CZ291877B6 - Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů - Google Patents
Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291877B6 CZ291877B6 CZ1994669A CZ66994A CZ291877B6 CZ 291877 B6 CZ291877 B6 CZ 291877B6 CZ 1994669 A CZ1994669 A CZ 1994669A CZ 66994 A CZ66994 A CZ 66994A CZ 291877 B6 CZ291877 B6 CZ 291877B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- restriction
- fragments
- primers
- primer
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 338
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 131
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 75
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 148
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 142
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 324
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 223
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 33
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 24
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 12
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 12
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 claims description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 abstract 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 47
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 44
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 33
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 32
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 30
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 15
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 12
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 10
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 10
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 6
- 241001293495 Lactuca virosa Species 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 240000005993 Lactuca saligna Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 3
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 3
- 101000836337 Homo sapiens Probable helicase senataxin Proteins 0.000 description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 102100027178 Probable helicase senataxin Human genes 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000208122 Solanum peruvianum Species 0.000 description 1
- 235000002558 Solanum peruvianum Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000011365 genetic imprinting Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Power Conversion In General (AREA)
- Auxiliary Devices For Music (AREA)
- Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Zp sob amplifikace p°inejmenÜ m jednoho restrik n ho fragmentu z v²choz DNA, p°i kter m se (a) v²choz DNA Üt p p°inejmenÜ m jednou restrik n endonukle zou a z skaj se restrik n fragmenty, (b) tyto fragmenty se liguj s alespo jedn m syntetick²m dvou°et zcov²m oligonukleotidov²m adaptorem, jeho jeden konec je kompatibiln pro ligaci s jedn m nebo ob ma konci restrik n ch fragment , m se p°iprav ozna en restrik n fragmenty, (c) tyto fragmenty se za hydridiza n ch podm nek p°ivedou do kontaktu s alespo jedn m oligonukleotidov²m primerem, p°i em tento primer nebo primery obsahuj nukleotidovou sekvenci p ruj c s st rozpozn vac sekvence restrik n endonukle zy p° tomn v ozna en m restrik n m fragmentu a tak p ruj c s st adaptorov sekvence, p°i em alespo jeden z uveden²ch primer obsahuje na sv m 3'-konci zvolenou sekvenci obsahuj c p°inejmenÜ m jeden nukleotid um st n² bezprost°edn vedle nukleotid · astn c ch se vytvo°en dan rozpozn vac sekvence, (d) ozna en restrik n fragmenty hybridizovan na uveden² primer nebo primery se amplifikuj v p° tomnosti po adovan²ch nukleotid a DNA polymer zy nebo se provede elongace t chto hybridizovan²ch primer pod l ozna en²ch restrik n ch fragment , a (e) amplifikovan nebo elongovan DNA fragmenty z skan ve stupni (d) se identifikuj nebo izoluj .\
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu selektivní amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu aplikací otisků DNA a použití DNA markérů v řadě různých aplikací včetně křížení rostlin a živočichů, identifikace kultivarů, v diagnostickém lékařství, při diagnóze různých chorob u rostlin i u živočichů, při identifikaci geneticky podmíněných chorob u člověka, při analýze příbuzenských vztahů, v kriminalistice a při určování typů mikroorganismů. Kromě toho do rozsahu řešení náleží způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů.
Konkrétně je možno uvést, že se vynález týká způsobů aplikaci otisků DNA a detekce specifického značení DNA v genomech od mikroorganismů až k vyšším rostlinám, živočichům a člověku. S vynálezem rovněž souvisí syntetické molekuly DNA a produkty na jejich bázi pro použití v různých oborech.
Dosavadní stav techniky
Využívání otisků DNA, stejně jako další metody pro mapování genů, identifikaci a analýzu DNA se týkají charakterizace podobnosti nebo odlišnosti genetického základu nebo genomu jednotlivce, variety nebo rasy nebo druhy. Obecným pravidlem je, že čím bližší je genetická příbuznost, tím větší je podobnost genomů, v důsledku toho budou odlišnosti genomů vzácnější. Tyto podobnosti nebo odlišnosti je možno odhalit analýzou DNA po jejím rozštěpení pomocí restrikčních endonukleáz. Restrikční endonukleázy jsou enzymy, které rozpoznávají krátké řetězce nukleotidů, obvykle 4 až 8 bází. Jejich působením dochází k rozštěpení obou řetězců DNA za vzniku fragmentů DNA s určitou délkou. Vzhledem k vysoké specifičnosti těchto řetězců je DNA štěpena restrikčními endonukleázami velmi specifickým způsobem. Výsledkem je, že vzniká reprodukovatelná sestava fragmentů. Fragmenty DNA je možno frakcionovat podle jejich vzniku typických pásů, které tvoří otisk DNA v genetickém základu organismu.
V případě, že se porovnávají otisky velmi blízce příbuzných druhů, variet nebo ras mohou být získány otisky totožné nebo velmi podobné. V případě, že jsou pozorovány rozdíly u jinak identických otisků DNA, hovoří se o polymorfii DNA. Jde o nové fragmenty DNA, které se objevují v otisku. DNA je pak v této poloze polymorfhí a nový fragment DNA je možno využít jako DNA markér. Polymorfie DNA detekovaná v otiscích DNA získaných pomocí štěpení restrikčními enzymy může být způsobena kteroukoliv z následujících změn v řetězci DNA: mutace, které odstraní rozpoznávací místo restrikční endonukleázy, mutace, jejichž důsledkem je vznik nových rozpoznávacích míst, inzerce, delece nebo inverze mezi dvěma restrikčními místy.
Polymorfizmus DNA tohoto typu se obecně označuje jako RFLP, polymorfizmus délky restrikčních fragmentů („Restriction Fragment Length Polymorphisms “). Takové změny, které jsou důsledkem mutací se budou chovat jako neškodné genetické markéry v případě, že se budou dělit dědičností Mendolova typu. V důsledku toho je možno polymorfizmus DNA využít jako genetické markéry obdobným způsobem jako jakékoliv jiné genetické markéry: při průkazu rodičovství, při genetických studiích, týkajících se dědičnosti různých vlastností a také v různých případech identifikace jednotlivců.
V případě téměř všech živých organismů s výjimkou virů vzniká při restrikčním štěpení veškeré DNA genomu organizmu tak velké množství pásů, že není možné vyhodnotit obsah všech těchto pásů. Z tohoto důvodu jsou všechny metody pro detekování DNA založeny na principu, při jehož provádění se vizualizuje jen malá frakce fragmentů DNA, takže vzniká jednoduchá sestava pásů, která tvoří otisk DNA.
-1 CZ 291877 B6
Nejrozšířenější postup spočívá v tom, že se DNA organismu rozštěpí působením restrikčních endonukleáz, restrikční fragmenty se podrobí frakcionaci při použití elektroforézy na gelu, fragmenty frakcionované DNA se přenesou a navážou na membrány, načež se membrána hybridizuje specifickým fragmentem DNA („sonda“). Fragment DNA vytvoří dvojřetězcovou molekulu DNA sDNA fragmentem (nebo fragmenty) na membráně s obsahem komplementárních nukleotidových řetězců. V případě, že je sonda opatřena značkou s vizualizovatelným markérem, je možno vizualizovat také fragment DNA, s nímž je sonda spojena. Tento postup se obvykle označuje jako hybridizace Southemova typu nebo Southem blot. V případě, že je možno prokázat rozdíly ve velikosti odpovídajících restrikčních fragmentů, na něž se sonda váže v blízce příbuzných molekulách DNA genomu, označují se tyto rozdíly jako polymorfizmus, specificky polymorfizmus délky restrikčních fragmentů. Rozdíly v délce restrikčních fragmentů odpovídají různým alelovým formám genetického místa, které jsou rozpoznávány sondou. Přestože je Southemova metoda otiskována DNA široce používána, je tato metoda velmi pracná a velmi náročná na čas.
Mimoto má tato metoda malou rozlišovací schopnost a je tedy možno ji použít pouze k vyhodnocování jednotlivých míst nebo malého množství míst maximálně v jedné reakci.
Technika PCR (řetězová reakce s použitím polymerázy) je metoda pro syntézu specifických fragmentů DNA in vitro. Metoda je založena na použití specifických oligonukleotidů, které se mohou vázat na určité specifické řetězce v molekule DNA a na použití DNA-polymerázy, stálé při vyšší teplotě. Oligonukleotidy jsou zkonstruovány tak, že se mohou vázat na opačné konce řetězců DNA a slouží jako primeiy při syntéze DNA takovým způsobem, že každý z nich povede k syntéze nových řetězců DNA. To znamená, že v průběhu jednoho cyklu syntézy se vytvoří mezi primeiy úplná kopie molekuly DNA, přičemž DNA mezi primeiy je zdvojena. V průběhu každého cyklu syntézy DNA tak dochází ke zdvojení množství DNA, což vede k amplifikaci DNA mezi oběma primery. V důsledku toho může technika PCR umožnit syntézu přesného segmentu DNA při použití jen malého množství „substrátové DNA“.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří nový způsob amplifikace restrikčních fragmentů, které byly získány po rozštěpení DNA určitého organismu pomocí alespoň jednoho restrikčního enzymu, při použití PCR. Při této nové aplikaci metody PCR nejsou použité nukleotidy namířeny proti známému řetězci DNA, avšak jsou zkonstruovány tak, že rozpoznávají zakončení restrikčního fragmentu. K tomuto účelu je zapotřebí modifikovat tato zakončení restrikčních fragmentů navázáním oligonukleotidových linkerů (adaptorů). Důvodem pro toto opatření je skutečnost, že konce restrikčních enzymů mají obvykle pouze několik nukleotidů (2 až 8 nukleotidů), což je příliš málo pro použití těchto struktur jako primerů při amplifikaci pomocí PCR.
Vynález se tedy týká způsobu amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA, přičemž podstaty tohoto postupu spočívá v tom, že se (a) výchozí DNA štěpí přinejmenším jednou restrikční endonukleázou a získají se restrikční fragmenty, (b) získané restrikční fragmenty se ligují s alespoň jedním syntetickým dvouřetězcovým oligonukleotidovým adaptorem, jehož jeden konec je kompatibilní pro ligaci s jedním nebo oběma konci restrikčních fragmentů, čímž se připraví označené restrikční fragmenty, (c) získané označené restrikční fragmenty se za hybridizačních podmínek přivedou do kontaktu s alespoň jedním oligonukleotidovým primerem, přičemž tento primer nebo primery obsahují nukleotidovou sekvenci párující s částí rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy přítomné
-2CZ 291877 B6 v označeném restrikčním fragmentu a také párující s částí adaptorové sekvence, přičemž alespoň jeden z uvedených primerů obsahuje na svém 3'-konci zvolenou sekvenci obsahující přinejmenším jeden nukleotid umístěný bezprostředně vedle nukleotidů účastnících se vytvoření dané rozpoznávací sekvence, (d) označené restrikční fragmenty hybridizované na uvedený primer nebo primery se amplifikují v přítomnosti požadovaných nukleotidů a DNA polymerázy nebo se provede elongace těchto hybridizovaných primerů podél označených restrikčních fragmentů, a (e) amplifikované nebo elongované DNA fragmenty získané ve stupni (d) se identifikují nebo izolují.
Ve výhodném provedení tohoto postupu primer nebo primery obsahují sekvence, které mají stejnou nukleotidovou sekvenci jako terminální části řetězců na koncích uvedených označených restrikčních fragmentů, včetně nukleotidů účastnících se tvorby rozpoznávací sekvence pro uvedenou restrikční endonukleázu a včetně přinejmenším části nukleotidů přítomných v ligovaných adaptorech, přičemž přinejmenším jeden z uvedených primerů má na svém 3'-konci zvolenou sekvenci obsahující přinejmenším jeden nukleotid umístěný bezprostředně vedle nukleotidů účastnících se vytvoření rozpoznávací sekvence pro uvedenou restrikční endonukleázu.
Podle dalšího výhodného provedení mají primer nebo primery sekvence přesně párující s konstantní DNA sekvencí, tvořenou části rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy a sekvencí adaptoru. Při tomto postupu přinejmenším jeden primer obsahuje výhodně zvolenou sekvenci 1 až 10 nukleotidů. Podle dalšího výhodného provedení primery obsahují 10 až 50 nukleotidů a rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy obsahuje 4 až 8 nukleotidů.
Rovněž je při provádění postupu podle vynálezu výhodné, jestliže nukleotidová sekvence primerů párující s adaptorem obsahuje 10 až 30 nukleotidů.
Adaptory jsou výhodně konstruovány takovým způsobem, že odpovídající rozpoznávací sekvence endonukleázy není při hybridizaci adaptoru na označené restrikční fragmenty rekonstruována, přičemž primer nebo primery představují oligonukleotidy obsahující konstantní sekvenci přesně párující s alespoň jedním koncem sekvence alespoň jednoho označeného restrikčního fragmentu ve směsi, přičemž tato konstantní sekvence dané restrikční endonukleázy a přinejmenším jeden z uvedených primerů obsahuje na svém 3'-konci nukleotidové sekvence účastnící se tvorby rozpoznávací sekvence 1 až 10 dalších zvolených nukleotidů.
Sekvence nukleových kyselin ve výchozí DNA je podle dalšího výhodného provedení alespoň zčásti neznámá.
Při provádění postupu podle vynálezu je výhodné, jestliže se použijí nejméně dvě od sebe odlišné restrikční endonukleázy.
Podle dalšího výhodného provedení postupu podle vynálezu všechny primery obsahují stejnou konstantní nukleotidovou sekvenci. Rovněž je výhodné jestliže při provádění tohoto postupu podle vynálezu použije směs různých primerů. Přinejmenším jeden primer obsahuje výhodně na svém 3'-konci 1, 2 nebo 3 zvolené nukleotidy.
Podle dalšího výhodného provedení postupu podle vynálezu se ve stupni (a) použijí dvě odlišné restrikční endonukleázy, přičemž přinejmenším jeden dvouřetězcový syntetický oligonukleotid použitý jako adaptor pro jednu z endonukleáz je biotinylován.
-3CZ 291877 B6
Podle dalšího výhodného provedení postupu podle vynálezu je alespoň jeden primer značený. Počet selektivních nukleotidů se výhodně volí k omezení počtu amplifíkovaných restrikčních fragmentů na 5 až 200.
Ve výhodném provedení se podle vynálezu jako výchozí DNA k amplifikaci použije DNA genomu z lidského nebo živočišného vzorku, zvláště z tkáně nebo z krevního vzorku, přičemž je rovněž výhodné, jestliže se k amplifikaci použije DNA genomu rostliny nebo rostlinné tkáně. Podle dalšího výhodného provedení se jako výchozí DNA k amplifikaci použije DNA mikroorganizmu.
Tento postup podle předmětného vynálezu může sloužit i identifikaci polymorfizmu DNA genomu mikroorganizmu, rostliny nebo živočicha, včetně člověka, nebo fragmentů DNA, vzájemně nebo ve vztahu k odpovídající předem stanovené standardní DNA.
Kromě toho postup podle vynálezu může sloužit k identifikaci polymorfizmu DNA souvisejícího s geneticky podmíněnými vlastnostmi u člověka, nebo geneticky podmíněnými vlastnostmi u živočichů nebo pro identifikaci geneticky podmíněných vlastností u rostlin a pro identifikaci značení DNA na bázi tohoto polymorfizmu DNA.
Podle dalšího výhodného provedení postupu podle vynálezu se srovnávají alespoň dva nebo více amplifíkovaných nebo elongovaných fragmentů DNA, identifikované nebo generované ve stupni (e) uvedeného způsobu pro detekci podobnosti mezi rostlinnými nebo živočišnými varietami, druhy, kultivary, mikroorganizmy, nebo pro hodnocení genetické odlišnosti a charakteristiky uvedených rostlinných nebo živočišných variet, druhů, kultivarů, mikroorganizmů.
Amplifíkované nebo elongované fragmenty DNA produkované ve stupni (e) se ve výhodném provedení identifikují nebo izolují ve formě DNA otisků.
Identifikace DNA markérů vázaných s.genetickým znakem vhodně zahrnují identifikaci polymorfizmu mezi výchozími DNA ze stejných živočišných druhů s odlišnými genetickými znaky a uvedení tohoto polymorfizmu do korelace s fenotypem uvedeného genetického znaku.
Výhodně postup amplifikace podle předmětného vynálezu dále zahrnuje stupně:
(f) izoluje se alespoň jeden identifikovaný nebo regenerovaný DNA fragment ve stupni (e), (g) stanoví se nukleotidová sekvence prvních 8 až 10 nukleotidových zbytků vnitřně přiléhajících na rozpoznávací sekvenci restrikční endonukleázy na obou koncích uvedených DNA fragmentů, (h) zkonstruují se oligonukleotidové primery s nukleotidovou sekvencí podle primerů ze stupně (c) z nároku 1, přičemž zvolená sekvence nukleotidů obsahuje 5 až 10 nukleotidových zbytků odpovídajících prvním 8 až 12 nukleotidových zbytků vnitřně přiléhajících k restrikčním místům na obou koncích DNA fragmentu.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží postup přípravy sestavy amplifíkovaných restrikčních fragmentů, jehož podstata spočívá v tom, že se (a) amplifikuje podskupina restrikčních fragmentů ze směsi restrikčních fragmentů, získaných z výchozí DNA při použití způsobu podle některého z nároků 1 až 15, (b) amplifíkované prodloužené restrikční fragmenty se od sebe oddělí, (c) amplifíkované restrikční fragmenty se identifikují.
-4CZ 291877 B6
Tyto metody podle vynálezu mohou sloužit pro identifikaci polymorfizmu mezi různými výchozími DNA pocházejícími ze stejné skupiny živých organizmů, přičemž podstata tohoto řešení spočívá v tom, že se identifikují rozdíly mezi amplifikovanými restrikčními fragmenty různých výchozích DNA.
Vynález je založen na použití nové aplikace PCR-reakce pro amplifikaci jednoho nebo většího počtu restrikčních fragmentů, získaných z komplexní směsi fragmentů DNA, získaných rozštěpením molekul DNA genomu působením restrikčních endonukleáz. Jednou ze zvláštních výhod vynálezu je umožnění amplifikace restrikčních fragmentů DNA v situacích, v nichž řetězec nukleotidů na 5'-konci a 3'-konci není stanoven. V takových případech není možno definovat obvyklé řetězce specifických primerů, hybridizující na každý ze řetězců restrikčního fragmentu, který má být amplifikován a není tedy možno použít žádnou ze známých amplifikačních metod.
Metodou podle vynálezu je možno použít například dvěma různými způsoby, které vedou ke dvěma různým typům konečných aplikací těchto postupů:
(1) Metody pro otiskování DNA genomů tak, že se náhodně vybere podskupina jednoho nebo většího počtu restrikčních fragmentů, které mají být amplifikovány metodou PCR. Vynález rovněž zahrnuje syntetické oligonukleotidy pro použití při provádění těchto postupů a některé aplikace uvedených metod, kterými mohou být například použití v kriminalistice pro otiskování DNA, identifikace mikroorganismů, identifikace odrůd, analýza plemen a vyšetřování DNA markérů vázaných na genetické prvky.
(2) Metody pro identifikaci jednoho nebo většího počtu předem vybraných fragmentů DNA, které mohou být polymorfhí, při použití PCR-amplifikace. Vynález rovněž zahrnuje specifické syntetické oligonukleotidy použitelná k provádění těchto postupů a některé aplikace těchto metod, kterými mohou být například sériové vyšetřování geneticky podmíněných chorob u lidí, sledování dědičnosti agronomicky využitelných vlastností u rostlin a u živočichů při chovu a průkaz původce u infekčních onemocnění.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je obecně graficky znázorněn způsob PCR-amplifikace označených restrikčních fragmentů, získaných štěpením DNA genomu působením restrikčních endonukleáz.
Na obr. 2 je znázorněn způsob ligace adaptorů na odlišné konce restrikčních fragmentů: posunutá zakončení a vyplněná zakončení.
Na obr. 3 je znázorněn PCR-amplifikace označených restrikčních fragmentů. Oblasti, označené orámováním, jsou adaptory, které jsou ligovány na restrikční fragmenty a primery, které jsou použity při provádění PCR-amplifikace. Šipky označují směr syntézy DNA.
Na obr. 4 je graficky znázorněno provádění PCR-amplifikace na označených restrikčních fragmentech.
Na obr. 5 je obecně znázorněna konstrukce selektivních primerů, které je možno použít při uskutečnění PCR-amplifikace označených restrikčních fragmentů. Šipkami jsou označeny obrácené opakující se řetězce na koncích restrikčních fragmentů. Selektivita primerů je ilustrována na dvou příkladech, v jednom žních dochází k přesnému souladu a ve druhém z nich k úplnému nesouladu mezi selektivní sekvencí a sekvencí restrikčního fragmentu matricové DNA.
-5CZ 291877 B6
Na obr. 6 je znázorněn princip uskutečnění PCR-amplifikace při použití PCR-primeru, který volí molekuly matricové DNA s trinukleotidovým řetězcem, uloženým v bezprostřední blízkosti řetězce adaptoru.
Na obr. 7 je znázorněn průběh selektivní PCR-amplifikace, prováděné na označených restrikčních fragmentech.
Na obr. 8 je znázorněn princip amplifikace specifické pro fragmenty při použití kombinace dvou PCR-primerů, z nichž každý obsahuje 6 selektivních bází. Každý zprimerů vytváří dvouřetězcovou strukturu v různých řetězcích restrikčních fragmentů, takže vzniká komplex primer/matrice, z něhož může být zahájena syntéza DNA, jak je naznačeno šipkami.
Na obr. 9 jsou znázorněny obecné prvky řetězce, které jsou rozpoznávány při provádění amplifikace, selektivní pro restrikční fragmenty včetně dvou nukleotidových řetězců, které jsou rozpoznávány a včetně vzdálenosti, která oba tyto řetězce od sebe odděluje.
Na obr. 10 jsou znázorněny typy variací nukleotidových sekvencí, které je možno prokázat při postupu identifikace polymorfizmu délky amplifikovaných fragmentů.
Na obr. 11 je znázorněn 1,0% agarozový gel s analýzou výsledků, získaných amplifikací DNA rajčete po rozštěpení restrikčním enzymem Pstl při použití primerů se zvyšující se selektivitou.
Na obr. 12 je znázorněn 1,0% agarazový gel s analýzou výsledků, získaných specifickou amplifikací tří navzájem odlišných fragmentů DNA rajčete po rozštěpení restrikčním enzymem Pstl při použití primerů, specifických pro fragmenty.
Na obr. 13 je znázorněn gel, obsahující 2,5 % polyakiylamidu a 1 % agarozy s DNA otisky, získanými selektivní amplifikací restrikčních fragmentů u dvou linií rajčat.
Na obr. 14 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu s DNA otisky ze 4 linií rajčat při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Pstl/Msel.
Na obr. 15 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu sDNA otisk z 10 linií Lactuca při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Pstl/Msel.
Na obr. 16 je znázorněn část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu pro 2 linie kukuřice při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Pstl/Taql a EcoRl/Taql.
Na obr. 17 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu s DNA otisky ze 26 kmenů Xanthomonas Campestris s použitím SRFA a kombinace restrikčních enzymů Apal/Taql.
Na obr. 18 je znázorněna část 4,5% denaturačního polyakrylamidového gelu a DNA otisky, odebranými různým jednotlivcům 4 druhů domácích zvířat: použita byla kuřata, vepř, kráva a kůň, postup byl uskutečněn při použití SRFA a kombinace restrikčních enzymů Ssel/Msel.
V popisu předmětného vynálezu a v následujících příkladech je užita celá řada pojmů. Aby bylo možno zajistit jasné porozumění popisné části i patentových nároků včetně rozsahu vynálezu, bude dále osvětlena řada pojmů:
Restrikční endonukleáza nebo restrikční enzym je enzym, který rozpoznává specifickou sekvenci (rozpoznávací sekvence nebo místo) ve dvouřetězcové molekule DNA, přičemž při použití tohoto enzymu dojde ke štěpení obou řetězců molekuly DNA v každém z těchto rozpoznávacích míst.
- Restrikční fragmenty: molekuly DNA, produkované štěpením působením restrikční endonukleázy se označují jako restrikční fragmenty. Jakýkoliv daný genom se bude štěpit určitou
-6CZ 291877 B6 restrikční endonukleázou na určitou vymezenou skupinu restrikčních fragmentů. Fragmenty DNA, které jsou výsledkem štěpení restrikční endonukleázou je možno rozdělit a identifikovat pomocí gelové elektroforézy.
- Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP): DNA genomu dvou blízce příbuzných organismů, bude vykazovat určité rozdíly mezi složením jednotlivých nukleotidových řetězců na řadě míst. V případě, že se tyto rozdíly vyskytnou v rozpoznávacím místě pro určitou restrikční endonukleázu, nebude se tato modifikovaná rozpoznávací sekvence štěpit v tomto místě. Stejným způsobem ovšem může dojít také k takové modifikaci řetězce, při níž vznikne nová rozpoznávací sekvence, která neexistuje u jiných organismů, a v tomto místě pak dojde ke štěpení řetězce DNA příslušným restrikčním enzymem. Alternativně bude inzerce nebo delece nukleotidů vyskytující se v jednom organizmu mezi dvěma rozpoznávacími místy pro restrikční endonukleázu modifikovat vzdálenost mezi těmito rozpoznávacími místy. V důsledku těchto skutečností může při štěpení DNA dvou organismů dojít ke vzniku restrikčních fragmentů s různou délkou. Dojde tedy k polymorfizmu v délce restrikčních fragmentů, produkovaných štěpením DNA dvou uvedených organismů.
- Gelová elektroforéza: Aby bylo možno prokázat přítomnost restrikčních fragmentů je zapotřebí použít analytické metody pro frakcionaci molekul DNA s dvojitým řetězcem podle rozměrů těchto fragmentů. Nejběžnější užívanou technikou pro dosažení této frakcionace je elektroforéza na gelu. Rychlost, s níž se fragmenty DNA v takovém gelu pohybují závisí na jejich velikosti. Znamená to, že čím je fragment větší, tím kratší je jeho dráha od společného počátku. Fragmenty DNA frakcionované elektroforézou na gelu je možno přímo vizualizovat například barvením v případě, že množství odlišných fragmentů ve vzorku není veliké.
- Syntetické oligonukleotidy: jednořetězcové molekuly DNA obsahující s výhodou 10 až 50 bází a syntetizované chemickou cestou se označují jako syntetické oligonukleotidy. Obecně jsou tyto syntetické molekuly DNA konstruovány tak, aby obsahovaly jediný nukleotidový řetězec, přestože je možno syntetizovat skupiny molekul, které mají příbuzné řetězce a které současně mají odlišné složení nukleotidů ve specifických polohách v rámci nukleotidového řetězce. Pojem syntetického oligonukleotidu tedy bude užíván pro ty molekuly DNA, které mají jedinečnou nukleotidovou sekvenci. Pojem smíšené oligonukleotidy bude dále užíván pro skupiny příbuzných syntetických oligonukleotidů.
- Ligace: enzymatické reakce, katalyzovaná enzymem ligázou, při níž jsou dvě dvouřetězcové molekuly DNA spolu kovalentně spojeny se označuje jako ligace (vazba). Obecně jsou spolu oba řetězce DNA kovalentně spojeny, je však také možné zabránit ligaci jednoho z těchto dvou řetězců chemickou nebo enzymatickou modifikací jednoho z obou zakončení. V tomto případě dojde ke kovalentní vazbě pouze na jednom z těchto dvou řetězců DNA.
- Adaptory: krátké dvouřetězcové molekuly DNA s omezeným počtem párů bází, například 10 až 30 párů bází, zkonstruované takovým způsobem, aby bylo možno je navázat na konce restrikčních fragmentů. Adaptory jsou složeny ze dvou syntetických oligonukleotidů, jejichž nukleotidové řetězce jsou vzájemně částečně komplementární. V případě, že se tyto dva syntetické oligonukleotidy smísí, vytvoří strukturu s dvojitým řetězcem v roztoku za příslušných podmínek. Jedno ze zakončení molekuly adaptoru je konstruováno tak, že může být navázáno na zakončení restrikčního fragmentu, druhé z obou zakončení je konstruováno tak, že není možné je navázat.
- PCR-reakce, řetězová reakce s použitím polymerázy: jde o enzymatickou reakci, při níž jsou fragmenty DNA syntetizovány ze substrátové DNA in vitro. Při reakci se užívá dvou syntetických oligonukleotidů, jejichž řetězce jsou komplementární vzhledem k nukleotidovému řetězci v molekulách DNA, které jsou od sebe odděleny několika sty až několika tisíci párů bází a dále se užívá DNA-polymerázy, odolné proti působení tepla. Řetězcová reakce například může být tvořena sérií 10 až 30 cyklů. V každém z těchto cyklů je DNA substrátu nejprve denaturována při
-7CZ 291877 B6 vysoké teplotě. Po zchlazení materiálu budou syntetické oligonukleotidy, které jsou přítomny ve velkém přebytku, v roztoku vytvářet dvojřetězcové struktury s molekulami substrátové DNA na specifických místech molekul substrátové DNA, které mají komplementární nukleotidové sekvence. Komplexy oligonukleotid-substrátová DNA pak budou sloužit jako iniciační místa pro další syntézu DNA, katalyzovanou enzymem DNA-polymerázou. Tímto způsobem je syntetizován nový řetězec DNA, který je komplementárním řetězcem pro původní řetězec substrátové DNA.
- Amplifikace DNA: Pod tímto pojmem se označuje způsob syntézy nových molekul DNA s dvojitým řetězcem in vitro při použití PCR-reakce tak, jak byla vysvětlena v předchozím odstavci. Produkty této PCR-reakce se pak označují jako amplifikované fragmenty DNA.
- Primery: Obecně se termín primer užívá pro řetězec DNA, který může podnítit syntézu nového řetězce DNA. DNA-polymeráza nemůže totiž syntetizovat novou DNA bez primerů. Může pouze prodlužovat existující řetězec DNA při reakci, v níž je komplementární řetězec použit jako matrice, která řídí pořadí, v němž budou nukleotidy navázány. Jako primery budou v následujícím testu označovány molekuly syntetických oligonukleotidů, které se užívají při PCR-reakci k zahájení reakce.
- Southemova hybridizace: Účelem Southemovy hybridizace, která se často označuje také jako Southem blot je fyzikální přenos DNA fřakcionované na agarozovém gelu za nosič, například na nylonovou membránu nebo na nitrocelulózový filtrační papír za současného uchování relativní polohy fragmentů DNA tak, jak k ní došlo v průběhu frakcionačního postupu. Postupem, jehož se využívá pro přenos z agarozového gelu na nosič je kapilární síla.
- Hybridizace nukleových kyselin: Hybridizace nukleových kyselin se užívá k detekci příbuzných řetězců DNA hybridizace jednořetězcové DNA na nosiči, například na nylonové membráně nebo na nitrocelulózovém filtračním papíru. Molekuly nukleových kyselin, které mají komplementární řetězce budou znovu vytvářet svou strukturu s dvojitým řetězcem v případě, že budou smíseny v roztoku za příslušných podmínek. Dvojitá struktura řetězce se vytvoří mezi dvěma komplementárními nukleovými kyselinami s jednoduchým řetězcem i v případě mobilizace na nosiči. V průběhu Southemovy hybridizace k této situaci dochází.
- Hybridizační sonda: aby bylo možno detekovat určitý řetězec DNA při Southemově hybridizaci, nechá se reagovat značená molekula DNA neboli hybridizační sonda s frakcionovanou DNA, vázanou na nosič, například na nylonovou membránu nebo na nitrocelulózový filtrační papír. Oblasti filtru, které nesou řetězce DNA, komplementární ke značené sondě DNA budou samovolně označeny v důsledku nové vazby. Ty oblasti filtru, které takové značení obsahují je pak možno detekovat v závislosti na typu použitého značení. Hybridizační sonda je obvykle získána molekulárním klonováním specifického řetězce DNA z genomu kukuřice.
Vynález se specificky týká způsobu a prostředků pro aplikaci PCR-reakce pro detekci polymorfizmu restrikčních fragmentů (RFP) včetně polymorfizmu v jejich délce. Vynález poskytuje metodu pro detekci RFP, syntetické oligonukleotidy pro použití při provádění tohoto postupu podle vynálezu a křty obsahující prostředky k detekci RFP, přičemž postupy podle vynálezu je možno aplikovat při pěstování rostlin a chovu živočichů včetně hospodářských zvířat, dále je možno vynález použít při diagnostice geneticky podmíněných onemocnění, identifikaci organismů, typování v kriminalistice apod.
Ve specifickém provedení poskytuje vynález prostředky pro identifikaci restrikčních fragmentů určitého genomu nebo skupin restrikčních fragmentů zgenomů různých organismů, mikroorganismů, rostlin, živočichů nebo lidí v případě, že tyto skupiny genomů jsou určitým způsobem geneticky vázány s určitými vlastnostmi nebo společně vytvářejí typ genomu, který je možno využít k identifikaci organismu, variety nebo jednotlivce.
-8CZ 291877 B6
Obecný postup podle vynálezu pro produkci a pro identifikaci restrikčních fragmentů zahrnuje použití restrikční endonukleázy, ligaci syntetických oligonukleotidů na tyto restrikční fragmenty a PCR-amplifikaci těchto restrikčních fragmentů, jak je znázorněno na obr. 1. Restrikční endonukleáza štěpí molekuly DNA genomu na specifických místech, rozpoznávacích místech za vzniku restrikčních fragmentů.
PCR-amplifikace restrikčních fragmentů je možno bez ohledu na to, zda je znám nukleotidový řetězec nebo zakončení restrikčních fragmentů uskutečnit podle vynálezu tak, že se nejprve na konce restrikčních fragmentů ligují syntetické oligonukleotidy (adaptory), takže každý restrikční fragment je opatřen dvěma označenými fragmenty, která slouží jako podklad pro zakotvení primerů, užitých při PCR-amplifikaci.
Po působení restrikčních enzymů vznikají buď rovná zakončení, v nichž vyvářejí terminální nukleotidy obou řetězců pár bází, nebo nepravidelně prodloužená zakončení, v nichž jeden ze dvou řetězců je na krátkou vzdálenost prodloužen (obr. 2). V případě restrikčních fragmentů se zarovnanými konci se užívají adaptory s jedním zarovnaným koncem. V případě nepravidelně zakončených restrikčních fragmentů se užívají adaptory s prodlouženým jedním řetězcem, komplementárním k prodlouženému řetězci restrikčního fragmentu. Užívají se tedy pro každý typ restrikčního fragmentu specifické adaptory, které se liší pouze na jednom ze zakončení tak, aby adaptor mohl být navázán na restrikční fragment. V typických případech jsou použité adaptory tvořeny dvěma syntetickými oligonukleotidy, které jsou částečně komplementární navzájem a které mají délku obvykle přibližně 10 až 30 nukleotidů, s výhodou 12 až 22 nukleotidů a které vytvářejí struktury s dvojitým řetězcem při vzájemném smísení v roztoku. Při použití enzymu ligázy jsou adaptory ligovány na směs restrikčních fragmentů. V případě, že se užije velkého molámího přebytku adaptoru ve srovnání s množstvím restrikčních fragmentů, je možno zajistit, že všechny restrikční fragmenty budou opatřeny adaptory na obou svých koncích. Restrikční fragmenty, připravené tímto způsobem se označují jako označené restrikční fragmenty a postup jímž se tyto fragmenty získávají, bude dále označován jako označování restrikčních fragmentů.
Adaptory mohou sloužit jako matrice pro primer se svrchu definovanými vlastnostmi, použité při následující PCR amplifikační reakci. Ve vhodném provedení vynálezu nese restrikční fragment na obou svých koncích tentýž adaptor a je tedy možno při amplifikací těchto restrikčních fragmentů použít jediný primer, jak je znázorněno na obr. 3. Vzhledem ktomu, že v takovém případě jsou všechny restrikční fragmenty označeny stejným způsobem, je zřejmé, že při PCRamplifikaci směsi těchto označených restrikčních fragmentů dojde k jejich amplifikací synchronním způsobem. V dalším možném provedení lze užít ke štěpení DNA dva různé restrikční enzymy, na konce restrikčních fragmentů pak lze ligovat dva odlišné adaptory. V tomto případě je možno k amplifikací uvedených restrikčních fragmentů použít dva různé PCR primery. V dalším výhodném provedení při použití dvou restrikčních enzymů je možno pro jedno ze zakončení použít biotinylovaný adaptor. Tímto způsobem je pak možno z komplexní směsi restrikčních fragmentů oddělit ty restrikční fragmenty, které alespoň na jednom svém konci nesou zakončení pro tento restrikční enzym při použití obvyklých postupů pro izolaci biotinylovaných molekul. Tento stupeň zmenšuje složitost výchozí směsi restrikčních fragmentů a tvoří stupeň v němž je možno směs před PCR amplifikací obohatit snížením počtu řetězců, které připadají pro amplifikací v úvahu. Současná amplifikace několika různých fragmentů se často označuje jako mnohočetná PCR-reakce. Princip pro mnohočetnou amplifikací restrikčních fragmentů je znázorněn na obr. 4.
Vynález je dále založen na definici specificky konstruovaných primerů a specifických metod pro směrování PCR-amplifikační reakce tak, že je možno dosáhnout řízené amplifikace a ve zvláštním provedení vynálezu může dojít pouze k amplifikací malé podskupiny označených restrikčních fragmentů z těchto fragmentů, které jsou k dispozici.
Obecně je možno uvést, že materiál, získaný rozštěpením, zvláště DNA genomu živočicha, rostliny nebo člověka, restrikční endonukleázou obsahuje velké množství restrikčních fragmentů.
-9CZ 291877 B6
Počet těchto restrikčních fragmentů závisí na rozměru genomu a na frekvenci výskytu rozpoznávacího místa pro restrikční endonukleázu v genomu, což je opět primárně určováno počtem nukleotidů tomto rozpoznávacím místě. Počet nukleotidů v rozpoznávacích (cílových) místech běžně užívaných restrikčních endonukleáz se pohybuje v rozmezí 4 až 8. Rozměry genomu v organismu se mohou široce měnit od několika milionů párů bází v případě mikroorganismu do několika bilionů párů bází v případě rostlin a živočichů. To znamená, že se počet restrikčních fragmentů, získaných po rozštěpení molekul DNA restrikčním enzymem může měnit od několika se do několika milionů. Obecně je možno uvést, že počet restrikčních fragmentů je tak velký, že není možné identifikovat jednotlivé restrikční fragmenty v materiálu, získaném rozštěpením DNA genomu frakcionací gelovou elektroforézou. Z takového materiálu se obvykle získá nepřehledná směs překrývajících se pásů, která má vzhled nátěru.
Při PCR-amplifikaci označených restrikčních fragmentů by měla rovněž vzniknout taková nepřehledná směs pásů vzhledem k tomu, že by mělo dojít při PCR-reakci k synchronní koamplifikaci všech restrikčních fragmentů. Ve výhodném provedení vynálezu, které je možno použít pro DNA genomu velkých rozměrů je možno použít obecného postupu, kteiý vede k omezení počtu restrikčních fragmentů, k jejichž amplifikací má dojít. To je možno uskutečnit předběžným výběrem podskupiny označených (opatřených značkou) restrikčních fragmentů tak, že v průběhu amplifikační reakce PCR bude amplifikován jen relativně malý počet těchto označených restrikčních fragmentů.
Selektivní princip, definovaný v tomto provedení podle vynálezu spočívá ve zvláštní konstrukci oligonukleotidů, které budou použity jako primery pro PCR-amplifikaci, tak, jak je podrobněji znázorněno na obr. 5.
Označené restrikční fragmenty (opatřené značkou) mají následující obecnou strukturu: jde o variabilní řetězec DNA (odpovídající restrikčnímu fragmentu před jeho označením), který je na obou svých stranách opatřen obráceným řetězcem DNA (konstantní řetězec). Obrácený řetězec DNA (konstantní řetězec) DNA je složen z části rozpoznávacího (cílového) místa pro restrikční endonukleázu a z řetězce adaptoru, navázaného na oba konce restrikčního fragmentu. Variabilní řetězec restrikčního fragmentu, který je uložen mezi konstantními řetězci DNA je obvykle neznámý a bude tedy mít náhodné složení řetězce. V důsledku toho bude ve velké směsi restrikčních fragmentů nukleotidový řetězec, obklopující konstantní řetězec DNA mít zcela náhodné složení.
Z tohoto důvodu se vynález tyká rovněž specifických PCR-primerů, které jsou tvořeny konstantní částí nukleotidového řetězce, která se při amplifikací vztahuje k omezené podskupině získaných restrikčních fragmentů, a variabilní část řetězce. V konstantní části řetězce je řetězec nukleotidů konstruován tak, aby primer měl sekvenci přesně párující s konstantním řetězcem DNA jednoho z řetězců DNA na konci restrikčního fragmentu. Variabilní část řetězce pak je tvořena náhodně zvoleným nukleotidovým řetězcem s obsahem 1 až 10 bází.
Pod pojmem „variabilní řetězec“ se přesněji rozumí řetězec, který je tvořen vybranými nukleotidy, které vytvoří řetězec, který pak zůstane stálý pro účely amplifikace podskupiny restrikčních fragmentů. Ve zvláštním provedení vynálezu je možno použít několika odlišných primerů. V takovém případě mohou primery mít tentýž stálý řetězec a variabilní řetězce mohou být vytvořeny vybranými bázemi, které jsou u takto vytvořených primerů od sebe navzájem odlišné.
Je to právě tato adice těchto variabilních (zvolených) řetězců na 3'-zakončení primerů, která řídí předběžnou selekci označených restrikčních fragmentů, které budou amplifikovat v následujícím PCR-stupni: v případě, že se PCR-reakce uskuteční za příslušných podmínek, zahájí primery syntézu DNA pouze na těch označených restrikčních fragmentech, v nichž může variabilní řetězec DNA přesně párovat s řetězcem matrice označeného restrikčního fragmentu, jak je znázorněno na obr. 5.
-10CZ 291877 B6
Tato selekce je determinována počtem nukleotidů ve variabilním řetězci primeru. Selektivita příměrů se zvyšuje s počtem nukleotidů ve variabilní části řetězce. K označení nukleotidů ve variabilní části řetězce bude také užíván pojem „selektivní báze“, aby bylo zřejmé, že selekce těchto bází činí primer selektivním. Je zřejmé, že označený restrikční fragment bude amplifikován pouze vtom případě, že selektivní báze použitého primeru bude rozpoznávat oba komplementární řetězce na koncích fragmentu. V případě, že primer odpovídá pouze jednomu zakončení, bude amplifikace spíše lineární než exponenciální a produkt nebude možno prokázat.
Je možné předem stanovit stupeň selektivity, jehož je možno dosáhnout při použití variabilních řetězců s různým počtem selektivních bází, při použití obecného vzorce 42n, v němž n znamená počet selektivních bází: při použití jedné selektivní báze dojde kamplifikaci jednoho ze 16 prodloužených fragmentů, při použití dvou selektivních bází jednoho z 256 označených fragmentů, při použití tří selektivních bází jednoho ze 4096 fragmentů, při použití 4 selektivních bází jednoho ze 65 536 fragmentů atd. Jedno z výhodných provedení vynálezu tudíž umožňuje selektivně amplifikovat náhodnou podskupinu označených restrikČních fragmentů z jakéhokoliv rozštěpeného vzorku DNA genomu bez ohledu na počet fragmentů, který vznikne působením restrikčního enzymu.
Ve výhodném provedení je počet selektivních nukleotidů volen tak, že počet restrikČních fragmentů, které budou amplifikovány je omezen na 5 až 200. Přestože tento počet je možno vypočítat dělením počtu fragmentů vzorce 420, přesná předpověď není možná vzhledem k tomu, že ne všechny restrikční fragmenty je možno amplifikovat se stejnou účinností. V praxi to znamená, že po amplifikaci je možno prokázat menší než teoreticky očekávané množství fragmentů. Je také nutno zdůraznit, že je možno užít směs dvou nebo většího počtu primerů. To umožní navíc k amplifikaci fragmentů, rozpoznávaných každým primerem, ještě amplifikaci fragmentů, které jsou rozpoznávány oběma primery. Konečně by mělo být zdůrazněno, že selekce, založená na tvorbě párů bází mezi selektivními nukleotidy primeru a komplementární matricí je silně ovlivněna teplotou, která se volí pro vazbu při PCR-reakci. V případě, že tato teplota je nižší než nebo příliš blízká teplotě tání komplexu primeru a matrice, budou primery napojovat řetězce matrice, které si přesně neodpovídají, takže v komplexu se objeví místa, v nichž se nevytvoří správné páry bází. K tomu by nemělo docházet, protože tento stav vede kamplifikaci daleko většího množství fragmentů, než bylo předpokládáno a získají se daleko variabilnější výsledky.
Produkty PCR-reakce, které je možno získat v rámci vynálezu je možno identifikovat s použitím standardních frakcionačních metod pro dělení molekul DNA na základě jejich velikosti s následným barvením molekul DNA příslušnými činidly. Je také možno postupovat tak, že se primery použité pro PCR-amplifikaci označí vhodnou radioaktivně značenou látkou nebo fluorescenčním chromoforem tak, aby byla možná identifikace reakčního produktu po frakcionaci na základě velikostí molekul. Ve výhodném provedení podle vynálezu jsou PCR-produkty frakcionovány elektroforézou na gelu při použití standardních gelových matricí, jako jsou například agaroza, polyalkrylamidový gel nebo směs agarozy a polyakrylamidu. PCR-produkty, získané způsobem podle vynálezu budou dále označovány jako amplifikované restrikční fragmenty (ARF).
Prostředky a metody podle vynálezu je možno použít k produkci skupin ARF z jakéhokoliv složitého genomu po jeho rozštěpení restrikčními enzymy. Vynález umožňuje uvést do souladu počet získaných restrikČních fragmentů s frakcionačním gelovým systémem, jehož bude použito k dělení ARF. Ve specifickém provedení vynálezu jsou selektivní primery zkonstruovány tak, aby vzniklo 5 až 10 ARF, které se pak dělí elektroforézou na agarozovém gelu. V dalším specifickém provedení se užívá selektivních primerů, které jsou konstruovány pro vznik 20 až 50 ARF, které se pak dělí systémem elektroforézy na gelu s vysokou rozlišovací schopností, například na polyakrylamidovém gelu nebo na gelu s obsahem směsi agarozy a polyakrylamidu.
-11 CZ 291877 B6
V jednom z výhodných provedení se volí enzym nebo enzymy tak, že se získají restrikční fragmenty s velikostí 20 až 1000 párů bází vzhledem ktomu, že, jak je obecně známo pro PCR-amplifikaci, dochází k nej účinnější amplifikaci právě v případě této velikosti fragmentů. Přestože je možno celou řadu fragmentů podrobit frakcionaci na různých standardních gelových matricích, nej lepších výsledků je možno dosáhnout frakcionaci na denaturačním polyakrylamidovém gelu, tak, jak se běžně používá pro analýzu řetězce DNA.
Podle vynálezu je možno získat různé skupiny ARF pro každý selektivní primer v průběhu PCRamplifikační reakce. ARF, identifikované po tomto dělení představuje dobře reprodukovatelné otisky DNA genomu. Takovéto otisky mohou mít různé použití, například otisky pro kriminalistické účely, pro diagnostickou identifikaci organismů a také pro identifikaci druhů, ras, variet nebo jednotlivců. Úroveň identifikace je možno stanovit podle stupně podobnosti (stupně variability) u různých členů specifické skupiny. Variabilita nebo podobnost je určována stupněm variace nukleotidového složení příbuzných genomů. Základním principem, v nějž vynález vychází je skutečnost, že v každém amplifikovaném restrikčním fragmentu je možno zjistit dva nukleotidové řetězce, které jsou od sebe odděleny řetězcem s určitou danou délkou, jak je zřejmé z obr. 9. Každý ze dvou nukleotidových řetězců je tvořen dvěma částmi:
(a) rozpoznávacím místem (cílovým místem) pro restrikční endonukleázu, (b) a nukleotidovým řetězcem, přilehlým k rozpoznávacímu místu a nacházejícím se v selektivním primeru.
V příbuzných organismech, druzích, varietách, rasách nebo u příbuzných jednotlivců jsou uvedené řetězce a jejich relativní vzdálenosti konzervovány v menší nebo větší míře. To znamená, že uvedené otisky představují bázi pro stanovení stupně příbuznosti mezi řetězci v genomech. Na druhé straně je možno využít rozdíly v ARF ke vzájemnému odlišení genomů. Specifické výhody vynálezu ve srovnání s jinými postupy pro otiskování genomů je vysoká rozlišovací schopnost, jíž je tímto postupem možno dosáhnout: je totiž možno současně srovnávat několik desítek nebo i stovek ARF.
Další zvláštní možností aplikace je sériové vyšetření nebo identifikace polymorfizmu restrikčních fragmentů (RFP). Změny v nukleotidovém složení DNA genomu často vedou k polymorfizmu restrikčních fragmentů: navíc zařazené nebo vypuštěné části pak ovlivní velikost restrikčních fragmentů, které je obsahují, jak je zřejmé z obr. 8, změny v nukleotidech pak mohou mít za následek zrušení rozpoznávacího (cílového) místa pro působení restrikční endonukleázy nebo vznik nového rozpoznávacího místa pro tento enzym, jak je zřejmé z obr. 11. Nejužívanějším postupem pro identifikaci takových změn je metoda Southem blot, při níž se používá klonovaných sond DNA, kde o techniku, která se často označuje jako detekce polymorfizmu délky restrikčních fragmentů, RFLP. Tato metoda zahrnuje extenzivní sériové vyšetření náhodně klonovaných fragmentů DNA při provádění Southem blot, tak aby bylo možno prokázat asociaci RFLP v různých genomech. V souladu s prováděním postupu podle vynálezu je možno RFP identifikovat přímým srovnáním ARF, získaných z různých genomů. V principu je postup podle vynálezu v případě detekce RFP citlivější vzhledem k tomu, že nedochází pouze k detekci rozdílů mezi rozpoznávacími místy pro restrikční endonukleázu, nýbrž také k detekci rozdílů v přilehlých nuldeotidových řetězcích, obsažených v selektivních PCR-primerech. V důsledku toho představuje postup podle vynálezu v současné době nej výhodnější postup pro detekci RFLP.
RFLP je nyní možno využít pro různé aplikace včetně otisků ke kriminalistickým účelům, ke sledování dědičně podmíněných onemocnění u lidí a ke sledování dědičnosti z agronomického hlediska sledovaných vlastností u rostlin a při chovu hospodářských a jiných zvířat. Základním principem je, že určitý polymorfizmus DNA je úzce spojen se specifickými genetickými vlastnostmi a je možno jej využít ke sledování přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických genetických vlastností.
-12CZ 291877 B6
V souladu s postupem podle vynálezu je možno analýzu ARF využít k definici genetického spojení polymorfních ARF se specifickými genetickými vlastnostmi. Polymorfhí ARF tohoto typu bude dále označovány názvem polymorfizmus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) k odlišení těchto fragmentů od polymorfizmu DNA typu RFLP, tak, jak je možno jej prokázat s použitím metody Southem blot při použití klonovaných sond DNA.
Jedna ze zvláštních aplikací vynálezu spočívá v detekci AFLP ve spojení se specifickými genetickými vlastnostmi. Aplikace zahrnuje analýzu ARF vzorků získaných při použití odlišných specifických primerů v materiálu, který byl získán působením restrikčních enzymů na DNA genomu blízce příbuzných jednotlivců s odlišnými genetickými vlastnostmi a použití analytických postupů, jimiž je možno zjistit korelaci mezi dědičností jednoho nebo většího počtu AFLP a genotypu, projevujícího se specifickými genetickými vlastnostmi.
Ve druhém výhodném provedení zahrnuje vynález použití postupu podle vynálezu pro identifikaci jednoho nebo většího počtu specifických restrikčních fragmentů. Určitý specifický restrikční fragment je možno amplifikovat z komplexní směsi označených restrikčních fragmentů tak, že se nejprve stanoví nukleotidový řetězec prvních 8 až 12 bází na každém konci restrikčního fragmentu. Na základě těchto sekvencí je pak možno konstruovat dva primery vždy s obsahem 5 až 10 nukleotidů, s řetězcem komplementárním k řetězci v bezprostřední blízkosti místa působení restrikčního enzymu v komplementárním řetězci restrikčního fragmentu. Při použití skupin takových primerů je po PCR-amplifikaci možno získat jediný amplifikovaný fragment. Restrikčním fragmentem, použitým při tomto postupu může být buď klonovaný restrikční fragment, nebo amplifikovaný restrikční fragment. Vzhledem k tomu, že celou řadu restrikčních fragmentů není možno příliš účinně amplifikovat, spočívá výhodný postup podle vynálezu pro identifikaci polymorfních DNA markérů v tom, že se nejprve pro identifikaci polymorfních DNA markérů v tom, že se nejprve amplifikuje náhodně zvolená skupina fragmentů a identifikují se AFLP, poskytující po PCR-amplifikaci silné pásy. Tyto vzorky je pak možno charakterizovat analýzou řetězce k vytvoření specifických primerů pro restrikční fragmenty. V typických případech je možno AFLP izolovat vyříznutím odpovídajícího pásu DNA z gelu a pak stanovit nukleotidový řetězec na obou koncích k průkazu řetězce prvních 5 až 10 nukleotidů, bezprostředně přiléhajících k rozpoznávacímu místu restrikční endonukleázy. Jakmile jsou tyto nukleotidové řetězce známy, je možno zkonstruovat specifické primery pro restrikční fragmenty, které budou amplifikovat pouze jediný restrikční fragment z rozštěpené DNA genomu. V tomto specifickém provedení vynálezu je možno použít pro detekci specifického restrikčního fragmentu dvou od sebe odlišných selektivních primerů. V každém ze dvou selektivních primerů se pak selektivní báze volí tak, že jsou komplementární vzhledem k řetězci nukleotidů, který je bezprostředně vázán na označené místo pro restrikční endonukleázu, jak je znázorněno na obr. 8. Počet selektivních bází pro každý primer závisí na komplexnosti směsi fragmentů po působení restrikčních endonukleáz.
Technika PCR se v posledních několika letech nesmírně rozvinula a rychle se stává jednou z nejužívanějších metod v lidském diagnostickém lékařství. Použití tohoto postupu zahrnuje mimo jiné detekci infekčních onemocnění a dědičně podmíněných onemocnění. Každá diagnostická zkouška je založena na použití dvou specifických syntetických oligonukleotidů, které se užijí jako primery při provádění PCR-reakce za získání jednoho nebo většího počtu fragmentů DNA se specifickou délkou. Při detekci onemocnění je zkouška schopna prokázat existenci i jen jediné molekuly DNA ve vzorku, která poskytuje charakteristický fragment. V případě geneticky podmíněných onemocnění se primery konstruují tak, že jejich produkty mohou rozlišovat mezi normální a chorobou pozměněnými alelami. Rozlišení je možné na základě odlišnosti řetězce v segmentu DNA genomu který je komplementární k primerů nebo na základě odlišné vzdálenosti mezi oběma primery.
Vzhledem k tomu, že primery mají nesmírně vysoký stupeň specifičnosti, přičemž je možné sledovat současně různá onemocnění, se tento postup často označuje jako PCR multiplex. Tento postup však trpí omezením, které spočívá v tom, že je možnou současně sledovat jen několik,
-13CZ 291877 B6 obvykle 5 až 8 různých onemocnění. Vědeckým podkladem tohoto omezení je skutečnost, že optimální podmínky pro PCR-amplifikaci (teplota pro vazbu, koncentrace hořečnatých iontů, koncentrace primeru) se podstatně mění v závislosti na použitém páru primerů. V případě PCR multiplex je proto často nutné volit kompromisní podmínky, při nichž všechny primery mohou poskytnout zjistitelné produkty. Kromě svrchu uvedeného jevu existuje ještě velký rozdíl mezi účinností amplifikace různých fragmentů. V důsledku obou uvedených omezení často může dojít k tomu, že produkty některých párů primerů nejsou při provádění PCR multiplex prokazatelné.
Postup podle vynálezu v podstatě odstraňuje svrchu uvedená omezení PCR multiplex vzhledem ktomu, že všechny primery, použité při provádění tohoto postupu mají podstatnou část svého nukleotidového řetězce společnou. Mimoto dochází při selekci AFLP k selekci DNA markérů, k jejíž amplifikaci dochází se stejnou účinností. To znamená, že v případě optimálních podmínek pro uskutečnění PCR-amplifikace pro různé selektivní primery dochází k daleko menším variacím, než jaké je možno pozorovat v případě běžně užívaných primerů, specifických pro určitý řetězec. V podstatě tedy jde o ideální kompromis mezi počtem bází syntetického oligonukleotidu, jehož je zapotřebí k dosažení požadované specifičnosti při detekci jediného určitého fragmentu DNA dané velikosti ve složitém genomu, tak jak bylo svrchu vypočítáno a mezi délkou a složením oligonukleotidu, které jsou optimální pro účinnou PCR-amplifikaci. Postup podle vynálezu proto představuje dosud nejvýhodnější postup pro PCR multiplex.
Vynález tedy poskytuje obecnou metodu izolování DNA markérů z jakéhokoliv genomu a pro použití těchto DNA markérů ve všech myslitelných aplikacích otisků DNA.
Příklady provedení vynálezu
Postup podle vynálezu bude v dalším blíže objasněn s pomocí konkrétních příkladů, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.
Příklad 1
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA z rajčete při použití Pstl.
A) Izolace a modifikace DNA
Celková DNA z rajčete (Lycopersicon esculentum c.v. Moneyamarker) byla izolována z mladých listů metodou podle publikace Bematzski a Tansley, Theor. Appl. Genet. 72, 314 - 321. Typický výtěžek byl 50 až lOOmikrogramů DNA na 1 gram čerstvých listů. DNA byla rozštěpena při použití enzymu Pstl (Pharmacia) a na získané restrikČní fragmenty byly navázány adaptory Pstl s dvojitým řetězcem (ds) dále popsaným způsobem. Tyto adaptory měly následující strukturu
5- CTCGTAGACTGCGTACATGCA - 3
3- CATCTGACGCATGT - 5
3'-TGCA-přečnívající zakončení v těchto adaptorech se váže na prodloužená zakončení, vytvořená působením Pstl. Po navázání na tento adaptor nedochází k obnovení rozpoznávacího místa pro Pstl, řetězce CTGCAG vzhledem k tomu, že 5'-C-zakončení je nahrazeno A. Vazná reakce byla navržena takovým způsobem, že konečným výsledkem je téměř výlučně molekula s vazbou fragmentu DNA na adaptor. Tohoto cíle bylo dosaženo tak, že 1) byly užity nefosforylované adaptory, vylučující vzájemnou vazbu adaptoru na adaptoru a 2) vazba a restrikční reakce byly provedeny současně. Druhé z uvedených opatření zajistí, že dojde
-14CZ 291877 B6 k restrikci jakéhokoliv produktu, který je vytvořen vazbou dvou restrikčmch fragmentů navzájem a tím dojde k téměř úplnému vyloučení tohoto typu produktů. Produkty, vytvořené vazbou adaptoru na restrikční fragment nemohou být restrikčním enzymem rozštěpeny vzhledem k tomu, že u těchto produktů nedochází ke znovuvytvoření místa štěpení pro enzym Pstl. Při vazbě adaptoru byly použity následující reakční podmínky:
mikrogramy DNA z rajčete
0,2 mikrogramu adaptoru jednotek Pstl jednotka T4 DNA-ligázy mM trisHAc o pH 7,5,10 mM MgAc, 50 mM KAc, mM dithiothreitolu, 0,5 mM ATP
Reakce k uskutečnění vazby se provádí v reakčním objemu 20 mikrolitrů celkem 3 hodiny při teplotě 37 °C. Po vazbě adaptoru se nenavázané řetězce adaptoru odstraní selektivním vysrážením. K tomuto účelu se objem reakční směsi zvýší na 100 mikrolitrů a přidá se NH4 do konečné koncentrace 2,5 M. Pak se přidá ještě 100 mikrolitrů ethanolu s teplotou -20 °C a směs se inkubuje 5 minut při teplotě místnosti. Pak se DNA oddělí odstředěním celkem 10 minut při 14 000 otáčkách za minutu v chlazené Eppendorfově odstředivce při teplotě 4°C. Usazenina DNA se pak jednou promyje 0,5 ml 70% ethanolu při teplotě místnosti a pak se rozpustí ve 40 mikrolitrech ΤΟ,ΙΕ (10 mM Tris.HCl o pH 8,0, 0,1 mM EDTA). DNA se pak skladuje při teplotě -20 °C. Selektivní srážení, tak, jak bylo popsáno účinně odstraní nenavázané adaptory z reakční směsi, současně však dochází také ke ztrátě malých fragmentů DNA (200 párů bází a menší).
B) Amplifikační reakce
DNA, připravená svrchu uvedeným způsobem byla užita jako matrice pro amplifikaci Pstlfragmentů. Reakční směs pro PCR-reakci v tomto případě obsahovala následující složky:
ng matricové DNA
150ngprimeru jednotku Taq DNA-polymerázy (Perkin Elmer)
200 mikromol všech čtyř dNTP mM Tris.HCl o pH 8,5,1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1
H2O do celkového objemu 50 mikrolitrů
Reakční směs byla převrstvena 20 mikrolitry lehkého minerálního oleje, aby nedošlo k odpařování v průběhu amplifikační reakce. PCR-reakce byla uskutečněna na zařízení Perkin Elmer Thermal Cycler při použití následujících typů cyklů: 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 60 °C, pak vzestup teploty od 60 do 72 °C rychlostí 1 °C za 5 sekund a 2,5 minuty při 72 °C. Bylo uskutečněno celkem 33 cyklů. Po ukončení reakce bylo přidáno 20 mikrolitrů chloroformu a 10 mikrolitrů barviva, v tomto případě 50% sacharóza s 0,1 % barviva Oraž G (Měrek). Barvivo bylo důkladně promíseno s reakční směsí a směs byla krátce odstředěna k odstranění organické fáze (minerální olej a chloroform) z reakční směsi, doplněné barvivém. Pak bylo 20 mikrolitrů reakční směsi analyzováno na 0,1% agarozovém gelu.
C) Amplifíkace DNA z rajčete při použití primerů se zvyšující se selektivitou
DNA rajčete byla rozštěpena působením restrikčního enzymu Pstl a zakončení byla prodloužena při použití Pstl-adaptoru za svrchu uvedených podmínek. Byly zvoleny čtyři odlišné primery s následujícími řetězci:
- 15CZ 291877 B6
1. 5-CTCGTAGGGGGGGGGGGGGGGGACTGCGTACA-3
2. 5-G AC TGCGTACAtg ca gA-3
3. 5-GACTGCGTACA tgcagAC-3
4. 5-GACTGCGTACAtgcagACC-3
Primer 1 je částí horního adaptoru, použitého pro modifikaci DNA a měl by tedy amplifikovat všechny Pstl-fragmenty. Primer 2 obsahuje část řetězce adaptoru, rozpoznávací místo působení enzymu Pstl (řetězec, psaný malými písmeny) a jeden selektivní nukleotid (velká písmena) a měl by teoreticky amplifikovat přibližně 1/16 všech Pstl-fragmentů. Primery 3 a 4 jsou podobné primeru 2, avšak obsahují 2 a 3 selektivní nukleotidy a je tedy možno očekávat, že budou amplifikovat přibližně 1/256 a 1/4096 Pstl-fragmentů. Část reakční směsi byla analyzována na 1,0% agarozovém gelu, výsledek je znázorněn na obr. 11. Dráhy 1 a 6 na tomto obrázku obsahují značící DNA, jejíž velikost je uvedena vlevo. Dráhy 2, 3, 4 a 5 obsahují produkty PCR, získané při použití primerů 1, 2, 3 a 4. Výsledky prokazují, že pouze v případě primeru, obsahujícího 3 selektivní nukleotidy je počet amplifikovaných fragmentů takový, aby bylo možno získat zřetelné pásy. V případě ostatních tří primerů byly získány pásy, které nebylo možno na agarozovém gelu rozdělit, protože vzniklo příliš mnoho produktů PCR-reakce. Mezi těmito produkty vždy převažují některé fragmenty a je možno je pozorovat jako nátěr v pozadí, na němž se jeví další PCR-produkty. Je pravděpodobné, že se tyto produkty vyskytují ve větším počtu kopií vgenomu rajčete nebo dochází k jejich účinnější amplifikaci než v případě dalších produktů. Je nutno uvést, že vzhledem k celkovému počtu fragmentů po štěpení enzymem Pstl v DNA genomu rajčete, 20 000 až 100 000 bylo od začátku předpokládáno, že bude zapotřebí použít primeiy, obsahující 3 selektivní nukleotidy k získání zřetelně odlišitelných pásů na agarozovém gelu.
D) Analýza amplifikovaných fragmentů pomocí Southem blot
Amplifikované fragmenty byly zkoumány metodou Southem blot, aby bylo možno ověřit, zda tyto fragmenty odpovídají restrikčním fragmentům s odpovídajícími rozměry. K tomuto účelu byly čtyři fragmenty, získané při použití primeru 4, vyříznuty z agarozového gelu. Ze získaných řezů byla čištěna DNA absorpcí na skleněné kuličky (Gene Clean, Bio 101) a část čištěné DNA byla znovu amplifikována, čímž byl získán přibližně 1 mikrogram každého ze čtyř fragmentů DNA. Produkty reamplifikační reakce pak byla analyzovány elektroforézou na 1,0% preparativním agarozovém gelu a požadované fragmenty DNA byly čištěny. 200 ng každého z fragmentů bylo označeno při použití (alfa- P)dATP při použití balíčku pro značení podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim). Veškerá DNA rajčete byla rozštěpena Pstl materiál byl podroben elektroforéze na 1,0% agarozovém gelu. Byly použity čtyři zřetelně od sebe oddělené dráhy, na každou z nich byly naneseny přibližně 3 mikrogramy DNA po rozštěpení. Pak byl proveden blot agarozového gelu při použití hybridizační membrány Genscreenn + podle návodu výrobce (New England Nuclear). Po uskutečnění blotu byl gel rozdělen na čtyři podíly, z nichž každý obsahovat jednu dráhu, získanou z DNA rajčete, rozštěpené působením enzymu Pstl. Každý z uvedených čtyř podílů byl hybridizován na jednu ze čtyř DNA-sond způsobem podle publikace Klein-Lankhorst a další, Theor. Appl. Genet. 81, 661-667. Hybridizovaný materiál byl podroben autoradiografii po dobu 40 hodin při použití filmů Kodak XAR5. Získané výsledky prokazují, že všechny fragmenty DNA genomu byly rozpoznávány uvedenými čtyřmi sondami DNA a měly stejnou délku jako tyto sondy. To znamená, že amplifikované fragmenty, užité jako sondy, pocházely z fragmentů, prokázaných na blotech.
-16CZ 291877 B6
E) Selektivní amplifikace jediného restrikčního fragmentu
Pro 3 náhodně zvolené Pstl-fragmenty DNA rajčete byly zkonstruovány tři skupiny primerů, šlo o fragmenty, z nichž byl znám řetězec, těsně sousedící s místem působení enzymu Pstl. Skupiny primerů s obsahem 5 selektivních nukleotidů byly zkonstruovány následujícím způsobem:
Skupina primerů 1
Řetězec 1
5-ctgcagCAGTACCAGC—-CCGGCACCTGctgcag-3
5-TGGGTAACATtgcagCAGTA-3 3-TGGACgacgtACATGCGT-5 primer 1.1 primer 1.2
Skupina primerů 2
Řetězec 2:
5-ctgcagCCGAATGTCT-----AGTGAGTTAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagCCGAA-3 3-CAATCgacgtACATGCGT-5 primer 2.1 primer 2.2
Skupina primerů 3
Řetězec 3:
5-ctgcagAATACCAAGA——GCAAGCACAGctgcag-3
5-T GCGTACAtgcagTTATG-3 3-GTGTCgacgtACATGCGT-5 primer 3.1 primer 3.2
DNA rajčete byla rozštěpena enzymem Pstl a na zakončení restrikčních fragmentů byly navázány adaptory svrchu uvedeným způsobem. Tato DNA byla pak užita jako matrice při PCR-reakci s použitím skupin primerů 1,2 nebo 3 a za svrchu uvedených podmínek. Produkty z každé PCRreakce byly analyzovány na 1,0% agarozovém gelu. Výsledek je znázorněn na obr. 12. Na obr. 12 je znázorněno 13 drah, z nichž ve drahách 1,2,12 a 13 se nachází značící DNA. Velikost molekul této značící DNA (v kilobázích, kb) je uvedena na obou stranách gelu. Ve drahách 3,6 a je znázorněna DNA plazmidu s každým ze tří fragmentů o restrikci enzymem Pstl za vzniku fragmentu vektoru, pUC18 (Yanisch-Perron a další, Gene 33, 103-119) a vloženého Pstlfragmentu. Ve drahách 4 a 5 je produkt amplifikace při použití skupiny primerů 1, 5 ft odpovídající DNA plazmidu a 1 ng celkové DNA genomu. Ve drahách 7 a 8 je znázorněna amplifikace při použití skupiny primerů 2, DNa plazmidu a celkové DNA genomu a v drahách a 11 je znázorněna amplifikace při použití skupiny 3 primerů. Znázorněné výsledky prokazují, že je možné dosáhnout amplifikace jediného Pstl-fragmentu ze směsi alespoň 20 000 fragmentů
-17CZ 291877 B6 při použití selektivní amplifikace fragmentů s použitím primerů, obsahujících 5 selektivních nukleotidů.
F) Identifikace polymorfizmu DNA s použitím SRFA
V předchozích kapitolách bylo jasně prokázáno, že při použití selektivní amplifikace restrikčních fragmentů je tyto fragmenty možno amplifíkovat, a to buď náhodným způsobem, nebo může jíž o amplifikaci specifických restrikčních fragmentů v případě, že je k dispozici informace o složení řetězce. Mělo by tedy být možné prokázat polymorfizmus cílových restrikčních míst mezi dvěma jednotlivci téhož druhu. Tato metoda bude dále popsána pro dvě linie rajčat, které jsou si velmi příbuzné, avšak liší se přítomností genu pro odolnost proti nematodům na kořenech rostlin, Mi, v jedné z uvedených linií. Tento gen Mi má svůj původ v Lycopersicon peruvianum, což je vzdáleně příbuzný druh vzhledem k poživatelným rajčatům Lycopersicon esculentum. Tento gen byl uložen do rajčat L. esculentum křížením a následným dvanáctinásobným zpětným křížením s původní rostlinou L. esculentum a pak selekcí na přítomnost genu Mi. Z uvedeného důvodu se obě použité linie rajčat od sebe liší pouze malou částí svého genetického materiálu, to znamená genem Mi a oblastí v jeho bezprostřední blízkosti. Bylo vypočítáno, že oblast Mi tvoří méně než 1 % genomu této linie při použití klasických genetických metod.
DNA byla izolována ze dvou linií rajčat (linie 83M-71392, Mi-senzitivní a linie 83M-71398, Mi-odolná, obě byly získány od De Riter Seeds, Bleiswijk, Nizozemí), tyto linie byly rozštěpeny působením restrikčního enzymu Pstl a opatřeny adaptory svrchu uvedeným způsobem. Pak byl proveden velký počet amplifikačních reakcí při použití primerů, které se od sebe lišily ve svém prodloužení obsahem selektivních nukleotidů. Byly užity tři selektivní nukleotidy a kromě jednotlivých primerů byly použity také kombinace dvou různých primerů. Výsledky reakcí byly analyzovány na gelech se směsí polyakrylamidu a agarozy, bylo užito 2,5 % polyakrylamidu a 1,0 % agarozy při poměru akrylamidu k bisakrylamidu 20:1. Analýza byla uskutečněna na gelu, uloženém v jednotce Proteam Π (Biorad) při použití dělicích přepážek 1,5 mm. Bylo užito celkem 16 různých primerů v 16 reakcích, v nichž byl použit vždy jeden primer a ve 120 reakcích, při nichž byly použity všechny možné kombinace dvou primerů. Typický příklad gelu se šesti těmito kombinacemi je znázorněn na obr. 13. Dráhy 1 a 14 tohoto gelu obsahují značící DNA, velikost molekul v kilobázích je uvedena na pravé straně gelu. Ve drahách 2 a 3,4 a 5, 6 a 7 atd. jsou uloženy produkty amplifikace při použití specifického primerů nebo při použití páru primerů při odebrání materiálů ze svrchu uvedených dvou linií rajčat. Při sériovém vyšetřování materiálu na polymorfizmus cílových míst pro působení restrikčních enzymů byla získána řada fragmentů, z nichž tři fragmenty byly obsaženy ve velkém množství, tyto fragmenty jsou znázorněny ve drahách 9, 11 a 12 na obr. 13 (znázornění pomocí malého kroužku). Je pravděpodobné, že polymorfní pásy ve drahách 9 a 11 jsou totožné vzhledem k tomu, že při obou reakcích byl použit tentýž primer (rozdíl spočívá pouze v použití druhého primerů ve dráze 11). Oba polymorfní fragmenty v drahách 11 a 12 byly z gelu vyříznuty, gel byl rozrušen protlačením jehlou velikosti 18 a DNA byla z gelu vymyta eluci pomocí difúze ve 200 mikrolitrech 100 mM tris.HCl o pH 8,0,10 mM EDTA. 2 mikrolitry materiálu byly použity pro remplifikaci uvedených fragmentů, jak již bylo svrchu popsáno. Ve 200 ng každého fragmentu byla vyplněna zakončení při použití T4-DNA-polymerázy a pak byl materiál navázán na 100 ng plazmidového vektoru pUC18 (Yanisch-Perron a další, Gene 33,103-119) po rozštěpení enzymem Smál. Směs, získaná vazbou, byla užita k transformaci E. coli a pro každý fragment byl zvolen jeden klon rekombinantní E. coli pro analýzu řetězce. Všechny uvedené manipulace byly prováděny při použití standardních postupů podle publikace Sambrook, Fritsch a Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Byly syntetizovány dvě skupiny primerů s obsahem šesti selektivních nukleotidů na bázi řetězců svrchu uvedených dvou fragmentů. Bylo možno amplifíkovat každý fragment specificky při použití uvedených skupin primerů. Byly amplifikovány pouze fragmenty z té linie rajčat, z níž pocházely. To znamená, že u uvedených skupin primerů bylo možno pozorovat tentýž
-18CZ 291877 B6 polymorfizmu, jaký byl původně prokázán u primerů s obsahem tří selektivních nukleotidů, které byly užity k průkazu tohoto polymorfizmu.
Příklad 2
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA rajčete při použití dvou restrikčních enzymů
V příkladu 1 byl osvětlen princip selektivní amplifikace restrikčních fragmentů (SRDA) při použití DNA rajčete a restrikčního enzymu Pstl. V tomto případu bude popsána amplifikace typu SRDA při použití dvou restrikčních enzymů, Pstl a Msel.
Izolace a modifikace DNA
Veškerá DNA rajčete byla izolována z mladých lístků způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Dva páry tak zvaných izogenických linií byly použity jako zdroj DNA a byly označeny GemR aGems a GCR26 a GCR151 (tyto linie jsou popsány v následujících publikacích: Denby a Wiliams, 1962, Can. J. Plant Sci. 42, 681-685, Smith a Ritchie, 1983, Plant. Mol. Biol. Rep., 1, 41-45). Dva vzorky, jeden z každého páru izogenických linií jsou geneticky velmi podobné, avšak liší se od sebe přítomností řetězce pro odolnost proti patogenní houbě Verticillium alboatratum.
Prvním stupněm při modifikaci vzorků DNA bylo štěpení těchto vzorků při použití dvou restrikčních enzymů, Pstl a Msel. Rozštěpení DNA a také následné navázání adaptorů na fragmenty DNA bylo prováděno v tomtéž pufru, označeném RL-pufr (pufr pro restrikci a vazbu), pufr obsahoval následující složky: 10 mM Tris.HAc, 10 mM MgAc, 50 mM KAc a 5 mM DTT, pH 7,5.
Štěpení DNA restrikční enzymy Pstl a Msel
Štěpení DNA bylo prováděno při použití následujících materiálů:
2.5 mikrogramů DNA
12.5 jednotek Pstl (Pharmacia, 10 jednotek/mikrolitr)
12,5 jednotek Msel (N.E. Biolabs, 4 jednotky/mikrolitr)
5,0 mikrolitr 10 x RL-pufr
H2O do 50 mikrolitrů
Inkubace reakční směsi byla prováděna jednu hodinu při teplotě 37 °C.
Následujícím stupněm při modifikaci DNA byla vazba molekul adaptorů na zakončení fragmentů DNA. Nejprve bylo zapotřebí připravit příslušné molekuly adaptorů s dvojitými řetězci dále uvedeným způsobem.
Příprava adaptorů
Adaptor Msel má následující řetězec:
-19CZ 291877 B6
5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TACTCAGGACTCAT-5
Pro přípravu roztoku 50 pmol/mikrolitr tohoto adaptoru bylo smíseno 8 mikrogramů, 1430 pmol 16-meru s řetězcem nukleotidů 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 s 7 mikrogramy, 1430 pmol 14-meru 5-TACTCAGGACTCAT-3 v celkovém objemu 28,6 mikrolitrů vody.
Adaptor Pstl má následuj ící řetězec:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
Pro přípravu roztoku 5 pmolu/mikrolitr tohoto adaptoru bylo smíseno 5,25 mikrogramů, 715 pmol biotinylovaného 21-meru 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 s 3,5 mikrogramy, 715pmolu 14-meru 5-TGTACGCAGTCTAC-3 v celkovém objemu 143 mikrolitrů vody.
Vazba molekuly adaptoru
K rozštěpené DNA bylo přidáno 10 mikrolitrů směsi, která obsahovala následující složky:
mikrolitr Pstl bio-adaptoru (= 5 pmol) mikrolitr Msel adaptoru (=50 pmol)
1,2 mikrolitrů 10 mM ATP mikrolitr 10 x RL-pufru jednotka T4 DNA-ligázy (Pharmacia, 5 jednotek/mikrolitr)
H2O do 10 mikrolitů
Výsledná reakční směs v množství 60 mikrolitrů byla inkubována celkem 3 hodiny při teplotě 37 °C.
Adaptoiy byly navrženy takovým způsobem, aby po ukončení vazby nedošlo k opětnému vzniku míst působení restrikčního enzymu, užitého ke štěpení. Tak je možno zabránit vzájemné vazbě restrikčních fragmentů vzhledem ktomu, že restrikční enzymy si v průběhu vazebné reakce uchovávají svoji účinnost. Vzájemná vazba adaptorů není uskutečnitelná z toho důvodu, že adaptory nejsou fosforylovány, jak je již podrobněji vysvětleno v příkladu 1.
Selekce biotinylovaných fragmentů
Příprava matricové DNA pro SRFA s použitím dvou restrikčních enzymů obvykle zahrnuje ještě další stupeň, který není užit v případě, že se SRFA provádí s použitím pouze jednoho enzymu. V tomto stupni se fragmenty DNA, na něž byl navázán biotinylovaný adaptor, oddělení od všech zbývajících fragmentů.
Biotinylované fragmenty se v tomto stupni oddělí od nebiotinylovaných fragmentů (fragmenty Msel-Msel) vazbou na paramagnetické streptavidinové kuličky (Dynal). 10 mikrolitrů kuliček se lx promyje 100 mikrolitry STEX (100 mM NaCl, 10 mM tris.HCl, lmM EDTA, 0,1 % Tritonu X-100 o pH 8,0) a pak se materiál znovu uvede do suspenze ve 140 mikrolitrech STEX. Pak se kuličky přidají ke směsi, v níž proběhla vazba, do konečného objemu 200 mikrolitrů. Směs se pak inkubuje 30 minut za opatrného míchání při teplotě místnosti, aby došlo k vazbě biotinylovaných fragmentů na kuličky. Pak se kuličky oddělí tak, že se zkumavky, které je obsahují,
-20CZ 291877 B6 přidrží v blízkosti magnetu. Tak nemohou kuličky být odpipetovány při přenášení supematantu do jiné zkumavky. Kuličky se lx promyjí a pak se přenesou do nové zkumavky. Pak se kuličky ještě 3x promyjí při použití 200 mikrolitrů STEX. Nakonec se kuličky znovu uvedou do suspenze ve 200 mikrolitrech TO1.E (10 mM tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) a přenesou se do nové zkumavky. DNA se uchovává při teplotě 4 °C.
DNA, rozštěpená působením restrikčních enzymů a opatřená adaptory, navázaná na paramagnetické streptavidinové kuličky a zbavená fragmentů Msel-Msel bude v následujících stupních označována jako matricová DNA.
Amplifikace fragmentů Pstl-Msel
Matricová DNA, připravená svrchu uvedeným způsobem by měla obsahovat všechny fragmenty Pstl-Msel z uvedených linií rajčat a mimoto ještě malé množství fragmentů Pstl-Pstl, prostých vnitřních fragmentů Msel. V tomto pokusu byl větší počet těchto fragmentů Pstl-Msel vizualizován amplifikací v podstatě způsobem, který byl popsán v příkladu 1: Analýza produktů amplifikace na gelu byla uskutečněna na denaturačním akrylamidovém gelu podle Maxam a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 560-564 vzhledem k tomu, že fragmenty, získané při uvedeném postupu byly mnohem menší než fragmenty, které byly popsány v příkladu 1. Mimoto tyto typy gelů umožňují oddělení až 100 pásů v jedné dráze, což je přibližně lOx tolik jako v případě agarozových gelů z příkladu 1. Fragmenty byly vizualizovány označením jednoho z PCR-primerů na 5'-zakončení pomocí (32P)ATP a polynukleotidkinázy.
Značení PCR-primeru
Primer, který byl vybrán pro značení byl 19-mer se vzorcem 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3, který byl označen jako Msel-primer-1 a v němž jsou selektivní nukleotidy označeny malými písmeny. Značení bylo uskutečněno při použití následujících materiálů:
3,0 mikrolitrů 18-neru (z roztoku 50 ng/mikrolitr = 150 ng) 5,0 mikrolitrů 32P-APT (z roztoku 10 mikroCi/mikrolitr = 50 mikroCi) 3,0 mikrolitrů 250 mM tris.HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM DTT, pH 7,5 0,5 mikrolitrů T4 DNA-kinázy (Pharmacia, 10 jednotek/mikrolitr) 18,5 mikrolitrů vody.
Byl získán celkový objem 30 mikrolitrů směsi, která byla inkubována 30 minut při teplotě 37 °C. V každé PCR byl přidán 1 mikrolitr tohoto 5'-značeného primerů.
Bylo provedeno celkem 28 PCR-reakcí, v nichž byla každá ze 4 matricových DNA amplifikována pomocí sedmi kombinací primerů. Každá kombinace primerů obsahovala tentýž Mselprimer (svrchu popsaný Msel-primer-1), avšak měnily se Pstl-primery. Bylo vybráno celkem 7 různých primerů (stejně jako v případě Msel-primeru jsou selektivní nukleotidy označeny pomocí malých písmen):
Pstl-primer-1: 5-GACTGCGTACATGCAGga-3
Pstl-pri mer-2: 5-GACTG CGTAGATG CAGgt-3
PstI-primer-3: 5-GACTGCGTACATGCAGgg-3 Pstl -primer-4: 5-GACTGCGTACATGCAGag-3 Psti -primer-5: 5-GACTGC GTACATG C AGat-3 Pstl-primer-6: 5-GACTGCGTACATGCAGct-3 Pstl-primer-7: 5-GACTGCGTACATGCAGta-3
-21 CZ 291877 B6
Všechny PCR-primery byly rozpuštěny ve vodě v koncentraci 50 ng/mikrolitr.
Amplifikační reakce
Směs pro uskutečnění PCR obsahovala tyto složky:
2,0 mikrolitrů matricové DNA
1,0 mikrolitrů 5'značeného Msel-primeru (5 ng)
0,5 mikrolitrů neznačeného Msel-primeru (25 ng)
0,6 mikrolitrů Pstl-primeru (30 ng)
2,0 mikrolitrů 100 mM tris.HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KC1, pH 8,5
0,8 mikrolitrů 5 mM dNTP
0,1 mikrolitrů Taq-polymerázy (Cetus Perkin Elmer, 5 jednotek na mikrolitr)
13,0 mikrolitrů vody
Všechny reakční složky byly dobře promíseny a podstatná složka PCR, obvykle enzym, byla přidána jako poslední. Pak byla reakce co nejdříve zahájena.
Amplifikace byla uskutečněna při použití zařízení Perkin Elmer k provádění tepelných cyklů. Bylo užito následujícího profilu jednotlivých cyklů:
| 1 cyklus: | denaturace: | 30 s při 94 °C |
| vazba: | 30 s při 65 °C | |
| prodloužení: | 30 s při 72 °C | |
| 11 cyklů: | denaturace: | 30 s při 94 °C |
| vazba: | teplota se snižuje o 0,7 °C v každém cyklu 64.3 °C, 63,6 °C, 62,9 °C, 62,2 °C, 61,5 °C, 60,8 °C, 61,1 °C, 59.4 °C, 58,7 °C, 58,0 °C, 57,3 °C. Při každé teplotě inkubace 30 sekund. | |
| prodloužení: | 60 sekund při 72 °C | |
| 23 cyklů: | denaturace: | 30 s při 94 °C |
| vazba: | 30 s při 56 °C | |
| prodloužení | 60 s při 72 °C |
Analýza amplifikovaných fragmentů na gelu
Reakční produkty byly analyzovány na 4,5% denaturačních polyakrylamidových gelech. Byly použity gely s rozměrem 50 x 38 cm, kazety pro přípravu těchto gelů byly získány od Biorad. Bylo užito vždy 100 ml roztoku gelu s obsahem 4,5 % akrylamidu, 0,225 % bisakrylamidu,
7,5 M močoviny, 50 mM tris, 50 mM kyseliny borité, 1 mM EDTA, pH 8,3.100 ml roztoku gelu bylo smíseno s 500 mikrolitry 10% persíranu amonného a 100 mikrolitry TEMED těsně přes odlitím gelu. Jako pufř pro elektroforézu byl užit tris pufř s kyselinou boritou a EDTA, obsahující 100 mM tris, 100 mM kyseliny borité a 2 mM EDTA, pH 8,3. Reakční směs byla smísena se stejným objemem 20 mikrolitrů 98% formamidu s 10 mM EDTA, 0,01 % bromfenolové modři a 0,01 xylenkyanolu. Výsledné směsi byly zahřátý na 3 minuty na 95 °C a pak rychle zchlazeny na ledu. 2 mikrolitry každého ze vzorků byly naneseny na gel a postup byl pak prováděn při napětí 110 W k zajištění stálého vývoje tepla v průběhu elektrofézy. Za těchto podmínek odpovídala síla elektrického pole v gelu hodnotám 40 až 50 voltů/cm.
Výsledky reakcí SRFA jsou znázorněny na obr. 14. Dráhy jsou označeny 1 až 28 a obsahují vždy čtyři linie rajčat s jednou ze sedmi kombinací primerů. Pořadí linií rajčat na gelu je následující.
1. GCR26, 2. GCR151, 3. GemR, 4. Gems, Dráhy 1 až 4 obsahují tyto DNA amplifikované Msel-primerem-1 a Pstl-primerem-1, dráhy 5 až 8 obsahují tyto DNA, amplifikované Msel-primerem-1 a Pstl-primerem-2, dráhy 9 až 12 obsahují tyto DNA, amplifikované
-22CZ 291877 B6
Msel-primer-1 a Pstl-primerem-3, dráhy 13 až 16 obsahují tyto DNA amplifíkované Msel-primerem-1 a Pstl-primerem-5, dráhy 21 až 24 obsahují tyto DNA amplifíkované Msel-primerem-1 a Pstl-primerem-6 a dráhy 25 až 28 obsahují tyto DNA amplifíkované Msel-primerem-1 a Pstl-primerem-7. Gel neobsahuje žádné označení, určují velikosti molekuly, avšak vizualizované fragmenty DNA odpovídají ±200 nukleotidům na spodní straně obrázku a ±500 nukleotidům na jeho horní straně.
Příklad 3
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA různých čeledí
V příkladu 2 je uveden princi selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA při použití dvou restrikčních enzymů s použitím DNA rajčete. V tomto příkladu bude prokázáno, že obdobné výsledky je možno získat při použití DNA různých čeledí Lactuca při použití týchž restrikčních enzymů, Pstl a Msel.
Izolace a modifikace DNA
DNA se izoluje způsobem, popsaným v příkladu 1 při použití mladých listů různých čeledí Lactuca. Jak bude ještě dále uvedeno, tyto rostliny zahrnují běžný salát L. sativa a několik jednotlivců ze dvou divokých čeledí Lactuca, L. saligna a L. virosa. Rostliny byly pro účely pokusů označeny následujícími jmény:
1. L. saligna, č. 21, rostlina 1
2. L. saligna, č. 21, rostlina 2
3. L. saligna, č. 22, rostlina 1
4. L. saligna, č. 22, rostlina 2
5. L. virosa, č. 01, rostlina 1
6. L. virosa, č. 01, rostlina 2
7. L. virosa, č. 02
8. L. virosa, č. 03, rostlina 1
9. L. virosa, č. 03, rostlina 2
10. L. sativa, běžný křehký salát
Analyzovaný genetický materiál tedy představoval 6 odlišných typů rostlin včetně dvou odlišných jednotlivců ze čtyř těchto typů.
Modifikace DNA těchto rostlin Lactuca k vytvoření matric pro SRFA byly prováděny stejným způsobem, jaký byl popsán svrchu v Příkladu 2.
Amplifikace Pstl-Msel-fragmentů
DNA, připravené svrchu uvedeným způsobem byly užity jako matrice pro reakce SRFA. Byly užity kombinace dvou primerů, přičemž byl použit jeden Msel-primer a dva od sebe odlišné Pstl-primery. Tyto primery (selektivní nukleotidy v nich jsou označeny malými písmeny) je možno charakterizovat jejich dále uvedenými řetězci:
| Msel-primer: | 5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3 |
| PstEprimer-l: | 5-GACTGCGTACATGCAGaa-3 |
| PstEprimer-2: | 5-GAGTGCGTACATGCAGca-3 |
-23CZ 291877 B6
Amplifikace fragmentů Pstl-Msel při použití svrchu popsaných primerů byla prováděna přesně způsobem podle příkladu 2 a vytvořené fragmenty byly vizualizovány na denaturačním polyakrylamidovém gelu způsobem podle příkladu 2. Získané pásy jsou znázorněny na obr. 15. Na drahách 1 až 10 jsou znázorněny vzorky DNA 1 až 10, amplifikované primerem Msel v kombinaci s Pstl-primerem-1, ve drahách 11 až 20 jsou znázorněny vzorky DNA 1 až 10, amplifikované primerem Msel v kombinaci s Pstl-primerem-2. Označení velikosti molekul nukleotidů (na výkrese není viditelné) je uvedeno v pravé straně gelu. Rozdíly v jednotlivých pásech odrážejí rozdíly v příbuznosti zkoumaných rostlin.
Příklad 4
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů v inbredních liniích kukuřice při použití různých kombinací restrikčních enzymů
V příkladech 2 a 3 je uveden princip selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA při použití dvou restrikčních enzymů při použití DNA z rajčete a ze salátu (Lactuca species).
V tomto příkladu bude prokázáno, že podobných výsledků je možno dosáhnout také při použití linií kukuřice (Zea mais). Mimoto bude prokázáno, že k typování DNA u těchto linií kukuřice je možno využít různých kombinací restrikčních enzymů.
Izolace a modifikace DNA
Byly užity dvě inbrední linie kukuřice, které byly označeny 1 a 2. Zdroj těchto linií je irelevantní vzhledem ktomu, že podle získaných zkušeností je možno z jakékoliv zvolené linie získat s použitím SRFA dobré typování DNA. DNA ze zkoumaných linií byla získána z mladých listů, z nichž byla izolována způsobem podle publikace Saghai-Mahoof a další 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 8014-8018. Pro přípravu matricové DNA byly užity následující kombinace restrikčních enzymů (EK): Pstl/Taql, EcoRI/Taql, Asel/Taql a Sse8387-1/Taql. Všechny enzymy byly získány od Pharmacia s výjimkou enzymu Asel, kteiý byl získán od New England Biolabs a enzymu Sse8387-I, který byl získán od Amersham. Matricové DNA byly připraveny v podstatě podle příkladů 2 a 3' s následujícími výjimkami.
Restrikční DNA byla uskutečněna tak, že nejprve byla DNA inkubována s enzymem Taql jednu hodinu při teplotě 65 °C a pak byla inkubována s druhým enzymem, Pstl, Asel, EcoRI nebo Sse8387-I další hodinu při teplotě 37 °C. Vazba adaptorů byla prováděna stejně jako v příkladu 2 při použití následujících adaptorů:
-24CZ 291877 B6
Taql-adaptor: 5-GACGATGAGTCCTGAC-3
- TACTCAGGACTGGC-5
Pstl a Sse8387-l-adaptor:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
-CATCTGACGCATGT- 5
Asel-adaptor: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
-CTGACGCATGGAT-5
EcoRI-adaptor: 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGTTAA-5
Amplifikace restrikčních fragmentů
Amplifikace restrikčních fragmentů byla uskutečněna způsobem, popsaným v příkladu 2.
Primery, zvolené pro označení amplifikačních produktů byly následující Taql-primery s třemi selektivními nukleotidy (tyto nukleotidy jsou opět označeny malými písmeny):
Taql-primery (5'-značené):
1. 5-TGAGTCCTGACCGAacc-3
2. 5-TGAGTCCTGACCGAaca-3
3. 5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3
4. 5-TGAGTCCTGACCGAcac-3 ío Uvedené čtyři primery byly použity pro detekci amplifikačních produktů, získaných při použití všech čtyř kombinací enzymů. Pro každou kombinaci enzymů byly užity 4 primery pro jiný enzym za vzniku celkem 16 kombinací pro každý z enzymů. Uvedené primery budou dále znázorněny svými řetězci (selektivní nukleotidy jsou označeny malými písmeny). Pro primery EcoRI a Asel byly vybrány primery se třemi selektivními nukleotidy, pro Pstl primery se dvěma 15 selektivními nukleotidy a pro enzym Sse byly zvoleny primery, obsahující jeden selektivní nukleotid. Pro enzymy, které štěpí DNA genomu kukuřice na malém počtu míst byly zvoleny primery, obsahující prodloužení s menším počtem selektivních nukleotidů.
-25CZ 291877 B6
| EcoRI-příměry: | 1. 5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3 2. 5-CTGCGTTACCAATTCaca-3 |
3. 5-CTGCGTTACCAATTCaac-3
| 4. 5-CTGCGTTACCAATTCcag-3 | |
| Asel-primery: | 1. 5-GACTGCGTACCTAATaac-3 2. 5-GACTGC GTACCTAATaag-3 3. 5-GACTGCGTACCTAATacc-3 4. 5-GACTGCGTACCTAATgaa-3 |
| Pstl-primery; 1. 2 | 5-GACTGCGTACATGCAGac-3 5-GACTGCGTACATGCAGaa-3 |
3. 5-GACTGCGTACATGCAGca-3
4. 5-GACTGCGTACATGCAGcc-3
SseeSST-l-primery: 1. 5-GACTGCGTACATGCAGGa-3
2. 5-GACTGCGTACATGCAGGg-3
3. 5-GACTGCGTACATGCAGGc-3
4. 5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
Bylo provedeno celkem 128 PCR-reakcí (2 DNA x 4 kombinace enzymů x 16 kombinací primerů) způsobem, uvedeným v příkladu 2. Reakční produkty těchto PCR byly analyzovány na 3 gelech (s obsahem 48 drah/gel) způsobem, popsaným v příkladu 2. Všechny kombinace primerů poskytovaly mapy DNA v rozsahu 50 až 100 pásů v jedné dráze, s výjimkou kombinace Ssel/Taql, kde bylo získáno pouze 10 až 15 pásů v jedné dráze. Příklad jednoho z gelů je znázorněn na obr. 16. Je znázorněna část gelu s analýzou mapy, získané při použití kombinace enzymů Pstl/Taql a EcoRI/Taql. V drahách 1 až 8 jsou znázorněny mapy dvou vzorků DNA kukuřice, získaných pomocí SRFA a Taql-primeru-3 a Pstl-primerů-1, -2, -3 a -4, v drahách 9 až 16 jsou znázorněny mapy DNA ze dvou vzorků kukuřice, získaných pomocí SRFA při použití Taql-primeru-4 a Pstl-primerů-1, -2, -3 a -4, v dráze 17 je uvedena lambda-DNA po rozštěpení enzymem Psrl pro označení, velikost některých fragmentů řetězce nukleotidů je uvedena vpravo a ve drahách 18 až 25 jsou znázorněny mapy pro DNA ze dvou vzorků DNA kukuřice, získaných pomocí SRFA při použití Taql-primeru-1 a EcoRI-primerů-1, -2, -3 a -4.
Příklad 5
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů bakteriální DNA
V příkladech 2, 3 a 4 byl vysvětlen princip selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA při použití dvou restrikčních enzymů u rajčete, salátů (Lactuca species) a u kukuřice. V tomto příkladu bude prokázáno, že uvedený postup je možno použít také k charakterizaci bakteriální
-26CZ 291877 B6
DNA. Velký počet kmenů Xanthomonas campestris byl získán z Laboratory of Microbiology, Ghent, Belgie a uvedené kmeny byly zvoleny k průkazu použitelnosti postupu u bakterií.
Izolace a modifikace DNA
Všechny vzorky DNA byly připraveny z kmenů Xanthomonas campestris, izolovaných z různých zdrojů, převážně z infikovaných rostlin. Tyto kmeny byly označeny čísly 1 až 26 tak, jak jsou dále uvedeny, a je možno je získat z Laboratoiry of Microbiology, Ghent, Belgie.
| DNA | podčeleď | pathovar | izolát |
| 1. | albilineans | 494 | |
| 2. | fřagariae | 708 | |
| 3. | oryzae | oryzae | 5047 |
| 4. | oryzae | populi | 5743 |
| 5. | maltophilia | 958 | |
| 6. | campestris | campestris | 568 |
| 7. | campestris | alfalfae | 497 |
| 8. | campestris | coracanae | 686 |
| 9. | campestris | citri | 8655 |
| 10. | campestris | citri | 9658 |
| 11. | campestris | citri | 9181 |
| 12. | campestris | citri | 8657 |
| 13. | campestris | citri | 8654 |
| 14. | campestris | citri | 8650 |
| 15. | campestris | citri | 682 |
| 16. | campestris | citri | 681 |
| 17. | campestris | citri | 9325 |
| 18. | campestris | citri | 9321 |
| 19. | campestris | citri | 9176 |
| 20. | campestris | citri | 9671 |
| 21. | campestris | citri | 9665 |
| 22. | campestris | citri | 9182 |
| 23. | campestris | citri | 568 |
| 24. | campestris | citri | 9167 |
| 25. | campestris | citri | 9175 |
| 26. | campestris | citri | 9160 |
DNA těchto bakteriálních kmenů byla izolována způsobem, popsaným v publikaci Marmur, J. Mol. Biol. 3, str. 208 až 218. Vzorky DNA byly rozštěpeny restrikčními enzymy v podstatě způsobem podle příkladu 4 s tím rozdílem, že jako restrikční enzymy byly použity enzymy Taql a Apal. Vazba adaptorů byla uskutečněna způsobem podle příkladu 4 při použití následujících 15 řetězců adaptorů:
Taql- adaptor: 5-GACGATGAGTCCTGAC-3
- TACTCAGGACTGGC-5
Apal- adaptor: 5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3
3- CATCTGACGCATGT-5
-27CZ 291877 B6
Amplifikace restrikčních fragmentů
Amplifikace restrikčních fragmentů byla uskutečněna způsobem, popsaným v příkladu 2. Primery, které byly zvoleny pro SRFA byly Taql-primer 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3 sjedním selektivním nukleotidem, označeným malým písmenem a Apal-primer 5GACTGCGTACAGGCCCg-3 s jedním selektivním nukleotidem, rovněž označeným malým písmenem. Apal-primer byl označen na 5'-zakončení pro detekci amplifikovaných fragmentů způsobem, popsaným v příkladu 2.
Každá ze 26 DNA byla amplifikována při použití svrchu popsané sestavy primerů. Podmínky amplifikace byly stejné jako v příkladu 2 stím rozdílem, že poslední 9 cyklů PCR bylo vynecháno vzhledem k menší složitosti DNA ve srovnání s rostlinnou DNA z příkladů 2, 3 a 4.
Typování DNA, kterého bylo dosaženo při použití bakteriální DNA podle toho příkladu je znázorněno na obr. 17. Dráhy 1 až 26 představují bakteriální DNA 1 až 26. Velikost DNA, použité pro označení (na gelu není viditelný) je v počtech nukleotidů uvedena na pravé straně gelu. Tato čísla jasně prokazují že příbuznost bakteriálních kmenů se odráží na podobnosti získaných pásů.
Příklad 6
Selektivní amplifikace restrikčních fragmentů DNA různých živočichů při použití dvou restrikčních enzymů
V předchozích příkladech byla popsána selektivní amplifikace restrikčních fragmentů SRFA pro DNA z různých rostlinných zdrojů. Nyní bude osvětlena účinnost způsobu při použití náhodně odebraných vzorků DNA z různých domácích zvířat. Byly použity: Gallus domesticus (kuře), SUSSCROFA DOMESTICA i. (vepř), bos taurus (kráva), Equus caballus (kůň). Použitými restrikčními enzymy byly Sse83871 a Msel.
Izolace a modifikace DNA
DNA byla izolována ze vzorků krve způsobem podle publikace Maniatis a další, 1982. Vzorky DNA 1 až 3 (kuře), 4 až 7 (vepř), 8 až 11 (kráva) a 12 až 15 (kůň) byla rozštěpeny restrikčními enzymy Sse83871 a Msel. Fragmenty DNA byly navázány na adaptory způsobem podle příkladu
2. Vzhledem ktomu, že při použití restrikčních enzymů Ssse83871 a Pstl vznikají kompatibilní 3'-prodloužená zakončení, bylo možno použít Pstl-adaptor i Msel-adaptor, popsané v příkladu 2.
Amplifikace restrikčních fragmentů
Matricová DNA, popsaná svrchu a připravená způsobem podle příkladu 2 byla použita jako matrice při uskutečnění reakcí SRFA. Použité kombinace primerů byly tvořeny jedním Mselprimerem a odlišnými Ssel-primery
Msel-primer:
5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3
Sse8387l-primer-1:
5-GACTGCGTACATGCAGGaa-3 Sse8387l-primer-2:
5-GACTGCGTACATGCAGGag-3
-28CZ 291877 B6
Amplifikace fragmentů Sse83871-Msel při použití párů primerů, tak jak byly svrchu popsány byla prováděna způsobem podle příkladu 2. Reakční produkty byl podrobeny elektroforéze na denaturačním polyakrylamidovém gelu, rovněž popsaném v příkladu 2. Autoradiografický záznam, znázorňující typování uvedených vzorků je uveden na obr. 18. Ve drahách 1 až 15 je uvedeno typování pro DNA 1 až 15 po amplifikaci při použití Msel-primeru, párovaného s Sse83871-primerem-I, ve drahách 16 až 30 je uvedeno obdobné typování při použití primeru Msel v kombinaci s Sse87871-primerem-2. Rozdíly mezi jednotlivými jedinci určitého živočišného druhu odrážejí heterogenitu živočišné populace. Celkové typování je charakteristické pro určitý živočišný druh.
Ve zvláštním provedení tvoří podstatu vynálezu způsob řízené amplifikace alespoň části výchozí DNA, která obsahuje větší počet restrikčních míst pro určité specifické restrikční endonukleázy, přičemž alespoň část řetězce nukleových kyselin je neznámá, postup spočívá v tom, že se
a) výchozí DNA rozštěpí specifickou restrikční endonukleázou za vzniku odpovídajícího počtu restrikčních fragmentů, opatřených zakončeními 5' a 3',
b) pokud 5'- a 3'- adaptory již nebyly k dispozici v oddělených formách, rozštěpí se toutéž specifickou restrikční endonukleázou také určený oligonukleotidový vazný řetězec s dvojitým řetězcem, obsahující v nukleotidovém řetězci jediné místo působení pro použitou restrikční endonukleázu za rozštěpení na 5'- a 3'-adaptor,
c) vzájemně se naváží restrikční fragmenty, získané z výchozí DNA na svých 5'- a 3zakončeních a 3'- a 5'-adaptory za vzniku restrikčních fragmentů výchozí DNA s prodlouženými zakončeními, přičemž tyto fragmenty obsahují na svém 5'- a 3'- zakončení prodlužující řetězce, jejichž nukleotidovými řetězci jsou řetězce 3'- a 5'- adaptorů včetně nukleotidů ze specifického restrikčního místa,
d) pokud neběží o vhodné matrice pro primery, prodlouží se uvedené 5'- a 3'- adaptory před svrchu uvedenou vazbou přidáním oligonukleotidových segmentů se stanoveným stálým řetězcem na odpovídající 5'- a 3'-zakončení, přičemž se v případě potřeby z téhož důvodu prodlouží odpovídající konce prodloužených restrikčních fragmentů oligonukleotidovými segmenty za vzniku restrikčních fragmentů, prodloužených na obou koncích uvedených konstantním řetězcem,
e) prodloužené, popřípadě elongované restrikční fragmenty se za hybridizačních podmínek uvedou do reakce s dvěma oligonukleotidovými primery,
f) primery zahrnují řetězce, odpovídající týmž nukleotidovým řetězcům, které obsahují 5'- a 3'-zakončení prodloužených nebo popřípadě elongovaných restrikčních fragmentů, které jsou komplementární k řetězcům, které mají funkci matricových řetězců pro uvedené primery, přičemž primery selektivně obsahují nukleotidy, komplementární k nukleotidům, účastnícím se tvorby místa působení specifické restrikční endonukleázy v řetězci matrice,
g) elongované restrikční fragmenty, hybridizované uvedenými primery se amplifikují PCR nebo podobnými postupy v přítomnosti požadovaných nukleotidů a polymerázy za další elongace hybridizovaných primerů podél restrikčních fragmentů výchozí DNA, s níž primery na počátku hybridizovaly po celé své délce, načež se
h) identifikují nebo izolují výsledné restrikční fragmenty.
Ve specifickém provedení tohoto postupu odpovídá terminální nukleotid alespoň z uvedených primerů ve směru elongace poslednímu nukleotidu místa působení restrikční endonukleázy,
-29CZ 291877 B6 postup zahrnuje identifikaci a izolaci restrikČních fragmentů výchozí DNA, které byly amplifikovány.
V dalším specifickém provedení tohoto postupu zahrnuje alespoň jeden z uvedených primerů řetězec určitého počtu nukleotidů (jeden nebo několik nukleotidů), který zasahuje za poslední nukleotid, účastnící se tvorby místa působení specifické endonukleázy ve směru své vlastní elongace v rozsahu odpovídajících restrikČních fragmentů v průběhu amplifikačního stupně.
Ve specifickém provedení uvedeného postupu obsahuje vazný řetězec s dvojitým řetězcem nukleotidů několik míst působení specifických restrikČních endonukleáz, které se navzájem od sebe liší, postup spočívá v opakování stupňů svrchu uvedeného postupu při použití téže výchozí DNA, avšak při použití jiné restrikční endonukleázy a při použití primerů, jejichž nukleotidový řetězec je definován stejným způsobem jako svrchu, avšak je specifický pro tuto odlišnou použitou restrikční endonukleázu.
Svrchu popsaný postup je vhodný pro použití k identifikací polymorfizmu určitých DNA, pocházejících z téhož živočišného druhu například může jít o DNA genomu mikroorganismu, rostliny nebo živočicha včetně lidí nebo může také jít o fragmenty této DNA. K témuž účelu je možno využít i oligonukleotidy podle vynálezu. Postupuje se tak, že se zkoumaná DNA podrobí způsobu podle vynálezu nebo se uvede do styku s oligonukleotidem podle vynálezu za podmínek, při nichž může docházet k amplifikaci nebo k elongační reakci, mapy získaných restrikČních míst se srovnávají po každou jednotlivou DNA a popřípadě se lokalizuje místo, v němž dochází k polymorfizmu podle rozdílů, pozorovaných mezi velikostí restrikČních fragmentů, které byly získány z různých DNA.
Vynález se rovněž týká fřagmentované DNA, jejíž různé fragmenty obsahují řetězce, které všechny odpovídají počátečním štěpným produktům nefragmentované výchozí DNA, z níž byly získány působením též specifické endonukleázy, přičemž všechny fragmenty byly prodlouženy na svých 5'- a 3'- zakončeních při použití příslušných 3'- a 5'- adaptorů, odpovídajících rozštěpené části téhož výchozího vazného řetězce DNA, který na začátku obsahoval jediné místo působení uvedené specifické endonukleázy, popřípadě prodloužené předem určenými stálými řetězci. Fragmentovaná DNA může mít formu skupiny putujících pásů na vhodném nosiči, například gelu, v němž byly fragmenty na začátku uvedeny do pohybu působením elektrického pole.
Fragmentovaná DNA může také obsahovat koncové části včetně nukleotidů, charakterizovaných následujícím složením, počínaje od 5 - zakončení:
i) nukleotidový řetězec (konstantní řetězec) alespoň 10 bází, avšak ne více než 30 bází, komplementární k určenému řetězci DNA, který je užit jako adaptor, okamžitě následovaný:
ii) nukleotidovým řetězcem, komplementárním k místu působení specifické restrikční endonukleázy, použité ve stupni a), přičemž řetězec tohoto místa ani jeho část nejsou obsaženy v řetězci ii), okamžitě následovaný iii) nukleotidovým řetězcem s obsahem alespoň jednoho nukleotidu, avšak méně než 10 nukleotidů, s délkou například 1 až 5 nukleotidů.
Vynález se rovněž týká sestavy pro fragmentaci DNA při použití alespoň jedné restrikční endonukleázy s následnou analýzou získaných fragmentů, sestava obsahuje:
- specifickou restrikční endonukleázou,
- oligonukleotidový vazný řetězec s dvojitým řetězcem DNA, který sám o sobě obsahuje ve svém nukleotidovém řetězci jediné místo působení uvedené specifické restrikční endonukleázy
-30CZ 291877 B6 pro rozštěpení na odpovídající 5'- a 3'- adaptory, přičemž uvedený vazný řetězec s obsahem DNA s dvojitým řetězcem má dostatečnou velikost pro vznik 5'- a 3'- části, které mohou sloužit jako matrice pro PCR-primery v této sestavě,
- PCR primery, obsahující tytéž sekvence jako řetězec 5'- a 3'- adaptorů, komplementární k řetězcům, použitých jako matrice pro uvedené primery, přičemž primery dále obsahují nukleotidy, komplementární k nukleotidům, které se účastní tvorby místa působení určené specifické restrikční endonukleázy v řetězci matrice,
- popřípadě oligonukleotidové segmenty stanovených (stálých) řetězců pro tvorbu míst s dostatečnou délkou pro hybridizaci s uvedenými primery pro elongaci 5'- zakončení 5adaptorů nebo 3'- zakončení 3'- adaptorů nebo obou zakončení před rozštěpením vazného řetězce působením specifické restrikční endonukleázy za vzniku 5'- a 3'- adaptorů nebo pro elongaci prodloužených fragmentů, získaných po vazbě 5'- a 3'- adaptorů na konce fragmentů výchozí DNA,
- popřípadě fragmentovanou DNA, odpovídající určené DNA, jejíž fragmentace je sledována, přičemž fragmenty uvedeného standardu DNA byly získány rozštěpením této DNA při použití uvedené specifické restrikční endonukleázy.
Ve zvláštním provedení této sestavy mají oligonukleotidové segmenty pro elongaci 5 - a 3'adaptoru nebo pro 5'- a 3'- zakončení prodloužených fragmentů DNA identické řetězce.
V dalším specifickém provedení obsahuje vazný řetězec sestavy několik míst působení specifické endonukleázy, od sebe navzájem odlišných a sestava dále obsahuje primery, odpovídající 3'- a 5'- adaptorům, vytvořeným rozštěpením vazného řetězce uvedenými specifickými endonukleázami, přičemž primery odpovídají typu, který je uveden v nároku 8, pokud jde o 3'- a 5'adaptory, vznikající v tomto vazném řetězci rozštěpením každou z uvedených specifických endonukleáz.
V dalším zvláštním provedení může sestava obsahovat fragmentované standardy DNA, odpovídající specifickým restrikčním endonukleázám přičemž určitý standard odpovídá vždy určité specifické restrikční endonukleáze.
Claims (26)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA, vyznačující se tím,že (a) výchozí DNA se štěpí přinejmenším jednou restrikční endonukleázou a získají se restrikční fragmenty, (b) získané restrikční fragmenty se ligují s alespoň jedním syntetickým dvouřetězcovým oligonukleotidovým adaptorem, jehož jeden konec je kompatibilní pro ligaci s jedním nebo oběma konci restrikčních fragmentů, čímž se připraví označené restrikční fragmenty, (c) získané označené restrikční fragmenty se za hybridizačních podmínek přivedou do kontaktu s alespoň jedním oligonukleotidovým primerem, přičemž tento primer nebo primery obsahují nukleotidovou sekvenci párující s částí rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy přítomné v označeném restrikčním fragmentu a také párující s částí adaptorové sekvence, přičemž alespoň jeden z uvedených primerů obsahuje na svém 3'-konci zvolenou sekvenci obsahující přinejmenším jeden nukleotid umístěný bezprostředně vedle nukleotidů účastnících se vytvoření dané rozpoznávací sekvence, (d) označené restrikční fragmenty hybridizované na uvedený primer nebo primery se amplifikují v přítomnosti požadovaných nukleotidů a DNA polymerázy nebo se provede elongace těchto hybridizovaných primerů podél označených restrikčních fragmentů, a (e) amplifikované nebo elongované DNA fragmenty získané ve stupni (d) se identifikují nebo izolují.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že primer nebo primery obsahují sekvence, které mají stejnou nukleotidovou sekvenci jako terminální části řetězců na koncích uvedených označených restrikčních fragmentů, včetně nukleotidů účastnících se tvorby rozpoznávací sekvence pro uvedenou restrikční endonukleázu a včetně přinejmenším části nukleotidů přítomných v ligovaných adaptorech, přičemž přinejmenším jeden z uvedených primerů má na svém 3'-konci zvolenou sekvenci obsahující přinejmenším jeden nukleotid umístěný bezprostředně vedle nukleotidů účastnících se vytvoření rozpoznávací sekvence pro uvedenou restrikční endonukleázu.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že primer nebo primery mají sekvence přesně párující s konstantní DNA sekvencí, tvořenou částí rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy a sekvencí adaptoru.
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím,že přinejmenším jeden primer obsahuje zvolenou sekvenci 1 až 10 nukleotidů.
- 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že primery obsahují 10 až 50 nukleotidů a rozpoznávací sekvence restrikční endonukleázy obsahuje 4 až 8 nukleotidů.
- 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence primerů párující s adaptorem obsahuje 10 až 30 nukleotidů.
- 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím,že adaptory jsou konstruovány takovým způsobem, že odpovídající rozpoznávací sekvence endonukleázy není při hybridizaci adaptoru na označené restrikční fragmenty rekonstruována, přičemž primer nebo primery představují oligonukleotidy obsahující konstantní sekvenci přesně párující s alespoň jedním koncem sekvence alespoň jednoho označeného restrikčního fragmentu ve směsi, přičemž tato konstantní sekvence obsahuje nukleotidy párující s částí cílové sekvence dané restrikční endonukleázy a přinejmenším jeden z uvedených primerů obsahuje na svém 3'-konci nukleotidové sekvence účastnící se tvorby rozpoznávací sekvence 1 až 10 dalších zvolených nukleotidů.
- 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že sekvence nukleových kyselin ve výchozí DNA je alespoň zčásti neznámá.
- 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se použijí nejméně dvě od sebe odlišné restrikční endonukleázy.
- 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím,že všechny primery obsahují stejnou konstantní nukleotidovou sekvenci.
- 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím,že se použije směs různých primerů.-32CZ 291877 B6
- 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že přinejmenším jeden primer obsahuje na svém 3'-konci 1,2 nebo 3 zvolené nukleotidy.
- 13. Způsob podle některého z nároků lažll,vyznačující se tím,že ve stupni (a) se použijí dvě odlišné restrikční endonukleázy, přičemž přinejmenším jeden dvouřetězcový syntetický oligonukleotid použitý jako adaptor pro jednu z endonukleáz je biotinylován.
- 14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že alespoň jeden primer je značený.
- 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že počet selektivních nukleotidů se volí k omezení počtu amplifikovaných restrikčních fragmentů na 5 až 200.
- 16. Způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů, vyznačující se t í m , že se (a) amplifíkuje podskupina restrikčních fragmentů ze směsi restrikčních fragmentů, získaných z výchozí DNA při použití způsobu podle některého z nároků 1 až 15, (b) amplifikované prodloužené restrikční fragmenty se od sebe oddělí, (c) amplifikované restrikční fragmenty se identifikují.
- 17. Způsob podle některého z nároků 1 až 15,vyznačující se tím, že se jako výchozí DNA k amplifikaci použije DNA genomu z lidského nebo živočišného vzorku, zvláště z tkáně nebo z krevního vzorku.
- 18. Způsob podle některého z nároků lažl5,vyznačující se tím,že se k amplifikaci použije DNA genomu rostliny nebo rostlinné tkáně.
- 19. Způsob podle některého z nároků lažl5,vyznačující se tím, že se jako výchozí DNA k amplifikaci použije DNA mikroorganizmu.
- 20. Způsob podle některého z nároků 1 až 16, pro identifikaci polymorfizmu mezi různými výchozími DNA pocházejícími ze stejné skupiny živých organizmů, vyznačující se t í m , že se identifikují rozdíly mezi amplifikovanými restrikčními fragmenty různých výchozích DNA.
- 21. Způsob podle některého z nároků 1 až 15, pro identifikaci polymorfizmu DNA genomu mikroorganizmu, rostliny nebo živočicha, včetně člověka, nebo fragmentů DNA, vzájemně nebo ve vztahu k odpovídající předem stanovené standardní DNA.
- 22. Způsob podle některého z nároků 1 až 15, pro identifikaci polymorfizmu DNA souvisejícího s geneticky podmíněnými vlastnostmi u člověka, nebo geneticky podmíněnými vlastnostmi u živočichů nebo pro identifikaci geneticky podmíněných vlastností u rostlin a pro identifikaci značení DNA na bázi tohoto polymorfizmu DNA.
- 23. Způsob podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že se srovnávají alespoň dva nebo více amplifikovaných nebo elongovaných fragmentů DNA, identifikované nebo regenerované ve stupni (e) uvedeného způsobu pro detekci podobnosti mezi rostlinnými nebo živočišnými varietami, druhy, kultivary, mikroorganizmy, nebo pro hodnocení genetické odlišnosti a charakteristik uvedených rostlinných nebo živočišných variet, druhů, kultivarů, mikroorganizmů.-33CZ 291877 B6
- 24. Způsob podle některého z nároků lažl 5, vyznačující se tím, že se amplifikované nebo elongované fragmenty DNA produkované ve stupni (e) identifikují nebo izolují ve formě DNA otisků.
- 25. Způsob podle nároku 23 pro identifikaci DNA markérů vázaných s genetickým znakem, vyznačující se tím, že zahrnuje identifikaci polymorfizmu mezi výchozími DNA ze stejných živočišných druhů s odlišnými genetickými znaky a uvedení tohoto polymorfizmu do korelace s fenotypem uvedeného genetického znaku.
- 26. Způsob podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupně:(f) izoluje se alespoň jeden identifikovaný nebo regenerovaný DNA fragment ve stupni (e), (g) stanoví se nukleotidová sekvence prvních 8 až 10 nukleotidových zbytků vnitřně přiléhajících na rozpoznávací sekvenci restrikční endonukleázy na obou koncích uvedených DNA fragmentů, (h) zkonstruují se oligonukleotidové primery s nukleotidovou sekvencí podle primerů ze stupně (c) z nároku 1, přičemž zvolená sekvence nukleotidů obsahuje 5 až 10 nukleotidových zbytků odpovídajících prvním 8 až 12 nukleotidovým zbytkům vnitřně přiléhajícím krestrikčním místům na obou koncích DNA fragmentu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91402542 | 1991-09-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ66994A3 CZ66994A3 (en) | 1994-12-15 |
| CZ291877B6 true CZ291877B6 (cs) | 2003-06-18 |
Family
ID=8208616
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1994669A CZ291877B6 (cs) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů |
| CZ0321397A CZ298187B6 (cs) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí a pouzití tohoto oligonukleotidového primeru |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0321397A CZ298187B6 (cs) | 1991-09-24 | 1992-09-24 | Oligonukleotidový primer schopný párování s nukleotidovou sekvencí a pouzití tohoto oligonukleotidového primeru |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6045994A (cs) |
| EP (2) | EP0969102B1 (cs) |
| JP (3) | JP3236295B2 (cs) |
| KR (1) | KR100321510B1 (cs) |
| AT (2) | ATE382094T1 (cs) |
| AU (1) | AU672760B2 (cs) |
| CA (1) | CA2119557C (cs) |
| CZ (2) | CZ291877B6 (cs) |
| DE (2) | DE69230873T3 (cs) |
| DK (2) | DK0969102T3 (cs) |
| ES (2) | ES2147550T5 (cs) |
| FI (2) | FI113184B (cs) |
| GR (1) | GR3033895T3 (cs) |
| HU (1) | HU223760B1 (cs) |
| IL (1) | IL103267A (cs) |
| NO (1) | NO318016B1 (cs) |
| PT (2) | PT969102E (cs) |
| RU (1) | RU2182176C2 (cs) |
| WO (1) | WO1993006239A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA927323B (cs) |
Families Citing this family (297)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6074818A (en) * | 1990-08-24 | 2000-06-13 | The University Of Tennessee Research Corporation | Fingerprinting of nucleic acids, products and methods |
| US20100267023A1 (en) | 1992-09-24 | 2010-10-21 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| US7026115B1 (en) | 1991-09-24 | 2006-04-11 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting |
| ZA929319B (en) * | 1991-12-11 | 1993-05-24 | Igen Inc | Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer. |
| EP0675966B1 (en) * | 1992-02-19 | 2004-10-06 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids |
| GB9301776D0 (en) * | 1993-01-29 | 1993-03-17 | Univ Alberta | Method for detecting genomic variation |
| US5470723A (en) * | 1993-05-05 | 1995-11-28 | Becton, Dickinson And Company | Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5650274A (en) * | 1993-06-25 | 1997-07-22 | Hitachi, Ltd. | DNA analyzing method |
| GB2283568B (en) * | 1993-10-13 | 1997-12-24 | Mini Agriculture & Fisheries | Identification of fruit juice components |
| RU2111254C1 (ru) * | 1994-07-11 | 1998-05-20 | Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ МАТРИЧНЫХ РНК И КЛОНИРОВАНИЯ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ФРАГМЕНТОВ кДНК |
| US5710000A (en) * | 1994-09-16 | 1998-01-20 | Affymetrix, Inc. | Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping |
| GB2295011A (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-15 | Unilever Plc | Selection of DNA markers using adaptor molecules |
| GB2295228A (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-22 | Unilever Plc | Selective amplification of DNA having a plurality of sites for a specific endonuclease |
| WO1996017082A2 (en) * | 1994-11-28 | 1996-06-06 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms |
| EP0718409A3 (en) * | 1994-12-22 | 1999-02-03 | Hitachi, Ltd. | DNA preparation method |
| EP0721987A1 (en) * | 1995-01-16 | 1996-07-17 | Keygene N.V. | Amplification of simple sequence repeats |
| US6031153A (en) * | 1995-01-23 | 2000-02-29 | Novartis Ag | Method for protecting plants |
| US5565340A (en) * | 1995-01-27 | 1996-10-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR |
| DE69621507T2 (de) * | 1995-03-28 | 2003-01-09 | Japan Science And Technology Corp., Kawaguchi | Verfahren zur molekularen Indexierung von Genen unter Verwendung von Restriktionsenzymen |
| US5712126A (en) * | 1995-08-01 | 1998-01-27 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3-end restriction fragments of CDNA |
| US6395887B1 (en) | 1995-08-01 | 2002-05-28 | Yale University | Analysis of gene expression by display of 3'-end fragments of CDNAS |
| IL122973A0 (en) * | 1995-08-07 | 1998-08-16 | Keygene Nv | Nucleic acid and its use in conferring resistance against wilt inducing fungi |
| US5972693A (en) * | 1995-10-24 | 1999-10-26 | Curagen Corporation | Apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US6418382B2 (en) | 1995-10-24 | 2002-07-09 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US5871697A (en) | 1995-10-24 | 1999-02-16 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
| US6218119B1 (en) | 1996-01-16 | 2001-04-17 | Keygene, N. V. | Amplification of simple sequence repeats |
| AU2264197A (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-28 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Restriction display (rd-pcr) of differentially expressed mrnas |
| US6091004A (en) * | 1996-06-21 | 2000-07-18 | Novartis Finance Corporation | Gene encoding a protein involved in the signal transduction cascade leading to systemic acquired resistance in plants |
| EP0823481A1 (en) | 1996-08-09 | 1998-02-11 | Keygene N.V. | Resistance against nematodes |
| DK1493817T3 (da) | 1996-08-09 | 2011-03-28 | Keygene Nv | Resistens over for planteskadegørere |
| EP2264045B1 (en) | 1996-08-14 | 2015-10-21 | Life Technologies Corporation | Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing |
| EP1007730A4 (en) * | 1996-08-30 | 2004-04-28 | Invitrogen Corp | METHODS OF IDENTIFYING AND ISOLATING SPECIFIC NUCLEOTIDE SEQUENCES IN cDNA AND GENOMIC DNA |
| US20040142327A1 (en) * | 1996-11-22 | 2004-07-22 | Jhy-Jhu Lin | Methods for identifying and isolating DNA polymorphisms or genetic markers |
| US5986082A (en) * | 1996-12-13 | 1999-11-16 | Novartis Ag | Altered forms of the NIM1 gene conferring disease resistance in plants |
| US5861295A (en) | 1997-01-02 | 1999-01-19 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof |
| AU6024598A (en) * | 1997-01-10 | 1998-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hybridization-based genetic amplification and analysis |
| US6306588B1 (en) | 1997-02-07 | 2001-10-23 | Invitrogen Corporation | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof |
| JP2002503954A (ja) | 1997-04-01 | 2002-02-05 | グラクソ、グループ、リミテッド | 核酸増幅法 |
| US6090556A (en) * | 1997-04-07 | 2000-07-18 | Japan Science & Technology Corporation | Method for quantitatively determining the expression of a gene |
| US6989259B2 (en) | 1997-04-22 | 2006-01-24 | Invitrogen Corporation | Recombinant methods for making reverse transcriptases and mutants thereof |
| JP2001512700A (ja) | 1997-08-07 | 2001-08-28 | キュラジェン コーポレイション | 公知の末端配列に厳密にハイブリダイズするサブ配列および未同定の配列にハイブリダイズするサブ配列を含むオリゴヌクレオチドの使用による核酸配列の検出および確認 |
| US6673577B1 (en) * | 1997-08-07 | 2004-01-06 | Curagen Corporation | Detection and confirmation of nucleic acid sequences by use of poisoning oligonucleotides |
| US6833242B2 (en) * | 1997-09-23 | 2004-12-21 | California Institute Of Technology | Methods for detecting and sorting polynucleotides based on size |
| WO1999023256A1 (en) * | 1997-10-30 | 1999-05-14 | Cold Spring Harbor Laboratory | Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing dna |
| AU3027699A (en) * | 1998-02-02 | 1999-08-16 | Amersham Pharmacia Biotech Ab | Nucleic acid analysis method |
| US6238863B1 (en) * | 1998-02-04 | 2001-05-29 | Promega Corporation | Materials and methods for indentifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers |
| US6500616B1 (en) | 1998-04-16 | 2002-12-31 | Case Western Reserve University | Methods of monitoring genomic integrity and detecting genomic destabilization of plant cells in tissue culture |
| US6324479B1 (en) | 1998-05-08 | 2001-11-27 | Rosetta Impharmatics, Inc. | Methods of determining protein activity levels using gene expression profiles |
| US6218122B1 (en) | 1998-06-19 | 2001-04-17 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles |
| DE69813203T2 (de) * | 1998-07-21 | 2004-02-12 | Keygene N.V. | Verbesserte Primer zur AFLP Amplifizierung |
| EP0976835B1 (en) * | 1998-07-29 | 2003-07-09 | Keygene N.V. | Method for detecting nucleic acid methylation using AFLPTM |
| US6306593B1 (en) * | 1998-09-17 | 2001-10-23 | Union Camp Corporation | Selective AFLP primers for reduction of complexity of maker genotyping and DNA markers for loblolly pine identified using the AFLP primers |
| US6146830A (en) * | 1998-09-23 | 2000-11-14 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Method for determining the presence of a number of primary targets of a drug |
| US6703228B1 (en) | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| JP3855492B2 (ja) * | 1998-10-08 | 2006-12-13 | 株式会社日立製作所 | 混合核酸断片分析法 |
| AU6074999A (en) | 1998-10-14 | 2000-05-01 | Agriculture And Agrifood Canada | Hybrid alfalfa ((medicago sativa)) |
| CA2345441A1 (en) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Affymetrix, Inc. | Complexity management and analysis of genomic dna |
| US6203987B1 (en) | 1998-10-27 | 2001-03-20 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for using co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns |
| US6950752B1 (en) | 1998-10-27 | 2005-09-27 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods for removing artifact from biological profiles |
| US6468476B1 (en) | 1998-10-27 | 2002-10-22 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for using-co-regulated genesets to enhance detection and classification of gene expression patterns |
| AU1402900A (en) * | 1998-11-09 | 2000-05-29 | Methexis N.V. | Restricted amplicon analysis |
| US6801859B1 (en) | 1998-12-23 | 2004-10-05 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods of characterizing drug activities using consensus profiles |
| US6222093B1 (en) | 1998-12-28 | 2001-04-24 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for determining therapeutic index from gene expression profiles |
| US6370478B1 (en) | 1998-12-28 | 2002-04-09 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Methods for drug interaction prediction using biological response profiles |
| US6605432B1 (en) * | 1999-02-05 | 2003-08-12 | Curators Of The University Of Missouri | High-throughput methods for detecting DNA methylation |
| US6630333B1 (en) | 1999-03-23 | 2003-10-07 | Invitrogen Corporation | Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof |
| EP1173612B1 (en) * | 1999-04-09 | 2004-09-29 | Keygene N.V. | METHOD FOR THE DETECTION AND/OR ANALYSIS, BY MEANS OF PRIMER EXTENSION TECHNIQUES, OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN RESTRICTION FRAGMENTS, IN PARTICULAR IN AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS GENERATED USING AFLP$m(3) |
| US6994969B1 (en) | 1999-04-30 | 2006-02-07 | Methexis Genomics, N.V. | Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry |
| JP3969091B2 (ja) | 1999-06-23 | 2007-08-29 | 株式会社日立製作所 | 遠心分離機及びこれを用いる試料調製装置 |
| US20020119448A1 (en) * | 1999-06-23 | 2002-08-29 | Joseph A. Sorge | Methods of enriching for and identifying polymorphisms |
| US6420117B1 (en) | 1999-09-14 | 2002-07-16 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Miniature inverted repeat transposable elements and methods of use |
| US6221600B1 (en) | 1999-10-08 | 2001-04-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis |
| US6958225B2 (en) | 1999-10-27 | 2005-10-25 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA |
| AUPQ439699A0 (en) * | 1999-12-01 | 1999-12-23 | University Of Sydney, The | Detection of nucleic acid fragments |
| WO2001049882A2 (en) * | 1999-12-29 | 2001-07-12 | Keygene N.V. | METHOD FOR GENERATING OLIGONUCLEOTIDES, IN PARTICULAR FOR THE DETECTION OF AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS OBTAINED USING AFLP$m(3) |
| AU2001254670A1 (en) * | 2000-03-02 | 2001-09-12 | Akzo Nobel N.V. | Detection of hepatitis b virus rna |
| AU6052001A (en) | 2000-03-29 | 2001-10-08 | Ct For The Applic Of Molecular | Methods for genotyping by hybridization analysis |
| EP1282729A2 (en) * | 2000-05-15 | 2003-02-12 | Keygene N.V. | Microsatellite-aflp |
| US7078208B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-07-18 | Invitrogen Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| CN1430670A (zh) | 2000-05-26 | 2003-07-16 | 茵维特罗根公司 | 热稳定逆转录酶及其用途 |
| US7657379B2 (en) | 2000-07-05 | 2010-02-02 | Microsoft Corporation | Methods and systems for determining the biological function of cell constituents using response profiles |
| US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| US20030143554A1 (en) * | 2001-03-31 | 2003-07-31 | Berres Mark E. | Method of genotyping by determination of allele copy number |
| EP1384022A4 (en) | 2001-04-06 | 2004-08-04 | California Inst Of Techn | NUCLEIC ACID AMPLIFICATION USING MICROFLUID DEVICES |
| JP2004526453A (ja) | 2001-04-16 | 2004-09-02 | アプレラ コーポレイション | ヌクレオチド分析のための方法および組成物 |
| WO2002086169A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-10-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for rapid screening of polymorphisms, mutations and methylation |
| US20030044785A1 (en) * | 2001-05-01 | 2003-03-06 | American Type Culture Collection | Method for identifying and genotyping microorganisms |
| BR0209700A (pt) | 2001-06-07 | 2004-10-13 | Pioneer Hi Bred Int | Resistência à produção de sclerotinia por controle de qtl em soja |
| GB0114853D0 (en) * | 2001-06-18 | 2001-08-08 | Medical Res Council | Happier Mapping |
| CA2450985A1 (en) | 2001-06-28 | 2003-01-09 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer stabilized proteinases |
| US20030170661A1 (en) * | 2001-07-23 | 2003-09-11 | Yi Liu | Method for identifying a nucleic acid sequence |
| US6872529B2 (en) * | 2001-07-25 | 2005-03-29 | Affymetrix, Inc. | Complexity management of genomic DNA |
| US20110151438A9 (en) | 2001-11-19 | 2011-06-23 | Affymetrix, Inc. | Methods of Analysis of Methylation |
| US7208295B2 (en) * | 2001-11-19 | 2007-04-24 | Affymetrix, Inc. | Multiplex oligonucleotide addition and target amplification |
| DE60239634D1 (de) * | 2001-12-10 | 2011-05-12 | Novartis Ag | Verfahren zur behandlung von psychosen und schizophrenie auf der basis eines polymorphismus im cntf gen |
| US7418351B2 (en) | 2002-01-31 | 2008-08-26 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods for analysis of measurement errors in measured signals |
| CA2474982A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for identifying genes and determining pathways associated with traits |
| JP2005518811A (ja) * | 2002-03-05 | 2005-06-30 | ソレックサ リミテッド | 表現型に関連するゲノム全域での配列変化を決定するための方法 |
| US20040110166A1 (en) * | 2002-03-07 | 2004-06-10 | Macevicz Stephen C. | Genome-wide scanning of genetic polymorphisms |
| AU2003224817B2 (en) | 2002-04-01 | 2008-11-06 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| EP1497447A4 (en) | 2002-04-12 | 2006-09-20 | Univ Missouri | US ECIST MICROARRAYSES FOR DUAL SCREENING OF DNA HYPERMETHYLATION AND GENE INACTIVATION, AND FOR USE IN AN INTEGRATED SYSTEM FOR EVALUATING GENE EXPRESSION, DNA METHYLATION AND ACETYLATION OF HISTONE |
| US7115370B2 (en) * | 2002-06-05 | 2006-10-03 | Capital Genomix, Inc. | Combinatorial oligonucleotide PCR |
| US20040072217A1 (en) * | 2002-06-17 | 2004-04-15 | Affymetrix, Inc. | Methods of analysis of linkage disequilibrium |
| US9388459B2 (en) | 2002-06-17 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| US20060099591A1 (en) | 2002-08-22 | 2006-05-11 | Andreas Krause | Diagnosis of chronic rejection |
| WO2004024749A2 (en) | 2002-09-13 | 2004-03-25 | Invitrogen Corporation | Thermostable reverse transcriptases and uses thereof |
| JP2006501056A (ja) | 2002-09-25 | 2006-01-12 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | ミクロ流体大規模集積 |
| WO2004040001A2 (en) | 2002-10-02 | 2004-05-13 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
| US7459273B2 (en) * | 2002-10-04 | 2008-12-02 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| US20040219565A1 (en) | 2002-10-21 | 2004-11-04 | Sakari Kauppinen | Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest |
| JP4690307B2 (ja) * | 2003-01-10 | 2011-06-01 | ケイヘーネ・エヌ・ブイ | 物理的および遺伝的地図を統合するためのａｆｌｐに基づいた方法 |
| US7996155B2 (en) | 2003-01-22 | 2011-08-09 | Microsoft Corporation | ANOVA method for data analysis |
| CA2513899C (en) * | 2003-01-29 | 2013-03-26 | 454 Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
| CN103396933B (zh) | 2003-02-26 | 2016-04-20 | 凯利达基因组股份有限公司 | 通过杂交进行的随机阵列dna分析 |
| EP1604040B1 (en) * | 2003-03-07 | 2010-10-13 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process |
| US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| WO2005018534A2 (en) | 2003-05-16 | 2005-03-03 | Rosetta Inpharmatics, Llc | Methods and compositions for rna interference |
| JP2006525814A (ja) | 2003-05-23 | 2006-11-16 | コールド スプリング ハーバー ラボラトリー | ヌクレオチド配列の実質的表示 |
| US20040259100A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| US20050181394A1 (en) * | 2003-06-20 | 2005-08-18 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| WO2005003304A2 (en) * | 2003-06-20 | 2005-01-13 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
| JP2007521003A (ja) * | 2003-07-02 | 2007-08-02 | ケイヘーネ・エヌ・ブイ | スプライス部位ａｆｌｐ |
| US20050032102A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-02-10 | Affymetrix, Inc. | Mapping genomic rearrangements |
| US8114978B2 (en) | 2003-08-05 | 2012-02-14 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping selected polymorphism |
| WO2005024068A2 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-17 | Sequenom, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| US7269517B2 (en) | 2003-09-05 | 2007-09-11 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for analyzing experiment design |
| US20050071087A1 (en) | 2003-09-29 | 2005-03-31 | Anderson Glenda G. | Systems and methods for detecting biological features |
| EP2380993B1 (en) | 2004-03-08 | 2015-12-23 | Rubicon Genomics, Inc. | Method for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
| EP1574585A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-09-14 | Plant Research International B.V. | Method for selective amplification of DNA fragments for genetic fingerprinting |
| CA2561381C (en) | 2004-03-26 | 2015-05-12 | Sequenom, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| US8192937B2 (en) * | 2004-04-07 | 2012-06-05 | Exiqon A/S | Methods for quantification of microRNAs and small interfering RNAs |
| US8135595B2 (en) | 2004-05-14 | 2012-03-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Computer systems and methods for providing health care |
| US7618778B2 (en) | 2004-06-02 | 2009-11-17 | Kaufman Joseph C | Producing, cataloging and classifying sequence tags |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| FR2876378B1 (fr) * | 2004-10-08 | 2007-01-05 | Univ Joseph Fourier Etablissem | Amorces universelles et leur utilisation pour la detection et l'identification de vegetaux dans des melanges complexes |
| US7335760B2 (en) | 2004-12-22 | 2008-02-26 | Ceres, Inc. | Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins |
| US9505846B2 (en) | 2005-01-28 | 2016-11-29 | Life Technologies Corporation | Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases |
| KR101317730B1 (ko) | 2005-03-03 | 2013-10-15 | 리즈크 즈완 자드틸트 엔 자드한델 비.브이. | 근접 후향 육종 방법 |
| CA2598737C (en) | 2005-03-03 | 2015-05-12 | Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. | Reverse progeny mapping |
| US20060223066A1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-05 | Applera Corporation | Methods for normalizing and for identifying small nucleic acids |
| US7452671B2 (en) | 2005-04-29 | 2008-11-18 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping with selective adaptor ligation |
| WO2006122215A2 (en) * | 2005-05-10 | 2006-11-16 | State Of Oregon Acting By & Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays |
| EP3257949A1 (en) | 2005-06-15 | 2017-12-20 | Complete Genomics Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| DK2302070T3 (da) | 2005-06-23 | 2012-11-26 | Keygene Nv | Strategier til identifikation og detektion af polymorfismer med højt gennemløb |
| DE602006013831D1 (de) * | 2005-06-23 | 2010-06-02 | Keygene Nv | Verbesserte strategien zur sequenzierung komplexer genome unter verwendung von sequenziertechniken mit hohem durchsatz |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| WO2007018602A1 (en) * | 2005-08-02 | 2007-02-15 | Rubicon Genomics, Inc. | Isolation of cpg islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method |
| WO2007018601A1 (en) | 2005-08-02 | 2007-02-15 | Rubicon Genomics, Inc. | Compositions and methods for processing and amplification of dna, including using multiple enzymes in a single reaction |
| WO2007038083A2 (en) | 2005-09-21 | 2007-04-05 | New York University | Heat shock proteins from mycobacterium leprae and uses thereof |
| US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
| WO2007037678A2 (en) | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Keygene N.V. | High throughput screening of mutagenized populations |
| CA2624896C (en) | 2005-10-07 | 2017-11-07 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| US7960104B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-06-14 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| BRPI0618609A2 (pt) | 2005-11-16 | 2011-09-06 | Novartis Ag | biomarcadores para tratamento com anticorpo anti-nogo-a em danos à medula espinhal |
| GB0524069D0 (en) * | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| US8137936B2 (en) * | 2005-11-29 | 2012-03-20 | Macevicz Stephen C | Selected amplification of polynucleotides |
| US11306351B2 (en) | 2005-12-21 | 2022-04-19 | Affymetrix, Inc. | Methods for genotyping |
| CN103937899B (zh) | 2005-12-22 | 2017-09-08 | 凯津公司 | 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法 |
| US8222482B2 (en) | 2006-01-26 | 2012-07-17 | Ceres, Inc. | Modulating plant oil levels |
| SG169356A1 (en) | 2006-02-08 | 2011-03-30 | Illumina Cambridge Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| SG170028A1 (en) * | 2006-02-24 | 2011-04-29 | Callida Genomics Inc | High throughput genome sequencing on dna arrays |
| CN101432439B (zh) * | 2006-02-24 | 2013-07-24 | 考利达基因组股份有限公司 | Dna阵列上的高通量基因组测序 |
| ES2301342B1 (es) * | 2006-03-14 | 2009-05-01 | Oryzon Genomics, S.A. | "metodo de analisis de acidos nucleicos". |
| WO2007107710A1 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Solexa Limited | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| EP3239304B1 (en) | 2006-04-04 | 2020-08-19 | Keygene N.V. | High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing |
| US20130191941A1 (en) | 2006-07-05 | 2013-07-25 | Shing Kwok | Modulating light response pathways in plants, increasing light-related tolerances in plants, and increasing biomass in plants |
| CN103333949B (zh) | 2006-07-12 | 2015-05-06 | 凯津公司 | 使用aflp的高通量物理作图 |
| US9328378B2 (en) * | 2006-07-31 | 2016-05-03 | Illumina Cambridge Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
| RU2322508C1 (ru) * | 2006-09-20 | 2008-04-20 | Павел Петрович Лактионов | Способ анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2008049071A2 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Carrots having increased lycopene content |
| US7910354B2 (en) * | 2006-10-27 | 2011-03-22 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US20090111706A1 (en) * | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by amplification |
| US20080221832A1 (en) * | 2006-11-09 | 2008-09-11 | Complete Genomics, Inc. | Methods for computing positional base probabilities using experminentals base value distributions |
| WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2008111453A1 (ja) * | 2007-03-07 | 2008-09-18 | The University Of Tokyo | Dna断片の増幅方法 |
| US20080293589A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-11-27 | Affymetrix, Inc. | Multiplex locus specific amplification |
| AR066922A1 (es) | 2007-06-08 | 2009-09-23 | Monsanto Technology Llc | Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido |
| CA2692687C (en) | 2007-07-09 | 2021-10-26 | Bayer Bioscience N.V. | Brassica plant comprising mutant fatty acyl-acp thioesterase alleles |
| US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
| US8951731B2 (en) * | 2007-10-15 | 2015-02-10 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
| US8415099B2 (en) | 2007-11-05 | 2013-04-09 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
| US7897344B2 (en) * | 2007-11-06 | 2011-03-01 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs |
| US8518640B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-08-27 | Complete Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing and process |
| US8298768B2 (en) * | 2007-11-29 | 2012-10-30 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
| EP2215455B1 (en) | 2007-11-02 | 2014-03-05 | Ceres, Inc. | A method for formulating an NIR model used in biomass processing |
| WO2009061840A1 (en) * | 2007-11-05 | 2009-05-14 | Complete Genomics, Inc. | Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors employing selective methylation |
| NL2000992C2 (nl) | 2007-11-09 | 2009-05-12 | Nunhems Bv | Nieuwe komkommerplanten met compacte groeiwijze. |
| EP2220239B1 (en) | 2007-11-28 | 2015-05-20 | Bayer CropScience NV | Brassica plant comprising a mutant indehiscent allele |
| US8592150B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-11-26 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for long fragment read sequencing |
| WO2009094583A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for preventing bias in amplification and sequencing reactions |
| WO2009097368A2 (en) * | 2008-01-28 | 2009-08-06 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| EP2255003B1 (en) | 2008-02-15 | 2015-01-28 | Ceres Inc. | Drought and heat tolerance in plants |
| US12060554B2 (en) | 2008-03-10 | 2024-08-13 | Illumina, Inc. | Method for selecting and amplifying polynucleotides |
| US9074244B2 (en) | 2008-03-11 | 2015-07-07 | Affymetrix, Inc. | Array-based translocation and rearrangement assays |
| WO2009132028A1 (en) * | 2008-04-21 | 2009-10-29 | Complete Genomics, Inc. | Array structures for nucleic acid detection |
| MX349774B (es) | 2008-05-26 | 2017-08-10 | Bayer Cropscience Nv | Metodos y medios para modificar la resistencia de las fibras en plantas que producen fibras. |
| EA036845B1 (ru) | 2008-07-17 | 2020-12-28 | Басф Агрикалчерал Солюшнс Сид Юс Ллк | Способ идентификации частично нокаутированного мутантного аллеля ind гена в биологическом образце и набор для осуществления этого способа |
| EP2172565A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-07 | Cyano Biotech GmbH | Method of identifying and/or differentiating cyanophyta |
| RU2386698C1 (ru) * | 2008-11-24 | 2010-04-20 | Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе |
| EP2367937B1 (en) * | 2008-12-04 | 2013-04-17 | Keygene N.V. | Method for the reduction of repetitive sequences in adapter-ligated restriction fragments |
| WO2010082815A1 (en) | 2009-01-13 | 2010-07-22 | Keygene N.V. | Novel genome sequencing strategies |
| WO2010105275A2 (en) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | Cornell University | Method to assess human allograft status from microrna expression levels |
| US8362332B2 (en) | 2009-04-15 | 2013-01-29 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV165560 |
| US8071864B2 (en) | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV897903 |
| US8071865B2 (en) | 2009-04-15 | 2011-12-06 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV589782 |
| EP2248914A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
| MX2011014032A (es) | 2009-07-07 | 2012-05-08 | Enza Zaden Beheer Bv | Plantas de pepino (cucumis sativus l.) resistentes al virus de las venas amarillas del pepino (cvyv por sus siglas en ingles). |
| US20120297505A1 (en) | 2009-07-20 | 2012-11-22 | Chuan-Yin Wu | Transgenic plants having increased biomass |
| US20110059453A1 (en) * | 2009-08-23 | 2011-03-10 | Affymetrix, Inc. | Poly(A) Tail Length Measurement by PCR |
| PT2669387T (pt) | 2009-08-25 | 2016-09-20 | Illumina Inc | Métodos para selecção e amplificação de polinucleótidos |
| WO2011071382A1 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Keygene N.V. | Polymorfphic whole genome profiling |
| EP2333104A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-15 | Lexogen GmbH | RNA analytics method |
| US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
| EP2513333B1 (en) | 2009-12-17 | 2013-10-02 | Keygene N.V. | Restriction enzyme based whole genome sequencing |
| EP2354243A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-10 | Lexogen GmbH | Complexity reduction method |
| US9746479B2 (en) | 2010-03-09 | 2017-08-29 | Cornell University | Methods and compositions to predict and detect acute rejection |
| NL2004412C2 (en) | 2010-03-16 | 2011-09-20 | Nickerson Zwaan B V | Male sterile leek plants. |
| WO2011133679A1 (en) | 2010-04-20 | 2011-10-27 | Seminis Vegetables Seeds, Inc. | White-stem trait containing plants |
| WO2011140329A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having increased biomass |
| US9080210B2 (en) | 2010-06-09 | 2015-07-14 | Keygene N.V. | High throughput screening using combinatorial sequence barcodes |
| WO2012058223A1 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having altered biomass composition |
| US8766054B2 (en) | 2010-12-08 | 2014-07-01 | Hm.Clause | Phytophthora resistance in sweet peppers |
| PL2655629T3 (pl) | 2010-12-24 | 2024-10-28 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Roślina brassica zawierająca zmutowany allel alcatraz |
| CA2823815A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Keygene N.V. | Paired end random sequence based genotyping |
| TWI465572B (zh) * | 2011-05-19 | 2014-12-21 | Univ Chang Gung | Method, composition and system of amplification and detection of target microbial DNA |
| DK2729580T3 (en) | 2011-07-08 | 2015-12-14 | Keygene Nv | SEQUENCE BASED genotyping BASED ON OLIGONUKLEOTIDLIGERINGSASSAYS |
| AU2012304328B2 (en) | 2011-09-09 | 2017-07-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for obtaining a sequence |
| WO2013067128A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having increased tolerance to aluminum |
| WO2013086499A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Ceres, Inc. | Transgenic plants having altered biomass composition |
| EP2802666B1 (en) | 2012-01-13 | 2018-09-19 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
| WO2013123442A1 (en) * | 2012-02-17 | 2013-08-22 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for accurately identifying mutations |
| EP2820174B1 (en) | 2012-02-27 | 2019-12-25 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Methods and uses for molecular tags |
| US10119147B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-11-06 | Washington State University | Brassica plants with modified seed oil composition |
| US9968041B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-05-15 | Bayer Cropscience Nv | Soybean ROD1 gene sequences and uses thereof |
| AU2013285456B2 (en) | 2012-07-06 | 2018-08-02 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica ROD1 gene sequences and uses thereof |
| EP2728013A1 (en) * | 2012-10-31 | 2014-05-07 | Universitätsspital Basel | Method for the simultaneous amplification of a plurality of different nucleic acid target sequences |
| US9758828B2 (en) | 2013-01-31 | 2017-09-12 | Cornell University | Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts |
| US9920332B2 (en) | 2013-04-19 | 2018-03-20 | Bayer Cropscience Nv | Hybrid brassica plants and methods for producing same |
| RU2549453C2 (ru) * | 2013-04-26 | 2015-04-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВЕРЕСКА ОБЫКНОВЕННОГО (Calluna vulgaris (L.) Hull.) |
| CN103233072B (zh) * | 2013-05-06 | 2014-07-02 | 中国海洋大学 | 一种高通量全基因组dna甲基化检测技术 |
| RU2535060C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ АРАЛИИ ВЫСОКОЙ (Aralia elata (Miq.) Seem.) |
| RU2535064C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СВОБОДНОЯГОДНИКА КОЛЮЧЕГО, ЭЛЕУТЕРОКОККА (Eleutherococcus senticocus (Rupr. et Maxim.) Maxim.) |
| RU2535063C1 (ru) * | 2013-05-30 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕCКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ СУШЕНИЦЫ БОЛОТНОЙ (Filaginella uliginosa (L.) Opiz) |
| US9982301B2 (en) | 2014-01-07 | 2018-05-29 | Cornell University | Urine mRNA profile and acute dysfunction of kidney allograft |
| JP2017503521A (ja) | 2014-01-22 | 2017-02-02 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 高温核酸合成で使用するための新規な逆転写酵素 |
| US20140245471A1 (en) | 2014-05-02 | 2014-08-28 | Nunhems B.V. | Carrot plants with a high anthocyanin level |
| US9107356B2 (en) | 2014-05-02 | 2015-08-18 | Nunhems B.V. | Hybrid carrot variety NUN 85931 |
| AU2015289691B2 (en) | 2014-07-15 | 2020-12-24 | Ceres, Inc. | Methods of increasing crop yield under abiotic stress |
| RU2573937C1 (ru) * | 2014-10-20 | 2016-01-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЛОДУШКИ МНОГОЖИЛЬЧАТОЙ (Bupleurum multinerve DC.) |
| PT3211991T (pt) | 2014-10-30 | 2021-11-11 | Nunhems Bv | Plantas de alface compreendendo resistência contra o biótipo 1 de nasonovia ribisnigri |
| US10494642B2 (en) | 2015-04-28 | 2019-12-03 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | Brassica plants with modified seed oil composition |
| IL257831B2 (en) | 2015-09-04 | 2025-11-01 | Keygene Nv | Diplosporic garden |
| US11277983B2 (en) | 2015-11-10 | 2022-03-22 | Pop Vriend Seeds Bv | Peronospora resistance in spinacia sp |
| US10226015B2 (en) | 2015-11-10 | 2019-03-12 | Pop Vriend Research B.V. | Peronospora resistance in Spinacia sp |
| WO2018091438A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Nunhems B.V. | Multibranching artichoke plant |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2019068647A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Hild Samen Gmbh | TOTAL RESISTANCE TO THE MILDIOU IN THE BASIL |
| AU2019207409B2 (en) | 2018-01-12 | 2023-02-23 | Basf Se | Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a |
| CN111655026A (zh) | 2018-01-26 | 2020-09-11 | 纽海姆有限公司 | 对至少粉霜霉8、9、11、13和16号小种具有抗性的菠菜植物 |
| WO2019178554A1 (en) | 2018-03-16 | 2019-09-19 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica plant resistant to plasmodiophora brassicae (clubroot) |
| WO2020109412A1 (en) | 2018-11-28 | 2020-06-04 | Keygene N.V. | Targeted enrichment by endonuclease protection |
| MX2021007009A (es) | 2018-12-13 | 2021-07-21 | Nunhems Bv | Planta solanacea capaz de formacion de frutas estenospermocarpicas. |
| CA3127572A1 (en) | 2019-02-21 | 2020-08-27 | Keygene N.V. | Genotyping of polyploids |
| WO2020239984A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | Keygene N.V. | Gene for parthenogenesis |
| US12054726B2 (en) | 2019-06-13 | 2024-08-06 | Nunhems B.V. | Tomato plant producing fruit having improved ripening characteristics |
| EP4055162A1 (en) * | 2019-11-05 | 2022-09-14 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Evaluating genomic variation using repetitive nucleic acid sequences |
| US12595519B2 (en) | 2019-11-26 | 2026-04-07 | Nunhems B.V. | Molecular markers for reduced pyruvate level trait in Allium cepa |
| WO2021116371A1 (en) | 2019-12-12 | 2021-06-17 | Keygene N.V. | Semi-solid state nucleic acid manipulation |
| EP4077661A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-10-26 | Keygene N.V. | Ngs library preparation using covalently closed nucleic acid molecule ends |
| IL297475A (en) | 2020-04-23 | 2022-12-01 | Nunhems Bv | Tomato plants with improved resistance to Tobamo virus |
| IL298023A (en) | 2020-05-13 | 2023-01-01 | Nunhems Bv | Tomato plants having suppressed meiotic recombination |
| KR20230023711A (ko) | 2020-06-10 | 2023-02-17 | 넌헴스 비.브이. | 개선된 총채벌레 저항성을 갖는 캅시쿰 아누움 식물 |
| WO2022074058A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Keygene N.V. | Targeted sequence addition |
| IL301700A (en) | 2020-10-13 | 2023-05-01 | Keygene Nv | Modified promoter of a parthenogenesis gene |
| WO2022112316A1 (en) | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Keygene N.V. | Targeted enrichment using nanopore selective sequencing |
| EP4262358A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-10-25 | Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer |
| US20240076653A1 (en) * | 2020-12-31 | 2024-03-07 | Mokobio Life Science Corporation Beijing | Method for constructing multiplex pcr library for high-throughput targeted sequencing |
| WO2022265965A1 (en) | 2021-06-14 | 2022-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Reverse transcriptase variants for improved performance |
| EP4373260A1 (en) | 2021-07-23 | 2024-05-29 | Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc | Blackleg resistant plants and methods for the identification of blackleg resistant plants |
| US12004476B2 (en) | 2022-01-26 | 2024-06-11 | Monsanto Technology Llc. | Cotton variety 20R750B3XF |
| WO2024121354A1 (en) | 2022-12-08 | 2024-06-13 | Keygene N.V. | Duplex sequencing with covalently closed dna ends |
| EP4646098A1 (en) | 2023-01-03 | 2025-11-12 | Keygene N.V. | Nal1 in rice |
| EP4689157A1 (en) | 2023-04-04 | 2026-02-11 | Keygene N.V. | Linkers for duplex sequencing |
| WO2024238992A1 (en) | 2023-05-18 | 2024-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Engineered non-strand displacing family b polymerases for reverse transcription and gap-fill applications |
| GB202308831D0 (en) * | 2023-06-13 | 2023-07-26 | Linear Diagnostics Ltd | Detection method |
| AU2023460546A1 (en) | 2023-08-07 | 2026-03-19 | Kws Vegetables B.V. | Downy mildew resistance in spinach |
| WO2025083165A1 (en) | 2023-10-19 | 2025-04-24 | Basf Agricultural Solutions Us Llc | Brassica napus plants having enhanced blackleg resistance |
| WO2025237806A1 (en) | 2024-05-13 | 2025-11-20 | Nunhems Netherlands B.V. | Lettuce plant having delayed bolting and shade tolerance |
| WO2026017734A1 (en) | 2024-07-16 | 2026-01-22 | Kws Vegetables B.V. | Downy mildew resistance in spinach |
| WO2026037742A1 (en) | 2024-08-12 | 2026-02-19 | Nunhems Netherlands B.V. | Pepper plant having multiple flowers per node |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4321365A (en) * | 1977-10-19 | 1982-03-23 | Research Corporation | Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules |
| US5093245A (en) * | 1988-01-26 | 1992-03-03 | Applied Biosystems | Labeling by simultaneous ligation and restriction |
| EP0456721A4 (en) * | 1989-01-31 | 1992-06-03 | University Of Miami | Microdissection and amplification of chromosomal dna |
| DE69034197T2 (de) * | 1989-03-03 | 2006-04-27 | Genentech, Inc., South San Francisco | Genomische Klonierung und Kartographie |
| AU5640090A (en) * | 1989-03-21 | 1990-11-05 | Collaborative Research Inc. | A dna diagnostic test using an exonuclease activity |
| JPH05508305A (ja) * | 1989-10-16 | 1993-11-25 | ジエネラブス・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | 非特異的ｄｎａ増幅 |
| WO1991014003A2 (en) * | 1990-03-09 | 1991-09-19 | Ig Laboratories, Inc. | Characterization and analysis of polymorphic vntr loci |
| US5126239A (en) * | 1990-03-14 | 1992-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences |
| WO1992007095A1 (en) * | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
| AU1426392A (en) * | 1991-01-22 | 1992-08-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences |
-
1992
- 1992-09-24 AU AU26629/92A patent/AU672760B2/en not_active Expired
- 1992-09-24 CZ CZ1994669A patent/CZ291877B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 ZA ZA927323A patent/ZA927323B/xx unknown
- 1992-09-24 WO PCT/EP1992/002216 patent/WO1993006239A1/en not_active Ceased
- 1992-09-24 IL IL10326792A patent/IL103267A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 AT AT99115309T patent/ATE382094T1/de active
- 1992-09-24 DE DE69230873T patent/DE69230873T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 JP JP50580793A patent/JP3236295B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DK DK99115309T patent/DK0969102T3/da active
- 1992-09-24 DK DK92402629T patent/DK0534858T4/da active
- 1992-09-24 HU HU9400809A patent/HU223760B1/hu active IP Right Grant
- 1992-09-24 EP EP99115309A patent/EP0969102B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 CZ CZ0321397A patent/CZ298187B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-24 EP EP92402629A patent/EP0534858B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 AT AT92402629T patent/ATE191510T1/de active
- 1992-09-24 ES ES92402629T patent/ES2147550T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 RU RU94033149/13A patent/RU2182176C2/ru active
- 1992-09-24 ES ES99115309T patent/ES2299229T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 CA CA002119557A patent/CA2119557C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 DE DE69233719T patent/DE69233719T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-24 PT PT99115309T patent/PT969102E/pt unknown
- 1992-09-24 KR KR1019940700959A patent/KR100321510B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-24 PT PT92402629T patent/PT534858E/pt unknown
-
1994
- 1994-01-12 US US08/180,470 patent/US6045994A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-23 NO NO19941064A patent/NO318016B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 FI FI941360A patent/FI113184B/fi not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-07-05 GR GR20000401580T patent/GR3033895T3/el unknown
- 2000-07-25 JP JP2000224187A patent/JP4088403B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-10-17 FI FI20031526A patent/FI115402B/fi not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-12-21 JP JP2007329833A patent/JP4385072B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ291877B6 (cs) | Způsob amplifikace přinejmenším jednoho restrikčního fragmentu z výchozí DNA a způsob přípravy sestavy amplifikovaných restrikčních fragmentů | |
| US7935488B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| EA018012B1 (ru) | Устойчивые к насекомым растения хлопчатника и методы их идентификации | |
| IL145141A (en) | Method for the identification, isolation, or separation of identical nucleic acid fragments from a mixture of at least two nucleic acid populations | |
| KR100781206B1 (ko) | 참깨 속 식물에서 분리한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| US7572583B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| US6306593B1 (en) | Selective AFLP primers for reduction of complexity of maker genotyping and DNA markers for loblolly pine identified using the AFLP primers | |
| US20030096269A1 (en) | Method for detecting genomic destabilization arising during tissue culture of plant cells | |
| JP4574263B2 (ja) | マイクロサテライトｄｎａを用いたホップ品種鑑定法 | |
| US20040241697A1 (en) | Compositions and methods to identify haplotypes | |
| JP2003339388A (ja) | アブラナ科植物のｓ遺伝子型同定方法 | |
| Van Rensburg | The development of a SCAR marker for the identification of the potato cultivars Astrid and Mnandi | |
| JPH05244995A (ja) | 新規プライマー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120924 |