PL188071B1

PL188071B1 - Sposób wytwarzania usieciowanej biokompatybilnej polisacharydowej kompozycji żelowej

Info

Publication number: PL188071B1
Application number: PL96324608A
Authority: PL
Inventors: Bengt Agerup
Original assignee: Q Med Ab
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-05-28
Publication date: 2004-12-31
Also published as: WO1997004012A1; EA001500B1; EP0839159A1; CZ290755B6; DE69614391D1; SI0839159T1; HU220257B; TR199800072T1; EP0839159B1; ATE204000T1; KR100314488B1; JPH11509256A; AU6371896A; AU700215B2; BRPI9609534B8; UA48980C2; MX9800484A; NO980213D0; CN1083849C; HUP9901714A3

Abstract

1 . Sposób wytwarzania usieciowanej biokompatybilnej polisacharydowej kompozy- cji zelowej droga sieciowania rozpuszczalnego w wodzie polisacharydu w roztworze wodnym, z uzyciem wielofunkcyjnego srodka sieciujacego, znamienny tym, ze inicjuje sie sieciowanie dajacego sie sieciowac polisacharydu wybranego sposród glukanów glukozoaminy, w obecnosci wielofunkcyjnego srodka sieciujacego, zaklóca sie sterycznie zajscie do konca reakcji sieciowania przed wystapieniem ze- lowania przez rozcienczanie osrodka wodnego, w którym prowadzi sie reakcje sieciowa- nia, do uzyskania mniejszego stezenia polisacharydu w tym osrodku, z wytworzeniem zaktywowanego polisacharydu; oraz przywraca sie sterycznie niezaklócone warunki dla zaktywowanego polisacharydu przez odparowanie lub dialize osrodka wodnego, w którym prowadzi sie reakcje siecio- wania, do uzyskania wiekszego stezenia polisacharydu w tym osrodku, i kontynuuje jego sieciowanie az do uzyskania lepkosprezystego zelu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako glukan glukozoaminy stosuje sie kwas hialuronowy. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze stosuje sie srodek sieciujacy wybrany z grupy obejmujacej epoksydy, zwiazki poliazyrydylowe i etery glicydylowe. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako eter glicydylowy stosuje sie eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sposób wytwarzania usieciowanej biokompatybilnej polisacharydowej kompozycji żelowej, ewentualnie zawierającej substancję czynną.

Żele wiążące wodę są szeroko stosowane w dziedzinie biomedycyny. Wytwarza się je zazwyczaj drogą chemicznego sieciowania polimerów z utworzeniem nieskończonych sieci. Przy stosowaniu biokompatybilnych polimerów zazwyczaj wykorzystuje się niski stopień usieciowania, aby zachować biokompatybilność. Jednakże często wymagane są żele o większej gęstości usieciowania, aby osiągnąć właściwe działanie stosowanych substancji czynnych, a w takim przypadku często następuje utrata biokompatybilności.

Inną cenną właściwością żeli wiążących wodę, czyli hydrożeli, jest to, że można w nich zamknąć peptydy i większe cząsteczki substancji biologicznie czynnych z wytworzeniem kompozycji o przedłużonym uwalnianiu. Jednakże często pojawiają się praktyczne problemy związane z utrzymaniem substancji czynnej przez wystarczający okres czasu, gdyż zazwyczaj substancja czynna jest uwalniana z taką samą szybkością, z jaką rozpuściła się lub została zamknięta w określonej kompozycji. Ponadto jeśli takie żele zagęści się, aby utrzymać substancję czynną przez dłuższy okres czasu, będą one szybko pęcznieć w tkance istoty żywej, gdzie istnieje swobodny dostęp do wody.

Jednym z najczęściej stosowanych w celach medycznych biokompatybilnych polimerów jest kwas hialuronowy. Jako substancja o identycznym składzie występująca w każdym żywym organizmie, kwas ten powoduje minimalne reakcje, toteż można go wykorzystywać w nowoczesnych zastosowaniach medycznych. W związku z tym kwas ten poddawano licznym modyfikacjom. Tak więc np. sieciowano go różnymi środkami, takimi jak aldehydy, epoksydy, związki poliazyrydylowe i diwinylosulfon (Laurent i inni, Acta Chem. Scand. 18 (1964), nr 1,274; EP 0 161 887 BI, EP 0 265 116 A2 i US 4 716 154).

W publikacji WO 87/07898 ujawniono reakcję polisacharydu z wielofunkcyjnym epoksydem, usuwanie nadmiaru epoksydu i następnie suszenie usieciowanego polisacharydu z wytworzeniem błony, sproszkowanego materiału lub podobnego suchego produktu. Jednakże w tej publikacji nie sugerowano rozcieńczania zaktywowanego polisacharydu i ponownego zatężania do uzyskania zasadniczo trwałej pożądanej gęstości lub konsystencji.

W opisie patentowym US 5 128 326 ujawniono szereg modyfikowanych kwasów hialuronowych do stosowania jako leki typu depot. Wszystkie ujawnione sposoby „obciążania” preparatów żelowych są oparte na dyfuzji substancji czynnej do żelu, a następnie uwalniania z taką samą stałą dyfuzji. W przeciwieństwie do takiego rozwiązania sposób według wynalazku obejmuje rozpuszczanie substancji czynnej, po czym zagęszczenie lub zatężenie kompozycji żelowej w takim stopniu, że dyfuzja substancji czynnej ustanie lub będzie minimalna.

W opisie patentowym US 5 399 351 ujawniono mieszaniny żelu i roztworów polimeru, które to roztwory wykorzystuje się do poprawy właściwości Teologicznych żelu. Jednakże w tym przypadku również ujawniono odwracalnie ściśliwe żele, jak podano np. w kolumnie 6, wiersze 53-58.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że dzięki nowemu sposobowi sieciowania można otrzymać polisacharydowe kompozycje żelowych o nowej strukturze nadającej im nowe doskonałe właściwości, co umożliwia nowe zastosowania takich kompozycji.

Zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania usieciowanej biokompatybilnej polisacharydowej kompozycji żelowej drogą sieciowania rozpuszczalnego w wodzie polisacharydu w roztworze wodnym, z użyciem wielofunkcyjnego środka sieciującego, polega na tym, że inicjuje się sieciowanie dającego się sieciować polisacharydu wybranego spośród glukanów glukozoaminy, w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego, zakłóca się sterycznie zajście do końca reakcji sieciowania przed wystąpieniem żelowania przez rozcieńczanie ośrodka wodnego, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, do

188 071 uzyskania mniejszego stężenia polisacharydu w tym ośrodku, z wytworzeniem zaktywowanego polisacharydu; oraz przywraca się sterycznie niezakłócone warunki dla zaktywowanego polisacharydu przez odparowanie lub dializę ośrodka wodnego, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, do uzyskania większego stężenia polisacharydu w tym ośrodku, i kontynuuje jego sieciowanie aż do uzyskania lepkosprężystego żelu.

Korzystnie jako glukan glukozoaminy stosuje się kwas hialuronowy.

Korzystnie stosuje się środek sieciujący wybrany z grupy obejmującej epoksydy, związki poliazyrydylowe i etery glicydylowe.

W szczególności jako eter glicydylowy stosuje się eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu.

Korzystnie reakcję wyjściowego sieciowego w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego sieciowania prowadzi się w ośrodku o odczynie alkalicznym, korzystnie o pH powyżej 9, drogą eteryfikacji.

Również korzystnie reakcję wyjściowego sieciowania w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego prowadzi się w ośrodku o odczynie kwaśnym, korzystnie o pH 2 - 6, drogą estryfikacji.

Korzystnie reakcję sieciowania sterycznie zakłóca się przed przereagowaniem środka sieciującego.

W trakcie wytwarzania usieciowanej polisacharydowej kompozycji żelowej, korzystnie w warunkach fizjologicznego pH i fizjologicznego stężenia soli, ewentualnie zamyka się w niej substancję biologicznie czynną.

W szczególności substancję czynną zamyka się w kompozycji żelowej przez rozpuszczenie lub zdyspergowanie jej w zaktywowanym polisacharydzie przed doprowadzeniem tego polisacharydu do stanu niezakłóconego sterycznie.

Korzystnie stosuje się substancję biologicznie czynną wybraną z grupy obejmującej hormony, cytokiny, szczepionki oraz substancje powodujące rozrost komórek i tkanek.

W szczególności jako substancję powodującą rozrost tkanek stosuje się polimer wybrany z grupy obejmującej kolagen, skrobię, dekstranomer, polilaktyd i ich kopolimery oraz poliβ-hydroksymaślan i jego kopolimery, względnie stosuje się hormon wybrany z grupy obejmującej erytropoetynę i kalcytoninę.

Ponadto korzystnie stosuje się substancję biologicznie czynną zawierającą grupy funkcyjne reagujące z polisacharydem i zamyka się ją w strukturze żelu drogą reakcji chemicznej.

W tym przypadku korzystnie substancję biologicznie czynną zawierającą grupy funkcyjne poddaje się wstępnej reakcji ze środkiem sieciującym polisacharyd, korzystnie z takim samym środkiem sieciującym, który stosuje się do sieciowania polisacharydu.

Sposób według wynalazku umożliwia wszechstronną regulację struktury i właściwości wytwarzanej polisacharydowej kompozycji żelowej, co z kolei umożliwia dostosowywanie końcowej kompozycji do przewidzianych zastosowań. Otrzymana kompozycja zachowuje biokompatybilność pomimo wysokiego stopnia usieciowania lub polimeryzacji. Kompozycja ta ma właściwości lepko-sprężyste pomimo usieciowania w znaczącym stopniu. Kompozycja żelowa jest bardziej lub mniej nieodwracalnie zagęszczona lub zatężona, czyli taka, która zasadniczo nie pęcznieje lub pęcznieje tylko w ograniczonym stopniu po zetknięciu z wodą.

Sposób według wynalazku umożliwia także otrzymanie polisacharydowej kompozycji żelowej z zawartą w niej substancją biologicznie czynną do stosowania jako kompozycja o przedłużonym uwalnianiu lub kompozycja typu depot.

Możliwe jest także otrzymanie polisacharydowych kompozycji żelowych zawierających różne substancje biologicznie czynne do stosowania jako kompozycje lecznicze lub profilaktyczne w różnych celach.

Wspomniane kompozycje można stosować do wytwarzania kompozycji leczniczych lub profilaktycznych, a także do podawania ssakom, a zwłaszcza ludziom.

Sposobem według wynalazku można wytworzyć częściowo usieciowaną zaktywowaną polisacharydową kompozycję żelową stanowiącą produkt pośredni, który można ostatecznie sieciować in situ w dowolnym pożądanym miejscu.

188 071

W sposobie według wynalazku sieciowanie rozpuszczalnego w wodzie, ulegającego sieciowaniu polisacharydu prowadzi się w co najmniej dwóch etapach lub stadiach, tak że reakcja sieciowania zostaje przerwana przed zainicjowaniem żelowania, przy czym nieciągłość ta występuje w wyniku sterycznego zakłócenia reakcji sieciowania. Następnie reakcję sieciowania kontynuuje się w drugim etapie przywracając warunki, w którym nie występuje zakłócenie steryczne.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że w wyniku sterycznego zakłócenia uzyskuje się zaktywowany polisacharyd, którego sieciowanie lub polimeryzację można kontynuować po przywróceniu warunków, w którym nie występuje zakłócenie steryczne. Poza tym nieoczekiwanie stwierdzono, że uzyskana w ten sposób polisacharydowa kompozycja żelowa nie tworzy zwartej, gęstej struktury, którą uzyskałoby się przy prowadzeniu odpowiedniej reakcji sieciowania w jednym etapie aż do uzyskania w pełni usieciowanego żelu, a nie żelu lepkosprężystego. Ponadto nowa struktura żelu uzyskana sposobem według wynalazku stanowi zasadniczo nieodwracalną strukturę żelu, która nie pęcznieje w znacznym stopniu w zetknięciu z wodą lub jakimkolwiek innym ośrodkiem wodnym. Zasadniczo oznacza to, że takie ponowne spęcznienie wynosi mniej niż 10% objętościowych w stosunku do objętości uzyskanej w sposobie według wynalazku.

Jakkolwiek wynalazek nie jest związany z jakąkolwiek teorią, być może nowa struktura uzyskana sposobem według wynalazku stanowi raczej połączenie usieciowań pomiędzy istniejącymi łańcuchami polimeru oraz wydłużeń istniejących łańcuchów niż bardzo gęstą sieć powodującą powstanie bardzo sztywnej struktury. Taki mechanizm może sugerować fakt, iż sposobem według wynalazku uzyskuje się produkt lepkosprężysty.

Określenie „steryczne zakłócenie reakcji sieciowania” należy interpretować w szerokim znaczeniu, gdyż nie jest niezbędne całkowite zakłócenie, a w wielu przypadkach następuje częściowe zakłócenie odpowiedniej reakcji. Bardzo ważne jest natomiast, aby szybkość sieciowania zasadniczo zmniejszyła się, aby umożliwić zajście końcowej reakcji sieciowania z udziałem nowych miejsc reakcji.

Również określenie „przywracanie sterycznie niezakłóconych warunków” należy interpretować szeroko, gdyż ogólnie oznaczano, że takie sterycznie niezakłócone warunki nie muszą być takimi samymi warunkami sterycznymi, które występowały przy inicjowaniu reakcji sieciowania. Istotne jest natomiast to, że takie sterycznie niezakłócone warunki umożliwia ją zachodzenie reakcji szybciej niż w stanie z zakłóceniem sterycznym.

Steryczne zakłócanie reakcji sieciowania można osiągnąć różnymi sposobami, z tym, że w sposobie według wynalazku zakłócenia steryczne są związane z rozcieńczeniem wodnego ośrodka, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, aby osiągnąć mniejsze stężenie polisacharydu w tym ośrodku.

Sterycznie niezakłócone warunki można także przywrócić różnymi sposobami, z tym, że w sposobie według wynalazku odparowuje się ośrodek wodny, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, względnie prowadzi się dializę wodnego ośrodka, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, aby osiągnąć większe stężenie polisacharydu w tym ośrodku.

Korzystnie sterycznego zakłócenia reakcji sieciowania dokonuje się zanim przereaguje całość środka sieciującego. Z kolei oznacza to zazwyczaj, że przywracanie sterycznie niezakłóconych warunków inicjuje się w obecności nieprzereagowanego środka sieciującego.

Steryczne zakłócenie reakcji sieciowania można zazwyczaj zainicjować lub przeprowadzić w przedziale czasowym stanowią cym 50 - 90% całkowitego czasu żelowania, przy czym należy wziąć pod uwagę właściwą elastyczność lub konsystencję dla przewidzianego zastosowania kompozycji.

Sposób według wynalazku może być przydatny w odniesieniu do dowolnego biokompatybilnego polisacharydu ulegającego sieciowaniu i rozpuszczalnego w ośrodku wodnym. Określenie „rozpuszczalny w wodzie” należy przy tym interpretować w szerokim znaczeniu, bez konieczności stosowania czystej wody. Określenie roztwór wodny oznacza dowolny roztwór, w którym woda stanowi główny składnik. Korzystną podgrupą polisacharydów, które można stosować w sposobie według wynalazku, są glukany glukozoaminy, których szczególnie interesującym przykładem jest kwas hialuronowy.

188 071

Środkiem sieciującym stosowanym w sposobie według wynalazku jest dowolny wcześniej znany środek sieciujący stosowany dla polisacharydów, z tym, że należy zapewnić spełnienie wymagań odnośnie biokompatybilności. Jednakże korzystny środek sieciujący jest wybrany z grupy obejmującej epoksydy, związki poliazyrydylowe i etery glicydylowe. Spośród nich reprezentatywną i szczególnie korzystną grupę stanowią etery glicydylowe, z których jako korzystny przykład można wymienić eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu. Należy tu również podkreślić, że określenie „wielofunkcyjny” obejmuje także określenie „dwufunkcyjny”.

Reakcję wstępnego sieciowania w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego można prowadzić przy różnych wartościach pH, zależnych przede wszystkim od tego, czy sieciowanie przebiega drogą reakcji eteryfikacji czy estryfikacji.

Oznacza to, że reakcję sieciowania korzystnie prowadzi się w ośrodku o odczynie alkalicznym, zwłaszcza przy pH powyżej 9, np. w zakresie pH 9 - 12, by przyspieszyć powstawanie eteru. W celu przyspieszenia powstawania estru reakcję sieciowania korzystnie prowadzi się w ośrodku o odczynie kwaśnym, zwłaszcza przy pH 2 - <3.

Usieciowana polisacharydowa kompozycja żelowa stanowi bardzo użyteczny produkt, gdyż sposób według wynalazku umożliwia wytwarzanie kompozycji lepkosprężystej. Taka kompozycja lepkosprężysta może być np. użyteczna w chirurgii oka, jako zamiennik płynu maziowego, jako krople do oczu itp., gdyż wynalazek umożliwia dostosowywanie właściwości lepkosprężystych do takich zastosowań. Tak więc wykorzystując metodę zakłócania sterycznego, stosowaną w sposobie według wynalazku, można osiągnąć przedłużanie łańcuchów, rozgałęzianie łańcuchów, usieciowanie itp., w bardziej kontrolowany sposób niż przy wykorzystaniu znanych metod, z mniej lub bardziej przypadkowymi miejscami sprzęgania.

Ponadto dzięki temu, że żele wytworzone sposobem według wynalazku nie zachowują wyjściowej objętości w obecności ośrodka wodnego, nowe produkty nie wywołują zakłócających lub ujemnych efektów objętościowych w tych i innych zastosowaniach medycznych.

Do polisacharydowej kompozycji żelowej można także wprowadzić dowolną substancję biologicznie czynną, w przypadku której użycie żelu polisacharydowego jako nośnika jest pożądane lub dopuszczalne. W takim przypadku metoda rozcieńczania-zatężania realizowana w sposobie według wynalazku umożliwia zamknięcie takiej substancji biologicznie czynnej przed przeprowadzeniem polisacharydu w stan sterycznie niezakłócony. W związku z tym, że osiąganie stanu niezakłóconego sterycznie zazwyczaj następuje w wyniku zatężania, substancja biologicznie czynna będzie się znajdować w fazie, która jest bardziej zagęszczona niż w momencie, gdy substancja ta została wprowadzana do nośnika. Innymi słowy substancję biologicznie czynną można będzie dłużej utrzymać w porównaniu ze znanymi reakcjami sieciowania żelu. Dzięki temu można będzie uzyskać korzystniejszy profil przedłużonego uwalniania substancji czynnej.

W przypadku wprowadzania substancji biologicznie czynnej do kompozycji żelowej korzystnie warunki dostosowuje się, aby osiągnąć fizjologiczne pH i stężenie soli, tak że wytworzony preparat jest gotowy do zastosowania medycznego. Takie dostosowanie do warunków fizjologicznych jest również korzystne z punktu widzenia warunków reakcji, gdyż stwierdzono, że drugi etap procesu przebiega bardzo dobrze w takich warunkach.

W sposobie według wynalazku można stosować różne substancje biologicznie czynne, ale nie tylko te stosowane w znanych rozwiązaniach. Dobór konkretnej substancji czynnej zależy od przeznaczenia leku do leczenia określonego stanu.

Jednakże interesujące z punktu widzenia wynalazku substancje można wybrać z grupy obejmującej hormony, cytokiny, szczepionki oraz substancje powodujące rozrost komórek i tkanek. Ze względu na wyjątkowe połączenie właściwości nowej kompozycji żelowej wytworzonej sposobem według wynalazku jest ona wyjątkowo cenna w połączeniu z takimi substancjami, przede wszystkim dzięki doskonałym właściwościom przydatnym w preparatach typu depot i w kompozycjach o przedłużonym uwalnianiu oraz niezdolności do pęcznienia.

Jedną z interesujących grup substancji biologicznie czynnych stanowią substancje powodujące rozrost tkanek, gdyż żel polisacharydowy stanowi dla nich dogodny nośnik. Więcej szczegółów dotyczących takich produktów można znaleźć w publikacji WO 94/21299. W szczególności do substancji powodujących rozrost tkanek należą polimery wybrane z grupy obej188 071 mującej kolagen, skrobię, dekstranomer, polilaktyd i ich kopolimery oraz poli-p-hydroksymaślan i jego kopolimery.

Spośród hormonów do szczególnie korzystnych należą erytropoetyna i kalcytonina.

Sposób według wynalazku umożliwia także wprowadzanie substancji biologicznie czynnej drogą reakcji chemicznej ze strukturą żelu polisacharydowego lub ze środkiem sieciującym go, pod warunkiem, że taka substancja czynna zawiera reagujące z nimi grupy funkcyjne. Umożliwia to uzyskanie kompozycji o wyjątkowych właściwościach i połączeniach właściwości, takich jak np. uzależnienie szybkości uwalniania substancji czynnej od degradacji lub rozkładu sieci polimerowej, a nie od szybkości rozpuszczania lub migracji takiej substancji z sieci żelu.

Modyfikacja powyższego sposobu umożliwia wstępne przereagowanie grup funkcyjnych substancji czynnej ze środkiem sieciującym polisacharyd. Korzystnie stosuje się ten sam środek sieciujący, który wykorzystuje się do sieciowania polisacharydu.

Można także otrzymać produkt pośredni, odsuwając ostateczny etap reakcji sieciowania w niezakłóconych sterycznie warunkach do późniejszego stadium lub innego miejsca, np. przy ostatecznym zastosowaniu kompozycji. Stwierdzono bowiem, że produkt pośredni uzyskany po sterycznym zakłóceniu reakcji sieciowania odznacza się taką trwałością, że reakcję sieciowania można dokończyć w późniejszym stadium.

Kompozycję wytworzoną sposobem według wynalazku można stosować jako kompozycję leczniczą lub profilaktyczną.

Kompozycję wytworzoną sposobem według wynalazku można stosować do wytwarzania kompozycji leczniczej lub profilaktycznej, do stosowania w dowolnym z wyżej wymienionych konkretnych celów medycznych lub terapeutycznych, przy czym do korzystnych zastosowań należy zwiększanie rozrostu tkanki i terapia hormonalna ssaków, zwłaszcza ludzi. Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

Przykład 1

Aktywowanie polimeru

a. W warunkach alkalicznych

Polisacharyd w postaci 10 g kwasu hialuronowego wytworzonego drogą fermentacji Streptococcus rozpuszczono w 100 ml 1% NaOH, pH > 9. Dodano środek sieciujący w postaci eteru diglicydylowego 1,4-butanodiolu do uzyskania stężenia 0,2%. Roztwór inkubowano w 40°C przez 4 godziny.

b. W warunkach kwasowych

Doświadczenie przeprowadzono jak w la, ale w ośrodku o odczynie kwaśnym, pH około 2-6, uzyskanym w wyniku dodania do roztworu 1%o kwasu octowego zamiast NaOH użytego w la.

Przykład 2

Wytwarzanie żelu lepkosprężystego

Produkty inkubowania z la i lb rozcieńczono do objętości stanowiącej dwukrotną ostatecznie wymaganą objętość, lub do stężenia około 0,5 - 1%, po czym zobojętniono. Żel odparowano w wyparce obrotowej z wytworzeniem lepkosprężystego żelu.

Przykład 3

Wytwarzanie żelu zawierającego cząstki dekstranomeru

Produkty inkubowania z la i lb rozcieńczono do osiągnięcia stężenia 1%o i z roztworem zmieszano 20 g suchych cząstek dekstranomeru (Sephadex® 25, Pharmacia). Cząstki zostały zamknięte w żelu w wyniku usieciowania polimeru kwasu hialuronowego w ciągu kilku minut na skutek zatężenia kwasu hialuronowego spowodowanego wchłanianiem wody przez kuleczki dekstranomeru.

Otrzymano trwałe lepkosprężyste żele, które można było autoklawować i wstrzykiwać z użyciem cienkich igieł do iniekcji podskórnej.

Przykład 4

Wytwarzanie żelu do stosowania jako lek typu depot zawierający erytropoetynę (EPO)

Produkt inkubowania uzyskany w przykładzie la rozcieńczono do uzyskania stężenia 1%, po czym pH nastawiono przez dodanie buforu cytrynianowego zgodnie z instrukcjami

188 071 producenta (Ortho Biotech Inc., Raritan, .USA) w celu zapewnienia trwałości roztworu wodnego. Do poddawanego mieszaniu roztworu dodano 5 x 10⁶ IU EPO. Po odparowaniu roztworu do 1/4 objętości otrzymano usieciowany polimer w postaci kompozycji użytecznej jako preparat typu depot zawierający 20 000 IU EPO/ml.

Przykład 5

Wytwarzanie żelu do stosowania jako preparat typu depot zawierający kalcytoninę

Kalcytoninę z łososia, 100 IU/ml (Miacalcic® Sandoz) wymieszano z 2% roztworem polimeru wytworzonym w sposób podany w przykładzie lb i roztwór zatężono do 5% (250 IU/ml) w wyparce obrotowej. Konia z przewlekłym chromaniem prawej przedniej nogi leczono wstrzykując mu podskórnie dawkę 2 ml/tydzień przez 2 tygodnie. W 6 tygodni po leczeniu koń został uwolniony od bólu. Poziom wapnia w surowicy obniżył się tylko o 12%.

Przykład 6

Wytwarzanie żelu zawierającego heparynę do przedłużonego uwalniania

W zaktywowanym polimerze według przykładu 4 rozpuszczono heparynę w ilości stanowiącej 5% polimeru. Uzyskaną mieszaninę pozostawiono na 1 godzinę dla ustalenia się równowagi, po czym odparowano ją do 1/4 objętości. Jej uwalnianie hamujące koagulację stwierdzono podczas 16-dniowego inkubowania w fizjologicznym roztworze soli.

Przykład 7

Wytwarzanie żelu z kowalencyjnie związaną heparyną w sterycznie kontrolowanej pozycji

Zaktywowany polimer według przykładu 1 wytrącono w metanolu w trakcie intensywnego mieszania. Uzyskany drobny osad wysuszono przez noc. Heparynę zaktywowano jak w przykładzie 1. Po inkubowaniu (4 godziny w 40°C) wytrącony polimer zmieszano z roztworem zaktywowanej heparyny. Mieszaninę inkubowano przez noc, a następnego dnia roztwór żelu zobojętniono, rozdrobniono i odmyto od pozostałości reagentów.

Otrzymany żel był zdolny do wiązania czynnika wzrostu, między innymi podstawowego czynnika wzrostowego fibroblastów (bFGF), ale nie wykazywał zdolności do koagulacji pełnej krwi.

Przykład 8

Wytwarzanie żelu zawierającego dodatnio naładowane grupy chitozanowe

Inkubowanie mieszaniny 7,5 g polimeru kwasu hialuronowego z 2,5 g chitozanu (See Cure® Protan) przeprowadzono sposobem podanym w przykładzie 1. Po rozpuszczeniu i zobojętnieniu otrzymano skopolimeryzowany lepkosprężysty roztwór. Roztwór ten wykazywał zdolność przyspieszania gojenia ran po naniesieniu na gojącą się otwartą ranę.

Przykład 9

Wytwarzanie żelu sprzężonego sterycznie

Kwas hialuronowy (7,5 g) zaktywowano sposobem podanym w przykładzie la. W taki sam sposób zaktywowano 2,5 g dekstranu. Kwas hialuronowy wytrącono w metanolu i uzyskany osad zmieszano z 500 ml rozcieńczonego 0,5% roztworu zaktywowanego dekstranu. Po wymieszaniu oraz nastawieniu pH i stężenia soli uzyskano lepkosprężysty roztwór. Otrzymany roztwór (5 ml) wstrzyknięto do pochewki ścięgna Achillesa wykazującego okresowo stan zapalny w postaci bolesności i „trzeszczenia”. Po 4 tygodniach tego typu problemy ze ścięgnem Achillesa zanikły.

Przykład 10

Wytwarzanie żelu do stosowania jako preparat typu depot zawierający GMCSF

Produkt wytworzono sposobem podanym w przykładzie 5, z tym, że zamiast kalcytoniny użyto czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów, GMCSF (Leucomax®), mg/g polimeru.

Przykład 11

Wytwarzanie żelu zawierającego uśmiercony wirus grypy typu A2

Preparat wytworzono sposobem podanym w przykładzie 4, z tym, że zamiast EPO dodano 40 960 HAU uśmierconego wirusa końskiej grypy/100 ml rozcieńczonego 1% roztworu zaktywowanego polimeru. Po czterokrotnym zatężeniu preparat zawierał 1 600 HAU/ml. W wyniku zaszczepienia preparatem ponad 100 koni w związku z epidemią grypy stwierdzono, że

188 071 jest on bardzo skutecznym środkiem chroniącym przed infekcją, przy czym ochrona była utrzymywana przez długi okres czasu (ponad 6 miesięcy).

Przykład 12

Wytwarzanie świeżego żelu zawierającego zawiesinę żywych komórek

Hodowlę fibroblastów (5 ml) zmieszano ze 100 ml zobojętnionego roztworu z przykładu la. Mieszaninę natleniono i wysuszono do połowy objętości. Otrzymano lepkosprężysty roztwór zawierający żywe komórki.

Przykład 13

Wytwarzanie gęstego mikronizowanego żelu zawierającego małe peptydy

Do zaktywowanego zobojętnionego żelu z przykładu la dodano 5 mg peptydu o 12 aminokwasach. Żel odparowano w trakcie mieszania do uzyskania stężenia 10% i zawieszono w oleju mineralnym. Po dodaniu metanolu suche cząstki żelu odsączono i przemyto w celu oczyszczenia od resztek oleju.

Przykład 14

Wytwarzanie żelu zawierającego gęsty mikronizowany żel z małymi peptydami z przykładu 13

Do 1% roztworu zobojętnionego polimeru zaktywowanego w sposób podany w przykładzie la dodano mikrokulki z przykładu 13. Żel następnie odparowano do połowy objętości. Otrzymano jednorodny i trwały żel do iniekcji zawierający rozproszone drobne mikrokulki.

Przykład 15

Wytwarzanie żelu zawierającego kuliste perełki polimetakrylanu metylu (PMM) o wielkości 40-120 |im

Do 5 g polimeru rozcieńczonego do stężenia 1% oraz zobojętnionego i zaktywowanego sposobem podanym w przykładzie la dodano 100 mg kuleczek polimetakrylanu metylu (PMM). Po odparowaniu polimerycznego żelu do stężenia 3% otrzymano trwały lepkosprężysty żel do iniekcji.

Przykład 16

Wytwarzanie żelu zawierającego fragmenty PMM o wielkości 500 nm, do których przyłączono hydrofobowy antygen

Antygen hemaglutyniny otrzymany z wirusa A2 sposobem podanym w przykładzie 11 zaadsorbowano w wyniku hydrofobowego oddziaływania na 500 nm cząstkach PMM. Cząstki te dodano do 1% roztworu z przykładu 15, po czym objętość zmniejszono do połowy. Powstał trwały, jednorodny, lepkosprężysty żel użyteczny jako szczepionka o silnym działaniu wspomagającym.

Przykład 17

Porównanie stopnia ponownego pęcznienia przy swobodnym dostępie wody znanych żeli i żeli wytworzonych sposobem według wynalazku

Żele kwasu hialuronowego wytworzone sposobem według Laurenta i innych, 1963, oraz według przykładów 1 i 2, wysuszono do połowy objętości w stanie spęcznionym. Następnie żele wprowadzono ponownie do odpowiednich wyjściowych roztworów. Znane żele uległy spęcznieniu do wyjściowej objętości, podczas gdy kompozycje żelowe według przykładów 1 i 2 spęczniały jedynie nieznacznie (10%).

Przykład 18

Porównanie aktywności biologicznej EPO kopolimeryzowanej z kwasem hialuronowym z wytworzeniem żelu oraz żelu według przykładu 1, w którym EPO została zamknięta w wyniku zatężania pacjentów, w trakcie leczenia środkiem Eprex® (CILAG) z uwagi na anemię spowodowaną przewlekłą mocznicą, leczono przez 2 miesiące stosując w każdym miesiącu dawkę zgodnie z procedurą podaną w tabeli 1.

188 071

Tabela 1

Pacjent nr	1	2	3	4
Dawka IU	60000	70000	70000	50000
Miesiąc 1	Bezpośrednio zżelowany depot	Bezpośrednio zżelowany depot	Kontrolna	Kontrolna
Miesiąc 2	Kontrolna	Kontrolna	Zatężony	Zatężony

Bezpośrednio zżelowany depot: Sieciowany epoksydem w łagodnych warunkach w sposób podany w przykładzie 11, w obecności EPO

Kontrolna: EPO rozpuszczona w 4% kwasie hialuronowym o masie cząsteczkowej około 6 x 10⁶ z grzebienia koguta, wytworzona sposobem według opisu patentowego US 4 141 973 (Healon® Pharmacia).

Zatężony: EPO zamknięta w zaktywowanym żelu, zżelowanym w wyniku zatęzenia.

Jako dawkę wybrano całkowitą dawkę miesięczną normalnie niezbędną dla pacjenta w celu utrzymania poziomu hemoglobiny. Poziom EPO w surowicy oznaczano w regularnych odstępach czasu metodą immunochemiczną.

Wyniki podano w tabeli 2.

Znany sposób przedstawiania działania funkcyjnego preparatów typu depot obejmuje wyliczanie powierzchni pod krzywą (jednostki EPO x dni). W tabeli 2 podano również biodostępność w postaci poziomu hemoglobiny we krwi; 0= poziom zachowany, + = wzrost, a - = spadek.

Tabela 2

Pacjent nr/miesiąc	1/1	1/2	2/1	2/2	3/1	3/2	4/1	4/2
Powierzchnia pod krzywą	41	424	57	534	224	952	567	656
Poziom hemoglobiny	-	+	-	+	0	+	+	+

Na podstawie tych wyników można wywnioskować, że zamknięcie EPO w zagęszczonym depocie zapewniło największe możliwe uwalnianie w czasie wykonywania badań. Próby przeprowadzenia reakcji żelowania w obecności EPO spowodowały rozkład hormonu, tak że można było stwierdzić bardzo małe uwalnianie.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania usieciowanej biokompatybilnej polisacharydowej kompozycji żelowej drogą sieciowania rozpuszczalnego w wodzie polisacharydu w roztworze wodnym, z użyciem wielofunkcyjnego środka sieciującego, znamienny tym, że inicjuje się sieciowanie dającego się sieciować polisacharydu wybranego spośród glukanów glukozoaminy, w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego, zakłóca się sterycznie zajście do końca reakcji sieciowania przed wystąpieniem żelowania przez rozcieńczanie ośrodka wodnego, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, do uzyskania mniejszego stężenia polisacharydu w tym ośrodku, z wytworzeniem zaktywowanego polisacharydu; oraz przywraca się sterycznie niezakłócone warunki dla zaktywowanego polisacharydu przez odparowanie lub dializę ośrodka wodnego, w którym prowadzi się reakcję sieciowania, do uzyskania większego stężenia polisacharydu w tym ośrodku, i kontynuuje jego sieciowanie aż do uzyskania lepkosprężystego żelu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako glukan glukozoaminy stosuje się kwas hialuronowy.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się środek sieciujący wybrany z grupy obejmującej epoksydy, związki poliazyrydylowe i etery glicydylowe.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako eter glicydylowy stosuje się eter diglicydylowy 1,4-butanodiolu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję wyjściowego sieciowania w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego prowadzi się w ośrodku o odczynie alkalicznym, korzystnie o pH powyżej 9, drogą eteryfikacji.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję wyjściowego sieciowania w obecności wielofunkcyjnego środka sieciującego prowadzi się w ośrodku o odczynie kwaśnym, korzystnie o pH 2 - 6, drogą estryfikacji.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję sieciowania sterycznie zakłóca się przed przereagowaniem środka sieciującego.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie wytwarzania usieciowanej polisacharydowej kompozycji żelowej, korzystnie w warunkach fizjologicznego pH i fizjologicznego stężenia soli, zamyka się w niej substancję biologicznie czynną.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że substancję czynną zamyka się w kompozycji żelowej przez rozpuszczenie lub zdyspergowanie jej w zaktywowanym polisacharydzie przed doprowadzeniem tego polisacharydu do stanu niezakłóconego sterycznie.
10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że stosuje się substancję biologicznie czynną wybraną z grupy obejmującej hormony, cytokiny, szczepionki oraz substancje powodujące rozrost komórek i tkanek.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako substancję powodującą rozrost tkanek stosuje się polimer wybrany z grupy obejmującej kolagen, skrobię, dekstranomer, polilaktyd i ich kopolimery oraz ροΐϊ-β-hydroksymaślan i jego kopolimery.
12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się hormon wybrany z grupy obejmującej erytropoetynę i kalcytoninę.
13. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że stosuje się substancję biologicznie czynną zawierającą grupy funkcyjne reagujące z polisacharydem i zamyka się ją w strukturze żelu drogą reakcji chemicznej.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że substancję biologicznie czynną zawierającą grupy funkcyjne poddaje się wstępnej reakcji ze środkiem sieciującym polisacharyd,

188 071 korzystnie z takim samym środkiem sieciującym, który stosuje się do sieciowania polisacharydu.