CZ292703B6 - Mutantní proteiny lidského interleukinu-4 - Google Patents
Mutantní proteiny lidského interleukinu-4 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ292703B6 CZ292703B6 CZ19963848A CZ384896A CZ292703B6 CZ 292703 B6 CZ292703 B6 CZ 292703B6 CZ 19963848 A CZ19963848 A CZ 19963848A CZ 384896 A CZ384896 A CZ 384896A CZ 292703 B6 CZ292703 B6 CZ 292703B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- amino acid
- mutant
- hil
- protein
- fermentation
- Prior art date
Links
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 54
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 54
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 4
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 4
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 4
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 His Chemical compound 0.000 description 3
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101100069857 Caenorhabditis elegans hil-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-5-ethoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCOC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyacetic acid;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound OCC(O)=O.CC(O)C(O)=O XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000012657 Atopic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101100484521 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) atpF gene Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710096444 Killer toxin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 101000930504 Macrovipera lebetina Disintegrin lebestatin Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100110710 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) atpH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 101150090348 atpC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099875 atpE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N l-leucine l-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N leuprolide acetate Chemical compound CC(O)=O.CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N 0.000 description 1
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000009116 palliative therapy Methods 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 108700001787 polyethylene glycol-modified interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L potassium tetrathionate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Obesity (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká mutantních proteinů lidského interleukinu-4 jako antagonistů nebo parciálních agonistů lidského interleukinu-4, které vedle výměn za známé přírodní aminokyseliny v pozicích 121, 124 nebo 125 mají zaveden alanin v poloze 2.ŕ
Description
Mutantní proteiny lidského interleukinu-4
Oblast techniky
Vynález se týká nových mutantních proteinů hIL-4, způsobu jejich výroby a jejich použití, obzvláště při nepřiměřených, chybně řízených imunitních reakcích a autoimunitních chorobách.
Dosavadní stav techniky
ZPCT WO 93/10235 jsou již známé terapeutické prostředky, které jsou nebo obsahují antagonisty nebo parciální agonisty hIL-4, přičemž antagonisty nebo parciální agonisty jsou mutantní proteiny hIL-4.
Lidský interleukin—4 (hIL—4) je jedním z řady početných cytokinů, které indukují a koordinují proliferaci, zrání, přežívání a diferenciaci lymfoidních a meyloidních buněk. Obzvláště se hIL-4 podílí na imunitní reakci mediované IgE a přímo urychlují proliferaci thymocytů a aktivovaných T-buněk. Bylo možné identifikovat vysoce afinní receptorový protein pro IL-4 o MR 140 000, který podle sekvence cDNA sestává z 800 aminokyselinových zbytků. Ten patří do nedávné popsané skupiny receptorů, které se označují jako nadrodina hematopoietin-receptorů.
Sekvence aminokyselin zralého hIL-4 sestává ze 129 zbytků, jestliže se za základ vezme klonová cDNA. Tato cDNA se exprimuje vE. coli a kvasinkách. Z těchto zdrojů se může získat rekombinantní IL-4 s vysokou biologickou aktivitou.
Již z dřívější doby je známá monoklonální protilátka, která oproti lidskému interleukinu-4 vykazuje antagonistické vlastnosti. Tato protilátka obsahuje jeden fragment Fab a produkuje ho hybridomová linie člověk-člověk. také jedna hybridomová linie z buněk krysy imunizované (ne)-glykosylovaným lidským IL-4 produkuje monoklonální protilátku proti hIL-4.
Na základě role interleukinu 4 při alergických procesech je možné očekávat, že látky, které procesy vyvolané interleukinem-4 inhibují nebo lidskému hIL-4 konkurují, přeruší řetěz reakcí vyvolávajících nemoc.
vDE 41 37 333 AI se popisují mutantní proteiny hIL-4, u nichž jsou v jedné nebo v několika pozicích 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 nebo 128 u divokého typu přirozeně se vyskytující aminokyseliny (aminokyselin) nahraženy jednou nebo několika možnými přírodními aminokyselinami. Tyto mutantní proteiny jsou antagonisty nebo částečně agonisty lidského ILr4.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká mutantních proteinů hIL-4, které jsou antagonisty nebo částečnými agonisty lidského interleukinu-4, které mají navíc k výměně (výměna) za přírodní aminokyseliny na pozicích 121, 124 nebo 125 zaveden alanin v poloze 2 proteinu hIL-4. Tyto modifikace se provádějí ke zvýšení stability mutantního proteinu hIL-4, k prodloužení biologického poločasu života nebo k usnadnění výrobního nebo purifikačního procesu.
Ktomu se v jedné nebo v několika pozicích, na kterých se aminokyseliny přirozeně se vyskytující v divokém typu, deletují, případně jsou nahraženy jinými aminokyselinami, nebo se zavedou dodatečně aminokyseliny.
-1 CZ 292703 B6
V rámci vynálezu znamenají aminokyseliny obecně
| Ala | L-alanin |
| Arg | L-arginin |
| Asn | L-asparagin |
| Asp | L-kyselina asparagová |
| Cys | L-cystein |
| Gin | L-glutamin |
| Glu | L-kyselina glutamová |
| His | L-histidin |
| lle | L-izoleucin |
| Leu | L-leucin |
| Lys | L-Lysin |
| Met | L-methionin |
| Pro | L-prolin |
| Phe | L-phenylanin |
| Ser | L-serin |
| Thr | L-threonin |
| Trp | L-tryptophan |
| Tyr | L-tyrosin |
| Val | L-valin |
přičemž ke zjednodušení je možné upustit od značení konfigurace.
Výhodné jsou mutantní proteiny hIL-4, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin), aminokyselina 121 (arginin) a aminokyselina 125 (serin) v libovolné kombinaci vyměněna za některou z možných přirozených aminokyselin a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.
Obzvláště výhodné provedení z této skupiny jsou mutanty, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin), aminokyselina 121 (arginin) a aminokyselina 125 (serin) v libovolné kombinaci za kyselinu asparagovou nebo glutamovou a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.
Výhodnou formou provedení je rovněž výměna aminokyseliny 121 (arginin) a aminokyseliny 125 (serin) za přirozeně se vyskytující aminokyselinu, s výhodou kyselinu asparagovou nebo glutamovou a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.
Obzvláště výhodné jsou dále mutantní proteiny hIL-4, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin) vyměněna za přirozeně se vyskytující aminokyselinu, a 0 až jedna další aminokyselina na pozicích 121 a nebo 125 výměna za některou zmožných aminokyselin a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.
Z této skupiny jsou obzvláště výhodné mutantní proteiny hIL-4, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin) vyměněna za kyselinu asparagovou nebo glutamovou a pozice 121 za některou z možných aminokyselin, s výhodou za kyselinu asparagovou nebo glutamovou a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.
Provedení N-koncové modifikace pro výše jmenované příklady je inzerce aminokyseliny Ala mezi N-koncový methionin a přirozený N-terminus mutantního proteinu hIL-4.
Příklady takového exprimovaného produktu jsou:
Ala(-l)-Tyr(124)Asp
Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp
Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)-Ser( 125)Asp
Ala(-l)-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp
Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp
-2CZ 292703 B6 hIL-4 je možné vyrábět jako rekombinantní protein (rhIL-4), příkladně vE. coli. Přitom vytvořený protein se nechá solubilizovat, renaturovat a izolovat, rhIL-4 pak má vysokou specifickou biologickou aktivitu, která se může stanovit příkladně měřením syntézy/proliferace DNA aktivovaných T-buněk nebo exprese CD23 aktivovaných B-buněk [srovnej Kruše, N. et al. (1991) FEBS Lett. 286, 58 - 60; Kikutani, H. et al. (1986) Cell 47, 657 - 665].
K přípravě cDNA, která obsahuje oblast DNA, která kóduje maturitní oblast hIL-4, nebo které kódují matumí oblast hIL-4, se odkazuje na Yokota, T., Otsuka, T., Mosmanna, T., Banchereua, J., DeFrance, T., Blanchard, D., De Vries, J.E. Lee, F. a Arai, K.I. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 5894 - 5898 a tam uvedenou literaturu. V uvedené souvislosti se jako „cDNA, které kódují matumí oblast hIL4“ rozumí také cDNA, které při přibližně stejném počtu párů bází přestavují mutanty cDNA uvedené podle konkrétního stavu techniky, pokud jsou jimi očekávané mutantní hEL-4 rovněž antagonisty nebo částečnými agonisty.
Z hlediska průběžného číslování oblasti DNA, kódující matumí oblast hIL-4 se zde postupuje podle Carr. C. et al., Biochemistry 1991, 30,1515 - 1523.
cDNA, která kóduje matumí oblast hIL-4, se může získat vyštěpením fragmentu EcoRV/BamHI z cDNA, vyrobené genovou technologií (příkladně British Bio-Technology Ltd., Oxford, England). Fragment DNA se za přídavku syntetických oligonukleotidů, příkladně 5 - CATGCACAAGTGCGAT a 5 - ATCGCACTTGTG, které obsahují první 4 kodony aminokyselin interleukinu-4 a navíc iniciační kodon methioninu, integruje do expresního vektoru, příkladně mezi restrikční místa Ncol a BamHI expresního vektoru pRTS pRC 109 [srovnej Weigel, U„ Meyer, M. a Sebald W. (1989) Eur. J. Biochem. 189,295 - 300],
Varianty sekvencí aminokyselin IL-4 se vyrábějí zavedením vhodných změněných nukleotidů do DNA kódující IL-4 nebo syntézou in-vitro požadované formy IL-4. K takovým variantám patří příkladně delece nebo inzerce nebo substituce zbytků v rámci sekvence aminokyselin IL-4. Přitom je k dosažení konečné sestavy přípustná každá kombinace delece, inzerce a substituce, za předpokladu, že konečná konstrukce vykazuje požadované znaky. Změny aminokyselin mohou měnit také post-translační úpravy IL-4: příkladně se mohou inzercí, delecí nebo jiným ovlivněním hlavní sekvence přirozeného IL-4 změnit počet nebo pozici glykosylačních míst, vlastnosti pro zachycení na membráně a/nebo intracelulámí lokalizace IL-4.
Při konstrukci variant sekvencí aminokyselin IL-4 závisí lokalizace mutovaných míst a druh mutace na měnící se vlastnosti nebo měnících se vlastnostech IL-4. Mutovaná místa se mohou měnit jednotlivě nebo v řadě, tak příkladně nejprve substitucí (1') s konzervativně volenými aminokyselinami a potom s radikálnějšími možnostmi volby v závislosti na dosahovaných výsledcích, (2) delecí aminokyselinového zbytku nebo inzercí (3) zbytku v blízkosti lokalizovaného místa.
Vhodnou metodou k identifikaci určitých zbytků nebo zbytků IL-4 jako výhodných míst pro mutagenezi je „Alanin-Scaning-Mutagenese“, popsaná autory Cunningham a Wells (Science, 244; 1081 - 1085, 1989). Přitom se zbytek nebo skupina zbytků target identifikuje (příkladně nabité zbytky jako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a neutrálními nebo negativně nabitými aminovými kyselinami (nejlépe alanin nebo polyalanin), aby se tak ovlivnila interakce amino kyselin se sousedním okolním vodným polem uvnitř nebo mimo buňku. Oblastí, které citlivě funkčně reagují na substituce, se potom připraví zavedením dalších nebo jiných variant na místa substituce nebo pro místa substituce. To znamená, že je sice místo pro zavedení změn v sekvenci aminových kyselin předem určeno, ale druh změny jako takové nemusí být předem určen.
K optimalizaci provedení mutace na určité místě se tedy může na cílový kodon nebo v cílové oblasti provést způsobem „Ala-Scanning“ nebo náhodná mutageneze, přičemž exprimované varianty IL-4 se v zájmu požadovaných vlastností přezkoumají z hlediska optimální kombinace.
-3CZ 292703 B6
Při konstrukci variant sekvencí aminokyselin jsou tedy dvě hlavní proměnné: místo mutace a druh mutace.
Velikost delecí v sekvenci aminokyselin činí zpravidla asi 1 až 30 zbytků, s výhodou 1 až 10 zbytků a v normálním případě loží za sebou. V normálním případě postihují delece bezprostředně vedle sebe ležící zbytky aminokyselin.
Počet po sobě následujících delecí se volí tak, aby terciární struktura IL-4 v dotčené oblasti, 10 příkladně cysteinové disulfidy, struktura β-skládaného listu nebo alpha-helix zůstala zachována.
K inzercím v sekvenci aminokyselin patří fuze s aminovou a/nebo karboxylovou koncovou skupinou s délkou jediného zbytku až po polypeptidy se 100 nebo více zbytky a rovněž inzerce ležící v rámci jedné sekvence jednotlivých nebo několika zbytků aminokyselin. Inzerce ležící 15 v rámci jedné sekvence (to znamená inzerce v rámci sekvence IL-4), mohou obsahovat asi 1 až zbytků, s výhodou 1 až 5 a optimálně 1 až 3 zbytky. Příklady terminálních inzercí jsou IL-4 s N-koncovým methionylovým zbytkem, artefakt přímé exprese IL-4 v rekombinantní bakteriální buněčné kultuře, inzerce jedné nebo několika dodatečných aminokyselin mezi methioninem a přirozeným N-koncem k lepšímu odštěpení methioninu, příkladně bakteriálními 20 proteázami, a fuze heterologní signální N-koncové sekvence na N-konec molekuly IL-4 k podpoře sekrece mutamího EL-4 z rekombinantních hostitelských buněk případně fuze polyaminových kyselin, příkladně polyhistidinu k lehčí izolaci IL-4. Tyto signální sekvence se zpravidla volí z předpokládaných druhů hostitelských buněk a jsou proto jejich homology. Vhodnými sekvencemi jsou příkladně ompA, ompT, phoA, molE, amp nebo pelB pro E. coli, 25 Alpha-Faktor, amyláza, invertaza, Killer-Toxin a mellitinpepro-peptid pro kvasinkové signály a virální signály jako herpes gD pro buňky savců.
Další výhodnou signální sekvencí je přirozená signální sekvence interleukinu-4.
Obzvlášť vhodné jsou signální sekvence, které se samy odštěpí v exprimujícím organismu, takže mutantní protein interleukinu-4 vykazuje přirozený N-konec.
Výhodnými produkty exprese po odštěpení signálních sekvencí jsou:
Tyr(124)Asp
Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp
Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp
Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp
Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp
K dalším variantám inzerce IL-4, patří fuze imunogenních peptidů na N- nebo C- konec IL—4, příkladně bakteriální polypeptidy jako beta-laktamáza nebo enzym kódovaný E.coli-trplokusem nebo kvasinkový protein, a také fuze na C-konci s proteiny s dlouhým poločasem života jako příkladně imunoglobulinové konstantní oblasti (nebo jiné imunoglobulinové oblasti), 45 albumin nebo ferritin - srovnej popis ve WO 89/02922 (zveřejněný 6. dubna 1989).
Další skupinou variant jsou varianty se substitucí aminokyseliny. U těchto variant se nejméně jeden aminový zbytek v molekule IL-4 nahradí jiným zbytkem.
Přirozeně se vyskytující zbytky se na základě společných charakteristik bočních řetězců dělí do tříd:
1) hydrofobní: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutrální hydrofilni: Cys, Ser, Thr;
3) kyselé: Asp, Glu;
-4CZ 292703 B6
4) bazické: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
5) zbytky s vlivem na orientaci řetězce: Gly, pro a
6) aromatické: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativní substituce zahrnují výměnu zástupce jedné třídy za zástupce jiné třídy.
Substituce aminokyselin se mezi jiným použije při změnách přirozeně glykosylační struktury polypeptidu. „Změna“ znamená deleci jedné nebo několika uhlovodíkových struktur v přirozeném IL-4 a/nebo zavedení jednoho nebo několika glykosylačních míst, které s v přirozeném IL-4 nevyskytují.
Výhodnou používanou možností ke zlepšení doby poločasu života proteinů cirkulujících in vivo je jejich konjugace na polymer, který jim propůjčuje delší dobu poločasu života. Tak se příkladně osvědčila konjugace polyethylenglykolu (PEG) na Cl-NH jako vynikající možnost k prodloužení doby poločasu života. PEG je neimunogenní, lineární, nenabitý polymer se třemi molekulami vody na molekulu ethylenoxidu, takže se hydrodynamické vlastnosti konjugované molekuly mohou dramaticky měnit (Maxfield et al., Polymer, 16:505-509 (1975); Bailey, F.E., et al., v: Nonionic surfactants [Schick. M. J., Hrsg.J strany 794-821, 1967). Řada terapeuticky používaných enzymů se s cílem účinného zvýšení doby poločasu života in vivo spojiva s PEG (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et. al., Cancer Biochem. Biphysl., 7:175-186, 1984). Vazba PEG-IL-2 (Interleukin-2) nemá jenom prodloužit cirkulační dobu přežití, ale také zvýšit jeho potenci (Katre, N. V. et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 84:1487-1491 (1987); Goodson, R. et al., Bio/Technology, 8:343-346 (1990). Pro vazby PEG na jiné molekuly je referováno o snížení imunogenity a toxicity (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem, 252:3598-3581,1977).
IL-4 se může také uzavřít do mikrokapslí, vyrobených příkladně koacervačními technikami nebo „polymerací na fázovém rozhraní“ (interfacial polymerization“) (příkladně hydroxymethylcelulózové nebo želatinové mikrokapsle a poly-(methylmetakrylátové) mikrokapsle)) vkoloidních systémech uvolňujících léčiva (příkladně liposomy, albuminové kuličky, mikroemulze, nano-částice a nano-kapsle) nebo v makroemulzích. Takové techniky uvádí Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Osol, A., vydání (1980).
Preparáty IL-4 jsou také vhodné pro přípravu protilátek, jako standardy pro kvantitativní imunoanalytické stanovení IL-4 (příkladně značení IL—4 k použití jako indikátor pro radioimunoanalýzu, pro ELISA stanovení, pro kvantitativní stanovení receptoru IL-4, pro afinitní purifíkační techniky) a pro kvantitativní stanovení receptoru kompetitivním testem při značení radioaktivním jodem, enzymy, fluorofory, „spin labels“ a tak dále.
Protože předpověď vlastností určité varianty IL-4 je obtížná, je samozřejmé, že je nutný určitý „screening“ získané varianty, aby bylo možné dosáhnout optimální varianty. Tak se příkladně měří změna v imunologickém charakteru molekuly IL-4, příkladně afinita k určitým protilátkám pomocí kompetitivní imunoanalýzy. Změny varianty se vyšetřují z hlediska snížení nebo zesílení jejich aktivity - ve srovnání s aktivitou zjištěnou ve stejném vzorku pro přirozený IL-4. Další případné změny vlastností proteinů nebo polypeptidů - jako příkladně redox- nebo tepelná stabilita, hydrofobicita, citlivost vůči proteolytické degradaci, stabilita v buněčných strukturách rekombinantních organismů nebo v plazmě nebo také tendence agregovat s „nosičem“ nebo agregovat do multimerů - se stanovují metodami, odpovídajícími stavu techniky.
Terapeutické přípravky a podávání IL-4
Sloučeniny podle vynálezu inhibují buďto procesy zprostředkované interleukinem-4, nebo konturují hIL-4. Jsou proto vhodné k ošetření nepřiměřených případně chybně řízených imunitních reakci a chorob autoimunity. K tomu patří také imunní deficience jak primárního, tak
-5CZ 292703 B6 i sekundárního druhu. Navíc se může antagonista použít jak při transplantacích, tak i při paliativní terapii tumorových onemocnění.
Patří k nim příkladě:
- alergie (blokování reakce primární a zprostředkované IgE, desensibilace známých alergií, atopická onemocnění, úlevy při atacích astma, hyper syndrom IgE).
- transplantace (redukce exprese HLA-DR při transplantacích orgánů, suprese reakce štěpu proti hostiteli, použití při čištění kostní dřeně)
- leukemie a tuhé tumory exprimuj ící receptor pro IL—4 (redukce nepřiměřené autokrinní produkce IL—4, potlačení růstu tumoru)
- protiregulaci při nadprodukci trombocytů
- terapie poruch srážlivosti (přes monocytový blok)
- použití při poruchách výměny lipidů
- náprava při poruchách hospodaření s cukry
- zlepšení imunního statusu při infekcích (sepse).
Na základě své dobré rozpustnosti ve vodě se může mutantní protein IL—4 použít jak systematicky, tak i lokálně, to znamená topicky, mimo jiné inhalačně jako spray. Možná je i receptura jako depotní preparát. Při všech formách terapie je možné zvažovat jak krátkodobou terapii, tak i trvalou terapii.
Terapeutické přípravky antagonistů IL-4 se připravují ke skladování tak, že se antagonista IL-4 po dosažení požadovaného stupně čistoty smíchá s fyziologicky přijatelnými nosiči (carrier), pomocnými látkami nebo stabilizátory (Remingtons Pharmaceutical Sciences, na uvedeném místě) ve formě lyofílizátu nebo vodných roztoků. Přijatelné nosiče, pomocné látky nebo 30 stabilizátory nejsou pro příjemce při použitých dávkách a koncentracích toxické; patří knim pufry, jako fosfáty, citráty a jiné organické kyseliny; antioxidanty jako příkladně kyselina askorbová; nízkomolekulámí polypeptidy (méně než 10 zbytků), proteiny jako serumalbumin, želatina nebo imunoglobulin; hydrofilní polymery jako polyvinylpyrrolidon; aminokyseliny jako glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin; monosacharidy, disacharidy a jiné cukry, 35 příkladně glukóza, manoza nebo dextrin; chelatotvomé látky jako EDTA; cukerné alkoholy jako mannitol nebo sorbitol; ionty, tvořící soli jako sodík a/nebo neionické povrchově aktivní látky jako tween, pluronics nebo polyethylenglykol (PEG).
Antagonisté IL-4 k použití in-vivo musí být sterilní. Toho se snadno dosáhne filtrací přes sterilní 40 membránový filtr, buďto před, nebo po lyofilizaci a rekonstituci. IL-4 antagonisté se skladují obvyklým způsobem v lyofilizované formě nebo v roztoku.
Vhodnými příklady přípravků se zpožděným uvolňováním jsou příkladně semipermeabilní matrice zpěvných hydrofobních polymerů, které obsahují protein; u těchto matric se jedná 45 o tvarované články („shaped articles“), příkladně filmové tablety nebo mikrokapsle. Příklady matric se zpožděným uvolňováním jsou polyestery, hydrogely (příkladně poly(2-hydroxyethylmethakrylát), které popisují Langer et al., J. Biomed. mater. Res., 15:167-277 (1981) a Lander, Chem. těch., 12:98-105 (1982) - nebo poly(vinylalkohol)), polyaktidy (patent US 3 773 919, EP 58481), kopolymery kyseliny L-glutamové a gama-ethyl-L-glutamátu (Sidman et al., 50 Biopoolymers 22:547-556 (1983)), neodbouratelný ethylenvinylacetát (Langer et al., na uvedeném místě), odbouratelné kopolymery kyseliny mléčné - kyseliny glykolové jako Lupron DepotTM (injikovatelné mikrokuličky z kopolymerů kyseliny mléčné - kyseliny glykolové a leuprolidacetát) a kyseliny poly-D-(-)-3-hydroxymáselné (EP 133 988). Zatímco polymery
-6CZ 292703 B6 jako ethylenvinylacetát a kyselina mléčná - kyselina glykolová umožňují uvolňování molekul více jak 100 dní, dochází k uvolňování proteinu u některých hydrogelů v kratším časovém období. Pokud zůstávají chráněné proteiny v těle delší časové období, mohou se vlivem vlhkosti při teplotě 37 °C denaturovat nebo agregovat, v důsledku čehož dochází ke ztrátě biologické účinnosti a možných změnách imunogenity. Ke stabilizaci proteinu je možné podle mechanizmu, přicházejícího v úvahu, vyvinout účelnost strategii. Zjistí-li se příkladně, že mechanismus, který vede k agregaci, spočívá na intermolekulámí tvorbě můstků S-S v důsledku thiodisulfidové výměny, je možné dosáhnout stabilizace modifikací sulfhydrylovými zbytky, lyofilizací z kyselých roztoků, řízením obsahu kapaliny, použitím vhodných přísad a vývojem specielních kombinací polymemích matric.
K přípravkům antagonistů IL-4 se zpožděným uvolňováním patří také antagonisty IL-4 uzavřené vliposomech. Liposomy se vyrábějí známými metodami: DE 3 218 121; Epstein et al., Proč. Nati. Acad., Sci. USA, (82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proč. Nalt. Acad. Aci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; japonská patentová přihláška 83-118008; patent US 4 485 045 a 4 544 545; rovněž EP 102 324. Liposomy jsou zpravidla malého (asi 200-800 Angstrom) unilamelámího typu s obsahem lipidu více než asi 30 % molových cholesterolu, přičemž podíl se vždy optimálně přizpůsobí antagonistům IL-4. Liposomy s prodlouženou dobou cirkulace zveřejňuje patent US 5 013 556.
Další použití vynálezu se týká vestavby antagonistů IL-4 do „tvarových článků“. Ty se mohou použít k modulování nebo zabránění vzniku šoku.
Příklady provedení vynálezu
Přikladl
Odstranění potenciálních N-glykosylačních míst v mutantním proteinu hIL-4.
V přirozené sekvenci aminokyselin hIL-4 se vyskytují dvě glykosylační místa s vazbou na asparagin v pozicích aminokyselin 38 a 105. Odpovídající kodony ve strukturních genech se mohou vyměnit za kodony kyseliny asparagové. Tím při expresi genu v kvasinkových kmenech odpovídá N-glykosylace výslednému mutantnímu proteinu ML-4.
Provedení obou výměn kodonu („site-directed mutagenesis“) ve strukturním genu za vzniku genu pro mutantní protein hIL-4 se provádí metodou podle Deng a Nickoloff (Anal. Biochem. 200:81 (1992)) s použitím klonovacího vektoru pUC18. Syntetické oligonukleotidy, které jsou potřebné pro změnu strukturního genu mají následující sekvence:
a) k výměně asparaginu za kyselinu asparagovou na pozici 38:
-GCC TCC AAG GAC ACA ACT GAG-3
b) k výměně asparaginu za kyselinu asparagovou na pozici 105:
-GTG AAG GAA GCC GAC CAG AGT ACG-3
Podtržené pozice v uvedených sekvencích nukleotidů označují kodony pro kyselinu asparagovou.
Sekvenování DNA se potvrdila výměna kodonu v sekvenci nukleotidů. Změněný strukturní gen se zabuduje do expresního kvasinkového vektoru a indukuje se k expresi ve vhodných kmenech.
-7CZ 292703 B6
Příklad 2
Inzerce aminokyseliny v pozici (+2) k přípravě mutantního proteinu IL-4 bez N-koncového methioninu v E. coli
K výrobě mutantního proteinu IL-4, jemuž chybí N-koncový methionin se zavede v pozici (+2) aminokyselina, která vede k odštěpení N-koncového methioninu v E. coli specifickou aminopeptidázou pro methionin (Flinta et al., Eur. J. Biochem. 154, 193-196 1986). Ktomu účelu se rozštěpí vektor RPR9-IL4-Y124D (příklad 1) restrikčními endonukleázami Xhol a BamHI. Přitom vznikají fragment DNA dlouhý asi 450 bp, který nese sekvenční informaci pro gen IL4Y124D a krátký fragment (dlouhý asi 50 bp) z oblasti vektoru atpE, se vyčistí elektroforézou na agarózovém gelu a překlonuje se do vektoru M13mpl8 otevřeného Sáli a BamHI. Připraví se jednořetězcová DNA a podrobí se „mutagenezi in vitro“ s následujícím oligonukleotidem:
5' CTGGAGACTGCCATGGCCCACAATGCGATATCACC3'
Touto mutagenezi se zavede do pozice (+2) genu IL4Y-124D aminokyselina alanin (kodon GCC). Kromě toho se na 5'-konci genu zavede Ncol restrikční místo (CCATGG), aby se usnadnil následný screening a klonování do expresního vektoru. Screening plaků se provádí restrikční analýzou vycházející z dvouřetězcové M13 RF DNA (replikativní forma). Pozitivní klony je možné identifikovat restrikčním štěpením enzymy Ncol a BamHI. Správnost sekvence se navíc potvrdí sekvenováním.
Fragment DNA dlouhý asi 400bp se pomocí Ncol a BamHI vyštěpí ze zvoleného klonu M13mpl8, vyčistí se elektroforézou na agarózovém gelu a klonuje se do vektoru pTrc99A rozštěpeném rovněž s pomocí Ncol a BamHI (obchodně dodávaný Pharmacia P-L Biochemicals). Vektorem pAPHIOO (IL4A125D), vzniklým z tohoto klonování se transformují buňky E. coli (TG1) a selektují se na živném agaru obsahujícím ampicilin.
Exprese a purifikace proteinu vede kmutantnímu proteinu IL-4, kterému chybí N-koncový methionin.
Příklad 3
Fermentace kvasinkových buněk
Živné roztoky:
Ke kultivaci kvasinkových buněk exprimujících mutantní proteiny hIL-4 se použijí následující živné roztoky:
| Živný roztok | ||
| Použitá látka | SD2 | Sc 6 |
| Bacto Yeast dusíkatá báze | 6,7 g/1 | — |
| Yest extrakt Difco | — | 20,0 g/1 |
| Glukóza | 20,0 g/1 | 5,0 g/1 |
| KH2PO4 | 6,7 g/1 | 1,4 g/1 |
| (NH4)2SO4 | - | 2,0 g/1 |
| MgSO4 x 7 H2O | - | 0,5 g/1 |
| Odpěňovací prostředek PPG 2000 | - | 0,2 g/1 |
Použité látky se rozpustí v deionizované vodě a hodnota pH se nastaví na pH 5,5. Sterilizace se provádí po dobu 20 minut při teplotě 121 °C. Glukóza se rozpustí v 1/5 potřebného objemu
-8CZ 292703 B6 v děionizované vodě, odděleně se sterilizuje a po ochlazení se přidá k ostatnímu živnému roztoku.
Kmenové konzervy
Kmenové konzervy všech transformantů kvasinek se připraví plněním 2 ml alikvotů předkultury a skladováním v kapalném dusíku.
Předkultury
Fermentace předkultur se provádí v 1-litrových třepacích buňkách, které se plní 200 ml živného roztoku SD-2. Očkování se provádí kmenovou konzervou nebo jednotlivou kolonií z agarózové plotny SD-2. Kultury se inkubují za trvalého třepání po dobu 2 až 3 dní při teplotě 26 až 30 °C.
Fermentace hlavní kultury
Fermentace hlavní kultury se provádí za použití 10-litrových míchaných kotlových fermentorů v živném roztoku Sc-6. Očkování se provádí 3 až 5 % objemovými předkultury, přičemž se před očkováním odcentrifuguje z předkultury biomasa a suspenduje se v médiu Sc-6. Podmínky fermentace pro 10 litrů hlavní kultury jsou následující:
| Teplota Otáčky míchadla Provzdušňovací poměr Požadovaná hodnota pH | 26 až 30 °C 600 ot/min 0,5 wm 5,5 (korektuiy pomocí 5 N NaOH a 5 N H2SO4 |
Po uplynutí doby fermentace 5 hodin se kultury kontinuálně doplňují glukózou a kvasničným extraktem. Živné dávky se řídí respiračním kvocientem (hodnota RQ) kultury. Požadovaná hodnota RQ činí 1,0. Živný roztok má následující složení:
| Glukóza Yeast extrakt Difco | 500 g/1 75 g/1 |
Složky se odděleně rozpustí v děionizované vodě a stabilizují se po dobu 20 minut při teplotě 121 °C. Po ochlazení se oba roztoky spojí.
Při použití indukovatelného promotoru Gal 10 nebo derivátu promotoru Gal 10 se provádí indukce výměnou cukru v krmném roztoku z glukózy (500 g/1) na galaktrózu g/1).
Další kontrola živné dávky se potom neprovádí pomocí hodnoty RQ. Živná dávka se nastaví ručně na dvojnásobnou živnou dávku v okamžiku indukce. K indukce promotoru GallO dochází obvykle po asi 48 hodinách doby fermentace.
Získávání buněk
Po ukončení fermentace (80 až 120 hodin) se obsah fermentorů ochladí na teplotu 10 až 15 °C a v případě intracelulámí exprese se získávají kvasinkové buňky standardními centrifugačními technikami (příkladně centrifugou skyvetami). Buněčná hmota získaná po centrifugaci se kryopeletizuje přímým vkapáním do kapalného dusíku a skladuje se při teplotě -80 °C. Zpracování produktu se provádí z takto ošetřené biomasy. Při sekvenci heterologního proteinu do kultivačního média se provádí oddělení kvasinkových buněk z kultivačního média standardními centrifugačními technikami (příkladně centrifugou s kyvetami) nebo pomocí mikrofitrace s příčným prouděním (příkladně systém Filtron-Minisette). Pokud je to nutné, kultivační médium se sterilizuje. Další zpracování produktu se provádí z kultivačního média neobsahujícího buňky.
-9CZ 292703 B6
Příklad 4
Fermentace E. coli
Živné roztoky:
Kultivace kvasinkových buněk exprimujících transformanty E. coli se provádí v LB-roztocích následujícího složení:
| Bacto Tryton Bacto kvasinkový extrakt NaCl | 10 g/1 5 g/1 10 g/1 |
Složky se rozpustí v deionizované vodě a sterilizují se po dobu 20 minut při teplotě 121 °C. Před zaočkováním se k živnému roztoku sterilně přidá antibiotikum vhodné k selekci transformantů (příkladně 100mg/l Na-ampicilinu nebo 50mg/l kanamycinsulfátu v závislosti na selekčním markéru použitém ve vektoru).
Kmenové konzervy
Kmenové konzervy všech transformantů kvasinek si připraví plněním 2 ml alikvotů předkultuiy a skladováním v kapalném dusíku.
Předkultury
Fermentace předkultur se provádí v 1-litrových třepacích baňkách, které se plní 200 ml živného roztoku LB. Očkování se provádí kmenovou konzervou nebo jednotlivou kolonií z agarózové plotny LB. Kultury se inkubují za trvalého třepání po dobu 12 až 18 hodin při teplotě 30 °C.
Fermentace hlavní kultury
Fermentace hlavní kultuiy se provádí za použití 10-litrových míchaných kotlových fermentorů v živném roztoku LB. Očkování se provádí 1 až 5 % objemovými předkultury, přičemž se před očkováním odcentrifuguje z předkultury biomasa a suspenduje se v čerstvém médiu LB. Podmínky fermentace pro 10 litrů hlavní kultury jsou následující:
| Počáteční teplota | 30 °C (při použití promotorů indukovaných teplotou) 37 °C (při použití vektorů indukovaných IPGT |
| Otáčky míchadla Provzdušňovací poměr | 500 ot/min 0,5 wm |
Ke sledování růstu biomasy se v intervalech asi 1 hodiny odebírající z kultivačního roztoku sterilní vzorky a stanovuje se optická hustota při 600 nm (ÓD600). Při dosažení hustoty OD600 0,8 až 1,2 se provádí indukce kultur. V závislosti na zvoleném promotoru se indukuje následovně:
| Teplotní indukce: | Zvýšení fermentační teploty ze 30 °C na 42 °C |
| Indukce IPTG: | Sterilní přídavek izopropyl-[3-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) an 0,4 mM |
Doba indukce činí typicky 4 až 8 hodin.
-10CZ 292703 B6
Získání buněk
Po ukončení fermentace (6 až 14 hodin) se obsah fermentoru ochladí na teplotu 10 až 15 °C a buňky bakterií se získávají standardními centrifiigačními technikami (příkladně cetrifugou s kyvetami). Buněčná hmota získaná po centrifugaci se příkladně skladuje v mraženém stavu. Zpracování produktu se provádí z takto ošetřené biomasy.
Příklad 5
Exprese mutantního proteinu interleukin-4 v kvasinkových buňkách za užití konstitutivních promotorů
Kvasinkové transformanty s expresním vektorem obsahujícím gen kódující mutantní protein hIL-4 a konstitutivní promotor (příkladně Alfa-mating-faktor-promotor, promotor GAPDH, promotor TPI) se kultivují v 10-litrovém objemu při teplotě 28 °C. Během fermentace se pomocí SDS-PAGE provádí kvalitativní zkoušky na expresi mutantního proteinu hIL-4. Doba fermentace činí 96 hodin. Koncentrace biomasy, dosažená na konci fermentace, činí 27 g/1 TG. Po oddělení buněk centrifugaci (15 minut, 6500 x g, 4 °C) a sterilní filtraci se provádí čištění produktu z kultivačního média neobsahujícího buňky.
Příklad 6
Exprese mutantního proteinu interleukin-4 v kvasinkových buňkách za použití indukovatelných promotorů
Kvasinkové transformanty se expresním vektorem obsahujícím gen kódující mutantní protein hIL-4 a indukovatelný promotir (příkladně promotor Gal 10 nebo derivát promotoru Gal 10) se kultivují v 10-litrovém objemu při teplotě 28 °C. Po době fermentace 48 hodin se provádí indukce výměnou uhlohydrátu použitého v živném roztoku glukózou po galaktóze. Během fermentace se pomocí SDS-PAGE provádí kvalitativní zkoušky na expresi mutantního proteinu hIL-4. Doba fermentace činí 96 hodin. Koncentrace biomasy, dosažená na konci fermentace, činí 24g/l Tg. Po oddělení buněk sterilní filtrací (15 minut, 6500 x g, 4 °C) a sterilní filtraci se provádí čištění produktu z kultivačního média neobsahujícího buňky.
Analogicky tomuto způsobu se mohou k expresi mutantního proteinu hIL-4 použít také jiné indukovatelné promotory. V závislosti na druhu zvoleného promotoru se musí použít vhodná indukční technika.
Příklad 7
Exprese mutantního proteinu interleukin-4 v E. coli za použití indukovatelných promotorů
Transformanty E. coli s expresním vektorem obsahujícím gen kódující mutantní protein hIL-4 a teplotou indukovatelný promotor (příkladně ZaznMapL-promotor nebo derivát lambdafiLpromotor) se kultivují v 10-litrovém objemu v živném roztoku LB. Selekce buněk obsahujících vektor se provádí přídavkem 100 mg/1 Na-ampicilinu k živnému roztoku LB (= LB + živný roztok-amp). Očkování násady hlavní kultury se provádí 5 objemovými % 14 hodin staré kultivované předkultury do LB+živný roztok-amp. Teplota fermentace činí při začátku fermentace 30 °C a k indukci promotoru citlivého na teplotu se po dosažení OD600 0,8 až 1,2 zvýší na 42 °C. Během fermentace se pomocí SDS-PAGE provádí kvalitativní zkoušky na expresi mutantního proteinu hIL-4. Po době indukce 4 až 6 hodin se provede ukončení fermentace ochlazením kultivačního roztoku na teplotu 10 až 15 °C. Koncentrace biomasy,
-11CZ 292703 B6 dosažená na konci fermentace, činí asi 5 g/1 FG. Buňky E. coli se sklízí centrifugací v centrifuze s kyvetami (15 minut, 6500 x g, 4 °C), a buněčná hmota se kryopeletizuje přímým kapáním do kapalného dusíku. Purifikace produktu se provádí z takto získané biomasy.
Analogicky tomuto způsobu se mohou k expresi mutantního proteinu hIL-4 v E. coli použít také jiné indukovatelné promotory. V závislosti na druhu zvoleného promotoru se musí použít vhodná indukční technika.
ío Příklad 8
Zpracování mutantního proteinu IL-4
Rozpuštění buněk a izolace „inclusion bodies“ g vlhké hmoty E. coli z příkladu 7 se vloží do 200 ml pufru (0,1 M fosforečného pufru, pH 7,3, 0,1 % Tritonu, 1 mM EDTA, 1 pg/ml Pepstatin) a rozpustí se účinkem ultrazvuku (Branson Sonifíer B 15). „Inclusion bodies“ obsahující produkt se získají pomocí centrifugace (35 000 x g, 20 min.) a promyjí se v rozpouštěcím pufru, obsahujícím navíc 4 M močoviny.
Solubilizace a sulfitolýza produktu
Promyté „inclusion bodies“ se solubilizují ve 125 ml pufru (0,2 M Tris, pH 8,1, 8 M hydrochlorid guanidinu).
Přidají se 4 g siřičitanu sodného a 2 g kaliumtetrathionátu a reakční směs se míchá po dobu 2 hodin. Nerozpustné součásti se po ukončení reakce odstraní centrifugací (35 000 x g, 20 min.).
Gelová filtrace
Zbytek se nanese na sloupec pro gelovou filtraci (Sephacryl-S-300 HR, Pharmacia, 10 x 90 cm) a filtruje se v pufru PBS, který obsahuje 6 M hydrochloridu guanidinu s průtočným množstvím 280 ml/h. Frakce obsahující produkty se identifikují pomocí SDS-PAGE a spojí.
Renaturace
K redukci molekul se přidá β-merkaptoethanol (konečná koncentrace 15 mM). Po dvou hodinách inkubace při teplotě místnosti se násada zředí pětinásobkem vody a dialyzuje se 3 až 4 dny proti pufru (3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4,2 mM KC1, 120 mM NaCl).
Koncentrace
Dialyzovaný materiál se upraví pomocí kyseliny octové na pH 5 a vodivost se sníží přídavkem vody na < lOmS/cm. Za míchání se k násadě přidá 50 ml CM-Sepharose-FF (Pharmacia), 45 ekvilibrované 25 mM octanu amonného, Ph 5,0. Nevázaný materiál se odfiltruje a gel se plní na sloupec. Produkt se eluuje lineárním gradientem 0-1 M NaCl v 25 ml octanu amonného, pH 5,0 při průtočném množství 300 ml/h. Frakce obsahující produkt se identifikují pomocí SDS-PAGe nebo analytickou chromatografií RP.
Konečné čistění
Poolované frakce CM-Sepharozy se nanesou na sloupec Vydac C-4 (1 x 25 cm, 10 pm) ekvilibrovaný pomocí 0,1 % TFA a eluují se stoupajícím gradientem acetonitrilu. Frakce obsahující čistý produkt se spojí a lyofilizují.
- 12CZ 292703 B6
Sekvenční protokol (1) Všeobecné informace (1) Přihlašovatel:
(A) Jméno: Bayer AG (B) Ulice: Bayerwerk (C) Místo: Leverkusen (E) Země: Německo (F) Poštovní směrovací číslo: D-51368 (G) Telefon: 0214/3061455 (H) Telefax: 0214/302482 (ii) Název přihlášky: Nové mutantní proteiny hIL-4 jako antagonisty nebo částečné agonisty lidského interleukinu 4 (iii) Počet sekvencí: 5 (iv) Forma uložená v počítači:
(A) Nosič dat: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Provozní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release = 1.0, verze a 1,25 (EPA) (2) Informace o SEQ ID č. 1:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 16 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNA (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:
(C) Individuum isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:
CATGCACAAG TGCGAT (2) Informace k SEQ ID č. 2:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 12 základní bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární
-13CZ 292703 B6 (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:
(C) Individuum isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:
ATCGCACTTG TG (2) Informace k SEQ ID č. 3:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 21 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:
(C) Individuu isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:
GCCTCCAAGG ACACAACTGA G (2) Informace k SEQ ID č. 4:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 24 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:
(C) Individuu isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:
- 14CZ 292703 B6
GTGAAGGAAG CCGACCAGAG TAGG (2) Informace k SEQ ID č. 5:
(i) Sekvenční charakteristika:
(A) Délka: 36 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:
(C) Individuu isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:
CTGGAGACTG CCATGGCCCA CAAGTGCGAT ATCACC
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mutantní proteiny lidského interleukinu-4 jako antagonisty nebo parciálního agonisty lidského interleukinu-4, které vedle výměn za známé přírodní aminokyseliny v pozicích 121,124 nebo 125 mají zaveden alanin v poloze 2.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4423131A DE4423131A1 (de) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ384896A3 CZ384896A3 (en) | 1997-06-11 |
| CZ292703B6 true CZ292703B6 (cs) | 2003-11-12 |
Family
ID=6522032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19963848A CZ292703B6 (cs) | 1994-07-01 | 1995-06-19 | Mutantní proteiny lidského interleukinu-4 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6130318A (cs) |
| EP (1) | EP0769020B1 (cs) |
| JP (3) | JPH10502360A (cs) |
| KR (1) | KR100393508B1 (cs) |
| AT (1) | ATE190068T1 (cs) |
| AU (1) | AU705745B2 (cs) |
| CA (1) | CA2193993C (cs) |
| CZ (1) | CZ292703B6 (cs) |
| DE (2) | DE4423131A1 (cs) |
| DK (1) | DK0769020T3 (cs) |
| ES (1) | ES2145280T3 (cs) |
| GR (1) | GR3033498T3 (cs) |
| HU (1) | HU221416B1 (cs) |
| NO (1) | NO965621L (cs) |
| SK (1) | SK284391B6 (cs) |
| TW (1) | TW458984B (cs) |
| WO (1) | WO1996001274A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA955443B (cs) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9415379D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| WO1999025732A2 (en) * | 1997-11-13 | 1999-05-27 | Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) | Design of coiled-coil dimer derived antagonists of 4-helix bundle cytokine specific receptors |
| ES2245114T3 (es) | 1998-08-06 | 2005-12-16 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso. |
| IL161121A0 (en) | 2001-10-03 | 2004-08-31 | Harvard College | Copolymers for suppression of autoimmune diseases, and methods of use |
| WO2004066704A2 (en) * | 2003-01-17 | 2004-08-12 | Cornell Research Foundation, Inc. | Injectable hydrogel microspheres from aqueous two-phase system |
| RU2389796C2 (ru) * | 2003-08-29 | 2010-05-20 | Аэровэнс, Инк. | Модифицированный антагонист рецептора il-4 и предназначенный для его получения очищенный полинуклеотид |
| ZA200601759B (en) * | 2003-08-29 | 2007-04-25 | Bayer Pharmaceuticals Corp | Modified IL-4 mutein receptor antagonists |
| US7404957B2 (en) * | 2003-08-29 | 2008-07-29 | Aerovance, Inc. | Modified IL-4 mutein receptor antagonists |
| US7785580B2 (en) * | 2003-08-29 | 2010-08-31 | Aerovance, Inc. | Modified IL-4 mutein receptor antagonists |
| US7635754B2 (en) * | 2004-09-22 | 2009-12-22 | Aerovance, Inc. | Interleukin-9 and interleukin-4 chimeric antagonist muteins and methods of using same |
| WO2006079169A1 (en) * | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Apollo Life Sciences Limited | Parameter selected gm-csf, il-3, il-4, il-5 and chimeras thereof for therapeutic and diagnostic purposes |
| WO2006110761A2 (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | A variant form of urate oxidase and use thereof |
| HUE052976T2 (hu) | 2005-04-11 | 2021-06-28 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Urát-oxidáz variáns formái és azok alkalmazása |
| US20070009479A1 (en) * | 2005-06-17 | 2007-01-11 | Aerovance, Inc. | Methods for treating dermatitis using mutant human IL-4 compositions |
| MX2008008968A (es) * | 2006-01-11 | 2008-09-10 | Aerovance Inc | Metodos y composiciones para tratar asma en primates humanos y no humanos. |
| CA2656379A1 (en) * | 2006-06-21 | 2007-12-27 | Apogenix Gmbh | Differential cytokine expression in human cancer |
| AU2007271349A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Apogenix Gmbh | Human IL-4 muteins in combination with chemotherapeutics or pro-apoptotic agents in cancer therapy |
| WO2008101671A2 (en) * | 2007-02-19 | 2008-08-28 | Apogenix Gmbh | Il-4 fc fusion proteins |
| EP2178547A4 (en) * | 2007-07-11 | 2011-02-16 | Aerovance Inc | PHARMACEUTICAL POLYPEPTIDE DRY POWDER AEROSOL FORMULATION AND MANUFACTURING METHOD |
| JP2009217498A (ja) * | 2008-03-10 | 2009-09-24 | Sato Knowledge & Intellectual Property Institute | 印字試験システム |
| US8182626B2 (en) | 2008-10-30 | 2012-05-22 | Continental Ag | Tire composition with improved vulcanizing agent |
| HUP1200205A3 (en) | 2009-06-25 | 2012-09-28 | Savient Pharmaceuticals | Method and kits for perdicting infusion reaction risk and antibody-mediated low of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricare therapy |
| EP2850093B1 (en) | 2012-01-27 | 2019-01-09 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Therapeutic il-13 polypeptides |
| IN2015KN00329A (cs) | 2012-08-09 | 2015-07-10 | Univ Leland Stanford Junior | |
| EP2813242A1 (en) * | 2013-06-13 | 2014-12-17 | PLS-Design GmbH | Low molecular weight immune-modulators as adjuvants for specific immunotherapy |
| WO2015042705A1 (en) | 2013-09-24 | 2015-04-02 | Medicenna Biopharma Inc. | Interleukin-4 receptor-binding fusion proteins and uses thereof |
| CN110234340A (zh) | 2016-11-11 | 2019-09-13 | 好利恩风湿病制药有限责任公司 | 泼尼松和尿酸酶分子的组合疗法及其用途 |
| US20200237881A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-07-30 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Reducing immunogenicity to pegloticase |
| WO2019073299A1 (en) | 2017-10-10 | 2019-04-18 | Medicenna Therapeutics, Inc. | IL-4 FUSION FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM (CNS) TUMORS |
| WO2019239213A2 (en) | 2018-06-01 | 2019-12-19 | Medicenna Therapeutics Inc. | Uses and methods for oncolytic virus targeting of il-4/il-13 and fusions thereof |
| WO2019232523A1 (en) | 2018-06-01 | 2019-12-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Il-13/il-4 superkines: immune cell targeting constructs and methods of use thereof |
| US12121566B2 (en) | 2019-01-30 | 2024-10-22 | Horizon Therapeutics Usa, Inc. | Methods for treating gout |
| CN112538108B (zh) * | 2020-12-24 | 2022-06-28 | 郑州大学 | 高亲和pvr突变体 |
| US12269875B2 (en) | 2023-08-03 | 2025-04-08 | Jeff R. Peterson | Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773919A (en) * | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4263428A (en) * | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
| JPS6023084B2 (ja) * | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
| EP0052322B1 (de) * | 1980-11-10 | 1985-03-27 | Gersonde, Klaus, Prof. Dr. | Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| US4485045A (en) * | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
| US4640835A (en) * | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
| DE3374837D1 (en) * | 1982-02-17 | 1988-01-21 | Ciba Geigy Ag | Lipids in the aqueous phase |
| DE3218121A1 (de) * | 1982-05-14 | 1983-11-17 | Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München | Arzneimittel zur tumorbehandlung |
| EP0102324A3 (de) * | 1982-07-29 | 1984-11-07 | Ciba-Geigy Ag | Lipide und Tenside in wässriger Phase |
| US4544545A (en) * | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
| HUT35524A (en) * | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
| DE3336583A1 (de) * | 1983-09-26 | 1985-04-25 | Udo Dr. 8400 Regensburg Ehrenfeld | Erzeugnis zur diagnose und therapie von malignen tumoren |
| EP0143949B1 (en) * | 1983-11-01 | 1988-10-12 | TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION | Pharmaceutical composition containing urokinase |
| US4496689A (en) * | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
| DE3675588D1 (de) * | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
| AU597574B2 (en) * | 1986-03-07 | 1990-06-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for enhancing glycoprotein stability |
| US4791192A (en) * | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
| JPH02501827A (ja) * | 1986-12-19 | 1990-06-21 | イミュネックス・コーポレーション | ヒト・インターロイキン‐４ ミューテイン |
| EP0335900A4 (en) * | 1986-12-19 | 1990-12-27 | Immunex Corporation | Human interleukin-4 muteins |
| PT88641B (pt) * | 1987-10-02 | 1993-04-30 | Genentech Inc | Metodo para a preparacao de uma variante de adesao |
| US5013556A (en) * | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| AU662327B2 (en) * | 1991-05-02 | 1995-08-31 | Novozymes A/S | Rhamnogalacturonase, corresponding DNA sequence, rhamnogalacturonase containing enzyme preparation and use of the enzyme preparation |
| DE4137333A1 (de) * | 1991-11-13 | 1993-05-19 | W Prof Dr Sebald | Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung |
| US5298410A (en) * | 1993-02-25 | 1994-03-29 | Sterling Winthrop Inc. | Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life |
-
1994
- 1994-07-01 DE DE4423131A patent/DE4423131A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-06-19 DK DK95924273T patent/DK0769020T3/da active
- 1995-06-19 JP JP8503644A patent/JPH10502360A/ja active Pending
- 1995-06-19 CZ CZ19963848A patent/CZ292703B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-19 ES ES95924273T patent/ES2145280T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-19 AU AU28852/95A patent/AU705745B2/en not_active Ceased
- 1995-06-19 KR KR1019960707590A patent/KR100393508B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-19 WO PCT/EP1995/002358 patent/WO1996001274A1/de not_active Ceased
- 1995-06-19 CA CA002193993A patent/CA2193993C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-19 HU HU9603563A patent/HU221416B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-06-19 DE DE59507920T patent/DE59507920D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-19 US US08/765,012 patent/US6130318A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-19 AT AT95924273T patent/ATE190068T1/de active
- 1995-06-19 SK SK1692-96A patent/SK284391B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-06-19 EP EP95924273A patent/EP0769020B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-30 ZA ZA955443A patent/ZA955443B/xx unknown
- 1995-07-10 TW TW084107101A patent/TW458984B/zh not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-12-30 NO NO965621A patent/NO965621L/no not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-05-24 GR GR20000401195T patent/GR3033498T3/el unknown
-
2006
- 2006-11-15 JP JP2006309383A patent/JP2007051161A/ja active Pending
-
2010
- 2010-12-06 JP JP2010271687A patent/JP2011102302A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9603563D0 (en) | 1997-02-28 |
| AU2885295A (en) | 1996-01-25 |
| ES2145280T3 (es) | 2000-07-01 |
| SK169296A3 (en) | 1997-08-06 |
| CZ384896A3 (en) | 1997-06-11 |
| AU705745B2 (en) | 1999-06-03 |
| NO965621D0 (no) | 1996-12-30 |
| HU221416B1 (en) | 2002-09-28 |
| ZA955443B (en) | 1996-02-13 |
| ATE190068T1 (de) | 2000-03-15 |
| TW458984B (en) | 2001-10-11 |
| JPH10502360A (ja) | 1998-03-03 |
| DE4423131A1 (de) | 1996-01-04 |
| EP0769020A1 (de) | 1997-04-23 |
| KR100393508B1 (ko) | 2003-10-23 |
| DK0769020T3 (da) | 2000-07-31 |
| US6130318A (en) | 2000-10-10 |
| WO1996001274A1 (de) | 1996-01-18 |
| JP2011102302A (ja) | 2011-05-26 |
| GR3033498T3 (en) | 2000-09-29 |
| NO965621L (no) | 1996-12-30 |
| DE59507920D1 (de) | 2000-04-06 |
| JP2007051161A (ja) | 2007-03-01 |
| SK284391B6 (sk) | 2005-03-04 |
| CA2193993A1 (en) | 1996-01-18 |
| CA2193993C (en) | 2008-11-18 |
| HUT77577A (hu) | 1998-06-29 |
| EP0769020B1 (de) | 2000-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ292703B6 (cs) | Mutantní proteiny lidského interleukinu-4 | |
| JP2957974B2 (ja) | エリスロポエチン活性を有するタンパク質の製造方法 | |
| KR100467751B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| KR101229995B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| IE881597L (en) | Expression of Human Proapolipoprotein A-I | |
| WO1994028017A1 (en) | Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists | |
| JP2002526073A (ja) | 新規のヒト生長分化因子のコード配列、そのｄｎａ配列によりコードされるポリペプチド、およびこれらの製造方法。 | |
| CA2188647A1 (en) | Recombinant fibrin chains, fibrin and fibrin-homologs | |
| JPH06505631A (ja) | 巨核球刺激因子 | |
| JPH09512706A (ja) | ＫｉｔリガンドおよびＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２リガンドの共有結合二量体 | |
| KR20010042383A (ko) | 분자내 샤퍼론 유사 서열을 함유하는 키메라 단백질 및이것의 인슐린 제조용 용도 | |
| JP2000504561A (ja) | Ｉｌ―１６活性のあるポリペプチド類、その製造方法およびその使用 | |
| FI81378C (fi) | Dna som kodar foer en prekursor till hpgrf, expressionsvektor och foerfarande foer expression av en prekursor till hpgrf. | |
| US5994296A (en) | Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists | |
| US5656458A (en) | Expression and processing of amino terminus acetylated FGF's in yeast | |
| JP2619036B2 (ja) | ブタ成長ホルモンアナログ | |
| CA2002210C (en) | Expression and processing of authentic fgf's in yeast | |
| EP0539414A1 (en) | Stable and bioactive modified somatotropins | |
| KR930005917B1 (ko) | 에리트로포이에틴의 제조방법 | |
| JPH0488984A (ja) | 組換え型ミンク成長ホルモン遺伝子、組換え型ミンクプレ成長ホルモン遺伝子、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換プラスミド、及び、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換大腸菌 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130619 |