PL182298B1 - zestaw do wykrywania obecnosci lub braku katalitycznie aktywnejlub katalitycznie nieaktywnej MTAzy, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy oraz polinukleotyd kodujacy katalitycznie aktywna METaze PL PL PL - Google Patents

zestaw do wykrywania obecnosci lub braku katalitycznie aktywnejlub katalitycznie nieaktywnej MTAzy, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy oraz polinukleotyd kodujacy katalitycznie aktywna METaze PL PL PL

Info

Publication number
PL182298B1
PL182298B1 PL94315229A PL31522994A PL182298B1 PL 182298 B1 PL182298 B1 PL 182298B1 PL 94315229 A PL94315229 A PL 94315229A PL 31522994 A PL31522994 A PL 31522994A PL 182298 B1 PL182298 B1 PL 182298B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mtase
metase
methionine
cells
ala
Prior art date
Application number
PL94315229A
Other languages
English (en)
Inventor
Tsutomu Nobori
Dennis A Carson
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of PL182298B1 publication Critical patent/PL182298B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

metylotioadenozynowej (MTAzy), znamienny tym, ze zawiera mieszanine terapeutycznie skutecznej ilosci L-deamino- ?-merkaptometano-liazy L-metioniny (METazy) o sekwencji ami nokwasowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 i terapeutycz- nie skutecznej ilosci metylotioadenozyny (MTA) w farmaceutycznie dopuszczalnym nosniku. 2. Zestaw do wykrywania obecnosci lub braku katalitycznie aktywnej lub katalitycznie nieaktywnej MTAazy w próbce komórek ssaka, znamienny tym, ze zawiera sondy oligo nukleotydowe specyficznie hybrydyzujace z sekwencja nukleotydowa oznaczona jako sek- wencja o numerze identyfikacyjnym 1. 3. Katalitycznie aktywny polipeptyd METazy o sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5. 7. Polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 kodujacy katalitycznie aktywna METaze. 8. Polipeptyd o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o nu- merze identyfikacyjnym 5. 9. Polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek do chemioterapii komórek nowotworowych, zestaw do wykrywania obecności lub braku katalitycznie aktywnej lub katalitycznie nieaktywnej MTAzy, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy oraz polinukleotyd kodujący katalitycznie aktywną METazę.
Aminokwas metionina (MET) jest konieczny do wzrostu komórek normalnych i złośliwych. Dla pewnych komórek złośliwych wymaganie to jest bezwględne, tj. bez dostatecznego dostarczenia MET komórki umierają.
W komórkach ssaków MET uzyskiwana jest z trzech źródeł. Może ona pochodzić z diety lub syntezy biochemicznej MET z L-homocysteiny (homocysteiny) bądź metylotioadenozyny (MTA) (produkt szlaku biosyntetycznego poliamin). W tym drugim przypadku, MTA jest przekształcana w MET przez fosforylazę metylodioadenozynową (MTAzę).
W ubiegłej dekadzie badacze zidentyfikowali wiele linii komórek złośliwych, które nie posiadają MTAzy i z tej przyczyny nie mogą przekształcać MTA w MET. Naprzykład Katamari i in. Proc. NaH Acad. Sci. USA, 78: 1219-1223 (1981) podali, że 23% z 3 linii ludzkich złośli182 298 wych komórek nowotworowych nie posiada wykrywalnej MTAzy, podczas gdy aktywność MTAzy była obecna w każdej z 16 badanych linii komórek niezłośliwych. Komórki ujemne pod względem MTAzy pokrywają swoje zapotrzebowanie na MET przez przekształcanie homocysteiny. Jednakże, jeśli homocysteina nie jest dostępna, komórki na ogół umierają.
Wiadomo, że L-dezamino-γ -merkaptometano-liaza L-metioniny (ED 4.4.1.11; METaza) degraduje nie tylko MET, ale również homocysteinę. Dlatego też, teoretycznie można głodzić komórki złośliwe, które nie posiadają MTAazy (tj. komórki ujemne pod względem MTAzy), przez degradację METaząMET i homocysteiny osocza. Przypuszcza się, że komórki normalne, dodatnie pod względem MTAzy, będą mogły pokrywać swoje zapotrzebowanie na MET przez ciągłe przekształcanie MTA w MET.
Podstawową wersję tego podejścia zaprezentował po raz pierwszy w 1972 roku Kreis w Cancer Treat. Rprts, 63: 1069-1072 (1972). Używając 11 linii komórek złośliwych w hodowlach bez MET, Kreis mógł zahamować wzrost pewnych komórek złośliwych przez zastosowanie METazy w hodowlach. Kreis zaobserwował także, że 2 linie normalnych komórek „broniły” się częściowo przed wpływem głodzenia pod względem MET, jeśli do hodowli dodano homocysteinę. Jednak, chociaż te badania in vitro były zachęcające, Kreis opisał kilka trudności związanych ze stosowaniem z powodzeniem METazy w chemioterapii in vivo; obejmowały one brak sposobów upewniania się co do przeżywalności normalnych komórek in vivo, potencjalną immunogenność oczyszczonego lub częściowo oczyszczonego enzymu i konieczność, aby enzym był odporny na degradację enzymami proteolitycznymi in vivo (Kries, Chemotherapy (Muggia, E M., red., The Hague, Boston and London: Martinud-Nijihoff, 1983), str. 219-248).
Inną trudnością w opracowaniu skutecznego sposobu głodzenia pod względem metioniny komórek złośliwych była konieczność stwierdzenia, które komórki złośliwe są odpowiednimi celami dla tej terapii; tj. które komórki złośliwe są ujemne pod względem MTAzy. W tym celu opracowano oznaczenie przewidujące, czy komórki złośliwe są ujemne pod względem MTAzy, polegające na określaniu, czy hodowla komórkowa wykazuje aktywność katalityczną (Seidenfeld i in., Biochem. Biophys. Res. Commun, 95:1861-1866, 1980). Jednakże, z powodu niedostępności w handlu substratu radiochemicznego potrzebnego do oznaczenia aktywności, jego stosowanie do rutynowych badań nie jest obecnie wykonalne. Ponadto, to oznaczenie aktywności nie uwzględnia niestabilności katalitycznej MTAzy in vitro przez wykrywanie, czy jakiś enzym jest obecny w hodowli komórkowej, niezależnie od tego, czy jest katalitycznie aktywny w czasie przeprowadzania oznaczenia.
Tego ograniczenia oznaczenia aktywności można uniknąć przez opracowanie oznaczenia immunologicznego, które jest dostatecznie czułe do wykrywania stosunkowo małych ilości enzymu. Jednak okazało się, że oczyszczenie z naturalnego źródła enzymu MTAzy w celu otrzymania przeciwciał do stosowania do immunologicznego wykrywania MTAzy jest procesem żmudnym i dającym stosunkowo niską wydajność (Rangione i in., J. Biol. Chem, 261: 12324-12329, 1986).
Ponadto, otrzymanie odpowiedniego zapasu METazy ze źródła naturalnego jest tak trudne jak otrzymanie MTAzy. METazy nie otrzymano dotąd innymi sposobami niż oczyszczanie natywnego enzymu, częściowo dlatego, że gen METazy był (do tej pory) tylko częściowo zsekwencjowany (Nakayama i in., Biochem., 27.1587-1591, 1988).
Z tych wszystkich powodów, jak dotąd nie opracowano skutecznego sposobu głodzenia pod względem MET komórek złośliwych za pomocą MTAzy. Niniejszy wynalazek odpowiada na tę potrzebę.
Przedmiotem wynalazku jest środek do chemioterapii komórek nowotworowych nowotworu złośliwego u ssaków, które wykazują bezwzględne zapotrzebowanie na metioninę, ale nie zawierająfosforylazy metylotioadenozynowej, charakteryzujący się tym, że zawiera mieszaninę terapeutycznie skutecznej ilości METazy o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 i terapeutycznie skutecznej ilości MTA w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
182 298
Innym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania obecności lub braku katalitycznie aktywnej lub katalitycznie nieaktywnej MTAzy w próbce komórek ssaka, charakteryzujący się tym, że zawiera sondy oligonukleotydowe specyficznie hybrydyzujące z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest katalitycznie aktywny polipetyd METazy o sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5.
Korzystnie, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy jest polipeptydem rekombinacyjnym oraz jest kodowany przez polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4.
Korzystnie, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy ulega ekspresji w organizmie prokariotycznym.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 kodujący katalitycznie aktywnąMETazę.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polipeptyd o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4.
Środek według wynalazku stosuje się w sposobie selektywnego niszczenia złośliwych komórek u ssaków, opartego na różnicach metabolicznych pomiędzy tymi komórkami i komórkami niezłośliwymi (tj. „normalnymi”). Bardziej szczegółowo, dotyczy on głodzenia komórek złośliwych, które nie posiadają enzymu koniecznego do przekształcania metylotioadenozyny w metioninę, przez degradację metioniny i homocysteiny osocza.
Zgodnie z tym sposobem, komórki złośliwe, które określono jako ujemne pod względem MTAzy, traktuje się terapeutycznie skuteczną ilością METazy, korzystnie rekombinowanej METazy, a najkorzystniej rekombinowanej METazy połączonej z glikolem polietylenowym lub równoważną cząsteczką. Bardziej szczegółowo, METazę podaje się ssakowi (korzystnie człowiekowi) w dawce, która będzie obniżać poziomy MET w osoczu w zakresie wystarczającym do głodzenia komórek ujemnych pod względem iMTAzy (która będzie ogólnie rzecz biorąc występować w ilości < 10% poziomu metioniny przed terapią). Normalne (dodatnie pod względem MTAzy) komórki będą zaopatrywane w MET przez jednoczesne podawanie MTA.
Wynalazek obejmuje również zrekombinowaną METazę otrzymaną w wyniki izolacji i klonowania genu kodującego METazę, umożliwiając w ten sposób wytwarzanie znaczących ilości METazy do stosowania w wyżej wymienionym sposobie.
Przedmiot wynalazku w przykładach realizacji jest odtworzony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia szlak metaboliczny syntezy poliamin i redukcji MTA przez MTAzę, fig. 2 przedstawia porównanie dodatnich i ujemnych pod względem MTAzy ludzkich i nie-ludzkich linii komórkowych wykrytych przez analizę poprzez immunobloting, fig. 3 przedstawia porównanie dodatnich i ujemnych pod względem MTAzy ludzkich linii komórkowych i pierwotnych nowotworów wykrytych przez analizę poprzez immunobloting, zaś fig. 4 przestawia porównanie wzrostu ludzkich komórek ujemnych pod względem MTAzy traktowanych w stosunku do komórek rosnących w środowisku bogatym w metioninę.
Środek do chemioterapii komórek nowotworowych nowotworu złośliwego u ssaków oraz zestaw do wykrywania obecności lub braku katalitycznie nieaktywnej MTAzy w próbce komórek ssaka według wynalazku wykorzystuje się w przy selektywnym głodzeniu pod względem metioniny komórek ssaka, które podejrzewa się że sąujemne pod względem MTAzy. Selektywne głodzenie polega na określeniu, czy komórki są zasadniczo pod względem MTAzy przy użyciu zestawu według wynalazku lub wykorzystaniu opisanych dalej metod, a następnie podaniu ssakowi środka według wynalazku lub terapeutycznie skutecznych ilości METazy oraz MTA.
Wykorzystując opis sekwencji kwasu nukleinowego w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, specjalista w tej dziedzinie mógłby skonstruować sondy oligonukleotydowe do zestawu według wynalazku, które hybrydyzowałyby z obecnym w próbce komórek DNa MTAzy. Ponieważ sądzi się, że brak MTAzy wynika z delecji genu, który mógłby kodować białko MTAzy z ge182 298 nomu, można założyć, że jeśli nie wykryje się genu kodującego MTAzę w próbce komórek, to komórki są ujemne pod względem MTAzy.
Szczegółowy opis protokołu amplifikacji i wykrywania genu MTAzy podano w równoległym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/176 855, złożonym 29 grudnia 1993 r. Ujawnienia równoległego zgłoszenia patentowego numer 08/176 855 odnoszące się do tego protokołu włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.
Alternatywny sposób wykrywania komórek ujemnych pod względem MTAzy
Figura 1 przedstawia schematycznie szlak metaboliczny in vivo MET z MTA i degradację MET przez METazę. Jak wskazano powyżej, do uzyskania pełnych korzyści w terapii raka polegającej na głodzeniu pod względem metioniny, konieczne jest wykrycie komórek ujemnych pod względem MTAzy w docelowym nowotworze złośliwym. Poniżej opisano alternatywny sposób pokrywania MTAzy, który można stosować oprócz zestawu według wynalazku.
Oznaczenie immunologiczne MTAzy
Wytwarzanie antygenowych MTAzy i peptydów MTAzy
Przeciwciała, które są specyficzne wobec MTAzy wytwarza, się przez immunizację organizmu innego niż człowiek antygenowymi MTAząlub peptydami MTAzy. Ogólnie rzecz biorąc, antygenowe peptydy MTAzy można wyizolować i oczyścić z tkanki ssaka zgodnie z metodą opisaną przez Ragnione i in..J. Biol. Chem., 265:6241-6246 (1990). Przykład ilustrujący praktyczne wykonanie tej metody podano w przykładach poniżej. Dla odniesienia, sekwencję aminokwasową pełnej długości MTA włączono w niniejszym opisie jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym 1.
Immunizacja antygenowymi peptydami MTAzy w celu wytworzenia przeciwciał skierowanych przeciw MTAzie
Po otrzymaniu antygenowych MTAzy lub peptydów MTAzy, przeciwciała skierowane przeciw immunizującemu peptydowi wytwarza się przez wprowadzenie peptydu do ssaka (takiego jak królik, mysz lub szczur). W celu zilustrowania, w dołączonej do niniejszego opisu Liście Sekwencji dostarczono, jako sekwencje o numerach identyfikacyjnych 2 i 3, sekwencje aminokwasowe dwóch antygenowych peptydów MTA. Przeciwciała wytworzone przez króliki immunizowane tymi peptydami wykazywały 50% maksymalną odpowiedź na oczyszczoną MTA w rozcieńczeniach, odpowiednio, 1:1500 i 1:4000.
Do immunizacji zwierząt antygenowymi peptydami MTAzy korzystne jest stosowanie protokołu immunizacji przez wielokrotne iniekcje (patrz, Langone i in., red., „Production of Antisera with Small Doses ofImmunogen: Multiple Intradermal Injections”, Methods of Ezymology (Acad. Press, 1981)). Naprzykład, dobrą odpowiedź wytwarzania przeciwciał można uzyskać w królikach w wyniku podania śródskórnej iniekcji 1 mg antygenowego peptydu MTAzy emulgowanego kompletnym adiuwantem Freunda, a następnie kilka tygodni później jednej lub więcej dawek przypominających tego samego antygenu w niekompletnym adiuwancie Freunda.
Jeśli jest wskazane, peptyd immunizujący można, wykorzystując techniki dobrze znane w tej dziedzinie, sprzęgać z nośnikiem białkowym przez kombinację. Takie powszechnie wykorzystywane nośniki, które sprzęga się chemicznie z peptydem, obejmują hemocyjaninę skałoczepa (KLH), tyroglobulinę, albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i toksoid tężcowy. Sprzężony peptyd stosuje się następnie do immunizacji zwierzęcia (np. myszy lub królika). Ponieważ obecnie uważa się że MTA jest konserwatywna u gatunków ssaków, korzystne jest stosowanie nośnika białkowego do wzmocnienia immunogenności białka MTAzy.
Wytworzone przez immunizowane zwierzęta przeciwciała poliklonalne można następnie oczyszczać, na przykład przez wiązanie i elucję z macierzy, z którą związany jest peptyd przeciw któremu wywołano przeciwciała. Specjaliści w tej dziedzinie będą znać wiele różnych powszechnych w immunologii technik oczyszczania i zatężania przeciwciał poliklonalnych, jak również przeciwciał monoklonalnych (patrz na przykład, Coligan i in., część 9, Current Protocols in Immunolog), Wiley Interscience, 1991).
Ze względu na specyficzność i łatwość wytwarzania, do stosowania w wykrywaniu komórek ujemnych pod względem MTAzy, korzystne są przeciwciała monoklonalne. Przeciwciała mono6
182 298 klonalne wytwarza się korzystnie przez immunizację myszy lub szczura. Termin „przeciwciało” w znaczeniu stosowanym w opisie wynalazku, obejmuje zarówno nienaruszone cząsteczki jak również ich fragmenty, takie jak na przykład Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania determinanty epitopowej. Również w tym kontekście, termin „mAb” odnosi się do przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec MTAzy.
Ogólna metoda stosowana do wytwarzania hybrydom wydzielających przeciwciała monoklonalne („mAb”) jest dobrze znana (Kohler i Milstein, Nature, 265:495,1975). W skrócie, jak opisali Kohler i Milstein, technika obejmuje izolację limfocytów z regionalnych drenujących węzłów limfatycznych pięciu odrębnych pacjentów chorych na raka z czerniakiem, potworniakiem złośliwym, rakiem szyjki, glejakiem lub rakiem płuc. Limfocyty otrzymywano ze skrawków chirurgicznych, zbierano, a następnie poddawano fuzji z SHFP-1. Hybrydomy przeszukiwano pod kątem wytwarzania przeciwciał wiążących się z liniami komórek rakowych. Równoważne techniki można stosować do wytwarzania i identyfikowania mAb o specyficzności wobec MTAzy.
Potwierdzenie specyficzności mAb wobec MTAzy można uzyskać stosując stosunkowo rutynowe techniki przeszukiwania (takie jak enzymatyczne oznaczenie immunosorbcyjne lub „ELISA”) do określania podstawowego wzoru reakcji mAb będącego przedmiotem zainteresowania.
Możliwajest także, bez nadmiernych prac eksperymentalnych, ocena mAb określająca czy posiada on taką samą specyficzność co mAb docelowe przez określenie czy testowane mAb przeszkadza docelowemu wiązać się z MTAzą. Jeśli testowane mAb współzawodniczy z mAb będącym przedmiotem zainteresowania, na co wskazuje obniżenie wiązania przez mAb będącego przedmiotem zainteresowania, to jest prawdopodobne, że te dwa przeciwciała monoklonalne wiążą te same lub ściśle zbliżone epitopy.
Jeszcze innym sposobem określenia, czy mAb posiada specyficzność mAb docelowego jest preinkubowanie mAb będącego przedmiotem zainteresowania z antygenem, z którym jest ono normalnie reaktywne i określenie czy testowane mAb ulega hamowaniu pod względem zdolności do wiązania antygenu. Jeśli testowane mAb ulega hamowaniu, to najprawdopodobniej posiada ono taką samą lub ściśle zbliżoną specyficzność epitopową, jak mAb docelowe.
Protokół oznaczenia immunologicznego do wykrywania komórek ujemnych pod względem MTAzy.
Po otrzymaniu odpowiednich przeciwciał w sposób opisany powyżej, stosuje się je do wykrywania MTAzy w nowotworze złośliwym. Przykład oznaczenia immunologicznego odpowiedniego do tego celu (na przykład metodę immunoblotingu) opisano dalej w przykładzie I poniżej. Jednakże, specjaliści w dziedzinie immunologii będą wiedzieć, że MTAzę można wykrywać stosując opisane powyżej przeciwciała w innych rodzajach oznaczeń immunologicznych, w fazie płynnej lub stałej (po związaniu z nośnikiem).
Wykrywanie MTAzy z wykorzystaniem skierowanych przeciw niej przeciwciał można wykonać stosując oznaczenia immunologiczne, które można przeprowadzać z wyprzedzeniem, wstecznie lub jednocześnie, obejmujące oznaczenia immunohistochemiczne na próbkach fizjologicznych. Protokoły odpowiednich oznaczeń immunologicznych obejmują protokoły współzawodniczę i niewspółzawodnicze, przeprowadzane w sposób bezpośredni lub pośredni. Przykładami takich oznaczeń immunologicznych sąoznaczenia radioimmunologiczne (RIA) i oznaczenie „kanapkowe” (immunometryczne). Specjaliści w tej dziedzinie będą znać lub bez trudu znajdą inne rodzaje oznaczeń immunologicznych bez nadmiernych prac eksperymentalnych.
W dodatku, przeciwciała wykorzystywane do oznaczeń immunologicznych można znakować, aby zapewnić wykrywalność. Znacznik jest substancją, która można kowalencyjnie przyłączyć lub silnie związać z sondą kwasu nukleinowego, co w rezultacie zapewni możliwość wykrywania sondy. Na przykład, znacznikiem może być izotop promieniotwórczy, substrat lub inhibitor enzymu, enzym, substancja nieprzepuszczalna dla promieniowania (włącznie z metalami koloidalnymi), substancje fluoroscencyjne, cząsteczka chemiluminescencyjna, liposomy zawierające którykolwiek w powyższych znaczników lub składnik specyficznie wiążących się par. Odpowiedni znacznik nie będzie tracił właściwości odpowiedzialnej za wykrywalność podczas amplifikacji.
182 298
Specjaliści w diagnostyce będą zorientowani co do odpowiednich wykrywalnych znaczników do stosowania w oznaczeniach wykrywania in vitro. Na przykład, odpowiednie izotopy promieniotwórcze obejmują 3H, 125J, I3!j, l4c, 35s. Zamplifikowane fragmenty wyznakowane izotopami promieniotwórczymi można wykrywać bezpośrednio stosując licznik promieniowania gamma lub densytometrię autoradiogramów, technikąblotingu Southerna zamplifikowanych fragmentów w połączeniu z densytometrią. Przykładami odpowiednich cząsteczek chemiluminescencyjnych są akrydyny lub luminol. Sekwencje docelowe zhybrydyzowane z sondami, przeprowadzonymi w pochodne estrem akrydyniowym są chronione przed hydroliząprzez interkalację. Przykładami odpowiednich substancji fluorescencyjnych są fluorosceina, fikobiliproteina, chelaty pierwiastków ziem rzadkich rodnik dansylowy lub rodamina.
Przykładami odpowiednich substratów lub inhibitorów enzymów są związki, które specyficznie wiąża się z peroksydazą chrzanu, oksydazą glukozową, dehydrogenazą glukozo-6-fosforanową, β-galaktozydazą, kinaząpirogroniaiowąlub fosfatazą alkaliczną esteraaąacetylocholinową. Przykładami substancji nieprzepuszczalnych dla promieniowania są złoto koloidalne lub proszek ferromagnetyczny.
Specyficznie wiążąca się para składa się z dwóch różnych cząsteczek, z których jedna z cząsteczek posiada obszar na swojej powierzchni lub w zagłębieniu, który specyficznie wiąże się z konkretną, przestrzenną lub polarną strukturą drugiej cząsteczki. Składniki specyficznie wiążącej się pary są często określane jako ligand i receptor lub ligand i antyligand. Na przykład, jeśli receptorem jest przeciwciało, ligandem jest odpowiadający antygen. Inne specyficznie wiążące się pary obejmują pary hormon-receptor. pary enzym-substrat, przy biotyna-awidyna i pary glikoproteina-receptor. Obejmująone fragmenty lub części specyficznie wiążących się par, które zachowują specyficzność wiązania, takie jak fragmenty immunoglobulin, włącznie z fragmentami Fab i podobnymi. Przeciwciała mogą być monoklonalne lub poliklonalne. Jeśli składnik specyficznie wiążącej się pary stosuje się jako znacznik, to korzystnąprocedurą rozdziałujest chromatografia powinowactwa.
Przeciwciało można także związać z nośnikiem. Przykłady dobrze znanych nośników obejmują szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, nylon, amylozy, naturalne i zmodyfikowane celulozy, poliakryloamidy, agarozy i magnetyt. Dla celów tego wynalazku nośnik może być albo rozpuszczalny albo nierozpuszczalny. Specjaliści w tej dziedzinie będą znać i inne odpowiednie nośniki do wiązania przeciwciał, albo będą mogli znaleźć je przeprowadzając rutynowe doświadczenia.
Ujemni pod względem MTAzy kandydaci do terapii głodzenia MTAzą
Nowotwór złośliwy, który jest kandydatem do terapii według wynalazku (tj. terapii głodzenia pod względem MET) jest nowotworem, w którym nie występuje wykrywalne białko MTAzy, ani w postaci katalitycznie aktywnej, ani katalitycznie nieaktywnej. We wszystkich dotąd badanych liniach komórek złośliwych, ujemność pod względem MTAzy (jeśli występuje) jest wspólną cechą całej populacji komórek. Innymi słowy, jeśli niektóre komórki nowotworu złośliwego są ujemne pod względem MTAzy, można oczekwiać, że wszystkie komórki tego nowotworu złośliwego będą ujemne pod względem MTAzy. Jest to zgodne z obecnym przekonaniem, że brak MTAzy jest wynikiem raczej delecji genu, niż mutacji. Homogenność nowotworu złośliwego w odniesieniu do ujemności pod względem MTAzy powinna znacząco wzmocnić skuteczność głodzenia pod względem MET jako terapii przeciwnowotworowej, w porównaniu z terapiami ukierunkowanymi na cechy heterogenne, takie jak antygeny nowotworowe, będące celem terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Jednakże, dla celów wynalazku wystarczające jest, aby nowotwór złośliwy był „ zasadniczo pozbawiony” MTAzy; tj. aby nie zawierał on wykrywalnych ilości białka MTAzy.
Ludzkie nowotwory złośliwe, które obecnie uważa się za zasadniczo pozbawione MTAzy obejmują:
182 298
Tabela 1
Nowotwór złośliwy Brak MTAzy określony przez
Nie-drobnokomórkowe raki płuc: Oznaczenie immunologiczne
A-549 (gruczolakomięsak) Sk-Lu-1 (gruczolakomięsak) H322 (oskrzelowo-pęcherzykowy) H1334 (wielkokomórkowy) H1437 (gruczolakomięsak) H1581 (rak wielkokomórkowy)
* linie komórkowe nowotworów mózgu Oznaczenie immunologiczne
A172 U-87MG U-138MG Hs683
Pierwotne nowotwory mózgu: Oznaczenie immunologiczne
Gwiaździak Glejak wielopostaciowy Skąpogwiaździak
Chłoniaki i białaczki Oznaczenie immunologiczne
CEM (białaczka limfoblastyczna) K-T-1 (białaczka limfoblastyczna) NALL-I (białaczka limfoblastyczna) K562 (przewlekła białaczka szpikowa) DHL-9 (chłoniak złośliwy) HSB2 (białaczka limfoblastyczna)
Inne:
Rakomięsak Walker 256 Jurkat K562 Capan-1 (gruczolakomięsak trzustki) Objawy kliniczne** Oznaczenie immunologiczne*** Oznaczenie immunologiczne*** Oznaczenie immunologiczne****
LEGENDA:
* otrzymany z American Type Culture Collection, Rockville, MD.
** podane przez Kriesa i in., Cancer Res., 33: 1866-1869 (1973) *** podane przez Rangione i in., Biochem. J. 281: 533-538 (1992) **** podane przez Kriesa i in., Cancer Trmt. Rpts, 65.1069-1072 (1972) ◊ brak MTAzy we wszystkich innych nowotworach złośliwych wykryty i podany przez Nobori i in., w Cancer Res. 55:1098-1101 (1993) i w Cancer Res., 51: 3193-3197 (1991).
Stosując opisane tu techniki wykrywania, specjaliści w tej dziedzine będąmogli wykrywać brak MTAzy w innych nowotworach złośliwych, bez nadmiernych prac eksperymentalnych.
Terapia głodzeniem pod względem MET
Wytwarzanie METazy
Do takiej terapii wymagane są źródła zarówno MTA, jak i METazy. Sposoby otrzymywania MTA opisano powyżej. METazę oczyszczono z mikroorganizmów obejmujących Trichomonas vaginaiis (Lockwood i in., J. Biochem. 279:675-682,1991), Ciostridium sporogenes (patrz np. Kries i in., powyżej na str. 1867; EC4.4.1.11) i Pseudomonas putida (Nakayama i in., Biochem., 27: 1587-1591, 1988).
Stosując bibliotekę cDNA skonstruowana^P. putida zidentyfikowano pełnej długości sekwencję nukleotydową METazy i zamieszczono ją w dołączonej do mniejszego opisu Liście Sek182 298 wencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym 4, sekwencja aminokwasowaprzedstawiona jest w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5.
Posiadając tą informację, METazę można łatwo zsyntetyzować lub uzyskać jej ekspresję z klonu cDNA, stosując dobrze znane techniki, jak opisano powyżej w odniesieniu do MTAzy. Szczegółowy przykład, jak można sklonować METazę i przeprowadzić jej ekspresję w E. coli. podano dalej poniżej w przykładach II i III.
Chociaż w przedmiotowej terapii można użyć oczyszczoną, częściowo oczyszczoną, zsyntetyzowaną lub zrekombinowaną METazę, ta ostatnia jest preferowana ze względu na łatwości jej wytwarzania i stosunkowo niską immunogenność. Immunogenność enzymu można, i korzystnie będzie się, dalej obniżać przez jego sprzęganie z glikolem polietylenowym (PEG) lub równoważną, biologicznie kompatybilną cząsteczką. Można również oczekiwać, że sprzęganie z PEG obniży okres półtrwania koniugatu METazy in vivo.
Koniugat PEG-METaza można utworzyć przez kowalencyjne związanie PEG z enzymem, jak opisano w odniesieniu do L-asparaginy (patrz np. Benedich i in., Clin. Exp. Immunol.48:273-278,1982). Metody sprzęgania PEG z białkami są dobrze znane w nauce i dlatego nie będą tu bardziej szczegółowo opisywane. W oparciu o obserwowane w próbach klinicznych wyniki leczenia chłoniaka nieziarniczego L-asparaginazą sprzęgniętą z PEG, nie należy oczekiwać, że sprzęganie METazy z PEG będzie znacząco obniżać jej aktywność in vivo (patrz na wyniki otrzymane in vivo dla PEG-L-asparaginazy, Muss i in., Invest. New Drugs, 8: 125-130 (1990)). Specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że sąznane i mogą być odpowiednie do stosowania z METaząinne sposoby wydłużania okresu półtrwania białek in vivo, nie ograniczone do glikozylacji i sukcynylacji.
Sposoby terapeutyczne
Nowotwory złośliwe, które są zasadniczo pozbawione MTAzy będzie traktować się podając równocześnie METazę oraz MET w postaci środka według wynalazku lub też podając je oddzielnie.
Korzystnie, tymi nowotworami złośliwymi będą te, które można traktować przez miejscową chemioterapię, tj. jeśli nowotwór złośliwy umiejscowiony jest i zawarty w rejonie ciała, który jest dostępny przez infuzję dotętniczą lub przez wprowadzenie poprzez miejscową, przezskórną lub równoważne drogi podawania METazy bezpośrednio do miejsca nowotworu złośliwego. Przykładami nowotworów złośliwych, które są podane na miejscową chemioterapię są czerniaki, rak jajnika (przez cewnik otrzewnowy) i rak pęcherza (przez cewnik moczowodowy). Inne nowotwory złośliwe, które, jeśli sąujemne pod względem MTAzy, można leczyć przez miejscową chemioterapię, będą znane specjalistom w dziedzinie onkologii.
Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że środek według wynalazku można również podawać ogólnoustrojowo. Jednakże, w dawkowaniu powinno się również uwzględniać kompensację klirens środka i potencjalną toksyczność dla komórek normalnych. W szczególności, powinno się ściśle monitorować objawy kliniczne głodzenia pod względem metioniny komórek normalnych i kompensować je, jeśli jest to konieczne, przez podawanie dodatkowych ilości MTA.
Nowotwory złośliwe, które zasadniczo pozbawione są MTAzy, będzie się korzystnie leczyć w następujący sposób.
METazę podawać się będzie ssakowi (korzystnie człowiekowi) pozajelitowo, przy czym preferowaną drogą podawania jest infuzja dotętniczą. METazę podawać się będzie w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, który może zawierać jałowe, wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykładami roztworów niewodnych są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak olej oliwkowy, i dopuszczalne do wstrzykiwań estry organiczne, takie jak oleinian etylowy. Nośniki wodne obejmują wodę, roztwory alkoholowo/wodne, emulsje lub zawiesiny, włącznie z solą fizjologiczną i zbuforowanymi podłożami. Jak zauważono powyżej, METazę będzie się korzystnie koniugować z PEG dla obniżenia jej immunogenności.
Podłoża pozajelitowe obejmują roztwory chlorku sodowego, dekstrozy w płynie Ringera, dekstrozy i chlorku sodowego, płyn Ringera z mleczanem lub oleje roślinne. Podłoża dożylne
182 298 obejmują płynne i odżywcze substancje uzupełniające, elektrolitowe substancje uzupełniające (takie jak te oparte na roztworze dekstrozy w płynie Ringera) i podobne. Mogąbyć również obecne substancje konserwujące i inne dodatki, takie jak, np. przykład, środki przeciwmikrobiologiczne, środki przeciwutleniające, czynniki chelatujące i gazy obojętne oraz podobne.
Dawki METazy mogąbyć zróżnicowane od około 10 jednostek/m2 do około 20 000jednostek/m2, korzystnie od około 5000 do 6000 jednostek/m2 (lub niższych przy podawaniu przez infuzje dotętniczą) w jednym lub więcej podawaniu dawki tygodniowo, w ciągu jednego lub kilku dni. Można generalnie oczekiwać, że METaza będzie ulegała klirensowi u ssaka w ciągu około 24 godzin po jej podaniu; przy stosowaniu sposobów wydłużenia okresu półtrwania enzymu, takich jak kombinacja z PEG, ten okres półtrwania można przedłużyć o kilka godzin do kilku dni. Dlatego też, poziom metioniny w osoczu ssaka powinno się monitorować i podawać dodatkowe dawki METazy, gdy jest to konieczne do uzyskania terapeutycznie znaczącego obniżenia stężenia metioniny w osoczu ssaka. Będzie to obniżenie wystarczające do indukowania wykrywalnego zmniejszenia objętości komórek ujemnych pod względem MTAzy, tj. zmniejszenia objętości komórek złośliwych lub obciążenia ssaka nowotworem. Dawkowanie, które doprowadzi do tego wyniku, będzie uważane za dawkowanie „skuteczne terapeutycznie”. W oparciu o badania in vivo na gryzoniach z zastosowaniem częściowo oczyszczonej METazy, można generalnie oczekiwać, że terapeutycznie skutecznym dawkowaniem będzie to, która obniża poziom metioniny w osoczu pacjenta do około < 10% poziomu przed terapią.
Poziomy metioniny w osoczu (i ich zmiany) można monitorować przez okresowe (a korzystnie codzienne) oznaczenia in vitro próbek krwi pobieranych od pacjenta otrzymującego METazę podczas okresu jej podawania. Generalnie, w oparciu o badania wykonane na gryzoniach, można oczekiwać, że poziomy metioniny w osoczu będą ulegały obniżeniu do <10%o j ej poziomu przed terapią w ciągu godziny od podania METazy. Oznaczenia metioniny w osoczu są dobrze znane w nauce; na przykład, stężenie metioniny w próbce krwi można określić stosując metodę chromatografii gazowo-cieczowej zestryfikowanych aminokwasów (ester n-butylowy) opisaną wRoachi in., J. Chromatog. 44:269-278 (1969). Inne równoważne procedury wykrywania metioniny w osoczu będą znane lub łatwe do znalezienia przez specjalistów w tej dziedzinie.
Należy zauważyć, że METaza nie może degradować metioniny wewnątrzkomórkowej. Dlatego też, przy odpowiednim dostarczeniu MTA do tworzenia wewnątrzkomórkowej metioniny, komórki dodatnie pod względem MTAzy będą generalnie zdolne do przeżycia po obniżeniu poziomu egzogennej metioniny przez METazę. Jednakże, bez dostarczenia egzogennej metioniny (lub substratu metioniny L-homocysteiny, która jest także degradowana przez METazę), komórki ujemne pod względem MTAzy, o bezwzględnym wymaganiu metioniny, nie będą generalnie przeżywać usunięcia metioniny osocza.
Skuteczność terapii można potwierdzać i monitorować wykorzystując jakikolwiek objaw kliniczny wskazujący na obniżenie komórkowej objętości nowotworu złośliwego (określanej sposobami dobrze znanymi w dziedzinie) i/lub okresowe określanie objętości komórek ujemnych pod względem MTAzy w nowotworze złośliwym przy zastosowaniu opisanych tu sposobów wykrywania. W oparciu o dane kliniczne dotyczące stosowania terapii L-asparaginazą u ludzi, można oczekiwać, że skuteczność terapii METaząbędzie dość niska i może składać się przede wszystkim z reakcji alergicznych, które można leczyć sposobami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie medycyny, takimi jak podawanie epinffiyny.
Dlatego też, MTA należy podawać ssakowi równolegle z METazą, w postaci środka według wynalazku. Ponieważ MTA nie będzie działać jako substrat METazy, obie substancje można połączyć razem w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Alternatywnie, MTA można podawać w ciągu 24 godzin od podania METazy (a korzystnie wcześniej) dla „obrony” komórek dodatnich pod względem MTAzy, których endogenne zapasy metioniny ulegają wyczerpaniu.
Dawka MTA potrzebna do obrony komórek normalnych będzie zróżnicowana w zależności od licznych czynników klinicznych, obejmujących położenie nowotworu złośliwego, objętość komórek ujemnych pod względem MTAzy w nowotworze złośliwym, długości terapii
182 298
METaząi dostępności dla pacjenta MET w diecie. Generalniejednak MTA podawać się będzie w dawkach wystarczających do utrzymania metioniny osocza na poziomie około 1-10 pM.
Przykład I. Immunologiczne oznaczenie MTAzy
A. Wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw MTAzie
MTAzę otrzymano z wątroby bydlęcej w sposób opisany przez Rangione i in., powyżej. Kilka trypsynowych peptydów wyizolowanego enzymu zsekwencjonowano stosując konwencjonalne techniki. W oparciu o otrzymane sekwencje, zsyntetyzowano peptydy 40 (o długości 18 aminokwasów; patrz sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i 51 (o długości 14 aminokwasów; patrz sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3), stosując modyfikację dobrze znanej metody Marrifielda syntezy peptydów na fazie stałej (patrz np. Chen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA,81: 1784-1788,1984). Wszystkie peptydy zawierały na końcu C resztę cysteiny w celu ułatwienia chemicznego wiązania z białkiem nośnikowym, KLH, estrem m-maleimdobenzoilo-N-hydroksysukcynimidowym.
Króliki rasy New Zealand white (po dwa króliki na peptyd) immunizowano co dwa miesiące koniugatami peptyd-KLH. Początkowe iniekcje zawierały 1 mg koniugatu syntetyczny peptyd-KLH zemulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda. Iniekcje przypominające zawierały 1 mg antygenu w niekompletnym adiuwancie Freunda. Po 3-4 iniekcjach, surowice częściowo oczyszczano poprzez wysalanie siarczanem amonowym o 50% nasyceniu i sprawdzano jej antypeptydową i anty-MTAzową reaktywność metodą ELISA.
Bardziej szczegółowo, płytki do mikromiareczkowania wstępnie pokrywano peptydem lub MTAząo stężeniu 10 pg/ml w BBS (0,2 M boran sodowy - 0,15 NaCl, pH 8,5) w ciągu nocy w temperaturze 4°C. Płytki przemywano raz BBS zawierającym 0,05% Tween 20, a następnie inkubowano w ciągu 4 godzin w BBS zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej dla zablokowania miejsc niespecyficznego wiązania. Następnie dodawano próbki o objętości 0,1 ml kilku rozcieńczeń surowicy kontrolnej lub surowic indukowanych peptydami w ciągu nocy. Płytki dwukrotnie przemywano BBS zawierającymi 0,05% Tween 20, po czym eksponowano w ciągu 1 godziny na kozi F(ab')2 skierowany przeciw immunoglobulinom królika wyznakowany alkaliczną fosfatazą (Jackson Laboratories, Inc., West Grove, PA) rozcieńczonym 1:1000 BBS. Po odpłukaniu płytek, do każdej studzienki dodawano 0,2 ml 0,1 M dwusodowego fosforanu p-nitrofenolu w 0,1M NaHCO3, pH 9,0. Po 30 min mierzono absorpcję przy długości fali 405 nm.
B. Protokół analizy przez immunobloting pod kątem immunoreaktywnej MTAzy
Kilka ludzkich linii komórkowych i biopsji nowotworów oceniono pod kątem obecności komórek ujemnych pod względem MTAzy (patrz komórki ujemne pod względem MTAzy, tabela I, pozycje z adnotacją „oznaczenie immunologiczne’). Innymi testowanymi próbkami dodatniki pod względem MTAzy były BV-173 (przewlekła białaczka szpikowa, „CML”), Molt-16 (białaczka limfoblastyczna, „ALL”), Molt-4 (ALL), U397 (chłoniak histiocytowy), SUP-T8 (ALL), U-373MG (glejak) i T98G (glejak).
Ekstrakty komórkowe przygotowane z komórek dodatnich pod względem enzymu poddawano elektroforezie w 12,5% żelu poliakryloamidowym, zawierającym 0,1% sodowy siarczan dodecylu, wraz z różnymi ilościami MTAzy oczyszczonej w sposób opisany powyżej z wątroby bydlęcej.
Bardziej szczegółowo, nieoczyszczone ekstrakty komórkowe (10-150 pg na ścieżkę) rozdzielano elektroforetycznie w 12,5% żelu poliakryloamidowym zawierającym 0,1 % sodowy siarczan dodecylu. Po elektroforetycznym przeniesieniu na membrany nitrocelulozowe (0,45 mm; Bio-Rad, Richmond, CA), miejsca niespecyficznego wiązania blokowano 3% mlekiem w proszku w BBS. Następnie białka poddawano sondowaniu, w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej, antysurowicą rozcieńczoną 1:500 BBS zawierającym 3% mleko w proszku. Po intensywnym odpłukaniu białek BBS, reaktywne prążki wykrywano przez wiązanie 125J-białka A w ciągu 1 godziny (ICN Radiochemicals, Irvine, CA). Membrany płukano, osuszano na papierowych ręcznikach i eksponowano na film Kodak XAR-5 (tm) w temperaturze -70°C.
Prążki autoradiogramów skanowano stosując denstometr (Bio-Rad ) i oznaczano lo^^<iiowo wykorzystując krzywą wzorcową otrzymaną dla immunoreaktywnych prążków oczyszczonego enzymu.
182 298
C. Wyniki
Z linii komórek i biopsji nie pochodzących z płuc (tj. w glejakach), sześćdziesiąt siedem procent (4 z 6) było całkowicie pozbawionych immunoreaktywnego enzymu (figura 2). Z sześciu kolejnych biopsji glejaka ludzkiego o różnych właściwościach histologicznych (tabela I), pięć było całkowicie pozbawionych tego enzymu (figura 3). Doświadczenia kontrolne wykazały, że normalny mózg ludzki posiada wysoką aktywność MTAzową (figura 3, ścieżka 7). A zatem, całkowita nieobecność MTAzy jest wspólnym i specyficznym zaburzeniem metabolicznym glejaków ludzkich.
z 19 badanych linii komórkowych nie-drobnokomórkowego raka płuc było całkowicie pozbawionym MTAzy (patrz tabela 1 i figura 4).
Przykład II. Klonowanie METazy z Pseudomonasputida
Na podstawie częściowej sekwencji aminokwasowej METazy, opublikowanej przez Wakayamę i in., Biochem, 27: 1587-1591, 1988), zaprojektowano zdegenerowane startery oligonukleotydowe i wykorzystano w oznaczeniu PCR genu METazy.
W tym oznaczeniu PCR amplifikacji ulegał fragment o długości około 300 bp. Produkt PCR o długości 300 bp zsublokowano w plazmidzie pBluescript II KS (Stratagene, San Diego). Przy zastosowaniu wewnętrznej sondy oligonukleotydowej na produkt PCR, przez bloting Southerna zsubklonowanego produktu PCR zweryfikowano identyczność tego fragmentu jako genu METazy Dalsza analiza przez bloting Southerna wykazała, że wytwarzany przez PCR fragment hybrydyzował z fragmentem Bgl II DNA Pseudomonas putida o długości 5,0 kb.
W oparciu o te wyniki skonstruowano bakteriofagową bibliotekę genomowego DNA, zawierającą genomowy DNA Pseudomonas putida. Strawiony Bgl II DNA Pseudomonas putida poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia. Fragmenty Bgl II o wielkości od 4/kb do 6/kb wycinano i oczyszczano z żelu. Stosując fragment Klenowa częściowo wypełniono te fragmenty Bgl II i zsubklonowano w wektorze bakteriofagowym /Fix II. Wektor ten trawiono Xho I i częściowo wypełniono fragmentem Klenowa. Bibliotekę upakowano w cząsteczkach bakteriofaga stosując upakowujący ekstrakt gigapack firmy Stratagene. Po upakowaniu bibliotekę amplifikowano i miareczkowano.
W celu wyizolowania pełnego genu METazy, bibliotekę przeszukano stosując fragment utworzony przez PCR. Po przeszukaniu 200 000 klonów, wyizolowano osiem niezależnych pierwotnych klonów. Tylko dwa z tych ośmiu klonów były rzeczywiście dodatnie i unikalne. Pierwszy klon zawierał wstawkę o długości 5,1 kb, a drugi wstawkę o długości 5,9 kb. Wstawki zsubklonowano w pBluescript II, a następnie zmapowano i zsekwencjonowano. Określiliśmy, że sekwencja genu METazy obejmuje 1615 bp (patrz sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4).
Przykład III. Ekspresja zrekombinowanej METazy
Ekspresję genu zrekombinowanej METazy prowadzono w wektorze C5. Jest to ten sam wektor, który stosowano do ekspresji MTAzy (patrz np. przykład VII, równoległe zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 08/176 855, złożone 29 grudnia 1993 r.). Pojedynczą kolonię E. coli ze sklonowanym zrekombinowanym C5 zastosowano do zaszczepienia hodowli o objętości 50 ml. W hodowlach bakterii na dużą skalę stosowano standardowe podłoże LB uzupełnione o 50 pg/ml ampicyliny. Zaszczepioną hodowlę o objętości 50 ml inkubowano w ciągu nocy w temperaturze 37°C. Całonocną hodowlę rozcieńczono 100-krotnie świeżym podłożem LB. Komórki hodowano w dużych hodowlach (1 litr) w ciągu 1,5 godziny w temperaturze 37°C z intensywnym wytrząsaniem. Do indukcji ekspresji METazy do dużych hodowli dodawano izopropylotio-P-D-galaktozyd (IPTG) o stężeniach końcowych 0,01, 0,1 i 1 mM i hodowle inkubowano w ciągu dalszych 4 godzin. Stwierdzono, że optymalne dla ekspresji białka stężenie IPTG wynosi 1 mM.
Po upływie 4 godzin od dodania IPTG komórki zbierano przez wirowanie przy 19 000 x g w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Supernatant odrzucano, a osad zawieszano i płukano w zimnym roztworze soli fizjologicznej, po czym znowu wirowano. Osad zawieszonych komórek płukano w 100-200 ml 20 mM buforu fosforanów potasowych, pH 7,5, zawierającego 15 pM 2-merkaptoetanol. Dodawano 1 mM EDTA i 30 pM 5'-fosforanupirydoksalu (bufor A), po czym osad znowu wirowano. Przepłukaną, ponownie zawieszoną (w buforze) zawiesinę umieszczono w bombie do rozbijania komórek. Rozbijanie komórek prowadzono stosując ciśnienie 15,2 MPa N2 w ciągu 20 minut. Zlizowane komórki wirowano przy 43 000 x g w ciągu 20 minut w tempera182 298 turze 4°C). Supernatant ekstraktu komórkowego oczyszczono dalej stosując kolumnę powinowactwa barwnik-ligand.
Ekstrakt komórkowy (10 ml) nakładano na kolumnę (12 x 2,6 cm) z żelem „DYEMATRIX” [Orange A] (Amicon Inc., Beverly, MA). Kolumnę pakowano i zrównoważono zgodnie z instrukcjami producenta. Po nałożeniu próbki kolumnę płukano 5 objętościami kolumny buforu A w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Po tym etapie związany produkt eluowano liniowym gradientem 0-1,5 M w buforze A. Zbierano frakcje o objętości 10 ml i oznaczano aktywność enzymatyczną γ-liazy. Frakcje zawierające główny pik aktywności γ -liazy metioninowej łączono i zatężano do objętości 2-3 ml stosując „CENTRICON 30” (Amicon Inc.).
Do zatężonych frakcji dodawano stały (NH4)2SO4 (0,314 g/litr) do końcowego stężenia 2,4 M, po czym próbkę wirowano przy 13000 x g w ciągu 10 minut. Supernatant sączono przez sączek acrodis o średnicy porów 0,45 m (Amicon Inc.) przed iniekcją na kolumnę FPLC do chromatografii oddziaływań hydrofobowych Alkyl-Superose (agaroza) Hr 5/5 (Pharmacia), poprzednio zrównoważoną 2,4 M (NH4)2SO4 rozpuszczonym w buforze A używanym na poprzednich etapach. Związane białko eluowano przez liniowe obniżenie stężenia (NH4LSO4 (szybkość przepływu 0,5 ml/min). Frakcje zawierające aktywność METazy łączono i zatężano jak opisano powyżej. Stężenie białka mierzono metodą opisaną przez Bradforda.
Czystość preparatów enzymu sprawdzano za pomocą elektroforezy w obecności SDS w płytkach o grubości 1 mm (Nowex, San-Diego, CA) w układzie 10o% glicyna-tris. Aktywność METazy oznaczano przez pomiar wytwarzania kwasu 2-ketomasłowego w sposób opisany przez Esaki'ego i Skodę (Meth. Enzymol., 143:459-465 (1987), ujawnienie którego włączono do niniejszego opisu. Końcowy enzym miał aktywność właściwą 300 U/mg, gdzie U = 1 pM produktu wytwarzanego w ciągu minuty.
Przykład IV. Selektywne głodzenie ujemnych pod względem MTAzy komórek linii nie-drobnokomórkowego raka płuc
Zidentyfikowane w przykładzie I ujemne pod względem MTAzy komórki nie-drobnokomórkowego raka płuc traktowano in vitro w hodowli komórkowej z METazą i MTA środkiem do chemioterapii. Szczegółowo, linie komórkowe dodatnie (SK-MES-1) i ujemne (A-549) pod względem enzymu hodowano w ciągu 4 dni w (a) zawierającym metionionę podłożu wzbogaconym o 10%o dializowaną surowicę końską, (b) pozbawionym metioniny podłożu wzbogaconym o 10%o dializowaną surowicę końska i (c) pozbawionym metioniny podłożu wzbogaconym o 10% dializowaną surowicę końską i 16 pM MeSAdo. Proliferacja obu linii komórkowych, zwłaszcza ujemnych pod względem enzymu komórek A-549, była znacznie opóźniona w podłożu pozbawionym metioniny (27 i 3,3% wzrostu kontroli odpowiednio dla komórek SK-MES-1 i A-549). Dodanie MTA do tego samego podłoża zwiększało wzrost posiadających pozytywną, reakcję na enzym SK-MES-1 (77% wzrostu kontroli). Jednakże, proliferacja ujemnych pod względem enzymu komórek A-549 nie ulegała wzmocnieniu w obecności MTA (4,3% wzrostu kontroli) (tabela 2).
Te dane wskazują, że wzrost komórek ujemnych pod względem fosforylazy MeSAdo można selektywnie zablokować w pozbawionym metioniny podłożu wzbogaconym w MeSAdo.
Tabela 2
Wzrost (% kontroli)b Bez metioniny
Linia komórkowa Obecność enzymu3 Bez MeSAdo Z MeSAdo
SK-MES-1 + 270 ± 2,6 77 ± 4,7
A-549 - 3,3 ±0,6 4,3 ± 1,1
+ , obecny, -, nieobecny b Procent wzrostu kontroli = 100 x (wzrost komórek w podłożu pozbawionym metioniny z lub bez MT A)/(wzrost komórek w podłożu zawierającym metioninę)
Przykład V. Głodzenie pod względem metioniny ludzkich komórek złośliwych zrekombinowaną METazą
Dla zbadania antyproliferacyjnego wpływu zrekombinowanej METazy otrzymanej jak opisano w przykładach II i III, hodowano ludzkie komórki SK-M.ES-1 i A-549 w podłożu
188 298
DMEM z 10%o dializowaną płodową surowicą bydlęcą wzbogaconym o 0,06 U/ml zrekombinowanej METazy. Po upływie 3 dni określano proliferację komórek. Wpływ METazy wyrażono jako procent wzrostu komórek w podłożu bez dodanego enzymu.
Jak przedstawiono na figurze 4, wzrost komórek dodatnich pod względem enzymu (SK-MES-1) i komórek ujemnych pod względem enzymu (A-549) w podłożu wzbogaconym w METazę zwiększał się odpowiednio o 26,6 i 2,96%. Jednak po dodaniu 20 pM MTA jako alternatywnego źródła komórkowej metioniny, wzrost komórek dodatnich pod względem enzymu powracał do 61,4% kontroli, a wzrost komórek ujemnych pod względem enzymu spadał do 2,0%.
Podsumowanie sekwencji
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1 jest sekwencją.aminokwasowąMTAzy o pełnej długości.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2 jest sekwencją aminokwasową antygenowego peptydu MTAzy.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3 jest sekwencją aminokwasową antygenowego peptydu MTAzy, który różni się sekwencją aminokwasową od peptydu według sekwencji o numerze identyfikacyjnym 2.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 jest sekwencją nukleotydową polinukleotydu kodującego METazę.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 jest sekwencjąaminokwasowąMETazy przewidzianąna podstawie sekwencji nukleotydowej według sekwencji o numerze identyfikacyjnym 4.
182 298
LISTA SEKWENCCI (1) INFORMACJA OGÓLNA· (i) ZGŁASZAJĄCY : THE REGENTS OF THE UN!IVERSITY OF CALIFOINUA (ii) TYTUŁ WYfNALLAZKU : Sposób selektywnego głodzenia pod względem metioniny komórek złośliwych u ssaków (iii) LICZBA SEKWENCJI: 5 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICA: 201 N. Figueroa Street, 5th Floor (C) MIASTO: Los Angeles (D) STAN: California (E) KRAJ: USA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 90012 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: elastyczna dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny do IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US (B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:
(A) NAZWISKO: Berliner, Robert (B) -NUMER REJESTRACYJNY: 20.121 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ / NUMER W REJESTRZE: 5555-286 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: 213-977-0001 (B) TELEFAX: 213-97710003 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:
(i) CKUJRYSTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2960 podstawowych par
(ii) (B) (C) (D) RODZAJ TYP: kwas nukleinowy ILOŚĆ NICI: jedna TOPOLOGIA: liniowa CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(vii) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(ix) (B) CECHA: KLON: fosfataza mftyfaadenozety
NAZWA/KLUCZ: CDS (sekwencja kodująca) LOKACJA: 1..2760
182 298 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:
TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60
AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120
ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180
TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240
TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300
GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 360
TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420
CANMMNNNMN WHHNMHHMNN GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480
TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 540
GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600
TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660
TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720
GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 780
GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 840
ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT TWHHMMMHMH MNNNMNWMNW 900
AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 960
TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG 1020
GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG 1020
GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA 1122
ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA 1200
GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT 1260
GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA 1320
AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA·GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA 1380
GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT 1440
TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN WNNNMNNNNN NNTACCCTAC 1100
ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG 1100
GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1200
AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1200
TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1244
AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1200
TCTCTATTCT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1200
182 298
CCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920
AACTGAGTAG TCTAAATAAC ATGGCAGGAA GTGCAGANNN NNHHNNMMNH WNAATATA.CA 1920
ATAATAAAGG ATGGGCTGGT ATGGAAATAA GAGAAAAACA GAAAAATGCT CTCTGATAAG 2000
AATTATTAAA CTAACATAAC ATTATAGTGA ^GAGC^C CAATATATAA GAGTACCCGA 2190
AGTTACACAT ATGTTTTTAT TAAATTATAT ATTACATAAT AAATATATAA AATTGTATGA 2160
TAAAAGCTTC CAAACTATTT ACATTTTTTT CAAAAAAATA TAAAAAATAA ATCATAAAAC 2200
TATTTTTAAT CGACAACAAT TGTTAATAAC ATCCACCATA CATCCTAACA GTTTAATTCC 2280
CATTAAAAAT ATAATTTTCC CTTCCCTTTT GAAATTAATT 23-40
CAAAAATAAA CAAGACAATA AGTTTTTACC TTCAATTCTA TTATTTTAAA ATTTAAATTC 2000
TATATGAAAA CAATCACAAT CAATACTTTT TTATATAATT ATTTTTTTCT TTACATTTAT 2000
ATAATATATA CTCCTCTTTT AAATTTTCTT CATCTATTAA CTTTTTATAT GCTTTTGTCA 2020
ATAATAAATT GiGGTAATATA TAAAAAAAAT AATTTTTATA ATTTACCCCT CCTAACACTA 2520
CTACCCATTT TAATATTTCA TAAATTAATT TATTTTTTTT ATCTCTACTT AACATATCAT 2600
CAAAATAAAG T’GTGGTTTTT TATTGTAACA AATTAATTTT TTATTTTCTT CATATAATTT 2000
GTAATGATTA TAAGGTGTTC TAAAATTATT ATTTCTTCTT TTTTCATAAT AAAAAGTAAT 2760
TAC 0003 (0) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 0:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 90 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa
lii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(vii) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(B) KLON: peptydy fosfatazy metyloadenozyny
(ix) CECHA:
NAZWA/KLUCZ: peptyd LOKACJA: 9..90 (xi) OPIS SEKWENJJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKAYJNNYM 2
Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu 1 5 10 15
Gly (0) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas
182 298 (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA;
(B) KLON: peptydy fosfatazy metyloadenozyny (ix) CEcm
NAZWA/KLUCZ: peptyd
LOKACJA: 1..13 (xi) OPIS SEKWENJJI: SEKWENJJA O NIMSERZE IDENTYFIKICJEYYM 3:
Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gln Ile Gly Ser Met Glu 1 5 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1015 podstawowych par (B) TYP: kwas nuklotydowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJT CZĄSTECZKI: DNA (genowowy)
(vi) ŹRÓDŁO TOCHODENHIA:
(ix) (B) KLON: metionino-gamma-liaza CEHAA:
NAZWA/KLUCZ: CDS (sekwencja kodująca)
LOKACJA: 304..1497 (xi) OJIS SEKWECJJI : SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4
ATAGGATGGC CTGGTAGCCA GTGATATAGC CGTTGTCTTC CAGCACCGTG GCCCGGGGCC 60
AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGGGAGGTGG TCGGCCCGTT TA TCGGCGCG 122
TTGTGGTGTA ACCGCGGCAG GACCGGGGCG TGCCTCGGCT GGCGCGTTCA CGCGCTCTTT 110
TCGGGTCGTG CTCCGTTACT TCTTGTTTTT GTTGGACGAC GGAGGGAGCT CGGTCCCGCA 224
TTTTCCAAAC IATGCCGGAG CTC^T^W TCAGCTTATC ACCCCCCCCC CACCCCCGTC 300
GCC ATG Met CGC GIC TCC Irg Isp Ser CAT IIC IIC ICC GGT TTT TCC ACA CGG GCC CTT Ile 15 308
His Isn 5 Isn Thr Gly Phe 10 Ser Thr Arg Ala
1
CAC CIC GGC TIC GIC CCG CTT TCC CAC GGT GGT GGC ATT ATT ACC ACC 306
His His Gly Tyr Isp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Aeu v»i A rr A r
20 25 00
GTG TIC CAG ICC GCG ICC TIT GCC TTC CCG ACT GGT AGI ATC AGG AGC 484
Val Tyr Gln Thr Ila Thr Tyr Ila Phe Pro Thr Val Gil Tto A ty A ll
05 40 45
GCG TGC TTC GCC GGG GAG GAG GCG GGG CAC TTC TAC AIG Ad AIT ttc 486
Ila Cys Phe Ala Gly Glu Glu : Ila Gly His Phe Tyr SSr Arg IIl Ts(
55 00
182 298
AAC CCC ACC CTG GCC TTG CTC GAG CAA CGC ATG GCC TCG TTG GAG GGT 540
Asn Pro Thr Leu Ala Leu Leu Glu Gln Arg Het Ala Ser Teu Glu Gly
70 75
GGT GAG GCG GGA TTG GCG CTG GCG TCG GGG ATG GGA GCC AAT TAC GTC 5M
Gly Glu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser Gly Het Gly Ala Hu G Th Gee
85 90 95
ACC CTC TGG ACC CTG CTG CGG CCT GGT GAT GAG CTG ATC GCT GGG GCC 666
Thr Leu Trp Thr Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu Ile Val Gll Gao
100 105 110
ACC TTA TAT TGC TAC ACC TTT GCG TTC CTG CAC CAT GGC ATT TTC TAC 684
Thr Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu
115 120 125
TTC TTT TTC AAG ATC CAC CAT TTC GAC CTT AAC TAT TCC AAG ACC CTC 762
Phe Gly Val Lys Ile His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu
160 165 140
AAA ACT ACT ATC AAC AGC AAA ACT CAG ATG ATC TAC TTC GAA ACA CCC 780
Lys Ala Ala Ile Asn Ser Lys Thr Arg Met Ile Tyr Phe Glu Thr Pro
145 10G 155
ACC AAC CCC AAC ATT CAA CTT TTG TAT ATA ACT GCG ATC GTC TAT ACA 288
Ala Asn Pro Asn Met Gln Leu Val Asp Ilu Ala Ala Val Val Glu Ala
160 165 170 175
TTC CTG GGG TAC GTA CTT CTT CTG CTT GTC GdC AAC Ad Gd GTC ACG 876
Val Arg Gly See AAp GbI Lru Val VbI Val Asp Asn TT»f Gyy Thr
180 185 190
CCC TAC CTG ICA CGG CCA CTT AAA CCT TTG GCA TAC CTG GTG CTG GCA 924
Pro Tyr Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Vaa His
195 200 205
TCG ACA ACC AAT TAC CTC AGT TGC CAT GGC GAC ATC ACT GGG dG GCT 972
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp He Thr AU Gl^ Ger
210 215 220
GTC TTT TTG CGC Ad GCT TTG GTC TAC CGC ATT Cd Cd TAA Gd GTT 1020
Val Val Gly Arg Lys Ala Lru Val Asp Arg Ile Arg Lru Glu GIt yer
225 260 265
AAA TAC ATG ACC GGT TCA GCC TTT TCA CCG CAT GAC CCT GCT TTT TTC 1068
Lys Asp Met Thr Tly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu
240 245 250 255
ATT CGC GTC ATC AAT ACC CTT GCC CTG CTC ATT TAC CTT CAT TGC dC 1116
Het Arg Tly Ile Lys Thr Leu Ala Leu Arg Het Asp Arg His Cys su
260 265 270
AAC GCC CTG TAC TTC GCT CAT TTC CTT ACC CCC CAT CCC CAT GTG GAG 114
Asn Ala Leu Glu Val Ala Tln Phe Leu Ala Gly Gln Pro Gln Vaa Glu
275 280 285
CTT ATC CAC Cd GCC GTC Td CCT iCC TTT GCC CAT TAC GTA CCT GTC 1212
Leu Ile Hih Gro Tly Llu Gro GSr Hie AU Tln Tyr Glu Leu Hu
290 295 600
CAT CCC CAG Ad CGT TTT CCG GTC GTC ATC AAT CCC TTT GAG CTC MG 1260
Tln Arg Gln Mer Arg Lru Pro Gly Gly Mrt Ile Ala Phr Glu Leu Lyy
605 610 515
182 298
GGC Gly 320 GGT ATC GAG GCC Gly Ile Glu Ala GGG CGC GGG STT AFT AFF AGC SCG ACF ACT SLe ATT She 335 1308
Gly Arg 327 Gly She Met Am 330 All SLe dl
GCC CGT GCG GTG AGC CTG GGG CGlF GCC GAG ATG GCG AGC AAG ACtC CCG 1656
Ala Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Sl SSr Alu All SGn Sis Pro
340 347 370
GCG AGC ATG ACG CAC TCC AGT TAC ACG CCA ACFl GAG CGG GCG CAT CAC 1600
Ala Ser Het Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gln Glu Arg Ala His His
377 360 367
GGG FTF TCA GAG GGG CTG GTG FGG TTG TCF GTG GGG CTG GAG GAT GTG 1657
Gly I le Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val
370 375 380
GAG GAC CTG CTG GCA GAT ATC GAG TTG GCG TTG GAG GCG TGT GCA 1607
Glu Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala
387 390 397
TGAACTTGCC TTGCAGGATC GGGAACACTT GCCCAATGCC TCACGGGATC AGGCGATGGC 1557
ACTTTGGATG AGCTGGTGAA TTGGCCGGCT TATCCAAGAG GAGTTTAAAA TGACCGTA 1615 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 398 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTEC^H : peptyci (xi) OPIA SEKWENAH : SEKWENCJA O NUMERZE ITYFTKFCYANYM^M 5
Met Arg , Asp i Ser His . Asn . Asn ' Thr i Gly Phe Ser Thr AgS a lit ile His
6 7 60 67
Mis Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Lej Val Pro Pro Val
20 G5 30
lyr Gln Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ala
37 00 45
Cys Phe Ala Gly Glu Glu Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser Asn
70 77 60
Pro Thr Leu Ala Llu See All . Gln Arg Met All Ser Leu Atu dl dy
65 70 77 88
Glu Ala Gly Leu Ala Llu All Ser Gly Het dy Ala He Thr Ser Thr
87 70 77
Leu Τιηρ Thr Leu Leu Arg Pro dy Asp Glu Ala tle Val Gly Arg STh
600 607 110
Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His tHi Gly Ile dt Glu Phe
H7 620 162
Gly Val iys tIl Ais Ais Val VUp Leu Ast e Aut sIf paf Ala Sfi Aye
630 635 140
182 298
Ala . Ala Ile Asn · Ser Lys Thr Arg Met I le Tyr Phe Glu Thr Pro Ala
145 150 155 160
Asn Pro Asn Met Gln Leu Val Asp I le Ala Ala Val Val Glu Ala Val
165 o 10 175
Arg Gly Ser Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys TTr Pro
180 iao 190
Tyr Leu Gln Arg Pro Leu Glu L<uj Gly Ala Asp Leu Val Val Η i s Ser
195 200 205
Ala Thr Lys Tyr Leu Seo Gly His Gly A^{p Ile Thr Ala Gly Leu Val
210 215 220
Val Gly Arr Oys A Oa Lru OLI Asp Org irg Arg L eu Glu Glu leu Lys
225 230 235 220
Asp Het Thr GIg y Oa AAa Oru OLr Ore His Asp A la P Oa leu Luu Ma O
245 250 255
Arg Gly He Lys TS^o Leu Ala Imj Arg Met Asp Arg His Cys Ala Asn
260 265 270
Ala Leu Glu Val AOa Gin Phe lun Ml u ly Gln a oo Gln GaL oog Lea
275 2^0 2^5
Ile His Oyy O Pr Oly Leu Ppo Ser Phe Ala Gln Tyy Glu Leu Ala Gln
290 299 300
Arg Gln Met Arg Leu Pro Gly Gly Met Ile Ala Phe Glu Leu Lys Gly
305 310 315 320
Gly Ile Glu Air a Oy , Aiy 1 Oly Pre Gul Ase AIm t ou Gin Oru OLe Olu
325 330 335
Arg Ala eal Ser Leu Gly Asp AIo Glo Ser Leu Pla Gln His Pro ma
340 345 350
Ser Het Thr His Oer OSr Oyr Tłłr Pr^o Gln Glu Arg Aia His Ohs Gly
355 360 365
Ile Ser GGg Gly Leu Vel Arg Leu Ser eal Gly Lin Glu Asp VvI Glu
370 375 380
Asp Leu Lu Ala Asp He Glu Leu Ala Leu Glu Ale Cys Ala
385 390 395
182 298
MeSAdoase
MDBK
Kolt -4 f ' | SUP-T8
J'.': | BV173
J Molt-16 U937 K-Tl | NALL-l K562 DHL-9 ' | HSB2
FIG. 2A
FG 2B
Nowotwory pierwotne
Linie komórkowe
KD
FIG. 3B
KD
SI A'i27
I A-549 | CALU-1 CALU-3
CALU-6 ll Hs 242T l| SK-LU-1 || SK-MES-1
HLF-a
MDBK
FG 3A
182 298
FIG. 4
182 298
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.
Cena 4,00 zł.

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Środek do chemioterapii komórek nowotworowych nowotworu złośliwego u ssaków, które wykazująbezwzględne zapotrzebowanie na metioninę, ale nie zawierają fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy), znamienny tym, że zawiera mieszaninę terapeutycznie skutecznej ilości L-deamino-γ -merkaptometano-liazy L-metioniny (METazy) o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 i terapeutycznie skutecznej ilości metylotioadenozyny (MTA) w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku.
  2. 2. Zestaw do wykrywania obecności lub braku katalitycznie aktywnej lub katalitycznie nieaktywnej MTAazy w próbce komórek ssaka, znamienny tym, że zawiera sondy oligonukleotydowe specyficznie hybrydyzujące z sekwencją nukleotydową oznaczonąjako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1.
  3. 3. Katalitycznie aktywny polipeptyd METazy o sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5.
  4. 4. Katalitycznie aktywny polipeptyd METazy według zastrz. 3, znamienny tym, że jest polipeptydem rekombinacyjnym.
  5. 5. Katalitycznie aktywny polipeptyd METazy według zastrz. 4, znamienny tym, że jest kodowany przez polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4.
  6. 6. Katalitycznie aktywny polipeptyd METazy według zastrz. 5, znamienny tym, że ulega ekspresji w organizmie prokariotycznym.
  7. 7. Polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej oznaczonej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 kodujący katalitycznie aktywną METazę.
  8. 8. Polipeptyd o sekwencji aminokwasowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5.
  9. 9. Polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej zasadniczo identycznej jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4.
PL94315229A 1993-12-29 1994-12-22 zestaw do wykrywania obecnosci lub braku katalitycznie aktywnejlub katalitycznie nieaktywnej MTAzy, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy oraz polinukleotyd kodujacy katalitycznie aktywna METaze PL PL PL PL182298B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/176,413 US5571510A (en) 1993-12-29 1993-12-29 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals
PCT/US1994/014919 WO1995017908A1 (en) 1993-12-29 1994-12-22 Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL182298B1 true PL182298B1 (pl) 2001-12-31

Family

ID=22644262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL94315229A PL182298B1 (pl) 1993-12-29 1994-12-22 zestaw do wykrywania obecnosci lub braku katalitycznie aktywnejlub katalitycznie nieaktywnej MTAzy, katalitycznie aktywny polipeptyd METazy oraz polinukleotyd kodujacy katalitycznie aktywna METaze PL PL PL

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5571510A (pl)
EP (1) EP0805690B1 (pl)
JP (1) JPH09507754A (pl)
CN (1) CN1143325A (pl)
AT (1) ATE221785T1 (pl)
AU (1) AU694161B2 (pl)
CA (1) CA2180262A1 (pl)
CZ (1) CZ291281B6 (pl)
DE (1) DE69431167T2 (pl)
HU (1) HU221341B1 (pl)
NO (1) NO962714L (pl)
NZ (1) NZ278271A (pl)
PL (1) PL182298B1 (pl)
RO (1) RO117542B1 (pl)
RU (1) RU2153885C2 (pl)
TJ (1) TJ294B (pl)
WO (1) WO1995017908A1 (pl)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6461851B1 (en) 1992-11-19 2002-10-08 Anticancer, Inc. High expression modules containing two or more tandem copies of a methioninase encoding sequence
US5891704A (en) * 1992-11-19 1999-04-06 Anticancer, Inc. Method to produce high levels of methioninase
US6911309B2 (en) * 1993-12-29 2005-06-28 The Regents Of The University Of Californnia Nucleic acids encoding MTAse
US6870037B1 (en) * 1995-07-03 2005-03-22 Arch Development Corporation Methylthioadenosine phosphorylase compositions and methods of use in the diagnosis and treatment of proliferative disorders
US5861154A (en) * 1995-10-30 1999-01-19 Shionogi & Co., Ltd. Recombinant L-methionine γ-lyase
JP3375834B2 (ja) 1995-10-30 2003-02-10 塩野義製薬株式会社 組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼ
WO2002020807A1 (fr) * 2000-09-05 2002-03-14 Shionogi & Co., Ltd. L-methionine $g(g)-lyase a fonction modifiee
US20030129262A1 (en) * 2001-08-30 2003-07-10 Epner Daniel E. Methionine restriction for cancer therapy
AU2003261354A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-23 The Regents Of The University Of California New uses for inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase
CA2516191A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Salmedix, Inc Compositions and methods for the detection and treatment of methylthioadenosine phosphorylase deficient cancers
US20110002978A1 (en) * 2003-06-17 2011-01-06 Harrison Roger G Enzyme prodrug cancer therapy selectively targeted to tumor cells or tumor vasculature and methods of production and use thereof
RU2393866C2 (ru) * 2005-03-17 2010-07-10 Проекто Де Биомедисина Сима, С.Л. Применение 5'-метилтиоаденозина (мта) для предотвращения и/или лечения аутоиммунных заболеваний и/или отторжения трансплантата
WO2009032057A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Adam Lubin Method for the selective therapy of disease
US8480731B2 (en) * 2008-04-14 2013-07-09 Medtronic ATS Medical, Inc. Tool for implantation of replacement heart valve
US9987241B2 (en) 2014-09-25 2018-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Enzyme conjugate and prodrug cancer therapy
WO2020032951A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Antimalarial enzyme conjugates, kits containing same, and methods of producing and using same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
NO962714L (no) 1996-08-26
DE69431167T2 (de) 2003-04-17
HU221341B1 (en) 2002-09-28
JPH09507754A (ja) 1997-08-12
RU2153885C2 (ru) 2000-08-10
ATE221785T1 (de) 2002-08-15
WO1995017908A1 (en) 1995-07-06
RO117542B1 (ro) 2002-04-30
EP0805690A4 (en) 1999-05-12
CZ186996A3 (en) 1996-12-11
AU1445995A (en) 1995-07-17
TJ294B (en) 2001-03-30
NZ278271A (en) 2001-07-27
AU694161B2 (en) 1998-07-16
EP0805690A1 (en) 1997-11-12
CA2180262A1 (en) 1995-07-06
EP0805690B1 (en) 2002-08-07
CN1143325A (zh) 1997-02-19
CZ291281B6 (cs) 2003-01-15
HUT75070A (en) 1997-04-28
HU9601695D0 (en) 1996-08-28
US5571510A (en) 1996-11-05
NO962714D0 (no) 1996-06-27
DE69431167D1 (de) 2002-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Weisgraber et al. Human apolipoprotein E. Determination of the heparin binding sites of apolipoprotein E3.
JP3541296B2 (ja) 腫瘍血管内皮細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体とその利用方法
EP0805690B1 (en) Method for selective methionine starvation of malignant cells in mammals
KR100372119B1 (ko) 지질화된단백질을경혈관적및세포내로전달하는방법
JP2000000091A (ja) 抗―ヒト乳癌モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ
JP2007197439A (ja) 中皮抗原及びそれを標的化するための方法及びキット
JPWO1999021577A1 (ja) 平滑筋増殖抑制組成物、動脈硬化症診断方法及びそのキット
WO1989007269A1 (en) Method for the preparation of antibody-fragment conjugates
US20150183843A1 (en) Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof
PT98398A (pt) Processo de preparacao de composicoes farmaceuticas, a base de homologo de d30 de preparacao de um anticorpo anti-(idiotipo d30), de deteccao da quantidade de homologo de d30 em amostras e de deteccao da quantidade de um complexo receptor mac-1:homologo de d30 numa composicao liquida
JPH0742320B2 (ja) 転移性ヒト腫瘍を確認する方法および組成物
US7094580B2 (en) Methods for producing pure perlecan and other heparan sulfate proteoglycans
Madaio et al. Effect of antibody charge and concentration on deposition of antibody to glomerular basement membrane
US5294698A (en) Human phospholipase activating protein and methods for diagnosis of rheumatoid arthritis
JPH06505496A (ja) 活性因子ｘ１１１の活性化を阻害するための組成物と方法
JPH05506241A (ja) ３５ｋｄ腫瘍関連タンパク質抗原および免疫複合体
JP2001050964A (ja) 関節炎関連メラノトランスフェリンの測定方法および試薬
KR900008014B1 (ko) 펩타이드 항체의 제조방법
WO1993020439A1 (en) Compositions and methods for regulating cellular signal transducing systems
Buchta Structure-function studies of the acute phase response protein: C-reactive protein
Larue et al. Optimization of mouse IgG fragmentation technique in the selection of monoclonal antibodies for myocardial infarct imaging
JPH07165794A (ja) 膵臓コレステロールエステラーゼによって仲介されたヒトのコレステロール吸収を阻害するための方法および試薬
EP0331743A1 (en) Protein derived from living body
Lotwick Anti-(acetylcholine receptor) antibodies in myasthenia gravis