CZ291612B6 - Deriváty Ara-C, farmaceutické kompozice, které je obsahují a jejich použití - Google Patents

Abstract

Nukleosidov deriv ty pro v²robu l iv pro l bu zhoubn²ch n dor . Nukleosidov deriv ty jsou d ny obecn²m vzorcem I, kde R.sub.1.n., R.sub.2.n. jsou nez visle vyb r ny z vod ku, elaidoylu, oleoylu, stearoylu, eikosenoylu (cis nebo trans) a eikosanoylu s v²hradou, e R.sub.1.n., R.sub.2.n. jsou oba z rove vod ky, oleoyly nebo stearoyly, R.sub.1.n. nen vod k, kdy R.sub.2.n. je oleoyl nebo stearoyl a R.sub.2.n. je vod k, kdy R.sub.1.n. je elaidoyl, oleoyl nebo stearoyl. Vyn lez se d le t²k pou it nukleosidov²ch deriv t obecn ho vzorce I, kde R.sub.1.n. a R.sub.2.n. jsou nez visle vyb r ny z vod ku a C.sub.18.n.- a C.sub.20.n.- nasycen²ch a mono-nenasycen²ch acylov²ch skupin s v²hradou, e R.sub.1.n. a R.sub.2.n. nejsou oba sou asn vod ky.\

Description

Vynález se týká některých nukleosidových derivátů, které mají vhodné vlastnosti pro léčbu zhoubných nádorů, farmaceutických kompozic a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Nukleosidové deriváty jsou estery Ι-β-D-arabinofuranosylcytozinu (Ara-C) vzorce A:

OH

Ara-C bývá také nazýván cytosar.

Ara-C je již dlouho znám jako chemoterapeutický prostředek pro léčbu akutní myeloidní leukémie, ovšem s omezeným účinkem proti pevným zhoubným nádorům. (Fre a kol., Cancer Res. 29 (1969), 1325-1332; Davis a kol., Oncology, 29 (1974), 190-200; Cullian a kol., Cancer Treat. Rep. 61 (1977), 1725-1726). I při léčbě leukemie se používá omezeně, protože má krátký biologický poločas a vysokou toxicitou.

Potřeba překonat tyto problémy vedla vědce k tomu, že začali připravovat a testovat pre-drogové deriváty Ara-C. Například Hamamura a kol. zkoumali 3'-acyl a 3',5'-diacyl deriváty Ara-C. (J. Med. Chem. 19 (1976) No. 5, 667-674). Tito vědci připravili a testovali četné Ara-C deriváty s nasycenými i nenasycenými esterovými skupinami obsahujícími od 2 do 22 uhlíkových atomů a zjistili, že mnoho sloučenin vykazuje vyšší aktivitu proti leukémii L 1210 myší než samotný výchozí nukleotid.

Práce Hamamury a kol. a dalších na predrogových analozích Ara-C byla shrnuta Hadfieldem a kol., v publikaci Advances in Pharmacology and Chemotherapy, 20, 1984, stany 21-67. V diskusi o 5'-esterech Ara-C tito autoři uvádějí (str. 27):

„...ačkoli mnohé tyto prostředky fungují jako velmi účinné depotní formy Ara-C u myší, analogické reakce v lidském organismu nebyla dosud prokázána.“

Přestože práce na pre-drogovém základu Ara-C včetně 3'- a 5'-acyl derivátů pokračovala, (viznapř. Rubas a kol. vint. J. Cancer, 37, 1986, str. 149-154, který zkoumal liposomální přípravky, mezi jiným, 5'-oleyl-Ara-C proti LI210 leukémii a melanomu B16) žádnou z látek se nepodařilo upravit tak, aby bylo možné podávat ji pacientům.

Mechanismus působení Ara-C spočívá v tom, že je enzymem rozpoznán jako 2'-deoxyribozid a následně fosforylován na nukleosid trifosfát, který soutěží s normálním CTP o včlenění do DNA. 2'-Hydroxylová skupina způsobuje sterickou překážku rotace pyrimidinové báze okolo nukleosidové vazby. Báze polyarabinonukleotidů se nemohou normálně skládat jako se skládají báze polydeoxynukleotidů. Ara-C inhibuje opětné spárování a syntézu DNA jak zpomalením prodlužování řetězce, tak pohybem nově replikované DNA v replikačním komplexu

-1 CZ 291612 B6 matrice-řetězce. Výsledkem mechanismu působení Ara-C je „nevyvážený růst“ v dělících se buňkách. Ara-C působící v S-fázi buněčného cyklu. Pro trvalou inhibici syntézy DNA a konečnou smrt buňky je podstatné, že Ara-C musí být přítomen v dostatečně vysoké koncentraci během alespoň jednoho buněčného cyklu.

Hlavní důvod, proč není Ara-C používán při léčbě pevných zhoubných nádorů je opět rychlá klírens aktivní látky z rakovinných buněk a plazmy. Je zjevně nemožné dosáhnout významné intracelulámí úrovně droby v neoplastické tkáni, a to i v případě, že by byl daný zhoubný nádor vnímaný k Ara-C in vitro. Pro terapeutický účinek výrobků podle vynálezu bude mít velký význam jejich překvapivě prodloužený biologický poločas a změněná distribuce do tkání.

Zjistili jsme, jak ukazuje obr. 7, 8, a 9, že 3' a 5'-O-estery Ara-C a určité nasycené a nenasycené mastné kyseliny mají neočekávaně dobrý účinek proti různým zhoubným nádorům na rozdíl od Ara-C samotné a také jiných mono- a diesterů.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou deriváty Ara-C obecného vzorce I:

kde R_1; R? jsou nezávisle vybrány z vodíku, elaidoylu, oleoylu, stearoylu, eikosenoylu (cis nebo trans) a eikosanoylu s výhradou, že R|, R₂ nejsou oba zároveň vodíky, oleoyly, elaidoyly, stearoylu nebo eikosanoylu, R] není vodík, když R₂ je oleoyl nebo stearoyl a R₂ není vodík, když Ri je elaidoyl, oleoyl stearoyl nebo eikosanoyl.

Dalším předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, která obsahuje Ara-C deriváty obecného vzorce I uvedeného výše a farmaceuticky přijatelný nosič nebo expicient.

Ještě dalším předmětem vynálezu je použití Ara-C derivátů obecného vzorce I uvedeného výše pro výrobu léčiva pro léčbu pevných tumorů a lymfomů, kde R,, R₂ jsou nezávisle vybrány z vodíku, Cis- a C₂o- nasycených a mononenasycených acylových skupin s výhradou že Rj, R₂ nejsou oba zároveň vodíky.

S výhodou se použijí Ara-C deriváty obecného vzorce I, kde Ri, R₂ jsou vybrány z vodíku a nasyceného nebo ω-9 mononenasycený Cig- a C₂₀-acylových skupin.

Výhodněji se použijí Ara-C deriváty obecného vzorce I, kde Ri je vodík a R₂ je elaidoylová nebo eikosenoylová (cis nebo trans)skupina.

Ara-C deriváty obecného vzorce I podle vynálezu se používají pro výrobu léčiva pro lokální léčbu pevných tumorů nebo lymfom, dále pro systémovou léčbu pevných tumorů a lymfomů. S výhodou se také používají pro léčbu pevných tumorů nebo lymfomů v retikuloendotelámím systému, v centrálním nervovém systému, pro léčbu metastazických tumorů.

-2CZ 291612 B6

Vynálezci jsou si vědomi, že testovací model, který je běžné užíván (injekce buněk napadených leukémií do abdominální dutiny myší a jeho léčení) odpovídá spíše modelu in vitro než reálné klinické situaci a může zkreslovat zejména cenné vlastnosti vybraných Ara-C esterů používa5 ných podle vynálezu, jak je popsáno dále.

Přesněji řečeno, jsou v tomto vynálezu použity 3'- a 5'-O-estery odvozené od Ci₈ nebo C₂o nasycených a mono-nenasycených mastných kyselin.

ío Tedy estery použité podle vynálezu mohou být zapsány obecným vzorcem I uvedeným výše.

Dvojná vazba mono-nenasycených acylových skupin může být buď v cis, nebo v trans konfiguraci, ovšem terapeutický účinek se může lišit podle toho, která konfigurace byla použita.

Zdá se, že také poloha dvojné vazby v mono-nenasycených acylových skupinách má vliv na aktivitu látky. Obvykle dáváme přednost použití esterů, které mají dvojnou vazbu v ω-9 poloze. (V ω-systému názvosloví je poloha (ω) dvojné vazby mononenasycené mastné kyseliny počítána od koncové methylové skupiny, takže například eikosenová kyselina (C20* 1 ω-9) má 20 uhlíkových atomů v řetězci a jediná dvojná vazba se nachází mezi uhlíkovými atomy 9 a 10, počítáme20 li od methylového konce řetězce). S výhodou se použijí estery Ara-C odvozené od kyseliny olejové (Ci₈:l, ω-9, cis), kyseliny elaidové (Ci₈:1, -9, trans) a kyseliny eikosenové (C₂₀: 1, ω-9, cis) a (C₂₀:1, ω-9, trans) a kyseliny stearové (Ci₈:0) a kyseliny eikosanové (C₂o:0).

Podle vynálezu mohou být použity při léčbě různých zhoubných nádorů jak 3'-O- a 5'0-mono25 estery tak 3',5'-O-diestery, ale všeobecně je dávána přednost 5'-0-monoesterům. Očekává se, že 3',5'-O-diestery budou užitečné v těchto případech, kdy jsou lipofilní vlastnosti výhodou, tj. absorpce nebo vychytávání v tukových tkáních.

Sloučeniny obecného vzorce I, jak je uvedeno výše jsou nové sloučeniny v dosavadních techno30 logiích neznámé.

Přesněji jsou tyto nové sloučeniny definovány v níže uvedené tabulce A

Tabulka A

Rj	r2
vodík	elaidoyl
vodík	eikosenoyl (cis)
vodík	eikosenoyl (trans)
eikosenoyl (cis)	vodík
eikosenoyl (trans)	vodík
eikosenoyl (cis)	eikosenoyl (cis)
eikosenoyl (trans)	eikosenoyl (trans)
eikosenoyl (cis)	eikosenoyl (trans)
eikosenoyl (trans)	eikosenoyl (cis)
eikosenoyl (cis)	elaidoyl
eikosenoyl (trans)	elaidoyl
elaidoyl	eikosenoyl (cis)
elaidoyl	eikosenoyl (trans)
eikosenoyl (cis)	oleoyl
eikosenoyl (trans)	oleoyl
oleoyl	eikosenoyl (cis)
oleoyl	eikosenoyl (cis)

eikosanoyl	eikosanoyl
eikosanoyl	stearoyl
stearoyl	eikosanoyl
elaidoyl	stearoyl
eikosenoyl (cis)	stearoyl
eikosenoyl (trans)	stearoyl
elaidoyl	eikosanoyl
eikosenoyl (cis)	eikosanoyl
eikosenoyl (trans)	eikosanoyl
stearoyl	oleoyl
oleyoyl	stearoyl

Limitujícím faktorem pro použití Ara-C je jeho degradace cytidin deaminázou a deoxycytidinmonofosfát (dCMP) deaminázou na neaktivní metabolity. Bylo zjištěno, že monoestery podle vynálezu jsou nevhodnými substráty pro uvedené deaktivační enzymy. Tento rozdíl by mohl znamenat, že jsou esterové deriváty vhodnější pro systemickou nebo lokální léčbu zhoubných nádorů, zejména zhoubných nádorů v RES a CNS, než samotná Ara-C.

To je jasně ukázáno na modelu mozkové metastázy leukemie (obr. 10, 11 a 12), ale zejména s agresivnějšími B-buňkami lymfomu na obr. 11, kde Ara-C samotná je zbavena aktivity.

Při klinické léčbě myeloidní leukemie je rychlá deaktivace Ara-C kompenzována nepřetržitý podáváním látky po dobu 5 až 7 dní, aby bylo dosaženo poměrně stálé úrovně terapeuticky aktivní Ara-C v plazmě. Ukázalo se, že po intravenózním podání ekvimolámího množství radioaktivně označeného Ara-C a Ara-C-5'-elaidového esteru krysám, je dosaženo blahodárné změny v metabolismu krys a exkrečním profilu. Jak je patrné z tab. 1 a na obr. 20, po podání Ara-C-5'-elaidového esteru lze pozorovat, jak vyšší koncentraci látky v celé krvi a plazmě, tak pomalejší přeměnu aktivní látky na Ara-U. Zatímco úroveň Ara-C i Ara-U v plazmě klesne pod detekovatelný limit za 48 hodin od chvíle, kdy byl podán čistý Ara-C, po podání Ara-C-5elaidátu mohou být tyto dvě sloučeniny kvantifikovány ještě po 27 hodin. Jak můžeme vidět z tab. 2, celkové vyloučené množství Ara-U (AUC, 0—72h) je stejné pro obě podané látky. V klinické praxi se tyto výsledky odrážejí v širším časovém intervalu po který je v krvi přítomna terapeuticky aktivní koncentrace Ara-C. V modelu leukemie in vivo, který je popsán na obr. 13, jsou srovnávány Ara-C a 5'-eladický ester. Podobné anti-rakovinné účinky dosažené s Ara-C jsou dosaženy podáním 1/20 molámí dávky esteru.

Jestliže lze u esterových derivátů pozorovat podobný profil toxicity jako u klinického použití Ara-C, zlepšení terapeutického indexu by mělo být ve stejném poměru (20x) jako zlepšení dávka/účinek.

Největší význam při léčení leukemie a dalších nemocí napadajících retikoloendotelámí systém (RES) má samozřejmě časový interval, po který je aktivní droga přítomna v plazmě v dostatečné koncentraci, ale rozmístění aktivní sloučeniny do retikuloendotelámích tkání (což jsou játra, slezina, lymfa, plíce, střevní stěna a volné fagocytující buňky přítomné například v morku kostí a v krvi) bude mít také velký význam. Pozorovali jsme (obr. 21 a tab. 1), že při intravenózním podání ekvimolámího množství Ara-C a Ara-C-5'-elaidového esteru, je koncentrace aktivní drogy v RES tkáních výrazně vyšší, a trvá po delší časový interval při dávkování esterových derivátů. Průběh distribuce a metabolismu je detailněji zkoumán a výsledky výzkumu jatemí tkáně jsou shrnuty na obr. 19. Terapeuticky významná úroveň Ara-C trvá nejméně 72 hodin po podání dávky esterového derivátu. To může umožnit léčbu původní rakoviny jater nebo jatemích metastáz, rakoviny colo-recta, prsu, pigmentových buněk nebo jiných druhů rakoviny. Léčení může být naordinováno jako mono-terapie, nebo jako paliativní/adjuvantní léčba v kombinaci s chirurgickou léčbou, ozařováním nebo chemoterapií.

-4CZ 291612 B6

Zvý šené koncentrace Ara-C lze také pozorovat v jiných tkáních, a to, ve spojení s menším objemem distribuce, může otevřít nové možnosti pro terapii Ara-C esterů v rakovinných novotvarech, které nejsou obvykle spojovány s léčbou pomocí Ara-C.

Mimoto se neočekávaně ukázalo, že estery tohoto vynálezu (obr. 15) stimulují větší stupeň aktivity NFkappaB, zatímco Ara-C nemá v tomto směru žádný účinek. Stimulace je biologický jev neobvyklý u terapeutických chemikálií a zvláště u konvenčních cytostatik. Můžeme se tedy domnívat, že Ara-C estery tohoto vynálezu stimulují některé imunitní formy, což může opět vysvětlovat překvapující zlepšení anti-rakovinného efektu. Tento fakt může být velmi důležitý při léčbě neoplastických onemocnění, která s sebou přinášejí imunokompetentní buňky jako je leukemie a lymphomy.

Vývoj rezistentních rakovinných buněk je velkým problémem pro současnou chemoterapeutickou léčbu rakoviny. Objevili jsme (obr. 7-9), že Ara-C deriváty tohoto vynálezu vykazují stejný efekt proti Cis-platina rezistentních buňkám (NHIK 3025/DDP) a MDR rezistentním buňkám (A549) jako proti odpovídajícím nerezistentním buněčným liniím. Jsme toho názoru, že důvodem je fakt, že deriváty nejsou substráty pro buněčné exkreční mechanismy, jako je „gp 120 MDR pumpa“, odpovědná zajev známý jako multi drogové rezistance.

Cu a C₂o mono- a di-estery Ara-C mohou být podle tohoto vynálezu použity u mnoha neoplastických rakovinných nádorů. Zjistili jsme obzvláště slibný efekt na rakovinné nádory mozku jako je gliom, a metastázy jiných rakovinných nádorů jako např. sarkomu, karcinomu, stejně jako na leukémii. Obvykle bývají gliomy léčeny chirurgicky, ozařováním a cytostatiky, například N,Ncis(2-chloroethyl)-N-nitroso-močovinou (BCNU). Avšak výsledky těchto způsobů léčby jsou velmi neuspokojivé.

Užitečné působení Ara-C esterů podle vynálezu bylo také zjištěno v metastazických nádorech jako jsou karcinomy, sarkomy, leukemie a melanomy.

Rozsah vynálezu a jeho podstatné a nejvýznamnější charakteristické rysy jsou definovány v přiložených patentových nárocích.

Biologické účinky

Micelámí přípravek mg/ml micellar přípravku získáme smísením l:l(w/w) Ara-C esteru (v DMSO) a lecitinu (v ethanolu) ve sterilní vodě.

Nakloňování na agaróze

Vzorek určený k biopsii byl ihned po odebrané pacientovi umístěn na živnou půdu. Tkáň nádoru byla mechanicky rozmělněna a živé buňky odděleny, byla přidána chemoterapeutická testovací látka BCNU (ve vodě) a Ara-C a Ara-C estery (v micelách), a buňky byly pěstovány na lehké agarózové půdě. Dvacetčtyři hodin před koncem kultivace (7 dní) byl přidán ³H thimidin. Aktivita testovací látky je tak vypočtena jako cpm ve scintilačním počítači.

^(I)G. Unsgaard a kol., Acta Neurochir (Wien) (1988) 91:60-66.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1

Tyto xýsledky jsme získali při studiu glioblastomu odňatého pacientovi. Stejnou modelovou reakci najdeme u 8 dalších biopsií glioblastomu. Graf ukazuje srovnání in vitro Ara-C a 3'—elaidyl esteru a 5'—elaidyl esteru. Výsledky udáváme v % neléčené kontrolní skupiny. Počet 50% (CDjo) ukazuje na zřetelnou možnost použití látky v terapii této aktuální rakovinné linie. Co je zde úplně zbytečné je vyšší koncentrace Ara-C než je 10¹’, což je třeba k získání CD50 jako srovnání s elaidyl estery.

Obr. 2

Ukazuje výsledky získané studiem stejného glioblastomu jako obr. 1 Graf srovnává ozařování a chemoterapii (BCNU).

Dávka ozařování vyšší než 10 Gray (Gy) potřebná k získání CD₅₀ nemá v terapii žádný praktický význam. Srovnáme-li obr 1 a obr. 2 zjistíme, že koncentrace BCNU potřebná k získání CD₅₀ je přibližně desetkrát vyšší než koncentrace Ara-C esterů, ale rozumně srovnatelná s Ara-C samotným.

Obr. 3

Tyto výsiedky jsme získali biopsií mozkové metastázy melanomu. Rozdíl mezi Ara-C a 3' a 5'—elaidyl estery zde není tak výrazný jako u gliomu, aleje stále řádově desetkrát vyšší.

Obr. 4

Ukazuje vliv BCNU na buněčnou linii melanomu. Ve srovnání s Ara-C estery je zde CBNU potřebná ve více než lx 10² vyšší koncentraci k dosažení CD₅₀.

Obr. 5

Tento graf znázorňuje výsledky studia mozkové metastázy karcinomu (plíce). Tyto rakovinné buňky jsou více rezistentní k chemoterapii, ale rozdíl mezi Ara-C a Ara-C estery je stále zřetelný.

Obr. 6

Výsledky léčení mozkové metastázy karcinomu (plíce) pomocí BCNU, které jsou zde předkládány, odpovídající výsledkům ostatních pokusů na jiných buněčných liniích.

Vezmeme-li v úvahu různé typy vyšetřovaných buněk, zdá se, že je zde výrazný rozdíl v aktivitě mezi Ara-C estery, Ara-C samotným a BCNU. Potenciál lx 10² je velmi nadějný pro terapeutické použití. Výsledky ukazují, že 5' estery jsou poněkud silnější než 3' estery.

Inaktivace buněk - schopnost tvoření kolonií

Inaktivace buněk měřená pomocí ztráty schopnosti tvořit kolonie byly určeny pro několik sloučenin. Použité buňky byly vzaty ze standardní linie lidských buněk rakoviny slepého střeva z in šitu zdroje, NHIK. 3025, NHIK 3025/DDP, cis-DDP rezistentní varianta stejných buněk nebo A549 buněk (lidský plicní karcinom). Buňky byly vystaveny testované sloučeniny po dobu 4 až 24 hodin. Testované sloučeniny byly podány jako micelámí roztok. Počet kolonií byl zjištěn po asi 12-ti denní inkubační době.

-6CZ 291612 B6

Obr. 7

Graf ukazuje srovnání in vitro testovaných sloučenin Ara-C, Ara-C-5'-elaidyl esteru, Ara-C5'-eikosen esteru a Ara-C-5'-petroselin esteru. Výsledky jsou udávány jako dávky potřebné 5 k redukci buněčného přežití s 90-ti % oproti neléčené kontrolní skupině. Jak je vidět z grafu, ve srovnání s působením Ara-C samotné je inaktivace HNIK 3025 buněk po působení esterů podstatně vyšší. Dávka odpovídají faktoru 10% úrovně přežívání se pohybuje v rozmezí 3 až 5 pro Ara-C estery ve srovnání s Ara-C, což znamená, že je potřeba 3 až 5krát vyšší dávka Ara-C k dosažení stejné schopnosti redukovat kolonie jaká byla pozorována u esterů.

Obr. 8

Tyto výsledky jsme získali po 4hodinovém léčení NHIK 3025/DDP buněk. Zvýšený efekt Ara-C-5'-elaidového esteru ve srovnání s Ara-C lze pozorovat podobně jako u NHIK 3025 15 buněk. Zvýšený efekt nezávisí na rezistenci k cis-DDP.

Obr. 9

Graf ukazuje in vitro výsledky pozorování schopnosti tvořit kolonie u A549 buněk (buňky lidské20 ho karcinomu plic) ve srovnání s testovanými sloučeninami Ara-C, Ara-C-5'-elaidyl esterem,

Ara-C-5'-stearyl esterem, Ara-C-5'-eikosen esterem a Ara-C-5'-petroselin esterem. Buňky byly exponovány po dobu 24 hodin. Nejvyšší inaktivace byla pozorována u Ara-C-5'-petrolin esteru, ale zvýšený efekt lze také pozorovat u elaidyl a petroselin esterů.

Ráji buňky lidského B-lymfomu - model leptomeningální karcinomytosy lysých krys

Jako model pro leptomeningální růst tumorů je zde použit model tumoru lysých krys, lx 10⁶ buněk B-buněčné tumorové linie Ráji bylo naočkováno do míšního mozku skrze cisterna magna (c.m.) 4-5 týdnů starých lysých krys. Zvířata onemocní neurologickými symptomy za 30 12 - 14 dní v případě, že nejsou léčena. Zvířata v narkóze byla léčena intracerebrálně injekcí 40 1 do cisterna magna 3 nebo 4 bolus injekcemi. Léčení začalo 1 den po inakulaci buněk. Testované sloučeniny byly Ara-C-5'-elaidyl ester (v micelách) a Ara-C. Ara-C byl podán jak v maximální snesitelné dávce (MTD), tak v dávce ekvimolámí s Ara-C-5'-elaidyl esterem. U kontrolních zvířat (léčená NaCl) nebo prázdnými liposomy (micely bez Ara-C esterů) se projevily symptomy 35 onemocnění centrálního nervového systému po přibližně 14 dnech.

Obr. 10 bolus injekce s Ara-C-elaidátem ve dnech 1,2 a 4 zvýšily latenční období bez symtomů na 40 1 30% oproti Ara-C a průměrný den úmrtí se zpozdil ze dne 13 na den 30,5, jak ukazuje obr. 10.

Jedna krysa přežila po více než 70 dní a byla pokládána na vyléčenou. Při necropsii prováděn 76. den, nebyly viditelné žádné tumory. Toto zvýšení v přežívání zdravých je lepší než výsledky získané s jinými terapeutickými alternativami testovaných na srovnatelných modelech pro různé typy lidských tumorů.

Obr. 11

Tento obr. ukazuje křivky přežívání ze zmíněného experimentu s lysými krysami naočkovanými Ráji buňkami do mozku, léčenými 4 bolus dávkami. Byla podávána bolus dávka denně ve dnech 50 1, 2, 3 a 4 do cisterna magna. Jako u předchozího experimentu nebylo pozorováno žádné působení Ara-C, ani při maximální přípustné dávce Ara-C(MTD) ani při dávce ekvimolámí s Ara-C-elaidátem. Výsledky pro skupinu danou Ara-C-elaidátem byly daleko překvapivější než u předchozího experimentu. 3 z 5 krys byly dosud naživu a bez symptomů i 70. den. Byly považovány za vyléčené. To je již nadějnější výsledek. 5 ze 6 kontrolních krys pošlo ve dni 13.

-7CZ 291612 B6

Šestá kontrolní krysa neměla žádný návrat míšního moku do stříkačky po injekci nádorových buněk a žádné neurologické symptomy po 70 dnech. V souladu s běžnými postupy nebylo toto zvíře zahrnuto do výsledků.

Molt 4 buňky lidského lymfomu - model íeptomeningální karconomatosy lysých krys

Modelem použitým pro Íeptomeningální růst nádorů je model nádoru lysých krys. 10⁶ buněk T-buněčné nádorové linie Molt 4 bylo vstříknuto skrze cisterna magna (c. m.) do míšního moku 4-5 týdnů starých lysých krys. Zvířata jevila neurologické symptomy po 20 - 22 dnech v případě, že nebyla léčena. Zvířata v narkóze byla léčena intracerebrálně injekcí 40 μΐ do cisterna magna 4 bolus injekcemi. Léčení bylo započato 1 den po buněčné inokulaci. Testované sloučeniny byly Ara-C-5, -elaidyl ester (v micelách) a Ara-C. Ara-C byla podána jak v maximální snesitelné dávce (MTD), tak v dávce ekvimolámí s Ara-C-5'-elaidyl ester. U kontrolních zvířat (léčená NaCl) se projevily symptomy onemocnění centrálního nerovového systému po přibližně 20 dnech.

Obr. 12

Na obr. 12 je znázorněno přežívání jako funkce času u krys naočkovaných do mozku MOlt 4 lymfomovými buňkami a léčených 4x do cisterna magna. V tomto počátečním experimentu byl zdržen začátek umírání u zvířat, která byla léčena Ara-C-elaidátem ve srovnání s kontrolními zvířaty, která dostala Ara-C. Počet zvířat na skupinu byl: Kontrola (7), Ara-C-elaidát (3) a Ara-C (5).

Model leukemie používající Ráji buňky lidského B-lymfomu

SCID myši byly naočkovány intravenózně lxlO⁶ Ráji buňkami lidského B-lymfomu. Myši byly léčeny ve dnech 7, 9, 11, 13 a 15 po injekci nádorových buněk buď 20 mg/kg/den Ara-Celaidátem, nebo 200 mg/kg/den Ara-C jako kontrolou. U zvířat se projevila paralýza zadních nohou v důsledku růstu tumoru. Průměrný den smrti zvířat léčených různými způsoby je vidět na obr. 13.

Obr. 13

Na tomto obr. je znázorněno průměrné přežití SCID myší naočkovaných intravenózně Ráji buňkami lidského B-lymfomu, léčených intravenózně jednou injekcí v každém ze dnů 7, 9, 11, 13 a 15 oběma Ara-C-elaidátem, Ara-C nebo kontrolou. Dávky byly 20 mg/kg Ara-C-elaidátu a 200 mg/kg Ara-C. Na ekvimolámím základu, 20krát redukovaná dávka Ara-C-elaidátu ve srovnání s dávkou Ara-C zvýšila průměrné přežívání oproti kontrole a Ara-C léčených zvířatům. Počet zvířat v každé skupině byl 7.

Obr. 14

Na tomto obr. je znázorněno průměrné přežití SCID myší naočkovaných intravenózně Ráji buňkami lidského B-lymfomu, léčených intraperitoneálně jednou injekcí v každém ze dnů 7-11 jak Ara-C-elaidátem tak Ara-C. Průměrná doba přežívání je velmi prodloužena u Ara-Celaidátu když je léčba opakována denně místo každý druhý den.

Aktivace buněčného transkripčního fakturu NFkappaB

Byly využity buňky lidského SW480 adenocarcinomu tlustého střeva, na které byl převeden CMV promotor obsahující gen pro β-galaktozidázu. Aktivace transkripčního faktoru NFkappaB se projevila zvýšeným množstvím β-galaktozidázy v cytoplazmě. Množství β-galaktozídázy je určováno pomocí optické hustoty při 570 nm. Buňky SW380 měly 2-3 dny inkubační dobu před

-8CZ 291612 B6 vystavením testované sloučeniny na dobu 4 hodin. Buňky byly promyty a připraveny a optická hustota byla zaznamenávána pro různé sloučeniny.

Obr. 15

Po expozici Ara-C nebyla naměřena žádná aktivita β-galaktosidázy, zatímco po exposici AraC-elaidátu byl pozorován podstatný vzrůst aktivity β-galaktosidázy jako zvýšení optické hustoty při 570 nm. To dokazuje, že Ara-C-elaidát způsobuje vysokou indukci transkripčního aktivátorového proteinu NF-kappa-B. NF-kappaB se účastní genové kontroly oblasti imunitních faktorů, a její aktivace pomocí Ara-C-elaidátu může vysvětlovat zlepšení protirakovinného působení pozorovaného u Ara-C-elaidátu. Stimulace určitých imunitních buněk Ara-C-elaidátem, kterou můžeme předpokládat, bude zajímavá zejména z hlediska léčení leukemie a lymfomů.

Protinádorová aktivita Ara-C-elaidátu versus Ara-C proti TLX/5 lymfomu myší

CBA myši vážící 20 - 25 g byly naočkovány subkutanálně 1 x 10⁶ TLX/5 nádorovými buňkami dne 0. Ara-C-elaidát nebo Ara-C byly podány intraperitoneálně ve dnech 3, 4, 5, 6 a 7. Dávky byly v rozmezí 6,25 - 50 mg/kg/den. V každé léčené skupině bylo 5 myší á 10 kontrolních myší nesoucích nádor. Aktivita byla posouzena podle vzrůstu doby přežití (ILS) oproti kontrole.

Obr. 16

Tento obr. ukazuje % vzrůst doby přežití (střední 5 na skupinu) myší s TLX/5 lymfomovým nádorem po léčení Ara-C-elaidátem nebo Ara-C, i.p léčení po 5 dní. Ara-C byl aktivní pouze v dávce 25 mg/kg, zatímco Ara-C-elaidát byl aktivní v dávkách 12,5 mg/kg a 25 mg/kg. Maximální vzrůst doby přežití byl 47,2 % ve srovnání s 32,7 % u Ara-C.

Protinádorová aktivita Ara-C-elaidátu ve srovnání s Ara-C v SCID myších, které byly intraperitoneálně naočkovány buňkami hemangiosarkomu.

SCID myši byly intraperitoneálně naočkovány PV/2B/35 hemangiosarkomovými buňkami. Myši byly léčeny 5 dnů v týdnu podáním 25 mg/kg/den Ara-C-elaidátu připraveného v micelách, Ara-C-elaidátu rozpuštěného v DMSO nebo Ara-C rozpuštěného v PBS. Kontrolou byly prázdné micely, respektive DMSO nebo PBS. Zvířata nebyla léčena přes víkend. Sledovali jsme přežívání myší.

Obr. 17

Přežívání myší intraperitoneálně naočkovaných PV/2b/35 hemangiosarkomovými buňkami. Přežívání bylo značně zvýšeno u zvířat léčených Ara-C-elaidátem. Zvýšené přežívání ve srovnání s kontrolou bylo pozorováno jak u Ara-C-elaidátu připraveného v micelách, tak u Ara-C-elaidátu rozpuštěného v DMSO.

Obr. 18

Zde jsou znázorněny výsledky studia působení 5'-Ara-C-elaidy esteru na glioblastomový nádor rostoucí v lysých krysách. Buněčná kultura glioblastomové buněčné linie U-l 18 (Uppsala) byla subcutaneálně naočkována do lysých krys. Malá část (2x2 mm) rostoucího tumoru byla přemístěna do nových myší. Subcutaneální tumory jeví poněkud rozdílnou rychlost růstu v různých zvířatech, ale na velikost 4 až 6 mm byla podána intratumorálně injekce s 10 mg/ml micelámího roztoku Ara-C esteru. V závislosti na aktuální velikosti tumoru dostane zvíře stejné relativní množství testované látky. Jako kontrola byla použita slaná voda. Rychlost růstu byla zaznamenávána jako poměrný objem nádoru (RTV). Růst kontrolního tumoru se nějak neodlišoval od obvyklého růstu tohoto typu rakoviny. Podstatné je, že růst tumoru se u léčených zvířat úplně zastavil. A navíc, zvířata nevykazovala žádné známky vedlejších účinků léku, což

-9CZ 291612 B6 jsou v případě Ara-C poškození kostní dřeně spolu s rozvojem anemie nebo krvácením ani změny v CNS.

Poměrná farmakokineze, distribuce, metabolismus a vylučování ¹⁴C-Ara-C elaidátu a ¹⁴C-AraC podávaných intravenózně samcům krys.

¹⁴C-Ara-C-elaidát (v micelách) nebo ¹⁴C-Ara-C byly intravenózně podávány krysím samcům v ekvimolámích dávkách 5 mg/kg pro ¹⁴C-Ara-C-elaidát a 2,4 mg/kg pro ^l4C-Ara-C. Hladina celkové radioaktivity a koncentrace metabolitů v plazmě byly určovány v různých časových okamžicích. Hladina celkové radioaktivity v tkáni byla určena pro řadu tkání v různých časových okamžicích až do 120 hodin po injekci. 72 hodin po injekci byl odebrána jatemí tkáň a změřena koncentrace metabolitů. Rozložení Ara-C-elaidátu v tkáních se významně změnilo ve srovnání s rozložením Ara-C. Maximální koncentrace ve většině tkání byla pozoruhodně vyšší a nastala v pozdějších časových okamžicích pro podání ^l4C-Ara-C-alaidátu, zejména v celé-krvi, plazmě, slezině, játrech a plicích. Maximální koncentrace ve svalu, slinných žlázách, kůži a močovém měchýři byly nižší. Poměrné množství dávky v celé krvi 0,08 hodiny po podání ^I4C-Ara-Celaidátu bylo určeno na 64,7 %, což je pozoruhodně vyšší než poměrné množství přítomné v systémové cirkulaci ve stejném časovém okamžiku po podání ¹⁴C-Ara-C (7,76 %). Vyloučení přes ledvinový systém bylo mnohem pomalejší pro elaidát než pro Ara-C samotný. Eliminace z tkání byly mnohem pomalejší pro ¹⁴C-Ara-C-elaidát ve srovnání s eliminací z tkání po pcdání ^l4C-Ara-C.

Tabulka 1

Maximální hodnota radioaktivity (vyjádřena jako pg ekvivalentů/g) po podání ekvimolámích dávek ¹⁴C-Ara-C-elaidátu nebo ¹⁴C-Ára-C s odpovídajícími časovými okamžiky pro maximální koncentraci. Jak je vidět z tabulky, maximální koncentrace pro tyto dvě sloučeniny nastává v různých tkáních v různých časových okamžicích.

Tabulka 1

Tkáň	14C-Ara-C-elaidát(tmax h)	^C-Ara-Cít.J5)
slezina	175,2 (0,25)	2,406 (0,08)
plazma	55,60 (0,08	3,058 (0,08)
celá krev	47,32 (0,08)	2,707 (0,08)
játra	42,37 (1 hod.)	2,526 (0,08)
krevní buňky	34,37 (0,08)	2,201 (0,08)
plíce	28,97 (0,08)	2,144 (0,08)
véna céva	17,29 (0,08)	1,887 (0,25)

-10CZ 291612 B6

Tabulka 1

Tkáň	14C-Ara-C-e I a i d át(tmax h)	l4C-Ara-C(tmax h)
kostní dřeň	13,29(1 hod.)	1,950 (0,08)
srdce	10,15(0,08)	1,916(0,25)
ledvina	9,108 (0,08)	7,752 (0,08)
prostata	9,014(4 hod.)	2,810(0,25)
hypofýza	8,359 (0,08)	0,931 (0,08)
aorta	7,795 (0,08)	2,213 (0,08)
močový měchýř	6,421 (4 hod.)	13,07(1 hod)
nadledviny	5,229 (0,08)	1,764 (0,08)
slinné žlázy	2,366 (0,25)	2,505 (0,08)
slzné žlázy	4,438 (4 hod.)	2,460 (0,08)
lymfatické uzliny	2,831 (1 hod.)	2,222 (0,08)
kůže	1,793 (0,25)	2,189 (0,08)
sval	1,990 (0,25)	2,158(0,08)
slinivka	2,817(0,08)	2,148 (0,08)
brzlík	2,090 (0,25)	2,054 (0,08)
mozek	1,408(0,08)	0,233 (1 hod.)

Tabulka 2

Vylučování radioaktivity (% dávky) po intravenózním podání ^l4C-Ara-C-elaidátu (5 mg/kg) nebo ¹⁴C-Ara-C (2,4 mg/kg) krysím samcům. Rychlost vylučování radioaktivity v moči je pomalejší pro ^,4C-Ara-C-elaidát než pro ^l4C-Ara-C.

Tabulka 2

Vzorek/čas	l4C-Ara-C-elaidát	14C-Ara-C
0-6	59,1 ±3,7	85,3 ±3,1
6-24	34,1 ±2,5	8,8 ± 1,9
24-48	2,7 ± 0,8	0,5 ± 0,3
48-72	0,5 ±0,1	0,2 ±<0,1
72-96	0,2 ±0,1	0,2 ± 0,1
96-120	0,1 ±<0,1	0,1 ±0,1

Obr. 19

Na obr. 19 jsou koncentrace Ara-C-elaidátu (P-A-C-el) a metabolitů Ara-C (P-Ara-C) a Ara-U (P-Ara-U) v játrech vynášeny jako funkce času po injekci ¹⁴C-Ara-C-elaidátu, a stejně tak koncentrace Ara-C (Ara-C) a metabolitů Ara-U (Ara-U) jako funkce času po injekci ¹⁴C-Ara-C samotného. Injekce Ara-C-elaidátu podstatně zvyšuje a prodlužuje expoxici krysích jater Ara-C-elaidátu i Ara-C, bez přítomnosti Ara-U po více než 24 hodin. To je ve velkém kontrastu ke koncentraci Ara-C v játrech po podání Ara-C jako takové. Koncentrace Ara-C v játrech se snížila na nedetekovatelnou úroveň po 4 hodinách, a metabolit Ara-U byl přítomen ve všech časových bodech.

-11 CZ 291612 B6

Obr. 20

Množství Ara-C-elaidátu a metabolitů Ara-C a Ara-U v plazmě po intravenózním podání ¹⁴C-Ara-C-elaidátu je zde znázorněno jako funkce času, stejně jako množství Ara-C a metabo5 litu Ara-U v plazmě po intravenózním podání ^l4C-Ara-C. Podání Ara-C-elaidátu zvyšuje úroveň Ara-C a prodlužuje dobu jeho působení v plazmě. Ara-C je v plazmě detekovatelný ještě 72 hodin po injekci, zatímco po podání Ara-C není možné látku v plazmě zjistit již po 24 hodinách. Metabolická přeměna Ara-C na Ara-U je méně rozsáhlá a začíná později u zvířat, která byla léčena Ara-C-elaidátem.

Obr. 21

Koncentrace celkové radioaktivity v tkáni je vynášena jako funkce času po intravenózním podání buď ¹⁴C-Ara-C-elaidátu (P), nebo ¹⁴C-Ara-C. Tkáně popsané vgrafu jsou játra, slezina, plíce, 15 kost a kostní dřeň. Koncentrace radioaktivity po injekci ¹⁴C-Ara-C-elaidátu je vyšší ve všech bodech času až do 120 hodin pro všechny dané tkáně.

Ara-C estery tohoto vynálezu mohou být připravovány s konvenčními nosiči a lékovými materiály.

Za lepší pro léčení gliomů a jiných pevných mozkových nádorů obvykle považujeme lokální aplikaci aktivních sloučenin do stěny tumoru. Pro tento účel mohly být aktivní sloučeniny přítomny raději jako lecitin micelámí roztok. Například, dáme přednost léčení mozkových metastáz podáním roztoku Ara-C esteru do míšního moku nebo do tumorové oblasti pomocí dávkovači 25 pumpy nebo jednoduchého zařízení.

Ara-C estery tohoto vynálezu mohou být také podávány systémově, buď enterálně, nebo parenterálně.

Pro enterální podání mohou být aktivní sloučeniny vynálezu přítomny jako např. měkké nebo tvrdé želatinové kapsle, tablety, granule, zrnka nebo prášek, dražé, sirupy, suspenze nebo roztoky.

Když jsou podávány parenterálně, jsou vhodné preparáty Ara-C esterů jako injekční nebo infuzní 35 roztoky, suspenze nebo emulze.

Přípravek může obsahovat inertní nebo farmakodynamicky aktivní přídavky, které jsou dobře známé odborníkům farmaceutického průmyslu. Například, tablety nebo granule mohou obsahovat řadu vazných prostředků, plniva, emulzifikátory, nosné látky nebo ředidla. Tekuté přípravky 40 mohou být například ve formě sterilního roztoku. Kapsle mohou obsahovat kromě aktivní ingredience plnidla nebo zahušťovací přípravky. Dále mohou být také přítomny vůni zlepšující přídavky, stejně jako látky obvykle používané jako konzervační, stabilizující, pohlcovače vlhkosti a emulgující přípravky, soli pro kolísání osmotického tlaku, pufry a další.

Dávkování přípravků tohoto vynálezu bude velmi kolísat v závislosti na technice a způsobu podávání a na potřebách konkrétního pacienta. Zejména denní dávky pro systémovou terapii průměrného dospělého pacienta budou okolo 0,1 - 150mg/kg tělesné váhy/den, častěji 1 50 mg/kg/den. Pro vnější aplikaci, například u mastí, může přípravek obsahovat od 0,1 10 hmotnostních % farmaceutické směsi, častěji 0,5 - 5 váhových procent.

Je zapotřebí, že farmaceutické preparáty obsahující Ara-C estery obsahovaly antioxidanty, např. tocopherol, N-methyl-tocypheramin, butylovaný hydroxyanisol, kyselinu askorbovou nebo butylovaný hydroxytoluen.

- 12CZ 291612 B6

Předpokládají se také kombinované terapie, tj. terapie ve kterých je podávání Ara-C esterů tohoto vynálezu kombinováno s jinými terapiemi, např. chirurgickou léčbu, ozařováním a chemoterapií.

Například při léčbě mozkových nádorů se zdá být nejlepší kombinace chirurgie a léčení Ara-C estery tohoto vynálezu systémovým nebo místním podáním.

Estery Ara-C tohoto vynálezu jsou obvykle připravovány podle následující reakční rovnice:

báze

Nu - OH + FaX----> Nu - O - Fa

-HX kde Nu-OH znamená Ara-C, O je kyslík na 3' a/nebo 5' pozici cukerné části Ara-C, Fa je acylová skupina nasycené nebo nenasycené C|_g nebo C₂₀ mastné kyseliny, a X může být Cl, Br nebo OR' kde R' je Fa, COCH₃, COEt nebo COCF₃.

V průběhu reakce tedy dochází k acylací nukleosidu. Toho se docílí použitím vhodných funkčních derivátů mastných kyselin, zejména halogenidů kyselin nebo anhydridů kyselin. Pokud se použije halogenid kyseliny, např. acylchlorid, přidá se do reakční směsi k navázání uvolněné hydrohalogenické kyseliny katalyzátor v podobě terciálního aminu, jako je např. triethylamin, Ν,Ν-dimethylamin, pyridin nebo Ν,Ν-dimethylaminopyridin. Reakce se raději provádějí v inertním rozpouštědle jako je Ν,Ν-dimethylformamid nebo halogenovaný uhlovodík, jako je dichlormethan. Jestliže je třeba provést některou z výše zmíněných reakcí, mohou být použity jako rozpouštědlo katalyzátory v podobě terciálních aminů, čímž je dosaženo vhodného nadbytku. Reakce by měla být raději držena při teplotě mezí 5 °C a 25 °C. Po uplynutí 24 až 60 hodin bude reakce jistě dokončena. Vývoj reakce může být sledována pomocí chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a korigována vhodnými systémy rozpouštědel. Když je pomocí TLC zjištěno ukončení reakce, je produkt vzat s organickým rozpouštědlem a očištěn chromatografií a/nebo rekrystalizací od rozpouštědel. Pokud je přítomna více než jedna hydroxylová skupina a také amino skupina v Ara-C, je vyrobena směs acylovaných sloučenin. Jednotlivé požadované mono-a di-O-estery mohou být odděleny například chromatograficky, krystalizací, nadkritickým odběrem atd.

Pokud je žádoucí připravit diesterovou sloučeninu vzorce I, kde R| a R₂ jsou stejné acylové skupiny, je lepší použít výše zmíněnou metodu využívající vhodného acylchloridu v nadbytku.

Aby se připravila diesterová sloučenina obecného vzorce I, kde R] a R₂ jsou rozdílné, je lepší nejdříve připravit buď 3'-, nebo 5'-monoester a pak reagovat monoester s vlastním acylchloridem.

Toto bude ukázáno na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

5'-O-(elaidoyl) 1-D-arabinofuranosyl-cytosin^1,2

K suspenzi Ara-C-HCl (1,007 g, 3,6xl0³ mol) v 15 ml dimethylacetamidu (DMA) byl přidán roztok elaidoylchloridu (1,26 g, 4,2xl0’³mol) v 5 mi DMA a směs byla míchána při teplotě 30 °C po dobu 22 hodin. Rozpouštědlo bylo ve vakuu odpařeno a zbytek se nechal reagovat s horkým ethyl-acetátem a byl přefiltrován. Hotový produkt reagoval s 2M NaHCO₃ aq., načež

-13CZ 291612 B6 byl přefiltrován a přečištěn na sloupci křemičitého gelu s methanolem (5 30 %) v chloroformu jako eluentní systém. Homogenní frakce byly rekrystalizovány, aby daly 1,31 g (72%) titulní sloučeniny ve formě bílé hmoty (teplota tání 133 až 134 °C).

'H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) 8: 7,58 (1H, d, H-6), 7,18 (2H, br.d, NH₂), 6,20 (1H, d, H-5), 5,77 (1GH, d, Η-Γ), 5,65 (2h, m, OH-2'a OH-3'), 5,47 (2H, m, CH=CH), 4,43 (1H, m, H-5'0, 4,30 (1H, m, H-5'₂), 4,M,0 (3H, m, H-2', H-3' a H-4'), 2,45 (2H, t, CH₂COO), 2,05 (4H, m, CH₂-C=), 1,63 (2H, m, CH₂-C-COO), 1,35 (20H, m, CH₂), 0,97 (3H, t, CH₃).

^I3C NMR (DMSO-de, 75 MHz) 8: 172,8 (COO), 165,59 (C4-N), 155,05 (C=O 2), 142,86 (C-6), 130,1 (CH=CH), 92,54 (C-5), 86,23 (C-Γ), 81,86 (C-4'), 76,83 (C-3'), 74,35 (C-2'), 63,77 (C-5'), 33,46, 31,95, 31,30, 29,03, 28,97, 28,85, 28,73, 28,52, 28,43, 28,36, 24,48 a 22,12 (CH₂), 13,97 (CH₃).

Příklad 2

3'-O-(elaidoyl) Ι-β-D-arabinofurantosyl-cytosin^2,3

Směs 2-hydroxyisomáselné kyseliny (1,15 g, 12xl0’³ mol) a elaidoyl chloridu (3,10 g, 10x10’³ mol) byla míchána při teplotě 50 °C po dobu 1 h. Byl přidán thionyl chlorid (1,5 ml 21x10’³ mol) a míchán nepřetržitě po dobu 2 hodin. Reakční směs byla držena při 50 °C pod sníženým tlakem 5360 kPa (40mmHg) po dobu 14 hodin. Utvořený 2-elaidoyloxy-2-methylpropanoyl chlorid byl použit bez dalšího přečištění a suspendován v 13 ml bezvodého acetonitrilu. Byl přidán cytidin (0,608 g, 2,5xl0'³ mol) a reagující směs byla míchána při teplotě 60 °C po dobu 24 hod. Rozpouštědlo se vypařilo a zbytek byl ošetřen etherem. Hotový produkt byl míchán v 40 ml pyridin-methanol 1:1 při teplotě 80 °C po dobu 20 h. během níž byl vysušen a pak vyčištěn na sloupci křemičitého gelu. Homogenní frakce byly rekrystalizovány a daly 0,446 g (35 %) sloučeniny uvedené v nadpisu ve formě bílé hmoty (teplota tání 164 až 166 °C) 'H NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) 8 7,71 (1H, d, H-6), 7,2 (2H, br.d, NH₂), 6,1 (1H, d, H-5), 5,88 (1H, d, Η-Γ), 5,81 (1H, d, OH-2'), 5,45 (2H, m, CH=CH), 5,18 (1H, m, OH-5'), 5,06 (1H, dd, H-3'), 4,18 (1H, m, H-2'), 4,01 (1H, m, H-4'), 3,85 (2h, m, H-5'), 2,47 (2H, t, CH₂CO), 2,06 (4H, m, CH₂-C=), 1,65 (2H, m, CH₂-C.COO), 1,35 (20H, m, CH₂), 0,97 (3H, t, CH₃).

¹³C NMR (DMSO-d₆, 75 MHz) 8: 172,15 (COO), 165,67 (C4-N), 154,95 (C=O), 142,72 (C-6), 130,11 a 130,08 (CH=CH), 92,59 (C-5), 86,24 (C-l'), 82,75 (C-4'), 78,72 (C-3'), 72,29 (C-2'), 61,15 (C-5'), 33,43, 31,97, 31,30, 29,03, 28,99, 28,85, 28,73, 28,53, 28,41, 28,36, 24,40, 22,12 (CH₂), 13,97 (CH₃).

Příklad 3

5'-O-(c/s-l 1-eikosenoil) Ι-β-D-arabinofurantosyl-cytosin

K suspenzi Ara-C-HCl (0,87 g, 3,lxl0’³ mol) v 30 ml Ν,Ν-dimethyIformamidu byl přidán roztok cis-11-eikosenoichloridu (1,06 g, 3,22 x 10'³ mol) v 30 ml DMA a reagující směs byla míchána při teplotě 25 °C po dobu 24 hodin. Rozpouštědlo bylo za odpařeno ve vysokém vakuu a zbytek byl rozpuštěn v 60 ml vařícího ethanolu, do kterého bylo přidáno 20 ml vody a 20 ml nasyceného roztoku NaHCO₃. Hotový produkt byl přefiltrován při teplotě místnosti a rozpuštěn v 100 ml vařícího ethanolu (60 % vody). Hotový produkt byl rekrystalizován z ethylacetátu, aby dal 1,1 g (66 %) titulní sloučeniny ve formě bílé hmoty.

- 14CZ 291612 B6 'Η NMR (DMSO-dé, 300 MHz), δ 7,45 (1H, d, H-6), 7,1 (2H, br.d, NH₂), 6,08 (1H, d, Η-Γ), 5,65 (1H, d, H-5), 5,55 (2H, m, OH-2’a a OH-3'), 5,32 (2H, m. CH=CH), 4,25 (1H, m, H-5'), 4,15 (1H, m, H-5'₂), 4,0-3,85 (3H, m, H-2’, H-3', H-4'), 2,33 (2H, t, CH₂-COO), 1,95 (4H, m, CH₂-C=), 1,5 (2H, m, CH₂-C-COO), 1,25 (24H, m, CH₂), 0,85 (3H, t, CH₃).

^I3C NMR (DMSO-d₆, 75 MHz), δ: 172,79 (COO), 165,59 (CM). 155,08 (C=O 2), 142,78 (C-6), 29,60 (CH=CH), 92,52 (C-5), 86,21 (C-Γ), 81,82 (CM), 76.75 (C-3'), 74,25 (C-2'), 63,76 (C-5'), 33,41,31,30, 29,11, 28,85, 28,72, 28,60, 28,42, 26.57, 24.46, 22,11 (CH₂), 13,94 (CHj).

Ref.:

1. D.T. Gisch et al.·, J. Med. Chem. 14 (1971) 1159

2. E.K. Hamamura et al., J. Med. Chem. 19 (1976) 667

3. E.K. Hamamura et al., J. Med. Chem. 19(1976)654

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (11)

1. Použití Ara-C derivátů obecného vzorce I kde Ri, R₂ jsou nezávisle vybrány z vodíku, C|g- a C₂o- nasyceného a mononenasycených acylových skupin s výhradou že R_h R₂ nejsou oba zároveň vodíky pro výrobu léčiva pro léčbu pevných tumorů a lymfomů.

2. Použití podle nároku 1 derivátů vzorce I, kde R_b R₂ jsou vybrány z vodíku a nasyceného nebo ω-9 mononenasycených Cig- a C₂₀- acylových skupin.

3. Použití podle nároku 2 derivátů vzorce I, kde Ri je vodík.

4. Použití podle nároku 3 derivátů vzorce I, kde R₂ je elaidoylová nebo eikosenoylová (cis nebo trans) skupina.

5. Použití derivátů vzorce I podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro výrobu léčiva pro lokální léčbu pevných tumorů nebo lymfomů.

6. Použití derivátů vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro výrobu léčiva pro systémovou léčbu pevných tumorů a lymfomů.

7. Použití derivátů vzorce I podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro výrobu léčiva pro léčbu pevných tumorů nebo lymfomů v retikuloendotelámím systému.

-15CZ 291612 B6

8. Použití derivátů vzorce I podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6 pro výrobu léčiva pro léčbu pevných tumorů nebo lymfomů v centrálním nervovém systému.

9. Použití derivátů vzorce I podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro výrobu léčiva pro léčbu metastazických tumorů.

10. Deriváty Ara-C obecného vzorce I

NH.

OR, kde R_b R₂ jsou nezávisle vybrány z vodíku, elaidoylu, oleoylu, stearoylu, eikosenoylu (cis nebo trans) a eikosanoylu s výhodou, že R_b R₂ nejsou oba zároveň vodíky, oleoyly, elaidoyly, stearoyly nebo eikosanoyly, R| není vodík, když R₂ je oleoyl nebo stearoyl a R₂ není vodík, když R] je elaidoyl, oleoyl stearoyl nebo eikosanoyl.

11. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje Ara-C deriváty obecného vzorce I podle nároku 10 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient.

21 výkresů