CZ291525B6 - Modifikované primery - Google Patents
Modifikované primery Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291525B6 CZ291525B6 CZ1998841A CZ84198A CZ291525B6 CZ 291525 B6 CZ291525 B6 CZ 291525B6 CZ 1998841 A CZ1998841 A CZ 1998841A CZ 84198 A CZ84198 A CZ 84198A CZ 291525 B6 CZ291525 B6 CZ 291525B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- primers
- modified
- amplification
- primer
- reaction
- Prior art date
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 210
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 207
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 53
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 104
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 44
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 41
- -1 phenoxy, substituted phenyl Chemical group 0.000 claims description 41
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 29
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 26
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 18
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 14
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 8
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 64
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 373
- 239000002585 base Substances 0.000 description 72
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 70
- 239000000047 product Substances 0.000 description 68
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 41
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 41
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 30
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 29
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 17
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 11
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 11
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 9
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 8
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Substances C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 4
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 3
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- RJJQAQFECPHEIJ-FILYFMJVSA-N (2R,3S,5R)-5-(6-amino-6-benzyl-8H-purin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound N1=CN=C2N([C@@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)C3)CN=C2C1(N)CC1=CC=CC=C1 RJJQAQFECPHEIJ-FILYFMJVSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-2-nitrobenzene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1CBr HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- IPSGRRPWHSSCPX-DKPWXRHPSA-N P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@H](O1)N1CN=C2C(N)(N=CN=C12)CC1=CC=CC=C1)O Chemical compound P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@H](O1)N1CN=C2C(N)(N=CN=C12)CC1=CC=CC=C1)O IPSGRRPWHSSCPX-DKPWXRHPSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000004533 oil dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- AUYBSFAHQLKXSW-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloroethane;3-(ethyliminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.ClCCCl.CCN=C=NCCCN(C)C AUYBSFAHQLKXSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-4-tert-butylbenzene Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C(CBr)C=C1 QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(=N)N(C)C2=C1N=CN2 XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000137282 Agathosma betulina Species 0.000 description 1
- 235000013388 Agathosma crenulata Nutrition 0.000 description 1
- 206010002942 Apathy Diseases 0.000 description 1
- 235000009269 Barosma crenulata Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCHMVRFYJYBEJV-SLLHVTCXSA-N C1[C@@H]([C@H](O[C@H]1N2CN=C3C2=NC=NC3(C(=O)C4=CC=CC=C4)NCC5=CC=CC=C5)CO)O Chemical compound C1[C@@H]([C@H](O[C@H]1N2CN=C3C2=NC=NC3(C(=O)C4=CC=CC=C4)NCC5=CC=CC=C5)CO)O UCHMVRFYJYBEJV-SLLHVTCXSA-N 0.000 description 1
- AMFKQYYKBZAHJD-SLLHVTCXSA-N C1[C@@H]([C@H](O[C@H]1N2CN=C3C2=NC=NC3(C(=O)C4=CC=CC=C4)NCC5=CC=CC=C5[N+](=O)[O-])CO)O Chemical compound C1[C@@H]([C@H](O[C@H]1N2CN=C3C2=NC=NC3(C(=O)C4=CC=CC=C4)NCC5=CC=CC=C5[N+](=O)[O-])CO)O AMFKQYYKBZAHJD-SLLHVTCXSA-N 0.000 description 1
- DFHZIAHBGYHWJL-DEAAAOJNSA-N CC(C)(C)C1=CC=C(C=C1)CNC2=C3C(=NC=N2)N(C=N3)[C@]4(C[C@@H]([C@H](O4)COC(C5=CC=CC=C5)(C6=CC=C(C=C6)OC)C7=CC=C(C=C7)OC)O)C(=O)C8=CC=CC=C8 Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C(C=C1)CNC2=C3C(=NC=N2)N(C=N3)[C@]4(C[C@@H]([C@H](O4)COC(C5=CC=CC=C5)(C6=CC=C(C=C6)OC)C7=CC=C(C=C7)OC)O)C(=O)C8=CC=CC=C8 DFHZIAHBGYHWJL-DEAAAOJNSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 101000935008 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) dITP/XTP pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940062650 buchu Drugs 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000013581 critical reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=NC=C1 PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- YHULXGUCQZFROV-UHFFFAOYSA-N sulfane;urea Chemical compound S.NC(N)=O YHULXGUCQZFROV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Modifikovan oligonukleotidy pro pou it p°i amplifikaci sekvence nukleov²ch kyselin. Amplifikace prov d n za pou it modifikovan²ch oligonukleotid vedou k menÜ mu mno stv nespecifick ho amplifika n ho produktu, zejm na primerov ho dimeru a k pr vodn mu v tÜ mu v²t ku ur en ho amplifika n ho produktu ve srovn n s amplifikacemi prov d n²mi za pou it nemodifikovan²ch oligonukleotid jako primer .\
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká oblasti molekulární biologie a chemie nukleových kyselin. Zejména se týká způsobů a eagencií pro zvýšení výtěžku amplifikačních reakcí nukleových kyselin. Vynález má tudíž využití v kterékoli oblasti, ve které se používá amplifikace nukleových kyselin.
Dosavadní stav techniky
Vynález reakce polymerázového řetězce (PCR) umožnil in vitro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin. PCR je popsána v US patentech č. 4 683 195, 4 683 202 a 4 965 188, Saiki a kol., 1985, Science 230:1350 - 1354, Mullis a kol., 1986, Cold Springs Harbor Sympl. Quant. Biol, 51:263273, a Mullis a Faloona, 1987, Methods Enzymoí. 155:335-350.
Vývoj a amplikace PCR jsou popsány rozsáhle v literatuře. Například oblast témat týkajících se PCR je diskutována v PCR Technology-Principles and Applications for DNA Amplifications, 1989 (ed. H. A. Erlich) Stockton Press, New York, PCR protokol: A. Guide to Methods and Applications, 1990, (ed. M.A. Innis a kol.) Academie Press, San Diego, a PCR Strategies, 1995, (ed. M.A. Innis a kol.) Academie Press, San Diego. Obchodníci jako je Perkin Elmer (Norvvalk, CT), prodávají PCR reagencie a publikují PCR protokoly.
Od původní publikace amplifikace nukleových kyselin byly popsány různé metody amplifikace nukleových kyselin na bázi primerů, zahrnující, ale bez omezení, Ligase Chain Reaction (LCR, Wu a Wallacae, 1989, Genomics 4:560-569 a Barany, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA88:189193), Polymerase Ligase Reacton (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16), Gap-LCR (PCT zveřejněná přihláška vynálezu č. WO 90/01 069), Repair Chain Reaction (zveřejněná Evropská přihláška vynálezu EP č. 439 182 A2), 3SR (Kwoh a kol., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci USA 86:1173-1177, Guatelli a kol., 190, Proč. Nati Acad. Sci USA 87:1874-1878, PCT zveřejněná přihláška vynálezu č. WO 92/0 880 A) a NASBA (US patent č. 5 130 238). Přehled amplifikačních systémů je uveden v Abramson a Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47.
Specifičnost amplifikačních reakcí na bázi primerů závisí na specifičnosti hybridizace primerů. Za zvýšených teplot používaných při typické amplifikaci primery hybridizují jen na určené cílové sekvence. Avšak amplifikační reakce směsí se typicky provádějí při teplotě místnosti, dost pod teplotou potřebnou k zajištění specifičnosti hybridizace primerů. Za takovýchto méně přísných podmínek se primery mohou vázat nespecificky na jiné jen zčásti komplementární sekvence nukleových kyselin nebo na jiné primery a iniciují syntézu nežádaných extenzních produktů, které mohou být amplifikovány spolu s cílovou sekvencí. Amplifikace nespecifických extenzních produktů primerů mohou soutěžit s amplifikaci žádaných sekvencí a mohou významně snížit účinnost amplifikace požadované sekvence.
Jeden často zjišťovaný typ nespecifického amplifikačního produktu je matricový nezávislý artefakt amplifikačních reakcí označovaný jako „primemí dimer“. Primemí dimer je dvouřetězcový fragment, jehož délka typicky odpovídá součtu délek dvou primerů a začne se vyskytovat, když jeden primer je protažen přes druhý primer. Výsledná konkatenace tvoří nežádoucí matrici, která vzhledem k své malé délce je účinně amplifikována.
Nespecifická amplifikace může být snížena snížením tvorby extenzních produktů primerů před začátkem reakce. Při jedné metodě označované jako protokol „horký start“, jedna nebo více kritických reagencií se udrží mimo reakční směs dokud se teplota dostatečně nezvýší, aby se zajistila nutná pecofičnost hybridizace. Při tomto způsobu reakční směs nemůže podpořit extenzi primeru během doby, kdy reakční podmínky nezajišťují specifickou hybridizaci primeru.
Ruční metody horkého startu, při kterých se reakční trubice otevírají po počátečním vysokoteplotním inkubačním stupni a přidávají se chybějící reagencie, jsou pracovně náročné a vzrůstá riziko kontaminace reakční směsi. Alternativně může být použit tepelně citlivý materiál jako je vosk k separaci nebo maskovací reakční komponent} jak jsou popsány v US patentu č.
411 876, a Chou a kol., 1992, Nucl. Acic Res. 20 (7:1717-1723). Při těchto metodách vysoká teplota předreakční inkubace taví tepelně citlivý materiál, čímž se umožňuje smísení reagencií.
Další metodou snížení tvorby extenzních produktů primerů před začátkem reakce spočívá v tepelně reverzibilní inhibici DNA polymerázy specifickými protilátkami DNA polymerázy, jak je popsáno v US patentu číslo 5 338 671. Protilátky jsou inkubovány sDNA polymerázou v pufru při teplotě místnosti před sdružením reakční směsi, aby se umožnila tvorba komplexu protilátka-DNA polymeráza. Protilátkové inhibice aktivita DNA polymerázy je inaktivována vysokou teplotou předreakční inkubace. Nevýhoda této metody je v tom, že produkce protilátek specifických k DNA polymeráze je drahá a spotřebovává čas, zejména ve velkých množstvích. Dále přísada protilátek k reakční směsi může vyžadovat předělání amplifikační reakce.
Tvorba extenzních produktů před zahájením reakce může být také inhibována přídavkem jednořetězcového vázacího proteinu do reakce, který se nekovalentně váže k primerům tepelně reverzibilním způsobem a inhibuje extenzi primeru zábranou hybridizace.
Nespecifická amplifikace může být také snížena enzymaticky degradováním extenzních produktů vytvořených před zahájením reakce za použití metod popsaných v US patentu 5 418 149. Degradace nově syntetizovaných extenzích produktů se dosáhne začleněním dUTP a UNG do reakční směsi a inkubací reakční směsi při 45 až 60 °C před prováděním amplifikační reakce. Extenze primeru vede k formaci DNA obsahující uráčil, což se degraduje pomocí UNG za předamplifikačních podmínek.
Nevýhodou této metody je to, že degradace extenzního produktu soutěží s tvorbou extenzního produktu a eliminace nespecifického extenzního primemího produktu vede k pravděpodobnosti, že bude méně kompletní. Výhoda této metody je to, že DNA obsahující uráčil zavedená do reakční směsi jako kontaminace z předchozí reakce se také degraduje a tak tato metoda také snižuje problém kontaminace PCR amplifikovanou nukleovou kyselinou z předcházejících reakcí.
Konvenční technologie molekulární biologie a chemie nukleových kyselin, které se používají v oboru, jsou zcela vysvětleny v literatuře. Viz například Sambrook a kol., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Oligonukcleotide Synthesis (M.J. Gait, ed. 1984), Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames a S. J. Higgins, eds.
1984) a řada methods in Enzymology (Academie Press, lne.).
Předložený vynález zajišťuje kovalentně modifikované oligonukleotidové primery pro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin in vitro. Použití modifikovaných primerů tohoto vynálezu vede ke snížení nespecifické amplifikace zejména tvorby příměrového dimeru a/nebo konkomitantnímu vzrůstu v oblasti určeného cíle ve vztahu k amplifikaci prováděné bez nemodifikovaných primerů.
Podstata vynálezu
Vynález se týká oligonukleotidového primeru pro amplifikaci sekvence nukleových kyselin, obecného vzorce
-2CZ 291525 B6
R R
5'-Si-N-3' nebo 5'-S!-NS2-3' kde Si představuje první sekvenci nukleotidů mezi 5 až 50 nukleotidy v délce,
S2 představuje druhou sekvenci mezi jedním až 3 nukleotidy v délce,
N představuje nukleotid, takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,
R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázána k N přes exocyklický amin a kde R má strukturu vzorce
Ri-C-R2
I
H kde Ri a R2 představují nezávisle vodík, Ci-Ci0 alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu. Alkylové skupiny mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené.
Ve výhodném provedení N je modifikovaný konvenční nukleotid, v kterémžto případě N je modifikovaný adenosid, cytidin, nebo guanosin a modifíkátorová skupina je kovalentně připojena k exocyklickému aminu adeninové, guaninové nebo cytosinové báze. Ve výhodnějším provedení N je modifikovaný adenosin.
Ve výhodném provedení R je 2-naftylmethylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina. Výhodné substituované benzylové skupiny mají strukturu vzorce
kde
R3 představuje Ct-C6 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, výhodněji C(-C4 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu. Výhodně je R3 připojena v para poloze.
Ve výhodnějším provedení je R benzyl, p-methylbenzyl, p-terc.butylbenzyl, p-methoxybenzyl, nebo 2-naftylmethylová skupina.
Další aspekt tohoto vynález se týká amplifikačních primerů, které jsou modifikovány fotolabilním kovalentním připojením modirikátorové skupiny, která vede k parciální nebo úplné inhibici extenze primerů.
Fotolabilní modifikátor může být vázán buď k exocyklickému aminu jako u modifikovaných nukleotidů popsaných výše, nebo ke kruhovému dusíku. Při jednom provedení alespoň jedna nitrobenzylová skupina je připojena k exocyklickému aminu adeninové, guaninové nebo cytosinové báze terminálu 3' nukleotidu.
Dalším aspektem tohoto vynálezu je dvojice nebo sestava primerů, kde alespoň jeden z primerů je modifikován jak je výše popsáno. Při výhodném provedení oba členy páru primerů nebo všechny členy sestavy primerů jsou modifikovány.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobu amplifikace nukleové kyseliny, který zahrnuje provedení amplifikační reakce za použití mofikovaných primerů tohoto vynálezu.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobů pro amplifíkaci cílové nukleové kyseliny, které zahrnují provádění amplifikační reakce za použití fotolabilních modifikovaných primerů tohoto vynálezu, přičemž reakční směs je ozářena zářením dostatečným k odstranění modifikátorové skupiny a umožnění tvorby příměrových extenzních produktů.
Při jednom provedení tohoto vynálezu se ozáření provádí jako oddělený stupeň před začátkem amplifikační reakce, ale potom, co reakční směs byla zahřáta na teplotu vyšší než asi 50 °C. V jiných provedeních je ozařovací stupeň spojen s předběžným stupněm amplifíkačního postupu jako je stupeň reverzní transkripce v amplifikační reakci RNA nebo počáteční denaturační stupeň při amplifikační reakci DNA.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká kitů pro amplifíkaci sekvencí nukleových kyselin in vitro, kteréžto kity zahrnují dvojici primerů, ve které alespoň jeden z primerů je modifikován jak je zde popsáno.
Kity tohoto vynálezu také mohou zahrnovat alespoň jednu amplifikační reagencii, například polymerázu nukleové kyseliny nebo ligázu, nukleotidtrifosfatázu a vhodné pufry.
Stručný popis výkresů
Obr. 1 ukazuje výsledky amplifíkaci HIV-1 RNA provedených za použití benzylovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 5.
Obr. 2 znázorňuje výsledky amplifíkaci HCV RNA prováděné za použití benzylovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 6.
Obr. 3 ukazuje výsledky amplifíkaci HCV RNA prováděných za použití primerů modifikovaných s jednou nebo třemi modifíkátorovými skupinami, jak je popsána v příkladu 7.
Obr. 4 ukazuje výsledky amplifíkaci HCV RNA prováděných za použití fotolabilních modifikovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 8.
Obr. 5 ukazuje výsledky amplifíkaci mykobakteriální DNA za použití primerů modifikovaných s benzylovou skupinou a primerů modifikovaných s p-terc.butylbenzylovou skupinou, jak je popsáno v příkladu 10.
Obr. 6 ukazuje obecné reakční schéma vhodné pro syntézu benzylem nebo substituovaným benzylem modifikovaného dA skla s řízenými póry (CPG).
Pro pomoc k porozumění vynálezu je dále definováno několik výrazů.
-4CZ 291525 B6
Výrazy „nukleová kyselina“ a „oligonukleotid“ se vztahují k polydeoxyribonukleotidům (obsahujícím 2-deoxy-D-ribózu), k polyribonukleotidům (obsahujícím D-ribózu), a kjakémukoli jinému typu polynukleotidu, který je N-glykosid purinové nebo pyrimidinové báze nebo modifikované purinové nebo pyrimidinové báze. Není žádný rozdíl v délce mezi výrazy „nukleová kyselina“ a „oligonukleotid“ a tyto výrazy budou používány zaměnitelně. Tyto výrazy se vztahují jen k primární struktuře molekuly. Tak tyto výrazy zahrnují dvouřetězcovou a jednořetězcovou DNA stejně jako dvouřetězcovou a jednořetězcovou RNA.
Výraz „konvenční“, v odkazu na báze nukleových kyselin, nukleosidy nebo nukleotidy se týká těch, které se vyskytují přirozeně v polynukleotidu, který je popisován. Čtyři konvenční (také vyzývané jako hlavní) deoxyribonukleotidy DNA obsahují purinové báze adenin aguanin a pyrimidinové báze cytosin a thymin. Čtyři konvenční ribonukleotidy RNA obsahují purinové báze adenin a guanin a pyrimidinové báze urasil a cytosin. Navíc k výše uvedeným konvenčním nebo běžným bázím existují jiné purinové a pyrimidinové deriváty nazývané vzácné nebo vedlejší báze, které se vyskytují v malých množstvích v některých nukleových kyselinách.
Použitý výraz „nekonvenční“ s odkazem na bází nukleových kyselin, nukleosidy, nebo nukleotidy se týká vzácných neboli vedlejších bází nukleových kyselin, nukleosidů nebo nukleotidů a modifikací, derivací nebo analogů konvenčních bází nukleosidů nebo nukleotidů a zahrnuje syntetické nukleotidy mající části modifikované báze a/nebo části modifikovaného cukru (viz Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol. 26, (Sudhir Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, NJ, (1994)), a Oligonukcleotide a Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).
Oligonukleotidy mohou být připraveny jakoukoli vhodnou metodou včetně například klonování a restrikce vhodných sekvencí a přímé chemické syntézy metodou jako je fosfotriesterová metoda, Narang a kol., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99, fosfodiesterová metoda, Brown a kol., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151, diethylfosforamiditová metoda, Beaucage a kol., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, a metoda tuhého nosiče z US patentu č. 4 458 066. Přehled syntézních metod je proveden v Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187, na což se tímto odkazuje.
Výraz „párování bází“, také označovaný v dosavadním stavu techniky jako „Watson-Crickovo párování bází“, se týká dobře známé vodíkové vazby komplementárních párů bází adeninthymin a guanin-cytosin v dvouřetězcové DNA struktuře, adenin-uracil a guanin-cytosin a RNA/DNA hybridní molekula a analogické vazby nekonvenčních nukleotidových párů.
Výraz „hybridizace“ se týká tvorby dvojité struktury dvěma jednořetězcovými nukleovými kyselinami vlivem komplementárního párování bází. Hybridizace se může uskutečnit mezi zcela komplementárními řetězci nukleových kyselin nebo mezi „v podstatě komplementárními“ řetězci nukleových kyselin, které obsahují menší oblasti chybného párování. Podmínky, za kterých jen plně komplementární řetězce nukleových kyselin budou hybridizovat, jsou označovány jako „přímé hybridizační podmínky“ nebo „sekvenční specifické hybridizační podmínky“.
Stabilní duplexy nebo v podstatě komplementární sekvence mohou být dosaženy za méně přísných hybridizačních podmínek. Stupeň chybného párování, které je tolerováno, může být řízen vhodným nastavením hybridizačních podmínek. Odborníci v oboru technologie nukleových kyselin mohou určit empiricky stabilitu duplexu uvážením počtu prováděných včetně například délky a koncentrace párů báze oligonukleotidů, iontové síly a výskytu chybných párů báze, podle návodu uvedeného v dosavadním stavu techniky (viz například Sambroock a kol., 1989, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York a Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. And Mol. Biol. 26(3/4): 227-259).
Výraz „primer“ se týká oligonukleotidu schopného působit jako bod iniciace DNA syntézy za podmínek, při kterých syntéza příměrového extenzního produktu komplementárního k řetězci
-5CZ 291525 B6 nukleové kyseliny se vyvolá, to je jak v přítomnosti čtyř rozdílných nukleosidových trifosfátů, tak prostředku pro extenzi (například DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy) ve vhodném pufru a při vhodné teplotě. Jak je zde použit, výraz „primer’· je určen k zahrnutí oligonukleotidů použitých v ligací zprostředkovaných amplifikačních procesech, ve kterých je jeden oligonukleotid „extendován“ ligací na druhý oligonukleotid, který hybridizuje v přilehlé poloze. Tak výraz „extenze primerů“ jak je zde použit, se týká jak polymerizace individuálních nukleosidtrifosfátů užívajících primer jako bod iniciace DNA syntézy, tak ligace dvou primerů k vytvoření extendovaného produktu.
Primer je výhodně jednořetězcová DNA. Vhodná délka primerů závisí na uvažovaném použití primerů, ale typicky je v rozmezí od 6 do 50 nukleotidů. Krátké příměrové molekuly obvykle vyžadují nižší teploty pro vytvoření dostatečně stabilních hybridních komplexů s matricí. Primer nereflektuje přesnou sekvenci matriční nukleové kyseliny, ale musí být dostatečně komplementární k hybridizací s matricí. Návrh vhodných primerů pro amplifikaci dané cílové sekvence je dobře znám v dosavadním stavu techniky a popsán v zde citované literatuře.
Primery mohou začleňovat další rysy, které berou v úvahu detekci nebo imobilizaci primerů, ale nemění základní vlastnost primem, totiž působení jako bod iniciace DNA syntézy. Například primery mohou obsahovat další sekvenci nukleové kyseliny na 5'konci, která nehybridizuje na cílovou nukleovou kyselinu, ale která usnadňuje klonování amplifikovaného produktu. Oblast primerů, která je dostatečně komplementární k matrici pro hybridizací, se zde označuje jako hybridizační oblast.
Výrazy „cíl“, „cílová sekvence“, „cílová oblast“, a „cílová nukleová kyselina“ se týkají oblasti nebo subsekvence nukleové kyseliny, která má být amplifikována.
Jak je zde použito, primer je „specifický“ pro cílovou sekvenci, když počet chybných párů, přítomných mezi sekvencí primem a cílovou sekvencí je menší než počet chybných párů přítomných mezi sekvencí primem a necílovými sekvencemi, které mohou být přítomny ve vzorku. Hybridizační podmínky mohou být voleny takové, že se vytvoří jen stabilní duplexy, když počet chybných párů přítomných není větší než počet chybných párů přítomných mezi sekvencí primerů a cílovou sekvencí. Za takovýchto podmínek může primer vytvořit stabilní duplex jedině s cílovou sekvencí. Tak použití cílově specifických primerů za vhodných přísných amplifikačních podmínek umožňuje specifickou amplifikaci těch cílových sekvencí, které obsahují cílová vazební místa primem. Použití sekvenčně specifických amplifikačních podmínek umožňuje specifickou amplifikaci těch cílových sekvencí, které obsahují přesně komplementární primerová vazební místa.
Výraz „nespecifická amplifíkace“ se týká amplifíkace sekvencí nukleových kyselin jiných než je cílová sekvence, která vzniká z primerů hybridizujících na sekvence jiné, než je cílová sekvence a pak slouží jako substrát pro extenzi primem. Hybridizace primem na necílovou sekvenci je označována jako „nespecifická hybridizace“ a může se vyskytnout během nižší teploty, snížené přísnosti preamplifíkačních podmínek.
Výraz „příměrový dimer“ se týká na matrici nezávislého nespecifického amplifíkačního produktu, který je výsledkem příměrových extenzí, kde další primer slouží jako matrice. Ačkoli příměrový dimer se často ukazuje konkatamerem dvou primem, to je dimerem, vyskytují se také konkatamery více než dvou primerů. Výraz „příměrový dimer“ je zde použit genericky, aby zahrnoval na matrici nezávislý nespecifický amplifikační produkt.
Výraz „reakční směs“ se týká roztoku obsahujícího reagenty nutné k provedení uvedené reakce. „Amplifikační reakční směs“, která se týká roztoku obsahujícího reagenty nutné k provádění amplifikační reakce, typicky obsahuje oligonukleotidové primery s DNA polymerázu nebo ligázu ve vhodném pufru. „PCR reakční směs“ typicky obsahuje oligonukleotidové primery, termostabilní DNA polymerázy, dNTP, a kation dvojmocného kovu ve vhodném pufru. Reakční směs
-6CZ 291525 B6 je zde označována jako kompletní, když obsahuje všechny reagenty nutné k umožnění reakce a nekompletní, když obsahuje jen neúplnou sestavu nutných reagentů.
Odborníci v oboru vědí, že reakční složky se rutinně skladují jako oddělené roztoky, každý obsahující podsestavu celkových složek, z důvodů výhodnosti, stability, skladování nebo pro umožnění pro aplikaci závislého nastavení koncentrací složek a že složky jsou sdruženy před reakcí, aby se vytvořila kompletní reakční směs. Dále odborníci v oboru vědí, že reakční komponenty se balí odděleně pro obchod a že výhodné komerční kity mohou obsahovat jakoukoli podsestavu reakčních komponentů, která zahrnuje modifikované primery tohoto vynálezu.
Modifikované primery
Amplifikační primery tohoto vynálezu jsou modifikovány kovalentním připojením skupiny k jednomu ze čtyř nukleotidů v 3'terminálním konci příměru.
Při jednom provedení modifikovaný primer tohoto vynálezu sestává ze sekvence nukleové kyseliny o obecné struktuře
R R
I I
5'-S,-N-3' nebo 5'- St-N-S2 - 3', kde představuje první sekvenci nukleotidů mezi 5 až 50 nukleotidy v délce,
52 představuje druhou sekvenci mezi 1 až 3 nukleotidy v délce,
N představuje nukleotid takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,
R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázán k N přes exocyklický amin a kde R má dále popsanou strukturu.
Jak je ukázáno v příkladech provedení, účinek modifikace je maximalizován, když je modifikace na 3'terminálním nukleotidu. Tak výhodně primer obsahuje modifikovaný 3'terminální nukleotid.
Modifikovaný nukleotid je vybrán z těch, jejichž báze obsahuje exocyklický amin, který je zahrnut při párování bází nukleotidu s jeho komplementárním nukleotidem.
Typicky primery jsou DNA obsahující jen konvenční nukleotidy. Ze čtyř konvenčních nukleotidových bází zajištěných v DNA adenin, guanin a cytosin obsahují exocyklický primární amin, který je zahrnut při párování bází s komplementární bází.
Ve výhodném aspektu tohoto vynálezu je primer modifikován připojením jedné modifíkátorové skupiny k exocyklickému aminu substitucí za jeden ze dvou vodíků aminové skupiny, které v nemodifikované bázi jsou schopny být zahrnuty při párování bází. Struktury modifikovaných nukleotidů obsahujících modifikovanou adeninovou, guaninovou a cytosinovou bází jsou znázorněny níže, kde
S představuje cukernou část a
R představuje modifikátorovou skupinu.
Předložený vynález není omezen na primery sestávající z konvenčních nukleotidů. Jakými nukleotidový analog, ve kterém část báze obsahuje exocyklický primární amin, který je začleněn při párování bází s komplementární bází, je modifikovaný jak je zde popsáno. Příklady nekonvenčních nukleotidů zahrnují 3-methyladenin, 7-methylguanin, 3-methylguanin, 5-methylcytosin a 5-hydroxymethylcytosin.
Modifikátorová skupina omezuje schopnost modifikované báze participovat při vodíkové vazbě, poněvadž modifikátor substituuje za jeden atom vodíku. Zbývající vodíkový atom může ještě participovat při vodíkové vazbě. Modifikátory mohou tudíž ovlivnit jak kinetiku, tak hydrodynamiku hybridizace. Různé modifikátorové skupiny jsou předvídány, které mají následující vlastnosti.
1. Interferují s, ale nezabraňují, Watson-Crickovu párování bází modifikované báze s komplementární bází.
2. Interferují s, ale nezabraňují, extenzi modifikovaného primeru a
3. umožňují syntézu řetězce komplementárního kextenznímu produktu modifikovaného primeru.
Modifikátorová skupina stericky zasahuje do párování bází a tak do extenze primeru. Takto fyzikální objem modifíkátoru ovlivňuje stupeň interference s hybridizaci. Když je modifikovaný adenosinový nebo cytidinový nukleotid začleněn do dvouřetězcové nukleové kyseliny, modifikátorová skupina se zasune do centrálního prostoru hlavní rýhy. Tudíž dokonce sterickou poruchu duplexní struktury. Avšak vhodné modifikátory nejsou tak veliké, že vodíková vazba je znemožněna nebo enzymatická extenze 3'-hydroxylu primeru je znemožněna. Když je modifikovaný guanosinový nukleotid začleněn do dvouřetězcové nukleové kyseliny, modifikovaná skupina se zasune do vedlejší rýhy, která vytváří méně prostoru k akomodaci objemu modifikátorové skupiny. Tudíž menší modifikátorové skupiny mají přednost pro připojení ke guaninové bázi.
Primerové extenzní produkty, které se užívají jako matrice v následujících amplifikačních cyklech, obsahují modifikovanou bází zavedenou primerem. Modifikátorová skupina je volena tak, že přítomnost modifikované báze v matrici vyvolá terminaci extenze primeru nebo inhibici extenze primeru. Výhodně povaha modifikátorové skupiny by neměla působit růst mutagenních událostí, čímž by se ztratila identita modifikované báze při replikaci od primeru odvozené matrice. Účinky modifikované báze v matrici na extenzi primeru mohou být rutinně testovány podle návodu zde uvedeného a známého v dosavadním stavu techniky (viz např. Gniazdowski a Cera, 1996, Chem. Rem. 96:619-634).
-8CZ 291525 B6
Modifikované skupiny R, které splňují výše uvedené vlastnosti jsou vhodné pro použití při metodách tohoto vynálezu. Výhodné modifikátorové skupiny mají strukturu
I
Rt -C-R2
I
H kde R, a R2 představují nezávisle vodík, Cj-Cio alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu.
Alkylová skupina může být rozvětvená nebo lineární. Větší alkylové skupiny až alespoň k C20 mohou být také použity.
Při výhodném provedení R je 2-naftylmethylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina. Výhodné substituované benzylové skupiny mají strukturu
kde R3 představuje Ct-C6 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, výhodněji C1-C4 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu. C1-C4 rozvětvená nebo lineární alkylová skupina jsou methyl, ethyl, propyl, butyl, izopropyl, izobutyl, terc.butyl a podobně. Methyl a terc.butyl jsou výhodnými alkylovými skupinami. Výhodně je R3 připojen v para poloze.
Zvlášť výhodné modifikátorové skupiny R jsou znázorněny dále:
benzyl p-methylbenzyl
p-methoxybenzyl o-nitrobenzyl
2-naftylmethyl
Početné vhodné modifikátorové skupiny jsou popsány v příkladech provedení. Obecně empirická selekce příslušné vhodné modifikátorové skupiny ze třídy popsaných sloučenin může být provedena rutinně odborníky v oboru podle zde uvedeného návodu. Výhodně vhodnost příslušné
-9CZ 291525 B6 skupiny je určena empiricky za použití modifikovaných primerů při amplifikační reakci. Úspěšná amplifikace indukuje jak to, že modifikovaná báze neinhibuje zcela extenzi primerů, tak i to, že přítomnost modifikované báze v odvozeném příměrovém templátu nevyvolá terminaci extenze primerů. Redukce příměrového dimeru je určena jak je popsáno v příkladech provedení.
Primery s fotolabilní modifikací
V alternativním provedení vynálezu jsou primery modifikovány jednou nebo více fotolabilními skupinami, které mohou být odstraněny vystavením zářením potom, kdy reakce dosáhla vysokoteplotních reakčních podmínek, které zajišťují specifičnost. Poněvadž modifikátor je odstraněn před extenzí primerů, modifikovaný primer nemusí být extendovatelný před odstraněním skupiny. Příklady fotolabilních modifikátorů, které mohou být použity při metodách tohoto vynálezu jsou popsány v Pillai, 190, „Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis“ Synthesis: 1—26.
Výhodně jsou fotolabilní primery tohoto vynálezu modifikovány na 3' terminálu nukleotidu připojením jedné nebo dvou o-nitrobenzylových skupin:
no2
U primerů modifikovaných připojením jedné nitrobenzylové skupiny k exocyklickému primárnímu aminu části báze, výsledný sekundární amin stále ještě může participovat při párování bází, jestliže je aminová skupina otočena tak, že zbývající vodík je orientován směrem ke komplementární bázi. Jak je popsáno v příkladech, tyto primery mohou být použity při amplifikací jak s nebo bez odstranění ozářením UV světlem.
Primery modifikované připojením dvou nitrobenzylových skupin k exocyklickému aminu báze nemohou být extendovány. Inhibice pravděpodobně vyplývá z nemožnosti modifikované báze podstoupit párování bází, které je vyloučeno, poněvadž oba vodíky exocyklického aminu jsou nahraženy objemnými nitrobenzylovými skupinami. Použití primerů modifikovaných dvěma nitrobenzylovými skupinami při amplifikací, ve které reakční směs byla vystavena UV záření po dobu dostatečnou k odstranění nitrobenzylových skupin, čímž se umožní uskutečnění extenze primerů, je popsáno v příkladech provedení.
Při alternativním provedení se modifikátorová skupina připojí ke kruhovému dusíku. Primery modifikované připojením nitrobenzylové skupiny ke kruhovému dusíku báze nemohou být extendovány vlivem nemožnosti modifikované báze podstoupit párování bází. Odstranění nitrobenzylových skupin vystavením UV záření umožňuje uskutečnění extenze primerů.
Použití fotolabilních primerů, které nemohou být extendovány, dokud se neodstraní modifikátorová skupina, v podstatě zajišťuje během nespecifických předreakčních podmínek. Reakční směs je ozářena a primery deblokovány jen po zvýšení reakční teploty na teplotu, která zajišťuje specifičnost reakce.
Syntéza modifikovaných primerů
Syntéza modifikovaných primerů se provádí za použití standardních chemických prostředků dobře známých v dosavadním stavu techniky. Metody zavádění těchto modifikátorů mohou být rozděleny do čtyř skupin.
-10CZ 291525 B6
1. Modifikátor může být zaveden použitím modifikovaného nukleosidu jako DNA syntézního nosiče.
2. Modifikátor může být zaveden použitím nukleosidu jako je fosforamidit.
3. Modifikátor může být zaveden použitím reagentu během DNA syntézy (například benzylaminové zpracování konvertibilního amiditu, když je začleněn do DNA sekvence).
4. Postsyntetická modifikace. Modifikátor může být zaveden jako reaktivní reagent, když je ve styku se syntetickou DNA.
Syntéza příslušných modifikovaných primerů je popsána v příkladech provedení. Další modifikované primery mohou být syntetizovány za použití standardních syntézních metod analogickým způsobem.
Výhodně jsou modifikované primery syntetizovány za použití syntézního nosiče, derivatizovaného skla s řízenými póry (CPG). Obecné reakční schéma pro syntézu derivatizovaného dA CPG je znázorněno na obr. 6. Příslušné modifikátorové skupiny mohou být přidány použitím příslušného alkylhalogenidového, benzylhalogenidového, substituovaného benzylhalogenidového, methylnaftylhalogenidového nebo substituovaného methylnaftylhalogenidového alkylačního prostředku. Syntézy benzyl a p-terc.butylbenzyl-dA CPG se popisují v příkladech 1 až 2 sledujících schéma znázorněné na obr. 6.
Alkylace exocyklické aminoskupiny může být provedena použití metod analogických k methylaci popsaného vGriffin a jsou popsány vAritoma a kol., 1995, J. Chem. Soc. Perchim Trans. 1:1837-1849.
Amplifikace užívající modifikované primery
Způsoby tohoto vynálezu zahrnují provádění amplifikace na bázi primerů užívající modifikované primery podle tohoto vynálezu. Obecně modifikované primery mohou být nahraženy za nemodifikované primery obsahující tytéž nukleotidové sekvence při amplifikaci na bázi primerů bez změny reakčních podmínek amplifikace. Ovšem odborník v oboru rozpozná, že rutinní malá reoptimizace reakčních podmínek může být při některých reakcích výhodná.
Při výhodném provedení se modifikované primery podle tohoto vynálezu používají při reakcí polymerázového řetězce (CPR). Avšak vynález není omezen na nějaký vhodný amplifikační systém. Modifikované primery podle tohoto vynálezu mohou být použity v jakémkoli amplifikačním systému na bázi primerů, ve kterém může být vytvořen příměrový dimer nebo nespecifický amplifikační produkt. Příklady zahrnují amplifikační metody popsané v odkazech výše uvedených Jako jsou vyvinuty jiné systémy, tyto systémy se mohou vylepšit prováděním tohoto vynálezu.
Metody podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro amplifikaci buď DNA nebo RNA. Například amplifikace RNA užívající reverzní transkripci/reakce polymerázového řetězce (RT-PCR) je dobře známa v dosavadním stavu techniky a popsána v US patentech číslo 5 322 770 a 5 310 652, Myers a Gelfant, 1991, Biochemistry 30 (31 ):7661-7666, Young a kol., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886, a Mulder a kol. 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300.
Při amplifikaci na bázi primeru se provádí extenze primeru typicky při zvýšené teplotě za použití termostabilního enzymu jako je termostabilní DNA polymeráza. Enzym iniciuje syntézu na 3' konci primeru a probíhá ve směru k 5' konci matrice, dokud syntéza nekončí. Čištěné termostabilní DNA polymerázy užitečné při amplifikačních reakcích jsou dobře známy ve stavu techniky, ale nejsou tím omezeny, enzymy popsané v US patentu č. 4 889 818, US patentu č. 5 079 352, US patentu č. 5 352 600, US patentu č. 5 491 086, WO 91/09 950, WO 92/03 556,
-11CZ 291525,B6
WO 92/06 200, WO 92/06 202, WO 92/09 689, a v US patentu číslo 5 210 036. Přehled termostabilních DNA polymeráz je uveden v Abromson, 1995, v PCR Strategies, (ED. M. A. Innis a kol.), str. 39-57, Academie Press, San Diego.
Při výhodném provedení, zejména pro amplifikaci DNA se amplifikace provádí za použití revezibilně inaktivovaného enzymu, jak je popsáno. Použití reverzibilně inaktivovaného enzymu, který je reaktivován za vysokoteplotních reakčních podmínek, dále redukuje nespecifickou amplifikaci inhibici extenze primeru před začátku reakce. Reverzibilní inaktivovaná termostabilní DNA polymeráza vyvinutá a vyráběná Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) a prodávaná Perkin Elmer (Norwalk, CT), je popsána v Birch a kol., 1996, Nátuře, 381 (6581): 445-446.
Účinek modifíkátorové skupiny na schopnost enzymu extendovat primer je závislý zčásti na příslušném enzymu a zčásti na vybraných reakčních podmínkách, na příklad Tth DNA polymeráza je permisivnější, když Mn2+ se použije jako dvojmocný kation jako při některých RNA amplifikacích, spíše než Mg2+. Odborník v oboru ví, že při rutinní selekci vhodné modifíkátorové skupiny budou brány v úvahu enzym a reakční podmínky.
Příkladné přípravné metody vhodné pro amplifikační reakce jsou dobře známy v dosavadním stavu techniky a plně popsány ve zde citované literatuře. Vhodná použití metoda není kritickou částí tohoto vynálezu. Odborník v oboru může optimalizovat reakční podmínky pro použití známých příkladných přípravných metod.
Metody analyzování amplifíkované nukleové kyseliny jsou dobře známy ve stavu techniky a plně jsou popsány ve zde citované literatuře. Příslušná použitá metoda není kritickou částí tohoto vynálezu. Odborník v oboru může vybrat vhodnou analýzní metodu v závislosti na aplikaci.
Výhodná metoda pro analýzu amplifikační reakce je monitorování růstu celkového množství dvouřetězcové DNA v reakční směsi, jak je popsáno v Higuchi a kol., 1992, Bio/Technologicy 10:413-417, Higuchi a kol. 1993, Bio/Technology 11:1026-1030, Evropské patentové publikace č. 512 334 a 640 828. Při této metodě, označované zde jako „kinetická PCR“ detekce dvouřetězcové DNA spočívá na zvýšené fluorescenci, kterou ethidiumbromid (EtBr) a jiné DNA vazební značkovače vykazují když jsou vázány k dvouřetězcové DNA. Amplifikace se provádí v přítomnosti značkovače. Vzrůst dvouřetězcové DNA, vyplývající ze syntézy cílových sekvencí, vede k zaznamenatelnému růstu fluorescence, který je monitorován během amplifikace. Tak tyto metody umožňují monitorování postupu amplifikační reakce.
V kinetické PCR, měřená fluorescence závidí na celkovém množství přítomné douřetězcové DNA, ať vyplývající z nespecifické amplifikace nebo z amplifikace cílové sekvence. Monitorování fluorescence umožňuje měření vzrůstu celkového množství dvouřetězcové DNA, ale vzrůst vyplývající z amplifikace cílové sekvence není měřen nezávisle od vzrůstu vyplývajícího z nespecifického amplifikačního produktu.
Modifikované primery tohoto vynálezu jsou zvlášť užitečné při kinetické PCR, poněvadž nejen snižují množství vytvořeného příměrového dimeru, ale také brzdí tvorbu zjistitelných množství příměrového dimeru. Zpoždění tvorby příměrového dimeru až po významném vzrůstu cílové sekvence umožňuje nezávislé monitorování amplifikace cílových sekvencí a minimalizuje interferenci od příměrového dimeru.
Kity
Předložený vynález se také týká kitů (sestav), multikontejnerových jednotek zahrnujících užitečné komponenty pro provádění předloženého způsobu. Užitečné kity obsahují primery, z nichž alespoň jeden je modifikován, jak je zde popsáno, pro amplifikaci nukleové kyseliny.
-12CZ 291525.B6
Jiné volitelné komponenty kitu zahrnují například prostředek pro katalýzu syntézy extenzního produktu primeru, substrátové nukleosidové trifosfáty, vhodné reakční pufry a instrukce pro provádění tohoto způsobu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza příměrů modifikovaných benzylovou skupinou
Primery modifikované adicí benzylové skupiny byly syntetizovány jedním z dvou postupů, které jsou dále popsány. Primery modifikované na 3'terminálu báze, byly syntetizovány za použití N6-benzyldeoxyadenosin skla s řízenými póiy (CPG) k iniciaci syntézy DNA. Primery modifikované v interní bázi byly syntetizovány za použití N6-benzyldeoxyadenosinfosforamiditu.
V tomto příkladu jsou používány následující standardní zkratky:
DMAP 4-dimethylaminopyridin
DMF N,N-dimethylformamid
TEA triethylamin
EDC l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochlorid
THF tetrahydrofuran
DMT 4,4'-dimethoxytrityl
LCAA-CPG sklo s póry s řízenými alkylamino dlouhým řetězcem
I. Syntéza N6-benzyldeoxyadenosin CPG
Stupeň 1: Syntéza N6-benzoyl, N6-benzyl, 5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu
Do N6-benzoyl-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyacenosinu (657 mg, 1,0 mmol, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), byl přidán pyridin (10 ml) a směs byla vysušena odpařením za vakua.
To bylo opakováno. Výsledná pěna byla rozpuštěna v bezvodém DMF (15 ml, Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI) a ochlazena na 5 °C. Hydrid sodný (44 mg, 1,1 mmol, 1,1 ekv., 60%ní disperze voleji) byl přidán pod argonovou atmosférou a míchán při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Benzylbromid (143 mikrolitrů, 206 mg, 1,2 mmol, 1,2 ekv., Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) byl přidán během 2 minut a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Směs byla vysušena odpařením za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a vodu (každého 10 ml) a extrahován. Vodná fáze byla reextrahována ethylacetátem (10 ml) a sloučené extraktory byly vysušeny nad bezvodým síranem hořečnatým, zfiltrovány a odpařeny.
Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (75 g) za použití methanolu, triethylaminu, methylenchloridu (3:0,5:96,5). Frakce obsahující produkt byly sloučeny a vysušeny odpařením, čímž se získal očekávaný N6-benzoyl-N6-benzyl-5'-O-DMT-2'deoxyadenosin (410 mg, 54 %). Struktura produktu byla potvrzena NMR.
Stupeň 2: Sukcinylace
Do N6-benzoyl-N6-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu (295 mg, 0,39 mmol) byl přidán pyridin (10 ml) a směs byla vysušena odpařením za vysokého vakua. Tento stupeň byl opakován. Byl přidán čerstvý bezvodý pyridin (10 ml) spolu sanhydridem kyseliny jantarové (200 ml,
-13CZ 291525 B6 mmol, 5,0 ekv.) a DMAP (24 mg) a roztok byl míchán pod argonovou atmosférou přes noc při teplotě místnosti. Objem rozpouštědla byl odstraněn za vakua a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid (20 ml) a roztok citranu sodného (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) a extrahován.
Vodná fáze byla extrahována dalším methylenchloridem (20 ml) a sloučené extrakty byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a vysušeny odpařením. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (4,5 g) za použití ethylacetátu, triethylaminu, methylenchloridu (32:1:67), čímž se získal 3'-sukcinátester N6-benzoyl-N6-benzyl-3'-O-sukcinát-5'-ODMT-2'-deoxyadenosin (247 mg, 74 %).
Stupeň 3: Derivatizace CPG
Kyselinou promyté CPG bylo připraveno následně: LCAA-CPG (1,0 g, LCA 00500C, 50 nm, 88,6 mol/g, CPG lne., Failfield, NJ) bylo promyto dichloroctovou kyselinou v dichlormethanu (2%ní, 20 ml) periodickým vířením po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Kyselinou promyté CPG bylo zfiltrováno na skleněné fritě a promyto dichlormethanem až bylo bez kyseliny. Prášek byl vysušen na vzduchu, pak vysušen za vakua při teplotě místnosti přes noc.
Vazba modifikovaného nukleosidintermediátu ke kyselinou promytému CPG byla provedena následovně. Do roztoku N6-benzoyl-N6-benzyl-3'-0-sukcinát-5'-0-DMT-2'-deoxyadenosinu (170 mg, 0,2 mmol) připraveného jak je výše popsáno, v dichlormethanu (10 ml) byl přidán TWA (100 mikrolitrů) a roztok byl koncentrován na asi 5 ml pod atmosférou argonu. Postupně byly přidány DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 ekv.), TEA (100 mikrolitů), ECC (384 g, 2,0 mmol, 10 ekv.) a kyselinou promyté CPG. Byl přidán bezvodý pyridin (5 ml) a směs byla uzavřena a třepána 3 dny při teplotě místnosti. CPG bylo odfiltrováno za vakua a promyto důkladně izopropanolem, pak dichlormethanem, vysušeno vzduchem, pak za vakua po dobu 1 hodiny.
Úprava čepičkou derivatizovaného CPG byla provedena následovně. Do suchého derivatizovaného CPG byly přidány roztoky Cap A a Cap B (každý 5 ml, acetanhydrid/2,6-lutidin/THF a 10%ní N-methylimidazol v THF, Glen Research DNA synthesis reagens, Sterling, VA) a směs byla třepána po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. CPG bylo zfiltrováno za vaku a promyto důkladně izopropanolem, pak dichlormethanem, vysušeno vzduchem a pak vysušeno za vakua přes noc.
II. Syntéza N6-benzyldeoxyadenosinfosforamiditu
N6-benzoyl-N6-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosin byl syntetizován jak je výše popsáno. Do N6-benzoyl-N6-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu (196 mg, 0,26 mmol) v suchém THF (8 ml) byl přidán diizopropylethylamin (350 mikrol., 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 ekv.) a 2kyanethyl-N,N-diizopropylchlorfosforamidit (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 ekv., Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI), a směs byla míchána po dobu 30 minut při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou. Rozpouštědlo bylo odstraněno za vaku a zbytek byl rozdělen mezi roztok hydrogenuhličitanu sodného (5%ní, 20 ml) á ethylacetát (20 ml). Organická fáze byla promyta roztokem hydrogenuhličitanu, vodou a nasycenou solankou (každý 20 ml) popořadě, vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena. Zbytek byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (4 g) za použití směsi aceton/hexan/TEA (34:65:0,7), čímž se získal požadovaný fosforamidit (248 mg, 100 %).
III. Syntéza DNA, čištění a analýza
Benzylem derivatizovaný adenosin CPG (25 mg, 1,0 mol) byl převeden do prázdných syntézních kolon (Glen Research Sterling WA) a ty byly použity k přípravě oligonukleotidů na ABI 374 DNA syntetizéru (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) za použití konvenčních syntézních a deprotekčních podmínek. Surová DNC-DNA byla vyčištěna a
-14CZ 291525 B6 převedena na 5'-hydroxy-DNA standardním DMT on/off HPLC za použití Rainin Pure - DNA kolony na Rainin HPLC systému (Rainin Instrument CO., Wobum, MA). Oligonukleotidy byla analyzovány za použití ABI kapilárního elektroforézního systému (Perkin Elmer, Applied
Biosystems Division, Foster City, CA) nebo denaturační aniontoměnné HPLC chromatografie na
Dionex Nukleopac koloně (Dionex Corp., Sunivale, CA).
Podobně byla provedena syntéza interně modifikovaných primerů za použití nemodifikovaného CPG a modifikovaného fosforamiditu, jak je výše uvedeno.
Příklad 2
Syntéza primerů modifikovaných terc.butylbenzylskupinou
Předložený příklad popisuje syntézu primerů modifikovaných na 3'terminálu adenosinu pterc.butylbenzyovou skupinou. Modifikované primery byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití N6-(p-terc.butylbenzyl)deoxyadenosin CPG. Syntézy derivatizovaného CPG je popsána dále.
Stupeň 1: Syntéza N6-benzoyl-N6-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosinu
Do N6-benzoyl-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosinu (658 mg, 1,0 mmol) byl přidán DMF (bezvodý, 10 ml) a odpařeno do sucha. To bylo opakováno. Čerstvý DMF (10 ml) byl přidán pod argonovou atmosférou. Byl přidán hydrid sodný (44 mg, 60%ní v oleji, 1,1 mmol) a směs byla míchána po dobu 0,5 hodiny při teplotě místnosti. Po kapkách byl přidán 4-(tercbutyl)benzylbromid (272 mg, 1,2 mmol) a mícháno při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a vodu (20 ml každého). Organická fáze byla promyta vodou (třikrát, 20 ml), vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha. Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (100 g), za použití směsi methylenchlorid:methanol:triethylamin 96,5:3:0,5, čímž se získal N6-benzoyl-N6-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin (229 mg, 28,5 %).
Stupeň 2: Sukcinylace
N6-benzoyl-N6-(p-terc.butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityI)-2'-deoxyadenosin (217 mg, 0,27 mmol) byl zpracován s anhydridem kyseliny jantarové (135 mg, 5 ekv.) a DMAP (17 mg, 0,5 ekv.) v pyridinu (10 ml). Zpracování a chromatografie jak je popsáno v příkladu 1 daly N6benzoyl-N6-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin, 3'-O-sukcinát (199 mg, 82 %).
Stupeň 3: Derivatizace CPG
Sukcinát (180 mg, 0,2 mmol) ze stupně 2 byl zpracován s kyselinou promytým LCAA-CPG jak je popsáno v příkladu 1. CPG byl upraveno čepičkou a vakuově vysušeno, čímž se získal N6-benzoyl-N6-(p-terc.butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl}-2'-deoxyadenosin, 3'-O-sukcinát derivatizovaný CPG, (1,065 g).
-15CZ 291525.B6
Příklad 3
Syntéza primeru modifikovaných methylovou skupinou
Primery modifikované v 3'terminálu adenosinu methylovou skupinou byly syntetizovány za použití N6-methyl dA CPG (22 mg, 1 mikron., Glen Research, Sterling, WA). N6-methyl dA CPG byl umístěn v prázdné syntézní koloně a primery byly připraveny podle standardních podmínek syntézy a deprotekce. Primery byly vyčištěny za použití DMT on/off HPLC postupu jak je popsáno v příkladu 1.
Příklad 4
Syntéza fotolabilních modifikovaných primerů
Předložený vynález popisuje syntézu primerů modifikovaných na 3'terminálu adenosinu buď jednou nebo dvěma nitrobenzylovými skupinami. Modifikované primery byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití buď mononitrobenzyl dA CPG nebo bisnitrobenzyl dA CPG.
I. Mononitrobenzylované primery
Obecná metoda pro syntézu N6-benzoyl-N6-benzyl-2'-deoxyadenosinem derivatizovaného CPG (viz příklad 1) byla aplikována na syntézu N6-benzoyl-N6-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosinem derivatizovaného CPG substitucí ortho-nitrobenzylbromidu jako alkylačního prostředku. Následné stupně pro CPG byly identické jako ty, které jsou popsány v příkladu 1 s přídavkem, za meziprodukty byly chráněny od okolního světla zabalením reakčních baněk do hliníkové fólie.
Podle syntézy derivatizovaného CPG byly primery syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, ale byly izolovány extrakcí na nerozpustném nosiči za použití Nensorb Prep prodávaných kolon (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Company, Boston, NA) za použití protokolů opsaných výrobcem.
II. Bisnitrobenzylované primery
Bisnitrobenzyldeoxyadenosin CPG bylo syntetizováno jak je dále popsáno. Podle syntézy derivatizovaného CPG byly primery syntetizovány a čištěny, jak je popsáno pro mononitrobenzylové primery.
Stupeň 1: Syntéza 5'-O-DMT-N6-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosinu
2-Deoxyadenosinmonohydrát (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) byl vysušen s bezvodým pyridinem (2x10 ml) za vakua. Zbytek byl rozpuštěn v bezvodém DMF (10 ml, Aldrich, Milwaukee, WI) pod argonovou atmosférou a byl přidán hydrid sodný (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 ekv., 60%ní disperze voleji) a mícháno po 40 minut při teplotě místnosti. Byl přidán 2-nitrobenzylbromid (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 ekv.) a roztok byl míchán po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. DMF byl odstraněn odpařením za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a vodu (20 ml každého). Vodná fáze byla extrahována ethylacetátem (20 ml) a sloučené extraktory byly promyty vodou (20 ml) a vysušeny nad síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (50 g, za použití 3%ního MeOH v CH2CI2), čímž se získal 2'-deoxy-N6-bis-ortho-nitrobenzyladenosin (320 mg, 30 %).
-16CZ 291525.B6
Do 2'-deoxy-N6-bis-ortho-nitrobenzyladenosinu (200 mg, 0,518 mmol) byl přidán bezvodý pyridin (10 ml) a odpařeno do sucha. Pyridin (10 ml) byl přidán, načež následoval přídavek 4,4'dimethoxytritylchloridu (900 mg, 2,3 mmol, 4,5 ekv.) a triethylaminu (280 mg, 2,76 mmol, 4,0 ekv.) a směs míchána při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou po dobu 5 hodin. Byla přidána voda (0,5 ml) a mícháno po dobu 20 minut. Směs byla rozdělena mezi ether a vodu (20 ml každého) a vodná fáze byla reextrahována etherem (20 ml). Extrakty byly sloučeny a promyty vodou (20 ml) a vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Materiál byl vyčištěn chromatografií na silikagelu (4 g, za použití 0,7 až 2,0 5%ního methanolu v methylenchloridu), čímž se získal 5'-0-DMT-N6-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosin, (121 mg, 33 %).
Stupeň 2: Suke inyláce
5'-0-DMT-N6-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosin (121 mg, 0,145 mmol) byl vysušen odpařením s bezvodým pyridinem (2 x, 3 ml). Pyridin (3 ml), anhydrid kyseliny jantarové (58 mg, 0,58 mmol, 4 ekv.) a DMAP (11 mg, katalytický) byly přidány a roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 3 dnů.
Roztok byl odpařen za vakua a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid (10 ml) a sodnocitrátový pufr (0,1 M, pH 5,0, 10 ml). Organická fáze byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha. Surový produkt byl vyčištěn chromatografií na silikagelu (2 g, za použití EtOAc:CH2Cl2:TEA, 32:67:1 10 ml, pak MeOH:CH2Cl2, 3:97, 25 ml), čímž se získala bleděžlutá pěna 5-O-DMT-N6-bis-ortho-nitrobenzyl-2-deoxyadenosin-3'-Osukcinátu (138 mg, 99,5 %).
Stupeň 3: Derivatizace DPG
Kyselinou promyté LCAA-CPG bylo připraveno jak v příkladu 1.
Spojení modifikovaného nukleosidového meziproduktu s kyselinou promytým CPG bylo provedeno následovně. 5'-0-DMT-N6-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-adenosin-3'-0-sukcinát (37 mg, 0,04 mmol) byl zpracován sTEA (16(1) v jantarově zbarvené skleněné ampuli a odpařen. K tomuto zbytku byl přidán bezvodý pyridin (1,5 ml), TEA (2 mikrol.), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04 mmol) a kyselinou promyté LCAA-CPG (200 mg) a směs byla třepána na oběhovém mixéru po dobu 3 dnů při teplotě místnosti. CPG bylo zfiltrováno za sníženého tlaku a promyto důkladně izopropanolem, pak methylenchloridem, vysušeno na vzduchu, pak vysušeno za vakua po dobu 1 hodiny.
Opatření čepičkou derivatizovaného CPG bylo provedeno jak je popsáno v příkladu 1.
Příklad 5
Amplifíkace za použití efektu modifikovaných primerů pomocí modifikovaného nukleotidu
K demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimeru byla provedena srovnání amplifikací HIV-1 RNA za použití jak modifikovaných primerů tak nemodifikovaných primerů. Navíc k určení účinku pomocí modifikovaného nukleotidu na snížení příměrového dimeru byly provedeny amplifíkace užívající 3 různé protisměrně modifikované primery, které se lišily jen v lokaci modifikované báze.
Cílová nukleová kyselina
HIV-1 RNA matrice byly syntetizovány za použití HIV-1 RNA transkripčního vektoru v podstatě jak je popsáno v Mulder a kol., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292:300.
-17CZ 291525 B6
Primery
Amplifikace byly provedeny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5'-3'směru. Protisměrný primer RAR1032MB (sekv. id. č.:l) a podměmý primer RAR1033MB (sekv. id. č.:2) amplifikují produkt 175 párových bází odpovídajících nukleotidovým polohám 29563130 sekvence HIV-1 referenčního řetězce HXB2 (GenBank uložení č. K.03455).
H1V-1 amplifikační primer primer sekv. id. č.
sekvence
RAR 1032MB RAR1033MB
CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA
CCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA
Výše uvedené určení primerů se týká nemodifikovaných primerů. Nemodifikované primery byly biotinylovány na 5' konci.
Modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, čímž sestávaly ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, ale obsahovaly benzylovaný adenosin buď v terminální poloze 3' nebo v poloze jednoho nebo tří nukleotidů protisměrně od 3' konce. Modifikované formy primerů jsou zde určeny následovně:
Modifikované HIV-1 amplifikační primery primer
RAR1032MBA1
RAR1033MNA2
RAR1032MBA4
RAR1033MBA1 sekv. id. č. poloha modifikovaného nukleotidu
3' zakončení
1 od 3'zakončení
3 do 3'zakončení
3' zakončení
Amplifikace
Amplifikace byly provedeny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:
100 kopií HIV matrice RNA, mm tricinu (pH 8,33),
110 mm KOAc,
300 mikroM každého dATP, dCTP, a dGTP, mikroM dTTP,
500 mikroM dUTP, mikroM každého primerů,
3,5 mm Mn (OAc)2,
13%ní glycerol.
jednotek ZO5 DNA polymerázy*) a
2,0 jednotky UNG**)
*) Popsáno v US patentu č. 5 455 170 **) Vyráběno a vyvíjeno Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT
Amplifikační teplotní cyklování bylo prováděno vTC480 DNA tepelného cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.
-18CZ 291525 ,B6
| Předreakční inkubace | 45 °C po dobu 4 minut |
| Reverzní transkripce 46 cyklů: | 60 °C po dobu 20 minut denaturace při 94 °C po dobu 45 sekund chlazení/extenze při 60 °C po dobu 45 sekund |
| Finální extenze Postreakční udržování | 60 °C po dobu 7 minut, 10 °C až do analýzy (po krátkou dobu). |
Detekce amplifikovaného produktu
Přítomnost amplifikovaného produktu byla zjišťována gelovou elektroforézou následně. Reakční produkt byl francionován za použití agarózového gelu (100 ml 3%ního NuSieve a 0,5%ního Sea Chem) a IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M disodné EDTA) průběžný pufr, byly použity. Byl přidán ethidiumbromid (0,5 mikrogramů/ml) k zabarvení jakékoli přítomné DNA. Elektroforéza byla prováděna při 100 V po dobu asi 1 hodiny. Ethidiumbromidem zabarvené pásy DNA byly vizualizovány za použití UV záření.
Výsledky
Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou znázorněn na obr. 1. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikací za využití kombinací nemodifikovaných a modifikovaných primerů jsou znázorněny v následující tabulce. Pásy odpovídající žádanému HIV produktu jsou označeny na obr. šipkou. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, zejména příměrovému dimeru.
| Primery | Pruh číslo | |
| Protisměrný | posměmý | |
| RAR1032MB | RAR1033MB | 1 |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MB | 2 |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MB | 3 |
| RAR1032MBA4 | RAR1033MB | 4 |
| RAR1032MB | RAR1033MBA1 | 5 |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MBA1 | 6 |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MBA1 | 7 |
| RAR1032MBA4 | RAR1033MBA1 | 8 |
Poněvadž tvorba příměrového dimeru soutěží s tvorbou určeného amplifikačního produktu, snížení příměrového dimeru má typicky za následek průvodní vzrůst v množství vytvořeného žádaného produktu. Tak účinek modifikovaných primerů je vidět z porovnání množství vytvořeného příměrového dimeru ve vztahu k množství vytvořeného za použití nemodifikovaných primerů a ze srovnání množství určeného cílového produktu ve vztahu k množství vytvořeného za použití nemodifikovaných primerů.
Srovnání výsledků za použití dvou nemodifikovaných primerů (pruh 1) s výsledky za použití jednoho 3'-modifikovaného primeru (pruhy 2 a 5) a s výsledky za použití dvou 3'-modifikovaných primerů (pruh 6) indikuje, že snížení příměrového dimeru bylo získáno za použití jednoho nebo dvou modifikovaných primerů. Při amplifikacích užívajících jeden 3'modifikovaný primer je vidět malý rozdíl ve snížení příměrového dimeru, který závisí na tom, který to byl modifikovaný primer. Použití dvou modifikovaných primerů (6) mělo za následek jak největší snížení příměrového dimeru tak zaznamenatelný růst množství amplifikované cílové sekvence.
Účinek polohy modifikovaného nukleotidu je zřejmý v porovnání pruhů 6 až 8. Snížení příměrového dimeru získaného použitím primeru modifikovaného v nukleotidu přilehlém k 3'terminálu nukleotidu (pruh 7) bylo ekvivalentní snížení získaného použitím primeru modifikovaného
-19CZ 291525 B6 v 3'terminálu nukleotidu (pruh 6), zatímco zlepšení získaného použití primeru modifikovaného v nukleotidu při báze proti směru od 3'terminálu nukleotidu (pruh 8) bylo poněkud menší.
Příklad 6
Další amplifikace užívající modifikované primery
Účinek polohy modifikovaného nukleotidu
Pro další demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimerů byla provedena srovnání amplifíkaci HCV RNA užívajících jak modifikované primery tak nemodifikované primery v podstatě jak bylo výše popsáno. Amplifikace byly prováděny za použití tří různě modifikovaných posměmých primerů, které se lišily jen v lokaci modifikované báze.
Cílová nukleová kyselina
HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru, jak je popsáno v Young a kol., 1993, J. Clin. Microbio. 31 (4):882-886.
Primery
Amplifikace byly prováděny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5' až 3' směru. Protisměrný primer ST280A (sekv. id. č.: 3) a posměmý primer ST778AA (sekv. id. č.: 4) amplifikují produkt s 240 páry bází z 5'netranslatované oblasti HCV genomu.
HCV amplifikační primery
Primer sekv. id. č. nukleotidová sekvence
ST280H ST778AA
GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA
Výše uvedená primerová určení se vztahují k nemodifikovaným primerům. Modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, kteréžto sestávají ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, ale obsahují benzylovaný adenosin na buď 3'terminální polohy nebo v poloze 1 nebo 3 nukleotidy proti směru 3' zakončení. Modifikované formy primerů jsou označeny následovně:
Modifikované HCV amplifikační primery
Primer
ST280ABA1
ST778AABA1
ST778AABA2
ST778AABA4 sekv.id.č. poloha modifikovaného nukleotidu
3'zakončení
3'zakončení
1 od 3' zakončení
3 do 3'zakončení
Amplifikace a analýza
Amplifikace byly prováděny v podstatě jak je popsáno v příkladu 3, ale za použití 100 kopií HCV RNA matrice. Gelová analýza amplifíkovaného produktu byla prováděna jak je popsáno v příkladu 3.
-20CZ 291525.B6
Výsledky
Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou uvedeny na obr. 2. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikaci užívající kombinace nemodifikovaných a modifikovaných primerů jsou znázorněna v tabulce dále uvedené. Pásy odpovídající určenému HCV produktu jsou značeny na obr. šipkou. Ostatní pásy v gelu odpovídající nespecifickému amplifikačním produktu a zejména příměrovému dimeru.
| Primery | pruh číslo | |
| protisměrný | posměmý | |
| ST280A | ST778AA | 1 |
| ST280A | ST778AABA1 | 2 |
| ST280A | ST778AABA2 | 3 |
| ST280ABA | ST778AABA4 | 4 |
| ST280ABA1 | ST778AA | 5 |
| ST280ABA1 | ST778AABA1 | 6 |
| ST280ABA1 | ST778AABA2 | 7 |
| ST280ABA1 | ST778AABA4 | 8 |
Poněvadž tvorba příměrového dimeru soutěží s tvorbou určeného amplifikačního produktu, snížení příměrového dimeru vede k typickému průvodnímu vzrůstu množství vytvořeného určeného produktu. Tak účinek modifikovaných primerů může být zřejmý jak ze srovnání množství vytvořeného příměrového dimeru ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů, tak ve srovnání množství vytvořeného určeného cílového produktu ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů.
Získané výsledky byly podobné výsledkům získaných z HIV amplifikaci popsaných v předcházejícím příkladu, ale při HCV amplifikacích byl vzrůst určeného produktu zjevnější než při HIV amplifikacích. Srovnání výsledků za použití dvou nemodifikovaných primerů (pruh 1) s výsledky za použití jednoho 3'-modifikovaného primerů (pruhy 2 a 5) a s výsledky používajícími dva 3'modifikované primery (pruh 6) indikuje, že snížení příměrového dimeru bylo získáno použitím buď jednoho nebo dvou modifikovaných primerů. Použití dvou modifikovaných primerů (pruh 6) mělo za následek u obou největší snížení příměrového dimeru spolu s význačným zvýšením množství amplifikované cílové sekvence. Jako v předcházejícím příkladu malý rozdíl ve snížení příměrového dimeru byl zřejmý u amplifikaci používajících jeden 3'-modifikovaný primer, což záviselo na tom, který primer byl modifikován.
Účinek polohy modifikovaného nukleotidu je vidět ze srovnání pruhů 6 až 8. V podstatě ekvivalentní výsledky byly získány použitím primerů modifikovaných v 3'terminálu nukleotidu (pruh 6), nukleotidu přilehlého k 3'terminálnímu nukleotidu (pruh 7) a nukleotidu 3 báze proti směru od 3'terminálního nukleotidu (pruh 8)’ Tyto výsledky ukazují, že modifikátorová skupina může být připojena ke kterémukoli ze čtyř nukleotidů v 3'konci primerů.
Příklad 7
Amplifikace používající modifikované primery
Účinek modifikátorové skupiny
Pro další demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimeru a pro demonstraci alternativních modifikací primerů byla provedena srovnání amplifikaci HCV RNA
-21CZ 291525.B6 užívajících jak modifikované primery, tak nemodifikované primery, přičemž primery byly modifikovány adicí jedné ze tří různých modifikátorových skupin: benzyl, nitrobenzyl a methyl.
Amplifikační výsledky byly analyzovány dvěma rozdílnými metodami. Při jednom souboru srovnání byla přítomnost příměrového dimeru vyhodnocena gelovou elektroforézní analýzou reakčních produktů. V druhém souboru srovnání byla tvorba příměrového dimeru monitorována během amplifikace pomocí kinetických PCR metod výše popsaných.
Cílová nukleová kyselina
HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru, jak je popsáno v Yung a kol., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886.
Amplifikační primery
Amplifikace byly prováděny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Modifikované primery sestávaly ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primeiy, ale byly modifikovány v 3'terminálu adenosinu adicí methylové skupiny, benzylové skupiny nebo nitrobenzylové skupiny. Primery byly syntetizovány jak je popsáno v dřívějších
| příkladech. Označení pro použití primery je uvedeno níže. | ||
| Primer | sekv. id. č. | modifikace 3' báze |
| ST280A | 3 | nemodifikovaná |
| ST280AMEA1 | 3 | methyl |
| ST280ABA1 | 3 | benzyl |
| ST280ANBA1 | 3 | nitrobenzyl |
| ST778AA | 4 | nemodifikovaná |
| ST778AAMEA | 4 | methyl |
| ST778AABA1 | 4 | benzyl |
| ST778AANBA1 | 4 | nitrobenzyl |
| Amplifikační reakce |
Amplifikace byly prováděny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty: 0,20 nebo 200 kopií HCV RNA matrice, mm tricinu, pH 8,3,
110 mm KOAc,
3,5 mm Mn (OAc)2,
300 mikrom. každý dATP, dCTP, dGTP, mikrom. dTTP,
500 mikrom, dUTP,
250 mm každého primeru,
U rTthx)
UNGX), a % glycerolu.
x) vyrobeno a vyvinuto Hoffmann - La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Tepelné cyklování každé reakční směsi bylo prováděno v GeneAmpR PCR Systém 9600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.
-22CZ 291525,B6
Předreakční inkubace reverzní transkripce 46 cyklů:
°C po dobu 4 minut, °C po dobu 24 minut, finální extenze postreakční udržování denaturace při 94 °C po dobu 30 sekund, zchlazení/extenze při 60 °C po dobu 30 sekund, °C po dobu 7 minut, °C
Detekce amplifikovaného produktu
A. Gelová elektroforéza
Přítomnost amplifikovaného produktu byla určena gelovou elektroforézou následovně. Reakční produkty byly frakcionovány za použití agarózového gelu (100 ml 3%ního NuSieve, 0,5%ního SeaChem, a 0,5 mikrog./ml ethidiumbromidu) a IX TBE (0,089 M tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M disodné EDTA) průběžného pufru.
Elektroforéza byla prováděna pri 100 V přibližně 1 hodinu. Ethidiumbromidem zbarvené pásy DNA byly vizualizovány pomocí UV ozáření.
B. Detekce kinetickou PCR
Při kinetických PCR metodách výše popsaných se přidává k PCR interkalační barvivo jako je ethidiumbromid, který fluoreskuje silněji, když je vmezeřen do dvouřetězcové DNA. Vzrůst dvouřetězcové DNA během amplifikace je monitorován měřením fluorescence barviva během reakce. Poněvadž kinetické PCR metody jen měří vzrůst celkového množství dvouřetězcové DNA, tvorba nespecifických amplifikačních produktů není měřena nezávisle. Aby se měření výskytu nespecifické amplifikace, vyplývající z příměrového dimeru provádělo nezávisle na matricové amplifikaci, byly reakce prováděny bez matriční nukleové kyseliny. Při takových bezmatričních reakcích jakýkoli vzrůst dvouřetězcové DNA je přisouditelný tvorbě matričně nezávislého nespecifického amplifikačního produktu.
Kinetické PCR reakční podmínky byly popsány výše s výjimkou toho, že ethidiumbromid byl přidáván do reakční směsi v koncentraci 1 mikrog./ml. Reakce byly monitorovány měřením fluorescence reakční směsi jak je popsáno v EP 640 828.
Fluorescenční měření byla normalizována oddělením počátečních fluorescenčních měření získaných během cyklu časně při reakci, zatímco fluorescenční měření mezi cykly byla relativně konstantní. Počet cyklů zvolený pro počáteční fluorescenční měření byl stejný pro všechny srovnávané reakce, takže všechna měření představují vzrůsty ve vztahu k stejnému reakčnímu cyklu. Reakční fluorescence bezcílových reakcí zůstávaly relativně konstantní, pokud se netvořil primerový dimer. Při většině reakcí, když se provede dost amplifikačních cyklů, primerový dimer se eventuálně stává detektabilním. Účinek modifikovaných primerů je zřejmý ze srovnání počtu cyklů prováděných, dokud se netvoří primerový dimer, pokud se vůbec tvoří.
Výsledky
Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou uvedeny na obr. 3. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikaci užívajících nemodifikované a tři typy modifikovaných primerů a 200 kopií, 20 kopií nebo 0 kopií HCV RNA jsou uvedeny v následující tabulce (čísla pruhů jsou počítána odleva doprava: pruhy 1 až 30 jsou v homí polovině gelu, pruhy 31 až 60 jsou ve spodní polovině gelu). Navíc značkovače molekulové hmotnosti byly přítomny v pruzích 1 a 31 (Hae III digested Phi X 174 RF DNA, New England Biolabs, Beverly, MA) a v pruzích 30 a 60 (Super LadderLow, 20 bp ladder, Gen Sura, Del Mar, CA). Pásy odpovídající určenému specifickému produktu
-23CZ 291525 B6 jsou označeny na obr. 3 šipkou (asi 230 bp). Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu a zejména příměrovému dimeru.
Čísla pruhů amplifíkačních výsledků uvedených na obr. 3
| Matrice | Primery | Pruhy |
| 200 | nemodifikovaný | 2-5 |
| 200 | methylovaný | 6-9 |
| 200 | benzylovaný | 10-13 |
| 200 | nitrobenzylovaný | 14-17 |
| 20 | nemodifikovaný | 18-21 |
| 20 | methylovaný | 22-25 |
| 20 | benzylovaný | 26-29 |
| 20 | nitrobenzylovaný | 32-35 |
| 0 | nemodifikovaný | 36-41 |
| 0 | methylovaný | 42-47 |
| 0 | benzylovaný | 48-53 |
| 0 | nitrobenzylovaný | 54-59 |
Výsledky ukazují, že amplifikace užívající modifikované primery vedla k většímu množství amplifikované HCV nukleové kyseliny než amplifikace užívající nemodifikované primery. Navíc amplifikace užívající modifikované primery vedly ke snížení příměrového dimeru ve vztahu io k amplifikacím užívajícím nemodifikované primery.
Při kinetických PCR zkouškách byla monitorována fluorescence během reakce. Míra vzrůstu fluorescence potom, kdy vzrůst fluorescence byl zjistitelný, byla přibližně stejná ve všech reakcích, jak je dokázáno tvarem křivky získané grafickým znázorněním fluorescence oproti 15 počtu cyklů (neznázoměno). To ukazuje, že modifikované primery nezjistitelně inhibují účinnost každého amplifikačního stupně po počátečním stavu amplifikace. Reakce se významně lišily v počtu cyklů prováděných před zjistitelným růstem fluorescence.
Pro kvantifikaci rozdílů mezi reakcemi jsou výsledky vyjádřeny v podmínkách počtu 20 amplifíkačních cyklů provedených dokud fluorescence nepřekročila dohodnutou fluorescenční úroveň (AFL). AFL byla zvolena těsně u základní fluorescenční úrovně, ale nad oblastí nahodilých fluktuací u měřené fluorescence, takže reakční kinetika byla měřena během geometrické růstové fáze amplifikace. Akumulace amplifikovaného produktu v pozdějších cyklech inhibuje reakci a event. vede k reakčnímu plato.
Kinetické PCR výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Každá hodnota pro amplifikace 20 nebo 200 kopií cílové matrice představuje průměr 5 replikačních amplifikaci s výjimkou amplifíkací užívajících benzylované primery a 20 kopií cílové látky, která představuje průměr Čtyř replikátů. Každá hodnota pro amplifikace bez matrice představuje průměr 8 replikátů.
Dva mimo 8 replikátů amplifikaci užívající benzylované primery s žádným uvedeným cílem nevedly k formaci příměrového dimeru do konce 46 cyklů. Průměr zbývajících 6 amplifikaci je uveden, což reprezentuje průměr upravený na vytvořený primerový dimer. Upravený průměr není srovnatelný s ostatním hodnotami, které jsou znázorněny vzhledem k vypuštěným údajům.
-24CZ 291525.B6
Cykly k dosažení AFL
| Primer | 0 | Počet cílových kopií 20 | 200 |
| nemodifikovaný | 35 | 36 | 34 |
| methyl | 39 | 38 | 36 |
| nitrobenzyl | 43 | 40 | 37 |
| benzyl | 43x) | 41 | 37 |
x) 2/8 neukázaly tvorbu příměrového dimeru
Údaje ukazují, že modifikované primery zjevně zpožďují amplifikaci cílové nukleové kyseliny tak, že AFL se dosáhne několik cyklů později. Toto zdržení neodpovídá snížení konečného zisku specifického amplifikačního produktu. Všechny amplifikace cílové nukleové kyseliny, jak bylo zjištěno, dosahují plato v 46 cyklech použitých v experimentu a jak je zjevné zodpovídajících údajů z gelové elektroforézní analýzy, konečný výtěžek byl zvýšen použitím modifikovaných primerů.
Údaje ukazují, že zdržení v tvorbě příměrového dimeru bylo významné větší než zdržení v amplifikaci cílové látky. Výhodný efekt primerů je nejjasněji vidět ze srovnání bezcílových amplifikaci a amplifikaci 200 kopií matrice. Při použití nemodifikovaných primerů se vzrůst fluorescence do AFI, vyskytl je jeden cyklus později při amplifikacícli bez cíle, což indikuje, že amplifikace cílové by se obtížně odlišily od tvorby příměrového dimeru. V kontrastu s tím při použití modifikovaných primerů vzrůst fluorescence vlivem příměrového dimeru se vyskytl alespoň 3 cykly později a při užití benzylovaných primerů se vyskytl alespoň 6 cyklů později, když se vůbec vyskytl. Tak mohly být cílové amplifikace detekovány a odlišeny od tvorby příměrového dimeru.
Srovnání bezcílových amplifikaci a amplifikaci 20 kopií matrice ukazuje, že účinek modifikovaných primerů vykazuje stejný model většího zdržení v nástupu příměrového dimeru než je zdržení v cílové amplifikaci. Při použití nemodifikovaných primerů, 20 kopií matrice nemohlo být deletováno. Použití nitrobenzylových a benzylových primerů vede ke zdržení tvorby příměrového dimeru, které je dostatečné tak, aby se umožnila detekce 20 kopií matrice v systému.
Údaje z monitorování fluorescence při každém amplifikačním cyklu (údaje nejsou znázorněny), indikují, že obecně zdržení v tvorbě příměrového dimeru je dostatečné k zábraně tvorby příměrového dimeru od dosažení plato úrovně během 46 cyklů. Takto se ukázalo, že modifikované primery zdržují tvorbu příměrového dimeru dostatečně tak, že amplifikace cílové látky může být dokončena a reakce zastavena před vytvořením významné úrovně příměrového dimeru.
Příklad 8
Fotolabilní primery
K. demonstraci použití fotolabilních příměrových dimerů byly provedeny amplifikace HCV RNA za použití jak modifikovaných primerů tak nemodifikovaných primerů. Modifikované primery byly modifikovány připojením jedné ze dvou nitrobenzylových skupin k oxocyklickému aminu 3'terminálu adeninu.
-25CZ 291525 B6
Amplifikační primery
Primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 4. Označení pro použité primery je uvedeno dále.
| Primer | Sekv. id. č. modifikace 3' báze |
| ST280A 15239 15241 ST778AA 15240 15242 | 3 nemodifikovaný 3 bisnitrobenzyl 3 mononitrobenzyl 4 nemodifikovaný 4 bisnitrobenzyl 4 mononitrobenzyl |
Amplifikační reakce
Pro každý primerový pár byly provedeny reakce užívající zřeďovacích sérií vstupní cílové koncentrace. 2 panely reakcí, každý zahrnující všechny kombinace příměrového páru a vstupní cílové koncentrace, byly provedeny, a v každém reakčním panelu každá reakce obsahující daný primerový pár a cílovou koncentraci, byly reakce provedeny dvojmo. Amplifíkace byly prováděny v 100 mikrol. reakcích obsahujících následující reagenty:
0,10,102, ΙΟ3,104 nebo 105 kopií HCV RNA matrice, mm tricinu, mm KOAc, mm Mn (OAc)2,
200 mikroM každého dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
200 mikroM dUTP,
250 nM každého primerů,
10UrTthx),
U UNGX), a % glycerolu.
x) Vyrobené a vyvinuté Hoffmann-La Roche a prodávané Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Tepelné cyklování každé reakční směsi bylo prováděno v GeneAmp PCR Systém 9600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.
| Předreakční inkubace reverzní transkripce počáteční denaturace 2 cykly: | 50 °C po dobu 5 minut, 60 °C po dobu 30 minut, 95 °C po dobu 1 minuty, denaturace při 95 °C po dobu 15 sekund, ochlazení/extence při 60 °C po dobu 20 sekund, |
| finální extenze | 72 °C po dobu 10 minut. |
Leštěná reakční trubicová víčka (Perkin Elmer, Norwalk, CT) byla použita průběžně. Poté, co reakční teplota byla zvýšena na 60 °C pro stupeň reverzní transkripce, bylo zahřáté víčko odstraněno z PCR patra v bloku tepelného cyklovače a polovina reakčních trubek (jeden kompletní soubor duplikátorových reakcí) byla pokryta aluminiovou fólií. Druhá polovina byla ozářena použitím ruční UV lampy emitující záření o vlnové délce 302 nm (UVP model UVM57, UVP Products, San Gabriel, CA) po dobu 10 minut. Zahřátý obal byl odstraněn a amplifíkace pokračovala.
-26CZ 291525 B6
Výsledky
Výsledky amplifikací byly analyzovány gelovou elekroforézou, jak je výše popsáno. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4. Primery a počet matričních kopií použité v každé reakci jsou indikovány v gelu (log. počtu kopií je uveden). Pásy odpovídající určenému produktu jsou označeny na obr. 4. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, a to zejména příměrovému dimeru.
Srovnání UV ozářeného souboru reakcí ukazuje, že použití modifikovaných primerů vedlo k významnému snížení příměrového dimeru, zejména při nízkém počtu kopií.
Srovnání neozářeného souboru reakcí ukázalo, že použití bisnitrobenzylových primerů vedlo k úplné inhibici amplifikace, jak bylo očekáváno. Amplifikace používající mononitrobenzylové primery nejen daly produkt, ale vykázaly významné snížení příměrového dimeru, což je konzistentní s výsledky získanými v předešlém příkladu.
Příklad 9
Amplifikace užívající p-terc.butylbenzylem modifikované primery
Tento příklad popisuje amplifikací HCV RNA za použití primerů modifikovaných j>terc.butylbenzylovými skupinami.
Cílová nukleová kyselina
HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru jak je popsáno v Young a kol., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886.
Primery
Amplifikace byly prováděny za použití modifikovaných primerů syntetizovaných tak, jak je popsáno v příkladu 2. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5'—3' směru. Použité primery byly modifikované verze protisměrného primerů ST280A (sekv. id. č.: 3) a posměmého primerů ST778A (sekv. id. č.: 4). Modifikované formy primerů jsou zde vyznačeny následovně.
Modifikované HCV amplifíkační primery
Primer
ST280ATBU ST778AATBU sekv. id. č. poloha modifikovaného nukleotidu
3'zakončení
3'zakončení
Amplifikace a analýza
Amplifikace byly provedeny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:
20, 5,2,5,2 nebo 0 kopií HCV matrice RNA, mm tricinu (pH 8,33),
110 mm KOAc,
300 mikroM každého dATP, dCTP a dGTP, mikroM dTTP,
500 mikroM dUTP,
-27CZ 291525 B6 nM každého primerů,
3.5 mm Mn (OAc)213 % glycerolu, jednotek rTtH DNA polymerázy a
8.0 jednotek UNGx).
x) Vyrobeno a vyvinuto Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Amplifikační teplota cyklování bylo prováděno v TC480 DNA tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:
| Předreakční inkubace UNG inaktivace reverzní transkripce 47 cyklů: | 45 °C po dobu 12 minut 90 °C po dobu 30 sekund 60 °C po dobu 20 minut denaturace při 94 °C po dobu 45 sekund, ochlazení/extenze při 60 °C po dobu 70 sekund |
| finální extenze poreakční udržování | 60 °C po dobu 7 minut 10 °C až do analýzy (po krátkou dobu). |
Amplifikační produkty byly analyzovány gelovou elektroforézou, jak je výše popsáno. Výsledky
Amplifikace prováděné u každého cílového matričního počtu byly replikovány následovně: 3 amplifikace byla prováděny za použití 20 kopií cílové matrice, 3 amplifikace byly prováděny za použití 5 kopií cílové matrice, 2 amplifikace byly prováděny za použití 2,5 kopií cílové matrice, 1 amplifikace byla prováděna za použití 2 kopií cílové matrice a 23 amplifikaci bylo prováděno bez přítomného cíle. Všechny matricové pozitivní amplifikace vedly k jednomu pásu na gelu očekávaného cílového stavu. Žádná z amplifikaci nevedla k buď příměrovému dimeru nebo jinému nespecifickému ampolifikačnímu produktu.
Výsledky mohou být porovnány s výsledky v příkladu 6, kde stejné HCV cíle byly amplifikovány za použití stejných příměrových sekvencí. Srovnání těchto výsledků s výsledky v příkladu 6 ukazuje, že amplifikace za použití p-terc.butylbenzylem modifikovaných primerů byly významně lepší ve vztahu k odpovídajícím amplifikacím prováděným s nemodifikovanými primery.
Byly provedeny další experimenty, ve kterých HIV-1 RNA byla amplifikována za použití p-terc.butylbenzylmodifikovaných verzí primerů popsaných v příkladu 5. Amplifikace byly prováděny v podstatě jak je výše popsáno. Jak u HCV systému, který je zde popsán, všechny HIV-1 matriční pozitivní amplifikace vedly k jednomu pásu na gelu očekávaného cílového stavu a žádná amplifikace nevedla k buď příměrovému dimeru nebo jinému nespecifickému amplifikačnímu produktu.
Tyto další výsledky mohou být srovnány s výsledky v příkladu 5, kde byl amplifikován stejný HIV cíl za použití stejných příměrových sekvencí. Srovnání těchto výsledků s výsledky příkladu 9 ukazuje, že amplifikace za použití p-terc.butylbenzyl modifikovaných primerů byly významně lepší ve vztahu k odpovídajícím amplifikacím prováděným s nemodifikovanými primery.
-28CZ 291525 B6
Příklad 10
Amplifikace mykobakteriální DNA
Tento příklad popisuje srovnání amplifikaci mykobakteriální DNA prováděných za použití nemodifikovaných a modifikovaných primerů.
Jak primery modifikované adicí benzylové skupiny na 3'terminál nukleotidu, tak primery modifikované adicí p-terc.butylbenzylové skupiny na 3'terminál nukleotidu byly použity. Reakce za použití nemodifikovaných primerů byly v podstatě takové, jaké jsou popsány v Tevere a kol., 1996, J. Clin. Microbiol. 34(4): 918-923. Amplifikace byly prováděny za použití vzorků sputa, do kterých byla přidána mykobakteriální DNA ve známé koncentraci do simulované infektovaných klinických vzorků. Další amplifikace byly prováděny za použití vyčištěné mykobakteriální DNA a za použití negativních kontrolních vzorků bez DNA.
Příprava vzorků
Vzorky sputa, které se dříve ukázaly být negativní na mykrobakterie pomocí mikroskopie a kultivace, byl zkapalněny a dekontaminovány pomocí N-acetylcistein-NaOH metody doporučené CDC (Kent a Hubica, 1985, Publ. Health Mycobacteriology, - příručka pro úroveň III laboratoře, U.S. Departmen of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta, na což se tímto odkazuje). Zkapalněné sputum (lOOmikrol) bylo přidáno do 500 mikrol. Respirátory Specimen Wash Reagents (10 mm tris-HCl, 1 mm EDTA, l%ní (obj./obj.) Triton X-100, 0,05%ní NaN3, pH 8,0) a odsřeďováno po dobu 10 minut při 12 500 g. Každá peleta byla resuspendována v 100 mikrol. lýzního reagentu (0,05 N NaOH, l%ní (obj./obj.) Triton X-100, 1 mm EDTA, 0,05%ní NaN3) a inkubována po dobu 45 minut při teplotě 60 °C. Lyzáty pak byly neutralizovány lOOmikrol. neutralizačního reagentu (0,2 M Tris-HCl, 8mM mgCl2, 0,05%ní NaN3, pH 7,5).
Sdružené lyzáty sputa byly vytvořeny sloučením 80 mikrol. každého ze dvou separátních lyzátů sputa. Do každého z 8 sdružených lyzátů sputa (160 mikrol. každého) bylo přidáno 15 mikrolitrů DNA základu (2 kopie/mikrol. v 1:1 směsi lýze a neutralizačních reagentů vyčištěného od kultivované M. tuberculosis.
Příklady obsahující vyčištěnou mykobakteriální DNA (žádné sputum) ve známé koncentraci byly připraveny přídavkem 10 mikrolitrů DNA základu do 100 mikrolitrů 1:1 směsi lýzního reagentu a neutralizačního reagentu.
Negativní kontrolní vzorky (žádná DNA) sestávaly ze směsi 100 mikrolitrů neutralizačního reagentu.
Amplifikační primery
Amplifikace byly prováděny za použití primerů sestávajících z následujících nukleotidových sekvencí:
Primery
KY18(sekv. id.č.:5) KY438 (sekv. id. č. 6) KY75 (sekv. id. č.: 7)
Sekvence 5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3' 5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3' 5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3'
-29CZ 291525 B6
Následující příměrové páry obsahující indikovanou modifikátorovou skupinu připojenou k 3'terminálu báze, byly použity při amplifíkacích. Všechny modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v předešlých příkladech. Všechny primery byly biotinylovány na 5'konci.
Příměrový pár
A
B
C
Amplifikace
Příměrové sekvence
KY18 (sekv. id. č.: 5)
ΚΎ75 (sekv. id. č.: 7)
KY436 (sekv. id. č. 6)
KY75 (sekv. id. č. 7)
KY436 (sekv. id. č.: 6)
KY75 (sekv. id. č.: 7)
Modifikace nemodifikované nemodifikované benzyl benzyl p-terc.butylbenzyl p-terc.butylbenzyl
Pro každý vzorek byly provedeny amplifikaci za použití nemodifikovaného příměrového páru KY18 (sekv. id. č.: 5) a KY75 (sekv. id. č.: 7), a modifikovaných forem příměrového páru
K.Y436 (sekv. id. č.: 6) a KY75 (sekv. id. č.: 7).
Amplifikace byly prováděny ve 100 mikrolitrových reakcích, každé obsahující 50 mikrolitrů jednoho ze tří vzorků výše popsaných a 50 mikrolitrů 2 x směsi reagentů, která obsahuje následující reagenty:
100 mm tris-HCl, pH 8,9,
500 nM každého primeru,
200 mikroM každého dNTP, (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), % obj./obj. giycerólu) j ednotek Ampl i Taqx), jednotek AmpErasex).
x) Vyrobeno a vyvinuto Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Tepelné cyklování každé reakce bylo prováděno v GeneAmp PCR systém 9 600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:
| Předreakční inkubace 2 cykly: | 50 °C po dobu 5 minut denaturace při 98 °C po dobu 20 sekund, chlazení při 62 °C po dobu 20 sekund, extenze při 72 °C po dobu 45 sekund. |
| 41 cyklů: | denaturace při 94 °C po dobu 20 sekund, chlazení při 62 °C po dobu 20 sekund extenze při 72 °C po dobu 45 sekund, |
| finální extenze | 72 °C po přibližně 12 hodin (přes noc). |
Amplifikační produkty byly vizualizovány elektroforézou skrz 2%ní Nusieve(R), 0,5%ní agarózový gel, načež následovalo zabarvení ethidiumbromidem.
Výsledky
Výsledky elektroforézní analýzy jsou znázorněny na obr. 5. Pro každý vzorec produkty z amplifikaci prováděných s nemodifikovanými primery (označené „A“) a s nemodifikovanými primery (označené „B“ a „C“) byly jednotlivé běhy uvedeny na přilehlých pruzích. Pásy odpovídající určené mykobakteriální cílové sekvenci jsou označeny šipkami. Jiné pásy odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, nejspodnější pásy v gelu odpovídají příměrovému
-30CZ 291525 B6 dimeru. Pruhy označené „M“ obsahují ukazatel molekulové hmotnosti (Hae III digestion of
PhiX174DNA).
Za použití nemodifikovaných příměrů vedly amplifikace vyčištěné mykobakteriální DNA k tvorbě příměrového dimeru. Použití obou modifikovaných párů primerů zvýšilo množství určené cílové látky, která byla přítomna, a v podstatě eliminovalo tvorbu zjistitelného příměrového dimeru.
V kontrastu k amplifikaci vyčištěné DNA za použití nemodifikovaných primerů, přítomnost lyzátu sputa v amplifikační reakci snížila účinnost lyzátu sputa v amplifikační reakci snížila účinnost a zvýšila tvorbu nespecifického amplifikačního produktu, jak je vidět z přítomnosti vnějších pásů produktu. Vzrůst nespecifického amplifikačního produktu není překvapením daným tím, že lyzáty sputa obsahují významné množství lidské DNA, která není přítomna v amplifikacích vyčištěné mykobakteriální DNA. Použití obou modifikovaných příměrových párů při amplifikacích prováděných v přítomnosti sputa mělo za následek jak významný vzrůst množství vytvořeného určeného produktu, tak snížení nespecifické amplifikace.
Příklad 11
Další syntéza primerů modifikovaných benzylovou skupinou
Primery modifikované adicí benzylové skupiny na terminální citosin byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití LCAA-CPG vázaného N4-acetyl-N4-benzyl-5'O-DMT-2'-deoxycitidinu připraveného jak je dále popsáno.
Stupeň 1: Syntéza N4-benzyl-2'-deoxycitidinu
Do 2'-deoxycitidinhydrochloridu (5,28 g, 20 mmol, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) byl přidán benzylamin (20 ml) a směs byla zahřívána při 150 °C po dobu 3 hodin pod argonovou atmosférou. Roztok byl koncentrován za vakua, čímž se získal viskózní žlutý olej, který byl rozdělen mezi vodu (100 ml) a ethylacetát (100 ml). Vodná fáze byla promyta ethylacetátem (100 ml) a oddělena. Vodná fáze byla koncentrována za vakua, čímž se získal žlutý sirup (13 g), který byl vyčištěn silikagelovou sloupcovou chromatografii směsí 15:1 methylenchlorid:methanol jako eluentu, čímž se získal požadovaný produkt (5,8 g, 91,5 %) jako bezbarvý sirup.
Stupeň 2: Syntéza N4-acetyl-N4-benzyl-2'-deoxycitidinu
N4-benzyl-2'-deoxycitidin (2,5 g, 7,9mmol) byl rozpuštěn v 15 ml suchého dimethylformamidu (15 ml), byl přidán acetanhydrid (8 g, 79 mmol, 10 ekv.) a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo a přebytek acetanhydridu byly odpařeny za vakua. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii silikagelem za použití 20:1 methylenchlorid:methanol jako eluentu, čímž se získala nadepsaná sloučenina (1,3 g, 48%). Sloučenina byla vysoce hygroskopická a byla uskladněna vysušená při -20 °C.
Stupeň 3: Syntéza N4-acety-N4-benzyI-5'-O-DMT-2'-deoxycitidinu
N4-acetyl-N4-benzyl-2'-deoxycitidin (76 mg, 0,2 mmol) byl rozpuštěn v 1 ml suchého pyridinu a byl přidán DMT-C1 (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 ekv.). Reakční směs byla míchána po dobu 3 hodin. Analýza TLC ukázala určitý úbytek výchozího materiálu, takže další alikvot DMT-C1 (61 mg, 0,5 ekv.) byl přidán a výsledná směs byla míchána další hodinu, v kteréžto době analýza TLC ukázala, že reakce byla skončena. Reakční směs byla zchlazena 15 ml solanky a vodná fáze byla extrahována methylenchloridem (3,15 ml). Sloučenina organická vrstva byla promyta solankou (2,15 ml) a vysušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno
-31CZ 291525 ,B6 nad bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno a směs byla vyčištěna silikagelovou chromatografií za použití 50:1 methylenchlorid:methanol, čímž se získal N4-acetyl-N4benzyl-5'-0-DMT-2'-deoxycitidin (96 mg, 65%ní výtěžek).
Stupeň 4: Sukcinylace
N4-acetyl-N4-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxycitidin (96 mg, 0,13 mmol) byl rozpuštěn ve 2 ml suchého pyridinu. Byly přidány anhydrid kyseliny jantarové (100 mg, 1,0 mmol) a dimethylaminopyridin (20 mg) a výsledná směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 3 dnů. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl spoluodpařen s toluenem (3,10 ml). Byl přidán chloroform (50 ml) k rozpuštění zbytku (byl použit ultrazvuk k nápomoci rozpouštění). Chloroformová vrstva byla promyta solankou (3,15 ml) a vodou (1,15 ml). Organická vrstva byla vysušena bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo dopařeno, čímž se získalo 108 mg čistého N4-acetyl-N4-benzyl-5'-0-DMT-2'-deoxycitidin-3'-0-sukcinamitu (97%ní výtěžek).
Stupeň 5: Příprava LCAA-CPG vázaného 5'-O-DMT-N4-acetyl-N4-benzyl-2'-deoxycitidin3'-O-sukcinátu
Aktivované CPG bylo připraveno následovně: LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPGInc., Fairfíeld, NJ) bylo zpracováno s trichloroctovou kyselinou v methylenchloridu (3%ní, 10 ml) a bylo mícháno rotací na rotačním odpařovači (rotovapor, Buchu, Flawil, Švýcarsko) (žádné vakuum) po dobu 4 hodin. Rozpouštědlo bylo odfiltrováno a CPG bylo promyto směsí 9:1 triethylamin:ethyldiizopropylamin (3,5 ml), methylenchloridem (3,10 ml) a etherem (3,10 ml), a to postupně a pak bylo vysušeno za vakua.
Spojení modifikovaného nukleosidového produktu s kyselinou promytým CPG bylo provedeno následovně. K. 1 g aktivovaného LCAA-CPG byl přidán N4-acetyl-N4benzyi-5'-O-DMT-2'deoxycitidin-3'-0-sukcinát (108 mg, 0,13 mrnol, připravený jak je výše popsáno, dimelhylaminopyridin (20 mg) a 5 ml suchého pyridinu. Reakční směs byla rotována na rotovaporu (žádné vakuum) po dobu 3 dnů. Supematant byl odfiltrován a propojené LCAA-CPG bylo promyto postupně pyridinem (3,5 ml), methylenchloridem (3,10 ml) a etherem (3,10 ml) a pak vysušeno ve vakuu.
Opatření čepičkou LCAA-CPG vázaného s N4-acetyl-N4-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxycitidin3'-O-sukcinátu bylo provedeno následovně. K derivatizovanému CPG byl přidán čepičkovací směsný reagent A (THF/lutidin/AC2O 8:1:1 Glen Research DNA syntézní reagenty, Sterling, VA) a B (10%ní N-methylimidazol v THF, Glen Research) a reakční směs byla rotována na rotavaporu (žádné vakuum) přes noc. Roztok byl odfiltrován a vázané LCAA-CPG bylo promyto postupně pyridinem (3,5 ml), methylenchloridem (3,10 ml), THF (3,10 ml) a etherem (3,10 ml) a pak vysušeno za vakua.
Vázací kapacita derivatizovaného LCAA-CPG byla určena zpracováním 5 mg produktu s 3%ní chloroctovou kyselinou v methylenchloridu a množství uvolněného dimethoxyltritylkarboniového iontu bylo změřeno UV spektroskopií. Množství nukleosidového derivátu vázaného k LCAAA-CPG bylo stanoveno v hodnotě 19,5 mikroM/g.
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulice: Grenzachestrasse 124 (C) Město: Basilej (D) Stát: BS
-32CZ 291525 B6 (E) Země; Švýcarsko (F) Poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) Telefon: 0601 -688 25 11 (H) Telefax: 0601 -688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlr ch (ii) Název vynálezu: Modifikované primery (iii) Počet sekvencí: 7 (iv) Počítačová čitelná forma:
(A) Druh média: Floppy disk (B) Počítač: Apple Macintosh (C) Operační systém: Systém 7.1 (Macintosh) (D) Software: Word 5.1 (v) Prioritní data přihlášky:
Číslo přihlášky: 60—041127
Datum podání: 20.03.97 (2) Informace pro sekv. id. Č. 1:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 1:
CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA 33 (2) Informace pro sekv. id. č. 2:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ: nukleová ky selina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 2:
CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA 32 (2) Informace pro sekv. id. č. 3:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 3:
GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA 26 (2) Informace pro sekv. id. č. 4:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 4:
GCAAGCACC TATCAGGCAG TACCACAA 28
-33CZ 291525 B6 (2) Informace pro sekv. id. č. 5:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 5:
CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 (2) Informace pro sekv. id. č. 6:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 6:
TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA 24 (2) Informace pro sekv. id. č. 7:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 7:
GCCCGTATCG CCCGAACGCT CACA24
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Oligonukleotid obecné strukturyRRII5'-S,-N-3' nebo 5'-Si -N-S2-3', kde51 představuje první sekvenci nukleotidů mezi 5 až 50 nukleotidy v délce,52 představuje druhou sekvenci mezi jedním až třemi nukleotidy v délce,N představuje nukleotid takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázán k N přes exocyklický amin a kde R má strukturu-34CZ 291525.B6Ri - C-R2 kdeRi a R2 představují nezávisle vodík, C|-Ci0alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu.
- 2. Oligonukleotid podle nároku 1, kde R je 2-naftylmethy!ová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina.
- 3. Oligonukleotid podle nároku 1 nebo 2, kde R je substituovaná benzylová skupina o struktuře kde R3 představuje Cj-C6 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu.
- 4. Oligonukleotid podle nároku 3, kde R3 představuje CrCd rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu.
- 5. Oligonukleotid podle nároku 3 nebo 4, kde R3 je připojen v para poloze.
- 6. Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde N je adenosin.
- 7. Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde R je vybrán ze skupiny zahrnující benzyl, p-methylbenzyl, p-terc.butylbenzyl, p-methoxybenzyl. o-nitrobenzyl a 2-naftylmethyl.
- 8. Způsob amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny, vyznačený tím, že se provede amplifikační reakce za použití alespoň jednoho oligonukleotidů podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se použije reakce polymerázového řetězce.
- 10. Sestava kprovádění amplifikační reakce nukleové kyseliny, vyznačená tím, že obsahuje oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4112797P | 1997-03-20 | 1997-03-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ84198A3 CZ84198A3 (cs) | 1998-10-14 |
| CZ291525B6 true CZ291525B6 (cs) | 2003-03-12 |
Family
ID=21914898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1998841A CZ291525B6 (cs) | 1997-03-20 | 1998-03-19 | Modifikované primery |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6001611A (cs) |
| EP (1) | EP0866071B1 (cs) |
| JP (1) | JP2966389B2 (cs) |
| KR (1) | KR100292997B1 (cs) |
| CN (1) | CN1065873C (cs) |
| AT (1) | ATE280177T1 (cs) |
| AU (1) | AU712448B2 (cs) |
| BR (1) | BR9801878B1 (cs) |
| CA (1) | CA2229766C (cs) |
| CZ (1) | CZ291525B6 (cs) |
| DE (1) | DE69827060T2 (cs) |
| DK (1) | DK0866071T3 (cs) |
| ES (1) | ES2230631T3 (cs) |
| HU (1) | HU223669B1 (cs) |
| IL (1) | IL123694A (cs) |
| NO (1) | NO322136B1 (cs) |
| PL (1) | PL190142B1 (cs) |
| RU (1) | RU2159248C2 (cs) |
| TW (1) | TW567188B (cs) |
| UA (1) | UA49843C2 (cs) |
Families Citing this family (207)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19520398B4 (de) | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
| KR100463475B1 (ko) | 1995-06-08 | 2005-06-22 | 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 | 자기성피그먼트 |
| US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
| WO2001037291A1 (en) | 1999-11-17 | 2001-05-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof |
| US6747141B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-06-08 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species |
| US6664081B2 (en) * | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| EP1242633B1 (en) * | 1999-12-17 | 2011-01-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US7205129B1 (en) | 2000-02-28 | 2007-04-17 | Qiagen Gmbh | Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US6548251B1 (en) * | 2000-09-05 | 2003-04-15 | Fidelity Systems, Inc. | Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides |
| WO2002020845A2 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Thomas Jefferson University | Ultra yield amplification reaction |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| AU2001296645A1 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| DE60115811T2 (de) * | 2000-10-25 | 2006-08-03 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplifizierung unter Verwendung von modifizierten Primern |
| AU2002314734B2 (en) * | 2001-03-30 | 2007-08-30 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | P450 single nucleotide polymorphism biochip analysis |
| RU2218414C2 (ru) * | 2001-05-04 | 2003-12-10 | Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Способ интеграции множественных полимеразных реакций амплификации с последующим анализом амплифицированных последовательностей непосредственно на биочипе |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| WO2002101041A1 (en) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting nucleotide polymorphism with the use of nucleotide analog |
| WO2003020983A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-13 | Virginia Commonwealth University | Allele specific pcr for genotyping |
| US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
| US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
| US7211382B2 (en) * | 2002-04-09 | 2007-05-01 | Orchid Cellmark Inc. | Primer extension using modified nucleotides |
| EP1509624A2 (en) * | 2002-05-31 | 2005-03-02 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands |
| US7955795B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-06-07 | Qiagen Gmbh | Method of whole genome amplification with reduced artifact production |
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| RU2240350C1 (ru) * | 2003-03-11 | 2004-11-20 | НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ | Способ идентификации генных мутаций и полиморфизмов |
| EP1611254B1 (en) * | 2003-03-31 | 2014-09-10 | Roche Diagnostics GmbH | Compositions and methods for detecting certain flaviviruses, including members of the japanese encephalitis virus serogroup |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7408051B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7517978B1 (en) | 2004-04-14 | 2009-04-14 | Applied Biosystems, Llc | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| US20090232771A1 (en) | 2004-07-13 | 2009-09-17 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Method of controlling cell functions |
| WO2006029184A2 (en) | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| WO2006048262A2 (en) * | 2004-11-04 | 2006-05-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Classification of acute myeloid leukemia |
| US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
| RU2299240C2 (ru) * | 2005-02-21 | 2007-05-20 | Рамиль Ришадович Вафин | Способ проведения пцр |
| JP2008535518A (ja) * | 2005-04-14 | 2008-09-04 | アプレラ コーポレイション | プソイドイソシトシン核酸塩基誘導体を含む３’改変オリゴヌクレオチド、およびプライマーまたはプローブとしてのその適用 |
| US7919242B2 (en) | 2005-06-30 | 2011-04-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Light emission modifiers and their uses in nucleic acid detection, amplification and analysis |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| ATE502122T1 (de) * | 2006-06-01 | 2011-04-15 | Trilink Biotechnologies | Chemisch modifizierte oligonukleotidprimer zur nukleinsäureamplifikation |
| WO2007147110A2 (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-21 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Controlled initiation of primer extension |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| CN106566855B (zh) * | 2006-07-31 | 2021-11-09 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸 |
| WO2008021431A2 (en) | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| EP2102367A2 (en) | 2006-11-09 | 2009-09-23 | XDX, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| GB2457402B (en) | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| ES2582602T3 (es) * | 2007-03-28 | 2016-09-14 | Signal Diagnostics | Sistema y método de análisis de alta resolución de ácidos nucleicos para detectar variaciones de secuencia |
| CA2691942C (en) | 2007-07-03 | 2017-12-05 | Genaphora Ltd. | Methods and kits using chimeric probes for reducing or eliminating formation of artifacts and non-specific amplification products |
| EP2185726B1 (en) | 2007-08-06 | 2014-01-08 | Orion Genomics, LLC | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the igf2 gene |
| JP2009077712A (ja) | 2007-09-11 | 2009-04-16 | F Hoffmann La Roche Ag | Ｂ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤に対する感受性についての診断試験 |
| JP5535921B2 (ja) * | 2007-10-04 | 2014-07-02 | コモンウェルス サイエンティフィック アンドインダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 核酸増幅 |
| US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
| DK2725107T3 (da) | 2007-10-19 | 2019-01-02 | Univ Columbia | DNA-sekventering med ikke-fluorescerende nukleotidreversible terminatorer og ddNTP'er modificeret med spaltbart mærke og nukleinsyre omfattende inosin med reversible terminatorer |
| WO2009051807A1 (en) | 2007-10-19 | 2009-04-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| DE102008005667A1 (de) | 2008-01-19 | 2009-07-30 | Olfert Landt | Basenmodifizierte Primeroligomere für die Multiplex-RT-PCR |
| EP2644708B1 (en) | 2008-04-30 | 2014-12-17 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNASE-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| NZ590265A (en) | 2008-06-11 | 2012-11-30 | Lasergen Inc | Nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing |
| EP2321642B1 (en) | 2008-08-04 | 2017-01-11 | Natera, Inc. | Methods for allele calling and ploidy calling |
| CN105200097A (zh) * | 2008-10-20 | 2015-12-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 改进的等位基因特异性扩增 |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US8206929B2 (en) * | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| CA2751758A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Orion Genomics Llc | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| US8409802B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
| WO2011041485A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Gene Security Network, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| US9238832B2 (en) * | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| WO2011146632A1 (en) | 2010-05-18 | 2011-11-24 | Gene Security Network Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US12152275B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-11-26 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US12221653B2 (en) | 2010-05-18 | 2025-02-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| EP2576837B1 (en) | 2010-06-04 | 2017-09-06 | Chronix Biomedical | Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| US20120142908A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Berry And Associates, Inc. | Compounds for the synthetic introduction of n-alkyl nucleosides into dna oligonucleotides |
| US20120164641A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene |
| CN103608466B (zh) | 2010-12-22 | 2020-09-18 | 纳特拉公司 | 非侵入性产前亲子鉴定方法 |
| RU2671980C2 (ru) | 2011-02-09 | 2018-11-08 | Натера, Инк. | Способы неинвазивного пренатального установления плоидности |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| US9624539B2 (en) | 2011-05-23 | 2017-04-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection |
| US9034581B2 (en) * | 2011-05-26 | 2015-05-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus |
| EP2768985B1 (en) | 2011-10-21 | 2019-03-20 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| KR101545848B1 (ko) * | 2012-04-09 | 2015-08-21 | (주)바이오니아 | 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법 |
| JP6450308B2 (ja) | 2012-06-14 | 2019-01-09 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｃｒ）のための新規の組成物、方法、およびキット |
| US9982313B2 (en) | 2012-08-17 | 2018-05-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2 |
| US20140100126A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-04-10 | Natera, Inc. | Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data |
| EP2722399A1 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
| US9382581B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| EP2931922B1 (en) | 2012-12-14 | 2018-10-17 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
| US9828629B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage |
| WO2014144883A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| WO2014194113A2 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Chronix Biomedical | Detection and quantification of donor cell-free dna in the circulation of organ transplant recipients |
| SG11201601044XA (en) | 2013-08-12 | 2016-03-30 | Genentech Inc | Compositions and method for treating complement-associated conditions |
| US9499870B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-11-22 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| JP6619332B2 (ja) | 2013-10-09 | 2019-12-11 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ヒトｅｚｈ２遺伝子中の変異を検出するための方法及び組成物 |
| KR102323375B1 (ko) | 2013-10-09 | 2021-11-08 | 플루어레센트릭 인코포레이티드 | 다중 프로브 |
| CN105722977A (zh) | 2013-10-30 | 2016-06-29 | 绿色生活生物技术有限责任公司 | 用于柑橘绿化枯萎病的发病定量系统和治疗方法 |
| US10072288B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-09-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe |
| US9637791B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-05-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage |
| EP3102230B1 (en) | 2014-02-08 | 2021-04-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Methods of treating alzheimer's disease |
| CA2945962C (en) | 2014-04-21 | 2023-08-29 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
| US20180173846A1 (en) | 2014-06-05 | 2018-06-21 | Natera, Inc. | Systems and Methods for Detection of Aneuploidy |
| DK3201361T3 (da) | 2014-10-01 | 2020-05-18 | Chronix Biomedical | Fremgangsmåder til kvantificering af cellefrit DNA |
| US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
| US9920381B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-03-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| US10020300B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-07-10 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US9618474B2 (en) | 2014-12-18 | 2017-04-11 | Edico Genome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| CA2971589C (en) | 2014-12-18 | 2021-09-28 | Edico Genome Corporation | Chemically-sensitive field effect transistor |
| US9859394B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10006910B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-26 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same |
| US9857328B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same |
| CA2983819A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Atila Biosystems Incorporated | Amplification with primers of limited nucleotide composition |
| US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US9970062B2 (en) * | 2015-08-06 | 2018-05-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
| US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
| WO2017121836A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic dna polymerase mutants |
| CN108779500B (zh) | 2016-03-11 | 2022-12-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测寨卡病毒的组合物和方法 |
| WO2017169119A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| JP6681804B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2020-04-15 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| RU2760913C2 (ru) | 2016-04-15 | 2021-12-01 | Натера, Инк. | Способы выявления рака легкого |
| WO2017201081A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Agilome, Inc. | Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10612101B2 (en) * | 2016-05-27 | 2020-04-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium |
| EP3464617B1 (en) | 2016-05-27 | 2021-04-07 | Roche Diagnostics GmbH | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
| US10934597B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-03-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
| US20170356025A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internal control probes for improving pcr assay performance |
| US10443095B2 (en) | 2016-08-02 | 2019-10-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Helper oligonucleotide for improved efficiency of amplification and detection/quantitation of nucleic acids |
| WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| GB201618485D0 (en) | 2016-11-02 | 2016-12-14 | Ucl Business Plc | Method of detecting tumour recurrence |
| US10793923B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of BK virus |
| CN110225919A (zh) | 2016-11-10 | 2019-09-10 | 达丽斯生物医学公司 | 用于扩增和检测淋病奈瑟氏菌的多核苷酸 |
| CN110177887B (zh) | 2016-11-10 | 2024-10-29 | 达丽斯生物医学公司 | 用于扩增和检测沙眼衣原体的多核苷酸 |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US20190211377A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
| WO2018156418A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
| EP3645710A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic dna polymerase mutants |
| US10760137B2 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
| WO2019045532A2 (en) * | 2017-08-31 | 2019-03-07 | Seegene, Inc. | EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS |
| WO2019063661A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Roche Diagnostics Gmbh | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS |
| US12084720B2 (en) | 2017-12-14 | 2024-09-10 | Natera, Inc. | Assessing graft suitability for transplantation |
| US12398389B2 (en) | 2018-02-15 | 2025-08-26 | Natera, Inc. | Methods for isolating nucleic acids with size selection |
| EP3768832B1 (en) | 2018-03-21 | 2023-11-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| US12024738B2 (en) | 2018-04-14 | 2024-07-02 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| WO2020006421A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-01-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites |
| US12234509B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-02-25 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| CA3118000A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | Cepheid | Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers |
| ES3031673T3 (en) | 2018-12-03 | 2025-07-10 | Hoffmann La Roche | Compositions and methods for detection of candida auris |
| US12390812B2 (en) | 2018-12-19 | 2025-08-19 | Nuclein, Llc | Apparatus and methods for molecular diagnostics |
| KR102141312B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-08-04 | 주식회사 제노헬릭스 | 짧은 RNA-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 RNA 탐지 기법 |
| US20260117329A1 (en) | 2019-05-02 | 2026-04-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | UTILIZATION OF dITP FOR PREFERENTIAL/SELECTIVE AMPLIFICATION OF RNA VERSUS DNA TARGETS BASED ON STRAND-SEPARATION TEMPERATURE |
| JP7592027B2 (ja) | 2019-05-07 | 2024-11-29 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｏｈｅａｅ）を検出するための組成物および方法 |
| US12305235B2 (en) | 2019-06-06 | 2025-05-20 | Natera, Inc. | Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system |
| CN114174540A (zh) | 2019-07-25 | 2022-03-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)的组合物和方法 |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| EP4022086B1 (en) | 2019-08-27 | 2025-08-06 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for amplification and detection of hepatitis b virus rna, including hbv rna transcribed from cccdna |
| US11441167B2 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
| ES2991814T3 (es) | 2019-12-27 | 2024-12-05 | Hoffmann La Roche | Composiciones y procedimientos para detectar Staphylococcus aureus resistente a la meticilina |
| WO2021136752A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates |
| JP7796660B2 (ja) | 2020-03-09 | 2026-01-09 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法 |
| US11047007B1 (en) | 2020-03-23 | 2021-06-29 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of SARS-CoV-2 |
| JP2023536962A (ja) | 2020-08-06 | 2023-08-30 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂの検出のための組成物及び方法 |
| US20240102110A1 (en) | 2020-12-04 | 2024-03-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of malaria |
| US20220205020A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
| WO2022167570A1 (en) | 2021-02-05 | 2022-08-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of human parainfluenza viruses 1-4 (hpiv 1-4) |
| US20220290221A1 (en) * | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| CN117858960A (zh) | 2021-05-06 | 2024-04-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于通过双靶标测定来检测丁型肝炎病毒的组合物和方法 |
| JP2024542104A (ja) | 2021-11-05 | 2024-11-13 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | マラリアを検出するための組成物および方法 |
| US20250011882A1 (en) | 2021-11-22 | 2025-01-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and Methods for Detecting vanA and/or vanB Genes Associated with Multidrug Resistance |
| US20250059600A1 (en) | 2021-12-09 | 2025-02-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Mass based detection of pcr amplicons |
| EP4450634A4 (en) | 2021-12-15 | 2025-12-24 | Nanjing Genscript Biotech Co Ltd | INTEGRATION SITE DETECTION METHOD |
| US20260098309A1 (en) | 2022-06-30 | 2026-04-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis |
| US20260015679A1 (en) * | 2022-07-18 | 2026-01-15 | Haystackanalytics Private Limited | Methods and systems for detection and identification of pathogens and antibiotic resistance genes |
| EP4577674A1 (en) | 2022-08-24 | 2025-07-02 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detecting monkeypox virus |
| WO2024141442A1 (en) | 2022-12-25 | 2024-07-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting carbapenem resistant acinetobacter calcoaceticus-baumannii (crab) |
| CN120457216A (zh) | 2022-12-28 | 2025-08-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 针对多个乙型肝炎病毒基因靶标的数字pcr测定设计及用于其的不可延伸的阻断剂寡核苷酸 |
| CN120731278A (zh) | 2023-02-25 | 2025-09-30 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于念珠菌属物种检测的组合物和方法 |
| CN120917150A (zh) | 2023-03-03 | 2025-11-07 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测b族链球菌（无乳链球菌）和克林霉素抗性基因决定子的组合物和方法 |
| WO2025024676A1 (en) | 2023-07-26 | 2025-01-30 | Caribou Biosciences, Inc. | In vitro validation methods for cd19-targeting cell therapies |
| WO2025027080A1 (en) | 2023-08-03 | 2025-02-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of 5'-tailed long primers to improve amplification performance when targeting short primer-binding sites |
| WO2025202488A1 (en) | 2024-03-28 | 2025-10-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Enhancer of nucleic acid amplification |
| WO2026052826A1 (en) | 2024-09-09 | 2026-03-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Methods for producing fluorescent dyes |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5256549A (en) * | 1986-03-28 | 1993-10-26 | Chiron Corporation | Purification of synthetic oligomers |
| US5418149A (en) * | 1990-07-24 | 1995-05-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Reduction of non-specific amplification glycosylase using DUTP and DNA uracil |
| US5359100A (en) * | 1987-10-15 | 1994-10-25 | Chiron Corporation | Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers |
| US5354656A (en) * | 1989-10-02 | 1994-10-11 | Stratagene | Method of DNA sequencing |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| GB9024005D0 (en) * | 1990-11-05 | 1990-12-19 | British Bio Technology | Process for amplifying nucleic acid |
| AU2544292A (en) * | 1991-09-11 | 1993-04-05 | Medical Research Council | Improvements in oligonucleotide primers and probes |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| CA2159631A1 (en) * | 1993-03-30 | 1994-10-13 | Sanofi | Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them |
| RU2084534C1 (ru) * | 1993-07-07 | 1997-07-20 | Институт молекулярной генетики РАН | Способ получения двуцепочечной нуклеиновой кислоты |
| FR2722799B1 (fr) * | 1994-07-21 | 1996-10-04 | Parteurop | Procede d'amplification d'acide nucleique a l'aide d'un nucleoside modifie, et detection du produit d'amplification a l'aide d'anticorps |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
-
1998
- 1998-03-12 EP EP98104461A patent/EP0866071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 DE DE69827060T patent/DE69827060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 ES ES98104461T patent/ES2230631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 AT AT98104461T patent/ATE280177T1/de active
- 1998-03-12 DK DK98104461T patent/DK0866071T3/da active
- 1998-03-13 AU AU58404/98A patent/AU712448B2/en not_active Expired
- 1998-03-16 HU HU9800581A patent/HU223669B1/hu active IP Right Grant
- 1998-03-16 US US09/039,866 patent/US6001611A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-16 IL IL12369498A patent/IL123694A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-18 CA CA002229766A patent/CA2229766C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 CN CN98105627A patent/CN1065873C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 PL PL98325439A patent/PL190142B1/pl unknown
- 1998-03-19 UA UA98031382A patent/UA49843C2/uk unknown
- 1998-03-19 RU RU98105786/04A patent/RU2159248C2/ru active
- 1998-03-19 NO NO19981239A patent/NO322136B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 CZ CZ1998841A patent/CZ291525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 KR KR1019980009644A patent/KR100292997B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 JP JP10090641A patent/JP2966389B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 BR BRPI9801878-7A patent/BR9801878B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 TW TW087104213A patent/TW567188B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ291525B6 (cs) | Modifikované primery | |
| US10358459B2 (en) | 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′˜P5′ phosphoramidates: their synthesis and use | |
| JP3165431B2 (ja) | 増幅方法 | |
| US7144995B2 (en) | Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same | |
| US5849482A (en) | Crosslinking oligonucleotides | |
| CA2329135A1 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| KR100901392B1 (ko) | 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진 | |
| US6312953B1 (en) | Bifunctional Crosslinking oligonucleotides adapted for linking to a target sequence of duplex DNA | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| JPWO1999009213A1 (ja) | Ｄｎａ増幅方法及びそのキット | |
| MXPA98002007A (en) | Cebers modify | |
| HK1051877B (en) | Process for labeling a nucleic acid, including purification | |
| HK1051877A1 (zh) | 包括純化的標記核酸的方法 | |
| HK1036627B (en) | Method for marking a ribonucleic acid | |
| HK1052952A (en) | Process for labeling a ribonucleic acid, including optional signal amplification, and labeled rna fragments which are obtained by this process |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180319 |