CZ497290A3 - Isoformy erythropoietinu - Google Patents
Isoformy erythropoietinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ497290A3 CZ497290A3 CZ19904972A CZ497290A CZ497290A3 CZ 497290 A3 CZ497290 A3 CZ 497290A3 CZ 19904972 A CZ19904972 A CZ 19904972A CZ 497290 A CZ497290 A CZ 497290A CZ 497290 A3 CZ497290 A3 CZ 497290A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- erythropoietin
- molecule
- isoforms
- acids per
- isoform
- Prior art date
Links
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 177
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims abstract description 147
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title claims abstract description 147
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title claims abstract description 147
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title claims abstract description 136
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 62
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 claims description 32
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 10
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241001125862 Tinca tinca Species 0.000 claims 1
- 206010047623 Vitamin C deficiency Diseases 0.000 claims 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 claims 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims 1
- 208000010233 scurvy Diseases 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 abstract description 26
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 abstract description 26
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 abstract description 21
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 10
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 57
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 18
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 14
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 11
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 11
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 4
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- -1 erythropoietin ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000000581 polycythemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 2
- 230000000913 erythropoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N Acetylene Chemical compound C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000352333 Amegilla alpha Species 0.000 description 1
- 101000651036 Arabidopsis thaliana Galactolipid galactosyltransferase SFR2, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001235572 Balantioides coli Species 0.000 description 1
- 101710195293 Beta-galactosidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100408464 Caenorhabditis elegans plc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100113998 Mus musculus Cnbd2 gene Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- BJAJDJDODCWPNS-UHFFFAOYSA-N dotp Chemical compound O=C1N2CCOC2=NC2=C1SC=C2 BJAJDJDODCWPNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 1
- MJEMIOXXNCZZFK-UHFFFAOYSA-N ethylone Chemical compound CCNC(C)C(=O)C1=CC=C2OCOC2=C1 MJEMIOXXNCZZFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 1
- 229940047135 glycate Drugs 0.000 description 1
- 108010057760 hepatic sialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- OCVXZQOKBHXGRU-UHFFFAOYSA-N iodine(1+) Chemical compound [I+] OCVXZQOKBHXGRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical class CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N phosphinic chloride Chemical compound ClP=O RLOWWWKZYUNIDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- ZMRUPTIKESYGQW-UHFFFAOYSA-N propranolol hydrochloride Chemical group [H+].[Cl-].C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 ZMRUPTIKESYGQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQLVQOSNDJXLKG-UHFFFAOYSA-N prosulfocarb Chemical compound CCCN(CCC)C(=O)SCC1=CC=CC=C1 NQLVQOSNDJXLKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- DZXKSFDSPBRJPS-UHFFFAOYSA-N tin(2+);sulfide Chemical compound [S-2].[Sn+2] DZXKSFDSPBRJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pyrane Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
isoformy erythropoietinu
Oblost techniky
nebo jejich směsí, farmaceutických přípravků, která tyto formy nebo jejich směsi obsahují a způsobu léčení za použití takových isoforem a přípravků.
Dosavadηí. stav _techni kv
Ery thr op o i eti n je gly'-©proteinový hormon zjištěný při zrání erythrcidních progenitorových buněk na erythrocyty.mé podstatný význam při regulaci hladin červených krvinek v oběhu. Přirozeně se vyskytující erythropoietin je produkován játry bohem fetálního života a ledvinami u dospělých s cirkuluje v ki i a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anenie je téměř vždy důsledek renéiního poškození, působícího snížení produkce erythropoietinu v ledvinách. 0 rekom; innntziím erethropoietinu, produkovaném technikami renovoho inženýrství, zahrnujícími expresi proteinového produktu hostitelskými buňkami transformovanými genem kódujícím erythropoietin bylo zjištěno, že je účinný jestliže se použije· při léčení anemie vzniklé z chronického renálního poškození.
^'osud byla dostupnost erythropoi eti nu velmi omezena.
když je protein přítomen v lidské moči, vylučované množství jsou příliš nízké p:
aktický zdroj ery thropoietinu pro terapeutické využití. Pacienti postižení aplastickou nnomií vykazují zvýšení hladiny urinárního erythropoietinu vo srovnání se zdravými individui ale omezené množství takové coče rovněž činí tento zdroj nepraktickým, ťurifikace lidského urinárního erythropcietinu podle iíiyakeho a spol, J.Biol.dhern., 252, 5558 (1977), používá jako výchozí materiál moč od osob ε aplsstickou aneciií.
Identifikace, klonování a exprese genů, kódujících erythropoietin je popsána v US patentu 6. 4703008 Linnem. Popis purifikace rekombinantního er.ythropoietinu z buněčného media, podporujícího růst savcích buněk, obsahujících rekombinantní erythropoietinové plasmidy je např. zahrnuta v US patentu č. 4667016 aie a spol.. Exprese a získání biologicky aktivního rekombinantního er.ythropoietinu ze savčích hostitelských buněk, obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantr.ím plasmidu, poskytuje v první řadě dostatečné množství ervthronoietinu vhodného pro terapeuDále znalost genové sekvence a dostupnost purifikov-,róbo proteinu umožňuje lepší tické aplikace, votších množství pochopení působení tohoto proteinu.
-biologická aktivita proteinu je závislá na jeho struktuře. ^ejménn primární struktura proteinu (tj. jeho aminokys·linová sekvence) poskvtuje informaci, která umožňuje formaci sekundární (např. ρζ -helix nebo Q -list) a terciární (trojrozměrné přehyby) struktury polypeptidu během a po jeho syntéze. Přerušení vlastních sekundárních a terciárních struktur zavedením mutací n^bo chemickým nebo enzymatickým zpracováním, může vést ke snížení biologické aktivity.
V prskanýctních organismech jsou biologické aktivity proteinů z velké části ovládány výše uvedenými strukturami.
Na rozdíl od proteinů z prokaryotních buněk je mnoho buněčných povrchů a sekrstávaných proteinů produkovaných v eukaryot nich buňkách modifikováno jednou nebo více oligosacharidovými
3skupinarai. Tato modifikace označovaná jako glykosylace nůže výrazně ovlivhit také být důležité pro celulérr.í lokalizaci.
fyzikální vlastnosti proteinů a může stabilitu proteinu, sekreci a subVlastní ř- lýko sy láce nůže mít základní význam pro biologickou aktivitu, ^řkteré geny z eukaryotnich organismů, když jsou exprimovány v bakteriích (např. E.ccli), které postrádají celulórní procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, která mají malou nebo žádnou aktivitu díky nedostatku glykosylace.
Glykosylace se uskutečňuje při specifických sístech podál polypeptidováho hlavního řetězce a je obvykle dvou typů: O-vézané oligosacharidy jsou spojené se serinovými ne bo ikreor.inovými zbytky, zatímco H-vázuné oligosachnridy jsou připojeny k aspa částí sekvence *sn-Xnckyselina s výjimkou zených oligosacharidů ayincvýa zbytkům, jestliže jsou tyto er/Thr, kde X může být jakákoliv atr.iprolinu. Struktury 1-vázaných a O-váa cuki-cvých zbytků nelezené v Každém typu, jscu rozdílné. Jeden typ cukru je obvykle nalezen na obou, je jí re N-acetylneuraminové kyselina (dále nazývaná jako siolové kyselina), klanová kyselina jo obvykle terminálni zbytek obou f'-vázaných ? O-vázaných oligosacharidů a díky svému negativnímu náboji uděluje glykoproteinu kyselý charakter.
ní ani
Jok lidský z m-če získaný erythrepoietin i rekombinant ervthropoietin (oxprimovnný v savčích buňkách), sající nokyselinoveu sekvenci 1 - 165 lidského erythropoietinu, obsahují tři N-vázsná a tězec, kde tyto řetězce hmotnosti g1ykoprotninu asparaginových zbytcích jeden O-vázaný oligosacharidový retvoří os i 40 ceikovéh molekulové K-Váz má glykosylace probíhá na umístěných v pc.ohách 24, 3S a
83, zatímco 0-vázanó rlykosylace probíhá na serinovém zbyt ku ucístánéu' v poloze 126 (Lai a spol., J.Diol.Chem. 261,
-43116 (1986); Broudy a spol. Arch.Biochem.Biophys. 265,
3?9 (1988). Oligosacharidové řetězce nohou byt modifikovány terminálními zbytky sialové kyseliny, -nzymatické zpracování glykosylovaného orythropoietinu pro odstranění zbytků sialové kyseliny vede ko ztrát? in vivo aktivity, ale nepůsobí ztrátu aktivity in vitro (Lowy a spol., ature 185, 102 (1963) 4202 (1974)). loto
Goldwasser ? spol., J.Biol.Oheň. ?49, chování nůž? být využito při rychlém odstranénífasialoerythropoietinu z obyhu po interakci s heoatickýiE proteinem, který váže asialoglykoprotein (Morrell a spol. J.Biol.Chea. 243, 155 (1968); Briggs a spol. An.
J.Pbisiol. °?7, 1385 (1974); Ashi eli a spol., ílethods hnzyoiol. 50, 867 (1978)). Rrythrop^řetin tak vykazuje in vivo biologickou účinnost pouze když je sialylován a je tek zabráněno jeho vazbo hepatickýn vázacím proteinem.
ů.ol·?. defi novéno iných slož dcstatečně.
k v oligosechsridrvých řetězcích není Rylo zjičt*-no, že neglykosylovaný erythr^p néní s o oietin 'á velmi sníženou in vivo lykosy1ovanou formou, ale udržuje aktivitu ve srovsi aktivitu in vitro (Dordal o spol. patent v,vše). V další
Rndocrinoiogy 116, 2293 (1985); Línův studii nicméně- odstranění K-vázaných nebo O-vázených oligosachoridových řetězců jednotlivě nebo společně mutagenesí asporaginových nebo serinových zbytků, které jsou glykosylačními místy, výrazně snižuje in vitro aktivitu přeměněného er thropoietinu, který je produkován v savčích buňkách (Dube ilol.Che:
^63, 17516 (1988)).
Glykoproteiny jako je ervth opoietin nohou být separovány na různě nabité formy za použití technik jako je isoelektrické fokusace (IBF). Jsou uváděny IKK studie surov íh-φ částečně purif i kovaných er.ythropoi etinových přípravků (Lukowsky a spol., J.Biochen 50, 939 (1>72); Shelton a spol, Biochec. Led. 18, 45 (1975); Fuhr a spol. Biochen. Biophys, Aos.Comc. 93, 930 (1981)). Nanejvýš tři nebo čt^ři frakce mající erythropoietir.ovou aktiv! tu byly rozlišeny Π-F v těchto studiích a 2áIra nebyla charakterizování ohledem na obsah cukrů. bále ne bvl· .itanoven žá lnů vztah mezi iso· eloktri.ckvmi bcd.y frakcí a jejich biologickou aktivitou.
V průběhu puriflka.ee urinárního eryťnropcietinu z lidské moce, popisovaná v práci ííiyakeho a spol. supra, byly zjištěny dvě erythropoietinové frakce z chromatogrnfie no hydroxylapatitu označeno jako II a IIIA, mající stejn.u specifickou aktivitu. Následují..í analýzu cukrů frakce II a IIIA prokázala, že frakce II ná větší průměrný obsah siaiová kyseliny než frakce IIIA (ž-crdel a spol. suora).
předloženého vynálezu je poskytnout separované •a rs+ ί incvsnj čtiví. tu. larmaceu
3C7 o t; nu, obsah dolových kyselin a biologickou tické přípravky, obsahující takové molekuly by mokly být terapeuticky prospěšné.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká er.ythropoi eti nových isoforem. ‘aké poskytuje způsob přípravy erythropíctinévé isoforo.y, obsahující stupněoodrobe.ní čištěného er.ythropoi etinu preparativní isoelektrické fokušaci a eluce jednotlivých iso forem z £niu. Jsou toká poskytovány farmaceutické přípravky, •-•bsahující ertyhropietinové isoformy. Předmět vynálezu se také týká způsobů zvýšení h.adiny hematokritů u savců, zahrnujících podání terapeuticky přijatelného množství těchto přípravků prc zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek.
Předložený vynález se týká způsobu přípravy směsi — θ' erythropoietinových molekul, majících více než nebo alternativně méně nez preieterminovaný počet sialových kyselin na molekulu, který zahrnuje zpracování materiálu, obsahujícího erythropoietin iontov/nknnou chromatografií. rředmětea vynálezu je také způsob přípravy směsi erythropoietino vích molekul, majících polet sialových kyselin nc molekulu větší nebo alternativně menší než je předeterminovnný počet, zahrnující zpracování materiálu obsabujícího erythrop-^i etin chromatof skusací.
V VZVÍLr Z t, O S A mající vátší počet, n íck.
/Asn než cá lidsk·
... cr .-, ..-
| mu je sinal ony lidského | e r y thr op i. e t inu, |
| st pro při pojení korboh | ydrátového |
| erythropoietin, jako j | e /íVsn^^/lPO, |
| /Thr1 ΆίΡΟ, a /fro1^ | Thr125/TPO. |
£opÍ3 připojených obrázků:
Obr.l přeistovuje analytický isoelektriekofokusaSn S®1 s dělení rekombinantních erythropoietincvých^oforem. dělové dráhy 1-11 představují isoforsy rozmezí od méně kyselých (vyšší pl) ve dráze I kyselejším (nižší pí) ve dráze 11. čištěný rekoihantní erythropoietin obsahující směs isoforem j-'také uveden v poslední levé a pravé dráze gelu.
Obr.2 představuje vzt--.h mezi počtem sinlových J^lin na erythropoietinovcu i sofo mu a specif icko^tivi tu in vivo každé isoforsy, vyjádřenou jako --° o tky na mg erythropoietinevého polypeptidů. *’a ? 2A, byla k centsrce každí erythrc pcieti nové isodV stanovena r>r.-jdfordevru proteinovou zkouákou, °br. 28, byla koncentrace stanovena absorbsneí ' na obr.2C, byla konce; trnee stanovena poirJlJ-^·
Obr.3 představuje analytický i soelektrofokusační gel dsfirov .ných směsí rekombinantních erythropoietinových isofcrem připravených aniontovýnSnnou chromatografií za r°zných polnínok. Gelové dráhy i-6 představují ervthropoietinové isoformy eluované při vysocesolném promývání po pr omývání Q-íepharosové kolony 150 aí! ky selirou octovou, př 4,7, 150 nd kyselinou octovou (nepufrováná), 200 mM kyselinou octovou, pí I 4,7,
250 mu kyselinou o.tovcu, ph 4,7, 300 nu kyselinou octovou , prt 4,7 nebo 300 itid kyselinou octovou (nepufrovanou). Čištěný rekombinantní erytbropoictin, obsahující směs isofnrem získaný za použití postupů popsaných v příkladu 7 práce -uaic a soc_. supra, ε -ím rozdílem, že DEAI—aoarozová ch:onatografie je nahrazena chromáterrnfií na C-vepharose, je znázorní' ve dráze zcc H vlevo no gelu.
Obr.4 představuje seporaoi erythropoiotinových isoforem 8 ;ískanýcb zpracování.; sedí a buněk na sloupci QSrpharosy li onto;
i ontov ύ si«>sajic-Lho prí a zvasujici se ly. -odíly z frakcí označených 2 ac 40 byly podrobeny analytické isoeloktrické fokusaci. čištěný rrkombinantní cx\ythropoietin obsahující směs isofopoužití postupu popsaných v přírBisřsnvcn z kladu 0 práce Laie a spol.supra, s tím rozdílem, že DEAO—agaros;vá chromá>tografie bylo nahrazena chromatoyrntií na t-íopharose, je uveden v poslední levé dráze tohoto g lu.
představuje aminekuseiinovou poietinu. Čtverečky označují kterým jsou připojeny/threoni sekvenci lidského erythro asparaminové zbytky, ke novo a serinové zbytky karboby írátov řetozce a hvězdičky označují
-εmodifikované karboh.ydrátem. Další glykosylnční místa poskytnutá v analozích z příkladu 6 jsou indikována □utaceci usparaginu, šeřinu a threoninu.
Obr. óA, 65 a 63 představují serie stupňů klonování při generování plasmidú pro konstrukci a analýzu analogů lidského erythropoietinu. Tyto analogy sají aminokyseliny změněné jak je uvedeno na obr. 5, které poskytují další glykosylační místa.
)br.7 představuje analýzy Western blot COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoieLinu a indikon váných erythropoietinových analogů. Analogy /Asn , ser
27 /Ε1Ό, /Asn°^/J;.ťO, /Asn1”Λ Ser''''/SPO a /Pro
124 'Ί.
Thr' <'J/EPS jsou konstruovány jak je popsáno v příSu.sdu b. Analos
Thr1 y.oK;, /Asn'
Ser126/
SPO a /Thr i 25 ”! >7
Ser'A
0, která neobsahují další irbehydrátoví řetězce jsou zde uvedeny pro srovnání.
Obr.S představuje Sestern blot analýzu COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoietinu a indikovaných erythrepoieti nových analogů po zpracování s N-gly\ '-.r- 4 < Ί Λ 4 n f 124 Thr12í?/řT0 kanasou. Analogy /Thr /KPO a /Pro js-u konstruovány jak je popsáno v příkladu 6. Analogy /V..11 ?6/FP0, /Pro1 4/SlC, /Pro12Í>/EPO, /Thr127/ Ir or, /Pro r ' a /Thr
125
27
Ser /PPO jscu uvedeny pro srovnání.
Obr.S představuje isoí^ketroíl:kusaění gel. poolů 2,3 a 4 získaných, chromatografií na C-lepharose a C4 reverzní fázi zpracováním buněčného media, které podporuje inst CHO buněk transferovaných erythropoietinovou cDNA, 12 5 obsahující /Thr /mutaci. Čištěný rekombinantní eryth-3ropoietin, obsahující směs isoforeci je získán za použití postupů, popsaných v příkladu 8 práce Laie a spol., supra, s tím rozdílem, že DKAE-agarosové chromátografie jo nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, tyto •rvxhropoi etiny jsou uvedeny v levých a pravých druhách gelu.
xodle předloženého vynálezu jsou poskytovány isoforn.y exytfcropoie linu. j-solelektri cká fukusace (UF) dělí pr-te^ny na základě náboje. Při umístění do gradientu pH a péscbením elektrického pole budou proteiny mirrovnt k bolu, ve kterém nenají náboj sítě a zůstávají na tomto míst' lote je is .el< ktri cký bod (pí) proteinu. Každý je notlivý pruh pí a : z oro var;.1 .olekui.y rojící určitý tím Leky obecně i stejný náboj a jsou nazvány jako isofermy. mužitý výraz ervthir-poieLirové i se.farma označuje e r tyh.rrpoie t i nov é přxpr--:vky , rojící je<iná pí a mající stejné ami nokysa,.: noví sekvence.
»e v>ncjr.2s prove mm jc eryurcpoictm procuict exprese exogcnaí ulA sekvence, která byla transfektována so jiných cukary-.-'tních hostitelských buněk než lidských, to jest, ve výhodném provedení je or.ythmpoietin ''rekombinantní erythropoietin. h-ekombinantní erythrcpcietin je výhodně produkován p stupen pop'
Linea, Uř patent č. 4703008, uvedeným z is íplncst. úokembinantní crythropoietin je výhodně či Stěn podle obecných oostupů pops/iných v příkladu v US z d e u v e 1 en ,i ak o v přikladu 2, kde putentu č. 1657016 laie a spol., kt^rý je oik-iz nebo alternativně postupem popsaným ch ro.uatograf i e aa ukal a^arose je nahrazena chrosatogrt.fií na C-^epharose. V modifikaci se sloupcem ú—-ephaxOsa se 55 mm NaCl nahradí 25 mk haCl v pufrovnnér. roztoku pro uvedení kolcnv no neutrální pH a 140 uh·.' 9 <
se nohrodí mM NaCl v pufr ováném roztoku pro elucí rrythropoirLinu z koleny. Tento materiál při analýze elektroforezou na polvakrylami-1 0dov::n ge iu s dodecylsulfátem sodným, migruje jako jediný druh (tj. pruh). Jestliže se čištěný erythrcpoiotin podrobí iEF, jsou v gelu zřejmé násobné pruhy, které indikují, jsou pří temny různě nabité formy gl.ykoprotei nu.
zo o nalezeno, že jednotlivé isoformy rekonbinsntního erythr poi eti nu, mající aminokyselinovou sekvenci z moče získaného lidského erythropoietinu odpovídají erythropoietónovým molekulám, majícím od 1 do 14 sialových kyselin a každá iscforma přítomná v čištěném rekombinantnim erythropoietinu sé in vivo aktivitu, která má vztah k počtu sialových kyselin isoformy. Výraz ‘'erythropoietin·', jak je zde použit, zahrnuje přirozeně získaný erythropoietin, z moče získaný lidský erythropoietin jeko_ž i nepřirozeně se vyskytující polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci a glykosylaci dostatečně duplikativní s přirozeně se vyskytujícím er.ythropoietinem pro získání in vivo biologických vlastností takových., že buňky kostní dřeně zvyšují produkci retikulceytů a S rvených krvinek.
Surové přípravky erythropoietinu mají mnoho isoforem, ale materiál čištěný například laien a spol. supra příklad 2, obsahuje převážně šest isoforem při analýze IFF. Dále byla dctegována nejméně jedna další isoforma vyšší kyselosti při použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4. (Tato více kyselé forma, migrující při >14 sikových kyselinách na IEF gelu může obsahovat negativní náboje nesia^ově kyseliny jak je zřejmé z odolnosti vůči štěpení sialidasou). Ayto isoformy se od sebe lisí obsahem siaiové kyseliny. unk je uvedeno v příkladech, je toto doloženo izolací li takových isoforem při preparativní 1EF a stanovením obsahu si.;i_ové kyseliny u pěti z nich. 2 isoforem zkoušených ns obsah sialcvé kyseliny bylo zjištěno, že pět isoforem obsahuje buď >,10, 11, 1? nebo 13 zbytků siaiové kyseliny.
Existuje vztah mezi relativní in vivo specifickou aktivitou er.y thr opci etinu o počtem zbytků sialové kyseliny na molekulu erythropoietinu cd. isoformy 5 io 11 (každá isoforma je zd označena počtem sialových kyselin na molekulu erythropoietinu). isoformy 11 až i 4 sejí přibližně stejnou in vivo specifickou aktivitu, Isofermy 5-14 byly studovány pokud jde o jejich in vivo e tivitu exhypoxickou polycyth.emickou biozkoužkou na cr/íích. a množství každá přítomné isofor.ry je stanoveno -ralfordovcu proteinovou zkouškou, absorbance při 9£0 nn nebo radioÍEunoztoučkou (ΠΙΑ) erythrepi etinu. ΠΙΑ stanovení (l.yrie a spol. Iirrtunohi o logy 172, 213 (196 ó)), vyjálřr-né jakc jodnctky/nl jsou rozděleny m«zi ?17,77v jednotko a; 1/iiig erythrepcietinového polypeptilu, primárné specifické ?.ktiv'ty ti íišr.éhc erythropciepon.ocí kikt udávají proteinové koncentrace f‘ ΟΧΆΓ yrbo 3 S ú? j V'/J án.PCMV-2 í 3fííCO tir.u stanovené iz'1-v :o;'o i' rn r kl rythrnpoietinuvíhc polypeptídu/al. °ak :cch, relativní in v:vo nativita se poc “ri-uy b do i safnroy 11 (viz taculkn o).
po uvedeno v přx.upne zvyšuje od xn vivo specifické aktivity, které jsou X. uváděny, jsou moření relativních in vivo specifických, aktivit a rejdd ná se o absolutní in vivo specifické aktivity. Aro účely této přihlášky jsou specifické aktivity použity pouze prc srov nání relativních, aktivit, Isoforet, studiem za stejných podmí nek ve stejných, pek cech, zahrnujících stejné vnitřní standardy, stejný typ zvířat, mající stejné analv ické údaje použité pro výpočet specifické k ti v ty, stejnou zkoušku pro stanovení obsahu proteinu. -:oní předpokládáno, že jakékoliv hodnota in vivo specifické aktivity uvedené pro jakoukoliv isoformu představujs základní nebo absolutní hodnotu pro tuto isofortu.
Předložený vynález poskytuje erythropoiotinovt isofoi‘my. tpecifické isofcr...y eryth.ropoi etinu. získané v souladu s předloženým vynálezem o jejich v_sstr.osti fe mohou měnit v závislosti na zdroji vvchozíh.c materiálu. Například isofermy z moče získaného lidského erythroooietinu jsou odlišné od isoforea rekomtinantního erythrcpoietinu. Ve výhodném provedení se vynález týká er.y thropoi e ti nové isofcrryy mající specificky .ocet (např. pevný počet vyčti než 0) číslových kyselin na mol „u erythrcpoietinu, uvedený pocel je zvolen ze skupiny zahrnující 1 a- 14, Výhodný je počet 3, 10, 11, 12, 13 nebo 14. v dalším provedení je počet vyšší než 14, výhodná 16 až 2J.
tento vynález také poskytuje přípravky, obsahující dvě nebo více erythropcietinovýeh iscforem. V jednom provedeni kompozice zahrnují směs isoforea, majících více než predeter Klínovaný počet sinlovýcH kvs^iir. na molekulu erythr-yaoietirru, např. vyšší 11 stolových kyselin nu molekulu erythropoietinu neb·'· vyšší než 1 ' sisiových kyselin na molekulu, sos
12, 13 a 14. V dalším provalení kompozice obsahují směsi isoforer., mající prodetcrninovaný počet slalovýci kyselin na ervthropoiesinovou molekulu, např méně než 12, ale víc- než δ sialových kyselin re. molekulu ja ko je např. směs isoferom 3, 13 a 11. Vynález také poskytuje přípravky obsahující erythroooiotinové isoforný, kde jsou relativní množství icoforem stejná nebo rozdílné. Například směsi i šoférem 3, 11 a 11 by mohly mít isoforný v r řznvch· co je 1:1:1, 2 :3 :' :OO než čtyř iroube směs 12 a
Výhodná přepravky obsahují směsi méně arem. 11, 12 a 13, torem, napři 14,nebo směs 7 9 •‘•ro přípravu směsí erythropoietových isoforeu vynález také poskytuje způsoby současná izolace vybraných erythropoietinových isoforem. Tyto postupy zahrnují izolaci indi1 3viduálních isofcrem takovými technikami j iko je isoelektrická fokusace nebo příprav-; směsí isoforem, majících přede terminovaný počet sialových kyselin n<
vyšší rmh 1 1 ) takovými, technikami j b::
rae.toyraf ie nebo chromatofokusace. ýsechny tyto techniky jsou založeny na coparuci proteinů podle neboje.
molekulu (například ie iontovýminná chronu
Ί kolonu pn 'i asi pH 4 ,v vážena na '.oncňntroci s
Obecně, i on to výměnná chromatografie a chroi?.:.tof o ku sace zahrnují aplikaci buď surového lidského erythropcfeti(buněčné kondici ovar.é medium) nebo čištěného materiálu na sloupec uryskyřics zs podmínek, kdy dochází k vázání některých nebo všech crythrcpoioíincvýc isofořem na pryskyřici. U surových erythrοροίetinových přípravků je výhod né aplik-vat protein na sloupec při eti oh 7 čilt-ný příoravky může být protoi pH 7 až asi p'! 4. řo promytí sloupce pudre se tv erothropoistineve i sof ?rty, ktpré zo sloupci i onexu eluují při svvlujíeím se ph li pufru nebo aplikací gradientu snižujícího se pn a zvyšující se iontové síly při pk asu 4. řři. chromatofckusaci jsou isoformy oluovány ze sloupce gradientem snižujícího se pd nebo promývánír. sxoupce vysokou koncentrací soli.
Jedno provedení vynálezu se týká savčích (např. z ovarya Čínského křečka, CHO) hostitelských buněk, které přednostně syntetizují erythrspoi.o tinové isoformy, mající více než specifický počet, např. více než 10 sislových kyselin na molekulu. hry threp ci o ti nov é m.clekulv mají h-vástns nebo 0vszané oligosach^ridová struktury, která mohou limitovat obsah sialově kysel’ny v rr-lckule. :’acfíklsd, tetraantennární (ótyř-rozvětvoné) N-vázané oligosachnridy nejobvykleji poskytují čtyři možná místa pro připojení šimlové kyseliny, zatímco bi- a triantennární oiiyosachsridcvé řetězce, ktoré mohou nahradit tetraantennárn. formu na asparaginových při-14pojovacích místech, mohou obvykle připojovat nejvýše dvě nebo tři sialové kyseliny. O-Vázané oligosacharidy obvykle poskytují Ivě místa pi o připojení sialové kyseliny, -rythropoietinová molekuly tak mohou akomodovat celkem 14 zbytků sialové kyseliny ε tím, že všechny tři h-vázané oligosacharidy jsou tetraantennární.Kultury savcích buněk jsou prohledávány na ty buňky, které mají přednostně připojeny tetraantennární řetězce k rekoabinantnímu erythropoietinu, a tedy maximalizovaný počet míst pro připojení sialové kyseliny.
z moče obsa3 a o4 z, o 263, 3667 (1988)). připojena ke kyselina ve i,3 rozvětvením
N-vézané oligosacharidy erythropoietinu hují sialovou kyselinu na obou spojeních 2, ke galaktoze (Takeuchi a spol., d.Biol.Chem. Typicky je sialové kyselina v 2,3 spojení galaktoze 1,6 rozvětvením manozy a sialová ek 2,6 spojení j« připojena ke galaktoze <X.
ca .nozy. enzymy, které připojují tyto sialové kyseliny (£>g-ílaktosid ':^ 2,3 sialyltransťeráza a β-gaiaktosid ¢^2,6 sial.vltransferáza) jsou nejúčinnéjái při připojování sialové kyseliny k manoze ďí 1 ,6 a marnoze «c. 1 ,3 větvení.
Jihydrofolát reduktázu (DhFR) postrádající buňky ovarya čínského křečka (ΰΠΟ) se obvykle používají jako hostitelské buňky pro produkci rekombinantních gl.ykoprotei nů včetně rekombnantního ery thropoietinu. *yto buňky neexorifQují enzym p -galaktosidaza 2,ó-sialyltransferázu a proto nepřidávají sialovcu kyselinu k 2,6 spojení N-vázaného oligosacharidu glykopreteinů. produkovaných v těchto buňkách, (iíutsaers a spol. kur.C.Biochem. 156, 631 Í19bb)j lakeuchi a spol. J.vhrocatogr. 4dd, ?d7 (1>ó7)). Následkem toho rekombinantní erythropoie tid produkovaný QHC buňkami, postrádá sialovou kyselinu na spojeních 2,6 ke galaktoze (Sasaki a spol., (1>87), supra; lakeuchi a spol., (1^2.7), supra). V dalším provedení vynálezu je erythropoietin použit pro produkci isoforem připravován v CHO buňkách, které jsou trsnsfektovány funkčním fi -raiaktosid 2,6-sialyltransferázovým genem pro získání inkorporece siaiové kyseliny do 4 2,6 vazby ke galuktoze. Viz Lee a spol. J.Biol.Chem. U9oý), práce· je zdn uvedena jako odkaz pro popis pro získání aodifikcv tných CLO buněk nebo jiných hostitelských buněk.
254, 13848 technik savčích č; vynálezu jsou :vně i ho erythropoietinu. Použitý poi cti nu pi o is tivuje t-nytkn ji v nrirokyseli nov 1 sezveme vele ke zv/hccí n d:u míz* c Analog,’'· jsou pes kyt ovány mís hrnujíeí -adice, dertce nebo zahrnuty některé analogy lidskévýraz analog lidského erythroopoietin s jedním nebo více náboi lils.<óho erythrupci etinu, ccž oc připojení siaiové kjzseiiny. ťč£, řízenou mutagenezí, 2asubstituce aminokyselinových zbytků, ccž ořem-zuje ní k-sylaci. -‘•a ková rniogy řetězců než lidský myt i
--u
V '?í v ό i .n· jsou dostupná pro glypočet karbony dra tový ch jxCx z-.ýaonou biologickou aktivitu ováním obsahu si. šlové kyseliny v mo. analogy mající obsah siaiové kyseztztno u lidsncho er-y thr opci et inu jsou jsou k.-nstiuovány zvyš lekule rrythxTpoietinu líny vydán než bylo m přepravovány přidávání pcbkcz ovát sekundární pr·.? bf ol mý ckou uktivi
p.lykosylcčních míst, která nebudou nebe terciární konfor lži ei ei potřebnou tu. Výhodně analog lidského erethrop·· ie má 1 , nebo -'esy i sci. nepřen za v v j t e m i g v c tnout až čt dalších zrn tir.u
lační cista přídavná místa pro K-glykosylaci nebo apř-íklad ieucin. v poloze 69 je nahrazen zni ku sekvence ^sn-Leu-Ser, která srouží japfo L-yiykosyisci. iaková změna může obvykle .yři dsiuí siaiové kyše i iny na molekulu. Pří;dn, ktexé generují další Π- nebo O-glykosyiny v polohách 1 2> a 127 na asparagin
-16a šeřin, alanin v poloze 1?5 na fchreonin a alaniny v po•olin a threonin. *ro odborníky bude zřejmé, že předložený vynález zahrnuje mnohé další analogy lidského erythropoietinu, mající další místa pro glykosyInci.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické přípravky obsahující terapeuticky účinné množství specifické Í S of o rovy t't nebo sr.ě-s iseforoc společně se ihodnýs ředidlem, přísadou a/nebo nosičem vhodným při terapii erythropoietine. Výraz terapeuticky účinné množství , který je zde použit, zahrnuje množství, které vyvolává terapeutické účinek při daných. oolnínkách a r Sinu pelú.ní. bodání erythropoieti novech isoforen se výho I-v provádí parenterálnim způsoben. Cp^-oifický způsob bude záviset na podmínkách, které jsou oš^tř-v ny. Dořértí orythropoietrnových iseforem je výhodny prove Donn y části přípravku, který obsahuje vhodný nosič jako jo lidský sérový albumin, vhodné ředidlo jako je pufrovaný sodinic’vý roztok a/ncbo vhodná přísada. Potřebná dávka bude tiková, že její množství dostačuje ke zvýšení hematokri t-° pa clem ta o bud^ záviset na obtížnosti podmínek, kt^ré mojí být mčítřovány, způsobu podaní a podobné.
clady slouží k ilustraci vynálezu, ale tinový smandard pouzich jo rekomxbinantní erythNásledující
| nikterak jej | neomezují. / |
| tý v in vivo | *7 5 o s * ’ u ’ i í cl· v |
| ropei etinov’·' | standard, kte |
| Či Stěn éru er, | ’ t hr ? o o i o t i nc v |
osou conz
- n vivo s υ c c i f * o k
j. standardu z moče. Takto uze relativní in vivo specifické aktivity, ktivity jsou vyjádřeny v jednotkách/ xl, .iednotkách/ry a je dnotkách/A a ne jako iU/áflL’ c- C b‘
ΊΓ/χ-εγ a ΙΓ/Αχς , oretogo použitý erythrcpoietinový 1 tandord není přímo koře'.-ván k meziná.. odnízmu existujícínu standardu
-17Příklady provedeni
Příklad 1
Izolace isoforem rekombinantního erythropoietinu ňekombinantní erythropoietin je produkován jak je popsáno inem, supra. Aekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí materiál pro izolace první a třetí isoformy je čištěn podle postupu popsaného v příkladu 2 práce Laie a spol., supra. Výchozí materiál pro izolaci druhé a páté isoformy je čišrěn podle Laie a spol., supra za použití modifikace Q-°epharosové chromatografie. xyto přípravky obsahují směs isoforem rekombinantního erythropoietinu majících stejné aminokyselinové sekvence jako lidský erythropoietin získaný z lidské moče a obsahují převážně isoformy > až 14. Výchozí materiál pro přípravu čtvrté isoformy je materiál, který je eluován během 5 kyselina octová/ mM glycin/óM močovinového promývání aniontovýmenné kolony v příkladu 2 práce Laie a spoll. 2-ato frakce obsahuje isoformy s méně než nebo obsahující 9 sialových kyselin a byla dále čištěna gelovou filtrační chromatografií jak je popsáno v příkladu 2 práce baie a spol. před použitím v preparativnín isoelektrickém fokusačním postupu. Příprava šesté isoformy používá jako výchozjfmateriál čištěný přípravek rekombinantního erythropoietinu mající od 4 do 13 sialových zbytků. Tento materiál byl čištěn j ’k je popsáno v příkladu
Laie a spol. s výjimkou pro modifikaci iontovýměnné kolony (eluce rekombinantního erythropoietinu gradientem chloridu sodného při pH 8,4 a vypuštění promývéní kyselinou octovou/močovinou), která vede k retenci nejvíce isoforem, přítomných ve výchozím materiálu.
Šest různých přípravků individuálních isoforem bylo zpracováno preparativní isoelektrickou fokusací na granulovaném gelu (Ultrodex, LKB) v podstatě jako LKB Application Notě 198. Pharmalyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolyty (Phar\ macia) jsou používány a gelové lože obsahuje 5 M močoviny.
V první přípravě se na gel aplikuje přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20 mM citrátu sodném/100 mM chloridu sodném, pH 7,0 a zpracovává fokusací při 8 wattech po přibližně 16 hodin. Po isoelektrické fokusaci se proužky isoforem v gelu vizualizují přitisknutím papíru ke gelovému loži. Vyrobí se otisk a pak se fixuje namočením ve třech provedeních (přibližně 10 minut, teplota místnosti) do fixačního roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% sulfosalicylová kyselina), podrobí další zrnině (asi 10 minut) - 40% methanol/10% kyselina octov? (30 až 60 °C), barví se 15 minut při 60 °C v 0,125% Coomasiie tílue B-250/40% methanol/10% kyselina octová a pak se odbarví v 7,5% methanolů/10% kyselině octové pro vizualizaci oddělených isoforem. ublast granulovaného gelového lože, obsahující isoformy ( /v 50 % pryskyřice) se odebere, přidá se voda (/y16 ml) a kaše se nalije na misku 5,5 x 24,5 ” a odpaří na asi 40 g čisté hmotnosti. Tento přípravek se zpracuje fokusací podruhé a otisk gelového lože se připraví jak bylo výše uvedeno. Část gelu, obsahující každou ze šesti rozlišitelných isoforem se odebere z gelového lože.
2a účelem eluce isoforem z gelu, se přidá ke každé isoformě roztok, obsahující 10 cul Tris-HCl, pH 7,0/ 5 mM Chaps pro přípravu kaše. Kaše se umístí do malých kolon a promyjí Tris-Chaps pufrem. Výtok kolonou byl odebrán a aplikován odděleně na malé kolony (otevřené uspořádáni kolony), obsahující Vydac C4 pryskyřici s reverzní fází ekvilibrovanou ve 20% ethylonu/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolony se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/10 mM Tric-Ηβΐ, pH 7,0, 35% ethanolem/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, a 65% ethanolem/10 mM TrisHCl, pH 7,0. Frakce euované 65% ethanolem/10 mM Tris se zředí 1:1 10 m£á Tris-HCl, pH 7,0 a zahustí a pak se pufr nahradí 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 za použití Centricon-10 (Amicon) mikrokoncentrátoru. Analytická isoelektrickó foku
-19sace tohoto přípravku se provede v podstatě jak je popsáno v LKB technická poznámka 250 za použití Servalyte 3-5 ampholinů (Serva) v polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 5 M močoviny.
Ve druhé přípravě se na gel aplikuje asi 2ó mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody a fokusuje se při 2,5 “attech po 35 minut a 10 Wattech asi 17 hodin. Proužky fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odeberou jako 11 různých skupin. &aždá skupina se převede do asi 7,5 ml deionizované vody a 20 ml každého z výsledných supernatantů z těchto skupin se podrobí analytické isoelektrické fokušaci jak je popsáno výše. Ke každé ze skupin se přidá 5 mil 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 a kase se umístí každá do malé kolony a ponechá se vytéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně třemi objemy 0,5 M Tris-HCl, pH 7 a promývací roztok se spojí s proteklou kapalinou. Eluované roztoky se zahustí a pufr se vymění za 20 m&l citrátu soineho/100 mM chloridu sodného, pH 7,0 za použití Amicon ultrafiltračního zařízení kajícího průnik 10000 daltonů mol.hmotnosti. Koncentrované roztoky (asi 0,5 ml) pak procházejí 0,22 mikrometrovým filtrem z acetátu celulózy. Vzhledem k analytické isoelektrické fokušaci bylo nalezeno pět skupin, obsahujících převážně jednotlivé isoformy 10, 11» 12, 13 a 14.
Ve třetí přípravě se na gel aplikuje asi 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21 ,8 ml destilované vody a fokusuje se při 2 Wattech po 25 minut, při 10 “attech po 20 hodin a 15 Wattech 15 minut. -Proužky proteinu, odpovídající individuálním isoformám jsou pozorovány vizuálně a odebrány z gelového lože. K isoformám izolovaným z gelu se přidá destilovaná voda, připraví se kaše a vzniklé supernatanty se analyzují analytickou isoelektrickou fokušaci. Ke každé kaši se přidá stejný objem 1 M Tris-HCl, pH 7,2., sus-2
0senze se umístí do oddělených malých kolon a kapalná fáze se nechá vytéci z kolony pro eluci isoforem. ^aždý výtok se zahustí a pufr se vymění za 20 mM sodný citrét/100 mM chlorid sodný, pH 7,0 za použití Amicon zařízení pro ultrafiltraci s dělením 10000 dalton mol. hmotnosti. Analytický isoleketrofokusační gel informuje o tom, že byly získány skupiny, obsahující zejména jednotlivé isoformy 9, 10,
11, 12, 13 a 14.
Čtvrtá příprava isoformy používá jako výchozí materiál erythropoietin, obsahující isoformy 3-9 (připravené výše). Před preparativní isoelektrickou fokusací provedenou v podstatě jak bylo popsáno výše pro přípravu 1 až 3, byly ampholyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionovány v Rotofor (BioRad, Richmond, CA) buňce pro isoelektrickou fokusací s kapalnou fází, pro získání ampholytú shodnějších pro nižší isoelektrické body výchozího materiálu. Pr;frakcionace se provádí smísením 6,7 ml Pharmalytu 2,5-5 s 15 g močoviny a přidáním vody na objem 50 ml. Směs se frakcionuje v Rotofo ru při 10 wattech, 1°C po 5 1/2 hodiny za použití 0,1M kyseliny fosforečné a 0,1 M hydroxidu sodného jako anolytu a katolytu. Amfolytové frakce, mající zjištěné pH mezi 4,5 a asi 6 byly použity pro isoelektrickou fokusací plochého lože.
Amfolyty byly získány z isoforem za použití Centrielute ru (Amicon, Danvers, MA) a 10000 MW Centriconu (Amicon) za použití následujících parametrů: 0,18 Iris půfr 8,8, 100 Volt, 25-30 mA, po 3 hodiny. Isoformy byly pak pufrem převedeny do 0,1 M chloridu sodného gelovou filtrací za použití Sephadexu G-25 (Pharmacia). Analytická isoelektrické fokusace pěti výsledných ppolů prokázala, že obsahují isoformy
4,5,6,7 a 8. Isoforma 4 vykazuje několik proužků což indikuje, že prošla určitou degradací.
-21Příprava páté isoformy byla modifikována přídavkem prefokusačního stupně k postupu iaoelektrické fokusace na plochém loži. V této modifikaci nebyl přidán protein ke směsi amfolyt/močovina/gel před elektroforézou, ale byl přidán do isoelektrického fokusačního zařízení s následujícím vývojem gradientu pH v gelovém loži. Po prefokusaci po 75 minut (1500 volt/h) byly sekce gelového lože ve vzdáleností 2,25 -4,25 cm od katody odebrány, smíseny s roztokem erythropoietinu a přidány zpět ke gelovému loži. Po isoelektrické fokusaci byly isoformy 10, 11, 12, 13 a 14 eluovány z gelového lože a odděleny od amfolytů ultrafiltrací za použití zařízení Gentrécon-10 (Amicon).
ťrefokusaČní modifikace byly uskutečněny pro to, aby charakteristiky ultrafialové absorbance přípravků, obsahujícím isoformy byly podobnější těmto charakteristikám výchozího rekombinantního erythropoietinu. ^lepšení ve spektrálních charakteristikách může být zřejmé z poměru absorbance pri 280 a 260 nm u izolovaných isoforem. Průměrný poměr absorbance při 980 nm k absorbanci při 260 nm (A280/A260) pro isoformy z přípravků 2 a 3 (ne-prefokusované) je 1,36 + w,11, zatímco průměrný poměr A280/A260 pro přípravky 5 a 6 (pre-fokusované) je 1,68+ 0,20. Jestliže je isoforma Č. 14 vyloučena z propočtů, průměrný A280/A260 poměry jsou 1,39 + ^,11 a 1,74 i 0,09 pro přípravky 2 a 3 a 5 a 6. (Isoforma 14 může mít nejatypičtější spektrum, protože je přítomna v nejmenších množstvích a je tak nx^více náchylná k interferencím stopovou kontaminací amfolytovými komponentami nebo protože je nejbližší elektrodě během provádění isoelektrické fokusace na plochém loži.). Průměrný A280/A260 poměr pro rekombinantní erythropoietin připravený podle příkladu 2 Laie a spol.(modifikovaný jak bylo popsáno použitím Q-Sepharosy jako aniontovýmšnné pryskyřice) je 1,91 i 0,04.
^ak je popsáno výše, výchozí materiál pro přípravu isoformy č.6 byl rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující isoformy 4-13. Amfolyty byly pre-fokusovány v zařízení Rotofor jako ve čtvrté přípravě. Pro isoelektrickou fokusaci na plochém loži byly použity amfolytové frakce, mající pil mezi 3,7 a 4,8. Ploché lože bylo prefokusováno postupem jako v přípravě č. 5 a isoformy 9, 1ΰ, 11, 12 a 13 byly získány po ultrafiltrací (Centricon-10) pro odstranění amfolytú.
Příklad 2
Obsah sialové kyseliny v isoformách rekombinantního erythropoietinu ‘•soformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 a erythropoietin čištěný postupy popsanými Laiem a spol., supra ( (směs isoforem 9 až 14) jsou pufrem převedeny do 0,10 - 0,15 A6 chloridu sodného a analyzovány na obsah sialové kyseliny modifikací postupu podle Jourdiana a spol., J.Biol.Chem. 246, 430 (1971).Zbytky sialové kyseliny jsou odštěpeny od glykoprot-inů hydrolýzou 0,35 M kyselinou sírovou při 80 °C po 30 minut a roztoky jsou neutralizovány hydroxidem sodným před analýzou. Za účelem vyhodnocení množství přítomného erythropoietinového proteinu se provede stanovení proteinu podle Bradforda (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) za použití rekombinantního erythropoietinu, majícího aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu jako standard za použití zkušebních reagencií a mikrozůsobu podle Bio-Rad. Výsledky, vyjádřené jako moly sialové kyse-iny na mol erythropoietinu, jsou uvedeny v tabulce 1. soformy jsou označeny podle počtu sialových kyselin na molekulu a rozsahu od málo kyselých (isoforma 9) do nejkyselejších (isoforma 13). ^soformy 9-13 jsou uvedeny v gelových drahách 6-1ϋ obr. 1. Množství isoformy 14 jsou nedostatečná k přesnému měření obsahu sialo-23vé kysexiny. Obsah siaiové kyseliny v této isoformě je odhadnut z její migrace na IEF gelech vzhledem k dalším isoformám. Obsah siaiové kyseliny isoforem 5-8 (přípravek č.4) nebyl měřen, ale je pravděpodobně pdhadnut z jejich migrací na IEF gelech.
Tabulka 1 lsoforma molyjsialové kyseliny/
| e ry thr op o i e t inu | mol erythropoietinu |
| isoforma 13 | 12,9 + 0,5 |
| isoforma 12 | 11,8 + 0,2 |
| isoforma 11 | 11,0 + 0,2 |
| iscforma 10 | 9,8 + 0,3 |
| isoforma 9 | 8,9 + 0,6 |
| směs isoforem 0-14) | 11,3 + 0,2 |
Příklad 3
Aktivita isoforem rekombinantního erythropoietinu isoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 byly h'dnoceny podle absorbance při 280 nm, Sradfordovou proteinovou zkouškou a pomocí RIA pro erythropoietin pro stanovení množství přítomného rekombinantního erythropoietinu. Exhypoxická polycythemická biostádie na myších (Cotes a spol., Nátuře 191, 1065 (1961) se použije pro stanoveni in vivo biologické aktivita. Kvantifikace množství erythropoietinovcho proteinu přítomného podle radioimunozkoušky pro erythropoietin poskytuje výsledky myjící vyšší relativní in vivo specifickou aktivitu pro některé isoform_y, protože zjevně snížená imunoreaktivita isoforem, obsahujících velké množství siaiové kyseliny vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu a tak k nadhodnocení in vivo specifické aktivity pro nejvíce negativní isoformy. Stanovení z biostudie na myších, vyjádřené jako jednotky/ml, jsou
-24jsou děleny koncentracemi odpovídajících proteinů pro získání ín vivo specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu. Ayto specifické aktivity jsou uvedeny v tabulce 2.
V atbulce 2, je n počet nezávislých přípravků isoforem, který spolupůsobí hodnotu specifické aktivity. v nejvíce případech byly provedeny in vivo studie pro každý přípravek isoformy. Některé in vivo údaje pomáhají při výpočtech specifické aktivity ve všech třech sloupcích, wednotkyzmg erythropoietinového polypeptidu byly stanoveny z absorbance pri 280 nm, z hndnot radioimunozkoušky nebo z výsledků 3radfordovy proteinové zkoušky, čištěný rekombinantní erythrcpoietin, obsahující isoformy 9-14 byl použit jako standard v ^radfordově proteinové zkoušce, n může být menší pro výpočty provedené za použití ^radfordovy proteinové zkoušky, protože některé přípravky nebyly v době provádění Bradfordovy zkoušky dostupné.
Erythrcpoietin čištěný podle postupů popsaných Laiem a spol., supra a obsahující směs isoforem 9 až 14 hyl použit jako standard ve zkouškách RlA a in vivo.
,uelativní specifické aktivity vyjádřené jako jednotky / mg erythropoietinového polypeptidu mohou být převedena na jednotky/A2gQ násobením 0,607 mg erythropoietinového polypeptidu/A2g0. rřepočítévací faktor je získán násobením extinkčního koeficientu erythropoietinu (1,345 mg/Άρθθ) obsahem proteinu v erythrcpoietinovám glykoproteinu (asi 60 λ hmotnostních, Davis a spol., Biochemistry 26, 2633 (1987)) pro vyjádření mg erythropoietinového polypeptidu/AggQ (tj.
1,345 mg erythropoietinu/ApgQ x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptídu/A2gQ). Dále specific-25ké aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu mohou být násobeny faktorem 0,60 mg pol.ypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu pro získání specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového glykoproteinu.
Xsoforma U/mg polypeotiilu n U/t-tí polvýke^átidu n U/nng polypeptidu (Bradf o rdovu pro- (z A2B0) (3 RIA) ___toinová zkoušku)_ _
| Al | LA | LÍO | xj- | co | AI | 1—) | r-t | r-t |
| O | O | O | O | o | O | |||
| p: | 1 | ’s | Ό | 0 | '-J | O | ||
| CÁ | c j | Ό | t> | ώ | 0 | 0 | O | |
| •k | ·* | ·* | •k | •k | LA | LO | ||
| ‘:O | '> | >4 | J | r—t | co | «k | ** | «k |
| XT | LO | CA | co | c\ | LA | rH | ||
| + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | +1 | r| | + 1 | |
| 0 | o | 0 | 0 | O | o | 0 | O | 0 |
| 0 | 0 | 0 | 0 | O | 0 | 0 | O | 0 |
| r- | Al | v-t· | CÁ | lc | '* A | CO | LA | |
| «k | •k | «k | •k | «k | «k | flk | •k | |
| c*- | r- | rH | H | co | rH | Oj | IfO | |
| vo | 'O | C-C | ř*- | rH | O | rH | ||
| co | CO | ej | CM | i—1 | 1—i | |||
| 04 | UO | LÍO | CO | 04 | rH | rH | rH |
| O | 0 | O | 0 | |||||
| 0 | ě~\ | 0 | O | 0 | o | O | 0 | O |
| *— | \r\ | CO | íA | rH | 0 | 'j | ||
| «k | «k | Λ | •k | «k | •k | •k | ||
| r- | CA | r-i | A- | 0 | •^ř | •k | «k | |
| <A | •co | LO | “-Λ | 'vt | Ό | rH | ||
| + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | + 1 | + 1 |
| 0 | 0 | o | O | 0 | 0 | Ό | 0 | 0 |
| 0 | -A | A | 1. i | 0 | --Ά | •-A | ||
| co | r£, | co | LO | co | CÁ | CA |
CO 'Ό > lj <0
O LA -A irs f— CA f— LA r-t 'vt Aj Ai Ai Γ=1 | AI ·φ ·=4- CA (—I , f-H Η Η
| O | 0 o | O O | 3 | 0 | O | o | |
| 0 | ι·Ο | LC | r-t | ^0 | A | ||
| r—t | «k | •k | «k | 0 | có | ώ | r- |
| Λ | 0 | LA | rH | co | *k | «k | |
| n | í*\ | A | Ή | 0k | co | LA | 1—1 |
| 41 | + 1 | + 1 | + 1 | 1—í » } | 1 Ή | + 1 | + 1 |
| O | A | ·'. | Ό | Ό | A | ||
| O | ó | Ó | ó | ó | O | ó | b |
| Al | r- | ,·-*» | 04 | Ai | LO | ||
| k | •k | ^k | ^k | * | «k | ·» | |
| CA | r- | LA | ;\i | Cj | . _A | vO | 0 |
| CO | 0 | c- | co | r-r-\ | LO | Xt | rH |
| . 4 | CA | Al | Al | ÍH |
-Φ CA Al H O r4 ι—I I—1 r-t r-i lA
-27Údaje z tabulky 2 jsou také znázorněny na obr. ?A, a ?C. Tyto údaje ukazují, že relativní in vivo aktivita erythropoietinu se zvyšuje jako funkce obsahu sialové kyseliny až do isoforay č. li. 1 sof oraiy č. 11-14 mají v podstatě stejnou relativní in vivo bioaktivitu.(Toto je nejzjevnější, jestliže je koncentrace isoforný 14 vyjádřena použití hodnoty z Bradfordovy zk.usky. ^radfordova hodnoty může být pro isoformu 14 přesnější, protože jsou obecně získány nižší hodnoty a to vede k obtížím při stanovení pomocí A9qq a nejzřejmnějšímu snížení reaktivity v RIA pro velmi negativní formy, jak bylo uvedeno dříve). Vyšší in vivo specifická aktivita erythropoietinových isoforem, majících více sialových kyselin je nejpravděpodobněji způsobena delším průběhem poločasu životnosti těchto forem, dsoformy 9 a 13 jsou značeny radioaktivním jodem ( I) a byla stanovena rychlost jejich štěpení u krys. -Poločas životnosti v oběhu byl výrazně delší pro isoformu 13 než pro isoformu 9.
Příklad 4 bělení směsí isoforem rekombinantního erythropoietinu chromatográfii na Q-Sepharose
Buněčná kondici ováná media z produkce rekombinantního erythropoietinu podle postupů popsaných Línem, supra, se koncentrují a disfiitrují proti 10 nL Tris, pH 7,2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovou mikroproteinovou zkouškou za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. 19,6 ml roztoku, obsahujícího 40 mg celkového proteinu se přepraví ve 20 ^uM CuSO^*, filtruje přes 0,45 mikro metrový filtr a vloží na 4ml kolonu (1,05 cm výška x 2,2 cm průměr) plněnou náplní Q Sepharose £ast Flow (Pharmacia) která byla ekvilibrována 10 mM Tris, plí 6,8 až 7,0 při 4 °C
-28Po aplikaci vzorku se kolona promyje dvě objemy kolony pufru. •Průtok kolonou je asi 1 ml/min. -ťro dělení směsí isoforem erythropoietinu se použije šest oddělených kolon.
Kolony se promyjí 6 až 9 objemy pufru o nízkém pH: kolona č. 1, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 yUM CuSO^,
M močovina, upraveno na pH 4,7 ^'aOH, kolona č. 2, 200 mM octové kyselina, 1 mM glycin, 20 yuM Gu304, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 3, 250 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 ^uM GuSO^, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 4, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 OuSO^, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 pomocí NaOH, kolona č. 5, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, yuM OuSO^, 6 M močovina, kolona č. 6, 300 mM kyselina octové, 1 mM glycin, 20 ^uM GuSO^, o M močovina.pil kolon se zvyšuje na asi pH 7 promýváním každé kolony 8 až 11 objemy kolony 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 ,uM CuSO4, pH 7« •definované erythropoietinové isoformové směsi jsou z kolon eíuovány promýváním 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 CuS04, pH 7,0.
Eluované isoformové pooly z každé kolony se zahustí a rozpouštědlo se vymění vodou za použití Amico Gentricon10 mikrokoncentrátoru. Výsledky analytické isoelektrické fokusace těchto koncentrovaných poolů jsou uvedeny na obr.3. dělové dráhy 1-6 představují definované směsi erythropoietinových isoforem eluovaných z kolon 1-6. Isoformové směs” uvedené v posladní pravé dráze gelu na obr. 3 představuje buněčné medium, které je aplikováno na kolonu Q-Sepharosy jak je p psáno výše, kolona se promyje 5 mM kyseliny octové, mM glycinu, 20 ^uM CuSO4> óM močoviny a směs isoforem erythropoietinu se eluuje z kolony za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs isoforem se dále čistí podle postupů popsaných v práci Laie a spol., supra, před analytickou isoelektrickou fokusací.
-’9Příklad 5
Frakcí onace isoforen rokombinantního erythropoietinu za použiti nízkého pil gradientu na Q-Cepharose
V dalším postupu jsou isoformy erythropoietinu separovány za použití gradientu snižování pil a zvyšování iontové síly. Koncentrovaná diafiltrované, erythropoietin obsahující medium se vnese na kolonu Q-Hepharosy v poměru asi 40 mg celkového proteinu/ml gelu. Kolona se pak promyje asi dvěma objemy kolony 10 mK Tris UG1, pH 7,0 a pak asi 10 objemy kolony ? itíí kyseliny octové/1 mM glycinu/20 CuSO^/6 M močoviny (pí! přibližně 4,8) pro odstranění kontaminujících proteinů a erythropoietinových isoforen, obsahujících méně než asi 7 zbytků sialové kyseliny. isoformy, obsahující od přibližně 8 do přibližně 17 sialových kyselin jsou z kolony eluovény za použití gradientu od počátečního 2, msi kyseliny octové v ó ií močoviny/1 mM glycinu/
Í0 ^uM CuSO^ a do až 40 mM kyseliny octové/β M močoviny/ mli gl,ycinu/20 ^uM CuSO^ (pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů kolony a frakce přibližně jednoho objemu kolony se odebírají do nádob, obsahujících objem Tris pufru dostačující k uvedení pH do rozmezí 6 8,5 proto, aby se zabránilo dlouhodobému vystavení odebraných frakcí nízkému pH. Rodily frakcí se podrobí analytické isoelektrické fokusaci pro sledování separace. Obr.4 ukazuje separaci isoforem 8-11, které může být dosaženo tímto postupem, isoformy 1? - 14, které zůstávají vázány na koloně při konci gradientu, jscu eluovány promýváním pufrem, obsahujícím 1G mři Tris-HCl, 140 mil NaCl, 70 yuM CuSO^ (pH 7,C). Isoformy (separované působením gradientu nebo eluované roztokem chloridu sodného) jsou prosté kontaminujících proteinů při chromatografii na reverzní fází, následované filtrační gelovou chromatografii jak je popsáno v příkladu 2 v práci Laie a spol..
-30Příklad 6
Analogy lidského erythropoietinu, mající další glykosylační místa
A. Konstrukce analogů lidského erythropoietinu ^místění existujících a navržených míst pro připojení karbohydrétu v erythropoietinové aminokyselinové sekvenci jsou uvedena na obr. 5 a postup přípravy těchto dalších glykosylačních míst je shrnut na obrázcích 6A-C a je popsán dále.
Za použití in vitro mutagenese byly syntetizovány následující oligonukleotidové primery:
/Asn4, Seró/EP0: 5*CGGCCAGGAAAGCTGAGGTGTGAGAGGGGA 3 /Asn9, Ser11/ PPG: 5*ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' /Asn69/EP0: 5'GGGGCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3* /Asn124/EP0: 5'TGGCGTGGAGATAATGGGTCAGGTGG 3* /Asn125, Ser127/EPO: 5ČAGATGGGAACTGATGTGGTGGAG 3* /Asn153, Ser1o5/EPC: 5'AGGGCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTTG 3* /Thr125/SPO: 5ÍCGAGATGGGACCTGAGCTGGTC 3* /Pro124, Thr125/ZPO: 5'CCTCCAGAICCGAGCTCAGCTGC 3*
Podtržené kodony představuji nevhodné spojené oblasti, kde aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují divoký typ aminokyselin.
/Asn4, 5er5/EPO byl konstruován přidáním N-glykosyladního místa u Asn 4. /Asn9, Ser11/EPC byl konstruován přidáním ^'-glykosylačního místa k Asn 9. /Asn59/EPO byl kon• 1 25 struovén přidáním K-glykosylaSního místa k Asn 69. /Asn , 1 27
Ser /EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa k Asn 125. /Thr125/EP0 a /Pro124, Thr125/EPO byly konstruovány přidáním C-glykosylačního místa u Thr 125.
Následující oligonuklectidcvó priméry jsou syntetizovány za použití in vitro mutagenese:
.71 /Asn69, Thr71/EPO: 5'GGGGGTGGGGAAGGTGAGAGAAGGTGTG 3* /c 68 » 69 r-. 71 /Ser , Asn , Thr /£
5'CAGGGCCTGTCCÁACCTGAGAGAAGCTGTC 3 * /Asn125, Thr1?7/EPO: 5*GAGATGCGAACTCAACGGGTGCAG 3* /Asn125, Thr127, ?hr13l/EPO:
*ATGGGAACTGAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3 * /Pro124, Asn125, Ser127/EPO:
5ČQAGATGCAAATTCATGTGCTCCAGTC 3 * /rro1<'4, Asn125, Thr127/EPO:
5'ggagatggaaattgaagaggtggagtg 3 * /Thr125, Thr126/PPO: 5*CGAGATGGGAGAACAGGTGCTGCA 3*
.. 1 ?4 1 ?5 tl 196 131/L..an /Pro , Thr , ihr , Thr /EPO:
^ligonukleotidový primer 5*ACATGCGACCACCGCTGCTCGAC 3* je použit pro přípravu /Pro124, Thr125, Thr126/EPO za použití /.Pro124, Thr125/EPO cDNA jako výchozí látky. Oligonukleotidový primer 5*TGGTGGACTGAGAACAATCACTG 3* je pak použit pro přípravu /Pro124, Thr125, Thr126, Thr131/EPO.
/Asn69, Thr71/EPO a /Ser6^, Asn69, Thr71/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačníbo místa k Asn 69 a zvýšenín N-glykosyl jce na tomto místě. /Asn1''5, Thr127/EP0, /Asn1'5,
Thr127, Thr131/EPC, /Pro124, Asn125, Ser127/EP0 a /Pro124,
125 197
Asn * , Thr ‘ /EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylač-32 ního místa na ňsn 125 a zvýšením glykosylac tě. /Thr125, Thr126/E?0 a /Pro124, Thr125, jsou konstruovány přidáním O-glykosylsčního 125 a zvýšením glykcsylace na tomto místě.
e na tomto mísThr120, 8er13l/EP0 místa ke Thr
Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenesi byl plasmid íxu13, klonxix cDNA lidského erythropoietinu v pUC 8 (Law a spol. Proč kati.Acad.8ci.83, 6920 (1986)). Plasmidová DNA odvozená od dul 3 byl© štěpena BstEII a BglII restrikčními enzymy, výsledné fragmenty DNA byly podrobeny elektrofořeze na agarosovém gelu a z gelu byl izolován
TM
810 bp fragment er'thropoietinové DNA za použití GeneClean kitu a postupy doporučenými výrobcem (BIO 101, Inc.). Plasmid pBRgHuEPO obsahuje erythropoietinový genomový gen jako ^amHI fragment inzertovaný do derivátu pBP322, jek je popsáno ve zveřejněném patentu Lina, supra. pBRgHuEPO byl také štěpen pomocí BstEII a BglII a byl získán vektorový fragment 6517 bp. Ligace těchto dvou fragmentů vede k IGT1. Pro konstrukci pLC-1 , byl pDSVL (popsaný ve zveřejněném patentu Lina., supra) štěpen BamHI a k němu byl lisován izolovaný BamHI fragment velikosti 2,8 kilobazí (kb) z IGT1 , obsahující erythropoietinocou cDNA.
Z© účelem přípravy jednořetězccvé DNA pro mutagenesi in vitro, byl pLG-1 štěpen BamHI a BglII a byl izolován fragment 880 bp erythropoietinové cDNA. Byl ligován k BamHI místu m13mp18 zs vzniku m13-SC-1. uednořetězcová DNA byla získána ze supernatantů E.coli kmen P.Z1G32, infikovaného m13-HC-1 jak popsal ^unkel a spol. Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Aessing, Methods in Enzymol. 161, 20 (1983). Pro nutagensi in vitro bylo smíseno přibližně 1 ^ug jednořetězcové DNA o 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše se ó ml pufru (?50 nm Iris pH 7,8, 50 mM
-33ígCl2 a 50 ml dithiothreitoiu). Pro připojení primeru k templétu byl objem reakční směsi upraven na 10 yul vodou, sm?s bylo zahřívána na 55 °3 po dobu 5 minut a pak nechána zchladnout na teplotu místnosti. fro prodlužovací reakci bylo přidáno 2,5 ml dTTř, dATP, dOTP a AT? (všechny s 10 yuM), dálo 1 ^ul (1 jednotka) E.coli DNA polymerázy (Xlenowůvf řrag ment) a 1 ^ul (1 je natká) T4 DNA ligázy. 3m?s pak byla inkubována přes noc při 14 a použita pro transformování N. coli JLI 109 (Yanisch-Perron a spol., Gene 33, 103 (19C5)) jak je popsáno (llessing, supra).
?ro identifikaci mutsntríck klonů rozlišovací hybridia icíjbyly plaky na nutričním ogaru přeneseny na Gene Bcrsan filtry (New řnglund Nuclcor). filtry byly sušeny pod tepelnou lampou a pak inkubovány pc dobu jedné hodiny v 6x CSC, i SDS při 60 °d. ?ro hybridi žnci byly oligoorimery uvedené výše (8 pnol) koncově označeny 3 9
T4 polynuklecti. lovou kor.áz.-cu a r-o znače ným ATP a inkubovány ε filtry přes noc v 6x ESC, 9,5% SDS a 100 mg/ml DNA lososího sperma při- 37 °C pro /Asn124/autaci, 55 °C pro •4 3er°/ mutaci, 65 °G pro /Thr1,:5/ a /Pro1“'4, Thr1 . ,, 9 c- 11 / 163 165 o osnou,'i cm / Asn mutace a 70 C pro /Asn7, Ger / e /Asn , Ser / mutace. ?řiští den byly filtry třikrát promyty 6x SSC při teplotě místnosti a podrobeny autoradicgrafii. Je-li to nutné byly pak filtry promyty 6X SEC při zvýšených teplotácr , dokud nebyla detegována malá nebo žádná hybridizace u pla ku | mci Jících erythropoieilrcvou cřfA sekvenci dikokého typu. R-l ony, které zn téchto
UUUi.
:ínek dávají pozitivní hybridizoční signály byly identifikovány a retransfektovány do J.Y109 k izolování čist ho klonu. Dideoxy řetězcová terminační sekvenční analýza dokládá, že jsou přítomny mutace u asparaginovýho, serinovóho, threoni nov -ho a přeli nového zbytku.
Dvojřetčzcovó n1 3 DJ-1 DNA nesoucí /Asn4, Ser6/, /Asn9, Ser11/, /Asn69/, /Asn124/, /Asn125/, /Ser127/,/Asn163
-34^er1^/ /Thr125/ a /Pro124, Thr125/ změny byly získány z JMI05 transfektovaných buněk varnou metodou (Holmes a spol. Anal. Biochem 117, 193 (1981)). DNA byly Štěpeny pomocí ostEII a Xholl a byl izolovány 810 bp fragmenty erythropoie tinové DMA. pEC-1 byly štěpeny BstSII s následujícím parciálním štěpením Bg1II a 5*kcnce výsledných fragmentů se de f orf oly latu jí bakteriální alkalickou fosfatézou v 1 0 mil Iris, pH 8 při 60 °C po 60 minut. Byl izolován 7 kb vektorový fragment postrádající 610 bp ^stEII-BglII a ligovén k erythropoietinovým fragmentům uvedeným výše. Výsledné plzsmidy (označené pEG-X, kde X znamená parciální mutaci) obsahují lidský erythropoietin se změněnými aminokyselinovými zbytky v označených pozicích.
cDNA klony sekvence lidského erythropoietinu a analogů odpovídajících /Asn4, Ser V, /Asn^, Ser11/, /Asn^/,
27/ z, 163 ner /, /Asn ,
25
Thr / erythropoietrnových cDNA klonů byly transSer165/, /Thr125/ a /Asn1’4/, /Asn125, .1 24 / rro fektovány do COS-1 buněk (ATC3 č. GD1-1650) elektrokorporací. COS-1 buňky byly z polotekut'ch disků odebrány, promyty mediem (modifikované .Dúlbecco základní medium, obsahující / fetálního telecího sera t 1 / L-glutasinu/penicilinu/ streptomycinu (Irvine Scientific) a resuspendují na 4 x 10 buněk/ml.Jeden mililitr buněk se přenese do elektroporační
ΠΊ lf kyvety (Bio-Bad) a elektroporuje Bio-Bad Gene Pulserenr při ?5 /uEaradech a 1600 voltech za přítomnosti 100 až 200 ^ug nosiče DNA a 2 až 20 ^ug plasmidové DNA kódující erythropoietinový analog. í-lektroporované buňky se umístí v kon6 centraci 2x10 buněk na 60 mm misku pro tkáňovou kulturu v 5 ml media. Po dvou až čtyřech hodinách po umístění se me dium nahradí 5 ml čerstvého media. Kondiciované medium se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporaci.
-35A. Zkouška aktivity erythropoietinového analogu
PIA byly provedeny podle Egrie a spol., supra. In vivo biologická aktivita erythropoietinových analogů byla stanovena exhypoxickou polycythemickou biostudií na myších (lotos a spol., supra).
in vitro erythropoietlnová aktivita byla stanovena zkouškou tvorby erythroidních kolonií jak je popsáno l3covem a spol., J.Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) s modifikacemi. Jednojaderné buňky z huněk lidské kostní dřené byly částečně čištěny na ficol-papue vložce a promyty Iscovým mediem pře< umístěním na plotnu pro odstranění adherentních buněk. K-ulti· vační medium obsahuje 0,9 / methylcelulozy a neobsahuje jakýkoliv hovězí sérový albumin. Srythrodní kolonie byly spočteny po 8 až 10 dnech kultivace.
^rythropoiPtinové analogy transfektované a exprimované v COS buňkách jak je popsáno v sekci A, byly analyzovány v sur-v zeh supernatantech COS buněk pomocí RIA a zkouškou tvorby eryth.roidních kolonií. Lidská erythropoietinová sekvence ná in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou stanovenou ve výše uvedeném pokusu. Analogy /Asn VEPO, /Asn125, 3er127/EP0, /Thr125/EPO a /Pro124, Thr125/EPO vykazují In vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou a poskytuje důkaz o dalších karboh.ydrátových řetězcích (jak je stanoveno v sekci C). Tyto analogy jscu dále analyzovány transfekcí cDNA klonem kódujícím erythropoietinový analog do CLO buněk, Čištěním erythropoietinového analogu a měřením in vivo biologické aktivity čištěného analogu.
C. Analýza Western Blot ubjem suspernatantu, obsahující 5-20 jednotek z COS bu-36něk transfektova ných cDNA erythropoietinových analogů jak je popsáno v sekci A, byl imunoprecipitován přes noc při teplotě místnosti s králičí antierythropoietinovou polyklonální protilátkou. K imunoprecipitátu bylo přidáno 20 až 80 yul 1:1 proteinu A-^epharosy v salinickém roztoku pufrcvnnéfls fosfátem (PBS) a ponecháno inkubovat jednu hodinu při teplotě místnosti. Vzorky byly odstředěny, promyty PBS a kde je to indikováno, byl$r peleta zpracována s N-glykanázou pro odstranění N-vázaného karbohydrátového řetězce· V Vzorky byly analyzovány elektroforezou na t5% SDS-polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulozu a podrobeny Westernově analýze jak je popsáno (Burnette a spol., Anal. Biochem 112, 195-203 (1981); Elliot a spol. Gene 79, 167-180 (1>8>)) za použití směsi myších antierythropietinových monoklonálních protilátek. Jedna z te.kových protilátek, 5G8A, je popsána Elliotea a spol. (1989) Blood 74, Supp.1, A.
22S.
Analýza supernatuntů COf buněk trar.sfektovaných /Asn BPD a /Asn^ 5, ser 1'-7/EPQ cDNA dokládá zvýšení velikosti proteinu v<? srovnání se sekvencí lidského erythrcpoietinu. Zvýšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího N-vázaného karbohydrátového řetězce (obr.7). Zpracování supernatantů z DOS buněk transfektovaných /Thr1^/EPO a /Pro1 ‘fy Thr1^^/ SPO cDNA ε K-glykanézou dokládá zvětšenou velikost proteinu ve srovnání se sekvencí lidského erythropoietinu. Tato zvětšené velikost svědčí o přítomnosti dalšího O-vázeného karbohydrátového řetězce (obr.8).
D. Izolace isoforem erythropoietinových analogů ván nové
25 dr-ytbropoi et3 nový analog /Thr /BPC byl konstruoak je popsáno v sekci A. 610 bp fragment erythropoieti1 2b cDNA nesoucí /Thr /mutaci byl izolován štěpením plas-37aidu pl'1 obsahujícího /Thr^mutaci pomocí BstEII a BgUI a ligací fragmentu k pDDG£ ,derivátu pDS ?. pDSo(2 je obecně popsán v US patentové přihlášce č. 501 904, která je zde uvedena pro úplnost. pDECA byl připraven z pDS wý 2 následujícími kroky:
1) HindlII místo pDS d.2 bylo deletováno Štěpením pDSo^2 pomocí HindlII, zpracováním HindlII koho coli DNA poiycerázou (Klenot fragment) a
DNA ivních konců dNTP,a religací tupě zakončeného vektoru. Výsledný plasmid je pD5 £ 2
2) pDS íK2 A H byl štěpen pomocí Balí a syntetický oligonukle otid mající SV40 jeným ke 3*konci ticky eligonukleet spliee signál se Sáli linkerem připosplice signálu byl k němu ligován. Synteid měl následující sekvenci:
TOCAGGAACTGAAAAAGGAGAAAGTTAáGTGGTAAGTTTAGT G ITT 1I GIG TTITATTTG AGGTC CO GGATG GGGT GC-TGGTGO AA ATG A AAGAAGTGGTGGTGAGTGGATGTTGCGTTTACTTCTAGGCCTGTAGGG AAGTOTTACITCTGCTCTAAAAGCTCCTGCAACAAGCTGGTCGACC j
Výsledný plasmid byl pDS<2AH spoj.
3) pDS fikl &,H spoj byl štěpen Sáli a konce zpracovány na tupo zpracováním s kohezivníni konci s 14 DNA polynerázou a dNTP. 820 bp fragment BanHI-BglII lidské ertyhropoietinovs cDNA byl na koncích natupo zpracován stejným postupem q ligován k plasmidů. Výsledný plasmid byl pDBG.
4) pDEG byl Štěpán s Kpnl a PvuII a na na tupo zpracováním s kohezivníni konci ^lasmid byl religován k deletovánému ex fragmentu zá vzniku plasmidů pDEG .
kosích zpracován mung beán” nuklcázou cisovánému Kpnl-PvuII
-38·
Plasmid pDTC Δ , obsahující /'Thr '?/ erythropoietinovou cDNA byl transfektován do DHFR-defioientníoh CHO buněk. 770 ml kondiciováného media CHO buněk byl znkoncentrován za pou žití dělící membrány 10000 daltonů molekulové hmotnosti a diafiltrován proti 10 nul Tris-HCl, pH 8,6 aa celkový objem 34 ml. I7ml podíl koncentrátu byl nanesen na Q-Sepharosovou kolonu ε rychlým průtokem (5 ml objem náplně) ekvilibrovanou stojným pufrem a eluovár. lineárním gradientem 0-250 mM NaCl v 10 mí! Tris-HCl, plí 8,6. Podíly frakci z kolony, bu3 nezpracované nebo štěpené N-glykanázou, byly analyzovány SDS-PAGE nebo ICF a pocly (označená 2,3 a 4) byly připra-( vény na bázi ísoformy a/nebo karbohydrátového složení frakcí. Každý pool byl nanesen na Vydac C4 kolonu (214TPB 2030, cm průměr, 1,8-2,5 ml objem náplně, 0,34 ml/min) a promyt dvěma objemy kolony ?!.<·· ethanolu v 10 mi Tris-HCl, pH 7,3. kolony byly eluovány lineárními yrvdienty 20-941· ethanolu, mi Tris, pH 7,3. Pooly byly připraveny, r.aředěny do 10 mi Tris-HCl, pH 7,3 a naneseny na Q-Sepkarosová kolony s rychlým pr tokem. Následujícím promýváním 10 mm Tris-HCl, p.T 7,3. byly vzorky eluovány 20 ml citrátem sodným, 250 mM NaCl, pE 7,0. čištěné /Thr* ^/ pooly byly analyzovány IEF a jsou uvedeny na obr. j. EPO analog je analyzován na in vivo biologickou aktivitu jak je popsáno výše (Cotes a spol., supra).
Vynález je popsán svými výhodnými provedeními, která však ni vak vyná.l. z neomezují, naopak, jsou v něm z hrnuty různé modifikace a ekvivalenty v rámci připojených nároků, provedené v nejáirším rozsahu tak, že zahrnují všechny takové modifikace a ekvivalenty.
Claims (17)
- PATENTOVé NÁROKY1 . Isoforma
- 2. Isoforma erythropřetinu.\ erythropoietinu podle nároku 1, která je produktem exprese excgonní DNA sekvence v eukeryotní hostitelské buňce nehumár.ního původu.
- 3. Isoforma erytropoietinu podle nároku 1, která zahrnuje erythropoietin mající aminokyselinovou sekvenci 1-165 nebo 1-166 lidského erythropoietinu.
- 4. Isofcrme erythropcietinu podle nároku 1, mající specifický počet fislc-vých kyselin na molekulu erythropoietinu, tento počet j« volen ze skupiny 1-14.
- 5. Isoforma er.ythropoietinu podle nároku 1 mající více než 14 sialových kyse.in na molekulu erythropoietinu.
- 6. Isc^orns erythropcietinu podle nároku 1, mající 14 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 7. Ascforna erythropoietinu podle nároku 1, sející 13 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 8. Isoforma erythropoietinu podle nároku 1, mající 10 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.5 · 1 'w Π i* Ti ii 2? V t, T1 r' P«P 2 ·ηΑ ? — IX Ό A 1 2. Γ5 nou eukaryotní hostitelskou, buňkou je .nároku 2, GdO buňka kdo uvede10. Farmaceutick sáhuje terapeuticky prostředek, vyznačující se tím, že obúčinné množství isoformy erythropoietinu-40podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.
- 11. Prostředek, obsahující směs méně než 4 isoforem erythropoietinu.
- 12. Prostředek, obsahující směs isoforem erythropoietinu, mající méně než 12 sialových kyselin na molekulu ery thropoi eti nu.
- 13. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, Že obsahuje směs isoforem erythropoietinu mající 9, 10 a 11 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 14. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje směs isoforem erythropoietinu, mající více než 11 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje směs isoforem erythropoietinu mající 13-14 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 16. Erythropoietin, obsahující v podstatě erythropoietinové molekuly, mající specifický počet sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 17. Erythropoietin, obsahující v podstatě erythropoietinovs molekuly, mající specifický počet sialových kyselin na molekulu erythropoietinu, tento počet je vybrán ae sku— piny zahrnující 1-14.
- 18. Erythropoietin, zahrnující erythropoietinová molekuly mající více než 14 sialových kyselin na molekulu erythro poi etinu.4119. F.rythrcp ietin podle nároku 15, mající 14 si šlových kyselin na molekulu erythrcpoictinu.25. -rythropoíetin podle nároku 15, mající 13 siaiových kyselin na molekulu erythropoietinu.
- 21. Lrythropoistin podle nároku 16, mající 1 kyzelin na molekulu erythropoietinu.si a..ov.ven52. Lrythropoietin podle nároku 16, kle uvedenou molekulou jc. produkt exprese oxogenní DNA sekvence v eukaryotních hostitelských buňkách nehumán.íího povedu.'3. Erythrcpoietin podle nároku 15, který má aminokyselinovou sekvenci lidského er threpoietinu.4. Earmsccutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství erythrepoietinu podle nároku 15 s íarnaccuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo íi u o a. '3 *
ť~ X · rrostředsk, vyzn au„j- se tx^., že obsahuje směs molekul ery t hrcp o i e t inu, majících, méně než 4 ciaiové kyse- xiny na molekulu eryuhro psic· ti nu. 5-5 . Prostředek, vyzn Ji 10 X 4j £> v lim. ) ze obsahuje směs molekul ory thr c^cie tinu, UjiCi IleM'. Π£ ž 1 . .5 šimlových kyše lín na c .olekulu erythrop sd 1 Ví v íx Ji · 27.mol kul kyselini. los cj. zz.., vy ..v,...ri.j. e txα., ze ery uhrepoi etinu, majících! více než nu molekulu erythropcietinu.bsukuje směs 11 siúlových-4228. Prostředek podle nároku 27, vyznačující se tím, še obsahuje směs isoforem erythropoietinu, majících 13 až 14 sial.vých kyselin na molekulu erythropoietinu.29. Způsob přípravy isoformy erythropoietinu, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně zpracování čištěného erythrepoistínu preparativní isoelekt r i o kou fo ku s a cí a eluce jednotlivé 5sofořev z gelu.30. Způsob příprav;/ sm*si jící více než pr«2et^rminoven molekulu, vyznačující so tím, erythrepoietin, zpracuje 'ntovýměnneu chromátografií.molekul erythropoietinu, maý počet si šlových kyselin na čo se materiál, obsahující31. Způsob přípravy směsi molekul erythropoietinu, majících více než přede terminovaný počet sialových kyselin na molekulu, vyznačující se tím, že se materiál, obsahující erythrcpoietin, zpracuje chromatofokušení.35. Způsob zvýšení hladiny hematokrýtů u savců, vyznačující se tím, že zahrnuje polání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 26.33.pinyAnalog lidského erythropoietinu, vybraný ze skurnu.? ic i /Asn69/7P0, /Asn íer /Thr1?5/SPC a /Pro124, Thr125/?PO.12534. čištěná ··.’ izolovaná statě ΊΧ’ά sekvenci kódující sekvence, obsahující v pod o'g li dského erythropoietinu :ny z£ skup i ny ishrr.u/ř /Α3ηυ>/ΞΡ0, /Asn1 ‘3 , Ser^ '^/ΞΡΟ, /Thr12^/FPO a /*Jro124, Thr‘“5/SPO.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20001772A CZ291488B6 (cs) | 1989-10-13 | 2000-05-12 | Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi |
| CZ20011117A CZ291472B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Směs skládající se ze dvou nebo tří erythropoietinových isoforem |
| CZ20011115A CZ291471B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42144489A | 1989-10-13 | 1989-10-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ497290A3 true CZ497290A3 (cs) | 2000-08-16 |
| CZ291515B6 CZ291515B6 (cs) | 2003-03-12 |
Family
ID=23670537
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19904972A CZ291515B6 (cs) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | Izolovaná biologicky aktivní erytropoietinová izoforma, způsob její přípravy a farmaceutická kompozice na její bázi |
| CZ20001772A CZ291488B6 (cs) | 1989-10-13 | 2000-05-12 | Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi |
| CZ20011115A CZ291471B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem |
| CZ20011117A CZ291472B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Směs skládající se ze dvou nebo tří erythropoietinových isoforem |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001772A CZ291488B6 (cs) | 1989-10-13 | 2000-05-12 | Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi |
| CZ20011115A CZ291471B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Způsob přípravy směsi erythropoietinových isoforem |
| CZ20011117A CZ291472B6 (cs) | 1989-10-13 | 2001-03-27 | Směs skládající se ze dvou nebo tří erythropoietinových isoforem |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0668351B1 (cs) |
| JP (2) | JP2983629B2 (cs) |
| KR (2) | KR100263845B1 (cs) |
| CN (1) | CN1063796C (cs) |
| AT (2) | ATE146187T1 (cs) |
| AU (1) | AU646822B2 (cs) |
| CA (2) | CA2027635C (cs) |
| CZ (4) | CZ291515B6 (cs) |
| DE (2) | DE69029370C5 (cs) |
| DK (2) | DK0668351T3 (cs) |
| ES (2) | ES2139764T3 (cs) |
| FI (1) | FI105688B (cs) |
| GR (2) | GR3022658T3 (cs) |
| HK (1) | HK1006718A1 (cs) |
| IE (1) | IE903663A1 (cs) |
| IL (3) | IL95971A0 (cs) |
| LV (1) | LV12575B (cs) |
| NO (1) | NO301832B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ235676A (cs) |
| PT (1) | PT95586B (cs) |
| SK (1) | SK284429B6 (cs) |
| WO (1) | WO1991005867A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA908166B (cs) |
Families Citing this family (186)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7217689B1 (en) | 1989-10-13 | 2007-05-15 | Amgen Inc. | Glycosylation analogs of erythropoietin |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US6153407A (en) * | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| US5614184A (en) * | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| WO1994024160A2 (en) * | 1993-04-21 | 1994-10-27 | Brigham And Women's Hospital | Erythropoietin muteins with enhanced activity |
| IL110669A (en) * | 1993-08-17 | 2008-11-26 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
| US5830851A (en) * | 1993-11-19 | 1998-11-03 | Affymax Technologies N.V. | Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5773569A (en) * | 1993-11-19 | 1998-06-30 | Affymax Technologies N.V. | Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5989538A (en) * | 1995-02-15 | 1999-11-23 | Amgen Inc. | Mpl ligand analogs |
| US5696250A (en) * | 1995-02-15 | 1997-12-09 | Amgen Inc. | DNA encoding megakaryocyte growth and development factor analogs |
| EP1731174A3 (en) * | 1996-08-02 | 2007-01-17 | Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. | Polypeptides having a covalently bound N-terminal polyethylene glycol via hydrazone or oxime bond |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| IL124015A0 (en) | 1998-04-08 | 1999-01-26 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutical compositions comprising a protein |
| US6696411B1 (en) | 1998-04-22 | 2004-02-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| AU753106B2 (en) | 1998-04-22 | 2002-10-10 | Cornell Research Foundation Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| DK1088084T3 (da) | 1998-06-15 | 2007-01-29 | Gtc Biotherapeutics Inc | Erythropoietin analog-humant serumalbumin fusionsprotein |
| US6210924B1 (en) | 1998-08-11 | 2001-04-03 | Amgen Inc. | Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line |
| DE69935345T3 (de) * | 1998-10-23 | 2018-03-01 | Amgen Inc. | Methoden und zusammensetzungen zur prävention und behandlung der anämie |
| US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| BR9905868A (pt) * | 1998-11-06 | 2001-01-23 | Bio Sidus S A | Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| JP2002531089A (ja) * | 1998-11-30 | 2002-09-24 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 赤血球産生性化合物 |
| CA2391080A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Erythropoietin forms with improved properties |
| US6703480B1 (en) | 1999-11-24 | 2004-03-09 | Palani Balu | Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use |
| JP5179689B2 (ja) | 2000-02-11 | 2013-04-10 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強 |
| AU5551601A (en) | 2000-04-21 | 2001-11-07 | Amgen Inc | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
| AU2001276737A1 (en) | 2000-08-04 | 2002-02-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein injection preparations |
| US8632778B2 (en) | 2000-08-11 | 2014-01-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilized anti-interleukin-6 antibody-containing preparations |
| US7645898B2 (en) | 2000-08-24 | 2010-01-12 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators and method of use thereof |
| US7919647B2 (en) | 2000-08-24 | 2011-04-05 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof |
| US7622503B2 (en) | 2000-08-24 | 2009-11-24 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof |
| US7855229B2 (en) | 2000-08-24 | 2010-12-21 | University Of Tennessee Research Foundation | Treating wasting disorders with selective androgen receptor modulators |
| US20030072737A1 (en) | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
| PA8536201A1 (es) * | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
| US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| DK1366067T3 (da) | 2001-03-07 | 2012-10-22 | Merck Patent Gmbh | Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed |
| ES2869895T3 (es) | 2001-03-09 | 2021-10-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Método de purificación de proteínas |
| DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| EP1382964A4 (en) | 2001-04-17 | 2009-06-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR TENSID QUANTIFICATION |
| BR0209177A (pt) | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| EA008220B1 (ru) | 2001-10-29 | 2007-04-27 | Круселл Холланд Б.В. | Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения |
| KR100467750B1 (ko) * | 2001-11-29 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
| US20070066568A1 (en) | 2005-08-31 | 2007-03-22 | Dalton James T | Treating renal disease, burns, wounds and spinal cord injury with selective androgen receptor modulators |
| US8853266B2 (en) | 2001-12-06 | 2014-10-07 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulators for treating diabetes |
| DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| MXPA05000063A (es) * | 2002-07-01 | 2005-04-08 | Kenneth S Warren Inst Inc | Citocinas recombinantes protectoras de tejido y acidos nucleicos que las codifican para la proteccion, restauracion y mejora de celulas, tejidos y organos respondedores. |
| WO2004019966A1 (ja) | 2002-08-27 | 2004-03-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | タンパク質溶液製剤の安定化方法 |
| DE20321793U1 (de) | 2002-09-11 | 2010-06-02 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hydroxyalkylstärke-Derivate |
| CN100522989C (zh) | 2002-09-11 | 2009-08-05 | 中外制药株式会社 | 纯化蛋白质的方法 |
| MXPA05002594A (es) | 2002-09-11 | 2005-05-27 | Fresenius Kabi Gmbh | Derivados de polipeptidos con hidroxialquilalmidon, especialmente derivados de eritropoyetina con hidroxialquilalmidon. |
| WO2004032971A1 (en) | 2002-10-08 | 2004-04-22 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates |
| ATE471946T1 (de) | 2002-12-17 | 2010-07-15 | Merck Patent Gmbh | Humanisierter antikörper (h14.18) des maus antikörpers 14.18, der gd2 bindet und seine fusion mit il-2 |
| WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
| CN1897959A (zh) | 2003-09-29 | 2007-01-17 | 沃伦药品公司 | 用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子 |
| EP1699821B1 (en) | 2003-12-31 | 2012-06-20 | Merck Patent GmbH | Fc-ERYTHROPOIETIN FUSION PROTEIN WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS |
| CN102816241B (zh) | 2004-02-09 | 2015-07-22 | 人类基因科学公司 | 清蛋白融合蛋白 |
| EP2336192A1 (en) | 2004-03-11 | 2011-06-22 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination |
| US9884038B2 (en) | 2004-06-07 | 2018-02-06 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulator and methods of use thereof |
| US9889110B2 (en) | 2004-06-07 | 2018-02-13 | University Of Tennessee Research Foundation | Selective androgen receptor modulator for treating hormone-related conditions |
| US7714114B2 (en) | 2005-02-16 | 2010-05-11 | Nektar Therapeutics | Conjugates of an EPO moiety and a polymer |
| US9988427B2 (en) | 2005-05-13 | 2018-06-05 | Charite Universitaetsmedizen-Berlin | Erythropoietin variants |
| EP3026109B1 (en) | 2005-12-08 | 2022-03-09 | Amgen Inc. | Improved production of glycoproteins using manganese |
| ES2434494T3 (es) | 2005-12-08 | 2013-12-16 | Amgen, Inc. | Células huésped mejoradas y métodos de cultivo |
| WO2007083683A1 (ja) * | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | シアル酸の除去方法及びアシアロエリスロポエチンの製造方法 |
| WO2007108505A1 (ja) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | エリスロポエチン溶液製剤 |
| CN101460188B (zh) | 2006-06-07 | 2013-09-04 | 国立大学法人德岛大学 | 使用促红细胞生成素的局部缺血疾病的治疗 |
| ES2780193T3 (es) | 2006-07-12 | 2020-08-24 | Univ Tennessee Res Found | Compuesto para tratar el cáncer de mama y afecciones dependientes de la progestina |
| EP2498096A1 (en) | 2006-07-21 | 2012-09-12 | Amgen Inc. | Method of detecting and/or measuring hepcidin in a sample |
| CN103169984B (zh) * | 2006-07-25 | 2016-08-03 | 利普生技术有限公司 | N末端聚唾液酸化 |
| EP2057997A4 (en) | 2006-08-22 | 2012-11-07 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | MEANS FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF PERIPHERAL NEUROPATHY |
| AU2007287070C1 (en) | 2006-08-24 | 2013-02-14 | University Of Tennessee Research Foundation | Substituted acylanilides and methods of use thereof |
| DK2081956T3 (da) | 2006-11-13 | 2013-06-24 | Charite Universitaetsmedizin | FREMGANGSMÅDE TIL CELLEDYRKNING OG FREMGANGSMÅDE TIL BEHANDLING OMFATTENDE EN vEPO-PROTEINVARIANT |
| AR065613A1 (es) | 2007-03-09 | 2009-06-17 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes de proteccion para organos transplantados |
| US7968603B2 (en) | 2007-09-11 | 2011-06-28 | University Of Tennessee Research Foundation | Solid forms of selective androgen receptor modulators |
| AU2008304111B2 (en) | 2007-09-27 | 2014-04-24 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
| US8796206B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-08-05 | Amgen Inc. | Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration |
| EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
| EP2803675A3 (en) | 2008-01-25 | 2014-12-24 | Amgen, Inc | Ferroportin antibodies and methods of use |
| WO2009139822A1 (en) | 2008-05-01 | 2009-11-19 | Amgen Inc. | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
| DE102008002209A1 (de) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin |
| US8003689B2 (en) | 2008-06-20 | 2011-08-23 | Gtx, Inc. | Metabolites of selective androgen receptor modulators and methods of use thereof |
| EP2161031A1 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-10 | SuppreMol GmbH | Fc gamma receptor for the treatment of B cell mediated multiple sclerosis |
| CA2736141C (en) | 2008-09-23 | 2018-03-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Purification of erythropoietin |
| CA2742871C (en) | 2008-11-13 | 2018-10-23 | Herb Lin | Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6 |
| DE102008054716A1 (de) | 2008-12-16 | 2010-06-17 | Evonik Degussa Gmbh | Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO |
| EP3009447B1 (en) | 2009-07-24 | 2018-06-06 | Dr. Reddy's Laboratories, Ltd. | Production of erythropoiesis stimulating protein using metal ions |
| KR20120117728A (ko) | 2009-09-23 | 2012-10-24 | 바이오제너릭스 에이지 | 재조합 인간 에리트로포이에틴(ｅｐｏ)의 정제 방법, 이렇게 정제된 ｅｐｏ 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
| US9662271B2 (en) | 2009-10-23 | 2017-05-30 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| ES2545411T5 (es) | 2010-06-07 | 2024-04-05 | Amgen Inc | Dispositivo de administración de fármaco |
| WO2012135315A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
| LT2699293T (lt) | 2011-04-20 | 2019-04-25 | Amgen Inc. | Automatinio purškimo prietaisas |
| EP3045187B1 (en) | 2011-10-14 | 2019-04-10 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
| US20150065689A1 (en) * | 2012-04-10 | 2015-03-05 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Single step fractionation method |
| US9969683B2 (en) | 2012-07-13 | 2018-05-15 | Gtx, Inc. | Method of treating estrogen receptor (ER)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS) |
| US9744149B2 (en) | 2012-07-13 | 2017-08-29 | Gtx, Inc. | Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs) |
| US10258596B2 (en) | 2012-07-13 | 2019-04-16 | Gtx, Inc. | Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS) |
| US10987334B2 (en) | 2012-07-13 | 2021-04-27 | University Of Tennessee Research Foundation | Method of treating ER mutant expressing breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMs) |
| US9622992B2 (en) | 2012-07-13 | 2017-04-18 | Gtx, Inc. | Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs) |
| US10314807B2 (en) | 2012-07-13 | 2019-06-11 | Gtx, Inc. | Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS) |
| US12685719B2 (en) | 2012-07-13 | 2026-07-21 | University Of Tennessee Research Foundation | Treatment of breast cancer with selective androgen receptor modulators and cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitors |
| EP3733170A1 (en) | 2012-07-13 | 2020-11-04 | Oncternal Therapeutics, Inc. | A method of treating androgen receptor (ar) -positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (sarms) |
| JP2015535464A (ja) | 2012-11-21 | 2015-12-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬剤送達装置 |
| EP3524691A1 (en) | 2012-12-07 | 2019-08-14 | SuppreMol GmbH | Stratification and treatment of patients of idiopathic thrombocytopenic purpura |
| TWI592183B (zh) | 2013-03-15 | 2017-07-21 | 安美基公司 | 本體輪廓可調適之自動注射器裝置 |
| US10492990B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-03 | Amgen Inc. | Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system |
| US10092703B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-09 | Amgen Inc. | Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system |
| CA2904357C (en) | 2013-03-15 | 2020-09-22 | Intrinsic Lifesciences Llc | Anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
| ES2853748T3 (es) | 2013-03-22 | 2021-09-17 | Amgen Inc | Inyector y método de montaje |
| MX2016005315A (es) | 2013-10-24 | 2016-08-11 | Amgen Inc | Sistema de administracion de farmacos con control sensible a la temperatura. |
| EP3060275B1 (en) | 2013-10-24 | 2019-07-03 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
| WO2015119906A1 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Amgen Inc. | Drug delivery system with electromagnetic field generator |
| WO2015130963A2 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Xenetic Biosciences, Inc. | Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain |
| SG11201609219QA (en) | 2014-05-07 | 2016-12-29 | Amgen Inc | Autoinjector with shock reducing elements |
| ES2864079T3 (es) | 2014-05-30 | 2021-10-13 | Pfizer | Derivados de carbonitrilo como moduladores selectivos del receptor de andrógenos |
| US20170103186A1 (en) | 2014-06-03 | 2017-04-13 | Amgen Inc. | Systems and methods for supporting patient use of a drug delivery device |
| CA2961917A1 (en) | 2014-09-22 | 2016-03-31 | Intrinsic Lifesciences Llc | Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
| ES3056224T3 (en) | 2014-10-14 | 2026-02-19 | Amgen Inc | Drug injection device with visual and audible indicators |
| US10799630B2 (en) | 2014-12-19 | 2020-10-13 | Amgen Inc. | Drug delivery device with proximity sensor |
| EP3689394A1 (en) | 2014-12-19 | 2020-08-05 | Amgen Inc. | Drug delivery device with live button or user interface field |
| US10583245B2 (en) | 2015-02-17 | 2020-03-10 | Amgen Inc. | Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback |
| ES2905870T3 (es) | 2015-02-27 | 2022-04-12 | Amgen Inc | Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja |
| WO2017039786A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Amgen Inc. | Syringe assembly adapter for a syringe |
| JP7082568B2 (ja) | 2015-12-09 | 2022-06-08 | アムジエン・インコーポレーテツド | 信号伝達キャップ付き自動注射器 |
| WO2017120178A1 (en) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling electronics |
| WO2017160799A1 (en) | 2016-03-15 | 2017-09-21 | Amgen Inc. | Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices |
| WO2017189089A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Amgen Inc. | Drug delivery device with messaging label |
| US11389588B2 (en) | 2016-05-02 | 2022-07-19 | Amgen Inc. | Syringe adapter and guide for filling an on-body injector |
| MX2018013616A (es) | 2016-05-13 | 2019-02-21 | Amgen Inc | Montaje de cubierta protectora de vial. |
| WO2017200989A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Amgen Inc. | Data encryption in medical devices with limited computational capability |
| ES3066292T3 (en) | 2016-06-03 | 2026-05-12 | Amgen Inc | Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices |
| EP3478342B1 (en) | 2016-07-01 | 2025-03-12 | Amgen Inc. | Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events |
| US20190328965A1 (en) | 2016-08-17 | 2019-10-31 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement detection |
| EP3532127B1 (en) | 2016-10-25 | 2026-04-08 | Amgen Inc. | On-body injector |
| WO2018136398A1 (en) | 2017-01-17 | 2018-07-26 | Amgen Inc. | Injection devices and related methods of use and assembly |
| AU2018220538B2 (en) | 2017-02-17 | 2023-12-14 | Amgen Inc. | Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly |
| MX2019009755A (es) | 2017-02-17 | 2019-10-07 | Amgen Inc | Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos. |
| WO2018165143A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-13 | Amgen Inc. | Drug delivery device with activation prevention feature |
| KR102627069B1 (ko) | 2017-03-07 | 2024-01-18 | 암겐 인코포레이티드 | 과압에 의한 바늘 삽입 |
| SG11201908062QA (en) | 2017-03-09 | 2019-09-27 | Amgen Inc | Insertion mechanism for drug delivery device |
| WO2018172219A1 (en) | 2017-03-20 | 2018-09-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein |
| MX2019011416A (es) | 2017-03-28 | 2019-11-01 | Amgen Inc | Sistema y metodo para conjunto de jeringa y vastago de embolo. |
| CA3066399A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Amgen Inc. | Torque driven drug delivery device |
| AU2018280054B2 (en) | 2017-06-08 | 2023-07-13 | Amgen Inc. | Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly |
| MA49447A (fr) | 2017-06-22 | 2020-04-29 | Amgen Inc | Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif |
| JP7475860B2 (ja) | 2017-06-23 | 2024-04-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス |
| JP7408398B2 (ja) | 2017-07-14 | 2024-01-05 | アムジエン・インコーポレーテツド | 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム |
| JP7649105B2 (ja) | 2017-07-21 | 2025-03-19 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法 |
| EP3658206A1 (en) | 2017-07-25 | 2020-06-03 | Amgen Inc. | Drug delivery device with container access system and related method of assembly |
| WO2019022951A1 (en) | 2017-07-25 | 2019-01-31 | Amgen Inc. | DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF |
| US12318593B2 (en) | 2017-08-09 | 2025-06-03 | Amgen Inc. | Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system |
| EP3668567B1 (en) | 2017-08-18 | 2026-02-18 | Amgen Inc. | Wearable injector with sterile adhesive patch |
| US11103636B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-08-31 | Amgen Inc. | Needle insertion mechanism for drug delivery device |
| EP3691717B1 (en) | 2017-10-04 | 2023-02-08 | Amgen Inc. | Flow adapter for drug delivery device |
| EP4257164A3 (en) | 2017-10-06 | 2024-01-17 | Amgen Inc. | Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly |
| MA50348A (fr) | 2017-10-09 | 2020-08-19 | Amgen Inc | Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé |
| ES3069718T3 (en) | 2017-11-03 | 2026-06-10 | Amgen Inc | System and approaches for sterilizing a drug delivery device |
| CA3079197A1 (en) | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement and flow sensing |
| MA50569A (fr) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Amgen Inc | Ensembles de remplissage-finition et procédés associés |
| IL319987A (en) | 2017-11-10 | 2025-06-01 | Amgen Inc | Plungers for drug delivery devices |
| AU2018368340B2 (en) | 2017-11-16 | 2024-03-07 | Amgen Inc. | Door latch mechanism for drug delivery device |
| JP7747438B2 (ja) | 2017-11-16 | 2025-10-01 | アムジエン・インコーポレーテツド | 失速及び終点検出を有するオートインジェクタ |
| US10835685B2 (en) | 2018-05-30 | 2020-11-17 | Amgen Inc. | Thermal spring release mechanism for a drug delivery device |
| US11083840B2 (en) | 2018-06-01 | 2021-08-10 | Amgen Inc. | Modular fluid path assemblies for drug delivery devices |
| CA3103682A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Delivery devices for administering drugs |
| CN112469454B (zh) | 2018-07-24 | 2024-01-26 | 安进公司 | 用于施用药物的输送装置 |
| US12303677B2 (en) | 2018-07-24 | 2025-05-20 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation |
| WO2020023336A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with grip portion |
| MA53320A (fr) | 2018-07-31 | 2021-11-03 | Amgen Inc | Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament |
| CA3106452A1 (en) | 2018-09-24 | 2020-04-02 | Amgen Inc. | Interventional dosing systems and methods |
| US12042642B2 (en) | 2018-09-28 | 2024-07-23 | Amgen Inc. | Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device |
| WO2020072577A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Amgen Inc. | Injection systems for drug delivery with internal force transmission |
| JP7547325B2 (ja) | 2018-10-05 | 2024-09-09 | アムジエン・インコーポレーテツド | 投薬量インジケータを有する薬物送達デバイス |
| JP7719714B2 (ja) | 2018-10-15 | 2025-08-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | ダンピング機構を有する薬物送達装置 |
| MA53913A (fr) | 2018-10-15 | 2022-01-19 | Amgen Inc | Procédé d'assemblage de plate-forme pour dispositif d'administration de médicament |
| TWI831847B (zh) | 2018-11-01 | 2024-02-11 | 美商安進公司 | 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法 |
| WO2020091956A1 (en) | 2018-11-01 | 2020-05-07 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
| MA54057A (fr) | 2018-11-01 | 2022-02-09 | Amgen Inc | Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament |
| EP3958934B1 (en) | 2019-04-24 | 2025-04-09 | Amgen Inc. | Syringe sterilization verification assemblies and methods |
| US20220273887A1 (en) | 2019-08-23 | 2022-09-01 | Amgen Inc. | Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods |
| CU24704B1 (es) * | 2019-09-05 | 2024-04-08 | Ct Inmunologia Molecular | Método para la obtención de eritropoyetina humana recombinante hiposialilada para el tratamiento de alteraciones del sistema nervioso |
| BR112023024278A2 (pt) | 2021-05-21 | 2024-01-30 | Amgen Inc | Método de otimizar uma receita de enchimento para um recipiente de fármacos |
| WO2023275715A1 (en) | 2021-06-30 | 2023-01-05 | Pfizer Inc. | Metabolites of selective androgen receptor modulators |
| WO2023209074A1 (en) | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing |
| JP2025536587A (ja) | 2022-11-02 | 2025-11-07 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 糖タンパク質組成物を生産するための方法 |
| WO2026030152A1 (en) | 2024-07-29 | 2026-02-05 | Amgen Inc. | System and method for assessing transferability of a fill recipe |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2354793A1 (fr) * | 1976-06-14 | 1978-01-13 | Gresset Bernard | Jouet tel que tableau |
| FR2475988A2 (fr) * | 1978-09-04 | 1981-08-21 | Cassagnes Andre | Appareil a dessiner |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
| DE3923963A1 (de) * | 1989-07-20 | 1991-01-31 | Behringwerke Ag | Muteine des menschlichen erythropoetins, ihre herstellung und ihre verwendung |
-
1990
- 1990-10-09 AU AU66042/90A patent/AU646822B2/en not_active Expired
- 1990-10-09 KR KR1019980707104A patent/KR100263845B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-09 KR KR1019910700600A patent/KR100221066B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-09 JP JP2514568A patent/JP2983629B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-09 WO PCT/US1990/005758 patent/WO1991005867A1/en not_active Ceased
- 1990-10-12 NZ NZ235676A patent/NZ235676A/en unknown
- 1990-10-12 EP EP95101849A patent/EP0668351B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 IE IE366390A patent/IE903663A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 DK DK95101849T patent/DK0668351T3/da active
- 1990-10-12 PT PT95586A patent/PT95586B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 CZ CZ19904972A patent/CZ291515B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 CN CN90109447A patent/CN1063796C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 DE DE69029370T patent/DE69029370C5/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 EP EP90311193A patent/EP0428267B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 IL IL95971A patent/IL95971A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 SK SK4972-90A patent/SK284429B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 IL IL12517590A patent/IL125175A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 DK DK90311193T patent/DK0428267T4/da active
- 1990-10-12 ES ES95101849T patent/ES2139764T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 AT AT90311193T patent/ATE146187T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 ZA ZA908166A patent/ZA908166B/xx unknown
- 1990-10-12 DE DE69033301T patent/DE69033301T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 AT AT95101849T patent/ATE184914T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-12 ES ES90311193T patent/ES2097753T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-15 CA CA002027635A patent/CA2027635C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-15 CA CA002165694A patent/CA2165694C/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-12 FI FI912829A patent/FI105688B/fi active
- 1991-06-13 NO NO912281A patent/NO301832B1/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-16 JP JP07057432A patent/JP3073905B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-02-26 GR GR970400345T patent/GR3022658T3/el unknown
-
1998
- 1998-06-23 HK HK98106060A patent/HK1006718A1/en not_active IP Right Cessation
- 1998-07-01 IL IL12517598A patent/IL125175A0/xx active IP Right Grant
-
1999
- 1999-12-08 GR GR990403180T patent/GR3032089T3/el unknown
-
2000
- 2000-05-04 LV LVP-00-60A patent/LV12575B/en unknown
- 2000-05-12 CZ CZ20001772A patent/CZ291488B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-27 CZ CZ20011115A patent/CZ291471B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-03-27 CZ CZ20011117A patent/CZ291472B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2159814C2 (ru) | Аналог эритропоэтина | |
| AU646822B2 (en) | Erythropoietin isoforms | |
| US5856298A (en) | Erythropoietin isoforms | |
| Browne et al. | Erythropoietin: gene cloning, protein structure, and biological properties | |
| AU650893B2 (en) | O-glycosylated alpha-2 interferon | |
| JP2001504324A (ja) | α―ガラクトシダーゼＡ欠損症の治療 | |
| KR20030045341A (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| Inoue et al. | The production of recombinant human erythropoietin | |
| JPH11500904A (ja) | Ｍｐｌリガンド類似体 | |
| PT92613B (pt) | Processo para a obtencao de factor de crescimento de celulas endoteliais | |
| FI104424B (fi) | Menetelmä onkostatiini M -mutantin valmistamiseksi | |
| FI106563B (fi) | Menetelmä ihmisen erytropoietiinin analogien valmistamiseksi ja niitä koodittavat DNA-sekvenssit | |
| WO1999049060A1 (en) | Use of growth hormone binding protein with a nuclear localization sequence (nls-ghbp) | |
| HK1010398B (en) | Erythropoietin analogs | |
| IE83805B1 (en) | Erythropoietin analogs | |
| HK1074058B (en) | Production of human alpha-galactosidase a |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20101012 |