CZ292009B6

CZ292009B6 - Heterocyklické sloučeniny typu benzothiofen-, benzofuran- a indolthiazepinonu,-oxazepinonu a -diazepinonu a farmaceutická kompozice na jejich bázi

Info

Publication number: CZ292009B6
Application number: CZ19962597A
Authority: CZ
Inventors: Diane Harris Boschelli; David Thomas Connor; James Bernard Kramer; Paul Charles Unangst
Original assignee: Warner-Lambert Company
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 2003-07-16
Also published as: KR100325881B1; RU2144033C1; US5565446A; MD960230A; NO963744D0; WO1995024408A1; KR100338017B1; SK282962B6; FI963462A0; ZA951844B; CA2181354A1; FI963462A7; BG100829A; NO313384B1; HUT77403A; HU9602451D0; ES2141922T3; NZ279737A; EP0749434A1; BG62698B1

Abstract

Heterocyklick slou eniny typu benzothiofen-, benzofuran- a indolthiazepinonu, -oxazepinonu a -diazepinonu obecn ho vzorce 1 a jejich farmaceuticky p°ijateln adi n soli s kyselinami, kde R.sub.1.n., R.sub.2.n., R.sub.3.n. a R.sub.4.n. jsou ka d² nez visle vod k, hydroxy, halogen, alkyl s 1 a 4 atomy uhl ku, alkoxy s 1 a 4 atomy uhl ku, benzyloxy, trifluormethyl, nitro nebo -NR.sub.8.n.R.sub.9.n., kde R.sub.8.n. a R.sub.9.n. jsou ka d² nez visle vod k, nebo alkyl s 1 a 4 atomy uhl ku, R.sub.5.n. a R.sub.6.n. jsou ka d² nez visle vod k, alkyl s 1 a 4 atomy uhl ku, nebo fenyl, X je O, S(O).sub.n.n. nebo NR.sub.7.n., Y je O, S(O).sub.n.n. nebo NR.sub.8.n., R.sub.7.n. je vod k, alkyl s 1 a 4 atomy uhl ku, fenyl, benzyl, CH.sub.2.n.OR.sub.8.n. nebo halogensubstituovan² alkyl s 1 a 4 atomy uhl ku, fenyl nebo benzyl, R.sub.8.n. je vod k, alkyl s 1 a 4 atomy uhl ku nebo fenyl, n je 0, 1 nebo 2, za p°edpokladu, e 1) jestli e X je NH, Y je NH, R.sub.1.n. je H, R.sub.3.n. je H a R.sub.4.n. je Br, potom R.sub.2.n. nen methyl; 2) jestli e X je NH, Y je NH, R.sub.1.n. je H, R.sub.3.n. je H a R.sub.4.n. je H, potom R.sub.2.n. nen methoxy nebo ethoxy a 3) jestli e X je NH, Y je S, potom alespo jeden z R.sub.1.n., R.sub.2.n., R.sub.3.n. a R.sub.4.n. nen H. Farmaceutick kompozice, kter obsahuje terapeuticky · inn mno stv heterocyklick slou eniny podle n roku 1 spolu s farmaceuticky p°ijateln²m nosi em.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových benzothiofen- benzofuran- a indolthiazepinonu, -oxazepinonu a diazepinonů a jejich farmaceuticky vhodných solí, kterých se používá pro zabránění adhezi leukocytů k buňkám andothelu. Adherence leukocytů k vaskulárnímu endothelu je neodlučitelná od patogeneze zánětu. Proces adheze předchází migraci leukocytů přes endothel do okolních tkání a výslednému poškození tkáně. O sloučeninách, které mohou blokovat tuto počáteční adhezní interakci se předpokládá, že jsou účinné při léčení zánětlivých chorob, jako rheumatoidní arthritis, osteoartritis, astma a psoriasis. Jako neomezující příklady jiných indikací, které přicházejí v úvahu, lze uvést syndrom respiračního distresu u dospělých, reperfuzní poškození, ischemii, ulcerosní kolitis, vaskulitidis, aterosklerózu, zánětlivou chorobu střev a metastázy nádorů.

Dosavadní stav techniky

Adhezní receptory se dělí do tří hlavních rodin: rodiny selektinů, nadrodiny imunoglobulinů a rodiny intergrinů (Nátuře, 346: 426 (1990)). Na zprostředkování adheze leukocytů během zánětu se podílejí látky ze všech třech tříd (přehled této oblasti viz: Thrombosis and Hemostasis, 65(3), 223 (1991), Clinical and Experimental Allergy, 20:619 (1990), Transplantation, 48: 727 (1989), Biochemical Pharm., 40(8): 1683 (1990)). Molekula-1 endotheliální adheze leukocytů (endothelial leukocyte adhesion molecule-1, ELAM-1 či E-selektin) náleží do rodiny selektinů glykoproteinů, které podporují adhezi buňka-buňka. O E-selektinu se uvádí, že je maximálně exprimován na povrchu endotheliálních buněk 4 hodiny po jejich stimulaci cytokiny, jako interleukinem 1 (IL—1) nebo faktorem nekrosy nádorů a (TNF-a) nebo jinými mediátory zánětu, jako je lipopolysacharid (LPS) (Proč. Nat. Acad. Sci., 84: 9238 (1987)).

Intercelulámí adhezní molekula-1 (ICAM-1) je členem nadrodiny imunoglobulinů. Je rovněž pozitivně regulována, přičemž k maximální expresi dochází 12 až 24 hodin po stimulaci. Ukázalo se, že 4 hodiny po stimulaci endotheliálních buněk mediátorem zánětu jsou na povrchu buňky přítomny jak E-selektin, tak ICAM-1 (J. Clin. Invest., 82: 1746 (1988) a J. Immun., 137-1893 (1986), Blood, 78:2721 (1991)).

Ukázalo se, že heterocyklické sloučeniny typu benzothiofen-, benzofuran- a indolthiazepinonu, -oxazepinonu a -diazepinonu podle vynálezu při in vitro zkoušce inhibují adhezi neutrofilů k buňkám endothelu pupečníkové žíly (HUVEC) stimulovaným faktorem nekrosy nádorů a.

Vynález se také týká nových heterocyklických sloučenin typu benzothiofen-, benzofuran- a indolthiazepinonu, -oxazepinonu a -diazepinonu pro léčení lidí infikovaných virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) inhibici aktivace HIV, kterýje u infikovaných lidí latentní.

Patogeneze viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) je komplikovaná a dosud nebyla zcela objasněna. Životní cyklus viru byl teoreticky rozdělen na aferentní a eferentní složky. Mezi procesy, které zahrnují aferentní složku životního cyklu viru, patří připojení, fúze, reverzní transkripce a konečně integrace viru. Je to aferentní složka životního cyklu HIV, která je zodpovědná za primární infekci HIV u jednotlivce, a po ní obvykle následuje virémie s případnými klinickými symptomy.

Byla vyvinuta řada terapeutických strategií zaměřených na intervenci během aferentních procesů. Viz například Mitsuya H., Broder S., „Inhibition of the In Vitro Infectivity and Cytopahic Effect

- 1 CZ 292009 B6 on Human T-lymphotropic Virus Type III/lymphadenopathy Virus-associated Virus (HTLVIII/LAV) by 2',3'-Dideoxynucleosides“, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 83: 1911 až 1915 (1986).

Ačkoliv různá stádia aferentní složky nabízejí potenciál pro účinnou terapeutickou intervenci, postupně se stalo zjevným, že intervence pouze v těchto bodech není dostatečná. Poté co dojde k infekci a choroba projde aferentními stádii, postižený jednotlivec při dobrém zdravotním stavu prodělává prolongované období klinické latence, které může trvat až několik let. V této době se dosahuje nízké nebo nulové hladiny virémie a replikace viru v buňkách periferní krve. Později však choroba časem progreduje na život ohrožující potlačení imunity (AIDS), pro které neexistuje žádná léčba. Tyto pozdější jevy jsou klinickou manifestací eferentních stádií životního cyklu HIV.

Eferentní složka životního cyklu HIV zahrnuje procesy, které jsou nezbytné pro to, aby mohlo dojít k úspěšné transkripci HIV proviru, translaci, sestavení a produkci virionů. Nástup procesů, které jsou nezbytné pro přechod buněk infikovaných HTV z asymptomatického stádia, při němž není exprimován HTV, do symptomatického stádia, při němž HTV exprimován je, se označuje jako aktivace. V současné době eferentní složka a buněčná podstata aktivace nejsou zcela objasněny. Vyvinutí nových léčivých složek a strategií, které budou použity během asymptomatické fáze pro potlačení progrese choroby do stádia AIDS, může poskytnout určitou naději odhadem jednomu milionů jedinců, kteří jsou infikovaní, ale klinicky latentní.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou heterocyklické sloučeniny typu benzothiofen-, benzofuran- a indolthiazepinonu, -oxazepinonu a -diazepinonu obecného vzorce I

(I) kde

Ri, R₂, R3 a R4 jsou každý nezávisle vodík, hydroxy, halogen, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxy, trifluormethyl, nitro nebo -NRgR₉, kde Rg a R₉ jsou každý nezávisle vodík, nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku,

R5 a R/5 jsou každý nezávisle vodík, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo fenyl,

X je O, S(O)_n nebo NR₇,

Y je O, S(O)_n nebo NR₈,

R₇ je vodík, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, fenyl, benzyl, CH₂ORg nebo halogensubstituovaný alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, fenyl nebo benzyl,

Rg je vodík, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo fenyl, n je 0, 1 nebo 2, za předpokladu, že

- 2 CZ 292009 B6

1) jestliže X je NH, Y je NH, R] je H, R₃ je H, a R4 je Br, potom R₂ není methyl;

2) jestliže X je NH, Y je NH, Rj je H, R₃ je H a R4 je H, potom R₂ není methoxy, nebo ethoxy a

3) jestliže X je NH, Y je S, potom alespoň jeden z R_b R₂, R₃, a R4, není H;

ajejich farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami.

Dále je předmětem vynálezu také farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce I definované výše spolu s farmaceuticky vhodným nosičem.

Vynález zahrnuje také další nenárokované aspekty.

Třetím aspektem vynálezu je tedy způsob léčení chorob zprostředkovaný inhibici adheze leukocytů k buňkám endothelu, jehož podstata spočívá v tom, že se hostiteli, který takové léčení potřebuje, podává farmaceutická kompozice, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I definovaného výše v jednotkové dávkovači formě.

V přednostním provedení se jedná o způsob léčení zánětlivých chorob u lidí, při němž se podává protizánětlivé množství sloučeniny vzorce I.

Čtvrtým aspektem vynálezu je způsob léčení hostitelů HTV, jehož podstata spočívá v tom, že se takovému hostiteli podává farmaceutická kompozice, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I definovaného výše v jednotkové dávkovači formě.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

V následujících odstavcích je uveden význam pojmů, kterých se používá v definici obecného vzorce I.

Pod pojmem „alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku“ a „alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku“ se rozumí alkylskupiny a alkoxyskupiny s řetězcem přímým nebo rozvětveným obsahující 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových alkylskupin je možno uvést methyl-, ethyl-, propyl-, izopropylči (methyl)ethyl-, a /erc-butyl- či l,l-(dimethyl)ethylskupmu. Podobně lze jako příklady alkoxyskupin uvést methoxy-, ethoxy-, izopropoxy- či l-(methyl)ethoxyskupinu apod.

Pod pojmem „halogen“ se rozumí fluor, chlor, brom nebo jod.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou dále tvořit farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami. Všechny tyto formy spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Jako farmaceuticky vhodné adiční soli sloučenin obecného vzorce I s kyselinami je možno uvést soli odvozené od anorganických kyselin, jako kyseliny chlorovodíkové, dusičné, fosforečné, sírové, bromovodíkové, jodovodíkové, fluorovodíkové, fosforité apod. a soli odvozené od netoxických organických kyselin, jako jsou alifatické mono- a dikarboxylové kyseliny, fenylsubstituované alkanové kyseliny, hydroxyalkanové kyseliny, alkandiové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny atd. K takovým solím se tedy řadí sírany, disírany, hydrogensírany, siřičitany, hydrogensiřičitany, nitráty, fosfáty, monohydrogenfosfáty, dihydrogenfosfáty, metafosfáty, pyrofosfáty, chloridy, bromidy, jodidy, acetáty, trifluoracetáty, propionáty, kapryláty, izobutyráty, oxaláty, malonáty, sukcináty, suberáty, sebakáty, fumaráty, maleáty, mandeláty, benzoáty, chlorbenzoáty, methylbenzoáty, dinitrobenzoáty, ftaláty, benzensulfonáty, toluensulfonáty, fenylacetáty, citráty, laktáty, maleáty, tartráty, methansulfonáty apod.

V úvahu také přicházejí soli s aminokyselinami, jako argináty apod. a glukonáty, galakturonáty a

- 3 CZ 292009 B6

N-methylglutaminové soli (viz například Berge S. M. et al., „Pharmaceutical Salts“, Joumal of

Pharmaceutical Sciences, 66:1 až 19, 1977).

Adiční soli takových bazických sloučenin s kyselinami se připravují tak, že se volná báze obvyklým způsobem uvede do styku s dostatečným množstvím požadované kyseliny za vzniku odpovídající soli. Volnou bázi lze ze soli znovu získat tak, že se solná forma uvede do styku s bází a volná báze se obvyklým způsobem izoluje. Volná báze se od svých solných forem mohou do určité míry odlišovat v některých fyzikálních vlastnostech, jako je rozpustnost v polárních rozpouštědlech. Pro účely tohoto vynálezu jsou však soli ekvivalentní odpovídajícím volným bázím.

Některé sloučeniny podle vynálezu se mohou vyskytovat v nesolvatovaných i solvatovaných formách, jako hydratovaných formách. Solvatované formy jsou ekvivalentní formám nesolvatovaným a spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Rj, R₃ a R4 jsou atomy vodíku a R₂ má výše uvedený význam.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde R_b R₃ a R4 jsou atomy vodíku, R₂ je vodík, nebo alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku, X je O, S(O)„ nebo NR₇; Y je O nebo S(O)_n, R₇ je vodík nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku a n je 0, 1, nebo 2.

Zvláště výhodnými sloučeninami jsou

2.3- dihydro-9-methoxy[ 1 ]benzothieno[2,3-f]-l ,4-thiazepin-5(4H)-on,

2.3- dihydro[ 1 ]benzothieno[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5(4H)-on,

2.3- dihydro-9-methoxy[l]benzothieno[2,3-f]-l,4-thiazepin-5(4H)-on-l-oxid,

3.4- dihydro-9-methoxy-6-methyl-2H-l,4-oxazepino[6,7-b]indol-5(6H)-on,

2.3- dihydro-l H-benzothieno[3,2-e]-l ,4-diazepin-5-on,

2.3- dihydro-9-methoxy-l H-benzothieno[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5-on,

2.3- dihydro-9-methoxy-6-oxid-l H-benzothieno[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5-on a

2.3- dihydro-9-methoxy-2-methyl-lH-benzothieno[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-on.

Při posouzení, kdy je indikován inhibitor buněčné adheze nebo inhibitor aktivace HIV, musí být brány v úvahu mj. daný konkrétní stav a jeho závažnost, jakož i věk, pohlaví, hmotnost apod. léčeného subjektu. Taková posouzení provádí ošetřující lékař v rámci odborné rutiny.

Při použití v medicíně bude množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinou potřebné pro dosažení terapeutického účinku samozřejmě kolísat v závislosti na konkrétní sloučenině, způsobu podávání, savci, kteiý je léčen a konkrétní poruše nebo chorobě. V přednostním provedení se vynález týká způsobu léčení lidí, kteří trpí zánětlivou chorobou, jako jsou arthritis nebo otoky, při němž se subjektu, který takové léčení potřebuje, podává protizánětlivě účinné množství sloučeniny podle vynálezu. Vhodná dávka sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinou pro savce, který trpí nebo pravděpodobně trpí kterýmkoliv stavem uvedeným výše, leží v rozmezí od 0,1 pg do 500 mg na kilogram tělesné hmotnosti. V případě systemického podávání dávka leží v rozmezí od 0,5 do 500 mg na kilogram tělesné hmotnosti. V nejvýhodnějším provedení se podává dávka 0,5 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti savce dvakrát až třikrát za den. V případě topického podávání, například dermálního nebo oftalmického, vhodná dávka leží v rozmezí od 0,1 ng do 100 pg/kg, a typickou dávkou je asi 0,1 pg/kg.

V případě perorálního podávání při léčení nebo profylaxi arthritis či obecně zánětu vyvolaného jakoukoliv příčinou je sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky vhodnou adiční sůl

- 4 CZ 292009 B6 s kyselinou možno podávat v dávkách uvedených výše, nejvýhodněji však v dávce 1 mg až mg/kg, zejména 1 mg až 5 mg/kg tělesné hmotnosti, například v dávce 1 až 2 mg/kg.

Je zřejmé, že množství sloučeniny, které je účinné pro zastavení progrese léčeného stavu, je ošetřující lékař nebo veterinář schopen snadno stanovit. Lékař nebo veterinář může nejprve použít relativně nízkých dávek, a tyto dávky postupně zvyšovat, dokud se nedosáhne maximální odpovědi.

Účinné sloučeniny je možno podávat samotné, ale přednost se dává jejich podávání ve formě farmaceutických formulací, které obsahují sloučeninu obecného vzorce I nebo její farmaceuticky vhodnou adiční sůl s kyselinou a farmakologicky vhodný nosič. Takové formulace představují další znak tohoto vynálezu.

Formulace, jak pro použití ve veterinární nebo humánní medicíně, podle vynálezu obsahují účinnou složku spolu s farmaceuticky vhodným nosičem a popřípadě jiné terapeutické činidlo nebo jiná terapeutická činidla. Použité nosiče musí být vhodné po stránce kompatibility s ostatními složkami formulace a nesmí poškozovat recipienta.

Jako formulace je možno uvést formy vhodné pro perorální, pulmonámí, oftalmické, rektální, parenterální (jako subkutánní, intramuskulámí a intravenózní), intraartikulámí, topické, nasální a bukální podávání. Do jejich rozsahu patří rovněž formulace s prodlouženým účinkem známé v tomto oboru.

Formulace mohou účelně mít formu jednotkových dávkovačích forem a lze je připravovat jakýmkoliv způsobem, který je v oboru farmacie dobře znám. Všechny takové způsoby mohou obsahovat stupeň v němž se účinná složka uvádí do styku s nosičem, který je tvořen jednou složkou nebo více složkami. Obvykle se formulace připravují jako dokonale promísené a homogenní směsi tak, že se účinná přísada smísí s kapalným nosičem nebo jemně rozmělněným pevným nosičem nebo oběma takovými nosiči, a poté se produktu tvaruje na požadovanou formulaci.

Formulace podle vynálezu vhodné pro perorální podávání mohou mít formu oddělených jednotek, jako jsou tobolky, sáčky, tablety nebo pastilky, z nichž každá obsahuje předem stanovené množství účinné přísady; formu prášku nebo granulí; roztoku nebo suspenze ve vodné nebo nevodné kapalině; nebo formu emulze olej ve vodě nebo voda v oleji. Účinná přísada rovněž může být ve formě bolu, lektvaru nebo pasty.

Užitečnost sloučenin podle vynálezu jako inhibitorů adherence leukocytů kvaskulámímu endothelu, a tedy při léčení zánětlivých chorob nebo stavů, je možno demonstrovat jako jejich účinnost při různých standardních zkouškách. Dále jsou popsány jednotlivé zkušební postupy a uvedeny příklady výsledků, kterých se při zkouškách dosáhlo.

Protokol stanovení exprese intercelulámí adhezní molekuly-1 (ICAM-1) a E-selektinu (ESEL) buňkami HUVEC

Buněčná kultura

Buňky endothelu lidské pupečníkové žíly (HUVEC) od firmy Clonetics získané v lahvích pro buněčné kultury T-25 se po podání 1 až 3 dny nechají růst při 37 °C v atmosféře 5% oxidu uhličitého. Buňky HUVEC se poté oddělí tak, že se nádoba T-25 po dobu asi 5 až 10 s promývá 10 ml směsi 0,025% trypsinu a 0,01% EDTA a promývací kapalina se vylije. Po přídavku dalších 10 ml roztoku trypsinu v EDTA se buňky míchají, přičemž se na stěnu nádoby poklepává vymazávací pryží. Obsah nádoby se přelije do 50ml centrifugační zkumavky obsahující 40 ml média. Médiem je endotheliální bazální médium od formy Clonetics obsahující hydrokortison (2 mg/litr), epidermální růstový faktor (0,05 pg/litr), extrakt z hovězího mozku (12 mg/litr) a

- 5 CZ 292009 B6 teplotně inaktivované fetální telecí sérum (6%) od firmy Hyclone. Buňky se centrifugují 10 až minut při 15 °C a supematant se odvede. Buňky se resuspendují v čerstvém médiu, podruhé promyjí stejným způsobem a zaočkují se jimi 96jamkové destičky pro tkáňové kultury.

Stimulace cytokiny

Během 5 dnů po dosažení konfluence se buňky’ stimulují faktorem nekrosy nádorů a (TNF-a) (Genzyme), aby se dosáhlo konečné koncentrace média 140 U/ml a inkubují 4 hodiny při 37 °C. Po čtyřhodinové inkubaci se médium odstraní a skladuje pro analýzu na produkci chemikinů. Buňky se třikrát promyjí fosfátem pufrovaným solným roztokem neobsahujícím vápník a hořčík. Monokultury se fixují tak, že se do jamek na 30 minut přidá 10% pufrovaný formalin. Po fixaci se buňky třikrát promyjí Dulbeccem modifikovaným Eaglovým médiem (Gibco) obsahujícím 2% hovězí sérový albumin (DMEM/2%BSA) a přes noc zmrazí.

ELISA

Myší monoklonální antihumánní ICAM-1 (R & D Systems, katalogové číslo BBA-4) nebo myší monoklonální antihumánní E-selektin (R & D, katalogové číslo BBA-2) se rozpustí v DMEM/2%BSA v množství 0,5 pg/ml přidá do každé jamky. Po dvouhodinové inkubaci při 37 °C se monokultury buněk HUVEC promyjí čtyřikrát DMEM/2% BSA a přidá se k nim s peroxidázou konjugovaný kozí protimyší IgG (Cappel) (zředění 1 :3000). Po jednohodinové inkubaci při 37 °C se buňky promyjí čtyřikrát DMEM. K fixovaným buňkám se přidá barvicí činidlo (Biorad) fixované buňky se inkubují 15 minut při teplotě místnosti. Reakce se zastaví 2% roztokem kyseliny šťavelové. Stanoví se absorbance při 414 nm za použití snímače destiček Titertek.

Zkoušení sloučenin

Sloučeniny se rozpustí v DMSO při koncentraci 30 mmol. Vzniklý roztok se zředí médiem, aby se dosáhlo zkušební koncentrace. Buňky HUVEC se 30 minut před stimulací faktorem nekrosy nádorů a ošetří sloučeninou rozpuštěnou v médiu. Před stanovením procenta inhibice se absorbance nestimulovaných buněk HUVEC odečte od hodnot absorbance buněk stimulovaných TNFa. Procento inhibice se stanoví porovnáním absorbance buněk ošetřených vehikulem s buňkami ošetřenými léčivem. Metodou lineární regresní analýzy se stanoví hodnoty IC50.

Stanovení inhibice adheze lidských neutrofilů k buňkám endothelu pupečníkové žíly stimulovaným TNF-a

Buněčná kultura

Buňky HUVEC (Clonetics Corporation, San Diego, Kalifornie, CC-2617) z druhého pasážování se naočkují na 96jamkové destičky pro buněčné kultury (Coming glass works, Coming, NewYork, USA) v koncentraci 5x 10³ buněk/jamka a až do konfluentního nárůstu pěstují v doplněném endotheliálním bazálním médiu (EBM MCDB-131 Clonetics, 10 ng/ml EGF, 1 pg/ml hydrokortison, 0,4% extrakt z hovězího mozku, 5% fetální hovězí sérum). Jeden den před zkouškou, obvykle 3 dny po zaočkování, se kultury doplní doplněným EBM (S-EBM).

Příprava zkoušených sloučenin

Zkoušené sloučeniny se připravují jako lOml zásobní roztoky o koncentraci l,0mM. Sloučeniny se nejprve rozpustí v 0,1 ml DMSO a ke vzniklému roztoku se přidá 9,9 ml S-EBM. Takto získané přípravky se v jednom stupni zředí na koncentraci 66,6 μΜ. Rozpuštění a ředění se provádějí v polystyrénových kontejnerech.

- 6 CZ 292009 B6

Stimulace buněk HUVEC

Rekombinantní faktor nekrosy nádorů a (TNF, Genzyme, Boston. Massachusets, kód TNF-H) se připraví jako roztok v S-EBM o koncentraci 400 U/ml. Zásobní roztok TNF se připraví jako roztok o koncentraci 20 000 U/ml v Dulbeccově fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS, Gibco, Grand Island, New York, USA) s obsahem 0.1% BSA a skladuje se při -70 °C. Buňky HUVEC se jednou promyjí 0,2 ml teplého nedoplněného EBM a poté 4 hodiny při 37 °C stimulují TNF o koncentraci 200 U/ml za přítomnosti zkoušené sloučeniny o koncentraci 33,3μΜ tak, že se knim přidá 0,1 ml TNF o koncentraci 400 U/ml a 0,1 ml zkoušené sloučeniny o koncentraci 66,6 μΜ. Tyto látky se přidávají pomalu, aby še neporušila monovrstva HUVEC. Každá sloučenina se zkouší na šesti jamkách. Na každé destičce se také provádí zkouška s nestimulovanými buňkami (kontrola vehikulem) a buňkami stimulovanými TNF bez ošetření zkoušenými sloučeninami.

Značení neutrofilů

Jednu hodinu před přídavkem neutrofilů k buňkám HUVEC se neutrofily (5 x 10⁶/ml) 30 minut při 37 °C značí 5μΜ kalceinem-AM (Molecular Probes. Eugene, Oregon, USA) v Hanksově vyváženém solném roztoku obsahujícím 0,45% BSA. Zásobní roztok kalceinu v bezvodém DMSO se připraví v koncentraci 5mM a skladuje se vysušený při -20 °C. Na konci inkubace se buňky promyjí dvakrát chladným HBSS a resuspendují na konečnou koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml v doplněném EBM.

Přídavek neutrofilů k HUVEC

Na konci čtyřhodinové stimulace a bezprostředně před přídavkem neutrofilů k monovrstvě buněk HUVEC se destičky promyjí 0,2 ml teplého nedoplněného EBM, čímž se odstraní TNF a léčivo. Do každé z ošetřených jamek se pomalu přidají neutrofily (1 x 10’ buněk). Destičky se inkubují 30 minut při 37 °C a na konci inkubace promyjí dvakrát 0,2 ml teplého nedoplněného EBM, načež následuje poslední přídavek (0,1 ml) pro snímání destiček.

Stanovení relativní fluorescence

Relativní fluorescence se stanoví za použití systému Millipore Cytofluor 300 (excitace = 480, emise = 530, citlivost = 4).

Výpočty

Stanovení je považováno za validní, pokud stimulace buněk HUVEC faktorem nekrosy nádorů vede ke 300% zvýšení adherence neutrofilů vzhledem kadherenci nestimulovaných buněk HUVEC. Výsledky se vyjádří jako procento inhibice adherence stimulované TNF.

% Inhibice = 100 —

Γ stimulovaná nestimulovaná 1

I adherence - adherence I I (léčivo)I

I I

I stimulovaná nestimulovaná I

I adherence - adherence I L(kontrola)J

Některé tyto sloučeniny byly za účelem stanovení hodnot IC₅₀ zkoušeny při koncentracích 33,3μΜ, ΙΟ,ΟμΜ, 3,3μΜ a Ι,ΟμΜ. Pro stanovení IC₅₀ bylo použito lineární regresní analýzy středních hodnot inhibice.

- 7 CZ 292009 B6

Výsledky, kterých se dosáhlo u některých sloučenin podle vynálezu, jsou uvedeny v tabulce I.

Zjistilo se, že sloučeniny podle vynálezu, zejména vzorce III, inhibují aktivaci viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV), který je u infikovaných savců latentní, a jsou tedy užitečné při léčení AIDS.

Pokusy objasnit virologický a buněčný základ klinicky asymptomatického období ukazují, že HIV se v rezervoárové populaci chronicky infikovaných buněk vyskytuje ve formě dormantního či neexprimujícího proviru. Specifický typ HIV, HIV-1, byl podroben řadě různých zkoumání, při nichž se ukázalo, že virus se ve formě dormantního či neexprimujícího proviru vyskytuje v rezervoárové populaci chronicky infikovaných T-lymfocytů. Podrobnosti týkající se jaderného a biochemického mechanismu, který je zodpovědný za udržování neexpresivního stavu viru, však leží mimo rozsah tohoto popisu. Lze je však nalézt v jiných publikacích (Mechanisms of HIV-1 Latency, Bednařík, et al., AIDS 6: 3 až 16, 1992).

Donedávna se mělo za to, že HIV je dormantní či neexprimující v průběhu klinicky asymptomatického období ve všech rezervoárových populacích chronicky infikovaných buněk. Pozorované nízké až nulové hladiny virémie a replikace viru v buňkách periferní krve vedly k dojmu, že HIV choroba během klinicky asymptomatické fáze není aktivní. Tým vědců však zjistil, že v průběhu HIV infekce nedochází k pravému stavu mikrobiologické latence. Fauci A. S. et al., „HIV Infection is Active and Progressive in Lymphoid Tissue During the Clinically Latent Stage of disease“, Nátuře 362: 355 až 358 (1993).

Vědci zaznamenali během klinické latence dichotomii mezi úrovní virové zátěže a replikací viru v periferní krvi oproti lymfatickým orgánům. Na základě těchto poznatků tedy zjistili, že „periferní krev neodráží přesně aktuální stav HIV choroby, zejména v ranném počátku klinickém průběhu infekce HIV. Ve skutečnosti je HIV choroba aktivní a progresivní, dokonce i v případě, že aktivita choroby přímým měřením virových parametrů málo průkazná, a pacient prodělává klinickou latenci“

HIV choroba nevyhnutelně progreduje z klinicky latentní asymptomatické fáze do expresivní a aktivní symptomatické fáze. Na základě zkoumání na několika různých modelech se začalo rýsovat objasnění buněčných drah, které se účastní aktivace HIV z laboratorní latence. Podle Butera et al., AIDS, 6, 994 (1992) je po ošetření cytokiny u řady buněčných modelů latence možno indukovat expresi HIV-1. To ukazuje, že ve fázi mikrobiologické latence HIV-1 před iniciací replikace předpokládá extracelulámí stimul. Tento signál nemusí být zprostředkován pouze interakcí rozpustného cytokinu se svým receptorem, ale také interakcemi receptorreceptor, knimž dochází během mezibuněčné komunikace nebo buněčného stresu, například vystavenín UV záření nebo tepelnému šoku. Kromě toho je extracelulámí signál možno generovat autokrinně nebo parakrinně tak, že HIV-1 aktivovaná buňka může vyvolat svou vlastní expresi při aktivaci sousední latentní buňky.

Odborníci v tomto oboru brali v úvahu další faktory, které se mají podílet na aktivaci HIV. Jedna studie ukázala, že 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetát (TPA) je mediátorem negativní regulace CD4 a virové exprese v buňkách infikovaných HIV. Hamamoto, et al., Biochem. Biophys, Res. Commun., 164: 339 až 344 (1989). Hamamoto také zkoumal účinek silných inhibitorů protein kinázy C, stausporinu, H-7 a UCN-01, na negativní regulaci CD4 zprostředkovanou TPA a zvýšení exprese HIV. Zjistilo se, že stausporin je účinným inhibitorem TPA při obou těchto aktivitách.

Buněčné dráhy, které se podílejí na zprostředkování aktivačního signálu z plazmatické membrány do integrovaného viru vedoucí k expresi HIV-1, jsou mnohem nejasnější. Nedávno bylo v National Cooperative Discovery Grant (NCDDG)/AIDS, P. Feorino, S. T. Butera, T. M. Folks a R. F. Schinazi, 3. až 7. listopad 1991 popsáno nalezení spolehlivého a jednoduchého systému hodnocení sloučenin, které by mohly zabraňovat aktivaci latentního HIV. Tento zkušební systém

- 8 CZ 292009 B6 využívá buněčné linie OM-10.1, unikátního chronicky infikovaného promyelocytického klonu, který zůstává CD4+ až do aktivace HIV-1 faktorem nekrozy nádorů a. Jako markérů se pro kvantifikaci exprese viru se používá exprese CD4+ na buněčném povrchu a aktivita reverzní transkriptázy. Alternativně je možno použít i jiných HIV markérů, jako je aktivita proteázy, které jsou odborníkům v tomto oboru známy. Buňky OM-10.1 zůstávají CD4+, dokud nedojde k virové aktivaci a indukci odpovědi na faktor nekrozy nádorů. Těchto kultur se tedy používá pro účelné a rychlé zkoušení farmaceutik na schopnost negativní modulace CD4+ (snížení exprese CD4+ na buněčném povrchu) a expresi HTV-1.

Na schopnost inhibovat expresi HTV v těchto buňkách OM-10.1 byly zkoušeny různé sloučeniny, o nichž je známo, že mají antivirovou účinnost na akutně nebo chronicky infikované buňky. Také bylo zkoušeno několik sloučenin, které interagují s biochemickými drahami, které mohou interferovat s reaktivačním procesem. Výsledky tohoto hodnocení jsou uvedeny v plakátovém sdělení NCDDG/AIDS, San Diego, Kalifornie, USA, 3. až 7. listopad 1991. Ze 48 hodnocených sloučenin jsou za mírné inhibitory HIV-1 považovány 3'-fluor-3'-deoxythymidin (FLT), interferon Y a desferrioxamin.

Reprezentativní sloučenina obecného vzorce I, 2,3-dihydro-9-methoxy-[l]benzothieno[2,3f]l,4-thiazepin-5(4H)-on, při inhibici v buňkách OM-10.1 vykazuje hodnotu IC_ÍO 0,2ΙμΜ (Tabulka I).

Tabulka I

2,3-Dihydro-9-methoxy-[ 1 ]benzothieno[2,3f]-l ,4-thiazepin-5(4H)-on

Příklad	r₂	X	Y	ECA (IC50)	ICAM/ESEL (IC₅o nebo % -inhibice při 30μΜ)	OM-10 (IC₅₀) (μΜ)
1	OMe	S	s	5,2	3,1/1,3	0,21
2	H	s	0		42%/40%	>30
4	OMe	NMe	0		14,7/14,2
5	H	s	NH		64%/47%
6	OMe	S	O		3,1/7,5
7	OMe	S-O	0		30%/30%
8	OMe	s	O(2-Me)		3,8/5,3

Doložena je rovněž aktivita sloučenin podle vynálezu při in vivo zkouškách, kterých se používá pro měření schopnost sloučenin inhibovat influx enutrofilů, a tedy jejich užitečnost při léčení zánětlivých stavů. Při jedné zkoušce nazvané „Reverse Passive Arthus Pleurisy Assay“ se samci outbrední linie potkana Wistar (220 až 245 g, Charles River Laboratories) 16 až 18 hodin nechají o hladu a intravenosně se jim podá vehikulum (směs ethanolu a solného roztoku v poměru 1:1) nebo roztok zkoušené sloučeniny podle vynálezu ve vehikulu. Zvířata se lehce anestetizují etherem a intravenózní injekcí se jim podá 2,5 mg hovězího sérového albuminu (BSA) v solném roztoku. Ihned po intravenózní injekci se jim provede malý řez mezi žebry a do pleurální dutiny se za použití jehly pro perorální podávání č. 20 podá 0,2 ml králičí IgG frakce anti-BSA (10 mg/ml v Dulbeccově fosfátem pufrovaném solném roztoku, PBS) v PBS. Řez se uzavře 9mm

- 9 CZ 292009 B6 nerezovou svorkou. Po 4 hodinách se zvířata usmrtí euthanasií oxidem uhličitým. Pleurální dutina se perfunduje 2 ml 0,325% roztokem fenolové červeni v PBS. Z pleurální dutiny se za účelem analýzy odebere exsudát-pufr. Za použití počítače Coulter se spočítají bílé krvinky (>90 % neutrofílů). Objem pleurálního exsudátu se změří postupem ředění barviva (Carter G. W., et al., J. Pharm. Pharmacol. 34: 66 až 67. 1982). Skupiny ošetřené sloučeninami se porovnají se skupinou, které bylo podáno vehikulum a za použití Studentova t-testu se stanoví statistická významnost.

Při hodnocení zkoušeniny z příkladu 1 se při výše popsané zkoušce dosáhlo následujících hodnot inhibice

Dávka (mg/kg)	Procento inhibice exsudátu	Procento inhibice influxu neutrofílů
0,3	40,5	1798,6
1,0	28,4	8,9
3,0	28,2	15,9

Při jiné in vivo zkoušce, která je označována jako stanovení influxu neutrofílů indukované glykolátem se samice inbrední linie myši Balb/c se chovají ve skupinách po 7 jedincích a během zkoušky je jim ponechán volný přístup k potravě a vodě. Zvířatům se perorálně podá vehikulum (0,5% hydroxypropylmethylceluloza obsahující 0,2% Tween 80) nebo sloučenina podle vynálezu rozpuštěná nebo suspendovaná ve vehikulu. Hodinu po perorálním podání se myši anestetizují inhalací diethyletheru a intraperitoneální injekcí se jim podá 0,1 Ml 3% thioglykolátového média v solném roztoku. Dvě hodiny po injekci thioglykolátu se zvířata usmrtí euthanasií, udušením oxidem uhličitým a injekčně se jim podá 6 ml Dulbeccova PBS obsahujícího 10 U/ml sodného heparinu a 0,1% BSA. Peritoneální dutina se promasíruje a provede se do ní řez, což umožní shromáždit kapalinu do 15ml centrifugačních zkumavek. Za použití počítače Coulter (Model ZBi, Coulter Instrument, Healeah, Florida, USA) se v alikvotech odebraných od každého zvířete stanoví celkový počet buněk. Druhý alikvot se odebere za účelem mikroskopického zkoumání za použití Cytospin 2 (Shandon lne., Pittsburg, Pennsylvania, USA) a následně se provede barvení modifikovaným Wrightovým barvivém. Za účelem stanovení procenta neutrofílů, které extravasovaly do peritoneální dutiny se provede hematologické rozdělení.

Sloučeniny z příkladu 1 při hodnocení touto zkouškou vykazuje 26,1% inhibici influxu neutrofílů v dávce 10 mg/kg, 31,9% inhibici v dávce 30 mg/kg a 34,3% inhibici v dávce 100 mg/kg.

Sloučeniny podle vynálezu je možno připravovat následujícími způsoby.

První obecný způsob vyžaduje 3-hydroxy-, thiol- nebo aminobenzo[b]thiofenové, -benzofuranové nebo indol-2-karboxylátové estery vzorce 1 (viz schéma 1) jako výchozí látky. 3-Hydroxybenzo[b]thiofen-2-estery se připravují způsobem uvedeným v Connor D. T. et al., J. Med. Chem., 35: 958, 1992. 3-Thiobenzo[b]thiofen-2-karboxylátové estery se připravují reakcí analogického 3-chlorderivátu (Connor D. T. et al., J. Med. Chem., 35: 958, 1992) s thioacetamidem za přítomnosti báze, jako l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-enu (DBU) a rozpouštědla, jako Ν,Ν'-dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu. 3-Aminobenzo[b]thiofen2-karboxylátové estery se připravují známým obecným způsobem (Beck J. R., J. Org. Chem., 37: 3224, 1972). 3-Hydroxyindol-2-karboxylátové estery se připravují známými způsoby, jako způsobem popsaným v Unangst P. C. et al., J. Heterocyclic Chem., 24: 811, 1987 a Moyer Μ. P. et al., J. Org. Chem., 51: 5106 (1986). 3-Thioindol-2-karboxylátové estery se připravují známými způsoby, jako způsobem popsaným v Unangst P. C. et al., J. Heterocyclic Chem., 24: 811, 1987; Atkinson J. G. et al., Synthesis, 480, 1988 a Nagarajan K. et al., Indián J. Chem., 20B: 672, 1981. 3-Aminoindol-2-karboxylátové estery se připravují známými způsoby, jako způsobem popsaným v Simakov S. V. et al., Chim.-Farm. Zu., 17: 1183, 1983.

-10CZ 292009 B6

Konverze sloučenin typu 1 na sloučeniny podle vynálezu je znázorněna ve schématu 1. Ester se nechá reagovat s α-halogenovaným derivátem acetonitrilu, jako bromacetonitrilem, za přítomnosti báze, jako terc-butoxidu draselného v tetrahydrofuranu, acetonitrilu nebo dimethylsulfoxidu při 0 až 80 ^CC, čímž se získá ester typu 2. Nitrilová skupina se redukuje na odpovídající primární amin a vzniklý meziprodukt 3 se cyklizuje na laktam 4. Konverze se přednostně provádí tak, že se sloučenina 2 hydrogenuje za přítomnosti katalytického Raneyova kobaltu v rozpouštědle, jako tetrahydrofuranu, za přítomnosti báze, jako triethylaminu, při zvýšené teplotě a tlaku. Za těchto podmínek se ze sloučeniny 2 získá přímo sloučenina 4. Pokud se meziprodukt 3 izoluje, jeho cyklizace na sloučeninu 4 se provádí za bazických podmínek (přednostně methoxid sodný v methanolu) nebo kyselých podmínek (přednostně kyselina polyfosforečná) při zvýšené teplotě.

Během syntézy některých sloučenin podle vynálezu může být nezbytné nebo žádoucí převést reaktivní skupiny, jako hydroxy-, amino- a karboxyskupiny, na své deriváty, což zabrání reakci na nežádoucím místě, pokud má reakce probíhat na jiném místě molekuly. Takové chráněné hydroxy-, amino- a karboxyskupiny lze snadno podrobit deprotekci za použití obvyklých způsobů. Obvykle se používá chemických zbytků, které slouží pro ochranu reaktivní skupiny, jako hydroxy-, amino- a karboxyskupiny a způsobů jejich zavádění a následného odstraňování, které jsou popsány v Greene a Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, lne., New York, USA, 1991.

Například 3-amino-, 3-hydroxy- nebo 3-thioindol-, -benzothiofen nebo -benzofuran (sloučenina 1 ve schématu 1) je možno nechat reagovat s β-halogenethylendiaminem, kde je aminoskupina chráněna vhodnou chránící skupinou (PG), jako tórc-butoxykarbonylskupinou (Boc) nebo benzyloxykarbonylskupinou (Cbz). Reakcí za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše, se získají sloučeniny typu 5. Deprotekci (tj. odstraněním skupiny PG) ze sloučeniny 5 se za standardních podmínek, tj. způsobením trifluoroctové kyseliny nebo vodné kyseliny při odstraňování BOC, nebo hydrosenolýzou při odstraňování Cbz, získají sloučeniny typu 3, které se cyklizují výše uvedeným způsobem. Jiný přístup představuje reakce sloučeniny typu 1 s ethyleniminem v alkoholickém rozpouštědle, kterou se získá přímo sloučenina 3 (viz Nagarajan K. et al., Indián J. Chem., 20B: 672, 1981).

Druhým obecným způsobem íschéma 2) je výroba sloučenin typu 4 zodpovídajících 3halogenderivátů 6. Reakcí derivátu 6 s ethylendiaminem a oxidem měďnatým v rozpouštědle, jako pyridinu, za přítomnosti báze, jako uhličitanu draselného, se získá sloučeniny typu 3, kde Y představuje NH (viz Hiremath S. P. et al., Proč. Nat. Acad. Sci., India, 60: 367, 1990). Reakcí sloučeniny 6 s cysteaminem v rozpouštědle, jako dimethylformamidu, za přítomnosti báze, jako DBU, se získá sloučenina typu 3, kde Y představuje síru. Reakcí sloučeniny 6 s nitroethanolem v rozpouštědle, jako tetrahydrofuranu, za přítomnosti báze, jako íerc-butoxidu draselného nebo hydridu draselného, se získá sloučenina typu 7. Následná redukce nitroskupiny na aminoskupinu vede ke sloučeninám typu 3, kde Y představuje kyslík. Při některých výše uvedených příkladech sloučeninu 3 není nutno izolovat ale sloučeninu 4 lze získat přímo.

Při třetím obecném postupu (schéma 3) se také používá 3-halogenderivátů. 3-Halogenderivát se nechá reagovat s primárním aminem, který v poloze β obsahuje vhodně chráněnou aminoskupinu, hydroxyskupinu nebo thiolovou skupinu, za vzniku amidové skupiny, čímž se získá meziprodukt typu 7. Deprotekci a následnou cyklizací se získá sloučenina typu 4. Při podobné sekvenci se jako výchozí látky používá 3-hydroxy-, thiol- nebo aminosloučeniny, do jejíž β polohy se zavádí aminoskupina opatřená vhodnou odstupující skupinou. Výsledné meziprodukty typu 8 se poté cyklizují na sloučeninu 4.

Sloučeniny typu 4, kde X představuje síru a Y představuje kyslík nebo NR, je možno převést na odpovídající sulfoxid a/nebo sulfon 9, působením oxidačního činidla, jako m-chlorperoxobenzoové kyseliny (m-CPBA) nebo oxaziridinu, za reakčních podmínek, které determinují

-11CZ 292009 B6 rozsah oxidace (schéma 4). Za účelem výroby sloučeniny typu 4, kde Y představuje síru, je podobnou oxidací možno získat buď sulfoxid, nebo sulfon typu 10.

Podmínky, za kterých se provádějí způsoby znázorněné ve schématech 1 až 4 a jejich varianty 5 jsou známé neboje lze snadno odvodit z podobných reakcí, které jsou odborníkům v tomto oboru známé.

Schéma 1

	^R1	YH	Z-CH(Rg)-CN
r₂			báze
			-COOMe-------------►
Rf' Jí		X	Z = I, Br, Cl
	R.	1
X	= 0,	s,	nr₇
Y	= 0,	s,	nr₈

-12CZ 292009 B6

Schéma 1 - pokračování

deprotekce

NaOMe/MeOH nebo PPA

-13CZ 292009 B6

Schéma 2

COOMe

Z = Br, Cl

-14Schéma 3

CL 292009 B6

-15CZ 292009 B6

Schéma 4

oxidace

----------»

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

2,3-Dihydro-9-methoxy[ 1 ]benzothieno[2,3-f]-l ,4-thiazepin-5(4H)-on

K roztoku methyl-3-chlor-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylátu (500 mg, 1,95 mmol) [připraveného reakcí známého 3-chlor-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karbonylchloridu s methanolem (J. Med. Chem., 35: 958,1992)] ve 20 ml dimethylformamidu o teplotě místnosti se přidá cysteamin-HCl (885 mg, 7,79 mmol) a poté l,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en (DBU, 2,33 ml, 15,58 mmol). Reakční směs se 1,5 hodiny míchá při teplotě místnosti, poté zahřeje na 70 °C a zředí ethylacetátem. Ethylacetátová směs se promyje vodnou kyselinou chlorovodíkovou, vodou a vodným roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší síranem hořečnatým, přefiltruje a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku. Surový produkt se překrystaluje z hexanu a ethylacetátu. Získá se 2,3-dihydro-9-methoxy[l]benzothieno[2,3-f]-l,4-thiazepin-5(4H)-on (výtěžek 74 %) o teplotě tání 209 až 209,5 °C.

-16CZ 292009 B6

Příklad 2

2.3- Dihydro[ 1 ]benzothierio[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5(4H)-on

Směs methylesteru 3-(kyanomethyloxy)benzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny (405 mg, 1,64 mmol) [J. Hetero. Chem., 12: 1037, 1975], 0,5 ml triethylaminu a 0,50 g RaCo v 50 ml tetrahydrofuranu se za tlaku vodíku 4644 kPa zahřívá na 100 °C. Reakční směs se zkoncentruje za sníženého tlaku. Po sloupcové chromatografii za použití elučního gradientu hexan : ethylacetát 1 : 1 až 100% ethylacetát se získá 2,3-dihydro[l]benzothieno[2,3-f]-l,4-oxazepin-5(4H)-on (výtěžek 55 %) o teplotě tání 244 až 245 °C.

Příklad 3

2.3- Dihydro-9-methoxy[l]benzothieno[2,3-f]-l,4-thiazepin-5(4H)-on-l-oxid

Směs 2,3-dihydro-9-methoxy[l]benzothieno[2,3-f]-l,4-thiazepin-5(4H)-onu (200 mg, 0,75 mol) a NaBO₃.4H₂O (116 mg, 0,75 mmol) v 18 ml kyseliny octové se míchá přes noc při teplotě místnosti a poté přefiltruje. K filtrátu se přidá 60 ml vody. Filtrací se získá 2,3-dihydro9-methoxy[l]benzothieno[2,3-f]-l,4-thiazepin-5(4H)-on-l-oxid (výtěžek 69 %) o teplotě tání 215 až 216 °C (za rozkladu).

Příklad 4

3.4- Dihydro-9-methoxy-6-methyl-2H-l,4-oxazepino[6,7-b]-indol-5(6H)-on

A. Methyl-3-(kyanomethoxy)-5-methoxy-l-methyl-lH-indol-2-karboxylát

Suspenze terc-butoxidu draselného (3,2 g, 29 mmol) v 60 ml dimethylsulfoxidu se po částech smísí s methyl-3-hydroxy-5-methoxy-l-methyl-lH-indol-2-karboxylátem (5,6 g, 24 mmol, Unangst P. C. et al., J. Heterocyclic Chem., 24, 811, 1987). Výsledná směs se 15 minut míchá a přikape se k ní chloracetonitril (4,8 ml, 5,7 g, 76 mmol). Vzniklá směs se 90 minut zahřívá na 80 °C, ochladí a přidá k 800 g směsi ledu a vody. Vysrážená pevná látka se odfiltruje, promyje 10% methanolem ve vodě a překrystaluje z vodného acetonitrilu. Získá se 3,9 g (60%) produktu o teplotě tání 136 až 137 °C.

B.

Směs methyl-3-(kyanomethoxy)-5-methoxy-l-methyl-lH-indol-2-karboxylátu (0,60 g, 2,2 mmol) a triethylaminu (0,40 ml, 0,29 g, 2,9 mmol) ve 35 ml tetrahydrofuranu se v tlakové reakční nádobě nechá reagovat s katalytickým Raneyovým kobaltem (0,40 g). Reakční nádoba se natlakuje vodíkem (4053,3 kPa) a 10 hodin zahřívá na 80 °C. Ochlazená reakční směs se přefiltruje a filtrát se odpaří. Olejovitý zbytek se rozpustí v 50 ml methanolu a k methanolickému roztoku se přidá methoxid sodný (0,80 g, 15 mmol). Vzniklá směs se 3 hodiny zahřívá ke zpětnému toku, ochladí a odpaří. Zbytek se rozdělí mezi 75 ml ethylacetátu a 150 ml vodného roztoku chloridu sodného. Vodná vrstva se několikrát extrahuje čerstvým ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se promyjí vodným roztokem chloridu sodného, vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Zbytek, surový produkt, se přečistí mžikovou chromatografií na silikagelu za použití 5% methanolu v dichlormethanu jako elučního činidla. Získá se 0,18 g (33 %) produktu. Vzorek má po překrystalování ze směsi ethylacetátu a hexanu teplotu tání 184 až 186 °C.

-17CZ 292009 B6

Příklad 5

2,3-Dihydro-lH-benzothieno-[3,2-e]-l,4-diazepin-5-on

Hydrochlorid methylesteru 3-(2-aminoethylamino)benzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny Roztok 2-(4,5-dihydro-lH-imidazol-2-yl)benzenthiolu (1,00 g, 5,62 mmol) [Hegen H. Fleig H., Justus Liebigs Ann. Chem., 11: 1994, 1975] a chlormethylacetátu (610 mg, 5,62 mmol) v 15 ml methanolu se 90 minut zahřívá ke zpětnému toku. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a přefiltruje. Filtrát se zkoncentruje do sucha a zbytek se rozpustí v horkém chloroformu. Po několika hodinách se shromáždí vzniklá sraženina, která se vysuší. Z matečného louhu se získá druhá frakce krystalického produktu. Získá se hydrochlorid methylesteru 3—(2— aminoethylamino)benzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny v celkovém výtěžku 61 % o teplotě tání 219 až 220 °C.

2.3- Dihydro-lH-benzothieno-[3,2-e]-l,4-diazepin-5-on

Roztok hydrochloridu methylester 3-(2-aminoethylamino)benzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny (339 mg, 1,18 mmol) a čerstvě připravený methoxid sodný (ze 134 mg, 2,48 mmol, sodíku) v 5 ml methanolu se 18 hodin zahřívá ke zpětnému toku. Reakční směs se ochladí, zneutralizuje 25 ml 1M kyseliny chlorovodíkové a 1 hodinu chladí na 0 °C. Vzniklá žlutá krystalická látka se odfiltruje a několik hodin suší a vakua při 60 °C. Získá se 2,4-dihydro-lHbenzothieno[3,2-e]-l,4-diazepin-5-on v 64% výtěžku. Po chromatografií za použití elučního gradientu 2% methanol v ethylacetátu až 5% methanol v ethylacetátu se získá analyticky čistý

2.3- dihydro-lH-benzothieno[3,2-e]-l,4-diazepin-5-on o teplotě tání 210 až 212 °C.

Příklad 6

2.3- Dihydro-9-methoxy-l H-benzothieno-[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5-on

Methylester 3-kyanomethoxy-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny

K roztoku methyl-3-hydroxy-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylátu (1,00 g, 4,2 mmol) [Connor et al., J. Med. Chem. 35: 959, 1991] ve 20 ml dimethylsulfoxidu o teplotě místnosti se přidá /erc-butoxid draselný (494 mg, 4,41 mmol) a poté bromacetonitril (878 μΐ, 12,58 mmol). Výsledná směs se 1,5 hodiny míchá při teplotě místnosti a poté nalije do ethylacetátu a 1M kyseliny chlorovodíkové. Organická vrstva se promyje 1M kyselinou chlorovodíkovou a poté několika dávkami vodného roztoku chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Z filtrátu se za sníženého tlaku odstraní rozpouštědlo a zbytek se překrystaluje ze směsi ethylacetátu a hexanu. Získá se 413 mg produktu. Z matečného louhu lze získat další frakci (112 mg). Teplota tání: 159,5 až 160 °C.

2,3-Dihydro-9-methoxy-l H-benzothieno-[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5-on

Roztok methylesteru 3-kyanomethoxy-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny (2,5 g, 9,0 mmol) v 50 ml tetrahydrofuranu se zahřívá k intenzivnímu zpětnému toku, rychle se k němu přidá boran-dimethylsulfidový komplex (9,0 ml, 90,2 mmol) a v zahřívání se pokračuje dalších 25 minut, přičemž se doplňuje odpařený tetrahydrofuran. Ke směsi se přidá další dávka boran-dimethylsulfidového komplexu (4,0 ml) a v zahřívání se pokračuje dalších 10 minut. Reakční směs se ochladí na 0 °C a opatrně se k ní přidá 6M kyselina chlorovodíková. Dojde k vývoji plynného vodíku a teplota reakční směsi se zvýší. Vyloučená sraženina se odfiltruje, promyje vodou a suší přes noc a vakua.

-18CZ 292009 B6

Získaná pevná látka (2,3 g, 8,2 mmol) se přidá k čerstvě připravenému roztoku methoxidu sodného (z 1,9 g, 82,0 mmol, sodíku) ve 40 ml methanolu. Reakční směs se 2 hodiny zahřívá na 50 °C, poté 2 hodiny ke zpětnému toku a ochladí na teplotu místnosti. Vyloučená sraženina se shromáždí, promyje chladným methanolem a poté chladným diethyletherem a suší přes noc za vakua. Získá se 1,18 g (52 %) produktu. Analytický vzorek 2,3-dihydro-9-methoxy-lHbenzothieno-[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-onu má po překrystalování ze směsi ethylacetátu a hexanu teplotu tání 264 až 265 °C.

Příklad 7

2,3-Dihydro-9-methoxy-6-oxid-lH-benzothieno-[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-on

K suspenzi 2,3-dihydro-9-methoxy-lH-benzothieno-[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-onu (1,00 g, 4,0 mmol) ve 100 ml teplého methanolu se přidá 30% peroxid vodíku (8,0 ml, 80 mmol) a poté oxid seleničitý (445 mg, 4,01 mmol). Reakční směs se 3 hodiny míchá při teplotě místnosti, poté 1,5 hodiny zahřívá na 30 °C a 2 hodiny na 40 °C a ochladí na -40 °C. Vyloučená sraženina se chromatografuje za použití 5% methanolu v ethylacetátu se zvyšující se polaritou až na methanol: ethylacetát v poměru 1 : 1 jako elučního činidla. Získá sé 338 mg produktu. Analytický vzorek 2,3-dihydro-9-methoxy-6-oxid-l H-benzothieno-[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5onu, který se získá překrystalováním ze směsi methanolu a ethylacetátu, má teplotu tání 273 až 274 °C.

Příklad 8

2,3-Dihydro-9-methoxy-2-methyl-lH-benzothieno-[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-on

Methylester 3-(l-kyanoethoxy)-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny

K roztoku methyl-3-hydroxy-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylátu (1,00 g, 4,2 mmol) [Connor et al., J. Med. Chem. 35: 958, 1992] ve 20 ml dimethylsulfoxidu o teplotě místnosti se přidá Zerc-butoxid draselný (494 mg, 4,41 mmol) a poté 2-chlorpropionitril (1,1 ml, 12,6 mmol). Výsledná směs se 1,5 hodiny míchá při teplotě místnosti, 3 hodiny zahřívá na 82 °C a poté nalije do ethylacetátu a 1M kyseliny chlorovodíkové. Organická vrstva se promyje 1M kyselinou chlorovodíkovou a poté několika dávkami vodného roztoku chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým a přefiltruje. Z filtrátu se za sníženého tlaku odstraní rozpouštědlo a zbytek se překrystaluje ze směsi ethylacetátu a hexanu. Získá se 853 mg produktu o teplotě tání 127 až 129 °C.

2,3-Dihydro-9-methoxy-2-methyl-lH-benzothieno-[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-on

Roztok methylester 3-(l-kyanoethoxy)-5-methoxybenzo[b]thiofen-2-karboxylové kyseliny (400 mg, 1,37 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu se zahřívá k intenzivnímu zpětnému toku, přikape se kněmu boran-dimethylsulfidový komplex (1,4 ml, 13,7 mmol) a v zahřívání se pokračuje dalších 20 minut, přičemž se doplňuje odpařený tetrahydrofuran. Reakční směs se ochladí na teplotu místnosti a opatrně se k ní přidá 7,5 ml 6M kyseliny chlorovodíkové. Po 5 minutách se reakční směs ochladí na 0 °C a přidá se k ní 68,5 ml 1M hydroxidu sodného a poté ethylacetát. Vrstvy se oddělí a organická fáze se promyje vodným roztokem chloridu sodného, vysuší síranem hořečnatým, přefiltruje a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se chromatografuje za použití elučního gradientu methanol: hexan : chloroform 5 : 25 : 70 až methanol: chloroform 10 : 90 až methanol: chloroform 30 : 70. Analytický vzorek 2,3-dihydro9-methoxy-2-methyl-lH-benzothieno[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-onu se získá překrystalováním ze směsi ethylacetátu a hexanu. Teplota tání: 185 až 186 °C.

-19CZ 292009 B6

Sloučeniny podle vynálezu lze snadno formulovat za použití obvyklých ředidel a nosičů, které jsou vhodné pro perorální nebo parenterální podávání lidem a zvířatům za účelem léčení chorob, jako zánětů, zejména arthritis apod. V následujících příkladech je ilustrována příprava obvyklých farmaceutických formulací.

Příklad 9

Příprava 250mg tobolek

2,3-Dihydro-9-izopropoxy-7-chlor-lH-benzothieno[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-on (250 mg) se mísí se 150 mg laktózy a 150 mg kukuřičného škrobu, dokud nevznikne homogenní směs. Touto směsí se plní želatinové tobolky. Takové tobolky se při léčení arthritis podávají perorálně v počtu 1 až 3 za den.

Příklad 10

Formulace perorální suspenze

Přísada	Množství
2,3-Dihydro-8-ethyl-10-trifluormethyl-6-oxid-l H-benzothieno-[2,3-f]-l ,4-oxazepin-5-on	500 mg
Roztok sorbitolu (70% N.F.)	40 ml
Benzoát sodný	150 mg
Sacharin	10 mg
Třešňové aroma	50 mg
Destilovaná voda	q.s. do 100 ml

Roztok sorbitolu se přidá do 40 ml destilované vody a ve vzniklé směsi se suspenduje oxazepinon. K získané suspenzi se přidá sacharin, benzoát sodný a aroma. Objem se destilovanou vodou doplní do 100 ml. Každý mililitr suspenze obsahuje 5 mg oxazepinonu. Tato perorální formulace ideálně slouží při léčení zánětů v pediatrii.

Příklad 11

Příprava parenterálních roztoků

V roztoku 700 ml propylenglykolu a 200 ml destilované vody pro injekce se rozpustí 20,0 g 2,3dihydro-7-dimethylamino-lH-benzothieno-[3,2-e]-l,4-diazepin-5-onu. Hodnota pH roztoku se kyselinou chlorovodíkovou upraví na 5,5 a objem roztoku se destilovanou vodou doplní na 1000 ml. Formulace se sterilizuje a plní sejí ampulky, z nichž každá obsahuje 2,0 ml formulace (představující 40 mg aktivního diazepinonu). Naplněné ampulky se uzavřou. Formulace se podává intravenózně pacientům, kteří trpí zánětem nebo AIDS.

Příklad 12

Příprava topického krému

500 mg 2,3-dihydro-7-ethoxybenzofurano-[2,3-f]-l,4-oxazepin-5-onu se smísí s 15 g cetylalkoholu, 1 g laurylsulfátu sodného, 40 g kapalného silikonu D. C. 200 (na trhu od firmy Dow Coming Co., Midland, Michigan, USA), 43 g sterilní vody, 0,25 g methylparabenu a 0,15 g propylparabenu. Výsledná směs se za konstantního míchání zahřeje na asi 75 °C, poté ochladí na teplotu místnosti, při níž ztuhne. Přípravek se aplikuje na povrch kůže osoby, která trpí zánětem.

Claims

1,4-diazepin-5-on.

1. Heterocyklické sloučeniny typu benzothiofen-, benzofuran- a indolthiazepinonu, -oxazepinonu a -diazepinonu obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami, kde ve vzorci I

R], R₂, R3 a R4 jsou každý nezávisle vodík, hydroxy, halogen, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku, benzyloxy, trifluormethyl, nitro nebo -NR₈R₉, kde Rg a R₉ jsou každý nezávisle vodík, nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku,

R₅ a Ré jsou každý nezávisle vodík, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo fenyl,

X je O, S(O)_n nebo NR₇,

Y je O, S(O)_n nebo NR_g,

2. Heterocyklická sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce I, kde Rj, R₂, a R4 jsou atomy vodíku.

2) jestliže X je NH, Y je NH, Ri je H, R₃ je H a R4 je H, potom R₂ není methoxy, nebo ethoxy a

3. Heterocyklická sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce I, kde R₂ je vodík, nebo alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku, X je O, S(O)_n nebo NR₇; Y je O nebo S(O)_n, R₇ je vodík, nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, a n je 0,1, nebo 2.

3) jestliže X je NH, Y je S, potom alespoň jeden z R_b R₂, R3, a R4, není H.

4. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro-9-methoxy[l]benzothieno[2,3f]-l ,4-thiazepin-5(4H)-on.

5. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro[l]benzothieno[2,3f]-l,4oxazepin-5-(4H)-on.

-21CZ 292009 B6

6. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro-9-methoxy[l]benzothieno[2,3f]-l,4-thiazepin-5(4H)-on-l-oxid.

7. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 3,4-dihydro-9-methoxy-6-methyl2H-l,4-oxazepino[6,7b]indol-5(6H)-on.

8. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro-lH-benzothieno[3,2e]~

9. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro-9-methoxy-lH-benzothieno[2,3f]-l ,4-oxazepin-5-on.

10. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro-9-methoxy-6-oxid-lHbenzothieno[2,3f]-l,4-oxazepin-5-on.

11. Heterocyklická sloučenina podle nároku 3, kterou je 2,3-dihydro-9-methoxy-2-methyl1 H-benzothieno[2,3f]-l ,4-oxazepin-5-on.

12. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství heterocyklické sloučeniny podle nároku 1 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.