením na 3 % polymemí gel vznikl stabilní, vhodný pro injekci, viskoelastický gel.

-8CZ 290755 B6

Příklad 16

Příprava gelu obsahujícího PMMA mající 500 nm fragmenty, ke kterým byl přidán hydrofobní antigen

Hemoglutinin antigen připravený z A2 viru dle příkladu 11 byl absorbován hydrofobní interakcí na 500 nm PMMA částice. Tyto částice byly přidány k 1 % roztoku dle příkladu 15 a objem byl zmenšen na polovinu. Vznikl stabilní homogenní viskoelastický gel, který je užitečný jako vakcína mající vysoký adjuvas efekt.

Příklad 17

Porovnání mezi stupněm na bobtnání při volném styku s vodou mezi obvykle připravenými gely a gely připravenými dle prezentovaného vynálezu.

Gely hyalurové kyseliny připravené dle Laurent a spol. a dle příkladů 1 a 2 výše popsané byly vysušeny na poloviční bobtnající objemy. A pak byly navráceny do svých původních roztoků. Doposavad známé gely nabobtnaly do svých původních objemů zatímco gelový prostředek dle příkladů 1 a 2 bobtnal pouze marginálně (10 %).

Příklad 18

Srovnání mezi biologickou aktivitou gelu, který je kopolymer hyalurové kyseliny a EPO a gelu připraveného dle příkladu 1 do kterého byl EPO uzavřen koncentrováním gelu.

Čtyři pacienti léčení Eprex® (CILAG) na jejich anemii zapříčiněnou chronickou urémií, byly léčení dva měsíce dávkami každý měsíc podle následujícího režimu:

Pacient č.	1	2	3	4
Dávka IU	60 000	70 000	70 000	50 000
Měsíc 1	Přímo gelovaný depot	Přímo gelovaný depot	Kontrolní	Kontrolní
Měsíc 2	Kontrolní	Kontrolní	Koncentrovaný	Koncentrovaný

Přímo gelovaný depot: Epoxid zesíťovaný za mírných podmínek dle příkladu 11 v přítomnosti EPO

Kontrolní: EPO rozpuštěné v 4% hyalurové kyselině M.h 6xl0⁶ zkohoutího hřebínku připraveného podle US 4 141 973 (Healon® Pharmacia)

Koncentrovaný: EPO do aktivovaného gelu koncentrací

Dávka byla vybrána jako celková dávka na měsíc, která je obyčejně potřebná pro pacienta k udržení hladiny hemoglobinu. Hladinu séra EPO byla analyzována v regulérních intervalech prostřednictvím imunochemické metody.

Výsledky

Běžnou metodou pro vyjádření funkčního efektu depotních přípravků je vypočítání plochy pod křivkou (jednotky EPO x dny). Tato studie poskytuje biodostupnost ve tvaru hladiny hemoglobinu v krvi jako 0 = zachována, + = vzrůst a - = pokles.

-9CZ 290755 B6

Tabulka

Pacient č/měsíc	1/1	1/2	2/1	2/2	3/1	3/2	4/1	4/2
Plocha pod křivkou	41	424	57	534	224	952	567	656
Kontrola hemoglobinu	-	+	-	+	0	+	+	+

Závěr

Uzavření EPO v depotním přípravku dle předkládaného vynálezu dává nejvyšší možné uvolňování během analýzy. Pokus o provedení reakce gelovatění v přítomnosti EPO zničilo hormony tak, že velmi nízké uvolňování mohlo být registrováno.

Claims

1. Způsob přípravy zesíťovaného biokompatibilního polysacharidového gelového prostředku zesíťováním zesíťovatelného polysacharidu s polyfunkčním síťovacím činidlem, vyznačující se tí m , že se

- vytvoří vodný roztok ve vodě rozpustného, zesíťovatelného polysacharidu;

- iniciuje zesíťování zesíťovatelného polysacharidu v přítomnosti polyfunkčního síťovacího činidla;

- stericky zabrání zesíťovací reakci ukončení před výskytem gelovatění, za vzniku aktivovaného polysacharidu; a

- znovu zavedou stericky odbraňovací podmínky pro aktivovaný polysacharid, takže se dokončí toto zesíťování až do vzniku viskoelastického gelu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,že se použije zesíťovatelný polysacharid vybraný ze skupiny obsahující glukosaminglukany.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se použije glukosaminglukan, kterým je hyalurová kyselina.

4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se použije polyfunkční síťovací činidlo vybrané ze skupiny obsahující epoxidy, polyaziridylové a glycidyl ethery.

5. Způsob podle nároku4, vyznačující se tím, že se jako polyfunkční síťovací činidlo použije glycidylether, kterým je 1,4-butandioldiglycidylether.

6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že pro sterické zabránění zesíťovací reakce se naředí vodné médium, v kterém se zesíťovací reakce provádí, přičemž se dosáhne nižší koncentrace zesíťovatelného polysacharidu v médiu.

7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že znovu zavedené stericky odbraňovací podmínky zahrnují odpaření vodného média, ve kterém se zesíťovací reakce provádí, přičemž se dosáhne vyšší koncentrace zesíťovatelného polysacharidu v médiu.

-10CZ 290755 B6

8. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že znovu zavedené stericky odbráňovací podmínky zahrnují dialýzu vodného média, ve kterém se zesíťovací reakce provádí.

9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že počáteční zesíťovací reakce v přítomnosti polyfunkčního zesíťovacího činidla se provádí při alkalickém pH, výhodně nad pH 9, čímž se zahájí etherické zesíťovací reakce.

10. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že počáteční zesíťovací reakce v přítomnosti polyfunkčního zesíťovacího činidla se provádí při kyselém pH, výhodně při pH 2 až 6, čímž se zahájí esterové zesíťovací reakce.

11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se stericky zabrání zesíťovací reakci před spotřebováním polyfunkčního zesíťovacího činidla.

12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, v y z n a č u j í c í se t í m , že se dále biologicky aktivní látka uzavře do zesíťovaného polysacharidového gelového prostředku, během jeho přípravy, nejlépe při fyziologickém pH, a iontových koncentračních podmínkách.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že biologicky aktivní látka je uzavřena do gelového prostředku, svým rozpuštěním nebo rozptýlením v aktivovaném polysacharidu před vystavením aktivovaného polysacharidu stericky odbráněným podmínkám.

14. Způsob podle některého z nároků 12 a 13, vy z n a č u j í c í se tím, že se použije biologicky aktivní látka vybraná ze skupiny hormonů, cytokináz, vakcín, buněk a tkáňových růstových látek.

15. Způsob podle nároku 14, vy z n a č uj í c í se tím, že tkáňová růstová látka obsahuje polymer vybraný z kolagenu, škrobu, dextranomeru, polylaktidu a jeho kopolymerů, a poly-βhydroxybutyrát a jeho kopolymery.

16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že jako biologicky aktivní látka se použije hormon, který je vybrán ze skupiny obsahující erytropoeitin a calcitonin.

17. Způsob podle nároků 12 až 16, vyznačující se tím, že se použije biologicky aktivní látka obsahující funkční skupiny reagující s polysacharidem a je uzavřena v gelové struktuře chemickou reakcí.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se použije biologicky aktivní látka obsahující funkční skupiny předreagované se síťovacím činidlem pro polysacharid, výhodně s tím samým polyfunkčním zesíťovacím činidlem, které je použité pro zesíťování polysacharidu.

19. Částečně zesíťovaný biokompatibilní aktivovaný polysacharidový gelový prostředek vyznačující se tím, že je získaný některým ze způsobů podle nároků 1 až 18, přičemž je získaný v prvním zesíťovacím kroku, který je ukončen před výskytem gelovatění sterickou zábranou zesíťovací reakce.

20. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek, vyznačující se t í m , že je získaný některým ze způsobů podle nároků 1 až 18, přičemž je získaný zesíťováním zesíťovatelného polysacharidu s polyfunkčním zesíťovacím činidlem ve dvou krocích, přičemž první zesíťovací krok je ukončený před výskytem gelovatění sterickou zábranou zesíťovací reakce a druhý zesíťovací krok počínající znovu zavedením stericky odbráněných podmínek pro pokračování zesíťovací reakce vede až k viskoelastickému gelu.

-11 CZ 290755 B6

21. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek podle nároku 20, v y z n a čujícíse tím, že je získatelný způsobem podle některého z nároků 2 až 11.

22. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek podle nároků 20 a 21, vyznačující se tím, že obsahuje uvnitř uzavřenou biologicky aktivní látku.

23. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek, podle nároku 22, v y z n a čující se tím, že biologicky aktivní látka je vybraná ze skupiny hormonů, cytokináz, vakcín, buněk a tkáňových růstových látek.

24. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek, podle nároku 23, v y z n a čující se tím, že tkáňová růstová látka obsahuje polymer vybraný z kolagenu, škrobu, dextranomeru, polylaktidu a jeho kopolymerů, a poly-[3-hydroxybutyrát a jeho kopolymery.

25. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek, podle nároku 23, v y z n a čujícíse tím, že hormon je vybrán ze skupiny obsahující erytropoeitin a calcitonin.

26. Medicínský nebo proíylaktický polysacharidový gelový prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek podle nároků 20 až 25.

27. Medicínský nebo proíylaktický polysacharidový gelový prostředek podle nároku 26, vyznačující se tím, že je ve formě depotního prostředku.

28. Zesíťovaný biokompatibilní polysacharidový gelový prostředek podle nároků 20 až 25 pro použití jako medicínský nebo proíylaktický prostředek.

29. Použití zesíťovaného biokompatibilního polysacharidového gelového prostředku podle nároků 20 až 25 pro výrobu medicínského nebo profylaktického polysacharidového gelového prostředku pro tkáňový růst savce, zejména člověka.

30. Použití zesíťovaného biokompatibilního polysacharidového gelového prostředku podle nároku 27 pro přípravu medicínského nebo profylaktického depotního prostředku pro zejména hormonální léčbu savce, zejména člověka.