CZ291471B6 - Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem - Google Patents
Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291471B6 CZ291471B6 CZ20011115A CZ20011115A CZ291471B6 CZ 291471 B6 CZ291471 B6 CZ 291471B6 CZ 20011115 A CZ20011115 A CZ 20011115A CZ 20011115 A CZ20011115 A CZ 20011115A CZ 291471 B6 CZ291471 B6 CZ 291471B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- erythropoietin
- isoforms
- isoform
- epo
- thr
- Prior art date
Links
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 231
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title claims abstract description 179
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title claims abstract description 179
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 168
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims abstract description 167
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title claims abstract description 153
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 39
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 60
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 57
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 57
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 28
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 26
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 26
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 16
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 16
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 15
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 11
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 10
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 9
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 3
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010064886 beta-D-galactoside alpha 2-6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000000581 polycythemic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- -1 / For 125 Chemical compound 0.000 description 2
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 108010027485 asialoerythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010057005 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- MJEMIOXXNCZZFK-UHFFFAOYSA-N ethylone Chemical compound CCNC(C)C(=O)C1=CC=C2OCOC2=C1 MJEMIOXXNCZZFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010057760 hepatic sialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Zp sob p° pravy sm si erythropoietinov²ch isoforem, p°i n m se a) vybere dv nebo v ce erythropoietinov²ch isoforem, z nich ka d vykazuje jedin² isoelektrick² bod a m specifick² po et sialov²ch kyselin na isoformu erythropoietinu, kde uveden² po et je vybr n ze skupiny, zahrnuj c 1 a 14; a b) tyto isoformy se sm s tak, aby v²sledn sm s vykazovala p°edem ur en² po et sialov²ch kyselin na isoformu erythropoietinu.\
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy směsi erythropoietinových isoforem.
Dosavadní stav techniky
Erythropoietin je glykoproteinový hormon zjištěný při zrání erythroidních progenitorových buněk na erythrocyty. Má podstatný význam při regulaci hladin červených krvinek v oběhu. Přirozeně se vyskytující erythropoietin je produkován játry během fetálního života a ledvinami u dospělých a cirkuluje v krvi a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anemie je téměř vždy důsledkem renálního poškození, působícího snížení produkce erythropoietinu v ledvinách. O rekombinantním erythropoietinu, produkovaném technikami genového inženýrství, zahrnujícími expresi proteinového produktu hostitelskými buňkami transformovanými genem kódujícím erythropoietin bylo zjištěno, že je účinný, jestliže se použije při léčení anemie vzniklé z chronického renálního poškození.
Dosud byla dostupnost erythropoietinu velmi omezena. I když je protein přítomen v lidské moči, vylučovaná množství jsou příliš nízká pro praktický zdroj erythropoietinu pro terapeutické využití. Pacienti postižení aplastickou anemií vykazují zvýšení hladiny urinárního erythropoietinu ve srovnání se zdravými individui, ale omezené množství takové moče rovněž činí tento zdroj nepraktickým. Purifikace lidského urinárního erythropoietinu podle Miyakeho a spol., J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977), používá jako výchozí materiál moč od osob s aplastickou anemií.
Identifikace, klonování a exprese genů, kódujících erythropietin je popsán v patentu US 4 703 008. Linnem. Popis purifikace rekombinantního erythropoietinu z buněčného média, podporujícího růst savčích buněk, obsahujících rekombinantní erythropoietinové plasmidy je např. zahrnuta v patentu US 4 667 016 Laie a spol. Exprese a získání biologicky aktivního rekombinantního erythropoietinu ze savčích hostitelských buněk, obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantním plasmidu, poskytuje v první řadě dostatečné množství erythropoietinu vhodného proterapeutické aplikace. Dále znalost genové sekvence a dostupnost větších množství purifíkovaného proteinu umožňuje lepší pochopení působení tohoto proteinu.
Biologická aktivita proteinu je závislá na jeho struktuře. Zejména primární struktura proteinu (tj. jeho aminokyselinová sekvence) poskytuje informaci, která umožňuje formaci sekundární (např. α-helx nebo β—list) a terciární (trojrozměrné přehyby) struktury polypeptidu během a po jeho syntéze. Přerušení vlastních sekundárních a terciárních struktur zavedením mutací nebo chemickým nebo enzymatickým zpracováním, může vést ke snížení biologické aktivity.
V prokaryotních organismech jsou biologické aktivity proteinů z velké části ovládány výše uvedenými strukturami. Na rozdíl od proteinů z prokaryotních buněk je mnoho buněčných povrchů a sekretovaných proteinů v eukaryotních buňkách modifikováno jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace označovaná jako glykosylace může výrazně ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může také být důležitá pro stabilitu proteinu, sekreci a subcelulární lokalizaci. Vlastní glykosylace může mít základní význam pro biologickou aktivitu. Některé geny z eukaryotních organismů, když jsou exprimovány v bakteriích (např. E. coli), které postrádají celulámí procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, které mají malou nebo žádnou aktivitu díky nedostatku glykosylace.
Glykosylace se uskutečňuje při specifických místech podél polypeptidového hlavního řetězce a je obvykle dvou typů: O-vázané oligosacharidy jsou spojené se serinovými nebo threoninovými zbytky, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, jestliže jsou
-1 CZ 291471 B6 tyto části sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků nalezené v každém typu, jsou rozdílné. Jeden typ cukru je obvykle nalezen na obou, je jím N-acetylneuraminová kyselina (dále nazývaná jako sialová kyselina). Sialová kyselina je obvykle terminální zbytek obou N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a díky svému negativnímu náboji uděluje glykoproteiny kyselý charakter.
Jak lidský z moče získaný erythropoietin, i rekombinantní erythropoietin (exprimovaný v savčích buňkách), mající aminokyselinovou sekvenci 1 -165 lidského erythropoietinu, obsahují tři N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, kde tyto řetězce tvoří asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace probíhá na asparaginových zbytcích, umístěných v polohách 24, 38 a 83, zatímco O-vázané glykosyly probíhá na serinovém zbytku umístěném v poloze 126 (Lai a spol., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy a spol. Arch. Bioche. Biophys. 265, 329 (1988). Oligosacharidové řetězce mohou být modifikovány terminálními zbytky sialové kyseliny. Enzymatické zpracování glykosylovaného erythropoietinu pro odstranění zbytků sialové kyseliny vede ke ztrátě in vivo aktivity, ale nepůsobí ztrátu aktivity in vitro (Lowy a spol., Nátuře 185, 102 (1960); Goldwasser a spol., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Toto chování může být využito při rychlém odstranění asialoerythropoietinu z oběhu po interakci s hepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein (Morrell a spol. J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs a spol. Am. J. Phisiol. 227, 1385 (1974); Ashwell a spol., Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Erythropoietin tak vykazuje in vivo biologickou účinnost pouze, když je sialylován, aje tak zabráněno jeho vazbě hepatickým vázacím proteinem.
Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích není definována dostatečně. Bylo zjištěno, že neglykosylovaný erythropoietin má velmi sníženou in vivo aktivitu ve srovnání s glykosylovanou formou, ale udržuje si aktivitu in vitro (Dordal a spol. Endocrinology 116, 2293 (1985); Linův patent výše). V další studii nicméně odstranění N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharidových řetězců jednotlivě nebo společně mutagenesí asparaginových nebo serinových zbytků, které jsou glykosylačními místy, výrazně snižuje in vitro aktivitu přeměněného erytropoietinu, který je produkován v savčích buňkách (Dube a spol. J. Biol. Chem. 263,17516 (1988)).
Glykoproteiny jako je erythropoietin mohou být separovány na různě nabité formy za použití technik jako je isoelektrická fokusace (IEF). Jsou uváděny IEF studie surového a částečně purifíkovaných erythropoietinových přípravků (Lukowsky a spol., J. Biochem 50, 909 (1972); Shelton a spol. Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr a spol. Biochem. Biphys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). Nanejvýš tři nebo čtyři frakce mající erythropoietinovou aktivitu byly rozlišeny IEF v těchto studiích a žádná nebyla charakterizována s ohledem na obsah cukrů. Dále nebyl stanoven žádný vztah mezi isoelektrickými body frakcí a jejich biologickou aktivitou.
V průběhu purifikace urinámího erythropoietinu z lidské moče, popisované v práci Miyakeho a spol., supra, byly zjištěny dvě erythropoietinové frakce z chromatografie na hydroxylapatitu označené jako II a IIIA, mající stejnou specifickou aktivitu. Následující analýza cukrů frakce II a IIIA prokázala, že frakce II má větší průměrný obsah sialové kyseliny než frakce IIIA (Dordal a spol. supra).
Podstatou předloženého vynálezu je poskytuje separované a izolované isoformy erythropoietinu, mající definovaný obsah sialových kyselin a biologickou aktivitu. Farmaceutické přípravky, obsahující takové molekuly by mohly být terapeuticky prospěšné.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem, jehož podstata spočívá v tom, že se
-2CZ 291471 B6
a) vybere dvě nebo více erythropoietinových isoforem, z nichž každá vykazuje jediný isoelektrický bod a má specifický počet sialových kyselin na isoformu erythropoietinu, kde uvedený počet je vybrán ze skupiny, zahrnující 1 až 14; a
b) tyto isoformy se smísí ta, aby výsledná směs vykazovala předem určený počet sialových kyselin na isoformu erythropoietinu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 představuje analytický isoelektrickofokusační gel z dělení rekombinantních erythropoietinových isoforem. Gelové dráhy 1-11 představují isoformy v rozmezí od méně kyselých (vyšší pí) ve dráze I ke kyselejším (nižší pí) ve dráze 11. Čištěný rekombinantní erythropoietin obsahující směs isoforem 9-14 je také uveden v poslední levé a pravé dráze gelu.
Obr. 2 představuje vztah mezi počtem sialových kyselin na erythropoietinovou isoformu a specifickou aktivitu in vivo každé isoformy, vyjádřenou jako jednotku na mg erythropoietinového polypeptidu. Na obr. 2A, byla koncentrace každé erythropoietinové isoformy stanovena Bradfordovou proteinovou zkouškou, na obr. 2B, byla koncentrace Stanovena absorbancí při 280 nm, na obr. 2C, byla koncentrace stanovena pomocí RIA.
Obr. 3 představuje analytický isoelektrofokusační gel definovaných směsí rekombinantních erythropoietinových isoforem připravených aniontovýměnnou chromatografií za různých podmínek. Gelové dráhy 1-6 představují eiythropoietinové isofcrmy eluované při vysocesolném promývání po proinývání Q-Sepharosové kolony 150 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 150 mM kyselinou octovou (nepufrovaná), 200 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 250 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 300 mM kyselinou octovou, pH 4,7 nebo 300 mM kyselinou octovou (nepufrovanou). Čištěný rekombinantní erythropoietin, obsahující směs isoforem získaný za použití postupů popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol. supra, stím rozdílem, že DEAE-agarozová chromatografie je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, je znázorněn ve dráze zcela vlevo na gelu.
Obr. 4 představuje separaci erythropoietinových isoforem 8 až 12 získaných zpracováním média buněk na sloupci Q-Sepharozy gradientem klesajícího pH a zvyšující se iontové síly. Podíly z frakcí označených 2 až 40 byly podrobeny analytické isoelektrické fokusaci. Čištěný rekombinantní erythropoietin obsahující směs isoforem, získaných za použití postupů popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol. supra, s tím rozdílem, že DEAE-agarosová chromatografie byla nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, je uveden v poslední levé dráze tohoto gelu.
Obr. 5 představuje aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu. Čtvrtky označují asparaginové zbytky, ke kterým jsou připraveny karbohydrátové řetězce a hvězdičky označují threoninové a serinové zbytky modifikované karbohydrátem. Další glykosylační místa poskytnutá v analozích z příkladu 6 jsou indikována mutacemi asparaginu, šeřinu a thereoninu.
Obr. 6A, 6B a 6C představují série stupňů klonování při generování plasmidů pro konstrukci a analýzy analogů lidského erythropoietinu. Tyto analogy mají aminokyseliny změněné jak je uvedeno na obr. 5, které poskytují další glykosylační místa.
Obr. Ί představuje analýzy Western blot COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoietinu a indikovaných erythropoietinových analogů. Analogy /Asn9, Ser” /EPO, /Asn69 /EPO, /Asn125, Ser127 /EPO a /Pro124, Thr125 /EPO jsou konstruovány jak je popsáno v příkladu 6. Analogy /Pro125, Thr127 /EPO, /Asn12, Ser128 /EPO a /Thr1 ,
-3 CZ 291471 B6
Ser127/EPO, které neobsahují další karbohydrátové řetězce jsou zde uvedeny pro srovnáni.
Obr. 8 představuje Western blot analýzu COS buněčných supematantu sekvencí lidského erythropoietinu a indikovaných erythropoietinových analogů po zpracování sNglykanasou. Analogy /Thr125 /EPO a /Pro124, Thr125 /EPO jsou konstruovány jak je popsáno v příkladu 6. Analogy /Val126 /EPO, /Pro124 /EPO, /Pro125 /EPO, /Thr127 /EPO, /Pro125, Ser127 /EPO a /Thr125, Ser127/EPO jsou uvedeny pro srovnání.
Obr. 9 představuje isoelektrofokusační gel poolů 2, 3 a 4 získaných chromatografií na Q-Sepharose a C4 reverzní fázi zpracováním buněčného média, které podporuje růst CHO buněk transfektovaných erythropoietinovou cDNA, obsahující /Thr125/mutaci. Čištěný rekombinantní erythropoietin, obsahující směs isoforem je získán za použití postupů, popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol., supra, s tím rozdílem že DEAE-agarosová chromatografie je nahrazena chromatografií na Q-sepharose, tyto erythropoietiny jsou uvedeny v levých a pravých drahách gelu.
Podle předloženého vynálezu jsou poskytovány isoformy erythropoietinu. Isoelektrická fokusace (IEF) dělení proteiny na základě náboje. Při umístění do gradientu pH a působením elektrického pole budou proteiny migrovat k bodu, ve kterém nemají náboj sítě a zůstávají na tomto místě. Toto je isoelektrický bod (pí) proteinu. Každý jednotlivý pruh pozorovaný při IEF představuje molekuly mající určitý pí a tím tedy obecně i stejný náboj a jsou nazvány jako isoformy. Použitý výraz „erythropoietinová isoforma“ označuje erythropoietinové přípravky, mající jediné pí a mající stejné aminokyselinové sekvence.
Ve výhodném provedení je erythropoietin produkt exprese exogenní DNA sekvence, která byla transfektována do jiných eukaryotních hostitelských buněk než lidských, tj., ve výhodném provedení je erythropoietin „rekombinantní erythropoietin“. Rekombinantní erythropoietin je výhodně produkován postupem popsaným Linem, patent US 4 703 008, uvedeným zde pro úplnost. Rekombinantní erythropoietin je výhodně čištěn podle obecných postupů popsaných v příkladu 2 a patentu US 4 667 016 Laie a spol., který je zde uveden jako odkaz nebo alternativně postupem popsaným v příkladu 2, kde chromatografie na DEAE agarose je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose. V modifikaci se sloupcem Q-Sepharosa se 55 mM NaCl nahradí 25 mM NaCl v pufrovaném roztoku pro uvedení kolony na neutrální pH a 140 mM NaCl se nahradí 75 mM NaCl v pufrovaném roztoku pro eluci erythropoietinu z kolony. Tento materiál při analýze elektroforézou na polyakiylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným, migruje jako jediný druh (tj. pruh). Jestliže se čištěný erythropoietin podrobí IEF, jsou v gelu zřejmé násobné pruhy, které indikují, že jsou přítomny různě nabité formy glykoproteinu.
Bylo nalezeno, že jednotlivé isoformy rekombinantního erythropoietinu, mající aminokyselinovou sekvenci z moče získaného lidského erythropoietinu odpovídající erythropoietinovým molekulám, majícím od 1 do 14 sialových kyselin a každá isoforma přítomná v čištěném rekombinantním erythropoietinu má in vivo aktivitu která má vztah k počtu sialových kyselin isoformy. Výraz „erythropoietin“, jak je zde použit, zahrnuje přirozeně získaný erythropoietin, z moče získaný lidský erythropoietin jakož i nepřirozeně se vyskytující polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci a glykosylaci dostatečně duplikativní s přirozeně se vyskytujícím erythropoietinem pro získání in vivo biologických vlastností takových, že buňky kostní dřeně zvyšují produkci retikulocytů a červených krvinek.
Surové přípravky erythropoietinu mají mnoho isoforem, ale materiál čištění například Laien a spol. supra příklad 2, obsahuje převážně šest isoforem při analýze IEF. Dále byla detekována nejméně jedna další isoforma vyšší kyselosti při použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4. (Tato více kyselá forma, migrující při >14 sialových kyselinách na IEF gelu může obsahovat negativní náboje nesialové kyseliny jak je zřejmé z odolnosti vůči štěpení sialidasou). Tyto isoformy se od sebe liší obsahem sialové kyseliny. Jak je uvedeno v příkladech, je toto
-4CZ 291471 B6 doloženo izolací 10 takových isoforem při preparativní IEF a stanovením obsahu sialové kyseliny u pěti z nich. Z isoforem zkoušených na obsah sialové kyseliny bylo zjištěno, že pět isoforem obsahuje buď 9, 10, 11, 12, nebo 13 zbytků sialové kyseliny.
Existuje vztah mezi relativní in vivo specifickou aktivitou erythropoietinu a počtem zbytků sialové kyseliny na molekulu erythropoietinu od isoformy 5 od 11 (každá isoforma je zde označena počtem sialových kyselin na molekulu erythropoietinu). Isoformy 11 až 14 mají přibližně stejnou in vivo specifickou aktivitu. Isoformy 5-14 byly studovány pokud jde o jejich in vivo aktivitu exhypoxickou polycythemickou biozkouškou na myších a množství každé přítomné isoformy je stanoveno Bradfordovou proteinovou zkouškou, absorbance při 280 nm nebo radioimunozkouškou (RIA) erythropoietinu. RIA stanovení (Egrie a spol. Imunobioogy 172, 213 (1986)) vyjádřené jako jednotky/ml jsou rozděleny mezi 212, 770 jednotkami/mg erythropoietinového polypeptidů, průměrná specifická aktivita čištěného erythropoietinu stanovené pomocí RIA udávají proteinové koncentrace izolovaných isoforem nebo směsí isoforem, vyjádřených jako mg erythropoietinového polypeptidu/ml. Jak je uvedeno v příkladech, relativní in vivo aktivita se postupně zvyšuje od isoformy 5 do isoformy 11 (viz tabulka 2).
In vivo specifické aktivity, které jsou zde uváděny, jsou měřeny relativních in vivo specifických aktivit a nejedná se o absolutní in vivo specifické aktivity. Pro účely této přihlášky jsou specifické aktivity použity pouze pro srovnání relativních aktivit isoforem, studiem za stejných podmínek ve stejných pokusech, zahrnujících stejné vnitřní standardy, stejný typ zvířat, mající stejné analytické údaje použité pro výpočet specifické aktivity, stejnou zkoušku pro stanovení obsahu proteinu. Není předpokládáno, že jakákoliv hodnota in vivo specifické aktivity uvedená pro jakoukoliv isoformu představuje základní nebo absolutní hodnotu pro tuto isoformu.
Předložený vynález poskytuje erythropoietinové isoformy. Specifické isoformy erythropoietinu, získané v souladu s předloženým vynálezem ajejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu. Například isoformy z moče získaného lidského erythropoietinu jsou odlišné od isoformy rekombinantního erythropoietinu. Ve výhodném provedení se vynález týká erythropoietinové isoformy mající specifický počet (např. pevný počet vyšší než 0) sialových kyselin na molekulu erythropoietinu, uvedený počet je zvolen ze skupiny zahrnující 1 až 14. Výhodný je počet 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. V dalším provedení je počet vyšší než 14, výhodně 16až23.
Tento vynález také poskytuje přípravky, obsahující dvě nebo více erythropoietinových isoforem. V jednom provedení kompozice zahrnují směs isoforem, majících více než predeterminovaný počet sialových kyselin na molekulu erythropoietinu, např. vyšší než 11 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu nebo vyšší než 12 sialových kyselin na molekulu, např. směs isoforem 12, 13 a 14. V dalším provedení kompozice obsahují směsi isoforem, mající predeterminovaný počet sialových kyselin na erythropoietinovou molekulu, např. více než 12, ale více než 8 sialových kyselin na molekulu jako je např. směs isoforem 9, 10 a 11. Vynález také poskytuje přípravky obsahující erythropoietinové isoformy, kde jsou relativní množství isoforem stejná nebo rozdílná. Například směsi isoforem 9, 10 a 11 by mohly mít isoformy v různých poměrech jako je 1:1:1, 2:3:1 nebo 20:20:1.
Výhodně přípravky obsahují směsi méně než čtyř isoforem, například směs isoforem 11, 12 a 13, nebo směs 12 a 14, nebo směs 7 a 13.
Pro přípravu směsí erythropoietinových isoforem vynález také poskytuje způsoby současné izolace vybraných erythropoietinových isoforem. Tyto postupy zahrnují izolaci individuálních isoforem takovými technikami jako je isoelektrická fokusace nebo příprava směsí isoforem, majících predeterminovaný počet sialových kyselin na molekulu (například vyšší než 11) takovými technikami jako je iontovýměnná chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na separaci proteinů podle náboje.
-5CZ 291471 B6
Obecně, iontovýměnná chromatografie a chromatofokusace zahrnují aplikaci buď surového lidského erythropoietinu (buněčné kondiciované médium), nebo čištěného materiálu na sloupec pryskyřice za podmínek, kdy dochází k vázání některých nebo všech erythropoietinových isoforem na pryskyřici. U surových erythropoietinových přípravků je výhodné aplikovat protein na sloupec při asi pH 7, zatímco pro čištěné přípravky může být protein aplikován na kolonu při pH 7 až asi pH 7. Po promytí sloupce pufrem při asi pH 4 se ty erythropoietinové isoformy, které zůstaly vázány na sloupci ionexu, eluují při zvyšujícím se pH a koncentraci soli pufru nebo aplikací gradientu snižujícího se pH a zvyšující se iontové síly při pH asi 4. Při chromatofokusaci jsou isoformy eluovány ze sloupce gradientem snižujícího se pH nebo promýváním sloupce vysokou koncentrací soli.
Jedno provedení vynálezu se týká savčích (např. z ovaria čínského křečka, CHO) hostitelských buněk, které přednostně syntetizují erythropoietinové isoformy, mající více než specifický počet, např. více než lOsialových kyselin na molekulu. Erythropoietinové molekuly mají N-vázané nebo O-vázané oligosacharidové struktury, které mohou limitovat obsah sialové kyseliny v molekule. Například, tetraantennámí (čtyř-rozvětvené) N-vázané oligosacharidy nejobvykleji poskytují čtyři možná místa pro připojení sialové kyseliny, zatímco bi- a triantennámí oligosacharidové řetězce, které mohou nahradit tetraantennámí formu na asparaginových připojovacích místech, mohou obvykle připojovat nejvýše dvě nebo tři sialové kyseliny. Ο-Vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě místa pro připojení sialové kyseliny. Erythropoietinové molekuly tak mohou akomodovat celkem 14 zbytků sialové kyseliny s tím, že všechny tři N-vázané oligosacharidy jsou tetraantennámí. Kultury savčích buněk jsou prohledávány na ty buňky, které mají přednostně připojeny tetraantennámí řetězce k rekombinantnímu erythropoietinu, a tedy maximalizovaný počet míst pro připojení sialové kyseliny.
Navázané oligosacharidy erythropoietinu z moče obsahují sialovou kyselinu na obou spojeních a2,3 a a2,6 ke galaktóze (Takeuchi a spol., J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Typicky je sialová kyselina v a2,3 spojení připojena ke galaktóze α 1,6 rozvětvením mannózy a sialová kyselina v α 2,6 spojení je připojena ke galaktóze α 1,3 rozvětvením mannózy. Enzymy, které připojují tyto sialové kyseliny (β-galaktosid α 2,3 sialyltransferáza a β-galaktosid α 2,6 sialyltransferáza) jsou nejúčinnější při připojování sialové kyseliny k mannóze α 1,6 a mannóze α 1,3 větvení.
Dihydrofolát reduktázu (DHFR) postrádající buňky ovaria čínského křečka (CHO) se obvykle používají jako hostitelské buňky pro produkci rekombinantních glykoproteinů včetně rekombinantního erythropoietinu. Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid α 2,6-sialyItransferázu, a proto nepřidávají sialovou kyselinu k α 2,6 spojení N-vázaného oligosacharidu glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách. (Mutasaers a spol. Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi a spol. J. Chromatogr. 400,207 (1987)). Následkem toho rekombinantní erythropoietid produkovaný CHO buňkami postrádá sialovou kyselinu na spojeních 2,6 ke galaktóze (Sasaki a spol., (1987), supra; Takeuchi a spol., (1987), supra). V dalším provedení vynálezu je erythropoietin použit pro produkci isoforem připravován v CHO buňkách, které jsou transfektovány funkčním β-galaktosid α 2,6-sialyltransferázovým genem pro získání inkorporace sialové kyseliny do α 2,6 vazby ke galaktóze. Viz Lee a spol. J. Biol. Chem 264, 13848 (1989), práce je zde uvedena jako odkaz pro popis technik pro získání modifikovaných CHO buněk nebo jiných savčích hostitelských buněk.
Do vynálezu jsou rovněž zahrnuty některé analogy lidského erythropoietinu. Použitý výraz „analog lidského erythropoietinu“ představuje erythropoietin s jedním nebo více náboji v aminokyselinové sekvenci lidského erythropoietinu, což vede k zvýšení počtu míst pro připojení sialové kyseliny. Analogy jsou poskytovány místně řízenou mutagenezí, zahrnující adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků, což přeměňuje místa tak, že jsou dostupná pro glykosylaci. Takové analogy mají větší počet karbohydrátových řetězců než lidský erythropoietin.
-6CZ 291471 B6
Jejich analogy mající zvýšenou biologickou aktivitu jsou konstruovány zvyšováním obsahu sialové kyseliny v molekule erythropoietinu. Analogy mající obsah sialové kyseliny vyšší než bylo nalezeno u lidského erythropoietinu jsou připravovány přidávání glykosylačních míst, která nebudou poškozovat sekundární nebo terciární konformaci potřebnou pro biologickou aktivitu. Výhodně analog lidského erythropoietinu má 1,2 nebo 3 přídavná míst pro N-glykosvlaci nebo O-gly kosy láci. Například leucin v poloze 69 je nahrazen asparaginem za vzniku sekvence Asn-Leu-ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosylaci. Taková změna může obvykle poskytnout až čtyři další sialové kyseliny na molekulu. Příklady dalších změn, které generují další N- nebo O-glykosylační místa jsou alaniny v polohách 125 až 127 na asparagin a serin, alanin v poloze 125 na threonin a alaniny v polohách 124 a 125 na prolin a threonin. Pro odborníky bude zřejmé, že předložený vynález zahrnuje mnohé další analogy lidského erythropoietinu, mající další místa pro glykosylaci.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické přípravky obsahující terapeuticky účinné množství specifické isoformy nebo směs isoforem společně se vhodným ředidlem, přísadou a/nebo nosičem vhodným při erythropoietinové terapii. Výraz „terapeuticky účinné množství“, které je zde použit, zahrnuje množství, které vyvolává terapeutické účinek při daných podmínkách a režimu podání. Podání erythropoietinových isoforem se výhodně provádí parenterálním způsobem. Specifický způsob bude záviset na podmínkách, které jsou ošetřovány. Podání erythropoietinových isoforem je výhodně provedeno v části přípravku, který obsahuje vhodný nosič jako je lidský sérový albumin, vhodné ředidlo jako je purovaný salinický roztok a/nebo vhodná přísada. Potřebná dávka bude taková, že její množství dostačuje ke zvýšení hematokritů pacienta a bude záviset na obtížnosti podmínek, které mají být ošetřovány, způsobu podání a podobně.
Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu, ale nikterak jej neomezují. Erythropoietinový standard použitý v in vivo biostudiích v příkladech je rekombinantní erythropoietinový standard, který byl standardizován vůči částečně čištěnému erythropoietinovému standardu z moče. Takto jsou měřeny pouze relativní in vivo specifické aktivity. In vivo specifické aktivity jsou vyjádřeny v ,jednotkách/ml“, ,jednotkách/mg“ a jednotkách/A280“ a ne jako „IU/ml“, ,,IÚ/mg“ a IU/A280“, protože použitý erythropoietinový standard není přímo korelován k mezinárodnímu existujícímu standardu.
Příklady provedení
Příklad 1
Izolace isoforem rekombinantního erythropoietinu
Rekombinantní erythropoietin je produkován jak je popsáno Linem, supra. Rekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí materiál pro izolaci první a třetí isoformy je čištěn podle postupu popsaného v příkladu 2 práce Laie a spol., supra. Výchozí materiál pro izolaci druhé a páté isoformy je čištěn podle Laie a spol., supra za použití modifikace Q-Sepharosové chromatografie. Tyto přípravky obsahují směs isoforem rekombinantního erythropoietinu majících stejné aminokyselinové sekvence jako lidský erythropoietin získaný z lidské moče a obsahují převážně isoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro přípravu čtvrté isoformy je materiál, který je eluován během 5 mM kyselina octová/1 mM glycin/6M močovinového promývání aniontovýměnné kolony v příkladu 2 práce Laie a spol. před použitím v preparativním isoelektrickém fokusačním postupu. Příprava šesté isoformy používá jako výchozí materiál čištěný přípravek rekombinantního erythropoietinu mající od 4 do 13 sialových zbytků. Tento materiál byl čištěn jak je popsáno v příkladu 2 Laie a spol. s výjimkou pro modifikaci iontovýměnné kolony (eluce rekombinantního erythropoietinu gradientem chloridu sodného při
-7CZ 291471 B6 pH 8,4 a vypuštění promývání kyselinou octovou /močovinou), která vede kretenci nejvíce isoforem, přítomných ve výchozím materiálu.
Šest různých přípravků individuálních isoforem bylo zpracováno preparativní isoelektrickou fokusací na granulovaném gelu (Ultradex, LKB) v podstatě jako LKB Application Notě 198. Pharmalyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolyty (Pharmacia) jsou používány a gelové lože obsahují 5 M močoviny.
V první přípravě se na gel aplikuje přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20 mM citrátu sodného/100 mM chloridu sodném, pH 7,0 a zpracovává fokusací při 8 W po přibližně 16 hodin. Po isoelektrické fokusací se proužky isoforem v gelu vizualizují přitisknutím papíru ke gelovému loži. Vyrobí se otisk a pak se fixuje namočením ve třech provedeních (přibližně 10 minut, teplota místnosti) do fixačního roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% sulfosalicylová kyselina), podrobí další změně (asi 10 minut) - 40% methanol/10% kyselina octová (30 až 60 °C), barví se 15 minut při 60 °C v 0,125% Coomassie Blue R-250/40% methanol/10% kyselina octová a pak se odbarví v 7,5% methanolu/10% kyselině octové pro vizualizaci oddělených isoforem. Oblast granulovaného gelového lože, obsahující isoformy (~ 50 % pryskyřice) se odebere, přidá se voda (vl6 ml) a kaše se nalije na misku 14 x 62 cm a odpaří se asi 40 g čisté hmotnosti. Tento přípravek se zpracuje fokusací podruhé a otisk gelového lože se připraví jak bylo výše uvedeno. Část gelu, obsahující každou ze šesti rozlišitelných isoforem se odebere z gelového lože.
Za účelem eluce isoforem z gelu, se přidá ke každé isoformě roztok, obsahující 10 mM Tris-HCL, pH 7,0/5 mM Chaps pro přípravu kaše. Kaše umístí do malých kolon a promytí TrisChaps pufrem. Výtok kolonou byl odebrán a aplikován odděleně na malé kolony (otevřené uspořádání kolony), obsahující Vydac C4 pryskyřici s reverzní fází ekvilibrovanou ve 20% ethylonu/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 35% ethanolem/10 mM Tris-HCl, pH 7,0 a 65% ethanolem/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Frakce eluované 65% ethanolem/10 mM Tris se zředí 1:1 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 a zahustí a pak se pufr nahradí 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 za použití Centricon-10 (Amicon) mikrokoncentrátoru. Analytická isoelektrická fokusace tohoto přípravku se provede v podstatě jak je popsáno v LKB technická poznámka 250 za použití Servalyte 3-5 ampholinů (Serva) v polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 5 M močoviny.
Ve druhé přípravě se na gel aplikuje asi 26 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody a fokusuje se při 2,5 W po 35 minut s 10 W asi 17 hodin. Proužky fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odeberou jako 11 různých skupin. Každá skupina se převede do asi 7,5 ml deionizované vody a 20 ml každé z výsledných supernatantů z těchto skupin se podrobí analytické isoelektrické fokusací, jak je popsáno výše. Ke každé ze skupin se přidá 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 a kaše se umístí každá do malé kolony a ponechá se vytéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně třemi objemy 0,5 M Tris-HCl, pH 7 a promývací roztok se spojí s proteklou kapalinou. Eluované roztoky se zahustí a pufr se vymění za 20 mM citrátu sodného/100 mM chloridu sodného, pH 7,0 za použití Amicon ultrafiltračního zařízení majícího vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000. Koncentrované roztoky (asi 0,5 ml) pak procházejí 0,22 mikrometrovým filtrem z acetátu celulózy. Vzhledem k analytické isoelektrické fokusaci bylo nalezeno pět skupin, obsahujících převážně jednotlivé isoformy 10, 11, 12, 13 a 14.
Ve třetí přípravě se na gel aplikuje asi 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21,8 ml destilované vody a fokusuje se při 2 W po 25 minut, při 10 W po 20 hodin a 15 W 15 minut. Proužky proteinu, odpovídající individuálním isoformám jsou pozorovány vizuálně a odebrány z gelového lože. K isoformám izolovaných z gelu se přidá destilovaná voda, připraví se kaše a vzniklé supernatanty se analyzují analytickou isoelektrickou fokusací. Ke každé kaši se přidá stejný objem 1 M tris-HCl, pH 7,2, suspenze se umístí do oddělených malých kolon a kapalná fáze se nechá vytéci z kolony pro eluci isoforem. Každý výtok se zahustí a pufr se vymění za 20 mM sodný citrát/100 mM chlorid sodný, pH 7,0 za použití Amicon zařízení pro ultrafiltraci
-8CZ 291471 B6 s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000. Analytický isoelektrofokusační gel informuje o tom, že byly získány skupiny, obsahující zejména jednotlivé isoformy 9, 10, 11, 12, 13 a 14.
Čtvrtá příprava isoformy používá jako výchozí materiál erythropoietin, obsahující isoformy 3-9 (připravené výše). Před preparativní isoelektrickou fokusací provedenou v podstatě jak bylo popsáno výše pro přípravu 1 až 3, byly ampholyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionovány v Rotofor (Bio-Rad, Richmond, CA) buňce pro isoelektrickou fokusaci s kapalnou fází, pro získání ampholytů vhodnějších pro nižší isoelektrické body výchozího materiálu. Prefrakcionace se provádí smísením 6,7 ml Pharmalytu 2,5-5 s 15 g močoviny a přidáním vody na objem 50 ml.
ío Směs se frakcionuje v Rotoforu při 10 W 1 °C po 5 1/2 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné a 0,1 M hydroxidu sodného při anolytu a katolytu. Amfolytové frakce, mající zjištěné pH mezi 4,5 a asi 6 byly použity pro isoelektrickou fokusaci plochého lože.
Amfolyty byly získány z isoforem za použití Centrieluteru (Amicon, Danvers, MA) a 10000 MQ
Centriconu (Amicon) za použití následujících parametrů: 0,18 Tris pufr 8,8, 100 Volt, 25-30 mA, po 3 hodiny. Isoformy byly pak pufrem převedeny do 0,1 M chloridu sodného gelovou filtrací za použití Sephadexu G-25 (Pharmacia). Analytická isoelektrická fokusace pěti výsledných ppolů prokázala, že obsahují isoformy 4, 5, 6, 7 a 8. Isoforma 4 vykazuje několik proužků což indikuje, že prošla určitou degradací.
Příprava páté isoformy byla modifikována přídavkem prefokusačního stupně k postupu isoelektrické fokusace na plochém loži. V této modifikaci nebyl přidán protein ke směsi amfolyt/močovina/gel před elektroforézou, ale byl přidán do isoelektrického fokusačního zařízení s následujícím vývojem gradientu pH v gelovém loži. Po prefokusaci po 75 minut (1500 volt/h) 25 byly sekce gelového lože ve vzdálenosti 2,25 - 4,25 cm od katody odebrány, smíseny s roztokem erythropoietinu a přidány zpět ke gelovému loži. Po isoelektrické fokusaci byly isoformy 10, 11, 12, 13 a 14 eluovány z gelového lože a odděleny od amfolytů ultrafiltrací za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).
Prefokusační modifikace byla uskutečněna pro to, aby charakteristiky ultrafialové absorbance přípravků, obsahujících isoformy byly podrobnější těmto charakteristikám výchozího rekombinantního erythropoietinu. Zlepšení ve spektrálních charakteristikách může být zřejmé z poměru absorbance při 280 a 260 nm u izolovaných isoforem. Průměrný poměr absorbance při 280 nm k absorbanci při 260 nm (Α280Ά260) pro isoformy z přípravků 2 a 3 (neprefokusované) je 1,36 ± 0,11, zatímco průměrný poměr A20/A260 poměry jsou 1,39 ± 0,11 a 1,74 ± 0,09 pro přípravky a 3 a 5 a 6. (Isoforma 14 může mít nejatypičtější spektrum, protože je přítomna v nejmenších množstvích a je tak více náchylná k interferencím stopovou kontaminací amfolytovými komponentami nebo protože je nejbližší elektrodě během provádění isoelektrické fokusace na plochém loži.). Průměrný A280/A260 poměr pro rekombinantní erythropoietin připravený podle příkladu 2 Laie a spol. (modifikovaný jak bylo popsáno použitím Q-Sepharosy jako aniontovýměnné pryskyřice) je 1,91 ± 0,04.
Jak je popsáno výše, výchozí materiál pro přípravu isoformy č. 6 byl rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující isoformy 4—13. Amfolyty byly pre-fokusovány v zařízení 45 Rotofor jako ve čtvrté přípravě. Pro isoelektrickou fokusaci na plochém loži byly použity amfolytové frakce, mající pH mezi 3,7 a 4,8. Ploché lože bylo prefokusováno postupem jako v přípravě č. 5 a isoformy 9, 10, 11, 12 a 13 byly získány pro ultrafiltrací (Centricon-10) pro odstranění amfolytů.
-9CZ 291471 B6
Příklad 2
Obsah sialové kyseliny v isoformách rekombinantního erythropoietinu
Isoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 a erythropoietin čištěný postupy popsanými Laiem a spol., supra (směs isoforem 9 až 14) jsou pufrem převedeny do 0,10 - 0,15 M chloridu sodného a analyzovány na obsah sialové kyseliny modifikací postupu podle Jourdiana a spol., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zbytky sialové kyseliny jsou odštěpeny od glykoproteinů hydrolýzou 0,35 M kyselinou sírovou při 80 °C po 30 minut a roztoky jsou neutralizovány hydroxidem sodným před analýzou. Za účelem vyhodnocení množství přítomného erythropoietinového proteinu se provede stanovení proteinu podle Bradforda (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) za použití rekombinantního erythropoietinu, majícího aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu jako standard za použití zkušebních reagencií a mikrozpůsobu podle Bio-Rad. Výsledky, vyjádřené jako moly sialové kyseliny na mol erythropoietinu, jsou uvedeny v tabulce 1. Isoformy jsou označeny podle počtu sialových kyselin na molekulu a rozsahu od málo kyselých (isoforma 9) do nejkyselejších (isoforma 13). Isoformy 9-13 jsou uvedeny vgelových drahách 6-10 obr. 1. Množství isoformy 14 jsou nedostatečná k přesnému měření obsahu sialové kyseliny. Obsah sialové kyseliny v této isoformě je odhadnut z její migrace na IEF gelech vzhledem k dalším isoformám. Obsah sialové kyseliny isoforem 5-8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, aleje pravděpodobně odhadnut z jejich migrací na IEF gelech.
Tabulka 1
Isoforma erythropoietinu isoforma 13 isoforma 12 isoforma 11 isoforma 10 isoforma 9 směs isoforem (9-14) mol sialové kyseliny / mol erythropoietinu
12,9 ±0,5
11,8 ±0,2
11,0 ±0,2
9.8 ±0,3
8.9 ± 0,6
11,3 ±0,2
Příklad 3
Aktivita isoforem rekombinantního erythropoietinu
Isoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 byly hodnoceny podle absorbance při 280 nm, Bradfordovou proteinovou zkouškou a pomocí RIA pro erythropoietin pro stanovení množství přítomného rekombinantního erythropoietinu. Exhypoxická polycythemická biostudie na myších (Cotes a spol., Nátuře 191, 1065 (1961) se použije pro stanovení in vivo biologické aktivity. Kvantifikace množství erythropoietinového proteinu přítomného podle radioimunozkoušky pro erythropoietin poskytuje výsledky mající vyšší relativní in vivo specifickou aktivitu pro některé isoformy, protože zjevně snížená imunoreaktivita isoforem, obsahujících velké množství sialové kyseliny vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu a tak k nadhodnocení in vivo specifické aktivity pro nejvíce negativní isoformy. Stanovení z biostudie na myších, vyjádřená jako jednotka/ml, jsou děleny koncentracemi odpovídajících proteinů pro získání in vivo specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu. Tyto specifické aktivity jsou uvedeny v tabulce 2.
V tabulce 2 je „n“ počet nezávislých přípravků isoforem, které spolupůsobí hodnotu specifické aktivity. V nejvíce případech byly provedeny in vivo studie pro každý přípravek isoformy. Některé in vivo údaje pomáhají při výpočtech specifické aktivity ve všech třech sloupcích.
-10CZ 291471 B6
Jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu byly stanoveny z absorbance při 280 nm, z hodnot radioimunozkoušky nebo z výsledků Bradfordovy proteinové zkoušky. Čištěný rekombinantní erythropoietin, obsahující isoformy 9-14 byl použit jako standard vBradfordově proteinové zkoušce, „n“ může být menší pro výpočty provedené za použití Bradfordovy proteinové zkoušky, 5 protože některé přípravky nebyly v době provádění Bradfordovy zkoušky dostupné.
Erythropoietin čištěný podle postupů popsaných Laiem a spol., supra a obsahující směs isoforem 9 až 14 byl použit jako standard ve zkouškách RIA a in vivo.
Relativní specifické aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu mohou být převedeny na jednotky/A280 násobením 0,807 mg erythropoietinového polypeptidu/A280. Přepočítávací faktor je získán násobení extinkčního koeficientu erythropoietinu (1,345 mg/A280) obsahem proteinu v erythropoietinovém glykoproteinu (asi 60 % hmotnostních, Davis a spol., Biochemistry 26, 2633 (1987)) pro vyjádření mg erythropoietinového polypeptidu/A280 (tj.
1,345 mg erythropoietinu/A280 x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptidu/A280). Dále specifické aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu mohou být násobeny faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu pro získání specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového glykoproteinu.
Tabulka 2
| Isoforma | U/mg polypeptidu (Bradfordova proteinová zkouška) | n | U/mg polypeptidu (z A280) | n | U/mg polypeptidu (z RIA) | n |
| 14 | 289,400 ±3,100 | 2 | 205,800 ± 37,700 | 2 | 366,700 ± 55,900 | 2 |
| 13 | 307,600 ± 30,600 | 4 | 258,700 ± 59,500 | 5 | 337,200 ±40,200 | 5 |
| 12 | 275,200 ± 55,600 | 4 | 258,400 ±41,700 | 5 | 287,700 ± 42,600 | 5 |
| 11 | 282,700 ±41,100 | 3 | 255,800 ± 67,300 | 4 | 251,400 ±62,700 | 4 |
| 10 | 188,000 ± 1,900 | 1 | 170,300 ±34,500 | 3 | 171,900 ±31,600 | 3 |
| 9 | 96,600 ± 46,700 | 2 | 113,600 ±39,600 | 2 | ||
| 8 | 65,200 ± 3,800 | 1 | 70,600 ±4,100 | 1 | 61,000 ±3,500 | 1 |
| 7 | 46,200 ± 5,800 | 1 | 50,300 ± 6,300 | 1 | 42,800 ± 5,400 | 1 |
| 5 | 16,600 ± 1,700 | 1 | 18,300 ± 1,900 | 1 | 15,500 ± 1,600 | 1 |
Údaje z tabulky 2 jsou také znázorněny na obr. 2A, 2B a 2C. Tyto údaje ukazují, že relativní in vivo aktivita erythropoietinu se zvyšuje jako funkce obsahu sialové kyseliny až do isoformy č. 11. Isoformy č. 11—14 mají v podstatě stejnou relativní in vivo bioaktivitu. (To je nejzjevnější, jestliže je koncentrace isoformy 14 vyjádřena použitím hodnoty z Bradfordovy zkoušky. Bradfordova hodnota může být pro isoformu 14 přesnější, protože jsou obecně získány nižší 30 hodnoty a to vede k obtížím při stanovení pomocí A280 a nejzřejmějšímu snížení reaktivity v RIA pro velmi negativní formy, jak bylo uvedeno dříve). Vyšší in vivo specifická aktivita erythropoietinových isoforem, majících více sialových kyselin je nejpravděpodobněji způsobena delším průběhem poločasu životnosti těchto forem. Isoformy 9 a 13 jsou značeny radioaktivním jodem (125I) a byla stanovena rychlost jejich štěpení u krys. Poločas životnosti v oběhu byl 35 výrazně delší pro isoformu 13 než pro isoformu 9.
-11 CZ 291471 B6
Příklad 4
Dělení směsí isoforem rekombinantního erythropoietinu chromatografii na Q-Sepharose
Buněčná kondiciovaná média z produkce rekombinantního erythropoietinu podle postupů popsaných Linem, supra, se koncentruje a diafíltrují proti 10 mM Tris, pH 7,2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovou mikroproteinovou zkouškou za použití hovězího sírového albuminu jako standardu. 19,6 ml roztoku, obsahujícího 40 mg celkového proteinu se připraví ve 20 μΜ io CuSO4, filtruje přes 0,45 mikrometrový filtr a vloží na 4ml kolonu (1,05 cm výška x 2,2 cm průměr) plněnou náplní Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia), která byla ekvilibrována 10 mM Tris, pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po aplikaci vzorku se kolona promyje dvěma objemy kolony pufru. Průtok kolony je asi 1 ml/min. Pro dělení směsí isoforem erythropoietinu se použije šest oddělených kolon.
Kolony se promyjí 6 až 9 objemy pufru o nízké pH: kolona č. 1, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO4, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 2, 200 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO4, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 3, 250 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO4, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 20 NaOH, kolona č. 4, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO4, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 pomocí NaOH, kolona č. 5, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO4, 6 M močovina, kolona č. 6, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO4, 6 M močovina. pH kolon se zvyšuje na asi pH 7 promýváním každé kolony 8 až 11 objemy kolony 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 μΜ CuSO4, pH 7. Definované erythropoietinové isoformové 25 směsi jsou z kolon eluovány promýváním 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuSO4, pH 7,0.
Eluované isoformové pooly z každé kolony se zahustí a rozpouštědlo se vymění vodou za použití Amico Centricon- 10 mikrokoncentrátoru. Výsledky analytické isoelektrické fokusace těchto 30 koncentrovaných poolů jsou uvedeny na obr. 3. Gelové dráhy 1-6 představují definované směsi erythropoietinových isoforem eluovaných z kolon 1-6. „Isofomiová směs“ uvedená v poslední pravé dráze gelu na obr. 3 představuje buněčné médium, které je aplikováno na kolonu Q-Sepharosy jak je popsáno výše, kolona se promyje 5 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ CuSO4, 6M močoviny a směs isoforem erythropoietinu se eluuje z kolony za použití výše 35 popsaných postupů. Tato eluovaná směs isoforem se dále čistí podle postupů popsaných v práci
Laie a spol., supra, před analytickou isoelektrickou fokusací.
Příklad 5
Frakcionace isoforem rekombinantního erythropoietinu za použití nízké pH gradientu na Q-Sepharose
V dalším postupu jsou isoformy erythropoietinu separovány za použití gradientu se snižováním, 45 pH a zvyšováním iontové síly. Koncentrované diafíltrované, erythropoietin obsahující médium se vnese na kolonu Q-Sepharosy v poměru asi 40 mg celkového proteinu/ml gelu. Kolona se pak promyje asi dvěma objemy kolony 10 mM Tris HC1, pH 7,0 a pak asi 10 objemy kolony 2 mM kyseliny octové/1 mM glycinu/20 μΜ CuSO4/6 M močoviny (pH přibližně 4,8) pro odstranění kontaminujících proteinů a eiythropoietinových isoforem, obsahujících méně než asi 7 zbytků 50 sialové kyseliny. Isoformy, obsahující od přibližně 8 do přibližně 12 sialových kyselin jsou z kolony eluovány za použití gradientu od počátku 2 mM kyseliny octové v 6 M močoviny/1 mM glycinu/ 20 μΜ CuSO4 a do až 40 mM kyseliny octové/6 M močoviny/1 mM glycinu/20 μΜ CuSO4 (pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů kolony a frakce přibližně jednoho objemu kolony se odebírají do nádob, obsahujících objem Tris pufru
-12CZ 291471 B6 dostačující k uvedení pH do rozmezí 6 - 8,5 proto, aby se zabránilo dlouhodobému vytavení odebraných frakcí nízkému pH. Podíly frakcí se podrobí analytické isoelektrické fokusaci pro sledování separace. Obr. 4 ukazuje separaci isoforem 8-11, které může být dosaženo tímto postupem. Isoformy 12 - 14, které zůstávají vázány na koloně při konci gradientu, jsou eluovány promýváním pufrem, obsahujícím 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuSO4 (pH 7,0). Isoformy (separované působením gradientu nebo eluované roztokem chloridu sodného) jsou prosté kontaminujících proteinů při chromatografií na reverzní fází, následované filtrační gelovou chromatografií jak je popsáno v příkladu 2 v práci Laie a spol.
Příklad 6
Analogy lidského erythropoietinu, mající další glykosylační místa
A. Konstrukce analogů lidského erythropoietinu
Umístění existujících a navržených míst pro připojení karbohydrátu v erythropoietinové aminokyselinové sekvenci jsou uvedena na obr. 5 a postup přípravy těchto dalších glykosylačních míst je shrnut na obrázcích 6A-C a je popsán dále.
Za použití in vitro mutagenese byly syntetizovány následující oligonukleotidové primery:
/Asn4, Ser6/EPO: 5'CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3' /Asn9, Ser1'/EPO: 5'ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' /Asn69/EPO: 5' GGGCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3' /Asn124/EPO: 5'TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3' /Asn125, Serl27/EPO: 5'CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3' /Asn163, Ser165/EPO: 5'AGGCCTGAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTTG 3' /Thr125/EPO: 5' TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3' /Pro121, Thr125/EPO: 5’ CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3'
Podtržené kodony představují oblasti chybného párování, kde aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují divoký typ aminokyselin.
/Asn4, Ser6/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa u Asn 4. /Asn9, Ser”/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa kAsn 9. /Asn69/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa k Asn 69. /Asn125, Ser127/EPO byl konstruován přidáním Nglykosylačního místa kAsn 125. /Thr125/EPO a /Pro124, Thr125/EPO byly konstruovány přidáním O-glykosylačního místa u Thr 125.
Následující oligonukleotidové primery jsou syntetizovány za použití in vitro mutagenese:
/Asn69, Thr71/EPO: 5'GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' /Ser68, Asn69, Thr7l/EPO: 5' CAGGCCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' /Asn125, Thr127/EPO: 5'CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAG 3' /Asn125, Thr127, Thr131/EPO: 5' ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' /Pro124, Asn125, Ser127/EPO: 5' CCAGATCCAATTCATCTGCTCCACTC 3' /Pro124, Asn125, Thr127/EPO: 5' CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3' /Thr125, Thr126/EPO: 5' CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3' /Pro124, Thr125, Thr126, Thr131/EPO:
Oligonukleotidový primer 5'AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' je použit pro přípravu /Pro124, Thr125, Thr 26/EPO za použití /Pro124, Thr125/EPO cDNA jako výchozí látky. Oligonukleotidový primer 5'TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' je pak použit pro přípravu /Pro124, Thr125, Thr126, Thr,31/EPO.
-13CZ 291471 B6 /Asn69, Thr71 /EPO a /Ser68, Asn69, Thr71/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačního místa k Asn 69 a zvýšením N-glykosylace na tomto místě. /Asn125, Thr127/EPO, /Asn125, Thr127, Thr131/EPO, /Pro124, Asn125, Serl27/EPO a /Pro124, Asn125, Thrl27/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačního místa na Asn 125 a zvýšením glykosylace na tomto místě /Thr'··. Thr126/EPO a /Pro124, Thr125, Thr126, Ser131 /EPO jsou konstruovány přidáním O-glykosylačního místa ke Thr 125 a zvýšením glykosylace na tomto místě.
Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenesi byl plasmid Hul3, klon cDNA lidského erythropoietinu v pUC 8 (Law a spol. Proč Nati. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plasmidová DNA odvozená od Hul3 byla štěpena BstEII a BglII restrikčními enzymy, výsledné fragment} DNA byly podrobeny elektroforéze na agarosovém gelu za použití GeneClean™ kitu a postupy doporučenými výrobcem (BIO 101, lne.) Plasmid pBRgHuEPO obsahuje erythropoietinový genomový gen jako BarnHl fragment inzertovaný do derivátu pBR322, jak je popsáno ve zveřejněném patentu Lina, Supra. pBRgHuEPO byl také štěpen pomocí BstEII a BglII a byl získán vektorovým fragment 6517 bp. Ligace těchto dvou fragmentů vede klGTl. Pro konstrukci pEC-1, byl pDSVL (popsaný ve zveřejněném patentu Lina, supra), štěpen BarnHl a kněmu byl ligován izolovaný BarnHl fragment velikosti 2,8 kilobází (kb) zIGTl, obsahující erythropoietinovou cDNA.
Za účelem přípravy jednořetězcové DNA pro mutagenesi in vitro, byl pEC-1 štěpen BarnHl a BglII a byl izolován fragment 820 bp erythropoietinové cDNA. Byl ligován k BarnHl místu ml3mP18 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA byla získána ze supematantů E. coli kmen RZI032, infikovaného ml3-EC-l jak popsal Kunkel a spol. Methods in Erizymol. 154, 367 (1987) a Messing, methods in Enzymol. 101, 20 (1983). Pro mutagenesi in vitro bylo smíseno přibližně 1 pg jednořetězcové DNA a 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše se 6 ml pufru (250 mM Tris pH 7,8, 50 mM MgCl2 a 50 ml dithiothreitolu). Pro připojení primerů ktemplátu byl objem reakční směsi upraven na 10 μΐ vodou, směs byla zahřívána na 65 °C po dobu 5 minut a pak nechána zchladnout na teplotu místnosti. Pro prodlužovací reakci bylo přidáno 2,5 ml dTTP, dATP, dGTP a ATP (všechny s 10 μΜ), dále 1 μΐ (1 jednotka) E. coli DNA polymerázy (Klenowůw fragment) a 1 μΐ (1 jednotka) T4 DNA ligázy. Směs pak byla inkubována přes noc při 14 °C a použita pro transformování E. coli JM 109 (Yanish-Perron a spol., Gene 33, 103 (1985)) jak je popsáno (Messing, supra).
Pro identifikaci mutantních klonů rozlišovací hybridizací, byly plaky na nutričním agaru přeneseny na Gene Screen filtry (New England Nuclear). Filtry byly sušeny pod tepelnou lampou a pak inkubovány po dobu jedné hodiny v 6x SSC, obsahujícím 1 % SDS při 60 °C. Po hybridizací byly oligonukleotidové primery uvedené výše (8 pmol) koncově označeny T4 polynukleotidovou kinázou a y32P-označeným ATP a inkubovány s filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a 100 mg/ml DNA losího sperma při 37 °C pro /Asn124/mutaci, 55 °C pro /Asn4, Ser6/ mutaci, 65 °C pro /Thr125/ a /Pro124, Thr125/ mutace a 70 °C pro /Asn9, Ser11/ a /As163, Ser165/ mutace. Příští den byly filtry třikrát promyty 6x SSC při teplotě místnosti a podrobeny autoradiografii. Je-li to nutné byly pak filtry promyty 6x SSC při zvýšených teplotách, dokud nebyla detekována malá nebo žádná hybridizace u plaků, majících erythropoietinovou cDNA sekvenci divokého typu. Klony, které za těchto podmínek dávají pozitivní hybridizační signály byl identifikovány a retransfektovány do JMI09 k izolování čistého klonu. Dideoxy řetězcová terminační sekvenční analýza dokládá, že jsou přítomny mutace u asparaginového, serinového, threoninového a prolinového zbytku.
Dvojřetězcové ml3 EC-1 DNA nesoucí /Asn4, Ser6/, /Asn9, Ser11/, /Asn69/, /Asn124/, /Asn125, /Ser127/, /Asn163, Ser165/ /Thr125/ a /Pro124, Thr125/ změny byly získány z JM109 transfektovaných buněk vaznou metodou (Holmes a spol., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)). DNA byly štěpeny pomocí BstEII a XhoII a byl izolován 810 bp fragmenty erythropoietinové DNA. pEC-1 byly štěpeny BstEII s následujícím parciálním štěpením BglII a 5'konce výsledných fragmentů se
- 14CZ 291471 B6 defosforylují bakteriální alkalickou fosfatázou v 10 mM Tris, pH 8 při 60 °C po 60 minut. Byl izolován 7 kb vektorový fragment postrádající 810 bp BstEII—BglII a ligován kerythropoietinovým fragmentům uvedeným výše. Výsledné plasmidy (označené pEC-X, kde X znamená parciální mutaci) obsahují lidský erythropietin se změněnými aminokyselinovými zbytky 5 v označených pozicích.
cDNA klony sekvence lidského erythropoietinu a analogů odpovídajících /Asn4, Ser6/, /Asn9, Ser11/, /Asn69/, /Asn124/, /Asn125, Ser127/, /Asn163, Ser165/, /Thr125/ a /Pro124, Thr'?P erythropoietinových cDNA klonů byly transfektovány do COS-1 buněk (ATCC č. CRL-1650) elektrokorporací. COS-1 buňky byly z polotekutých disků odebrány, promyty médiem (modifikované Dulbecco základní médium, obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % L-glutaminu/penicilinu/ streptomycinu (Irvine Scientific) a resuspendují na 4 x 106 buněk/ml. Jeden mililitr buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad) a elektroporuje Bio-Rad Gene Pulserem™ při 25 pF a 1600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosiče DNA a 2 až 20 pg plasmidové DNA kódující erythropoietinový analog. Elektroporované buňky se umístí v koncentraci 2 x 106 buněk na 60 mm misku pro tkáňovou kulturu a 5 ml média. Po dvou až čtyřech hodinách po umístění se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Kondiciované médium se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporaci.
A. Zkouška aktivity erythropoietinového analogu
RIA byly provedeny podle Egria a spol., supra. In vivo biologická aktivita erythropoietinových analogů byla stanovena ethypoxickou polycythemickou biostudií na myších (Cotes a spol.. supra).
ln vitro eryrhropoietinová aktivita byla stanovena zkouškou tvorby erythroidních kolonií jak je popsáno Iscovem a spol., J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) s modifikacemi. Jednojademé buňky z buněk lidské kostní dřeně byly částečně čištěny na „focol-pague“ vložce a promyty Iscovým médiem před umístěním na plotnu pro odstranění adherentních buněk. Kultivační 30 médium obsahuje 0,9 % methylcelulózy a neobsahuje jakýkoliv hovězí sérový albumin.
Erythroidní kolonie byly spočteny po 8 až 10 dnech kultivace.
Erythropoietinové analogy transfektované a exprimované v COS buňkách jak je popsáno v sekci A, byly analyzovány v surových supematantech COS buněk pomocí RIA a zkouškou tvorby 35 erythroidních kolonií. Lidské erythropoietinová sekvence má in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou stanovenou ve výše uvedeném pokusu. Analogy /Asn69/EPO, /Asn125, Ser127/EPO, /Thr125/EPO a /Pro124, Thr125/EPO vykazují in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou a poskytuje důkaz o dalších karbohydrátových řetězcích (jak je stanoveno v sekci C). Tyto analogy jsou dále analyzovány transfekcí cDNA klonem kódujícím erythropoietinový analog do 40 CHO buněk, čištěním erythropoietinového analogu a měřením in vivo biologické aktivity čištěného analogu.
C. Analýza Western Blot
Objem suspernatantu, obsahující 5-20 jednotek z COS buněk transfektovaných cDNA erythropoietinových analogů jak je popsáno v sekci A, byl imunoprecipitován přes noc při teplotě místnosti s králičí antierythropoietinovou polyklonální protilátkou. K imunoprecipitátu bylo přidáno 20 až 80 μΐ 1:1 proteinu A-Sepharosy v salinickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) a ponecháno inkubovat jednu hodinu při teplotě místnosti. Vzorky byly odstředěny, promyty PBS 50 a kde je to indikováno, byla peleta zpracována s N-glykanázou pro odstranění N-vázaného karbohydrátového řetězce. Vzorky byly analyzovány elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulózu a podrobeny Westernově analýze jak je popsáno (Burnette a spol., Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981); Elliot a spol. Gene 79, 167-180 (1989)) za použití směsi myších antierythropoietinových monoklonálních protilátek.
-15CZ 291471 B6
Jedna z takových protilátek. 9G8A, je popsána Elliotem a spol. (1989) Blood 74, Supp. 1, A. 1228.
Analýza supematantů COS buněk transfektovaných /Asn69/ EPO a /Asn125, Serl27/EPO cDNA dokládá zvýšení velikosti proteinu ve srovnání se sekvencí lidského erythropoietinu. Zvýšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího N-vázaného karbohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supematantů z COS buněk transfektovaných /Thr125/EPO a /Pro124, Thr125/ EPO cDNA s N-glykanázou dokládá zvětšenou velikost proteinu ve srovnání se sekvencí lidského erythropoietinu. Tato zvětšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího O-vázaného karbohydrátového řetězce (obr. 8).
D. Izolace isoforem erythropoietinových analogů
Erythropoietinový analog /Thr12’/EPO byl konstruován jak je popsáno v sekci A. 810 bp fragment erythropoietinové cDNA nesoucí /Thr,25/mutaci byl izolován štěpením plasmidu pEC obsahujícího /Thr125/ mutaci pomocí BstEII a Bglll a ligací fragmentu kpDEC Δ byl připraven z pDS α 2 následujícími kroky:
1) HindlII místo pDS a2 bylo deletováno štěpením pDS a2 DNA pomocí HindlII, zpracováním HindlII kohezivních konců s E. coli DNA polymerázou (Klenow fragment) a dNTP, a eligaci tupě zakončeného vektoru. Výsledný plasmid je pDS α2 ΔΗ.
2) pDS α2 ΔΗ byl štěpen pomocí Sáli a syntetický oligonukleotid mající SV40 „splice“ signál se Sáli linkerem připojeným ke 3' konci „splice“ signálu byl k němu ligován. Syntetický oligonukleotid měl následující sekvenci:
5'TCGAGGAACTGAAAAACCACAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT CTTTTTGTCTTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCAGTACGG AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGGAACAAGCTGGTCGACC 3'
Výsledný plasmid byl pDS α2 Δ H spoj.
3) pDS α2 ΔΗ spoj byl štěpen Sáli a konce zpracovány na tupo zpracováním s kohezivními konci T4 DNA polymerázou a dNTP. 820 bp fragment BamHI-BglII lidské erythropoietinové cDNA byl na koncích natupo zpracován stejným postupem a ligován k plasmidu. Výsledný plasmid byl pDEC.
4) pDEC byl štěpen sKpnl a pVUII a na koncích zpracován na tupo zpracováním s kohezivními konci „mung beán“ nukleázo. Plasmid byl ligován k deletovanému excisovanému Kpnl-PvuII fragmentu za vzniku plasmidu pDEC Δ.
Plasmid pDECA, obsahující /Thr125/ erythropoietinovou cDNA byl transfektován do -deficientních CHO buněk. 770 ml kondiciovaného média CHO buněk byl zakoncentrován za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 a diafiltrován proti 10 mM Tris-HCl, pH 8,6 na celkový objem 34 ml. 17ml podíl koncentrátu byl nanesen na Q-Sepharosovou kolonu s rychlým průtokem (5 ml objem náplně) ekvilibrovanou stejným pufrem a eluován lineárním gradientem 0-250 mM NaCl v lOmM Tris-HCl, pH 8,6. Podíl frakcí z kolony, buď nezpracované, nebo štěpené N-glykanázou, byly analyzovány SDS-PAGE nebo IEF a pooly (označené 2,3 a 4) byly připraveny na bázi isoformy a/nebo karbohydrátového složení frakcí. Každý pool byl nanesen na Vydac C4 kolonu (214TPB 2030, 1 cm průměr, 1,8-2,5 ml objem náplně, 0,34 ml/min) a promyt dvěma objemy kolony 20% ethanolu v 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolony byly eluovány lineárními gradienty 20-94% ethanolu, 10 mM Tris, pH 7,0. Pooly byly připraveny, naředěny do 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 a naneseny na Q-Sepharosové kolony
-16CZ 291471 B6 s rychlým průtokem. Následujícím promýváním 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, byly vzorky eluovány 20 mM citrátem sodným, 250 mM NaCl, pH 7,0. Čištěné /Thr125/ pooly byly analyzovány IEF ajsou uvedeny na obr. 9. EPO analog je analyzován na in vivo biologickou aktivitu jak je popsáno výše (Cotes a spol., supra).
Vynález je popsán svými výhodnými provedeními, která však nijak vynález neomezují, naopak, jsou v něm zahrnuty různé modifikace a ekvivalenty v rámci připojených nároků, provedené v nej širším rozsahu tak, že zahrnují všechny takové modifikace a ekvivalenty.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (5)
1. Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem, v y z n a č u j í c í se tím, že se
a) vybere dvě nebo více erythropoietinových isoforem, z nichž každá vykazuje jediný isoelektrický bod a má specifický počet sialových kyselin na isoformu erytropoietinu, kde uvedený počet je vybrán ze skupiny, zahrnující 1 až 14; a
b) tyto isoformy se smísí tak, aby výsledná směs vykazovala předem určený počet sialových kyselin na isoformu erythropoietinu.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačují cíše tím, že se ve stupni a) vyberou alespoň dvě isoformy mající méně než 12 sialových kyselin na isoformu erythropoietinu.
3. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se tím, že se ve stupni a) vyberou isoformy mající 9,10 a 11 sialových kyselin na isoformu erythropoietinu.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se ve stupni a) vyberou alespoň dvě isoformy mající více než 11 sialových kyselin na isoformu erythropoietinu.
5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se ve stupni a) vyberou isoformy mající 13 a 14 sialových kyselin na isoformu erythropoietinu.
13 výkresů
-17CZ 291471 B6
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42144489A | 1989-10-13 | 1989-10-13 | |
| CZ19904972A CZ291515B6 (cs) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | Izolovaná biologicky aktivní erytropoietinová izoforma, způsob její přípravy a farmaceutická kompozice na její bázi |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ291471B6 true CZ291471B6 (cs) | 2003-03-12 |
Family
ID=23670537
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19904972A CZ291515B6 (cs) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | Izolovaná biologicky aktivní erytropoietinová izoforma, způsob její přípravy a farmaceutická kompozice na její bázi |
| CZ20001772A CZ291488B6 (cs) | 1989-10-13 | 2000-05-12 | Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi |
| CZ20011115A CZ291471B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem |
| CZ20011117A CZ291472B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Směs skládající se ze dvou nebo tří erythropoietinových isoforem |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19904972A CZ291515B6 (cs) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | Izolovaná biologicky aktivní erytropoietinová izoforma, způsob její přípravy a farmaceutická kompozice na její bázi |
| CZ20001772A CZ291488B6 (cs) | 1989-10-13 | 2000-05-12 | Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20011117A CZ291472B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Směs skládající se ze dvou nebo tří erythropoietinových isoforem |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0668351B1 (cs) |
| JP (2) | JP2983629B2 (cs) |
| KR (2) | KR100221066B1 (cs) |
| CN (1) | CN1063796C (cs) |
| AT (2) | ATE146187T1 (cs) |
| AU (1) | AU646822B2 (cs) |
| CA (2) | CA2165694C (cs) |
| CZ (4) | CZ291515B6 (cs) |
| DE (2) | DE69033301T2 (cs) |
| DK (2) | DK0428267T4 (cs) |
| ES (2) | ES2097753T5 (cs) |
| FI (1) | FI105688B (cs) |
| GR (2) | GR3022658T3 (cs) |
| HK (1) | HK1006718A1 (cs) |
| IE (1) | IE903663A1 (cs) |
| IL (3) | IL95971A0 (cs) |
| LV (1) | LV12575B (cs) |
| NO (1) | NO301832B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ235676A (cs) |
| PT (1) | PT95586B (cs) |
| SK (1) | SK284429B6 (cs) |
| WO (1) | WO1991005867A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA908166B (cs) |
Families Citing this family (185)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7217689B1 (en) | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US6153407A (en) * | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| WO1994024160A2 (en) * | 1993-04-21 | 1994-10-27 | Brigham And Women's Hospital | Erythropoietin muteins with enhanced activity |
| CN1057534C (zh) * | 1993-08-17 | 2000-10-18 | 柯瑞英-艾格公司 | 促红细胞生成素类似物 |
| US5773569A (en) * | 1993-11-19 | 1998-06-30 | Affymax Technologies N.V. | Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5830851A (en) * | 1993-11-19 | 1998-11-03 | Affymax Technologies N.V. | Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5696250A (en) * | 1995-02-15 | 1997-12-09 | Amgen Inc. | DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs |
| US5989538A (en) * | 1995-02-15 | 1999-11-23 | Amgen Inc. | Mpl ligand analogs |
| EP0964702B1 (en) | 1996-08-02 | 2006-10-04 | Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. | Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| IL124015A0 (en) | 1998-04-08 | 1999-01-26 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutical compositions comprising a protein |
| USRE40911E1 (en) | 1998-04-22 | 2009-09-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| US6696411B1 (en) | 1998-04-22 | 2004-02-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| DE69933216T2 (de) | 1998-06-15 | 2007-09-20 | GTC Biotherapeutics, Inc., Framingham | Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein |
| US6210924B1 (en) | 1998-08-11 | 2001-04-03 | Amgen Inc. | Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line |
| US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| AU774989B2 (en) * | 1998-10-23 | 2004-07-15 | Amgen, Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| BR9905868A (pt) * | 1998-11-06 | 2001-01-23 | Bio Sidus S A | Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| EP1135493A2 (en) * | 1998-11-30 | 2001-09-26 | Eli Lilly And Company | Erythropoietic compounds |
| CA2391080A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Erythropoietin forms with improved properties |
| US6703480B1 (en) | 1999-11-24 | 2004-03-09 | Palani Balu | Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use |
| HUP0204475A2 (en) | 2000-02-11 | 2003-04-28 | Merck Patent Gmbh | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| PT1274728E (pt) | 2000-04-21 | 2008-06-20 | Amgen Inc | Métodos e composições para a prevenção e tratamento de anemia |
| JP5490972B2 (ja) | 2000-08-04 | 2014-05-14 | 中外製薬株式会社 | タンパク質注射製剤 |
| JP5485489B2 (ja) | 2000-08-11 | 2014-05-07 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有安定化製剤 |
| US7855229B2 (en) | 2000-08-24 | 2010-12-21 | University Of Tennessee Research Foundation | Treating wasting disorders with selective androgen receptor modulators |
| US7622503B2 (en) | 2000-08-24 | 2009-11-24 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof |
| US7919647B2 (en) | 2000-08-24 | 2011-04-05 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof |
| US7645898B2 (en) | 2000-08-24 | 2010-01-12 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators and method of use thereof |
| PA8536201A1 (es) * | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
| US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| US20030072737A1 (en) | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
| RU2003129528A (ru) | 2001-03-07 | 2005-04-10 | Мерк Патент ГмбХ (DE) | Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела |
| WO2002072615A1 (en) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of purifying protein |
| DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| US7531358B2 (en) | 2001-04-17 | 2009-05-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of quantifying surfactant |
| EP1383785B1 (en) | 2001-05-03 | 2011-03-16 | Merck Patent GmbH | Recombinant tumor specific antibody and use thereof |
| ATE542904T1 (de) | 2001-10-29 | 2012-02-15 | Crucell Holland Bv | Verfahren und mittel zur herstellung von proteinen mit vorbestimmten posttranslationalen modifikationen |
| KR100467750B1 (ko) * | 2001-11-29 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| US8853266B2 (en) | 2001-12-06 | 2014-10-07 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators for treating diabetes |
| DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| EP1552298A4 (en) * | 2002-07-01 | 2006-11-08 | Kenneth S Warren Inst Inc | RECOMBINANT TISSUE-PROOFING CYTOKINS AND NUCLEIC ACIDS COORDINATING THEREOF FOR THE PROTECTION, RECOVERY AND IMPROVEMENT OF CELLS, TISSUE AND ORGANS THEREOF |
| EP1541165A4 (en) | 2002-08-27 | 2009-06-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR STABILIZING PROTEIN PREPARATION |
| DE20321793U1 (de) | 2002-09-11 | 2010-06-02 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hydroxyalkylstärke-Derivate |
| EP3225625A1 (en) | 2002-09-11 | 2017-10-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein purification method |
| BR0314227A (pt) | 2002-09-11 | 2005-10-25 | Fresenius Kabi De Gmbh | Derivados de amido de hidroxialquila |
| US7538092B2 (en) | 2002-10-08 | 2009-05-26 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates |
| WO2004055056A1 (en) | 2002-12-17 | 2004-07-01 | Merck Patent Gmbh | Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2 |
| WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
| WO2005032467A2 (en) | 2003-09-29 | 2005-04-14 | Warren Pharmaceuticals, Inc. | Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions |
| RU2370276C2 (ru) | 2003-12-31 | 2009-10-20 | Мерк Патент Гмбх | Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ |
| HUE027902T2 (en) | 2004-02-09 | 2016-11-28 | Human Genome Sciences Inc Corp Service Company | Albumin fusion proteins |
| JP5191729B2 (ja) | 2004-03-11 | 2013-05-08 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
| US9884038B2 (en) | 2004-06-07 | 2018-02-06 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulator and methods of use thereof |
| US9889110B2 (en) | 2004-06-07 | 2018-02-13 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulator for treating hormone-related conditions |
| US7714114B2 (en) | 2005-02-16 | 2010-05-11 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an EPO moiety and a polymer |
| US9988427B2 (en) | 2005-05-13 | 2018-06-05 | Charite Universitaetsmedizen-Berlin | Erythropoietin variants |
| JP2009506119A (ja) | 2005-08-31 | 2009-02-12 | ユニバーシティ オブ テネシー リサーチ ファウンデーション | 選択的アンドロゲン受容体モジュレーターを用いる腎疾患、熱傷、創傷および脊髄損傷の処置 |
| WO2007067564A2 (en) | 2005-12-08 | 2007-06-14 | Amgen Inc. | Improved host cells and culture methods |
| EP2495308A1 (en) | 2005-12-08 | 2012-09-05 | Amgen Inc. | Improved production of glycoproteins using manganese |
| EP1978030A4 (en) * | 2006-01-18 | 2009-12-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | PROCESS FOR REMOVING SIALIC ACID AND METHOD FOR PRODUCING ASIALOERYTHROPOIETIN |
| JP5553506B2 (ja) | 2006-03-22 | 2014-07-16 | 中外製薬株式会社 | エリスロポエチン溶液製剤 |
| BRPI0712063A2 (pt) | 2006-06-07 | 2011-12-20 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | tratamento de doenças isquêmicas usando eritropoietina |
| MX2009000385A (es) | 2006-07-12 | 2009-04-06 | Univ Tennessee Res Foundation | Acil-anilidas sustituidas y metodos de uso de las mismas. |
| US20090173876A1 (en) | 2006-07-21 | 2009-07-09 | Amgen Inc. | Method of detecting and/or measuring hepcidin in a sample |
| US8299015B2 (en) | 2006-07-25 | 2012-10-30 | Lipoxen Technologies Limited | Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor |
| CA2661054A1 (en) | 2006-08-22 | 2008-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Prophylactic and/or therapeutic agents for peripheral neuropathy |
| ES2581765T3 (es) | 2006-08-24 | 2016-09-07 | University Of Tennessee Research Foundation | Acilanilidas sustituidas y métodos de uso de las mismas |
| WO2008058942A2 (en) | 2006-11-13 | 2008-05-22 | Charite - Universitätsmedezin Berlin | Method of cell culture and method of treatment comprising a vepo protein variant |
| AR065613A1 (es) | 2007-03-09 | 2009-06-17 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes de proteccion para organos transplantados |
| US7968603B2 (en) | 2007-09-11 | 2011-06-28 | University Of Tennessee Research Foundation | Solid forms of selective androgen receptor modulators |
| EP2205280B1 (en) | 2007-09-27 | 2019-09-04 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
| US8796206B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-08-05 | Amgen Inc. | Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration |
| EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
| WO2009094551A1 (en) | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Amgen Inc. | Ferroportin antibodies and methods of use |
| US9315577B2 (en) | 2008-05-01 | 2016-04-19 | Amgen Inc. | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
| DE102008002209A1 (de) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin |
| US8003689B2 (en) | 2008-06-20 | 2011-08-23 | Gtx, Inc. | Metabolites of selective androgen receptor modulators and methods of use thereof |
| EP2161031A1 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-10 | SuppreMol GmbH | Fc gamma receptor for the treatment of B cell mediated multiple sclerosis |
| CN102164954B (zh) * | 2008-09-23 | 2018-04-06 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 促红细胞生成素的纯化 |
| JP6018753B2 (ja) | 2008-11-13 | 2016-11-02 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイションＴｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｂｍｐ−６の調節によって鉄の恒常性を制御するための方法および組成物 |
| DE102008054716A1 (de) | 2008-12-16 | 2010-06-17 | Evonik Degussa Gmbh | Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO |
| WO2011011674A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Production of erythropoiesis stimulating protein using metal ions |
| EA022396B1 (ru) | 2009-09-23 | 2015-12-30 | Ратиофарм Гмбх | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин |
| WO2011050333A1 (en) | 2009-10-23 | 2011-04-28 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| SG186094A1 (en) | 2010-06-07 | 2013-01-30 | Amgen Inc | Drug delivery device |
| AU2012236573B2 (en) | 2011-03-31 | 2016-06-02 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| HUE042822T2 (hu) | 2011-04-20 | 2019-07-29 | Amgen Inc | Automata befecskendezõ szerkezet |
| PL3045187T3 (pl) | 2011-10-14 | 2019-09-30 | Amgen Inc. | Wstrzykiwacz i sposób montażu |
| US20150065689A1 (en) * | 2012-04-10 | 2015-03-05 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Single step fractionation method |
| LT2872482T (lt) | 2012-07-13 | 2020-12-28 | Oncternal Therapeutics, Inc. | Krūties vėžių gydymo būdas selektyviu androgeno receptoriaus moduliatoriumi |
| US10987334B2 (en) | 2012-07-13 | 2021-04-27 | University Of Tennessee Research Foundation | Method of treating ER mutant expressing breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMs) |
| US9744149B2 (en) | 2012-07-13 | 2017-08-29 | Gtx, Inc. | Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs) |
| US10314807B2 (en) | 2012-07-13 | 2019-06-11 | Gtx, Inc. | Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS) |
| US9622992B2 (en) | 2012-07-13 | 2017-04-18 | Gtx, Inc. | Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs) |
| US9969683B2 (en) | 2012-07-13 | 2018-05-15 | Gtx, Inc. | Method of treating estrogen receptor (ER)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS) |
| US10258596B2 (en) | 2012-07-13 | 2019-04-16 | Gtx, Inc. | Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS) |
| ES2860954T3 (es) | 2012-11-21 | 2021-10-05 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármacos |
| EP2740805B1 (en) | 2012-12-07 | 2019-02-20 | SuppreMol GmbH | Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura |
| TWI614041B (zh) | 2013-03-15 | 2018-02-11 | 安美基公司 | 用於注射器之匣盒 |
| JP6336564B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-06-06 | アムゲン・インコーポレーテッド | 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム |
| US10646664B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | Amgen Inc. | Body contour adaptable autoinjector device |
| WO2014152006A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Intrinsic Lifesciences, Llc | Anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
| WO2014149357A1 (en) | 2013-03-22 | 2014-09-25 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
| SG11201602876WA (en) | 2013-10-24 | 2016-05-30 | Amgen Inc | Injector and method of assembly |
| CA3168888A1 (en) | 2013-10-24 | 2015-04-30 | Amgen Inc. | Drug delivery system with temperature-sensitive control |
| US10994112B2 (en) | 2014-02-05 | 2021-05-04 | Amgen Inc. | Drug delivery system with electromagnetic field generator |
| WO2015130963A2 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Xenetic Biosciences, Inc. | Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain |
| AU2015256082C1 (en) | 2014-05-07 | 2020-09-10 | Amgen Inc. | Autoinjector with shock reducing elements |
| ES2864079T3 (es) | 2014-05-30 | 2021-10-13 | Pfizer | Derivados de carbonitrilo como moduladores selectivos del receptor de andrógenos |
| CN111840696B (zh) | 2014-06-03 | 2022-12-20 | 安姆根有限公司 | 可控制药物递送系统和使用方法 |
| US10323088B2 (en) | 2014-09-22 | 2019-06-18 | Intrinsic Lifesciences Llc | Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
| EP3206739B1 (en) | 2014-10-14 | 2021-12-01 | Amgen Inc. | Drug injection device with visual and audio indicators |
| US11357916B2 (en) | 2014-12-19 | 2022-06-14 | Amgen Inc. | Drug delivery device with live button or user interface field |
| EP3848072A1 (en) | 2014-12-19 | 2021-07-14 | Amgen Inc. | Drug delivery device with proximity sensor |
| JP6484345B2 (ja) | 2015-02-17 | 2019-03-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置 |
| WO2016138434A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Amgen Inc. | Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement |
| WO2017039786A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Amgen Inc. | Syringe assembly adapter for a syringe |
| JP7082568B2 (ja) | 2015-12-09 | 2022-06-08 | アムジエン・インコーポレーテツド | 信号伝達キャップ付き自動注射器 |
| US11154661B2 (en) | 2016-01-06 | 2021-10-26 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling electronics |
| DK3429663T3 (da) | 2016-03-15 | 2020-09-28 | Amgen Inc | Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler |
| WO2017189089A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Amgen Inc. | Drug delivery device with messaging label |
| US11389588B2 (en) | 2016-05-02 | 2022-07-19 | Amgen Inc. | Syringe adapter and guide for filling an on-body injector |
| AU2017263558B2 (en) | 2016-05-13 | 2022-12-22 | Amgen Inc. | Vial sleeve assembly |
| WO2017200989A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Amgen Inc. | Data encryption in medical devices with limited computational capability |
| US11541176B2 (en) | 2016-06-03 | 2023-01-03 | Amgen Inc. | Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices |
| EP3478342B1 (en) | 2016-07-01 | 2025-03-12 | Amgen Inc. | Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events |
| WO2018034784A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement detection |
| US20200261643A1 (en) | 2016-10-25 | 2020-08-20 | Amgen Inc. | On-body injector |
| AU2018210301A1 (en) | 2017-01-17 | 2019-08-01 | Amgen Inc. | Injection devices and related methods of use and assembly |
| CA3052204A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Insertion mechanism for drug delivery device |
| WO2018151890A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly |
| EP3592403B1 (en) | 2017-03-06 | 2025-08-20 | Amgen Inc. | Drug delivery device with activation prevention feature |
| US11571511B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-02-07 | Amgen Inc. | Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device |
| AU2018230486B2 (en) | 2017-03-09 | 2023-05-11 | Amgen Inc. | Insertion mechanism for drug delivery device |
| EP3570871B1 (en) | 2017-03-20 | 2020-11-18 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein |
| ES3023742T3 (en) | 2017-03-28 | 2025-06-03 | Amgen Inc | Plunger rod and syringe assembly system |
| US11590294B2 (en) | 2017-06-08 | 2023-02-28 | Amgen Inc. | Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly |
| JP7200134B2 (ja) | 2017-06-08 | 2023-01-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | トルク駆動式薬物送達デバイス |
| JP7195276B2 (ja) | 2017-06-22 | 2022-12-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | デバイス起動による衝突／衝撃の低減 |
| WO2018237225A1 (en) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | Amgen Inc. | Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly |
| IL270784B2 (en) | 2017-07-14 | 2023-11-01 | Amgen Inc | Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system |
| JP7649105B2 (ja) | 2017-07-21 | 2025-03-19 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法 |
| US11617837B2 (en) | 2017-07-25 | 2023-04-04 | Amgen Inc. | Drug delivery device with gear module and related method of assembly |
| MA49676A (fr) | 2017-07-25 | 2020-06-03 | Amgen Inc | Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé |
| MA49838A (fr) | 2017-08-09 | 2020-06-17 | Amgen Inc | Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre |
| EP3668567B1 (en) | 2017-08-18 | 2026-02-18 | Amgen Inc. | Wearable injector with sterile adhesive patch |
| US11103636B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-08-31 | Amgen Inc. | Needle insertion mechanism for drug delivery device |
| WO2019070472A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Amgen Inc. | FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE |
| ES2971450T3 (es) | 2017-10-06 | 2024-06-05 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente |
| US11464903B2 (en) | 2017-10-09 | 2022-10-11 | Amgen Inc. | Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly |
| IL273582B2 (en) | 2017-11-03 | 2024-12-01 | Amgen Inc | Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device |
| EP3706830B1 (en) | 2017-11-06 | 2024-08-07 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement and flow sensing |
| EP3707075A1 (en) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Amgen Inc. | Fill-finish assemblies and related methods |
| MA50557A (fr) | 2017-11-10 | 2020-09-16 | Amgen Inc | Pistons pour dispositifs d'administration de médicament |
| MX2020005066A (es) | 2017-11-16 | 2020-08-20 | Amgen Inc | Autoinyector con deteccion de detencion y punto final. |
| JP7370969B2 (ja) | 2017-11-16 | 2023-10-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構 |
| US10835685B2 (en) | 2018-05-30 | 2020-11-17 | Amgen Inc. | Thermal spring release mechanism for a drug delivery device |
| US11083840B2 (en) | 2018-06-01 | 2021-08-10 | Amgen Inc. | Modular fluid path assemblies for drug delivery devices |
| MA53375A (fr) | 2018-07-24 | 2021-06-02 | Amgen Inc | Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments |
| US12303677B2 (en) | 2018-07-24 | 2025-05-20 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation |
| WO2020023336A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with grip portion |
| CA3103681A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Delivery devices for administering drugs |
| CA3103105A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Amgen Inc. | Fluid path assembly for a drug delivery device |
| US20210346601A1 (en) | 2018-09-24 | 2021-11-11 | Amgen Inc. | Interventional dosing systems and methods |
| CA3110371A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Amgen Inc. | Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device |
| EP3860685A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Amgen Inc. | Injection systems for drug delivery with internal force transmission |
| US12151089B2 (en) | 2018-10-05 | 2024-11-26 | Amgen Inc. | Drug delivery device having dose indicator |
| TW202541859A (zh) | 2018-10-15 | 2025-11-01 | 美商安進公司 | 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器 |
| WO2020081480A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Amgen Inc. | Platform assembly process for drug delivery device |
| EP3873563A1 (en) | 2018-11-01 | 2021-09-08 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
| TWI831847B (zh) | 2018-11-01 | 2024-02-11 | 美商安進公司 | 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法 |
| MA54048A (fr) | 2018-11-01 | 2022-02-09 | Amgen Inc | Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament |
| AU2020263289B2 (en) | 2019-04-24 | 2025-05-22 | Amgen Inc. | Syringe sterilization verification assemblies and methods |
| WO2021041067A2 (en) | 2019-08-23 | 2021-03-04 | Amgen Inc. | Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods |
| CU24704B1 (es) * | 2019-09-05 | 2024-04-08 | Ct Inmunologia Molecular | Método para la obtención de eritropoyetina humana recombinante hiposialilada para el tratamiento de alteraciones del sistema nervioso |
| JP2024523779A (ja) | 2021-05-21 | 2024-07-02 | アムジェン インコーポレイテッド | 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法 |
| WO2023275715A1 (en) | 2021-06-30 | 2023-01-05 | Pfizer Inc. | Metabolites of selective androgen receptor modulators |
| WO2023209074A1 (en) | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing |
| WO2024094457A1 (en) | 2022-11-02 | 2024-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing glycoprotein compositions |
| WO2026030152A1 (en) | 2024-07-29 | 2026-02-05 | Amgen Inc. | System and method for assessing transferability of a fill recipe |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2354793A1 (fr) * | 1976-06-14 | 1978-01-13 | Gresset Bernard | Jouet tel que tableau |
| FR2475988A2 (fr) * | 1978-09-04 | 1981-08-21 | Cassagnes Andre | Appareil a dessiner |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
| DE3923963A1 (de) * | 1989-07-20 | 1991-01-31 | Behringwerke Ag | Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung |
-
1990
- 1990-10-09 KR KR1019910700600A patent/KR100221066B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-09 JP JP2514568A patent/JP2983629B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-09 AU AU66042/90A patent/AU646822B2/en not_active Expired
- 1990-10-09 KR KR1019980707104A patent/KR100263845B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-09 WO PCT/US1990/005758 patent/WO1991005867A1/en not_active Ceased
- 1990-10-12 ZA ZA908166A patent/ZA908166B/xx unknown
- 1990-10-12 NZ NZ235676A patent/NZ235676A/en unknown
- 1990-10-12 AT AT90311193T patent/ATE146187T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 EP EP95101849A patent/EP0668351B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 SK SK4972-90A patent/SK284429B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 CZ CZ19904972A patent/CZ291515B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 ES ES90311193T patent/ES2097753T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 IL IL95971A patent/IL95971A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 DK DK90311193T patent/DK0428267T4/da active
- 1990-10-12 IL IL12517590A patent/IL125175A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 AT AT95101849T patent/ATE184914T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 CN CN90109447A patent/CN1063796C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 IE IE366390A patent/IE903663A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 DK DK95101849T patent/DK0668351T3/da active
- 1990-10-12 EP EP90311193A patent/EP0428267B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 PT PT95586A patent/PT95586B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 DE DE69033301T patent/DE69033301T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 DE DE69029370T patent/DE69029370C5/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 ES ES95101849T patent/ES2139764T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-15 CA CA002165694A patent/CA2165694C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-15 CA CA002027635A patent/CA2027635C/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-12 FI FI912829A patent/FI105688B/fi active
- 1991-06-13 NO NO912281A patent/NO301832B1/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-16 JP JP07057432A patent/JP3073905B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-02-26 GR GR970400345T patent/GR3022658T3/el unknown
-
1998
- 1998-06-23 HK HK98106060A patent/HK1006718A1/en not_active IP Right Cessation
- 1998-07-01 IL IL12517598A patent/IL125175A0/xx active IP Right Grant
-
1999
- 1999-12-08 GR GR990403180T patent/GR3032089T3/el unknown
-
2000
- 2000-05-04 LV LVP-00-60A patent/LV12575B/en unknown
- 2000-05-12 CZ CZ20001772A patent/CZ291488B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-27 CZ CZ20011115A patent/CZ291471B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-03-27 CZ CZ20011117A patent/CZ291472B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5856298A (en) | Erythropoietin isoforms | |
| CZ291471B6 (cs) | Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem | |
| RU2159814C2 (ru) | Аналог эритропоэтина | |
| HK1006718B (en) | Erythropoietin isoforms | |
| HK1001589B (en) | Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites | |
| JP4345077B2 (ja) | 有利なグリコシル化プロフィルを有する組換えヒトエリスロポエチン | |
| FI106563B (fi) | Menetelmä ihmisen erytropoietiinin analogien valmistamiseksi ja niitä koodittavat DNA-sekvenssit | |
| IE83805B1 (en) | Erythropoietin analogs | |
| HK1010398B (en) | Erythropoietin analogs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20101012 |