CZ294475B6 - Konjugát mezi superantigenem divokého typu a skupinou hledající cíl - Google Patents

Abstract

Konjugát mezi a) superantigenem divokého typu, který je modifikován a b) skupinou hledající cíl, kdy modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci. Skupina hledající cíl je zvolena ze souboru sestávajícího z účinného fragmentu protilátky, protilátky a protilátky s jednoduchým řetězcem, Fab, F(ab)2 a Fv. Předmětem řešení je i použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu a farmaceutický prostředek s jeho obsahem.ŕ

Description

(57) Anotace:

Konjugát mezi

a) superantigenem divokého typu, který je modifikován a

b) skupinou hledající cíl, kdy modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci. Skupina hledající cíl je zvolena ze souboru sestávajícího z účinného fragmentu protilátky, protilátky a protilátky s jednoduchým řetězcem, Fab, F(ab)2 a Fv. Předmětem řešení je i použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu a farmaceutický prostředek s jeho obsahem.

Konjugát mezi superantigenem divokého typu a skupinou hledající cíl

Oblast techniky

Vynález se týká konjugátu mezi modifikovaným superantigenem divokého typu a skupinou hledající cíl. Týká se funkčně aktivních modifikovaných superantigenů, které náleží k „divokému“ typu superantigenů (SA I), jež mají jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituovaných při zachování superantigenní funkce. V případě,že jeden nebo více substituujících zbytků (nebo od toho zachovaný aminokyselinový zbytek) se nacházejí v odpovídajících polohách jiného typu divokého superantigenů (SA I), nazývá se tento superantigen chiméra (hybrid). Chimérické superantigeny proto obsahující část sekvencí/regionů odvozených od alespoň dvou různých superantigenů divokého typu.

Termín „odpovídající“ znamená, že zbytky, část sekvencí a regiony nahrazující jeden druhý, mají funkčně stejnou polohu v superantigenech I a I, takže substituce vede k chimérické formě, která je schopna fungovat jako superantigen.

Terminologie spojený/spojující/spojení je použita ve spojení s částmi úplné sekvence superantigenu I, které nahradily odpovídající části superantigenů I, dokonce i když byla nahrazena pouze jediná aminokyselina.

Modifikované /chimérické superantigeny také zahrnují funkční superantigeny modifikované jinými cestami, například modifikované nahrazením aminokyselin v jiných regionech než jsou ty vztahující se k předloženému vynálezu, konjugované se skupinou hlesající cíl, včetně kondenzovaných forem, když je skupinou polypeptid/protein. Pořadí pro provádění těchto modifikací se může měnit, jak je zřejmé dále.

Superantigeny

Podle úplně první definice (kolem roku 1988 až 1993) jsou superantigeny bakteriální nebo virové proteiny schopné vázat se k antigenům MHC třídy I bez předchozího intracelulárního zpracování a aktivovat T buňky vazbou k β-řetězci variabilního regionu (νβ) T buněčného receptorů (TCR). Vazba způsobuje restrikční aktivaci rodiny νβ relativně velkého počtu/subpopulace T buněk a zánik MHC třídu I exprimujících buněk (na superantigenů závislý buňkami zprostředkovaný rozpad buněk) (superantigen dependent cell-medated cytolysis = SDCC).

Dobře známé superantigeny divokého typu podle shora uvedené definice jsou enterotoxiny stafylokoků (SEA, SEB, SECI, SEC2, SED, SEE a SEH). Dalšími příklady jsou toxin syndromu toxického šoku 1 (TSST-1, také stafylokokového původu), exfoliační toxiny (EXft), streptokokový pyrogenní exotoxin A, B a C (SPE A, B a C), proteiny viru nádoru myšího prsu (MMTV), streptokokové M proteiny, exotoxin Clostridia perfringens (CPET), superantigeny mycoplazma arthritis atd. Pro přehled superantigenů a jejich vlastností viz Kotzin a kol. 1993.

V průběhu začátku 90tých let bylo objeveno, že aktivace a následný buněčný rozpad mohou nastat MHC I nezávislým způsobem v případě, že superantigen byl konjugován s cíl hledající skupinou, schopnou vázat se k struktuře buněčného povrchu (Dohlsten a kol. W09201470 a Abrahmsén a kol. W09601650). Po inkubaci cílových buněk (nesoucích cílovou strukturu pro cíl hledající skupinu) a efektorových buněk (T buněk) skonjugáty, dochází k rozpadu cílových buněk (superantigen antibody dependent cell-mediated cytolysis = SADCC) bez nutnosti exprese třídy I. Podle dnešní koncepce superantigenů a použití v kontextu podle předloženého vynálezu, pokud není uvedeno jinak, patří mezi ně jakákoliv sloučenina (výhodně polypeptidové struktury), která je schopna vázat se ke struktuře buněčného povrchu (cílová struktuře) a k jednomu nebo více polymorfním TCR řetězcům, zejména k νβ řetězci, a tím aktivovat subpopulaci T buněk exprimujících specifický TCR řetězec sloužící k navázání. T buňky se pak stávají cytotoxickými pro buňky, nesoucí povrchovou strukturu (cílová struktura, cílové buňky). Normálně aktivovaná subpopulace T buněk sestává z asi 1 až 20 % celkového množství T buněk individua.

Dosavadní stav techniky

Strukturní a funkční studie využívají mutované a chimérické superantigeny.

Chimérické superantigeny včetně bodově mutovaných forem jsou již známy (Kappler a kol. WO 9314364, Kappler a kol. 1992, Grošman a kol. 1991, Hugnagle a kol. 1991, Hartwig a kol. 1993, Fraser a kol. 1993, Mollick a kol. 1993, Irwin a kol. 1992, Hudson a kol. 1993, a Blacko a kol. 1990). Mollick a kol. a Hudson a kol. ukazují na studiích chimér, že νβ specifická SEA a SEE spočívá v některých aminokyselinových sekvencí přítomných v karboxy terminální oblasti (např. aminokyselinové zbytky 200, 206 a 207). Navíc k νβ specifícitě, převážně závislé na tomto regionu, dokázali Mollick a kol., že pro kompletní rekonstituci SEE podobné aktivity SEA obsahujících SEE spojení vzhledem k Vfi8 byl nutný fragment, obsahující N-terminální 70ti aminokyselinový zbytek z SEE. Tento fragment obsahuje části SEE podobného vazebného místa a řetězce MHC třídy I, chimérické SEA/SEE molekuly obsahující tuto část z SEE, inhibovaly vazbu SEA k HMC třídu I DR1 SEE podobným způsobem.

Nyní jsou už známy SEE-SEA chiméry s výměnou regionů schopných vazby na ΤΰΚνβ (Lamphaer a kol., J. Immunol. 156 (March 15, 1996), 2178-2185). Fúzový protein Fab protilátka SEE superantigen, ve kterém SEE domény umožňující interakci s T buňkami byly zaměněny za odpovídající nehomogenní SEA domény, byl popsán v ABRF 1996: Biomolecular Techniques, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, Califomia March 30 - Apríl 2, 1996 (Bjěrk a kol., M45).

Terapeutické použití superantigenů

Nekonjugované superantigeny byly již navrženy pro terapii s předpokládaným léčebným účinkem dosaženým všeobecnou aktivací imunitního systému (Kalland a kol. WO9104053, Terman a kol. WO9110680 a WO9324136, Newall a kol. 1991).

Bylo také navrženo používat modifikované superantigeny konjugované se skupinami hledajícími cíl. (Dohlsten a kol. W09201470, Abrahmsén a kol. W09601650, obě tyto přihlášky jsou zde vloženy do popisu formou odkazu). Umožňuje to širší terapeutické použití aktivace T buněk prostřednictvím νβ. Doposud studované konjugáty měly sníženou afinitu k třídě I, což na druhé straně vede ke snížení vážné systémové toxicity, normálně spojené se superantigeny divokého typu.

Terman a kol. (WO9110680, WO9324136) v okrajových větách navrhuje léčit rakovinu pomocí modifikovaných superantigenů a jejich fragmentů.

Kappler a kol. (WO9314634) navrhl použít nekonjugované superantigeny (SEB) mutované tak, že ztratily svou schopnost vazby νβ nebo vazby HMC třídy II (v souvislosti s vakcínami a neutralizací toxických účinků superantigenů). Abrahmsén a kol. (W09601650) navrhl léčení rakoviny konjugovanými superantigeny, které mají modifikovanou, výhodně sníženou, schopnost vázat se na antigeny třídy I. Modifikace zahrnují prosté mutace, stejně tak jako konstrukce chimér mezi různými superantigeny.

Problémy, které má za úkol řešit tento vynález.

Séra lidských populací normálně obsahují vysoké titry protilátek proti superantigenům. Proti stafylokokovým superantigenům jsou např. relativní titry TSST-1 > SEB > SECI > SE3 > SEC2

-2CZ 294475 B6 > SEA > SED > SEE. Tyto relativní titry poukazují na problémy s imunogenicitou a problémy se neutralizací protilátek v případě, že jsou superantigeny (SE) podávány parenterálně. Na bázi těchto problémů by měl být SEE výhodný stafylokokový superantigen. V kontextu práce s fázovými proteiny se však zjistilo, že schopnost T buněčné na MHC třídě I nezávislé cytotoxicity, superantigen-protilátka závislé buněčné cytotoxicity (SADCC), je u SEE konjugátů malá. Anti-SE titry také ukazují, že by mohlo být výhodné modifikovat superantigen s „vysokým titrem“ na superantigen s pravděpodobným „nízkým titrem“.

Cíle vynálezu

Prvním úkolem je zlepšit dosud známé antigeny se zřetelem na snížení jejich imunogenicity a reakce s neutralizujícími protilátkami.

Druhým úkolem je získání superantigenů s menším množstvím vedlejších účinků při použití jako léčiva.

Třetím úkolem je získat vylepšené superantigeny, které se mohou použít jako účinná látka při ošetřování savců trpících rakovinou, poruchou autoimunity, napadením parazity, virovými infekcemi nebo dalšími nemocemi spjatými s buňkami, které na svém povrchu exprimují antigeny a nebo struktury MHC třídy I, které jsou specifické pro danou nemoc a vážou se na skupinu hledající cíl, inkorporovanou do superantigenu.

Objev, který vedl k vynálezu

Analýza sekvenční homologie SEA a SEE (obr. 2) ukázala, že neidentické aminokyselinové zbytky jsou koncentrovány do osmi oddělených regionů. Vně těchto osmi regionů, které tvoří 34% sekvence, je identita obou SE 97%, se Zachovalými aminokyselinovými substitucemi zodpovídajícími za ostatní rozdíly. Čtyři z těchto regionů jsou strukturně blízké dvěma vazebným místům MHC třídy II (B: AA 37-50, D: 71-78, E 136-149 a G1891-195), a nemají tendenci interagovat sTCR. Na okraji molekuly v blízkosti domnělého TCR vazebného místa, které se postupuje do žlábku mezi dvěma subdoménami, jsou umístěny další čtyři regiony (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 a H: 200-207).

Spojením jednotlivých regionů (nahrazením aminokyselinových zbytků, které se od sebe liší), se nyní zjistilo, že vlastnosti SEA konjugátů vyvolávat cytotoxickou odezvu, stejně tak jako potenciace proliferační odezvy za nepřítomnosti MHC třídy I, spočívá v jedné oblasti TCR vazebné oblasti SEA. Tento region (A) je přemístitelný na SEE a má velký vliv na aktivitu za nepřítomnosti třídy I, avšak omezené účinky na νβ specificitu superantigenu (obr. 6, tab. 2). Všechny tyto regiony (A, C, F a H) se podílejí, přímo nebo nepřímo, na interakci s TCR, manifestované alterovaným stimulačním efektem na hybridomy myších T-buněk (tab. 2).

Vzhledem k analogickému mechanismu působení je možné předpokládat, že podobné strukturální oddělení těchto TCVR^ vazebných vlastností je možné také u analogů superantigenů SEA a SEE.

Totéž lze také aplikovat v rámci ostatních typů superantigenů, ve kterých jsou vazné struktury organizovány různě. Náš objev nám umožnil nastínit konstrukci chimérických superantigenů, které mají potencionálně mimořádně velkou hodnotu jako terapeutické prostředky.

Podstata vynálezu

Předmětem podle předloženého vynálezu je konjugát mezi superantigenem divokého typu a skupinou hledající cíl.

-3 CZ 294475 B6

Podstata konjugátu mezi

a) superantigenem divokého typu, který je modifikován a

b) skupinou hledající cíl, spočívá v tom, že modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence prvního superantigenu divokého typu v tom, že alespoň jeden aminokyselinový zbytek v regionu I, kde se region I nachází ve vazebném místě receptorů T buněk a určuje vazbu k řetězci νβ receptorů T buněk a aktivaci T buněk, uvedeného prvního superantigenu divokého typu, je nahrazen jedním nebo více aminokyselinovými zbytky odpovídající pozice v druhém superantigenu divokého typu, tento modifikovaný antigen vykazuje zlepšenou schopnost indukovat proliferaci T buněk a cytotoxicitu ve srovnání s prvním superantigenem divokého typu a cytotoxicitu ve srovnání s prvním superantigenem divokého typu a má sníženou seroreaktivitu ve srovnání s druhým superantigenem divokého typu, modifikovaný superantigen dále obsahuje mutaci, která snižuje jeho schopnost vázat se k antigenům MHC třídy I ve srovnání s oběma uvedenými superantigeny divokého typu, a skupina hledající cíl je zvolena ze souboru sestávajícího z aktivního fragmentu protilátky, protilátky a protilátky s jednoduchým řetězcem, Fab, F(ab)2 a Fv.

Předmětem vynálezu je také použití terapeuticky účinného množství superantigenu, definovaného výše, obsahujícího superantigen divokého typu, který je modifikován a skupiny hledající cíl, přičemž modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci superantigenu prvního divokého typu, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků valespoň jednom regionu

i) který je přítomen uvnitř uvedené aminokyselinové sekvence superantigenu prvního divokého typu a

í) jehož funkce při determinaci vazby k receptorů T buněk a aktivaci podsouboru T buněk je zaměněna odlišným aminokyselinovým zbytkem, přičemž uvedený modifikovaný antigen si zachovává schopnost aktivovat podsoubor T buněk pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

Aspektem vynálezu je i způsob léčení chorob savců prostřednictvím aktivace jejich imunitního systému prostřednictvím podávání terapeuticky účinného (imunitu aktivujícího) množství modifikovaného, výhodně chimérického superantigenu. Savcem je výhodně člověk. Nemoci, kterých se to týká, jsou převážně takové nemoci, které jsou spojeny s expresí cílových struktur na povrchu buněk, které jsou schopné vazby na superantigen. Cílová struktura je ve většině případů odlišná od TCR epitopu normálně vázajícího superantigeny. Vazba na cílovou strukturu dovoluje také navázání na TCR a aktivaci T buněk. Ilustrativními příklady jsou antigeny MHC třídy II a další struktury buněčného povrchu, které mohou být exprimovány na buňkách ve spojení s průběhem nemoci. Ilustrativními chorobami jsou maligní nádory včetně veškerých typů rakovin, (jako karcinom, sarkom, melanom, lymfom atd.), virové infekce, parasitální choroby a autoimunitní onemocnění. Rakovina, která se má léčit, může být lokalizována v tlustém střevě, prsu, čípku děložním, ledvinách, žaludku, tenkém střevě, dvanáctníku, prostatě, varlatech, kůži, plících, játrech, slinivce břišní, v kostře atd. včetně všech metastáz v nejrůznějších místech. Vynalezená účinná látka je také použitelná v případě rakoviny rezistentní na mnohočetnou lékovou léčbu (multidrug resistant). Buňkami exprimujícími cílové struktury mohou být také buňky, které nějak kontrolují nebo regulují vývoj nemoci, která se má léčit.

Charakteristickým znakem způsobuje použití modifikovaného superantigenu, vekterém je jeden nebo více aminokyselinových zbytků v regionu (region I) zprostředkovávající vazbu k subpopu

-4CZ 294475 B6 láci T buněk přes polymorfní TCR řetězec, zejména TCRVfi, u divokého typu superantigenu (SA I), nahrazen aminokyselinovým zbytkem, který zachovává superantigenní aktivitu modifikovaného superantigenu. Ve výhodných provedeních, týkajících se chimérického superantigenu, je jeden nebo více aminokyselinových zbytků v regionu (region I) prvního superantigenu divokého typu (SA I) nahrazen jedním nebo více odpovídajícími zbytky aminokyselin v odpovídajícím regionu (region I) antigenu druhého divokého typu (SA I). Regiony I a I se liší z hlediska sekvencí aminokyselin. Superantigeny I a I se také vybírají tak, že reginy I a II jsou nahraditelné jeden druhým, aniž by došlo k ztrátě suprantigenní funkce. V tomto kontextu je třeba počítat s faktem, že určitý region I sám nemusí být zaměnitelný s odpovídajícím regionem jiného superantigenu divokého typu, avšak při záměně s jinými regiony, determinujícími CR vazbu a T buněčnou aktivaci, výsledkem je funkčně aktivní superantigen. Regiony, kterých se to týká, normálně obsahují méně než 20 zbytků, zejména v případě superantigenů analogických k SEA. Nahrazující aminokyselinový zbytek je tedy odlišný od zaměněného zbytku, a popřípadě zahrnuje také konzervativní substituce a další aminokyselinové substituce, které vedou k funkčně aktivním modifikovaným superantigenům schopným vázat se na TCRVp a aktivovat subpopulaci T buněk. To znamená, že se inventivně modifikují superantigeny, v jejich nejširších vlastnostech a funkcích za vzniku modifikovaného antigenu, ve kterém je jedna nebo více aminokyselin v shora zmíněných regionech funkčně obměněných.

Termín „konzervativní substituce“ označuje záměnu aminokyselinového zbytku chemicky podobným zbytkem, např. hydrofobní zbytek se nahradí za odlišný hydrofobní zbytek, polarizovaný zbytek se nahradí za jiný, ale podobně polarizovaný zbytek atd.

Jako superantigeny I, II atd. byly v době objevu a vzniku práva přednosti považovány za výhodné stafylokokové enterotoxiny, zejména takové, které koordinují zinek, aj. SEA, SEE, SED a popřípadě také SEH.

Regiony mohou zahrnovat buď shora zmíněné funkce (viz část popisu „objev, který vedl k vynálezu“ a experimentální část).

1. Velký vliv na aktivitu superantigenu jako takovou a omezený vliv na TCR specifícitu, zejména na νβ specifícitu. Pro SEA typ superantigenů to znamená region A (aminokyseliny v poloze 20 až 27).

2. Nově nalezený vliv na specifícitu s ohledem k vazbě na polymorfní TCR řetězce, jako je νβ řetězec. Pro SEA-typ superantigenů to znamená region C (aminokyseliny v poloze 60 až 62), F aminokyseliny v poloze 160 až 176 a H (aminokyseliny v poloze 200 až 207).

Pro superantigeny podobné SEA toto znamená jednu nebo více substitucí (aplikovaných vazbou z SEA na SEE; SEE/A chimérám):

Region A: R20G, N21T, S24G, R27K

Region C: G60D, P62S,

Region F: H161R, H164Q, G165Y, F167Y, G168N, S174V, G176D,

Region H: D200G, P206S, D207N.

V prioritnímu datu byly výhodně provedeny všechny substituce pro každý region. Pro jiné superantigeny se mohou analogicky provést obdobné substituce mezi odpovídajícími umístěními/regiony.

Obvykle se může začít od prvního superantigenu, jako je SEE a SED a pak nahradit jeden nebo více jeho jedinečných νβ vázajících regionů odpovídajících regionem(y) druhého superantigenu (např. SEA), přičemž první a druhý superantigen jsou výhodně voleny tak, protilátkový titr v normálním lidském séru pro první superantigen je nižší než pro druhý superantigen. Pro SEA

-5CZ 294475 B6 a SEE chiméry je nej lepším způsobem náhrada za vzniku chimér SEE/A-A, SEE/A-AH a SEA/E-BDEG, přičemž absolutně nejvýhodnější je SEE/A-A. Viz experimentální část a obrázky.

Spolu s regiony A, C, F a H lze také zaměnit aminokyselinové zbytky v jiných částech. Jedním typem takové záměny je snížení schopnosti vázat třídu I, neboť tato vlastnost je spojena s mnoha vedlejšími účinky, které s sebou přenáší superantigenní terapie (všeobecná aktivace imunity se spolu jdoucím systematickým uvolňováním faktoru nádorové nekrózy (tumor necrosis factor = TNF) a interfenonu gama. Pro superantigeny jako je SEA, SED a SEE jsou důležité pozice aminokyselin, umožňující koordinaci zinkových iontů výhodně změněné, tj. jde o pozice aminokyselin 225 a 227, např. při SEA mutaci H225A a zejména, D227A, které mají pozitivní vliv na snížení vedlejších toxických efektů (viz Abrahmsén a kol. W096/01650 Fraser a kol. 1993).

Lze provést i další substituce kdekoli v molekule, pokud nedojde ke ztrátě superantigenní funkce, např. konzervativní substituce v určité části mimo regiony vnese možnost vazby k třídě II a TCR. Změna v sekvenci DNA vedoucí ke změně vazby MHC třídy II nebo jakákoliv jiná změna na úrovni DNA se dá provést před nebo po změně v regionech, zaměřené na vazbu k TCR. Tyto další typy změn mohou být stejně dobře provedeny před záměnou aminokyseliny v regionu I. V souladu s vynálezem je koncentrace využívající „superantigen divokého typu“ popsaná shora, tedy modifikace podle nároků tímto primárně daná, zaměřená na divoké typy aminokyselinové sekvence v regionu I, mimo kterou se však mohou shora uvedené modifikace také provést.

Konstrukce chimérických a mutovaných superantigenů se dá provádět technikami, které jsou v oboru dobře známy. Přechod od specifického regionu jednoho superantigenu k odpovídajícímu regionu jiného superantigenu je dána úrovní genomů a může provést náhradou kompletní sekvence nebo bodovými mutacemi v jednotlivých místech těchto specifických bází, které jsou požadovány jako ukončení vhodné aminokyselinové sekvence. Viz např. experimentální část a známý stav techniky v tomto popisu. Termín „mutace“ zahrnuje nahrazení, vložení, nebo odstranění jednoho nebo více aminokyselinových zbytků modifikací DNA sekvence kódující daný protein, který má být mutován.

Superantigen, který se má použít při metodě podle vynálezu může být nekonjugovaný superantigen modifikovaný způsobem popsaným shora, tj. modifikovaný superantigen, kterému chybí specificky napojená cíl hledající skupina, ale má schopnost vázat se kMHC třídy I antigenům a subpopulace T buněk přes TCR. Zejména je modifikovaný superantigen, výhodně chimérický superantigen, konjugován s cíl hledající skupinou. V jiném případě jsou výhodné varianty fúze mezi cíl hledající skupinou a modifikovaným superantigenem. Konjugáty jako takové jsou nové a představují samostatný aspekt tohoto vynálezu.

Struktury vynalezených konjugátů jsou analogické dříve známým konjugátům protilátkasuperantigen (Dohlsten a kol. WO 92/01471 Abrahmsén a kol. WO 96/01650, což jsou publikace zde uvedené referované), tedy jde o konjugáty, které většinou odpovídají vzorci:

T-B-SA(m) kde T představuje cíl hledající skupinu, SA(m) modifikovaný, výhodně chimérický superantigen, jak je definován shora a B je kovalentní můstek spojující T a SA(m). T může principiálně obsahovat další superantigenní skupiny, přičemž ve výhodných konjugátech je pouze jedna cíl hledající skupina a jedna modifikovaná skupina superantigenu, jak je shora definována.

T může být principiálně jakákoliv struktura, která je schopna navázat se na strukturu buněčného povrchu, výhodně strukturu specifickou pro určitou chorobu. Struktura, proti které je T nasměrováno, je obvykle odlišná od a) epitopu νβ řetězce, ke kterému se váže SA(m), a b) epitopů MHC třídy I, k kterým se váží superantigeny. Cíl hledající skupina se primárně volí mezi interleukiny (např. interleukin-2), hormony, protilátkami, včetně antigen nesoucími fragmenty protilátek, růs

-6CZ 294475 B6 tovými faktory atd. Viz např. Woodwordth, Preclinical atd Clinical Developement and Cytokine

Toxins, uvedená na konferenci „Molecular approaches to cancer Immunotherapy“, Ashville,

North Carolina, November 7-11, 1993.

V den priority bylo s výhodou zjištěno, že T je protilátka (protilátka plné délky, Fab, F(ab)₂, Fv, a protilátka s jedním řetězcem a jakýkoliv další antigen vázající fragment protilátky), s určitou specificitou pro účinné fragmenty protilátky (např. Fab), řízené proti tzv. C242 epitopům (Lindholm a kol. W09301303) nebo s výhodou proti vazebnému epitopu specifické protilátky 5T4 rakoviny plic (Stern a kol. W08907947). Toto však nevylučuje možnost použití specifických protilátek proti jiným druhům rakoviny, které mohou fungovat stejně dobře nebo dokonce lépe. Termín „protilátka“ zahrnuje monoklonální nebo polyklonální varianty, přičemž jako výhodné se předpokládají monoklonální přípravky.

T může být také řízené proti jednotlivé struktuře nebo více méně zdravým buňkám, které regulují nebo kontrolují vývoj nemoci.

Můstek B může být volen, jak bylo v předešlém textu popsáno (Dohlsten a kol. W092/0147, Abrahmsén a kol. W096/01650), tj. B znamená výhodně hydrofílní můstek a je tvořeno jednou nebo více strukturami, vybranými ze skupiny zahrnující amid, thioether, disulfíd atd. Nejlepší můstky jsou ty, které lze získat rekombinačními metodami tj. konjugace se používá na úrovni genomu. V takových případech jsou výhodné oligopeptidové můstky obsahující hydrofílní aminokyselinové zbytky, jako je Gin, Ser, Gly, Glu, Pro, His a Arg. Zejména výhodnými můstky B jsou peptidické můstky sestávající zjedné až deseti aminokyselinových zbytků, přičemž zcela nejvýhodnější jsou zbytky o třech až sedmi aminokyselinách. Typickým můstkem je tripeptid GlyGlyPro, SEQ ID NO 1.

Výroba nových vynalezených konjugátů se dá uskutečnit na principu dvou hlavních syntéz: 1. rekombinantní metody a 2.chemické připojení cíl hledající skupiny T k modifikovanému, výhodně chimérickému, superantigenu (SA(m)), jak je definováno shora. Tyto způsoby jsou dobře proveditelné pro zběhlého pracovníka v oboru a zahrnují velké množství variant.

Chemické připojení modifikovaného nekonjugovaného superantigenu k cíl hledající skupině T je často prováděno s použitím funkčních skupin (např. primárních aminoskupin nebo karboxyskupin), které jsou přítomny v četných pozicích ve sloučenině. Z toho plyne, že finální produkt obsahuje směs konjugovaných molekul, lišících se v místě navázání, a hetero- a homo- konjugáty.

Pro rekombinantní konjugáty (fúzové proteiny) je získaná konjugovaná látky jednotná co do místa navázání. Amino zakončení chimérického superantigenu je buď navázáno ke karboxy zakončení cíl hledající skupiny, nebo naopak. Pro protilátky jako jsou intaktní protilátky a antigen vazebné fragmenty (Fab, Fv protilátky s jedním řetězcem atd.), se pro fúzi může použít lehký nebo těžký řetězec. V současné době jsou výhodnější konjugáty získané rekombinací, přičemž většinou jsou výhodné Fab fragmenty a napojení aminoterminální skupiny chimérického superantigenu k první konstantní doméně těžkého řetězce protilátky (CH1), včetně analogického napojení na lehký řetězec nebo k VH a VL doméně, jak může také dávat dobré výsledky.

Hlavní používanou buňkou pro rekombinantní produkci vynalezených modifikovaných superantigenů ve velkém měřítku (ve fúzových formách stejně tak jako v nekonjugovaných formách) je Escherichia coli. Tato buňka funguje v principu dvěma způsoby: intrecelulární produkcí a sekrecí. Druhý způsob je výhodný, neboť nabízí čištění správně poskládaných proteinů z periplazmy a z média kultury. To co bylo shora uvedeno neznamená, že by nebylo možno produkovat aktivní konjugáty také v jiných hostitelských buňkách, např. v eukaryotických buňkách, jako jsou např. kvasinky nebo savčí buňky.

-7CZ 294475 B6

Farmaceutické kompozice, dávkování a způsoby podávání

Aspektem vynálezu je farmaceutická kompozice, obsahující vynalezené modifikované výhodně chimérické superantigeny, jak je uvedeno shora (jde o konjugované i nekonjugované formy). Kompozice, které se používají, jsou v oboru známé, kromě toho že obsahují přísadu vynalezeného superantigenu. Proto mohou mít kompozice formu lyofilizovaného partikulárního materiálu, sterilního nebo asepticky vyrobeného roztoku, tablety, ampule atd. Nosiče jako je voda (výhodně pufrovaná nebo fyziologicky přijatelnou hodnotu pH například použitím PBS) nebo jiné inertní pevné nebo kapalné materiály, které mohou tvořit další přísady. Obecně se kompozice připravují smísením konjugátu, rozpuštěním konjugátu, navázáním konjugátu nebo jiným kombinováním konjugátu s jedním nebo více ve vodě rozpustnými nebo ve vodě nerozpustnými vodnými nebo nevodnými vehikuly. Pokud je to nutné, přidávají se další vhodná aditiva a adjuvanty. Je nutné, aby vehikula a ostatní podmínky nepůsobily na aktivitu modifikovaného superantigenu nežádoucím účinkem.

Vynalezený superantigen lze běžně prodávat a podávat v předem upravených dávkách, přičemž každá obsahuje účinné množství konjugátu, který byl zde popsán, přičemž je možno předpokládat, že půjde o dávku v rozmezí 10 ng až 50 mg, např. v rozmezí 10 ng až 1 mg nebo uvnitř rozmezí 10 pg až 50 mg. Přesná dávka se mění případ od případu v závislosti na hmotnosti a věku pacienta, způsobu podávání, typu choroby, cíl hledající skupině, superantigenu, navázání (-B-) atd.

Cesty podávání jsou také ve shodě s cestami, které se obvykle používají v tomto oboru, tj. účinné množství antigenu, které postačují k zabíjení cílových buněk nebo má terapeutickou aktivitu, přičemž jde o antigen modifikovaný podle vynálezu, se převádí do kontaktu s cílovými buňkami. Pro indikace, uvedené shora to většinou znamená parenterální podání, jako je injekce nebo infuze (subkutánní, intravenózní, intrarteriální, intramuskulární, intraperitoneální) savci, jako je např. člověk. Modifikované, výhodně chimérické superantigeny, o které jde, mohou být podávány lokálně nebo systemicky.

Terminem „množství dostačující k zabíjení cílových buněk“ se míní, že množství je účinné pro aktivaci a řízení T buněk pro zničení cílových buněk.

Výhodnou cestou podání je tatáž cesta, jaká byla volena pro superantigenní konjugáty podle Dohlstena a kol. W092/01470 a Abrahmséra a kol. W096/01650.

To znamená jedno až pětihodinové intravenózní infuze (výhodně čtyřhodinová) denně kombinovaná s látkou, snižující teplotu (paracetamol). Podávání se může po několika dnech zopakovat, např. může být opakováno 4 dny, se zřetelem na riziko vlivu protilátek namířených proti konjugátu.

Vynalezené superantigeny lze podávat buď jako hlavní terapii, nebo ve výhodném provedení jako adjuvantní terapii ve spojení s chirurgickým zákrokem nebo ve spojení s jiným léčivem.

V kontextu s terapií se zjistilo, že protilátkové přípravky, které jsou čisté v ohledu na nekovalentně asociované těžké a lehké řetězce protilátky, mají výhody oproti přípravkům, které obsahují protilátky, ve kterých řetězce jsou připojeny cystinovými vazbami. Podle dalšího aspektu vynálezu je řešením terapeutické použití přípravku protilátek, zejména Fab přípravku, ve kterých se cystainové zbytky spojující řetězce dohromady nahradí aminokyselinou, která neumožňuje tvorbu disulfidu, např. serinem. Nejvýhodnější protilátkou specificitou pro účely tohoto vynálezu byla stanovena C242mab (Lindholm a kol. W093/01302) a dále 5T4mab, jak je definována v odkazech citovaných shora. Ve výhodných variantách je jeden z řetězců protilátky napojen na superantigen, který je schopný aktivace subpopulace T buněk Vp specifickým způsobem, jak je popsáno shora. Superantigen může být divokého typu, chiméra nebo bodově mutovaná verze

-8CZ 294475 B6 (a jejich kombinace), jak je opsáno shora nebo Dohlstenem a kol. W092/01470 nebo Abrahmsénem a kol. W096/01650. Tento aspekt vynálezu také zahrnuje farmaceutické kompozice, jak jsou popsány shora, ale obsahující přípravek protilátky, jak je definováno pro tento aspekt vynálezu, místo chimérického superantigenu.

V provedení vynálezu bylo výhodné použít Fab fragmentu 5T4 protilátky (Stern a kol. WO89/07947) v kombinaci s SEA/A-A chimérou s mutací D227A. Výhodný Fab fragment je mutován s obou řetězcích v místech umožňujících meziřetězcové disulfídové spojení (cys na ser), za účelem zvýšení výtěžku protilátka/fúzový protein při výrobě v E. coli byly také prováděny v určitých pozicích mutace ve Vk řetězci. Viz experimentální část.

MATERIÁLY A PODKLADY

Konstrukce SEA/SEE chimérických genů

Konstrukce SEA/SEE chimér byla provedena pomocí metody, založené na polymerázové řetězové reakci (PCR), extenzi překrývající se sekvence (Horton a kol.). Reakce PCR byly prováděny tak, že řetězec byl prodlužován (UlTma) (PerkinElmer) podle doporučení výrobce. PCR fragmenty se klonují v PCR-sktriptu (Stratagene, USA) a sekvenují se pro ověření správnosti sekvence. Geny chimérických superantigenů pak byly subklonovány do expresního vektoru pKP889 (Abrahmsén a kol. 1995), fúzí SE konstruktů k části těžkého řetězce na Fab fragment myší monoklonální protilátky C215. SEA a SEE rekombinantní fázové proteiny byly vyrobeny jako polypeptidy plné délky ve shodě se sekvencí pro signální peptid (von Heijne 1986).

Exprese a čištění proteinů

Pro expresi Fab-SE fúzových proteinů a SEA mutantů byl použit kmen UL635 bakterie Escherichia coli, jak bylo popsáno dříve (Abrahmsén a kol. 1995). Fab-SE fázové proteiny se sklidí odstředěním při 5000 g a supematantové frakce byly podrobeny čištěním na proteinové Gsepharose (Pharmacia Biotech AB Uppsala, Sweden), jak bylo popsáno dříve (Abahmsán a kol. 1995). Čistota afinitou čištěných Fab-SE variant byla >90% podle analýzy čistoty pomocí SDSpage.

Buňky

Buňky lymfomu lidských B-buněk linie Ráji a karcinomu lidského tlustého střeva Colo205 byly kultivovány v úplném R-médiu (RPMI-1640 doplněný 10% fetálním telecím sérem (GibcoBRL, Life technologies, Limited, Paisley Scotland) 1 mmol glutami, HyClone Europe, Ltd. Cramlington 5x10'⁵ mol β-merkaptoelanolu, ICN Biomedicals INC., Costa Mesa CA, 0,1 mol NaHC0₃, seromet - Biochrome, lxlO’² mol Hepes pufr, HyClone Europe Ltd. Cramlington, 0,1 mg/ml gentamycinu, Biological Industries Kibbuts Beit Haemek israel, lxl0'³ mol pyruvátu sodného, HyClone Europe, Ltd. Cramlington). CHO buňky transfektované lidskými C215 a CD80 molekulami byly kultivovány v úplném R médiu doplněném o 0,5 mg/ml Genintic (G418) GipcoBRL, Life technologies, LTD, Paisley Scotland). Mononukleámí buňky periferní krve PBM byly připraveny z heparinizované krve od normálních dárců. Buňky byly izolovány centrifugací v gradientu hustoty pomocí Ficoll-pague, jak bylo dříve podáno (Dohlsten a kol. 1991). Lidské T lymfocyty byly čištěny do dosažení homogenity pozitivní selekcí pomocí MiniMACS kolon ve spojení s magnetickými korálky povlečenými monoklonálními protilátkami se specifícitou na lidské CD4 a CD8 (Miltenyi Biotec GmbH, Germany) podle pokynů výrobce. Lidské SEA a SEE reaktivní buněčné linie se vytvoří podle předchozího popisu (Dohlsten a kol. 1994). Lidské TCR νβ 22 exprimující buněčná linie byla získána z primárně stimulovaných SEA reaktivní buněčné linie pomocí pozitivní selekce s magnetickými korálky Dynabeads (Dynal A.S., Norway) povlečenými TCR νβ 22 specifickou monoklonální protilátkou (immunotech, Francie). Obohacené buňky obsahovaly > 95 % TCR Υβ 22⁺ T buněk, jak bylo určeno pomocí průtokové cytometrie

-9CZ 294475 B6 (výsledky se neuvádějí). Hybridomy myší T buňky (I1B3, 2B4 a 11.40) byly namnoženy, jak je uvedeno v literatuře (Fleuri a kol., 1991).

Testy Cytotoxicity

Cytotoxicita byla měřena standardním testem uvolňování ⁵¹Cr po čtyřech nebo 6ti hodinách, jak bylo popsáno výše (Dohlsten a kol. 1991). Jako cílové buňky byly používány lidské buňky kmenů CoLo205 a Ráji. Efektorové buňky, SEA nebo SEE reaktivní lidské T buněčné linie nebo linie TCR νβ 22 byly přidány jako efektor v konečném poměru 30:1. Při stanovení cytotoxicity byly použity ⁵¹Cr značené cílové buňky v úplné médiu v koncentraci 2500 buněk/200 ml v mikrotitračních nádobkách se špičatým dnem. Byly přidány C215Fab-SEA/E hybridy v různých koncentracích a uvolňování ⁵¹Cr bylo měřeno počítačem měřícím gama záření. Procento specifické toxicity bylo vyhodnoceno jako 100x[(c.pm. experimentálně uvolněné - c.p.m. uvolněné v pozadí)/(c.p.m. celkově uvolněné - c.p.m. uvolněné v pozadí)].

Testy lymfocytární proliferace

Za účelem měření proliferace 10⁵ lidských C buněk byly tyto buňky inkubovány při 37 °Cs 10⁴ ozářenými (200.000 Rad) stimulovanými buňkami v 200 ml úplného média v 96 mikrotitračních jamkách s různým množstvím hybridů C215Fab-SEA/E po dobu 72 hodin. Proliferace byla stanovena podle inkorporace [³H]-thymidinu, jak je popsáno (Dohlsten a kol., 1988).

Analýza Fab-SAg indukované IL-2 produkce.

Buňky myších T-T hybridomů byly inkubovány v 200 ml úplného R-média s C215Fab-SEA/E chimérickými proteiny za přítomnosti 2x104 Ráji stimulovaných buněk. Po 48 hodinách byl sebrán Supernatant a analyzován za přítomnosti myšího IL-2. Stručně, obsah cytokinu byl analyzován pomocí krysího vůči myšímu cytokinu namířeného mAb jako protilátky ve funkci lapače.

Čištěný krysí protimyší IL-2, biotinem značený krysí protimyší IL-2 a rIL-2 byly získány od firmy PharMingen (San Diego, CA). Biotinem značený anticytokin mAb, byl získán jako Vectastain ABC kit od firmy (Vector Laboratories, CA) a perxidasový substrátový kit od firmy (BioRad Laboratories, CA). Takto získané látky byly používány po detekci cytokinu. Absorpce byla stanovena pomocí zařízení ImmunoReader NJ2000 (InterMed Roskilde, Denmark) při vlnové délce 405 až 450 nm.

Mutace 5T4Fab

Konstrukce vektoru pro expresi 5T4Fab-SEA v E. coli

Fv-kódující port 5T4 byly klonovány z hybridomů 5T4 získaného od Dr. Peter Sterna (Stern a kol., W089/07947). Podrobněji: cDNA byla vyrobena z mRNA, regiony veškerých variabilních domén a části signální frekvence a také první konstantní doména těžkého řetězce a konstantní doména lehkého řetězce byly amplifikovány pomocí PCR. Oligonukleotidy:

5-CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC-3' (SEQ ID NO: 2) a

5'-ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATIyTCTT-3' (SEQ ID NO 3) byly použity pro těžký řetězec, přičemž vznikl fragment dlouhý 553bp, a oligonukleotidy:

5'-ACTAGTCGACATGGGCITCAAGATGGAGTCACAkwýCwGG-3' (SEQ ID NO: 4) a

-10CZ 294475 B6

5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3' (SEQ ID NO: 5) byly použity pro lehlý řetězec, přičemž vznikl fragment dlouhý 724bp, a oligonukleotidy. Pro každý řetězec byly sekvenovány 3 oddělené kolony a bylo zjištěno, že jsou identické. DNA fragmenty vhodné pro vložení do expresního vektoru (ref) byly získány ve druhém kroku PCR. Za účelem sestavení Fab expresního plazmidů byly různé regiony 5T4 podrobeny fúzi se sekvencemi kódujícími konstantní regiony myší IgGl/k protilátky C242 mab (Lindholm a kol. W093/01302). Region kódující superantigen odvozený od stafylokokového enterotoxinu A (SEA) byl navázán za těžký řetězec. Ověřená sekvence pro konstrukci protilátky V_k řetězce pro 5T4 protilátku je uvedena v přehledu výsledků.

Mutageneze 5T4

Do regionů kódujícího výrobu konstruktu protilátky bylo provedeno sedm záměn aminokyselin. Byly to PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser a Leu78Val. Podobně byly Cys zbytky poskytující řetězci mezidoménovou disulfidovou vazbu nahrazeny serinovými zbytky, což vedlo k mutacím Cys458Ser v těžkém řetězci a Cys214Ser v lehkém řetězci. Mutace byly provedeny s použitím na PCR založené mutageneze a DNA sekvence, která byla získána, byla potvrzena pomocí sekvenování.

Exprese fermentoru a čištění 5T4Fab-SEA.

Exprese plazmidů obsahuje gen resistence proti kanamycinu a lacUV5 promotor, který může být indukován za pomoci IPTG. Fúzové proteiny byly čištěny zčištěného kultivačního média pomocí proteinu G sepharosy a SP sepharosy (Pharmacia Biotec Uppsala, Sweden) a formulovány v citrátovém pufru s použitím Sephadexu G-25, v podstatě podle uvedeného popisu. Charakterizace pomocí SGS-page, HPLC s reverzní fází a hmotnostní spektroskopie ukázaly, že čištěné fúzové proteiny byl více než z 95 % čisté a měly odpovídající molekulární hmotnost.

Výsledky: Modifikace superantigenu

Pomocí SEA- a SEE-reaktivních lidských T buněk jako efektorových buněčných linií efektoru byla analyzována na superantigenu závislá buněčná cytotoxicita (superantigen dependent cellular cytotoxicity (SDCC)) C215Fab-SEA a C215Fab-SEE proti MHC třídy I⁺ Ráji buňkám. Přes rozdíly v νβ specificitě mezi SEA a SEEE oba superantigeny vykazují indukci ve srovnatelném stupni cytotoxiny s oběma efektorovými buněčnými liniemi (obr. 1). Pro rozlišení účinků prezentace MHC třídy I a přímých účinků SEA a SEE v TCR rozpoznání byly testovány na superantigen-protilátka závislou testovány na superantigen-protilátka závislou buněčnou cytotoxicitu (superantigen-antiobody dependent cellular cytotoxicity (SADCC)) proti C215 exprimujícím Colo205 buňkám. V testu řídí Fab skupina fúzový protein na C215 exprimující cílové buňky, což vede k prezentací fúzových SE molekul cytotoxickým T buňkám (CTL) nezávisle na molekulách HMC třídy I (Dohlsten a kol. 1994). Přes > 80 % aminokyselinovou identitu sekvence vykazuje TCR interakci mezi SEA a SEE kvalitativní rozdíly v tomto typu testu. C215Fab-SEA fúzový proteinsi uchovává svou schopnost řídit SEA a SEE reaktivní CTL proti HMC třídy Γ cílovým buňkám (obr. 1), zatímco C215Fab-SEE není schopen indukovat cytotoxicitu vůči HMC třídy Γ cílovým buňkám ani u SEA ani u SEE reaktivních CTL (obr. 1).

Již dříve bylo jinými výzkumníky popsáno, že rozdíly v νβ specificitě mezi SEA a SEE se primárně týkající rozdílu tří aminokyselin v předcházející kličce a v nepravidelném a5 helixu (Irwin a kol. 1992, Hudson a kol. 1993, Frase a kol. 1993 a Mollick a kol. 1993). Rozdíl vzhledem k TCR interakci, který je popsaný v těchto publikacích se netýká alterované CR νβ specificity, neboť schopnost C12Fab-SEA indukovat na HMC třídy I nezávislou toxicitu není omezena na SEA reaktivní CTL, aleje také pozorována u SEE reaktivních CTL.

- 11 CZ 294475 B6

Analýza sekvenční homologie SEA a SEE (obr. 2) potvrdila, že neidentické aminokyselinové zbytky jsou soustředěny do osmi různých regionů. Mimo těchto osm regionů tvořících 34 % sekvence se identita obou uvedených SE uplatňuje z 97 % konzervativními aminokyselinovými substitucemi, které zodpovídají za zbývající rozdíly. Čtyři z těchto nehomologních regionů jsou strukturálně blízké dvěma místům MHC třídy I (B, D, E a G) a nejsou schopny interreagovat s TCR (obr. 3). Další čtyři regiony (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 a H: 200-207) jsou umístěny na okraji molekuly (obr. 3) v blízkosti TCR vazebného místa, které je umístěno ve žlábku mezi oběma subdoménami (Kappler a kol. 1992). Pro výzkum kvalitativních rozdílů v TCR rozpoznání SEA od SEE jsme vyrobili hybridní proteiny spojením regionů z SEA na SEE jako chiméru s jedním regionem (SEE/A-A, -C, -F, H) do hybridů se dvěma regiony (SEE/A-AH) a spojením regionů umístěných v blízkosti vazebných míst MHC třídy I na SEE k SEA (SEA/EBDEG) (obr. 4). Všechny chimérické SE byly exprimovány jako C215Fab fúzové proteiny, aby bylo možné detekovat rozdíly s ohledem na jejich aktivitu v nepřítomnosti MHC třídy I.

SEA/E hybridní proteiny fúzované s C215Fab skupinou vykazující rozdíly ve Fab cílených cytotoxických testech.

SDCC aktivita C215Fab-SEE/A hybridních proteinů proti MHC třídě I* Ráji buněk pomocí SEA-reaktivních lidských T buněk jako efektorů. Hodnoty EC50 všech C15Fab-SE hybridů stejně jako C15Fab-SEAwt a -SEEwt spadající do rozmezí chyb (např. 10“¹² až, 10’¹¹ mol, obr. 5). Jediný detekovatelný rozdíl je mírně redukované plateau C215Fab-SEE/A-Ah hybridu, indikující ztrátu odpovídajících T buněk. Na druhé straně u experimentů s SADCC, kde cytotoxicita je řízena proti MHC třídy 17215⁺ Colo205 buněčné linií, pouze C215Fab -SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-AH a C215Fab-SEA/E-BDEG indukovaly srovnatelnou cytotoxicitu jako C215Fab-SEAwt (obr. 5). Tento 215Fab-SEE/A-F hybrid je schopen indukovat C215 cílenou cytotoxicitu ve vyšších koncentracích (EC50 přes 10 ¹⁰ mol). Také uvedený 215Fab-SEE/A-H hybrid je schopen indukovat C215 cílenou cytotoxicitu při podobné koncentraci pro polovinu maximální účinnosti, jako C215Fab-SEAwt (např. EC50 = 10¹³ mol), přičemž absolutní úroveň cytotoxicity je silně snížena (obr. 5). Tento rozdíl může být následkem restrikce νβ specifícity u linie C215 Fab-SEE/A-H zatímco schopnost indukovat C215 cílenou cytotoxicitu spočívá v odpovídající subpopulaci T buněk. Za účelem prozkoumání těchto zjištění se dále připravila lidská νβ 22 oligoklonální CTL linie. Lidské νβ 22 jsou analogické s myšími νβ 3 v tomto smyslu, že se jedná o SEA ne SEE specifickou rodinu. Ve známém stavu techniky již bylo ukázáno (Mollick a kol. 1993), že hlavní přínos SEA a SEE νβ je primárně obsažen v rozdílu tří aminokyselina mezi SEA a SEE v regionu Η (AA 200-207). V testech SDCC proti Ráji cílům MHC třídy I⁺, při použití νβ 22 oligonukleonální CTL linie jako efektorů, byly schopny pouze hybridy obsahující SEA-H region poskytnout C215Fab-SEAwt podobnou odezvu (např. C215Fab-SEE/AH, C215Fab-SEE/A-AH a C215Fab-SEA/E-BDEG, obr. 6). Hybrid C215FabSEE/A-A, který byl schopen indukovat plnou SDCC odezvu u celých CTL populací jako efektorů je v této zkoušce velice snížen jak v koncentraci poloviny maxima, tak v plateau (obr. 6). Jestliže je cytotoxicita νβ 22 TLC řízena proti MHC třídy I7C215⁺ colo 205 buněčné liní, jsou pouze hybridy obsahující jak SEA-A tak i SEA-H (např. jsou to C215Fab-SEE/A-AH a C215Fab-SEA/E-BDEG) schopny indukovat cytotoxickou odezvu, srovnatelnou sC215FabSEAwt (obr. 6). Hybrid obsahující samotný SEA region A (C215Fab-SEE/A-A) indukuje nižší hladinu cytotoxicity se srovnatelnou EC₅₀ hodnotou. To ukazuje, že zbytková aktivita pozorovaná u C215Fab-SEE/A-H hybridu v SADCC s celou T buněčnou populací jako efektorů není příčinou hybridem indukované odezvy u omezené populace T buněk. Lepší vysvětlení pro toto pozorování je, že schopnost indukovat SADCC odezvu u C215Fab-SE hybridních proteinů je primárně obsažen v SEA/A regionu a přínos SEA-H a -F regionů je nepatrný. Není žádný důvod se domnívat, že tato kvalita je omezena na jakoukoliv subpopulaci T buněk v kombinované SEA-SEE odpovídající T buněčné populaci, neboť C215Fab-SEA je schopen indukovat stejnou odezvu u SEE reaktivních CTL a C215Fab-SEE/A-A je schopen plné rekonstituce odezvy, pozorované u C215Fab-SEA.

- 12CZ 294475 B6

SEA/E hybridní proteiny, fúzované s C215Fab skupinou ukazují rozdíly ve Fab cílených testech proliferace.

Bylo již ukázáno, že čištěné klidové lidské T buňky jsou indukovány k proliferaci představením C215Fab-SEA na buněčnou linií MHC třídy I-/C215+/CD80+ (Lando a kol. 1993). Schopnost C215-Fab-SEA indukovat na MHC I nezávislou proliferaci je nicméně znatelně snížena u-C215Fab/SEE (tab. 1). Za účelem stanovení a zkoumání, zda tento rozdíl v kvalitě ukazuje stejné omezení na SEA region A jako bylo pozorováno u SADCC, se testovala proliferační kapacita C215Fab-SE hybridů, přítomných buď jako CHO-DR1⁺/CD80⁺, nebo CHOC215⁺/CD80⁺ transfektované buněčné linie, na čištěných klidových lidských T buňkách. Pokud se prezentovaly Fab-SE konjugáty na CHO-DR1⁺/CD80⁺, nebyly zaznamenány žádné rozdíly pro různé SE proteiny (data neukázána). Nicméně spojení SEA region A, C a H v SEE potencuje proliferační aktivitu srovnatelnou s C215Fab-SEE. Nejlepší výsledky byly získány spojení SEA regionů A a H, poukazujících na významnou úlohu pro region A, jak bylo zaznamenáno u cytotoxicity nezávislé na MHC třídy I. Použitím negativní selekce je možné, že by diference-FabSEA a -SEE mohly být v některých případech významnější.

νβ specificita SE hybridů

Pro další výzkum, zda C15Fab-SEA/SEE hybridní fúzové proteiny byly spojeny s určitou νβ specificitou, jsme použili SEA reaktivní myší T buněčné hybridomy exprimující νβΐ, νβ3 aVflll. Z těchto dat plyne, že všechny zkoumané regiony přímo nebo nepřímo, působí na interakci s TCR. Nevázáním SEA regionů C a F v C215Fab-SEE je zrušena aktivita vůči SEA a SEE zkříženě reaktivnímu νβΐ hybridomu I1B3. Zdá se, že stejné chiméry nemají žádné účinky nebo mají jen nepatrný vliv na aktivitu νβ3 a νβΐ 1 hybridomů (2.B4 a 11.40) ve srovnání s C215Fab-SEE. Navázáním SEA regionu A vC215Fab-SEE se aktivita vůči νβ3 (2.B4) ve srovnání sC215Fab-SEE zvýší alespoň lOOkřát. Výraznější účinky byly pozorovány u stejné buněčné linie při navázání SEA regionu H v C215Fab-SEE. Tento výrazný efekt, který spočívá na vliv νβ3 specificity u SEA region H byl také zaznamenán při dřívějších experimentech (Mollick a kol.). Nicméně se zdá, že stejná chiméra (C215Fab-SEE/A-H) snižuje aktivitu vůči SEA/SEE zkříženě reaktivním νβί a νβΐ 1 hybridomů (I1B3 a 11.40) asi desetinásobně. V souladu s tím se pozorovaná TCR interakce u SEA jeví jako významná pro všechny SEA-SEE, různé regiony A, C, F a H.

Séroreaktivita

Séroreaktivita vzorků lidského séra vůči chimérickým SE byla testována jednak na spojených vzorcích z různých částí světa a také na vzorcích individuálních. Napojením SEA regionů A a H v SEE jsme získali průměrnou séroreaktivitu (obr. 8). Podobná séroreaktivita byla také pozorována vůči chiméře C215Fab-SEE/A. Nicméně, jednoduché napojení SEA regionu A v SEE (C215Fab-SEE/A-A) poskytlo séroreaktivitu podobnou C215Fab-SEE, což ukazuje, že SEE region H je odpovědný za zachování séroreaktivity vůči C215Fab-SEE/A-AH. Toto ukazuje, že SEA region Z je částí dominujícího antigenního epitopu v SEA. Séroreaktivita získaná měřením na spojených vzorcích SEA z různých částí světa (Japonsko a USA) a stejně tak, jako u 14 individuálních vzorků ze Švédská, potvrzují stejnou obecnou závislost (data nejsou znázorněna).

Výsledky: Mutace Fab části fúzových proteinů.

Exprese konstruktů 5T4Fab-SEA

Produkční úroveň E. coli 5T4Fab-SEA ve fermentoru byla významně nižší než u jiných Fab superantigenních konstruktů, které jsme již dříve studovali v naší laboratoři. Pro zvýšení této produkční úrovně byly zavedeny z tohoto důvodu dva typy modifikací. Za prvé bylo zavedeno sedm různých dobových mutací do oblasti regionu lehkého řetězce, byly to PhelOSer, Thr45Lys,

-13 CZ 294475 B6

Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser a Leu78Val. Za druhé se cysteinové zbytky, které tvoří disulfídové vazby, které jsou spojeny lehké a těžké řetězce, nahradí serinovými zbytky. Tato druhá modifikace měla za následek trojnásobný vzrůst produkce a sedm bodových mutací další dvanáctinásobný vzrůst produkční úrovně. Kromě významného růstu produkce odstranění disulfidové vazby také poskytuje homogennější produkt vzhledem vyloučení možnosti reakce těchto reaktivních thiolových skupin s jinými činidly obsahujícími thioly.

Modifikovaná 5T4 molekula byla testována na afinitu ke svým antigenům a stejně tak na biologickou aktivitu v SADCC. Při těchto testech nebyla detekována žádná rozdílná aktivita mezi mutanty a divokými formami.

Cys/Ser mutace byla dále provedena v těžkém řetězci i v lehkém řetězci u Fab fragmentů několika jiných monoklonálních protilátek. Produkty se staly homogenními a plně si podržely schopnost vázat antigen.

Sekvence regionu protilátky proti 5T4 V_k řetězec:

DAVMTWTPTF LLVSAGDRVT ITCKASQSVS NDVAWYOQKP GQSPTLLISY TSSRYAGVPD RFIGSGYGTD FTFTISTLQA EDLAVYFCOQ DYNSPPTFTGG GTKLEIK (SEQ ID č. 6)

Podtržené sekvence jsou CDR. Tučné psaná písmena znamenají pozice, kde byly provedeny mutace: PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Ile63Thr, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val.

Tabulka 1:

	Proliferace EC50 (pM)
C215Fab-SE	2,2
C215Fab-SEEwt	6,9
C215Fab-SEE/A-A	0,9
C215Fab-SEE/A-C	2,8
C215Fab-SEE/A-F	5,7
C215Fab-SEE/A-H	1,0
C215Fab-SEE/A-AH	0,3
C215Fab-SEA/E-BDEG	1,6

Tabulka 2:

	IIB3 (MuVp 1) EC50 (nM)	2.B4 (MuVp 3) EC50 (nM)	11.40 (MuVP 11) EC50 (nM)
C215Fab-SEA	10	3	0,05
C215Fab-SEE	10	>100	0,05
C215Fab-SEE/A-A	10	10	0,05
C215Fab-SEE/A-C	>1000	>1000	0,05
C215Fab-SEE/A-F	>300	>300	0,05
C215Fab-SEE/A-H	100	3	0,3
C215Fab-SEE/A-AH	10	3	0,3

- 14CZ 294475 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1. Cytotoxicita závislá a nezávislá na MHC třídy II pro lidské SEE a SEA CTL.

Buněčná cytotoxicita závislá na MHC třídy II (A a B) a buněčná toxicita závislá na C215 (C a D) sC215Fab-SEA () a C215Fab-SEE (♦) jako efektorové molekuly. Cytotoxicita byla stanovena pomocí standardního 4-h testu uvolňování ⁵¹Cr pomocí SEE-reaktivní lidské T buněčné linie (A a 4) a SEA-reaktivní lidské T buněčné linie (B a D). Linie cílových buněk byly MHC třídy II⁺/C215⁺ Ráji (A a B) a MHC třídy Il7C215'Colo 205 (C a D). Data jsou z jednotlivých zkoušek, což představuje dva (A a C) až pět (B a D) nezávislých experimentů.

Obrázek 2. Posouzení homologie SEA a SEE.

SEA/SEE různé regiony jsou poblíže TCR vazebných míst (A, C, F a H) a různé regiony jsou blízko vazebných míst dvou MHC třídy II.

Obrázek 3. Papírový model SEA.

Popis modelu (Kraulis 1991) SEA krystalu (Schad et al. 1995). SEA/SEE různé regiony jsou blízké TCR vazebným místům (A, C, F a H) a různé regiony blízké vazebných místům dvou MHC třídy II. Koordinačním iontem je zinek.

Obrázek 4. Schematické znázornění chimérických SE molekul.

Napětí SEA sekvencí jsou snížená. SEA/SEE různé regiony představují A, B, C, D, E, F, G a H.

Obrázek 5. Cytotoxicita na lidské SEA reaktivní CTL závislá a nezávislá na MHC třídy II.

(A) MHC třídy II - závislá buněčná cytotoxicita a (B) C215 závislá buněčná cytotoxicita,

C215Fab-SEE/A-A (♦), C215Fab-SEE/A-C (□), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (·), C215Fab-SEE/A-H (Δ) a C215Fab-SEA/E-BDEG (O). Cytotoxicita byla stanovena standardním 4-h testem uvolňování 51CR s použitím SEA-reaktivní linie lidských T buněk. Cílové buňky byly z linie MHC třídy Il7C215⁺ Ráji (A) a MHC třídy lf7C2í5⁺Colo 205(B). Data z jedné zkoušky jsou výsledkem pěti nezávislých experimentů.

Obrázek 6. Cytotoxicita na lidské Vb22⁺ reaktivní CTL závislá a nezávislá na MHC třídy II.

(A) MHC třídy II - závislá buněčná cytotoxicita a (B) C215 závislá buněčná cytotoxicita, C215Fab-SEA (), C215Fab-SEE (♦), C215Fab-SEE/A-A(>), C215Fab-SEE/A-C (□), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEA/A-H (·), C215Fab-SEE/A-AH (Δ) a C215Fab-SEA/EBDEG (O). Cytotoxycita byla stanovena standardním 4-h testem uvolňování 51CR s použitím SEA-reaktivním linie lidských T buněk. Cílové buňky byly z linie MHC třídy H⁺/C215⁺ Ráji (A) a MHC třídy Il⁺/C215⁺Colo 205(B). Data z jedné zkoušky jsou výsledkem pěti nezávislých experimentů.

Obrázek 7. Proliferace závislá a nezávislá na MHC třídy II (není uvedeno v prioritní přihlášce).

Vliv Fab-SE hybridů v proliferaci T buněk závislou (A) nezávislou (B) na MHC třídy II. Přečištěné lidské T buňky byly stimulovány 96 hodin působením C215Fab-SEA (), C215Fab-SEE (♦), C215Fab-SEE/A-A(^), C215Fab-SEE/A-C (□), C215Fab-SEE/A-F (0), C215FabSEA/A-H (·), C215Fab-AEE/A-AH (Δ) a C215Fab-SEA/E-BDEG (O) prezentované na MHC

- 15 CZ 294475 B6 třídy II⁺/C215⁺CHO-DR4/C215 transfektantech (A) na MHC třídy II⁺/C215⁺CHO-CHOCD80/C215 (B). Po 72 hodinách byly buněčné kultury uvedeny do kontaktu s ³H-thmydinem po dobu 24 hodin v množství inkorporovaného značeného vodíku bylo změřeno jako reprezentativní pro polovinu maximální koncentrace (EC₅o). Data jsou udaná projeden test a představují průměr z dvou nezávislých experimentů.

Obrázek 8: Séroreaktivita lidského Ig poolu.

Pool od více než 5000 dárců zjižní Evropy byl testován na C215Fab-SE fúzní proteiny. Postupně ředěný lidský Ig byl uveden do interakce po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě s C215FabSEAwt, C215Fab-SEEwt, C215Fab-SE/A-A, C215Fab-SEE/A-H a FabSee/A-AH. Imobilizace do mikrotitrových prohlubní při koncentraci 1 ng/nádoba. Oprava na 215Fab-vazbu k proteinům séra byla provedena subtrakcí hodnoty OD pro C215Fab v každém bodě. Každý bod představuje průměr ze dvou vzorků. Další detaily viz „materiály a metody“.

Tabulka 1. Přečištěné lidské T buňky byly stimulovány 96 hodin působením C215Fab-SE na transfektantech MCH třídy II negativních CHO-CD80/C215. Po 72 hodinách bylo na buněčnou kulturu působeno ³H-thymidinem po dobu dalších 24 hodin a inkorporována radioaktivita byla změřena a představovala polovinu maximální koncentrace (EQo).

Tabulka 2. Přírodní nebo chimérický Fab konjugovaným superantigenem byly stimulovány po dobu 24 hodin musinové T buňky hybridomů. Aktivita byla měřena jako IL-2 produkce a představuje polovinu maximální koncentrace (EC₅₀).

Práce v průběhu roku od priority.

Ve snaze minimalizovat toxicitu fúze protilátky superantigenové chiméry C242Fab-SEE/A-A byla chiméra SEE/A-A mutována v vazebných místech třídy II způsobem, popsaným ve WO 96/01650 a připojena kC215Fab. Konstrukce jsou C215Fab-SEE/A-A-D227A, C215FabSEE/A-A-F47A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-H187A/D227A, C215Fal>-SEE/A-AW130A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A nebo C215FabSEE/A-A-D70R/D227A. Všechny fúze byly testovány na schopnost indukovat proliferaci lidských PBNC s cílem identifikovat mutanty, kteří mají sníženou aktivitu ve srovnání s C215FabSEE/A-A-D227A. Snížená proliferativní aktivita byla pozorována u C215Fab-SEE/A-AF47A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A nebo C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. Některé chimérické fúze byly také testovány na titr protilátek v normálním lidském séru (C215Fab-SEE/A—D227/A, C215Fab-SEE/A-A-D70A-D227A a C215Fab-SEE/A-AD70RPD227A). Srovnání bylo provedeno s C215Fab-SEA-D227A a C215Fal^SEE-D227A. Relativní tritr C215Fab-SEA-D227-A byl mnohem nižší u všech chimér, které byly testovány.

Tyto změny na pozicích, odpovídající jednomu nebo více výhodně dvěma pozicím 47, 50, 70, 130, 187, 227 byly provedeny, jak jsou definovány v sekvencích ID č. 7 a 8 na obr. 2.

Vzhledem k tomu, že v rámci koncepce vynálezu který zde byl vysvětlen, jsou možné četné obměny a různá provedení a vzhledem k modifikacím, které mohou být v těchto provedeních v detailech uplatněny v souladu s taxativními požadavky právaje třeba rozumět, že detaily, které zde jsou interpretovány jako ilustrativní, neznamenají omezení podstaty vynálezu.

ODKAZY

Abrahmsén L et al (1995) Characterization of two distinct MHC Class II binding sites in the superantigen staphylococcal enterotoxin A. EMBo J 14:2978-86.

-16CZ 294475 B6

Abrahmsén et al (1996) W09601650 (patent application). A conjugate between a modifíed superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate.

Antonsson P et al (1996) Staphylococcal enterotoxin A and E chiméra with reduced seroreactivity and retained ability to target cytotoxic T cells for use in tumor therapy. ABRF '96: Biomolecular Techniques, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, Califomia. March 30-april 2, 1996.

Dohlsten et al (1988) Two subsets of human peripheral blood CD4+ T helper calls differing in the capacity to produce IL-2 and interferon-gamma can be defíned by the Leu-18 and UCHL1 monoclonal antibodies. Eur J Immunol 18:1173-1178.

Blanco et al (1990) Mutant od staphylococcal toxic shock syndrome toxin 1: Mitogenicity and recognition by a neutralizing monoclonal antibody. Infect. Immun. 58 (1990) 3020-3028.

Dohlsten M et al (1994) Monoclonal antibody-superantigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell based tumor therapy. Proč Nati Acad Sci USA 91:8945-8949.

Dohlsten M et al (1991) Monoclonal antibody-targeted superantigens: A different class of antitumor agents. Proč Nati Acad Sci USA 88:9287-9291.

Dohlsten et al (1992) W09201470 (patent application). Target specific antibody -superantigen conjugates and thier preparation,

Fleury Set al (1991) Mutational analysis of the interaction between CD4 and class II MHC: class II antigens. Cell 66:1037-49.

Fraser JD et al (1993) Structural model of Staphylococcal enterotoxin A interactions with MHC class II antigens. In: Huber, BT Palmer, E (eds) Current Comunications in Cell and Molecular Biology 7. Cols Sprint Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. pp 7-29.

Grossman et al (1991) Mutation of the disulfide loop in staphylococcal enterotoxin A. Consequencs for T cell recognition. J Immunol 147:3274-3281.

Hartwig UF et al (1993) Mutations affectiong MHC class II binding of the superantigen streptococcal erythrogenic toxin A. Int. Immunol. 5 (8) 860-875.

Horton RM et al (1990). Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerace chain reaction. Biotechnique 8:528-535

Hudson et al (1993) Two adjacent residues in staphylococcal enterotoxins A and E determine T cell receptor V beta specificity. J Exp Med 177:175-184.

Hufnagle WO et al (1991) The carboxyl-terminal region of staphylococcal enterotoxin type A is required for a fully active molecule. Infect Immun 59:2126-2134.

Irwin MJ et al (1992). Enterotoxin residues determining T-cell receptor Vb binding specificity. Nátuře 359:841-3

Kalland et al (1991) Wo 9104053 (patent application). Pharmaceutical composition that makes cells expressing MHC Class II antigens targets for cytotoxi cells.

Kappler JW et al (1992) Mutations defining functional regions of the superantigen staphylococcal enterotoxin B. J. Exp med 175:387-396

- 17CZ 294475 B6

Kappler et al (1993) WO9314634 (patent application). Protective effects of mutted superantigens.

Kotzin BL et al (1993) Superantigens and their potential role in human disease. Adv. Immunol 54:99-166.

Kraulis PJ (1991) MOLSCRIPT: A program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl Cryst 24:946-950.

Lamphear JG et al (1996) Residues near the amino and carboxy termini of staphylococcal enterotoxin E independently mediate TCRVp-specific interactions. J Immunol 156: 2178-2185 (March 15, 1996)

Lando PA et al (1993) Co-stimulation with B7 and targeted superantigen is required for MHC class Π-independent T-cell proliferation but not ctotoxicity. Immunology 80: 236-241.

Lindholm et al (1993) 9301302 (patent application). Tumor, carbohydrate antigen specific monoclonal antibody and cell line.

Mollick JA et al (1993) Localization of a site on bacterial superantigens that determines T cell receptor beta chain specifícity. J Exp Med 177:283-293.

Newall et al (1991) In vivo T-cell activation by staphylococcal enterotoxin B prevents outgrowth of a malignant tumor. Proč Nati Acad Sci USA 88 1074-1078

Schad EM et al (1995) Crystal structure of the superantigen, Staphylococcal enterotoxin typu A. EMBOJ 14:3292-3301

Stern et al (1991) WO8907974 (patent application). Improvements relating to anigens.

Terman et al (1991) WO9110680 (patent application). Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds.

Terman et al (1991) WO9324136 (patent application). Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds.

von Heijne, G (1986). A new method for predicting signál sequence cleavage sites. Nucleis Acid Res, 14, 1483-1490.

PŘEHED SEKVENCÍ (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 3 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 1:

Gly Gly Pro (3) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 24 základních párů

-18CZ 294475 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jeden (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 2:

CAATTTTCTT GTCCACCTTG GTGC (4) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 35 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 3:

ACTAGTCGAC ATGGATGGAG CTITATCATI YTCTT (5) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 41 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 4:

ACTAGTCGAC ATGGGCITCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G (6) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 34 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 5:

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCATTCCTGT TGAA (7) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptidy (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 6:

Asp 1	Ala	Val	Met	Thr 5	Gin	Thr	Pro	Thr	Phe 10
L6U	Leu	Val	Ser	Ala 15	Gly	Asp	Arg	Val	Thr 20

-19CZ 294475 B6

Ile	Thr	Cys	Lys	Ala 25	Ser	Gin	Ser	Val	Ser 30
Asn	Asp	Val	Ala	Trp 35	Tyr	Gin	Gin	Lys	Pro 40
Gly	Gin	Ser	Pro	Thr 45	Leu	Leu	Ile	Ser	Tyr 50
Thr	Ser	Ser	Arg	Tyr 55	Ala	Gly	Val	Pro	Asp 60
Arg	Phe	Ile	Gly	Ser 65	Gly	Tyr	Gly	Thr	Asp 70
Phe	Thr	Phe	Thr	Ile 75	Ser	Thr	Leu	Gin	Ala 80
Glu	Asp	Leu	Ala	Val 85	Tyr	Phe	Cys	Gin	Gin 90
Asp	Tyr	Asn	Ser	Pro 95	Pro	Thr	Phe	Gly	Gly 100
Gly	Thr	Lys	Leu	G1U	Ile	Lys

105 (8) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 233 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptidy (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 7:

Ser	Glu	Lys	Ser	Glu 5	Glu	Ile	Asn	Glu	Lys 10	Asp	Leu
Arg	Lys	Lys	Ser	Glu	Leu	Gin	Gly	Thr	Ala	Leu	Gly
				15			20
Asn	Leu	Lys	Gin	Ile	Tyr	Tyr	Tyr	Asn	Glu	Lys.	Ala
25					30					35

-20CZ 294475 B6

Lys	Thr	Glu	Asn 40	Lys	Glu	Ser	His	Asp 45	Gin	Phe	Leu
Gin	His	Thr	Ile	Leu	Phe	Lys	Gly	Phe	Phe	Thr	Asp
	50					55					60
His	Ser	Trp	Tyr	Asn	Asp	Leu	Leu	Val	Asp	Phe	Asp
				65					70
Ser	Lys	Asp	ile	Val	Asp	Lys	Tyr	Lys	Gly	Lys	Lys
		75					80
Val	ASp	Leu	Tyr	Gly	Ala	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Gin	cys
85					90					95
Ala	Gly	Gly	Thr	Pro	Asn	Lys	Thr	Ala	Cys	Met	Tyr
			100					105
Gly	Gly	val	Thr	Leu	His	Asp	Asn	Asn	Arg	Leu	Thr
	110					115					120
Glu	Glu	Lys	Lys	Val	Pro	Ile	Asn	Leu	Trp	Leu	Asp
				125					130
Gly	Lys	Gin	Asn	Thr	Val	Pro	Leu	Glu	Thr	Val	Lys
		135					140
Thr	Asn	Lys	Lys	Asn	Val	Thr	Val	Gin	Glu	Leu	Asp
145					150					155
Leu	Gin	Ala	Arg	Arg	Tyr	Leu	Gin	Glu	Lys	Tyr	Asn
				160				165
Leu	Tyr	Asn	Ser	Asp	Val	Phe	Asp	Gly	Lys	Val	Gin
	170					175					180
Arg	Gly	Leu	Ile	Val	Phe	His	Thr	Ser	Thr	Glu	Pro
				185					190
Ser	Val	Asn	Tyr	Asp	Leu	Phe	Gly	Ala	Gin	cly	Gin
		195					200
Tyr	Ser	Asn	Thr	Leu	Leu	Arg	Ile	Tyr	Arg	Asp	Asn
205					210					215
Lys	Thr	Ile	Asn	Ser	Glu	Asn	Met	His	Ile	Asp	Ile
			220					225
Tyr	Leu	Tyr	Thr	Ser

230 (9) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 233 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptidy (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 8:

-21 CZ 294475 B6

Ser	Glu	Lys	Ser	GlU 5	Glu	Ile	Asn	Glu	Lys 10	Asp	Leu
Arg	Lys	Lys 15	Ser	Glu	Leu	Gin	Arg 20	Asn	Ala	Leu	Ser
Asn 25	Leu	Arg	Gin	Ile	Tyr 30	Tyr	Tyr	Asn	Glu	Lys 35	Ala
Zle	Thr	Glu	Asn 40	Lys	Glu	Ser	Asp 45	Asp	Gin	Phe	Leu
Glu	Asn 50	Thr	Leu	Leu	Phe	Lys 55	Gly	Phe	Phe	Thr	Gly 60
His	Pro	Trp	Tyr	Asn 65	Asp	Leu	Leu	Val	Asp 70	Leu	Gly
Ser	Lys	Asp 75	Ala	Thr	Asn	Lys	Tyr 80	Lys	Gly	Lys	Lys
Val 85	Asp	Leu	Tyr	Gly	Ala 90	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Gin 95	Cys
Ala	Gly	Gly	Thr 100	Pro	Asn	Lys	Thr	Ala 105	Cys	Met	Tyr
Gly	Gly 110	Val	Thr	Leu	His	Asp 115	Asn	Asn	Arg	Leu	Thr 120
Glu	Glu	Lys	Lys	Val 125	Pro	Zle	Asn	Leu	Trp 130	Ile	Asp
Gly	Lys	Gin 135	Thr	Thr	Val	Pro	11« 140	Asp	Lys	Val	Lys
Thr 145	Ser	Lys	Lys	Glu	Val 150	Thr	Val	Gin	Glu	Leu 155	Asp

Claims (30)

1. Konjugát mezi

a) superantigenem divokého typu, který je modifikován a

b) skupinou hledající cíl, ve kterém modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence prvního superantigenu divokého typu v tom, že alespoň jeden aminokyselinový zbytek v regionu I, kde region I se nachází ve vazebném místě receptoru T buněk a určuje vazbu k řetězci νβ receptoru T buněk a aktivaci T buněk, uvedeného prvního superantigenu divokého typu je nahrazen jedním nebo více aminokyselinovými zbytky z odpovídající pozice v druhém superantigenu divokého typu, tento modifikovaný antigen vykazuje zlepšenou schopnost indukovat proliferaci T buněk a cytotoxicitu ve srovnání s prvním superantigenem divokého typu a cytotoxicitu ve srovnání s prvním suprantigenem divokého typu a má sníženou seroreaktivitu ve srovnání s druhým superantigenem divokého typu, modifikovaný superantigen dále obsahuje mutaci, která snižuje jeho schopnost vázat se k antigenům MHC třídy II ve srovnání s oběma uvedenými superantigeny divokého typu, a skupina hledající cíl je zvolena ze souboru sestávajícího z aktivního fragmentu protilátky, protilátky a protilátky s jednoduchým řetězcem, Fab, F(ab)2 a Fv.

2. Konjugát podle nároku 1, ve kterém první superantigen divokého typu je stafylokokový enterotoxin A (SEA).

3. Konjugát podle nároku 1, ve kterém první superantigen divokého typu je stafylokokový enterotoxin E (SEE).

-23 CZ 294475 B6

4. Konjugát podle nároku 2, ve kterém druhý superantigen divokého typu je stafylokokový enterotoxin E (SEE).

5. Konjugát podle nároku 3, ve kterém druhý superantigen divokého typu je stafylokokový enterotoxin A (SEA).

6. Konjugát podle nároku 4, ve kterém region I je regionem A, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 8.

7. Konjugát podle nároku 4, ve kterém region I je regionem C, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 8.

8. Konjugát podle nároku 4, ve kterém region I je regionem F, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 8.

9. Konjugát podle nároku 4, ve kterém region I je regionem H, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 8.

10. Konjugát podle nárok 5, ve kterém region I je regionem A, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 7.

11. Konjugát podle nároku 5, ve kterém region I je regionem C, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 7.

12. Konjugát podle nároku 5, ve kterém region I je regionem F, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 7.

13. Konjugát podle nároku 5, ve kterém region I je regionem H, jak je zobrazen na obr. 2 a v SEQ 7.

14. Konjugát podle nároku 10, ve kterém je provedena následující substituce aminokyselin R20G, N21T, S24G a R27K, kde pozice jsou zobrazeny na obr.2.

15. Konjugát podle nároku 14, který dále obsahuje mutace na pozici 227, jak je zobrazena na obr. 2.

16. Konjugát podle nároku 15, ve kterém je mutace D227A.

17. Konjugát podle jakéhokoliv z nároků 1 až 16, ve kterém cysteinové zbytky dovolující vazbu cysteinů mezi řetězci v protilátce nebo ve fragmentu protilátky jsou nahrazeny serinovýmizbytky

18. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu, definovaného v nároku 1, obsahujícího superantigen divokého typu, který je modifikován, přičemž modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci superantigenu prvního divokého typu, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků v alespoň jednom regionu

i) který je přítomen uvnitř uvedené aminokyselinové sekvence superantigenu prvního divokého typu a

ii) který působí při determinaci vazby k receptorů T buněk a následné aktivaci subsouboru T buněk

-24CZ 294475 B6 je zaměněn odlišným aminokyselinovým zbytkem, přičemž uvedený modifikovaný antigen si zachovává schopnost aktivovat subsoubor T buněk pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

19. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároku 18, ve kterém uvedený modifikovaný superantigen je chimérický superantigen mezi superantigenem prvního divokého typu a jedním nebo více přídavnými superantigeny divokého typu, přičemž každý z jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v alespoň jednom regionu uvedeného superantigenu prvního typu je nahrazen odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem, přítomným v odpovídajícím regionu uvedeného superantigenu nebo superantigenu jednoho nebo více přídavných divokých typů, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

20. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle kteréhokoliv z nároků 18 až 19, ve kterém nemoc je spojena s tím, že buňky exprimují povrchovou cílovou strukturu, která váže na svém epitopu superantigen, přičemž tento epitop je strukturálně odlišný od epitopu vázajícího se k receptorů T buněk a ve kterém vazba k povrchu vázající struktury umožňuje vazbu k receptorů T buněk s následnou aktivací subsouboru T buněk, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

21. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároků 18 a 20, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců jako je například rakovina, virové infekce, parazitická napadení a autoimunitní choroby, aktivací imunitního systému léčeného savce.

22. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároků 18 až 21, kdy superantigeny divokého typu jsou zvoleny ze skupiny sestávající z SEA, SED a SEE a analogických superantigenů, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

23. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároku 22, ve kterém alespoň jeden region je zvolen ze skupiny zahrnující regiony A, C, F nebo H jak jsou definovány v obr. 2, SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO 8, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

24. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároků 18 až 23, ve kterém uvedený superantigen prvního divokého typuje SEE a uvedený region je zvolen ze skupiny zahrnující A, C, F a H, jak jsou definovány v SEQ ID NO 8 v obr. 2, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

25. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároku 24, ve kterém alespoň jeden region je region A a dále jsou provedeny následující substituce aminokyselinových zbytků: R20G, N21T, S24G a R27K, přičemž pozicejsou definovány v SEQ ID NO 8 v obr. 2, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

26. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároků 18 až 25, ve kterém alespoň jeden přídavný superantigen divokého typu je SEA, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

27. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároků 18 až 26, kdy uvedeným superantigenem je konjugát, definovaný v kterémkoliv z nároků 1 až 17, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

-25CZ 294475 B6

28. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároku 27, ve kterém superantigeny divokého typu jsou zvoleny z superantigenu vyžadujících vazbu k zinkovým iontům, aby se mohly navázat kMHC třídy II, přičemž aminokyselinový zbytek v sekvenci superantigenu prvního divokého typu je zaměněn v pozici, umožňující vazbu k zinku, pro snížení schopnosti vazby MHC třídy II, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

29. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároku 28, ve kterém uvedené pozice odpovídají 227, jak je definováno v obr. 2, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, s důrazem na mutaci D227A, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.

30. Použití terapeuticky účinného množství superantigenu obsahujícího superantigen divokého typu podle nároků 27 až 29, ve kterém skupinou hledající cíl je Fab fragment, ve kterém každý z cysteinových zbytků, vytvářejících můstek mezi řetězci, je zaměněn aminokyselinovým zbytkem, neumožňujícím vazbu mezi řetězci, přičemž je výhodně nahrazen serinem, pro přípravu léčiva k léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce.