CZ291281B6 - Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-gama-merkaptomethan-lyázový polypeptid a jeho pouľití - Google Patents

Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-gama-merkaptomethan-lyázový polypeptid a jeho pouľití Download PDF

Info

Publication number
CZ291281B6
CZ291281B6 CZ19961869A CZ186996A CZ291281B6 CZ 291281 B6 CZ291281 B6 CZ 291281B6 CZ 19961869 A CZ19961869 A CZ 19961869A CZ 186996 A CZ186996 A CZ 186996A CZ 291281 B6 CZ291281 B6 CZ 291281B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
metase
mtase
methionine
ala
leu
Prior art date
Application number
CZ19961869A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ186996A3 (en
Inventor
Tsutomu Nobori
Dennis A. Carson
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of CZ186996A3 publication Critical patent/CZ186996A3/cs
Publication of CZ291281B6 publication Critical patent/CZ291281B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Katalyticky aktivn L-methionin-L-deamino-.gama.-merkaptomethan ly zov² (MET zov²) polypeptid maj c schopnost degradovat methionin (MET), v²hodn rekombinantn . D le polynukleotid, kter² k duje tento polypeptid, farmaceutick² prost°edek pro chemoterapii sav ch malign ch bun k a souprava pro stanoven p° tomnosti nebo nep° tomnosti katalyticky aktivn a katalyticky inaktivn methylthioadenosin fosforyl zy (MTAzy) ve vzorku bun k.\

Description

Vynález se týká způsobu selektivní destrukce maligních buněk u savců na základě metabolického rozdílu mezi těmito buňkami a nemaligními (tj. „normálními”) buňkami. Konkrétně se týká ohrožení maligních buněk, kterým chybí enzym nutný k přeměně methylthioadenosinu na methionin degradací plazmového methioninu a homocysteinu.
Dosavadní stav techniky
Aminokyselina methionin (MET) je nezbytná pro růst normálních i maligních buněk. U určitých maligních buněk je tato potřeba absolutní, tzn. že bez adekvátní zásoby methioninu buňky umírají.
V savčích buňkách se MET získává ze tří zdrojů. Je možno jej získat z výživy nebo biochemickou syntézou MET z L-homocysteinu (homocystein) nebo methylthioadenosinu (MTA) (produkt polyamidové biosybtetické dráhy). V posledním případě se MTA převádí na MET pomocí methylthioadenosin fosforylázy (MTAza).
V poslední dekádě identifikovali výzkumníci četné maligní buněčné linie, kterým chybí MTAza a které tudíž nemohou převádět MTA a MET. Například Katamari a d., Proč. Nati Acad. Sci. USA 78: 1 219-1 223 (1981), uvádějí, že u 23% ze 3 studovaných lidských maligních nádorových buněčných linií chyběla detekovatelná MTAza, zatímco v každé ze 16 studovaných nemaligních buněčných linií byla aktivita MTAzy přítomna. MTAza-negativní buňky principiálně uspokojují svou potřebu MET konverzní homocysteinu. Není-li však k dispozici homocystein, buňky obvykle umírají.
Je známo, že L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyáza (ED 4.4.1.11; Metáza) degraduje nejen MET, ale také homocystein, Teoreticky je tedy možno zahubit maligní buňky, jimž chybí MTAza (tj. MTAza-negativní buňky) degradací plazmového MET a homocysteinu METázou. Lze předpokládat, že normální MTAza-pozitivní buňky budou uspokojovat svou potřebu MET další přeměnou MTA na MET.
Rudimentární verze tohoto přístupu byla navržena poprvé v r. 1972 v Kreis, Cencer Treat. Rprts. 63:1 069-1 072 (1972). Při použití 11 maligních buněčných linií v kulturách prostých MET byl Kreis schopen aplikací METázy na kultury inhibovat růst určitých maligních buněk. Kreis rovněž pozoroval, že po přídavku homocysteinu ke kultuře se 2 normální buněčné linie „zachránily“ před účinky nedostatku MET. Avšak přestože byly tyto studie in vitro povzbuzující, bylo Kreisem popsáno několik překážek, bránících úspěšnému použití METázy v chemoterapii in vivo, zahrnujících nedostupnost prostředků k zajištění přežití normálních buněk in vivo, potenciální imunogenicitu čištěného nebo částečně čištěného enzymu a nutnost aby enzym byl rezistentní vůči degradaci proteolytickými enzymy in vivo (Kreis, Chemotherapy (muggia, FM, ed. Haag, Boston a Londýn: Martinus-Nijihoff, 1983), str. 219-248).
Další překážkou vývoje úspěšného přístupu k vyvolávání nedostatku MET u maligních buněk je potřeba identifikovat, které malignity jsou vhodnými cíli terapie, tj. které malignity jsou MTAzanegativní. Za tímto účelem byl vyvinut test, který zjišťuje, zdaje malignita MTAza-negativní, ze stanovení, zda je v buněčné kultuře přítomna katalytická aktivita (Seidenfeld a d., Biochem, Biophys. Res. Commun. 95:1 861-1 866, 1980). Pro komerční nedostupnost radiochemického substrátu, potřebného pro test aktivity, však není dosud schůdné její použití při rutinních hodnoceních. Test aktivity navíc nepočítá s katalytickou labilitou MTAzy in vitro, jestliže
-1 CZ 291281 B6 detekuje, zda je v buněčné kultuře přítomen vůbec nějaký enzym bez ohledu na to, zda je katalyticky aktivní v době provádění testu.
Toto omezení testu aktivity by bylo možno překonat vývojem imunoanalýzy, která by byla dostatečně citlivá pro detekci relativně nepatrných množství enzymu. Ukázalo se však, že čištění enzymu MTAzy z přírodních zdrojů za účelem vývinu protilátek pro použití při uimunologické detekci MTAzy je pracné a poskytovat relativně špatné výsledky (Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12 324-12 329,1986).
I kdyby byly vyvinuty přiměřené prostředky pro detekci MTAza-negativních buněk, zůstává produkce dostatečné zásoby METázy z přírodních zdrojů stejně obtížnou jako produkce MTAzy. Produkce METázy jiným způsobem než čištěním netivního enzymu se dosud nezdařila zčásti proto , že gen pro METázu by l (do nynějších dnů) pouze částečně sekvenován (Nakayama a d., Biochem. 27:1 587-1 591, 1988).
Ze všech uvedených důvodů zůstává účinný přístup k vyvolání nedostatku MET in vivo v MTAza-maligních buňkách neuskutečnitelný. Tuto potřebu řeší tento vynález.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyázový (METázový) polypeptid, mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 5, nebo sekvenci v podstatě stejnou, a mající schopnost degradovat methionin (MET).
Výhodně se jedná o rekombinantní polypeptid.
Předmětem vynálezu je rovněž polynukleotid, který kóduje výše uvedený katalyticky aktivní METázový polypeptid, kteiý má nukleotidovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 4, nebo sekvenci v podstatě stejnou.
Dále je předmětem vynálezu farmaceutický prostředek pro chemoterapii savčích maligních buněk, které myjí absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza, který zahrnuje směs terapeuticky účinného množství výše uvedeného METázového polypeptidu a terapeuticky účinného množství methylthioadenosinu (MTA) ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
Vynález zahrnuje rovněž soupravu pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy (MTAzy) ve vzorku buněk savce, obsahující oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují s nukleotidovou sekvencí, která kóduje MTAzu, znázorněnou jako SEQ ID č. 1.
Předmětem vynálezu je rovněž použití směsi terapeuticky účinného množství výše uvedeného METázového polypeptidu a terapeuticky účinného množství MTA ve farmaceuticky přijatelném nosiči pro přípravu farmaceutického prostředku pro chemoterapii savčích maligních buněk, které mají absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza.
S použitím prostředku podle vynálezu se malignita, která byla určena jako MTAza-negativní, ošetřuje terapeuticky účinným množstvím METázy, přednostně rekombinantní METázy, a zejména rekombinační METázy konjugované s polyethylenglykolem nebo ekvivalentní molekulou. Konkrétně se METáza může podávat savci (přednostně člověku) v dávce, která sníží hladinu jeho plazmového MET v rozsahu postačujícím k ohrožení MTAza-negativních buněk nedostatkem methioninu (ke kterému obvykle dochází při asi< 10% hladiny methioninu před terapií). Normálním (MTAza-pozitivním) buňkám je MET dodáván v podstatě současným podáváním MTA.
-2CZ 291281 B6
S použitím vynálezu je možno rovněž provádět detekci MTAza-negativních buněk při malignitě. Konkrétně zahrnuje v jednom provedení produkci protilátek proti MTAze (včetně monoklonálních) a jejich použití při imunoanalýze na MTAzu. V jiném provedení zahrnuje detekci přítomnosti genu, který kóduje MTAzu, použitím analýzy na základě metody amplifikace nukleových kyselin, zejména polymerázové reakce (polymerase chain reaction, PCR).
Rekombinantní METáza může být získána izolací a klonováním genu kódujícího METázu, která umožňuje produkci podstatných množství METázy pro použití podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 představuje schéma metabolické dráhy syntézy polyamidů a redukce MTA MTAzou.
Obr. 2 znázorňuje porovnání MTAza-pozitivních a MTAza-negativních lidských a jiných než lidských buněčných linií, detekovatelných imunoblottingem.
Obr. 3 znázorňuje porovnání MTAza-pozitivních a MTAza-negativních lidských buněčných linií a primárních nádorů detekovaných imunoblottingem.
Obr. 4 znázorňuje porovnání růstu, vyvolaného u MTAza-negativních lidských buněk ošetřených METázou oproti buňkám kultivovaným v prostředí bohatém na methionin.
I. Způsob detekce MTAza-negativních buněk
Obr. 1 schematicky znázorňuje metabolické dráhy syntézy MET z MTA in vivo a degradace MET METázou. Jak výše uvedeno, k dosažení plného přínosu terapie rakoviny na základě nedostatku methioninu musejí být v cílové malignitě detekovány METza-negativní buňky. Za tímto účelem jsou dále popsány alternativní prostředky detekce MTAzy, které jsou vhodné pro použití podle vynálezu.
A: Imunoanalýza obsahu MTAzy
1. Produkce antigenní MTAzy a MTAzových peptidů
Protilátky, specifické pro MTAzu, se získají imunizací živočicha jiného než člověka antigenní MTAzou nebo MTAzovými peptuidy. Antigenní MTAzové peptidy mohou být obecně izolovány a čištěny ze savčí tkáně způsobem popsaným Ragnionem a d., J. Biol. Chem. 265:6 241-6 246 (1990). Příklad provedení tohoto postupuje uveden dále v příkladech provedení, odkazuje se rovněž na aminokyselinovou sekvenci plné délky MTA, která je zde uvedena jako SEQ ID. NO. 1.
2. Imunizace antigenními MTAzovými peptidy k vyvolání tvorby anti-MTAzových protilátek
Jakmile se získá antigenní MTAza nebo MTAzové peptidy, získají se protilátky k imunizujícímu peptidů zavedením peptidů do savce (jako je králík, myš nebo krysa). Pro ilustraci jsou v připojeném seznamu sekvencí uvedeny aminokyselinové sekvence dvou antigenních MTA peptidů jako SEQ ID. NO. 2 a 3. Protilátky, produkované králíky, imunizovanými těmito peptidy, vykázaly 50 % maximální odpovědi na čištěný MTA při ředění 1 : 1 500, resp. 1 :4000.
Pro imunizaci živočichů antigenními MTAzovými peptidy se přednostně používá imunizační protokol s vícerázovou injekcí (viz například Langone a d., ed., „Production of Antisera with Smáli Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections“, Methods of Enzymology
-3CZ 291281 B6 (Acad. Press, 1981)). Příznivou protilátkovou odpověď je možno získat například u králíků při intradermální injekci 1 mg antigenního MTAzového peptidů emulgovaného v kompletním Freundově adjuvans, po níž za několik týdnů následuje jedna nebo několik posilovačích dávek téhož antigenu v neúplném Freundově adjuvans.
Je-li to žádoucí, je možno imunizující peptid navázat na nosný protein konjugací s použitím známých metod. Běžně používané nosiče, které se chemicky navazují na peptid, zahrnují hemocyanin přísavky keyhole limpet (KLH), thyreoglobulin, bovinní sérový albumin (BSA) a tetanový toxoid. Navázaný peptid se pak použije k imunizaci živočicha (například myši nebo králíka). Jelikož se má v současnosti za to, že MTAza je zachovávána mezi savčími druhy, je použití nosného proteinu ke zvýšení imunogenicity MTAzových proteinů preferováno.
Polyklonální protilátky, produkované imunizovanými živočichy, mohou být dále čištěny, například vazbou a eluci na matrici, k níž je navázán peptid, proti němuž byly vyvolány protilátky. Odborníkům jsou známy různé metody, běžné v oboru imunologie pro čištění a/nebo koncentraci polyklonálních protilátek, stejně jako monoklonálních protilátek (viz například Coligan a d., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
Pro použití při detekci MTAza-negativních buněk jsou pro svou specificitu a snadnost produkce preferovány monoklonální protilátky. Pro přípravu monoklonálních protilátek je preferována imunizace myší nebo krys. Výraz „protilátka“ zde rovněž zahrnuje intaktní molekuly a jejich fragmenty, jako jsou například Fab a F(ab')2, které jsou schopné vázat epitopovou determinantu. V tomto kontextu se rovněž výraz „mAb podle vynálezu“ vztahuje na monoklonální protilátky specifické pro MTAzu.
Obecná metoda produkce hybridomů vylučujících monoklonální potilátky (mAb) je známa (Kohler a Milstein, Nátuře 256:495, 1975). Stručně řečeno zahrnovala metoda popsaná Kohlerem a Milsteinem izolaci lymfocytů z regionálních odtékajících mízních uzlin pěti různých pacientů' buď smelanomem, teratokarcinomem nebo rakovinou čípku, gliomu nebo plic, lymfocyty byly získány z chirurgických vzorků, spojeny a pak fúzovány s SHFP-1. Hybridomy byly podrobeny screeningu na produkci protilátky, která se vázala na rakovinné buněčné linie. Ekvivalentní metody lze použít k produkci a identifikaci mAb specifických pro MTAzu.
Potvrzení MTAzové specificity mezi mAb podle vynálezu je možno provádět pomocí relativně rutinních metod screeningu (například enzymová imunoanalýza ELISA) za účelem stanovení elementárního reakčního schématu příslušné mAb.
Bez zbytečné experimentální práce je rovněž možno hodnotit mAb za účelem stanovení, zda má stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, stanovením, zda testovaná mAb brání vazbě mAb podle vynálezu na MTAzu. Jestliže testované mAb soutěží s mAb podle vynálezu, což je patrné z poklesu vazby mAb podle vynálezu, pak je pravděpodobné, že se obě monoklonální protilátky vážou na stejný nebo blízce příbuzný epitop.
Další možností, jak zjistit, zda má mAb stejnou specificitu jako mAb podle vynálezu, je preinkubace mAb podle vynálezu s antigenem, s nímž normálně reaguje, a stanovení, zda testovaná mAb je inhibována ve své schopnosti vázat antigen. Je-li testovaná mAb inhibována, pak ve vší pravděpodobnosti má stejnou nebo blízce příbuznou epitopovou specificitu jako mAb podle vynálezu.
3. Postup imunoanalýzy prodetekci MTAza-negativních buněk
Jakmile se výše popsaným způsobem získají vhodné protilátky, použijí se k detekci MTAzy v malignitě. Příklad imunoanalýzy, vhodné pro tento účel (například imunoblotting) je blíže popsán dále v příkladu I. Odborníkovi v imunologii je však zřejmé, že MTAzu je možno
-4CZ 291281 B6 detekovat pomocí výše popsaných protilátek i v jiných formátech imunoanalýzy buď v kapalné nebo pevné fázi (je-li navázána na nosič).
Detekci MTAzy pomocí anti-MTAzových protilátek je možno provádět pomocí imunoanalýzy, které se provádějí postupným, obráceným nebo simultánním způsobem, včetně imunohistochemických analýz na fyziologických vzorcích. Vhodné postupy imunoanalýzy zahrnují kompetitivní a nekompetitivní protokoly, prováděné v přímém nebo nepřímém formátu. Příklady takových imunoanalýz jsou radioimunoanalýza (RIA) a sendvičová (imunometrická) analýza. Odborník zná nebo může bez nadměrného experimentování snadno určit další formáty imunoanalýzy.
Protilátky používané při imunoanalýzách mohou být kromě toho detekovatelně značeny,. Značka je látka, která může být kovalentně spojena nebo pevně asociována se sodnou nukleové kyseliny, což umožňuje sondu detekovat. Značkou může být například radioizotop, enzymový substrát nebo inhibitor, enzym, radioopakní látka (včetně koloidních kovů), fluorescenční látka, chemiluminiscenční molekula, Iiposomy, obsahující kteroukoli zvýše uvedených značek nebo specifický člen vazebného páru. Vhodná značka neztrácí během amplifikace vlastnost odpovědnou za detekovatelnost.
Odborníkům v oboru diagnostiky jsou známy vhodné detekovatelné značky pro použití v detekčních analýzách in vitro. Vhodné radioizotopy například zahrnují 3H, 125I, 131I, 32P, 14C, 35S. Amplifikované fragmenty, značené radioizotopem, mohou být detekovány přímo gama čítačem nebo denzitometrií autoradiogramů, Southemovým blottingem amplifikovaných fragmentů v kombinaci s denzitometrií. Příklady vhodných chemiluminiscenčních molekul jsou akridiny nebo luminol. Cílové sekvence hybridizované se sondami, derivatizovanými aktidiumesterem, jsou chráněny před hydrolýzou interkalací. Příklady vhodných fluorescenčních látek jsou fluorescein, fykobiliprotein, cheláty vzácných zemin, dansyl nebo rhodamin.
Příklady vhodných substrátů nebo inhibitorů enzymů jsou sloučeniny, které se specificky vážou na křenovou peroxidázu, glukózu, oxidázu, glukózu-6-fosfát dehydrogenázu, β-galaktosidázu, pyruvát kinázu nebo acetylcholinesterázu alkalické fosfatázy. Příklady radioopakních látek jsou koloidní zlato nebo magnetické částice.
Specifický vazebný pár zahrnuje dvě různé molekuly, přičemž jedna z nich má na svém povrchu nebo v dutině oblast, která se specificky váže na konkrétní prostorovou a polární organizaci jiné molekuly. Členové specifického vazebného páru se často označují jako ligand a receptor nebo ligend a antiligend. Je-li například receptorem, protilátka, je ligandem odpovídající antigenem. Další specifické vazebné páry dvojice hormon-receptor, enzym-substrát, biotin-avidin a glykolprotrein-receptor. Zahrnuty jsou rovněž fragmenty a části specifických vazebných párů, které si uchovávají vazebnou specificitu, jako jsou fragmenty imunoglobulinů, včetně fragmentů Fab apod. Protilátky mohou být buď monoklonální nebo polyklonální. Použije-li se člen specifického vazebného páru jako značka, zahrnuje výhodný dělicí postup afinitní chromatografii.
Protilátky mohou být rovněž navázány na nosič. Příklady známých nosičů zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, polyethylen, dextran, nylon, amylózy, přírodní a modifikované celulózy, polyakrylamidy, agarózy a magnetit. Charakter nosiče může být pro účely vynálezu buď rozpustný nebo nerozpustný. Odborníkovi jsou známy další vhodné nosiče pro vazbu protilátek neboje schopen je určit rutinními experimenty.
B. Detekce MTAza-negativních buněk analýzou na bázi PCR
Z důvodu relativní snadnosti a rychlosti detekce imunoanalýzou s použitím MTAza-specifických protilátek podle vynálezu je imunoanalýza výhodným prostředkem detekce MTAza-negativních buněk. Odborník si je však vědom, že k detekci přítomnosti MTAza-negativních buněk
-5CZ 291281 B6 v malignitě je možno použít dalších detekčních prostředků. Například na základě popisu sekvence nukleových kyselin uvedených v SEQ ID NO 1 by odborník mohl konstruovat oligonukleotidové sondy, které by hybridizovaly s DNA MTAzy přítomnou v buněčném vzorku. Naopak, protože se má za to, že deficit MTAzy je důsledkem genomické delece gemu, který by kódoval MTAzový protein, je možno předpokládat, že není-li v buněčném vzorku detekován žádný gen kódující MTAzu, jsou buňky MTAza-negativní.
Podrobný popis pracovního postupu pro amplifikaci a detekci genu MTAzy je uveden v dosud neukončené patentové přihlášce USA č. 08/176 855, podané 29.12.1993. Pasáž přihlášky č. 08/176 855, týkající se tohoto pracovního postupuje zde zahrnuta formou odkazu.
C. MTAza-negativní kandidáti na terapii nedostatkem MTAzy
Malignita, která je kandidátem na terapii podle vynálezu (tj. terapii vyvoláním nedostatku MET), je taková, v níž není detekovatelně přítomen protein MTAza, ať katalyticky aktivní nebo inaktivní. Ve všech dosud studovaných maligních buněčných liniích je MTAza-negativita (je-li přítomna) shodným lysém celé buněčné populace. Jinými slovy je možno očekávat, že jsou-li některé buňky v malignitě MTAza-negativní, budou MTAza-negativní všechny buňky v malignitě. Tato skutečnost souhlasí s dosavadním názorem, že deficit MTAzy je výsledkem delece genu spíše než mutace. Homogenita MTAza-negativity v malignitě by měla významně zvyšovat účinnost vyvolání nedostatku MET jako terapie rakoviny oproti terapiím zaměřeným na heterogenní rysy, jako jsou nádorové antigeny, na něž je cílena terapie monoklonálními protilátkami. Pro účely vynálezu však postačuje, je-li malignita na MTAzu „v podstatě deficitní“, tzn. že neobsahuje detekovatelně množství proteinu MTAzy.
Lidské malignity, které se v současnosti považují za v podstatě deficitní na MTAzu, zahrnují:
Tabulka I
malignita deficit MTAzy zjištěn:
nemalobuněčné rakoviny plic: imunoanalýzou*
A-549 (adenosarkom) Sk-Lu-1 (adenosarkom)
H322 (bronchoalvedor
H1334 (velkobuněčný karcinom)
H1437 (adenosarkom)
H1581 (velkobuněčný karcinom)
buněčné linie mozkových nádorů*: imunoanalýzou*
A172
U-87MG U-138MG Hs683
primární mozkové nádory: imunoanalýzou ♦
astrocytom multiformní glioblastom oligostrocytom
lymfomy a leukemie: imunoanalýzou ♦
CEM (akutní lymfocytické leukemie) K-T-l (akutní lymfocytická leukemie) NALL-1 (akutní lymfocytická leukemie) K562 (chronická myeloidní leukemie)
-6CZ 291281 B6 deficit MTAzy zjištěn:
Tabulka I - pokračování malignita
DHL-9 (maligní lymfon)
HSB2 (akutní lymfoxytická leukemie)
Jiné:
sarcinosarkom Walker 256
Jurkat
K562
Capan-1 (adenosarkom pankreatu) klinickým důkazem” imunoanalýzou
imunoanalýzou
Legenda:
získáno z Američan Type Culture Collection, Rockville, MD., uvedeno Kriesem a d., Cancer Res. 33:1 866-1 869 (1973), uvedeno Rangionem a d., Biochem. J. 281:533-538 (1992), uvedeno Kriesem a d., Cancer Trmt. Rpts. 63:1 069-1 072 (1979), ♦ deficit MTAsy ve všech ostatních malignitách byl detekován a zaznamenán Noborim a d. v Cancer Res. 53:1 098-1 101 (1993) a v Cancer Res. 51:3 193-3 197(1991).
Pomocí zde popisovaných detekčních metod je odborník schopen bez přílišného experimentování detekovat deficit MTAzy v dalších malignitách.
II. Terapie nedostatkem MET
A. Produkce MEtázy
Pro použití v metodách podle vynálezu je vyžadován zdroj jak MTA, tak METázy. Prostředky pro získání MTA jsou popsány výše. METáza se pro použití v metodách podle vynálezu čistí z mikroorganismů, zahrnujících Trichomonas vaginalis (Lockwood a d., J. Biochem. 279:675-682, 1991), Clostridium sporogenes (viz například výše Kries a d., 1 867; EC4.4.1.11) a Pseudomonas putidaQ4akayama ad., Biochem. 2ΤΛ 587-1 591, 1988).
Pomocí knihovny cDNA konstruované zP. putida byla identifikována plná délka sekvence nukleotidů pro METázu a je uvedena v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 4; sekvence aminokyselin je uvedena jako SEQ ID NO 5.
S touto informací je možno METázu snadno syntetizovat nebo experimovat z klonu DNA známými metodami, jaké jsou popsány výše s ohledem na MTAzu. Podrobný popis klonování a exprese v E. coli je uveden dále v příkladech II a lil.
V terapeutické metodě podle vynálezu je možno použít čištěné, částečně čištěné, syntetizované nebo rekombinanční METázy, avšak z důvodu snadného získání a relativně nízké imunogenicity je preferována rekombinanční METáza. Imunogenicitu enzymu je možno dále snížit, a přednostně se to provádí navázáním na polyethylenglykol (PEG) nebo na ekvivalentní biologicky kompatibilní molekulu, je možno očekávat, že navázání na PEG rovněž snižuje poločas existence konjugátu METázy in vivo.
Konjugát PEG-METáza je možno vytvořit kovalentním navázáním PEG na enzym, jak je popsáno pro L~asparagen (viz například Benedich a d., Clin. Exp. Immunol. 48:273-278, 1982). Metody navázání PEG na proteiny jsou známy a nejsou zde proto podrobněji popisovány. Na základě výsledků klinických pokusů na lidech při léčbě nehodgkinovského lymfomu pomocí L-asparaginázy navázané na PEG nelze očekávat, že by vazba METázy na PEG významně
-7CZ 291281 B6 snižovala její aktivitu in vivo (viz výsledky in vivo získané s PEG-L-asparagináza, Muss a d., Invest. New Drugs 8:125-130, 1990). odborník si je však vědom, že existují další prostředky prodloužení poločasu existence proteinů in vivo, které mohou být vhodné pro použití u METázy a které zahrnují, aniž by se však na ně omezovaly, glykosylaci a sukcinylaci.
B. Terapeutické metody
Malignity, které jsou v podstatě deficitní na MTAzu, se podle vynálezu částečně ošetřují podáváním METázy. Přednostně se jedná o ty malignity, které je možno léčit regionální chemoterapií, tzn. takové, kde malignita je lokalizována a obsažena v oblasti těla, která je přístupná intraarteriální infuzí, nebo zaváděním METázy topickou, transdermální nebo ekvivalentní cestou přímo do místa malignity. Příklady malignit, které jsou přístupné regionální chemoterapii, jsou melanomy, rakovina vaječníků (peritoneálním katétrem) a rakovina močového měchýře (uretrálním katétrem). další malignity, které je možno ošetřovat regionální chemoterapií podle vynálezu, jsou-1 i MTAza-negativní, jsou známy onkologickým odborníkům.
Odborník si je vědom, že terapeutické přípravky podle vynálezu je možno rovněž podávat systemicky. Je však nutno upravit dávkování ke kompenzaci clearance přípravků a potenciální toxicity vůči normálním buňkám. Zejména je nutno přísně sledovat klinické důkazy nedostatku methioninu v normálních buňkách a podle potřeby jej vyrovnávat podáváním dalšího množství MTA.
Malignity, v podstatě deficitní na MTAzu, se podle vynálezu ošetřují takto:
METáza se podává savci přednostně člověku) parenterálně, přednostně intraarteriální infuzí. Podává se ve farmaceuticky přijatelném nosiči, který může zahrnovat sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako je olivový olej, a injekční organické estery, jako je ethyloleát. Vhodné nosiče zahrnují vodu, alkoholické vodné roztoky, emulze nebo suspenze včetně solného roztoku a pufrovaných médií. Jak je uvedeno výše, METáza je ke snížení imunogenicity přednostně konjugována s PEG.
Parenterální vehikula zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, laktátované Ringerovo médium nebo fixované oleje. Intravenózní vehikula zahrnují tekuté a živné doplňky, elektrolytové doplňky (například na bázi Ringerovy dextrózy) apod. Mohou být přítomny rovněž konverzační a jiné přísady, například antimikrobiální, antioxidační nebo chelatační prostředky a inertní plyny apod.
Dávkování METázy se může pohybovat od asi 10 do 20 000, přednostně od asi 5 000 do 6000 jednotek/m2 (nebo níže, aplikuje—li se intraarteriální infuzí) v jedné nebo několika dávkách týdně v jednom nebo několika dnech. Obvykle lze očekávat, že METáza má u savce clearanci do asi 24 h po podání; použitím prostředků prodloužení poločasu existence, například konjugace s PEG, je možno tento poločas prodloužit o několik hodin až několik dní. Měla by být tedy monitorována hladina plazmového methioninu savce a podle potřeby by měly být podávány další dávky METázy k dosažení terapeuticky významného snížení koncentrace methioninu v plazmě savce. Takové snížení bude dostatečné k vyvolání detekovatelného poklesu objemu MTAza-negativních buněk, tj. poklesu objemu maligních buněk nebo nádorového zatížení savce. Dávka, kterou se dosahuje tohoto účinku, se považuje za „terapeuticky účinnou“ dávku. Na základ studií in vivo na hlodavcích s částečně čištěnou METázou lze obecně očekávat, že terapeuticky účinná dávka je taková, která snižuje hladinu methioninu v plazmě pacienta na asi < 10 % příslušné hladiny před terapií.
Hladinu plazmového methioninu ( a její změny) je možno monitorovat periodickými (přednostně každodenními) testy in vitro na krevních vzorcích odebíraných pacientovi, jemuž je aplikována METáza, v průběhu jejího podávání. Obecně je možno na základě studií prováděných na
-8CZ 291281 B6 hlodavcích očekávat, že hladina methioninu v plazmě se na hodnotu < 10 % příslušné hladiny před terapií sníží během asi 1 h podávání METázy. testy na plazmový methionin jsou známy; například je možno stanovit koncentraci methioninu ve vzorku krve metodou rozdělovači plynové chromatografie (GLC) esterifikovanych aminokyselin (n-butylester), která je popsána vRoach a d., J. Chromatog: 44:269-278 (1969). Jiné ekvivalentní postupy detekce methioninu v plazmě jsou odborníkovi známy neboje může snadno nalézt.
Je nutno upozornit, že METáza nemůže degradovat intracelulámí methionin. Proto jsou MTAza-pozitivní buňky s přiměřenou zásobou MTA pro tvorbu intracelulámího methioninu obvykle schopny přežít redukci exogenního methioninu METázou. Naopak MTA-negativní buňky s absolutní potřebou methioninu obvykle bez zásoby exogenního methioninu (nebo L-homocysteinového substrátu pro methionin, který je také degradován METázou) nepřežijí úbytek methioninu v plazmě.
Účinnost této terapie je možno potvrdit a monitorovat pomocí jakéhokoli klinického důkazu snížení buněčného objemu malignit}' (zjišťovaného známými prostředky) a/nebo periodickou detekcí objemu MTAza-negativních buněk v malignitě pomocí zde popsaných detekčních prostředků. Na základě údajů ohledně použití L-asparaginázové terapie u lidí je možno očekávat, že toxicita METázové terapie bude značně nízká a může spočívat primárně v alergických reakcích, léčitelných prostředky, známými klinickému odborníkovi, například podáváním epinefrinu.
MTA se tedy podává savci v podstatě souběžně s METázou. Přednostně se MTA a METáza podávají současně. Protože MTA se nechová jako substrát pro METázu, mohou být obě látky spolu kombinovány v jednom farmaceuticky přijatelném nosiči. Alternativně je možno MTA podávat do asi 24 h po podání METázy (přednostně dříve) pro „záchranu“ MTAza-pozitivních buněk, jejichž endogenní zásoba methioninu začíná být vyčerpána.
Dávka MTA, potřebná k záchraně normálních buněk, se liší v závislosti na různých klinických faktorech, zahrnujících umístění malignity, objem MTAza-negativních buněk v malignitě, délku METázové terapie a dostupnost MET pro pacienta ve výživě. Obecně se však MTA podává v dávkách, dostatečných k udržení hladiny methioninu v plazmě na asi 1 až 10 μΜ.
Příklady provedení vynálezu
K bližšímu osvětlení provedení vynálezu, který je výše podrobně popsán, jsou uvedeny příklady, které však nelze chápat jako omezující rozsah vynálezu, který je definován v připojených patentových nárocích.
Příklad I
Imunoanalýza na MTAzu
A. Produkce protilátek proti MTAze
MTAza byla čištěna z hovězích jater, jak uvádí výše citovaný Rangione a d. Z izolovaného enzymu bylo konvenčními technikami sekvenováno několik tryptických peptidů. Na základě získaných sekvencí byly syntetizovány peptidy 40 ( o délce 18 aminokyselin, viz SEQ ID NO 2) a 51 (o délce 14 aminokyselin viz SEQ ID NO 3) modifikaci známé Merrifíeldovy metody syntézy v pevné fázi (viz například Chen a d., Proč. Nat7 Acad. Sci. USA 81:1 784-1 788,1984). Všechny peptidy obsahovaly na karboxylovém konci cysteinový zbytek pro usnadnění chemické vazby na nosný protein KLH pomocí m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidového esteru.
-9CZ 291281 B6
Pomocí konjugátů peptid-KLH byli ve dvouměsíčních intervalech imunizováni novozélandští bílí králíci (dva králíci pro jeden peptid). Počáteční injekce obsahovaly 1 mg konjugátu syntetický peptid-KLH emulgovaného ve Freundově kompletním adjuvans. Posilovači injekce obsahovaly 1 mg antigenu v nekompletním Freundově adjuvans. Po 3 až 4 injekcích byla séra částečně přečištěna 50% nasyceným roztokem síranu amonného a byla podrobena screeningu na anti-peptidovou a anti-MTAzovou reaktivitu pomocí ELISA.
Konkrétně byly mikrotitrační plotny předem povlečeny peptidy nebo MTAzou v koncentraci 10 pg/ml v BBS (0,2 M boritanu sodného-0,15 M NaCl, pH 8,5) a ponechány přes noc při 4 °C. Plotny byly jednou promyty BBS s obsahem 0,05 % Tween 20 a pak byly inkubovány 4 h s BBS, obsahujícím 1 % bovinního sérového albuminu, pro blokování nespecifických vazebných míst. Pak byla v 0,1 ml alikvotech aplikována různá ředění kontrolního séra nebo antiséra proti peptidu a podrobena inkubaci přes noc. Plotny byly dvakrát promyty BBS s obsahem 0,05 % Tween20 a pak na 1 h exponovány kozímu anti-králičímu imunoglobulinu F(ab')2, značenému alkalickou fosfázou (Jackson Laboratories, lne., West Groove, PA), ve zředění 1:1 000 v BBS. Po promytí ploten bylo do každé jamky přidáno 0,2 ml 0,1 M />-nitrofenylfosfátu disodného v 0,1 M NaHCOj, pH 9,0. Po 30 min byla měřena absorpce při 405 nm.
B. Pracovní postup imunoblottingové analýzy na imunoreaktivní MTAzu
Několik lidských buněčných linií a nádorových biopsii bylo hodnoceno v přítomnosti MTAza-negativních buněk (viz tabulka 1, položky označené „imunoanalýzou“). Jiný vzorek, který testoval MTAza-pozitivní buňky, byly BV-173 (chronická myeloidní leukemie, „CML“) Molt-16 (akutní lymfocytická leukemie, „ALL“), Molt-4 (ALL), U397 (histiocytický lymfom), SUP-T8 (ALL), U-373MG (glioblastom) a T98G (glioblastom).
Buněčné extrakty, připravené z enzym-pozitivních buněk, byly podrobeny elektroforéze na 12,5% polyakrylamidovém gelu s obsahem 0,1% dodecylsulfátu sodného spolu s různými množstvími MTAzy, která byla čištěna, jak výše uvedeno, z hovězích jater.
Konkrétně byly surové buněčné extrakty (10 až 150pg/pruh) rozděleny elektroforézou na 12,5% polyakrylamidových gelech s obsahem 0,1 % dodecylsulfátu sodného. Po elektrotransferu na nitrocelulózové membrány (0,45 mm, Bio-Rad, Richmond, CA) byla nespecifická vazebná místa blokována 3% práškového mléka v BBS. Proteiny pak byly po dobu 16 h při teplotě místnosti sondovány antiséry ve zředění 1:500 v BBS s 3 % práškového mléka. Po intenzivním promytí proteinů pomocí BBS byly vazbou 125I-protein A (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) po dobu 1 h detekovány reaktivní pásy. Membrány byly promyty a přeneseny na papírové ubrousky a vystaveny při -70 °C filmu Kodak XAR-5™.
Na autoradiogramech byly denzitometrem (Bio-Rad) skanovány pásy a kvantifikovány pomocí kalibrační křivky získané z imunoreaktivních pásů čištěného enzymu.
C. Výsledky
U neplicních buněčných linií a biopsii (tj. v gliomech) bylo 67 % (4 ze 6) zcela deficitních na imunoreaktivní enzym (obr. 2). Ze Šesti postupných bioptických vzorků z lidských gliomů s různými histologickými charakteristikami (tabulka I) bylo pět zcela deficitních (obr. 3). Kontrolní pokusy ukázaly, že normální lidský mozek má hojnou MTAzovou aktivitu (obr. 3, pruh 7). Úplný deficit MTAzy je tedy v lidských gliomech společnou a specifickou metabolickou abnormalitou.
Z 19 testovaných buněčných linií nemalobuněčné rakoviny plic MTAza zcela chyběla v 6 buněčných liniích (viz tabulka I a obr. 4).
-10CZ 291281 B6
Příklad II
Klonování METázy z Pseudomonas putida
S odkazem na částečnou sekvenci aminokyselin MTAzy, publikovanou Wakayamou a d., Biochem. 27:1 587-1 591, 1988) byly navrženy degenerované oligonukleotidové primery a použity v PCR analýze ne gen pro METázu.
Při této PCR analýze se amplifikoval fragment o přibližně 300 bp. Produkt PCR 300 bp byl subklonován do plazmidu pBluescript II KS (Stratagene, San Diego). Pomocí inertní oligonukleotidové sondy k produktu PCR byla Southemovým blottingem tohoto subklonovaného produktu PCR potvrzena identita toho fragmentu jako genu METázy. Další Southemův blotting ukázal, že tento fragment, vytvořený pomocí PCR, hybridizoval s fragmentem Bgl II 5,0 kb v DNA Pseudomonas putida.
Na základě těchto výsledků byla konstruována knihovna bakteriofágové genomové DNA, obsahující genomovou DNA Pseudomonas putida. Pseudomonas putida, digerována Bgl II, byla podrobena elektroforéze na 0,8% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání. Byly vyříznuty fragmenty Bgl II o velikosti v rozmezí 4 kb až 6 kb a čištěny z gelu. Pomocí KlenoWova fragmentu byly fragmenty Bgl II částečně zarovnány a subklonovány do bakteriofágového vektoru yFix II. Tento vektor byl digerován s Xho I a částečně zarovnán Klenowem. Knihovna byla balena do bakteriofágových částic pomocí balicího extraktu gigapack od Stratagene. Po obalení byla knihovna amplifikována a titrována.
Za účelem izolace kompletního genu METázy byla tato knihovna podrobena screeningu fragmentem vytvořeným pomocí PCR. Po screeningu 200 000 klonů bylo izolováno osm nezávislých primárních klonů. Z těchto osmi klonů byly pouze dva skutečně pozitivní a jedinečné. Jeden klon obsahoval inzert o velikosti 5,1 kb a druhý obsahoval inzert o velikosti 5,9 kb. Tyto inzerty byly subklonovány do pBluescript II KS a pak mapovány a sekvenovány. Stanovili jsme, že sekvence genu METázy má 1615 bp (viz SEQ ID NO 4).
Příklad III
Exprese rekombinanční METázy
Gen rekombinanční METázy byl exprimován ve vektoru C5, což je tentýž vektor, který byl použit pro expresi MTAzy (viz například příklad VII neukončené přihlášky USA č. 08/176 855, podané 29.12.1993). K inokulaci o objemu 50 ml kultury byla použita bakteriální kultury v malém i velkém měřítku bylo použito standardní médium LB, doplněné 50 pg/ml ampicilinu. 50ml inokulovanéá kultura byla inkubována přes noc při 37 °C. Pak byla kultura lOOnásobně naředěna do čerstvého média LB. Ve velké kultuře (11) byly buňky pěstovány po dobu 1,5 h při 37 °C za intenzivního třepání. K vyvolání exprese METázy byl k velké kultuře přidán izopropylthio-p-D-galaktosid [IPTG] v konečné koncentraci 0,01, 0,1 a 1 mM a kultury byly inkubovány další 4 h. Bylo zjištěno, že optimální koncentrace IPTG pro expresi proteinu je 1 mM.
Po 4 h od přídavku IPTG byly buňky shromážděny a odděleny odstředěním při 19 000 g po dobu 10 h při 4 °C. Supematant byl odstraněn a peleta byla suspendována a promyta chladným solným roztokem a pak znovu odstředěna. Resuspendovaná peleta buněk byla promyta ve 100 až 200 ml pufru s 20 mM fosforečnanu draselného o pH 7,5, obsahujícího 15 μΜ 2-merkaptoethanolu. Bylo přidáno 1 mM EDTA a 30 μΜ pyridoxal-5'-fosfátu (pufr A) a pak byla peleta znovu odstředěna. Promytá resuspendovaná (v pufru) suspenze buněk byla vložena do bomby na rozrušování buněk. Rozrušování buněk bylo prováděno po dobu 20 min s použitím tlaku N2 2200 psi. Lyžované buňky byly odstřeďovány 20 min při 4 °C při 43 000 g. Supematant z buněčného extraktu byl dále čištěn na sloupci s afinitou barvivo-ligand.
-11 CZ 291281 B6
Buněčný extrakt (10 ml) byl vložen na sloupec (12 x 2,6 cm) gelu „DYEMATRIX“ [Orange A] (Amicon lne., Beverly, MA). Kolona byla plněna a ekvilibrována podle pokynů výrobce. Po nanesení vzorku byla kolona propláchnuta 5násobným objemem pufru A k odstranění nenavázaného podílu. Po tomto stupni byl navázaný podíl eluován lineárním gradientem 0 až 1,5 M KC1 v pufru A. Byly shromážděny frakce po 10 ml a podrobeny analýze na enzym γ-lyázu. Frakce obsahující hlavní pík methionin γ-lyázové aktivity byly spojeny a zkoncentrovány na přístroji „CENTRICON 30“ (Amicon lne.) na 2 až 3 ml.
Ke koncentrovaným frakcím (0,314 g/ml) byl přidán pevný (NH4)2SO4 do konečné koncentrace 2,4M, vzorek byl odstřeďován 10 min při 13 000 g a supematant byl přefiltrován přes filtr acrodis 0,45 pm (Amicon, lne.), načež byl nastříknut na sloupec FPLC s hydrofobní interakcí Alkyl „SUPEROSE“ (agaróza) Hr5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 2,4M (NH4ESO4, rozpuštěným v pufru A, použitém pro předchozí stupně. Navázaný protein byl eluován s lineárně klesající koncentrací (NH4)2SO4 (průtok 0,5 ml/min). Frakce, obsahující METázovou aktivitu, byly spojeny a zkoncentrovány výše uvedeným způsobem, Koncentrace proteinu byla měřena metodou, popsanou Bradfordem.
Čistota enzymového preparátu byla kontrolována pomocí 1 mm gelu SDS s 10% glycin-tris (Novex, San Diego, CA). Metázová aktivita byla analyzována měřením produkce 2-ketomáselné kyseliny podle návodu Esakiho & Škody (Meth. Enzymol. 143:459-465, 1987), který je zde zahrnut. Konečný enzym měl specifickou aktivitu 300 U/mg, kde 1 U = 1 μΜ produktu, vzniklého za minutu.
Příklad IV
Selektivní ohrožení MTAza-negativních buněk v buněčných liniích nemalobuněčné rakoviny plic
MTAza-negativní buněčné linie nemalobuněčné rakoviny plic, uvedené v příkladu I, byly in vitro v buněčné kultuře podrobeny terapeutickému působení METázy a MTA podle vynálezu. Konkrétně byly enzym-pozitivní (SK-MES-1) a negativní (A-549) buněčné linie kultivovány 4 dny v (a) médiu obsahujícím methionin, doplněném 10 % dialyzovaného koňského séra, (b) v médiu zbaveném methioninu, doplněném 10% dialyzovaného koňského séra, a (c) v médiu zbaveném methioninu, doplněném 10% dialyzovaného koňského séra a 16 μΜ MeSAdo. Proliferace obou buněčných linií, zvláště enzym-negativních buněk A-549, byla výrazně retardována v médiu s chybějícím methioninem (27 %, resp. 3,3 % růstu kontroly u buněk SK-MES-1, resp. A-549). Když byl ke stejnému médiu přidán MTA, zvyšoval růst enzym-pozitivních buněk SK-MES-1 (77 % růstu kontroly). Proliferace enzym-negativních buněk A-549 však nebyla v přítomnosti MTA podpořena (4,3 % růstu kontroly; tabulka II).
Z těchto údajů vyplývá, že růst buněk, negativních na MeSAdo fosforylázu, může být selektivně blokován v médiu zbaveném methioninu, doplněném MeSAdo.
růst (% kontroly)15
bez methioninu
buněčná linie statut enzymu3 bez MeSAdo s MeSAdo
SK-MES-1 + 27 ± 2,6 77 ± 4,7
A-549 3,3 ± 0,6 4,3 ± 1,1
+ přítomen, - nepřítomen, procento růstu kontroly = 100 x (růst buněk v médiu zbaveném methioninu s MTA nebo bez MTA) / (růst buněk v médiu s obsahem methioninu).
- 12CZ 291281 B6
Příklad V
Nedostatek methioninu u lidských maligních buněk s rekombinanční METázou
Pro studium antiproliferativních účinků rekombinanční METázy, získané podle příkladů II a III, byly lidské buňky SK-MES-1 a A-549 kultivovány v médiu DMEM a v 10% dialyzovaném fetálním bovinním séru doplněném 0,06 U/ml rekombinační METázy. Po 3 dnech byla zjišťována proliferace buněk. Účinky METázy byly vyjádřeny jako procento růstu buněk v médiu bez přidávaného enzymu.
Jak je znázorněno na obr. 4, růst buněk se v médiu, doplněném METázou, zvýšil v případě enzym-pozitivního média (SK-MES-1) o 26,6 % a v případě enzym-negativního média (A-549) o 2,96 %. Jestliže však bylo přidáno 20 QM MTA jako alternativní zdroj buněčného methioninu, obnovil se růst u enzym-pozitivních buněk na 61,4% hodnoty kontroly, zatímco u enzym-negativních buněk poklesl na 2,0 %.
PŘEHLED SEKVENCÍ
SEQ ID č. 1 je aminokyselinová sekvence pro plnou délku MTAzy.
SEQ ID č. 2 je aminokyselinová sekvence antigenního MTAzového peptidu.
SEQ ID č. 3 je aminokyselinová sekvence aktigenního MTAzového peptidu, který se liší aminokyselinovou sekvencí od peptidu SEQ ID č. 2.
SEQ ID NO 4 je nukleotidová sekvence polynukleotidu kódujícího METázu.
SEQ ID NO 5 je aminokyselinová sekvence METázy předpokládaná z nukleotidové sekvence SEQ ID NO 4.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB SELEKTIVNÍHO VYVOLÁVÁNÍ NEDOSTATKU METHIONINU V MALIGNÍCH BUŇKÁCH U SAVCŮ (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) KORESPONENČNÍ ADRESA:
(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5* Floor (C) MĚSTO: Los Angeles (D) STÁT: Califomia (E) ZEMĚ: USA (F) POŠT. KÓD: 90012 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
-13CZ 291281 B6 (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US (B) DATUM PODÁNÍ:
(C) KLASIFIKACE:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:
(A) JMÉNO: Berliner, Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5555-286 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAX: 213-977-1003 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2763 párů bází (B) TYP: nukleov8 kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatáza (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..2763
-14CZ 291281 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 1:
TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACAIATTTG60
AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG120
ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CrGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT180
TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT240
TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG 7CAACTACCA300
GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG360
TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA420
CANHNHNNMX NNHNNNNNNH GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT480
TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT540
GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT600
TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT660
TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG720
GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG780
GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT840
ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT THNNHNNNNM NNNNNNNNNK900
AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC960
TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG1020
GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG1080
GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA1140
ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA1200
GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT1260
GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA1320
AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA1380
GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT1440
TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTAMM NNNNNNNNNN KNNNNHNNNM NNTACCCTAC1500
ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG1560
GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC1620
-15CZ 291281 B6
AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680 TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740 AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800 TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860 WCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTAC1AC7 ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920 AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGAHNX KKNKNNXNNN NNAATAAACA 19B0 ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040 CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100 AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160 TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT ΤΤΤΠΤΤΤΤΤ AACAAACATC 2220 TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280 CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340 CATTCTAATT CEAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400 ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460 TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520 AETAAEATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580 CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640 CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700 GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG 2760 TAC 2763
-16CZ 291281 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..17 (xi) POPIS SEKVENCE:SEQ ID NO 2:
Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu
10 15
Glu Gly (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:
Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu
5 10
-17CZ 291281 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1615 párů bází (B) TYP: nukleov8 kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:
(B) KLON: methionin-gama-lyáza (ix) RYS:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 304..1497 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:
-18CZ 291281 B6
ATAGGATGGC CTGGTAGCCA GTGATATAGC AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGCCACCTGG TTGTCCTGCA AGGCGGCGAG CAGGGCGCGG TGCCCTCCTG GTCCGTTAAT TATTGTTTTT TTTTGGAAAA AATCGGGCAG CTCGGTGGCA
CGTTGTCTTC CAGCAGCTTG ACCCGGCGCC60
TCGGCAAGTT CGGCGACGGT TAGGCGGGCG120
TCGGTGCGGT CGAGGCTTGA AGGCATGTTT180
GTTCCAGCAA GCACGCAGAT GCGTGGGCAA240
TAAGCTTATA ACAAACCACA AGAGGCTGTT300
GCC ATG Met CGC GAC TCC CAT AAC AAC Asn ACC GGT TTT TCC ACA CGG GCC Ala ATT Ile 15 348
Arg Asp Ser His 5 Asn Thr Gly Phe 10 Ser Thr Arg
1
CAC CAC GGC TAC GAC CCG CTT TCC CAC GGT GGT GCC TTG GTG CCA CCG 396
His His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro
20 25 30
CTG TAC CAG ACC GCG ACC TAT GCC TTC CCG ACT GTC GAA TAC GGC GCT 444
Val Tyr Gin Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gty Ala
35 40 45
GCG TGC TTC GCC GGG GAG GAG GCG GGG CAC TTC TAC AGC CGC ATC TCC 492
Ala Cys Phe Ala oty Glu Glu Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser
50 55 60
AAC CCC ACC CTG GCC TTG CTC GAG CAA CGC ATG GCC TCG TTG GAG GGT 540
Asn Pro Thr Leu Ala Leu Leu Glu Gin Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly
65 70 75
GGT GAG GCG GGA TTG GCG CTG GCG TCG GGG ATG GGA GCC ATT ACT TCG 588
Gly Glu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser Gly Met Gly Ala Ile Thr Ser
80 85 90 95
ACC CTC TGG ACC CTG CTG CGG CCT GGT GAT GAG CTG ATC GTG GGG CGC 636
Thr Leu Trp Thr Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu Ile Val Gly Arg
100 105 110
ACC TTG TAT GGC TGC ACC TTT GCG TTC CTG CAC CAT GGC ATT GGC GAG 684
Thr Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu
115 120 125
TTC GGG GTC AAG ATC CAC CAT GTC GAC CTT AAC GAT GCC AAG GCC CTG 732
Phe Gly Val Lys Ile His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu
130 135 140
AAA GCG GCG ATC AAC AGC AAA ACG CGG ATG ATC TAC TTC GAA ACA CCG 780
Lys Ala Ala Ile Asn Ser Lys Thr Arg Met Ile Tyr Phe Glu Thr Pro
145 150 155
GCC AAC CCC AAC ATG CAA CTG GTG GAT ATA GCG GCG GTC GTC GAG GCA 828
Ala Asn Pro Asn Met Gin Leu Val Asp He Ala Ala Val Val Glu Ala
160 165 170 175
GTG CGG GGG AGT GAT GTG CTT GTG GTG GTC GAC AAC ACC TAC TGC ACG 876
Val Arg Gly Ser Asp Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr cys Thr
180 185 190
CCC TAC CTG CAG CGG CCA CTG GAA CTG GGG GCA GAC CTG GTG GTG CAT 924
Pro Tyr Leu Gin Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His
195 200 205
TCG GCA ACC AAG TAC CTC AGT GGC CAT GGC GAC ATC ACT GCG GGC CTG 972
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp Ile Thr Ala Gly Leu
210 215 220
- 19CZ 291281 B6
GTG GTG GGG CGC AAG GCT TTG GTC GAC CGC ATT CGG CTG GAA GGG CTG 1020
Val Vat □ ty Arg tys Ala Leu Val Asp Arg Ile Arg Leu Glu Gly Leu
225 230 235
AAA GAC ATG ACC GGG GCA GCC TTG TCA CCG CAT GAC GCT GCG TTG TTG 1068
tys Asp Met Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu
240 245 250 255
ATG CGC GGC ATC AAG ACC CTG GCG CTG CGC ATG GAC CGG CAT TGC GCC 1116
Met Arg Gly Ile Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Asp Arg His Cys Ala
260 265 270
AAC GCC CTG GAG GTC CCG CAG TTC CTG GCC GGG CAG CCC CAG GTG GAG 1164
Asn Ala Leu Glu Val Ala Gin Phe Leu Ala Gly Gin Pro Gin Val Glu
275 280 285
CTG Leu ATC Ile CAC His 290 TAC CCG GGC TTG CCli iCG TTT GCC CAG TAC GAA CTG GCA Ala 1212
Tyr Pro Gly Leu Pro 295 Ser Phe Ala Gin Tyr 300 Glu Leu
CAG CGG CAG ATG CGT TTG CCG GGC GGG ATG ATT GCC TTT GAG CTC AAG 1260
Gin Arg Gin Het Arg Leu Pro Gly Gly Met Ile Ala Phe Glu Leu Lys
305 310 315
GGC GGT ATC GAG GCC GGG CGC GGC TTC ATG AAT GCC CTG CAG CTT TTT 1308
Gly Gly Ile Glu Ala Gly Arg Gly Phe Met Asn Ala Leu Gin Leu Phe
320 325 330 335
GCC CGT GCG GTG AGC CTG GGG GAT GCC GAG TCG CTG GCA CAG CAC CCG 1356
Ala Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gin His Pro
340 345 350
GCG AGC ATG ACG CAC TCC AGT TAC ACG CCA CAA GAG CGG GCG CAT CAC 1404
Ala Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gin Glu Arg Ala His His
355 360 365
GGG ATA TCA GAG GGG CTG GTG AGG TTG TCA GTG GGG CTG GAG GAT GTG 1452
Gly Ile Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val
370 375 380
GAG GAC CTG CTG GCA GAT ATC GAG TTG GCG TTG GAG GCG TGT GCA 1497
Glu Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala
385 390 395
TGAACTTGCC TTGCAGGATC GGGAACACTT GCCCAATGCC TCACGGGATC AGGCGATGGC
1557
ACTTTGGATG AGCTGGTGAA TTGGCCGGCT TATCCAAGAG GAGTTTAAAA TGACCGTA
1615
-20CZ 291281 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 398 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:
Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Ala Ile His
1 5 10 15
His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro Val
20 25 30
Tyr Gin Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ala
35 40 45
Cys Phe Ala Gly Glu Glu Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser Asn
50 55 60
Pro Thr Leu Ala Leu Leu Glu Gin Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Clu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser cly Met Gly Ala Ile Thr Ser Thr
85 90 95
Leu Trp Thr Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu Ile Vat Gly Arg Thr
100 105 110
Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu Phe
115 120 125
Gly Val Lys Ile His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu Lys
130 135 140
Ala Ala Ile Asn Ser Lys Thr Arg Met Ile Tyr Phe Glu Thr Pro Ala
145 150 155 160
-21 CZ 291281 B6
Asn Pro Asn Het Gin Leu Val Asp Ile Ala Ala Vat Val Glu Ala 175 Val
165 70
Arg Gly Ser Asp Vat Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr Pro
180 185 190
Tyr Leu Gin Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser
195 200 205
Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp Ile Thr Ala Gly Leu Val
210 215 220
Val Gly Arg Lys Ala Leu Val Asp Arg I le Arg Leu Glu Gly Leu Lys
225 230 235 240
Asp Het Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu Het
2« 250 255
Arg Gly Ile Lys Thr Leu Ala Leu Arg Het Asp Arg His Cys Ale Asn
260 265 270
Ala Leu Glu Val Ala Gin Phe Leu Ala Gly Gin Pro Gin Val Glu Leu
275 280 285
Ile His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Ala Gin Tyr Glu Leu Ala Gin
290 295 300
Arg Gin Het Arg Leu Pro Gly Gly Het Ile Ala Phe Glu Leu Lys Gly
305 310 315 320
Gly Ile Gtu Ala Gly Arg Gly Phe Het Asn Ala Leu Gin Leu Phe Ala
325 330 335
Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gin His Pro Ala
340 345 3SG
Ser Het Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gin Glu Arg Ala His His Gly
355 360 365
Ile Ser Glu Gly Leu Val Arg leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Glu
370 375 380
Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala
385 390 395

Claims (8)

1. Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyázový (METázový) polypeptid, mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 5, nebo sekvenci v podstatě stejnou, a mající schopnost degradovat methionin (MET).
2. METázový polypeptid podle nároku 1, kterým je rekombinantní polypeptid.
3. METázový polypeptid podle nároku 1, který je kódován polynukleotidem majícím sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 4, nebo sekvenci v podstatě stejnou.
4. METázový polypeptid podle nároku 3, který je exprimován v prokaryotu.
5. Polynukleotid, který kóduje katalyticky aktivní METázový polypeptid podle nároku 1, který má nukleotidovou sekvenci znázorněnou jako SEQ ID č. 4, nebo sekvenci v podstatě stejnou.
6. Farmaceutický prostředek pro chemoterapii savčích maligních buněk, které mají absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza, vyznačující setím, že zahrnuje směs terapeuticky účinného množství METázového polypeptidu podle nároku 1 a terapeuticky účinného množství methylthioadenosinu (MTA) ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
7. Souprava pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy (MTAzy) ve vzorku buněk savce, vyznačující se t í m, že zahrnuje oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují snukleotidovou sekvencí, která kóduje MTAzu, znázorněnou jako SEQ ID č. 1.
8. Použití směsi terapeuticky účinného množství METázového polypeptidu podle nároku 1 a terapeuticky účinného množství MTA ve farmaceuticky přijatelném nosiči pro přípravu farmaceutického prostředku pro chemoterapii savčích maligních buněk, které mají absolutní potřebu methioninu, ale chybí jim methylthioadenosin fosforyláza.
4 výkresy
CZ19961869A 1993-12-29 1994-12-22 Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-gama-merkaptomethan-lyázový polypeptid a jeho pouľití CZ291281B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/176,413 US5571510A (en) 1993-12-29 1993-12-29 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ186996A3 CZ186996A3 (en) 1996-12-11
CZ291281B6 true CZ291281B6 (cs) 2003-01-15

Family

ID=22644262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19961869A CZ291281B6 (cs) 1993-12-29 1994-12-22 Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-gama-merkaptomethan-lyázový polypeptid a jeho pouľití

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5571510A (cs)
EP (1) EP0805690B1 (cs)
JP (1) JPH09507754A (cs)
CN (1) CN1143325A (cs)
AT (1) ATE221785T1 (cs)
AU (1) AU694161B2 (cs)
CA (1) CA2180262A1 (cs)
CZ (1) CZ291281B6 (cs)
DE (1) DE69431167T2 (cs)
HU (1) HU221341B1 (cs)
NO (1) NO962714L (cs)
NZ (1) NZ278271A (cs)
PL (1) PL182298B1 (cs)
RO (1) RO117542B1 (cs)
RU (1) RU2153885C2 (cs)
TJ (1) TJ294B (cs)
WO (1) WO1995017908A1 (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891704A (en) * 1992-11-19 1999-04-06 Anticancer, Inc. Method to produce high levels of methioninase
US6461851B1 (en) 1992-11-19 2002-10-08 Anticancer, Inc. High expression modules containing two or more tandem copies of a methioninase encoding sequence
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
US6870037B1 (en) * 1995-07-03 2005-03-22 Arch Development Corporation Methylthioadenosine phosphorylase compositions and methods of use in the diagnosis and treatment of proliferative disorders
US5861154A (en) * 1995-10-30 1999-01-19 Shionogi & Co., Ltd. Recombinant L-methionine γ-lyase
JP3375834B2 (ja) 1995-10-30 2003-02-10 塩野義製薬株式会社 組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼ
EP1316611B1 (en) * 2000-09-05 2013-03-13 AntiCancer, Inc. L-methionine gamma-lyase with modified function
US20030129262A1 (en) * 2001-08-30 2003-07-10 Epner Daniel E. Methionine restriction for cancer therapy
AU2003261354A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-23 The Regents Of The University Of California New uses for inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
CA2516191A1 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
US20110002978A1 (en) 2003-06-17 2011-01-06 Harrison Roger G Enzyme prodrug cancer therapy selectively targeted to tumor cells or tumor vasculature and methods of production and use thereof
RU2393866C2 (ru) * 2005-03-17 2010-07-10 Проекто Де Биомедисина Сима, С.Л. Применение 5'-метилтиоаденозина (мта) для предотвращения и/или лечения аутоиммунных заболеваний и/или отторжения трансплантата
US8796241B2 (en) 2007-08-29 2014-08-05 Adam Lubin Therapy of tumors and infectious agents deficient in methylthioadenosine phosphorylase
US8480731B2 (en) * 2008-04-14 2013-07-09 Medtronic ATS Medical, Inc. Tool for implantation of replacement heart valve
US9987241B2 (en) 2014-09-25 2018-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enzyme conjugate and prodrug cancer therapy
US11446365B2 (en) 2017-08-09 2022-09-20 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Antimalarial enzyme conjugates, kits containing same, and methods of producing and using same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU694161B2 (en) 1998-07-16
US5571510A (en) 1996-11-05
NZ278271A (en) 2001-07-27
JPH09507754A (ja) 1997-08-12
RU2153885C2 (ru) 2000-08-10
CA2180262A1 (en) 1995-07-06
HU221341B1 (en) 2002-09-28
DE69431167T2 (de) 2003-04-17
NO962714D0 (no) 1996-06-27
PL182298B1 (pl) 2001-12-31
EP0805690B1 (en) 2002-08-07
EP0805690A1 (en) 1997-11-12
TJ294B (en) 2001-03-30
DE69431167D1 (de) 2002-09-12
CZ186996A3 (en) 1996-12-11
NO962714L (no) 1996-08-26
RO117542B1 (ro) 2002-04-30
ATE221785T1 (de) 2002-08-15
EP0805690A4 (en) 1999-05-12
AU1445995A (en) 1995-07-17
HU9601695D0 (en) 1996-08-28
HUT75070A (en) 1997-04-28
CN1143325A (zh) 1997-02-19
WO1995017908A1 (en) 1995-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ291281B6 (cs) Katalyticky aktivní L-methionin-L-deamino-gama-merkaptomethan-lyázový polypeptid a jeho pouľití
KR100748920B1 (ko) 단백분해 항체의 유도제 및 억제제를 동정하는 방법,조성물 및 이들의 용도
JP2007521835A (ja) ニコチンアミドリボシドキナーゼ組成物およびそれらの使用方法
US5545518A (en) Assay for determinig TNF or IL-1 convertase activity
US20150183843A1 (en) Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof
AU736937B2 (en) Method for suppressing multiple drug resistance in cancer cells
EP0752872B1 (en) Nadh oxidase as a target in diagnosis and therapy
JPS61239889A (ja) 物質の部位−特異的活性化方法及びその用途
EP1270594A1 (en) Antibodies to peptide from a soluble fragment of acetylcholinesterase
US5605810A (en) NADH oxidase assay for neoplasia determination
JPS61122224A (ja) 部位選択性プラスミノ−ゲン活性化因子及びその製造方法
JP2704880B2 (ja) アンギオゲニンの抑制剤
WO1992013958A1 (en) Receptor blocking peptides of fibroblast growth factor receptor
US5294698A (en) Human phospholipase activating protein and methods for diagnosis of rheumatoid arthritis
JPH1052282A (ja) アンギオゲニンの抑制剤
CZ186896A3 (en) Detection method of methylthioadenosine phosphorylase deficiency in mammal cells
JPH11139984A (ja) 抗腫瘍剤、抗肥満剤、及び悪疫質の検出方法
JP2003047479A (ja) ビタミンｄ３水酸化酵素
EP0331743A1 (en) Protein derived from living body
Buchta Structure-function studies of the acute phase response protein: C-reactive protein
JPS61204133A (ja) 抗マウス膀胱癌抗体と抗腫瘍性物質との結合物
JPWO2002057448A1 (ja) 新規ペプチド及びその活性

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19941222