PL189696B1 - Koniugat, kompozycja obejmująca koniugat i zastosowanie koniugatu - Google Patents

Abstract

1. Koniugat pomiedzy a) superantygenem typu dzikiego, który zostal zmodyfikowany, i b) domena po szukujaca celu, znam ienny tym , ze zm odyfikowanym superantygenem je st SEE, w którym jedna albo wiele reszt aminokwasowych w regionie I, który to region I jest w miejscu wiazacym receptora limfocytu T (TCR) i okresla wiazanie do lancucha Vß TCR i aktywacje lim focytów T, zostaly zastapione przez je d n a lub wiecej reszt aminokwasowych z odpowiadajacej pozycji w SEA, tak, ze zm odyfikowany superantygen wykazuje polepszona zdolnosc do indukowania cytotoksycznosci lim focytów T w porównaniu z SEE oraz zm niejszona seroreaktywnosc w porównaniu z SEA, oraz zm odyfikowany superantygen zaw iera ponadto mutacje, która zm niejsza jego zdolnosc do wiazania z antygenami M HC klasy II w porównaniu z którym - kolwiek z wyzej wymienionych superantygenów typu dzikiego. 10. Kompozycja, zn am ienna tym , ze obejmuje terapeutycznie skuteczna ilosc koniugatu pomiedzy: a) superantygenem typu dzikiego, który zostal zmodyfikowany, i b) dom ena poszukujaca celu, do zastosowania w leczeniu choroby u ssaka przez aktywowanie ukladu odpornosciow ego tego ssa- ka, przy czym zmodyfikowanym superantygenem w koniugacie jest SEE, w którym jedna albo wiele reszt am inokwasowych w regionie I, który to region 1 jest w miejscu wiazacym receptora lim focytu T (TCR) i okresla wiazanie do lancucha v p TCR i aktywacje limfocytów T, zostaly zastapione przez je d n a lub w ie- cej reszt aminokwasowych z odpowiadajacej pozycji w SEA, tak, ze zm odyfikowany superantygen w ykazu- je polepszona zdolnosc do indukowania cytotoksycznosci limfocytów T w porównaniu z SEE oraz zm niej- szona seroreaktywnosc w porównaniu z SEA, oraz zmodyfikowany superantygen zawiera ponadto mutacje, która zm niejsza jego zdolnosc do w iazania z antygenami MHC klasy II w porównaniu z którym kolwiek z wyzej wymienionych superantygenów typu dzikiego. 22. Koniugat okreslony w zastrz. 1 do zastosowania jako lek. 23. Zastosowanie koniugatu okreslonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia choroby u ssa- ka przez aktywacje ukladu odpornosciowego, przy czym choroba jest w ybrana z grupy obejm ujacej nowo- twory, zakazenia wirusowe, inwazje pasozytnicze i choroby autoagresyjne. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest koniugat, kompozycja obejmująca koniugat i zastosowanie koniugatu. Niniejsze zgłoszenie korzysta z pierwszeństwa ze szwedzkiego zgłoszenia patentowego nr 9601245-5, zgłoszonego 29 marca 1996, i zgłoszenia USA 08/695,692, zgłoszonego 12 sierpnia 1996, które są powołane tu w całości jako odnośniki.

Niniejszy wynalazek dotyczy funkcjonalnie czynnych zmodyfikowanych superantygenów, które są superantygenami typu dzikiego (SA I), w których jedną lub wiele reszt aminokwasowych zastąpiono przy zachowaniu ich funkcji superantygenu. W przypadku jednej lub wielu reszt zastępujących (albo ich konserwatywnych reszt aminokwasowych) występujących w odpowiednich pozycjach w innym superantygenie typu dzikiego (SA II), zmodyfikowany superantygen zwany jest chimerą (czasami hybrydą). Chimeryczne superantygeny zawierają więc część sekwencji/regionów pochodzących z przynajmniej dwóch superantygenów typu dzikiego.

Przez określenie „odpowiednich” rozumie się, że reszty, części sekwencji i regiony zastępujące się nawzajem mają czynnościowo to samo położenie w superantygenach I i II tak, że zastąpienie daje postać chimeryczną, która jest zdolna do działania jako superantygen.

Terminologia „przeszczepiony/przeszczepianie/przeszczep” jest stosowana w odniesieniu do części pełnej sekwencji superantygenu II, które zastąpiły odpowiednie części superantygenu I, nawet gdy zastąpiono pojedynczy aminokwas.

Zmodyfikowane/chimeryczne superantygeny obejmują również funkcjonalne superantygeny zmodyfikowane w inny sposób, przykładowo zmodyfikowane przez zastąpienie aminokwasu w regionach innych niż związane z wynalazkiem, sprzęgnięte z domeną poszukującą celu, w tym również postać fuzyjna, w której domena jest polipeptydem/białkiem. Sposób przeprowadzania modyfikacji może być różny. Patrz niżej.

Nawiązując do pierwszej definicji (około 1988-1993) superantygeny są białkami bakteryjnymi albo wirusowymi, zdolnymi do wiązania antygenów. MHC klasy II bez uprzedniego przetwarzania wewnątrzkomórkowego i aktywującymi limfocyty T przez

189 696 związanie się z regionem zmiennym łańcucha β (νβ) receptora limfocytów T (TCR).

Wiązanie prowadzi do aktywacji ograniczonej do rodziny νβ, względnie dużego odsetka/podtypu limfocytów T i lizy komórek wyrażających MHC klasy II (cytoliza komórkowa zależna od superantygenu = SDCC).

Dobrze znanymi superantygenami typu dzikiego według tej definicji są enterotoksyny gronkowcowe (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE i SEH). Dalszym przykładem jest toksyna 1 zespołu wstrząsu septycznego (TSST-1, również pochodzenia gronkowcowego), toksyna eksfoliatywna (Exft), paciorkowcowa pirogenna toksyna A, B i C (SPE A, B i C), białka wirusa guza sutka myszy (MMTV), białka M paciorkowców: enterotoksyna pałeczki ropy błękitnej, superantygeny mykoplazmatycznego zapalenia stawów itp. Przegląd superantygenów i ich właściwości opublikowano w Kozin i in., 1993.

We wczesnych latach 90-tych odkryto, że aktywacja i następująca po niej liza komórek może nastąpić w sposób niezależny od MHC klasy II i w przypadku sprzęgnięcia superantygenu z domeną poszukującą celu, zdolną do wiązania ze strukturą powierzchni komórki (Dohlsten i in., W09201470 i Abramsen i in., W09601650). Po inkubacji komórek docelowych (niosących strukturę stanowiącą cel dla domeny poszukującej celu) i komórek efektorowych (limfocytów T) z koniugatem, komórki docelowe ulegają lizie (cytoliza komórkowa zależna od koniugatu przeciwciała z superantygenem = SADCC) bez konieczności ekspresji MHC klasy II. Obecna koncepcja antygenu stosowana w kontekście niniejszego wynalazku, jeżeli nie zaznaczono inaczej, obejmuje dowolny składnik (korzystnie strukturę polipeptydową), która jest zdolna do wiązania struktury powierzchniowej komórki (struktury stanowiącej cel) oraz jednego lub więcej łańcuchów polimorficznych TCR, w szczególności łańcucha νβ, aktywując w ten sposób podtyp limfocytów T wyrażających konkretny łańcuch TCR biorący udział w wiązaniu. Limfocyty T stają się wówczas cytotoksyczne dla komórek niosących strukturę powierzchniową (stanowiącą cel, komórki docelowe). Normalnie aktywowany podtyp limfocytów T stanowi około 1-20% całkowitej ilości limfocytów T osobnika.

Stan techniki

Badania strukturalne i funkcjonalne wykorzystujące superantygeny zmutowane i chimeryczne

Superantygeny chimeryczne, w tym formy zmutowane punktowo, opisano uprzednio (Kappler i in., WO9314346; Kappler i in., 1992; Hufnagle i in., 1991; Hartwig i in., 1993; Fraser i in., 1993; Mollick i in., 1993; Irwin i in., 1992; Hudson i in., 1993; Blanco i in., 1990). Mollick i in., oraz Hudson i in., wykazali w badaniach na chimerach, że swoistość SEA i SEE wobec νβ znajduje się w pewnych sekwencjach aminokwasowych obecnych w regionie karboksylowym (tj. reszty aminokwasowe 200, 206 i 207). Oprócz tego, głównie w oparciu o ten region, Mollick i in., wykazali również, że do całkowitego odtworzenia aktywności SEA przypominającej SEE, zawierającej przeszczep SEE skierowany przeciwko Vβ8, konieczny był N-końcowy fragment SEE wielkości 70 aminokwasów. Fragment ten zawierał części miejsca wiązania łańcucha a MHC klasy II przypominające SEE, zaś chimeryczne cząsteczki SEA/SEE zawierające tą część z SEE hamowały wiązanie SEA z DR1 MHC klasy II w sposób przypominający SEE.

Ostatnio, opisano chimery SEE-SEA obejmujące wymianę regionów związanych z wiązaniem z TCR V β (Lamphaer i in., J. Immunol. 156 (marzec 15, 1996) 2178-2185). Białko fuzyjne superantygenu SEE i fragmentu Fab przeciwciała, w którym domeny SEE brały udział w oddziaływaniu z limfocytami T zastąpiono odpowiednimi niehomologicznymi domenami SEA było omawiane na ABRF'96: Biomolecular Techniąues, Holiday Inn Golden Gateway, California, 30 marca - 2 kwietnia 1996 (Bjork i in., M45).

Stan techniki - zastosowanie terapeutyczne superantygenów.

Sugerowano, że nieskoniugowane superantygeny nadają się do leczenia, przy czym ich wpływ leczniczy należy przypisać uogólnionej aktywacji układu odpornościowego (Kalland i in., WO 9104053; Terman i in., WO 9110680 i WO 9324136; Newall i in., 1991).

Sugerowano również, że zastosowanie zmodyfikowanych superantygenów koniugowanych z domenami poszukującymi celu (Dohlsten i in., WO 9201470; Abrahmsen i in., WO 9601650, załączone tu jako odnośniki). Umożliwiło to szersze zastosowanie terapeutyczne aktywacji lim189 696 focytów T przez νβ. Badane do tej pory koniugaty wykazywały zmniejszone powinowactwo wobec klasy II, co z kolei prowadziło do zmniejszenia ciężkiej toksyczności ogólnoustrojowej normalnie związanej z superantygenami typu dzikiego.

Terman i in., (WO 9110680 i WO 9324136) sugerowali terapię przeciwnowotworową zmodyfikowanymi superantygenami i fragmentami superantygenów.

Kappler i in., (WO9314634) sugerowali zastosowanie nieskoniugowanych superantygenów (SEB) zmutowanych w sposób znoszący ich zdolność wiązania νβ albo MHC klasy II (w kontekście szczepionek oraz w celu neutralizacji efektów toksycznych superantygenów).

Abrahmsen i in., (WO 9601650) sugerowali terapię nowotworową koniugowanymi superantygenami o zmodyfikowanej, korzystnie osłabionej, zdolności wiązania antygenów klasy II. Modyfikacje obejmowały pojedyncze mutacje jak również konstruowanie chimer pomiędzy różnymi superantygenami. Problemy rozwiązywane przez niniejszy wynalazek.

Surowice populacji ludzkiej zawierają wysokie miana przeciwciał przeciwko superantygenom. Przykładowo, dla superantygenów gronkowcowych względne miano są następujące TSST-1 > SEB > SEC1 > SE3 > sEc > SEA > SED > SEE. Te względne miana wskazują na problem immunogenności oraz problem przeciwciał neutralizujących w przypadku pozajelitowego podawania SE. W oparciu o te problemy, SEE powinien być korzystnym superantygenem gronkowcowym. W kontekście pracy z białkami fuzyjnymi jednakże, stwierdzono, że zdolność limfocytów T do cytotoksyczności niezależnej od MHC klasy II, cytotoksyczności komórkowej zależnej od koniugatu przeciwciała z superantygenem (SADCC) w przypadku koniugatów SEE jest słaba. Miana przeciwciał wobec Se wskazują również, że korzystne być może modyfikowanie superantygenów z „wysokimi mianami” w sposób taki by przypominały superantygeny o „niskich mianach”.

Cele niniejszego wynalazku

Celem niniejszego wynalazku jest ulepszenie znanych uprzednio superantygenów, w sposób zmniejszający ich immunogenność i reakcję z przeciwciałami neutralizującymi, dostarczenie superantygenów o mniejszych efektach ubocznych do zastosowania jako leki, oraz dostarczenie ulepszonych superantygenów, które mogą być stosowane jako składnik czynny w leczeniu ssaków cierpiących z powodu nowotworów, chorób autoagresyjnych, inwazji pasożytniczych, zakażeń wirusowych albo innych chorób związanych z komórkami, które na swoich powierzchniach wyrażają antygeny MHC klasy II i/lub struktury swoiste dla danej choroby i wiążą domenę poszukującą celu włączoną do superantygenu.

Ujawnienie prowadzące do powstania wynalazku

Analiza homologii sekwencji SEA i SEE (fig. 2) wykazała, że nieidentyczne reszty aminokwasowe koncentrują się w ośmiu osobnych regionach. Poza tymi ośmioma regionami, tworzącymi około 34% sekwencji, identyczność obu SE wynosi 97%, z zastąpieniami konserwatywnych aminokwasów stanowiącymi pozostałą różnicę. Cztery z tych regionów są strukturalnie pokrewne z dwoma miejscami wiążącymi MHC klasy II (B: AA 37-50, D: 71-78, E: 136-149 i G: 189-195) i prawdopodobnie nie oddziaływają z TCR. Dodatkowe cztery regiony (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 i H: 200-207) są położone na brzegu cząsteczki, w pobliżu domniemanego miejsca wiążącego TCR, prawdopodobnie w zagłębieniu pomiędzy dwoma poddomenami. Przez przeszczepianie poszczególnych regionów (zastąpienie różniących się reszt aminokwasowych) stwierdzono, że właściwość koniugatów SEA do wywoływania odpowiedzi cytotoksycznej, jak również odpowiedzi wzmagającej proliferację pod nieobecność MHC klasy II znajduje się w jednym regionie w domenie wiążącej TCR SEA. Region ten (A) można przenieść do sEe i ma on wielki wpływ na aktywność pod nieobecność klasy II, ale ograniczony efekt wobec swoistości superantygenu wobec νβ (fig. 6, tab. 2). Wszystkie z tych regionów (A, C, F i H) wydają się uczestniczyć, pośrednio albo bezpośrednio, w oddziaływaniu z TCR manifestującym się zmienionym wpływem pobudzającym na mysie hybrydoma limfocytów T (tab. 2).

Przekonujące jest to, że z powodu analogicznego sposobu działania, podobny rozdział strukturalny tych właściwości wiązania TCRVP jest również zgodny dla superantygenów analogicznych z SEA i SEE. Może to również dotyczyć innych rodzajów superantygenów, w których inaczej są zorganizowane struktury wiążące. Ujawnienie to umożliwiło zarys konstrukcji

189 696 superantygenów chimerycznych, które potencjalnie mają wielką wartość jako czynniki terapeutyczne.

Wynalazek

Przedmiotem wynalazku jest zatem koniugat pomiędzy a) superantygenem typu dzikiego, który został zmodyfikowany, i b) domeną poszukującą celu, przy czym zmodyfikowanym superantygenem jest SEE, w którym jedna albo wiele reszt aminokwasowych w regionie I, który to region I jest w miejscu wiążącym receptora limfocytu T (TCR) i określa wiązanie do łańcucha VP TCR i aktywację limfocytów T, zostały zastąpione przez jedną lub więcej reszt aminokwasowych z odpowiadającej pozycji w SEA, tak, że zmodyfikowany superantygen wykazuje polepszoną zdolność do indukowania cytotoksyczności limfocytów T w porównaniu z SEE i zmniejszoną seroreaktywność w porównaniu z SEA, oraz zmodyfikowany superantygen zawiera ponadto mutację, która zmniejsza jego zdolność do wiązania z antygenami MHC klasy II w porównaniu z którymkolwiek z wyżej wymienionych superantygenów typu dzikiego. Korzystnie, region I jest regionem A, jak przedstawiono na fig. 2, składającym się z reszt aminokwasowych 20 do 27 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7. Korzystnie, region I jest regionem C, jak przedstawiono na fig. 2, składającym się z reszt aminokwasowych 60 do 62 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7. Również korzystnie, region I jest regionem F, jak przedstawiono na fig. 2, składającym się z reszt aminokwasowych 161 do 176 z sekwencji 0 Identyfikatorze Sekw. Nr 7. Ponadto, korzystnie region I jest regionem H, jak przedstawiono na fig. 2, składającym się z reszt aminokwasowych 200 do 207 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.

Korzystniej koniugat według wynalazku zawiera następujące podstawienia aminokwasowe: R20G N21T, S24G i R27K, przy czym pozycje określono jak w Identyfikatorze Sekw. Nr 7. Jeszcze korzystniej koniugat zawiera ponadto mutację w pozycji 227 jak określono w Identyfikatorze Sekw. Nr 7. Najkorzystniej mutacją tą jest mutacja D227A.

Również korzystnie domena poszukująca celu w koniugacie według wynalazku jest wybrana z grupy składającej się z wiążącego antygen aktywnego fragmentu przeciwciała, przeciwciała wiążącego antygen, przeciwciała jednołańcuchowego, Fab, F(ab)2 oraz Fv.

Korzystnie koniugat według wynalazku jest przeznaczony do stosowania jako lek.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja obejmująca terapeutycznie skuteczną ilość koniugatu według wynalazku do zastosowania w leczeniu choroby u ssaka przez aktywowanie układu odpornościowego tego ssaka. Korzystnie choroba, do leczenia której jest przeznaczona kompozycja według wynalazku jest związana z komórkami wyrażającymi docelową strukturę powierzchniową, która wiąże się z fuzją superantygenu w epitopie superantygenu strukturalnie innym niż epitop wiążący TCR, przy czym wiązanie to pozwala na wiązanie do TCR i aktywację limfocytów T przez superantygen. Korzystniej, choroba ta jest wybrana z grupy składającej się z nowotworów, zakażeń wirusowych, inwazji pasożytniczych i chorób autoagresyjnych, a najkorzystniej jest rakiem.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie koniugatu do wytwarzania leku do leczenia choroby u ssaka przez aktywację układu odpornościowego, przy czym choroba jest wybrana z grupy obejmującej nowotwory, zakażenia wirusowe, inwazje pasożytnicze i choroby autoagresyjne, a korzystnie jest rakiem.

Rozwiązanie według wynalazku umożliwiają leczenie choroby u ssaka, w tym również człowieka, przez aktywację jego układu odpornościowego przez podanie skutecznej terapeutycznie (aktywującej odporność) ilości zmodyfikowanego i/lub chimerycznego superantygenu. Choroby, w przypadku których znajdują zastosowania rozwiązania według wynalazku, są w większości związane z komórkami wyrażającymi na powierzchni strukturę stanowiącą cel, wiążącą superantygen. Struktura stanowiąca cel jest w większości przypadków różna od epitopu TCR normalnie wiążącego superantygen. Wiązanie struktury stanowiącej cel umożliwia również wiązanie z TCR i aktywację limfocytów T. Przykładami są antygeny MHC klasy II i inne struktury powierzchniowe komórki, które mogą ulegać ekspresji na komórkach związanych z przebiegiem choroby. Przykładami chorób są nowotwory złośliwe obejmujące dowolny rodzaj nowotworu (taki jak rak, mięsak, czerniak, chłoniak itp.), zakażenia wirusowe, inwazje pasożytnicze i choroby autoagresyjne. Do nowotworów należą, między innymi, nowotwory okrężnicy, sutka, szyjki macicy, nerki, żołądka, jelita cienkiego, dwunastnicy, gruczołu kro189 696 kowego, jądra, skóry, płuc, wątroby, trzustki, kością itp., w tym również przerzuty do innych organów. Rozwiązania według wynalazku można również stosować w tzw. wielolekoopornych postaciach nowotworów. Komórki wyrażające strukturę stanowiącą cel mogą być również komórkami, które w pewien sposób kontrolują albo regulują rozwój leczonej choroby.

Podstawą rozwiązań według wynalazku jest to, że stosuje się zmodyfikowany superantygen, w którym jedna lub wiele reszt aminokwasowych w regionie (region I) zapewniającym wiązanie z podtypem limfocytów T przez polimorficzny łańcuch TCR, w szczególności TCRYP, w superantygenie typu dzikiego (SA I) jest zastąpionych odpowiednią resztą aminokwasową pozwalającą zachować zmodyfikowanemu superantygenowi aktywność superantygenu. Chimeryczny superantygen jest superantygenem, w którym jedna lub wiele reszt aminokwasowych w regionie (region I) pierwszego superantygenu typu dzikiego (SA I) zostało zastąpionych odpowiednią jedną albo wieloma resztami aminokwasowymi w odpowiednim regionie (region II) drugiego superantygenu typu dzikiego (SA II). Regiony I i II różnią się pod względem sekwencji aminokwasowych. Superantygeny I i II wybiera się w taki sposób, że regiony I i II można zastąpić wymiennie bez zniszczenia funkcji superantygenu. W tym kontekście należy zwrócić uwagę na fakt, że konkretny region I może nie być wymienny z odpowiednim regionem innego superantygenu typu dzikiego, mimo że kiedy jest wymieniany razem z innymi regionami określającymi wiązanie z TCR i aktywację limfocytów T, w wyniku uzyskuje się czynny superantygen. Wymieniane regiony zwykle zawierają mniej niż 20 reszt, w szczególności superantygeny analogiczne z SEA. Zastępująca reszta jest więc różna od zastępowanej reszty, i możliwe jest, że obejmuje zastąpienia konserwatywne i inne zastąpienia aminokwasowe prowadzące do powstania funkcjonalnie czynnych zmodyfikowanych superantygenów, umożliwiając wiązanie z TCRVp i aktywację podtypu limfocytów T. Oznacza to, że superantygeny zmodyfikowane w najszerszym sensie obejmują dowolny zmodyfikowany superantygen, w którym jeden lub wiele aminokwasów we wspomnianych regionach zastąpiono funkcjonalnie.

Określenie „zastąpienie konserwatywne” dotyczy zastąpienia reszty aminokwasowej przez resztę podobną chemicznie, np. reszty hydrofobowej inną resztą hydrofobową, reszty obdarzonej ładunkiem inną, ale podobnie naładowaną resztą itp.

Mimo, że rozwiązania według wynalazku wykorzystują jako superantygeny enterotoksyny gronkowcowe, SEA i SEE, możliwe jest zastosowanie analogicznych rozwiązań dla innych superantygenów, takich jak SED i prawdopodobnie również SEH.

Regiony poddawane modyfikacji w superantygenach mogą wykazywać jedną z aktywności (patrz część opisu zatytułowana „Ujawnienie prowadzące do powstania wynalazku” oraz część doświadczalna):

1. Znaczny wpływ na aktywność superantygenu jako taką oraz ograniczony wpływ na swoistość TCR, w szczególności swoistość wobec V β. Dla superantygenów typu SEA oznacza to region A (pozycje aminokwasowe 20-27).

2. Zaznaczony wpływ na swoistość pod względem wiązania polimorficznych łańcuchów TCR, takich jak łańcuch Vp. Dla superantygenów typu SEA oznacza to region C (pozycje aminokwasowe 60-62), F (pozycje aminokwasowe 110-126) i H (pozycje aminokwasowe 200-207).

Dla superantygenów typu SEA oznacza to jedno lub wiele zastąpień (zastosowanych wobec przeszczepów SEA na SEE; chimery SEE/A):

Region A: R20G, N21T, S24G, R24K

Region C: G60D, P62S

Region F: H11R, H114Q, G115 Y, F117 Y, G118N, S24V, G126D

Region H: D200G, P206S, D207N.

Dla innych superantygenów mogą być również przeprowadzone analogiczne zastąpienia pomiędzy odpowiednimi pozycjami/regionami.

Zwykle można rozpocząć od pierwszego superantygenu, takiego jak SEE i SED, a następnie zastąpić jeden lub wiele unikalnych regionów wiążących odpowiednimi regionami drugiego superantygenu (np. SEA), przy czym pierwszy i drugi superantygen korzystnie są wybrane w taki sposób, że miano przeciwciał wobec pierwszego superantygenu w normalnej

189 696 surowicy ludzkiej jest niższe niż dla drugiego superantygenu. Dla chimer SEA i SEE, najlepsze właściwości wykazują SEE/A-A, SEE/A-AH i SEA/E-BDEG, a w szczególności sEe/A-A. Patrz część doświadczalna oraz figury.

Wraz z regionami A, C, F i H, również aminokwasy w innych częściach mogą zostać zastąpione. Jednym rodzajem zamiany jest zmniejszenie zdolności wiązania klasy II, ponieważ właściwość ta jest związana z powszechnym efektem ubocznym spotykanym w terapii superantygenami (uogólniona aktywacja odporności z równoczesnym układowym uwolnieniem czynnika martwicy nowotworów (TNF) i interferonu-y. Dla superantygenów takich jak SEA, SED i SEE, pozycja która jest istotna dla zdolności do koordynacyjnego wiązania jonów cynku może zostać korzystnie zmieniona, tj. pozycja 225 i 227, przykładowo w mutacji SEA H225A zaś w szczególności D227A powinna wykazać wpływ pozytywny na zmniejszenie toksycznych objawów ubocznych (patrz, Abrahmson i in., WO 9601650 i Fraser i in., 1993).

Inne zastąpienia mogą być również wykonane w cząsteczce pod warunkiem, że nie niszczą one działania superantygenu, przykładowo zastąpienia konserwatywne, w szczególności poza regionami związanymi z wiązaniem klasy II i TCR. Zmiana sekwencji DNA w celu zmiany wiązania z MHC klasy I albo jakakolwiek inna zmiana na poziomie DNA może być przeprowadzona bez poprzedzającej albo późniejszej zmiany w regionach zapewniających wiązanie z TCR. Te inne rodzaje modyfikacji mogą być równie dobrze wprowadzone przed zastąpieniem aminokwasu w regionie I. W kontekście niniejszego wynalazku koncepcja wykorzystania „superantygenu typu dzikiego” na początku modyfikacji, jak zostało to opisane w zastrzeżeniach, dotyczy przede wszystkim sekwencji aminokwasowej typu dzikiego w regionie I, poza którym wcześniejsze modyfikacje mogą mieć miejsce.

Konstruowanie chimerycznych i zmutowanych superantygenów można przeprowadzić technikami znanymi w stanie techniki. Przełączenia z regionu swoistego dla jednego superantygenu na odpowiedni region w innym superantygenie dokonuje się na poziomie genomowym i może być ono osiągnięte przez zastąpienie kompletnej sekwencji albo przez mutację punktową tych konkretnie zasad, które są wymagane do uzyskania pożądanej sekwencji aminokwasowej. Patrz, przykładowo część doświadczalna jak również cytowany stan techniki. Określenie „mutacja” obejmuje zastąpienie, wprowadzenie albo usunięcie jednej lub wielu reszt aminokwasowych przez modyfikowanie sekwencji DNA kodującej mutowane białko.

W rozwiązaniach według wynalazku stosuje się zmodyfikowany chimeryczny superantygen sprzęgnięty z domeną poszukującą celu.

Struktury koniugatu według wynalazku są analogiczne do wcześniej znanych koniugatów przeciwciał z superantygenami (Dohlsten i in., WO 9201470; Abrahmsen i in., WO 9601650, załączone tu jako odnośniki), tj. są zgodne ze wzorem:

T-B-SA(m) w którym T oznacza domenę poszukującą celu, SA(m) oznacza zmodyfikowany, chimeryczny superantygen jak to opisano wyżej, zaś B oznacza mostek kowalencyjny łączący T i SA (m). T może w zasadzie zawierać dalsze domeny superantygenu (SA(m)), zaś SA(m) dalsze domeny poszukujące celu, jakkolwiek rozwiązania według wynalazku dotyczą przypadków, w których występuje tylko jedna domena poszukująca celu i jedna zmodyfikowana domena superantygenu opisaną wyżej.

T w zasadzie może być dowolną strukturą zdolną do wiązania się ze strukturą powierzchniową, korzystnie strukturą swoistą dla choroby. Struktura, przeciwko której skierowane jest T jest zwykle różna od (a) epitopu łańcucha νβ, z którym wiąże się SA(m), i (b) epitopów MHC klasy II, z którymi wiążą się superantygeny. Domena poszukująca celu jest wybrana przede wszystkim spośród interleukin (np. interleukina-2), hormonów, przeciwciał, w tym fragmentów przeciwciał wiążących antygen, czynników wzrostowych itp. Patrz, przykładowo, Woodworth, Preclinical and Clinical Development of Cytokine Toxins, przedstawione na konferencji „Molecular Approaches to Cancer Immunotherapy”, Ashville, North Carolina, 7-11 listopad 1993.

W rozwiązaniach według wynalazku T może być przeciwciałem (pełnej długości, Fab, F(ab)2, Fv, przeciwciałem jednołańcuchowym albo dowolnym fragmentem przeciwciała wiążącym antygen), ze szczególnym uwzględnieniem fragmentów aktywnych przeciwciała (takich jak Fab) skierowanych przeciwko epitopowi zwanemu C242 (Lindholm i in., WO 9301303) albo ko189 696 rzystniej przeciwko epitopowi wiążącemu przeciwciało 5T4 swoiste wobec raka płuc (Stern i in., WO 8907947). Nie wyklucza to jednakże, że inne przeciwciała swoiste wobec nowotworów płuc mogą działać równie dobrze lub nawet lepiej. Określenie „przeciwciało” obejmuje odmiany monoklonalne jak również poliklonalne, z preferencją preparatów monoklonalnych.

T może być również skierowana przeciwko unikalnym strukturom na mniej lub bardziej zdrowych komórkach, które regulują albo kontrolują rozwój choroby.

Mostek B może być wybrany jak to opisano uprzednio (Dohlsten i in., WO 9201470; Abrahmson i in WO 9601650), tj. B powinien być korzystnie hydrofilowy i wykazywać jedną lub wiele struktur wybranych spośród amidu, tioeteru, disiarczku itp. Najlepszymi mostkami są uzyskane technikami rekombinacji, tj. kiedy koniugacja ma miejsce na poziomie genomowym. W takich przypadkach korzystne są mostki oligopeptydowe zawierające reszty aminokwasowe takie jak Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His i Arg. Szczególnie korzystnymi B są mostki peptydowe zawierające od 1 do 10 reszt aminokwasowych, w szczególności korzystnie od 3 do 7 reszt aminokwasowych. Typowym mostkiem jest tripeptyd GlyGlyPro, Identyfikator Sekw. Nr 1.

Wytwarzanie nowych koniugatów według wynalazku może być przeprowadzone w zasadzie dwoma głównymi drogami:

1. techniką rekombinacji i

2. wiązaniem chemicznym domeny poszukującej celu T i zmodyfikowanego, chimerycznego superantygenu (SA(m)). Sposoby te są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i obejmują wiele odmian.

Wiązanie chemiczne zmodyfikowanego niesprzęgniętego superantygenu z domeną poszukującą celu T często wykorzystuje grupy funkcyjne (np. pierwszorzędowe grupy aminowe albo karboksylowe), które są obecne w wielu położeniach w związkach. Powoduje to, że produkt końcowy powinien zawierać mieszaninę cząsteczek koniugatu różniących się pozycją łączenia, jak również hetero- i homokoniugatów.

W przypadku koniugatów rekombinowanych (białek fuzyjnych) otrzymany koniugat powinien być jednorodny pod względem pozycji wiązania. Koniec aminowy superantygenu chimerycznego jest połączony z końcem karboksylowym domeny poszukującej celu albo vice versa. W przypadku przeciwciał, takich jak kompletne przeciwciała i fragmenty wiążące antygen (Fab, Fv, przeciwciała jednołańcuchowe itp.) do fuzji może być wykorzystany łańcuch ciężki albo lekki. Obecnie, korzystne są koniugaty rekombinowane, zaś najbardziej korzystne fragmenty Fab i wiązanie końców aminowych chimerycznych superantygenów z pierwszą domeną stalą łańcucha ciężkiego przeciwciała (CHI), bez wykluczenia analogicznego wiązania z łańcuchem lekkim albo z domeną VH i VL, co również może zapewnić dobry skutek.

Główną komórką gospodarza do rekombinacyjnego wytwarzania na dużą skalę zmodyfikowanych superantygenów znajdujących zastosowanie w rozwiązaniach według wynalazku (postaci fuzyjnych, jak również postaci nieskoniugowanych) jest E. coli. Gospodarz ten zapewnia zasadniczo dwie drogi wytwarzania: wewnątrzkomórkowe i wydzielanie. Ten ostatni wariant jest korzystny ponieważ oferuje oczyszczanie prawidłowo pofałdowanego białka z periplazmy i pożywki hodowlanej. Powyższe nie wyklucza również, że możliwe jest wytwarzanie czynnego koniugatu w innych komórkach gospodarza, np. komórkach eukariotycznych takich jak drożdże albo komórki ssacze. Kompozycje farmaceutyczne, dawkowanie i drogi podania.

Kompozycje według wynalazku mogą być wytwarzane sposobami znanymi w dziedzinie, z takim wyjątkiem, że będą one zawierały koniugat według wynalazku. Tak więc, kompozycje mogą być w postaci liofilizowanego materiału ziarnistego, sterylnego albo wytwarzanego aseptycznie roztworu, tabletki, ampułki itp. Mogą one zawierać nośniki takie jak woda (korzystnie buforowana do wartości pH dopuszczalnych fizjologicznie przy użyciu, przykładowo, PBS) albo inny obojętny materiał stały albo płynny. W znaczeniu ogólnym, kompozycje wytwarza się przez zmieszanie, rozpuszczenie, związanie, albo łączenie w inny sposób, koniugatu według wynalazku, z jednym lub wieloma rozpuszczalnymi albo nierozpuszczalnymi w wodzie, wodnymi albo bezwodnymi nośnikami, ewentualnie wraz z odpowiednimi dodatkami albo adiuwantami. Wymagane jest, natomiast aby nośniki i warunki nie wpływały ujemnie na aktywność zmodyfikowanego superantygenu.

189 696

Normalnie, koniugat według wynalazku powinien być sprzedawany i podawany w dawkach uprzednio podzielonych, z których każda zawiera skuteczną ilość koniugatu, która w oparciu o uzyskane wyniki powinna zawierać się w zakresie od 10 ng do 50 mg, na przykład od 10 ng do 1 mg albo od 10 pg do 50 mg. Dokładne dawkowanie może być różne w zależności od przypadku, zależnie od ciężaru i wieku pacjenta, drogi podania, rodzaju choroby, domeny poszukującej celu, superantygenu, wiązania (-B-) itp.

Drogi podania są powszechnie znane w dziedzinie, tj. skutecznie niszcząca komórki docelowe ilość albo ilość skuteczna terapeutycznie koniugatu według wynalazku doprowadzona jest do kontaktu z komórkami docelowymi. W przypadku opisanych wyżej zastosowań oznacza to głównie podawanie pozajelitowe, takie jak wstrzykiwanie albo przetaczanie (podskórne, dożylne, dotętnicze, domięśniowe, dootrzewnowe) ssakowi takiemu jak człowiek. Koniugaty według wynalazku mogą być podawane miejscowo albo układowo.

Przez określenie „ilość skutecznie niszcząca komórki” rozumie się, że ilość jest skuteczna do aktywacji i nakierowywania limfocytów T w celu zniszczenia komórek docelowych.

Korzystna droga podania w dacie pierwszeństwa jest ta sama co rozważana dla koniugatów superantygenu według Dohlstena i in., WO 9201470 i Abrahmsena i in., WO 9601650. Oznacza to 1-5-godzinny wlew dożylny (korzystnie 4-godzinny) na dzień w skojarzeniu ze środkiem przeciwgorączkowym (paracetamol). Podawanie należy powtarzać w ciągu kilku dni, przykładowo 4 dni, podejmując środki ostrożności przeciwko ryzyku wywołania przeciwciał skierowanych przeciwko koniugatowi.

Koniugaty według wynalazku mogą być podawane jako terapia główna albo jako terapia wspomagająca w skojarzeniu z leczeniem chirurgicznym albo innymi lekami.

W kontekście leczenia stwierdzono, że preparaty przeciwciała, które są czyste pod względem niekowalencyjnie połączonych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciał wykazują zalety w stosunku do preparatów, które zawierają przeciwciała, w których łańcuchy są połączone ze sobą wiązaniami cystynowymi. Tak więc w odniesieniu do rozwiązań według wynalazku, możliwe jest aby częścią koniugatu były przeciwciała lub ich fragmenty, w szczególności Fab, w którym reszty cysteiny łączące łańcuchy ze sobą zastąpiono aminokwasem uniemożliwiającym tworzenie disiarczku, przykładowo seryną. Koniugaty według wynalazku można przykładowo otrzymać z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego C242 (Lindholm i in., WO 9301302) i 5T4 jak to określono w odnośnikach cytowanych powyżej. Jeden z łańcuchów takiego przeciwciała może być poddany fuzji z superantygenem, który jest zdolny do aktywacji podtypu limfocytów T w sposób swoisty dla νβ jak to opisano wyżej. W dacie pierwszeństwa przykładowym koniugatem według wynalazku był koniugat fragmentu Fab przeciwciała 5T4 (Stern i in., Wo 8907947) z chimerą SEE/A-A wykazującą mutację D227A. Fragment Fab został również zmutowany w obydwu łańcuchach w pozycji zapewniającej międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe (Cys na Ser). W celu zwiększenia uzysku białka fuzyjnego podczas wytwarzania w E. coli, wprowadzono również mutacje w pewnych położeniach łańcucha Vkappa. Patrz, część doświadczalna.

Materiały i metody

Konstruowanie chimerycznych genów SEA/SEE

Konstruowanie chimer SEA/SEE wykonano stosując metodę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), tj. wydłużaniu sekwencji nakładających się (Horton i in.). Reakcje PCR wykonano stosując UITma (Perkin-Elmer) według zaleceń producenta. Fragmenty wytworzone w PCR klonowano do PCR-script (Stratagene, USA) i sekwencjonowano w celu potwierdzenia prawidłowej sekwencji. Chimeryczne geny superantygenów klonowano do wektora ekspresyjnego pKP889 (Abrahmsen i in., 1995), poddając fuzji konstrukty SE z częścią łańcucha ciężkiego fragmentu Fab mysiego przeciwciała monoklonalnego C215. Rekombinowane białka fuzyjne wytworzono jako polipeptydy pełnej długości SEA i SEE w oparciu o sekwencję zgodności odcinania peptydu sygnałowego (von Heijne 1986).

Ekspresja i oczyszczanie białka

Szczep E. coli K12, UL635, zastosowano do ekspresji białek fuzyjnych Fab-SE i mutantów SEA, jak to opisano wcześniej (Abrahmsen i in., 1995). Białka fuzyjne Fab-SE zebrano przez odwirowanie przy 5000 g i frakcje nadsączu poddano oczyszczaniu na Sepharozie189 696 białku G (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja) jak to opisano wcześniej (Abrahmsen i in., 1995). Czystość oczyszczonych przez powinowactwo wariantów Fab-SE wynosiła >90% w analizie SDS-PAGE.

Komórki

Linię ludzkiego chłoniaka z limfocytów B RAJI i ludzkiego raka okrężnicy Colo 205 hodowano w kompletnej pożywce R (RPMI 1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Gibco BRL, Life Technologies, Ltd. Paisley Szkocja), 1 mM glutaminy; HyCłone Europę, Ltd. Cramlington, 5x10'⁵ M P-merkaptoetanolu; ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa CA, 0,1 M NaHCCb; Seromed Biochrome, lxl0² M bufor HEPES; Hyclone Europę, Ltd. Cramlington, 0,1 mg/ml gentamycyny; Biological Industries Kibbutz Beit Haemek Izrael, 1x10'³ M pirogronian sodu; Hyclone Europę, Ltd. Cramlington). Komórki CHO transfekowane ludzkimi cząsteczkami C215 i CD80 hodowano w kompletnej pożywce R z dodatkiem 0,5 mg/ml Genetycyny (G418) Gibco BRL, Life Technologies Ltd. Paisly Szkocja). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBM) wyizolowano z heparynizowanej krwi zwykłych dawców. Komórki izolowano przez odwirowanie na gradiencie gęstości Ficol-Paque, jak to opisano uprzednio (Dohłsten i in., 1991). Ludzkie limfocyty T oczyszczono do homogenności przez selekcję pozytywną stosując kolumny MiniMACS w połączeniu z perełkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi wobec ludzkiej CD4 i CD8 (Miltenyi Biotec GmbH, Niemcy) według protokołu producenta. Ludzkie linie wrażliwe na SEA i SEE wytworzono jak to opisano uprzednio (Dohłsten i in., 1994). Ludzkie linie wyrażające TCR νβ22 wytworzono z pierwotnych linii wrażliwych na SEA stosując selekcję pozytywną z perełkami magnetycznymi Dynabeads (Dynal A.S., Norwegia) pokrytymi przeciwciałem monoklonalnym swoistym wobec TCR νβ22 (Immunotech, Francja). Wzbogacone komórki zawierały >95% limfocytów Τ νβ22⁺, co określono cytometrią przepływową (dane nie pokazane). Mysie hybrydoma limfocytów T (I1B3, 2B4 i 11.40) wytworzono jak to opisano (Fleury i in., 1991).

Test cytotoksyczności

Cytotoksyczność mierzono w standardowym teście uwalniania ⁵¹ Cr jak to uprzednio opisano (Dohłsten i in., 1991). Ludzkie komórki Colo 205 i Raji zastosowano jako komórki docelowe. Komórki efektorowe, linie ludzkich limfocytów T wrażliwych na SEA albo SEE albo linie limfocytów T TCR νβ22 dodano jako komórki efektorowe w stosunku 30:1 do komórek docelowych. Znakowane ⁵¹ Cr komórki zastosowano do w testach cytotoksyczności przy 2500 komórkach/200 ml kompletnej pożywki w płytkach do mikromiareczkowania o denkach w kształcie V. Hybrydy C215Fab-SEA/E dodano w różnym stężeniu jak to zaznaczono i mierzono uwalnianie ⁵¹ Cr w liczniku γ. Procent cytotoksyczności właściwej obliczono jako 100x[(cpm uwalniania doświadczalnego - cpm uwalniania tła)/(cpm uwalniania całkowitego - cpm uwalniania tła)].

Testy proliferacji limfocytów

W celu zmierzenia proliferacji inkubowano 10⁵ ludzkich wrażliwych limfocytów T w 37°C z 104 napromieniowanych (20000 Rad) komórek pobudzających w 200 ml kompletnej pożywki w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania o denkach w kształcie U, z różnymi ilościami hybryd C215Fab-SEA/E przez 72 godziny. Proliferację określano wbudowywaniem [³H]-tymidyny jak to opisano (Dohłsten i in. 1988). Analiza wytwarzania IL-2 wywołanego Fab-Sag.

Mysie komórki hybrydoma T-T (10⁵) inkubowano w 200 ml kompletnej pożywki R z białkami chimerycznymi C215Fab-SEA/E w obecności 2x10⁴ komórek pobudzających Raji. Po 48 godzinach, zebrano nadsącze i analizowano na obecność mysiej IL-2. Pokrótce, zawartość cytokiny analizowano stosując szczurze mAb przeciwko mysiej cytokinie jako przeciwciała wychwytujące. Oczyszczone szczurze przeciwciało przeciwko mysiej IL-2, szczurze biotynowane przeciwciało przeciwko mysiej IL-2 i rIL-2 zakupiono w PharMingen (San Diego, CA). mAb przeciwko cytokinie znakowane biotyną, zestaw ABC Vectastain (Vector Laboratories, CA) i zestaw z substratem peroksydazy (Bio-Rad Laboratories, CA) zastosowano do wykrywania cytokin. Absorbancję mierzono w urządzeniu ImmunoReader NJ2000 (InterMed, Roskilde, Dania) przy długości fali 405 albo 450 nm.

189 696

Mutacja Fab 5T4

Konstruowanie wektora w celu ekspresji 5T4Fab-SEA w E. coli

Części kodujące Fv 5T4 klonowano z hybrydoma 5T4, uzyskanej od Dr P. Sterna (Stern i in., WO 8907947). Szczegółowo, z mRNA wytworzono cDNA, regiony kompletnych domen zmiennych łańcucha ciężkiego i domeny stałej łańcucha lekkiego amplifikowano przez PC,R.

Oligonukleotydy

5'-CAATTTTCTTGTCCACCACCTTGGTGC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 2) i

5'-ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATIyTCTT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 3) zastosowano dla łańcucha ciężkiego dając fragment wielkości 553 bp, podczas gdy oligonukleotydy

5'-ACTAGTCGACATGGGGCITCAAGATGGAGTCACAkwyyCwGG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 4) i

5'-GCGCCGTCTAGAATTAACAGTCATTCCTGTTGAA-3' (Identyfikator Sekw: Nr 5) zastosowano dla łańcucha lekkiego uzyskując fragment wielkości 724 bp. Dla każdego z łańcuchów sekwencjonowano trzy osobne klony i stwierdzono, że są identyczne. Fragmenty DNA odpowiednie do wprowadzenia do wektora ekspresyjnego (ref) uzyskano w drugim etapie PCR. W celu połączenia plazmidu wyrażającego Fab, regiony zmienne 5T4 poddano fuzji z sekwencjami kodującymi regiony stałe mysiego przeciwciała IgG/k C242 (Lindholm i in., WO 9301302). Region kodujący superantygen pochodzący z gronkowcowej enterotoksyny A (SEA) poddano fuzji po łańcuchu ciężkim. Potwierdzoną sekwencję dla zrębu łańcucha Vkappa przeciwciała dla przeciwciała 5T4 podano w wynikach.

Mutageneza 5T4

W regiony kodujące zrąb przeciwciała wprowadzono siedem zastąpień aminokwasowych. Były to PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser i Leu78Val. Podobnie reszty Cys w obu łańcuchach, związane z międzydomenowe wiązanie disiarczkowe zastąpiono resztą serynową powodując mutację Cys458Ser w łańcuchu ciężkim i Cys214Ser w łańcuchu lekkim. Mutacje wprowadzono stosując mutagenezę opartą na PCR, zaś uzyskane sekwencje potwierdzono sekwencjonowaniem.

Ekspresja w jermentatorze i oczyszczanie 5T4Fab-SEA.

Plazmid ekspresyjny zawierał gen oporności na kanamycynę i promotor lacUV5, który może być indukowany IPTG Białka fuzyjne oczyszczono z klarowanej pożywki hodowlanej stosując sepharozę-białko G i SP-Sepharozę (Pharmacia Biotec, Uppsalla, Szwecja) i poddano formulacji w buforze cytrynianowym stosując Sephadex G-25, zasadniczo jak to opisano. Charakterystyka przy użyciu SDS-PAGE, HPLC w odwróconej fazie i spektrometrii masowej wykazała, że oczyszczone białko fuzyjne było czyste w ponad 95% i miało prawidłowy ciężar cząsteczkowy.

Wyniki: modyfikacje superantygenu

Cytotoksyczność komórkową zależną od superantygenu (SDCC) C215Fab-SEA i C215Fab-SEE przeciwko wobec komórek Raji MHC klasy II+, analizowano stosując ludzkie limfocyty T reagujące na SEA i SEE jako linię efektorową. Mimo różnicy w swoistości wobec V(3 pomiędzy SEA i SEE, oba superantygeny wykazywały indukcję porównywalnego stopnia cytotoksyczności z oboma liniami efektorowymi (fig. 1). W celu rozróżnienia pomiędzy wpływem prezentacji MHC klasy II i bezpośrednim efektem SEA i SEE w rozpoznawaniu tCr, badano je w cytotoksyczności zależnej od koniugatu przeciwciała i superantygenu (SADCC) wobec komórek Celo215 wyrażających C215. W tym teście domena Fab kierowała białko fuzyjne na docelowe komórki wyrażające C215 i powodowała prezentację fuzyjnej cząsteczki SE cytotoksycznym limfocytom T (CTL), niezależną od cząsteczek MHC klasy II (Dohlsten i in., 1994). Mimo >80% identyczności sekwencji aminokwasowej pomiędzy SEA i SEE, oddziaływanie TCR z SEA i SEE wykazuje różnice jakościowe w tym rodzaju testu. Białko fuzyjne C215Fab-SEA zachowuje swoją zdolność do kierowania CTL swoistej wobec SEA i SEE przeciwko komórkom docelowym MHC klasy II (fig. 1), podczas gdy C215FabSEE nie wywoływał cytotoksyczności komórek docelowych MHC klasy II, z limfocytami CTL aktywnymi wobec SEE jak i SEA (fig. 1).

189 696

Opisywano uprzednio, że różnica w swoistości wobec Vp pomiędzy SEA i SEE zależy przede wszystkim od różnicy w trzech aminokwasach w pętli poprzedzającej oraz w nieregularnej helisie a5 (Irwin i in., 1992, Hudson i in., 1993, Freser i in., 1993 i Mollick i in., 1993). Różnica w odniesieniu do oddziaływania z TCR opisywana w tych publikacjach nie zależy od zmienionej swoistości TCR wobec Vp, ponieważ zdolność C215Fab-SEA do wywoływania cytotoksyczności niezależnej od MHC klasy II nie jest ograniczona do CTL reagujących na SEA, ale jest również obserwowana w przypadku CTL reagujących na SEE.

Analiza homologii sekwencji SEA i SEE (fig. 2) ujawnia, że nieidentyczne reszty aminokwasowe koncentrują się w ośmiu osobnych regionach. Poza tymi regionami, tworzącymi około 34% sekwencji, identyczność obu SE wynosi 97%, z zastąpieniami zakonserwowanych aminokwasów stanowiącymi pozostałą różnicę. Cztery z tych regionów są strukturalnie pokrewne z dwoma miejscami wiążącymi MHC klasy II (B, D, E i G) i prawdopodobnie nie oddziaływają z TCR (fig. 3). Dodatkowe cztery regiony (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 i H: 200-207) są położone na brzegu cząsteczki (fig. 3), w pobliżu domniemanego miejsca wiążącego TCR, prawdopodobnie w zagłębieniu pomiędzy dwoma poddomenami (Keppler i in., 1992). W celu zbadania różnicy ilościowej pomiędzy rozpoznawaniem TCR przez SEA i SEE wytworzono hybrydy białek przez przeszczepienie regionów z SEA na SEE jako chimery pojedynczego regionu (SEE/A-A, -C, -F, H), jako hybrydy podwójnego regionu (SEE/A-AH) oraz przez przeszczepienie regionów położonych w sąsiedztwie miejsc wiążących MHC klasy II SEE na SEA (SEA/E-BDEG) (fig. 4). Wszystkie chimeryczne SE poddano ekspresji jako białka fuzyjne C215Fab w celu stwierdzenia różnic w odniesieniu do ich aktywności pod nieobecność MHC klasy II.

Hybrydowe białka SEA/E w fuzji z domeną C215Fab wykazują różnice w testach cytotoksycznych kierowania przez Fab.

Aktywność SDCC białek hybrydowych C215Fab-SEE/A wobec komórek Raji MHC klasy H+ analizowano stosując jako komórki efektorowe ludzkie limfocyty T reagujące na SEA. Wartości EC50 wszystkich hybryd C215Fab-SE jak również C215Fabwt i -SEEwt wypadały w granicach błędu (np. 10'-10’^H M, fig. 5). Jedynie wykrywalną różnicą jest nieco zmniejszone plateau dla hybrydy C215Fab-SEE/A-AH, wskazując na spadek wrażliwych limfocytów T. Z drugiej strony doświadczenia SADCC, gdzie cytotoksyczność skierowana jest przeciwko linii komórkowej Colo 205 MHC klasy IF/C215+, wyłącznie C215Fab-SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-AH i C215Fab-SEA/E-BDEG wywoływały porównywalną cytotoksyczność co C215Fab-SEAwt (fig. 5). Hybryda C215Fab-SEE/A-H jest zdolna do wywołania cytotoksyczności ukierunkowanej C215 w stężeniach wyższych (EC50 >10'^K> M). Jakkolwiek hybryda C215Fab-SEE/A-H jest zdolna do wywołania cytotoksyczności ukierunkowanej C215 w podobnym półmaksymalnym stężeniu co C215Fab-SEAwt (np. EC50 10^³ M). Całkowity poziom cytotoksyczności był silnie zmniejszony (fig. 5). Różnica ta może być konsekwencją ograniczonej swoistości Vp C215Fab-SEE/A-H, podczas, gdy zdolność do wywołania cytotoksyczności ukierunkowanej C215 przeważa w populacji reagujących limfocytów T. W celu dalszego badania tej obserwacji, wykonano linię ludzkich oligoklonalnych CTL Vp22.

Ludzkie Vp22 były analogiczne do mysich Vp3 pod takim względem, że były rodziną VP swoistą wobec SEA, a nie SEE. Wykazano uprzednio (Mollick i in., 1993), że główny wkład Vp SEA i SEE znajduje się w trzech różnicach aminokwasowych pomiędzy SEA i SEE w regionie H (AA 200-207). W testach SDCC przeciwko komórkom Raji MHC klasy II+, z zastosowaniem oligoklonalnej linii CTL Vp22 jako komórek efektorowych, tylko hybrydy zawierające region SEA-H są zdolne do wywołania odpowiedzi przypominającej C215FabSEAwt (np. C215Fab-SEE/A-H, C215Fab-SEE/-AH i C215Fab-SEA/E-BDEG, fig. 6). Hybryda C2ł5Fab-SEE/A-A, która była zdolna do wywołania pełnej odpowiedzi SDCC z pełną populacją CTL jako komórkami efektorowymi jest w tym teście silnie zmniejszona, zarówno pod względem stężenia półmaksymalnego, jak i pod względem plateau (fig. 6). Gdy cytotoksyczność CTL Vp22 jest skierowana przeciwko linii komórek Colo 205 MHC klasy II/C215+ wyłącznie hybrydy zawierające regiony zarówno SEA-A jak i SEA-H (np. C215Fab-SEE/A-AH i C215Fab-SEA/E-BDEG) są zdolne do wywołania odpowiedzi cytotoksycznej, porównywalnej z C215Fab-SEAwt (fig. 6). Hybryda zawierająca wyłącznie region A SEA (C215FabsEa/A-A) wywołuje niższy poziom cytotoksyczności z porównywalnymi wartościami EC50.

189 696

Wskazuje to, że pozostała aktywność obserwowana w SADCC w przypadku hybrydy C215Fab-SEE/A-H z pełną populacją limfocytów T jako komórkami efektorowymi nie jest konsekwencją odpowiedzi wywołanej hybrydą w ograniczonej populacji limfocytów T. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tej obserwacji jest, że zdolność do wywołania odpowiedzi SADCC hybrydowych białek C215Fab SE znajduje się w regionie SEA-A, z mniejszym wpływem regionów SEA-H i -F. Nie ma dowodów, że właściwość ta jest ograniczona do jakiegokolwiek podtypu limfocytów T w skojarzonej populacji limfocytów T reagujących na SEA-SEE, ponieważ C215Fab SEA jest zdolny wywołać taką samą odpowiedź przy użyciu CTL wrażliwych na SEE oraz C215Fab-SEE/A-A jest zdolny do pełnego przywrócenia odpowiedzi obserwowanej z C215Fab-SEA.

Białka hybrydowe SEA/E w fuzji z domeną C215Fab wykazują różnicę w teście proliferacji ukierunkowanej Fab.

Wykazano uprzednio, że oczyszczone spoczynkowe ludzkie limfocyty T są indukowane do proliferacji przez prezentację C215Fab-SEA na linii komórkowej MHC klasy 1Γ/(^/215/ΎΩ80+ (Lando i in., 1993). Zdolność C215Fab-SEA do wywołania proliferacji niezależnej od MHC klasy II jest jednakże wydajnie zmniejszona przy użyciu C215Fab-SEE (tab. 1). W celu badania czy ta różnica w jakości pokazuje tę samą właściwość regionu A SEA jaką obserwowano w SADCC, zbadano zdolność proliferacyjną hybrydy C215Fab-SE prezentowanej przez linie transfekowane 0'10-Γ)Η1\'Τ.'080+ albo ChÓ-C215⁺/CD80⁺ na oczyszczone ludzkie limfocyty T. Przy prezentacji koniugatów Fab-SE na CHO-DR1+/CD80+ nie obserwowano różnic pomiędzy różnymi białkami SE (dane nie pokazane). Jednakże, przeszczepienie regionu SEA A, C i H na SEE, wzmagało aktywność proliferacyjną w porównaniu z C215Fab-SEE. Najlepsze wyniki uzyskano przez przeszczepienie regionów A i H SEA, co wskazuje na ważną rolę regionu A jak to obserwowano dla cytotoksyczności niezależnej od MHC klasy II. Przez zastosowanie selekcji negatywnej możliwe jest by zwiększyła się różnica pomiędzy Fab-SEA i -SEE.

Swoistość hybryd SE wobec νβ

W celu dalszego badania czy białka hybrydowe-fuzje C215Fab-SEA/SEE związane są ze szczególną swoistością wobec νβ, zastosowano mysie hybrydoma limfocytów T aktywne wobec SEA wyrażające νβ1, νβ3 i νβ11. Oczywiste jest z uzyskanych danych, że wszystkie z badanych regionów bezpośrednio albo pośrednio wpływają na oddziaływanie z TCR. Przez przeszczepienie regionów C i F SEA na C215Fab-SEE, zniszczona zostaje aktywność wobec SEA i SEE hybrydoma I1B3 νβ1. Te same chimery wydają się mieć mniejszy wpływ na aktywność hybrydom νβ3 i νβΗ (2.B4 i 11.40) w porównaniu z C215Fab-SEE. Przez przeszczepienie regionu A SEA na C215Fab-SEE aktywność wobec νβ3 (2.B4) zwiększa się 100-krotnie w porównaniu z C215Fab-SEE. Bardziej wyraźny efekt obserwowany jest w przypadku tej samej linii komórkowej przez przeszczepienie regionu H SEA na C215FabSEE. Ten zaznaczony wpływ regionu H SEA na swoistość wobec νβ3 obserwowano również we wcześniejszych badaniach (Mollick i in., 1993). Jednakże ta sama chimera (C215FabSEE/A-H) wydaje się zmniejszać aktywność przeciwko SEA/SEE aktywnym krzyżowo hybrydomom νβ1 i νβ11 (I1B3 i 11.40) 10-krotnie. Podsumowując, oddziaływanie SEAz TCR wydaje się obejmować wszystkie spośród regionów zmiennych SEA-SEE A, C, F i H.

Seroreaktywność

Seroreaktywność próbek surowicy ludzkiej wobec chimerycznych SE badano zarówno na pulowanych próbkach z różnych części świata, jak i na pojedynczych próbkach surowic. Przez przeszczepianie regionów A i H SEA na SEE uzyskano seroreaktywność pośrednią (fig. 8). Podobną Seroreaktywność obserwowano również przeciwko chimerze C215Fab-SEE/A. Jednakże, pojedyncze przeszczepy regionu A SEA na SEE (C215Fab-SEE/A-A) dawały seroreaktywność przypominającą C215Fab-SEE, wskazując, że region H SEA jest odpowiedzialny za pozostałą seroreaktywność przeciwko C215Fab-SEE/A-AH. Wskazuje to, że region H SEA jest częścią dominującego epitopu antygenowego w SEA. Seroreaktywność pulowanych próbek surowic z innych części świata (Japonia i USA), jak również 14 poszczególnych próbek ze Szwecji potwierdziło ten ogólny wzorzec (dane nie pokazane).

189 696

Wyniki: Mutowanie części Fab białek fuzyjnych.

Ekspresja konstruktów 5T4FabSEA

Stwierdzono, że poziom wytwarzania 5T4Fab-SEA w E. coli w fermentatorze jest znacznie niższy niż innych konstruktów Fab-superantygenu badanych w laboratorium. Tak więc wprowadzono dwa rodzaje modyfikacji w celu zwiększenia poziomu wytwarzania. Po pierwsze, wprowadzono siedem różnych mutacji punktowych w regionie zrębowym łańcucha lekkiego. Były to PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser i Leu78Val. Po drugie, reszty Cys w obu łańcuchach, tworzące wiązanie disiarczkowe zastąpiono resztą serynową. Ta ostatnia modyfikacja spowodowała 3-krotny wzrost, zaś 7 mutacji punktowych dodatkowo 12-krotny wzrost poziomu wytwarzania. Oprócz zwiększonego poziomu wytwarzania usunięcie wiązania disiarczkowego dało również bardziej homogenny produkt, ponieważ wykluczono możliwość wejścia tych aktywnych grup tiolowych w reakcję z innymi czynnikami zawierającymi grupę tiolową.

Zmodyfikowana cząsteczka 5T4 zbadana została na powinowactwo względem jej antygenu, jak również na aktywność biologiczną w SADCC. W testach tych nie stwierdzono różnic pomiędzy postacią zmutowaną i postacią typu dzikiego.

Wykonano również mutację Cys/Ser w łańcuchu ciężkim i lekkim fragmentów Fab kilku przeciwciał monoklonalnych. Produkty stały się homogenne i w pełni zachowywały zdolność wiązania antygenu.

Sekwencja regionu zrębowego przeciwciała dla łańcucha V-kappa 5T4:

DAVMTQTPTF LLVSAGDRVT ITCKASOSYS NDYAWYOOKP GQSPTLLISY TSSRYAGYPD RFIGSGYGTD FTFTISTLQA EDLAYYFCOO DYNSPPTFGG GTKLEIK (Identyfikator Sekw. Nr 6)

Sekwencjami podkreślonymi są CDR. Pozycje wytłuszczonym drukiem zmutowano PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser i Leu78Yal.

Tabela 1

	Proliferacja EC50 (pM)
C215Fab-SEAwt	2,2
C215Fab-SEEwt	6,9
C215Fab-SEE/A-A	0,9
C215Fab-SEE/A-C	2,8
C215Fab-SEE/A-F	5,7
C215Fab-SEE/A-H	1,0
C215Fab-SEE/A-AH	0,3
C2 15Fab-SEA/E-BDEG	1,6

Tabela 2. Legendy do figur

	IlB3(MuVp 1) EC50 (nM)	2.B4 (MuVP3) EC50 (nM)	11.40(MuVp11) EC50 (nM)
C215Fab-SEAwt	10	3	0,05
C215Fab-SEEwt	10	>1000	0,05
C215Fab-SEE/A-A	10	10	0,05
C215Fab-SEE/A-C	>1000	>1000	0,05
C215Fab-SEE/A-F	>300	>300	0,05
C215Fab-SEE/A-H	100	3	0,3
C215Fab-SEE/A-AH	10	J	0,3

189 696

Figura 1. Cytotoksyczność ludzkich CTL SEE i SEA zależna i niezależna od MHC klasy II

Cytotoksyczność komórkowa zależna od MHC klasy II (A i B) oraz cytotoksyczność komórkowa zależna od C215 (C i D) z C215Fab-SEA () i C215Fab-SEE (♦) jako cząsteczkami efektorowymi. Cytotoksyczność analizowano w standardowym 4-godzinnym teście uwalniania ^5lCr stosując linię ludzkich limfocytów T reagujących na SEE (A i C) oraz linię ludzkich limfocytów T reagujących na SEA (B i D). Komórkami docelowymi były Raj i MHC klasy II+/C215 (A i B) oraz Colo 215 MHC klasy IIVC215+ (C i D). Dane pochodzą z pojedynczych testów reprezentatywnych dla dwóch (A i C) do pięciu (C i D) niezależnych doświadczeń.

Figura 2. Przyrównanie homologii SEA i SEE.

Regiony zmienne SEE/SEA w pobliżu miejsca wiązania TCR (A, C, F i H) oraz regiony zmienne w pobliżu dwóch miejsc wiązania MHC klasy II.

Figura 3. Rysunkowy model SEA.

Model „molscript” (Kraulis, 1991) kryształu SEA (Schad i in., 1995). Regiony zmienne SEA/SEE w pobliżu miejsca wiązania TCR (A, C, F i H)i regiony zmienne w pobliżu dwóch miejsc wiązania MHC klasy II. Jon cynku przedstawiony jest okrągłą kulą.

Figura 4. Schemat cząsteczek chimerycznych SE.

Przedstawiono ciągi sekwencji SEA. Regiony zmienne SEE/SEA pokazane są jako A, B, C, D, E, F, G i H.

Figura 5. Cytotoksyczność ludzkich CTL reagujących na SEA zależna i niezależna od MHC klasy II.

(A) cytotoksyczność zomórkowa. zaleóia od MHC Masy II i (B) cytotoksyczność komórkowa zależna od C215 C215Fab-SEE/A-A (♦), C215Fab-SEE/A-C (□), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (·), C215Fab-SEE/A-AH (Δ) i y215Fab-SEA/E-BDEG 1O).yytctcZ(ćkaoość analizowano w standardowym 4-gcCainoćw teście uwalniania ⁵'Cr stosując linię ludzkich limfocytów T reagujących na SEA. Komórkami docelowymi były Raji MHC klasy IT/C215· (A) oraz Colo 215 MHC klasy II7C215+ (B). Dane pochodzą z pojedynczych testów reprezentatywnych dla pięciu niezależnych doświadczeń.

Figura 6. yytotoksćkaoość ludzkich CTL νβ22+ zależna i niezależna od MHC klasy II (A) cytotoksyczność' ZomórZowa ζιΜ:?^ ale. ÓaHC klay Π a ly) cy1otoksyc20lość kocśóckowa zależna od C215 C215Fab-SEA (), C215Fab-SEE (♦), C215Fab-SEE/A-A (♦), C215FabSEE/A-C (□), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (·), C215Fab-SEE/A-AH (A) i CyUSFab-SETAE-BDEG (O). CyćotokIyć.zność amal/zwano w s(andardυwećn 4-godzinn\'m teście uwalniania 5*Cr stosując linię ludzkich limfocytów T reagujących na SEA. Komórkami docelowymi były Raji MHC klasy II+/C215' (A) oraz Colo 215 MHC klasy II7C215+ (B). Dane pochodzą z pojdCćOcaćkh testów rdprdzdntatywoćkh dla dwóch nidzaldżoćkh doświadczeń.

Figura 7. Proliferacja zależna i nidaaldżna od MHC klasy II (brak w zgłoszeniu pierwszeństwa)

Wpływ hybryd Fab-SE na proliferację limfocytów T zależną (A) i niezależną (B) od MHC klasy II. Oczyszczone ludzkie limfocyty T pobudzano przez 96 godzin przy użyciu C215Fab-SEA (), C215Fab-SEE (♦), C215Fab-SEE/A-A (♦), C215Fab-SEE/A-y (□), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (·), C215Fab-SEE/A-AH (A) i C215Fab-SEA/EBDEG (O) prdzdotowaoćch na trao(fdZtaotakh yHO-DR4/C215 MHC klasy II+/C215+ (A) i na transfdktaitach CHO-CD80/C215 MHC kkl^i^^ II7C215⁺ (B). Po 72 godzmach komórki pulsowano ^Hj-tymidyną przez 24 godziny, po czym widrzcoc wbudowany znacznik i przedstawiano jako stężenie półwaZsćmalnd (EC50). Dane pochodzą z pojedynczych testów i są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń.

Figura 8. Sdrcreaktćwndść z pulami ludzkiej Ig.

Badano pulę >5000 surowic zdrowych dawców z południowej Europy wobec białek fuzyjnych C215Fab-SE. Szeregowo roacidńkacod ludzkie Ig pozostawiono do reakcji przez godzinę z C215Fab-SEAwt, C215Fab-SEEwt, C215Fab-SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-H i FabSEE/A-AH. Uoidruchcmicnd na płytkach do wiZrcwiardkzZcwaoia w stężeniu 1 ng/stu189 696 dzienkę. Korekcję na wiązanie C215Fab z białkami surowicy wykonano przez odjęcie w każdym punkcie wartości OD dla C215Fab. Dalsze szczegóły podano w Materiałach i Metodach.

T a b e 1a 1. Oczyszczone ludzkie limfocyty T pobudzano przez 96 godzin odpowiednim C215Fab-SE prezentowanym na transfektantach CHO-CD80/C215 MHC klasy II-negatywnych. Po 72 godzinach komórki pulsowano [³H]-tymidyną przez 24 godziny, po czym mierzono wbudowany znacznik i przedstawiano jako stężenie półmaksymalne (EC50).

T a b e 1 a 2. Mysie hybrydoma limfocytów T pobudzano przez 48 godzin natywnym albo chimerycznym superantygenem sprzęgniętym z Fab. Aktywność mierzono jako wytwarzanie IL-2 i przedstawiano jako stężenie półmaksymalne (EC50).

Praca wykonana w trakcie roku pierwszeństwa

W celu minimalizacji toksyczności chimery fuzji przeciwciała z antygenem C242Fab-SEE/A-A, chimerę SEE/A-A zmutowano w miejscu wiązania z MHC klasy U, jak to opisano w WO 9601650 i poddano fuzji z C215Fab. Wykonano konstrukcje C215Fab-SEE/A-A-D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-H 187/D227A, C215Fab-SEE/A-A-W130A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A i C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. Wszystkie fuzje badano na ich zdolność do wywołania proliferacji ludzkich PBMC w celu zidentyfikowania mutantów wykazujących niższą aktywność w porównaniu z C215Fab-SEE/A-A-D227A. Zmniejszoną aktywność pro-liferacyjjią stwierdzono w przypadku C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A i C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. Niektóre z fuzji chimerycznych badano również na miano przeciwciał w normalnej surowicy ludzkiej (C215Fab-SEE/A-A-D227A, C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A i C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A). Dokonano porównania z C215Fab-SEA-D227A i C215Fab-SEE-D227A. W porównaniu z c215Fab-SEA-D227A miano było znacznie niższe dla każdej z badanych chimer. W porównaniu z C215Fab-SEE-D227A miano było nieco wyższe dla każdej z badanych chimer;

Oznacza to zastąpienie z pozycjach odpowiadających jednej albo więcej, korzystnie dwu z pozycji 47, 50, 70, 130, 187, 227 według sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7 i 8 na figurze 2.

Ponieważ możliwych jest wiele różnych i odmiennych wykonań mieszczących się w zakresie wynalazku, oraz ponieważ możliwe są modyfikacje wykonań opisanych tu ze względu na wymóg prawny dotyczący opisu, należy rozumieć, że poniższe szczegóły powinny być rozumiane w sensie ilustrującym, a niejako ograniczającym.

Literatura

Abrahmsen L et al (1995) Characterization of two distinct MHC Class II binding sites in the superantigen staphylococcal enterotoxin A. EMBO J 14:2978-86.

Abrahmsen et al (1996) W09601650 (patent application). A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate.

Antonsson P et al (1996) Staphylococcal enterotoxin A and E chimera with reduced seroreactivity and retained ability to target cytotoxic T cells for use in tumor therapy. ABRF '96: Biomolecular Techniques, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, California. March 30April 2, 1996.

Dohlsten et al (1988) Two subsets of human peripheral blood CD4+ T helper cells differing in the capacity to produce IL-2 and interferon-gamma can be defined by the Leu-18 and UCHL1 monoclonal antibodies. Eur J Immunol 18:1173-1178.

Blanco et al (1990) Mutants of staphylococcal toxic shock syndrome toxin 1: Mitogenicity and recognition by a neutralizing monoclonal antibody. Infect. Immun. 58 (1990) 3020-3028.

Dohlsten M et al (1994) Monoclonal antibody-superantigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell based tumor therapy. Proc Natl Acad Sci USA 91:8945-8949.

189 696

Dohlsten M et al (1991) Monoclonal antibody-targeted superantigens: A different class of anti-tumor agents. Proc Natl Acad Sci USA 88:9287-9291.

Dohlsten et al (1992) W09201470 (patent application). Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation.

Fleury S et al (1991) Mutational analysis of the interaction between CD4 and class II MHC: class II antigens. Cell 66:1037-49.

Fraser JD et al (1993) Structural model of Staphylococcal enterotoxin A interactions with MHC class II antigens. In: Huber, BT Palmer, E (eds) Current Communications in Cell and Molecular Biology 7. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. pp 7-29.

Grossman et al (1991) Mutation of the disulfide loop in Staphylococcal enterotoxin A. Consequences for T cell recognition. J Immunol 147:3274-3281.

Hartwig UF et al (1993) Mutations affecting MHC class II binding of the superantigen streptococcal erythrogenic toxin A. Int. Immunol. 5(8) 869-875.

Horton RM et al (1990) Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques 8:528-535

Hudson et al (1993) Two adjacent residues in staphylococcal enterotoxins A and E determine T cell receptor V beta specificity. J Exp Med 177:175-184.

Hufnagle WO et al (1991) The carboxyl-terminal region of staphylococcal enterotoxin type A is required for a fully active molecule. Infect Immun 59:2126-2134.

Irwin MJ et al (1992) Enterotoxin residues determining T-cell receptor Vb binding specificity. Nature 359:841-3

Kalland et al (1991) WO 9104053 (patent application). Pharmaceutical composition that makes cells expressing MHC Class II antigens targets for cytotoxic cells.

Kappler JW et al (1992) Mutations defining functional regions of the superantigen staphylococcal enterotoxin B. J Exp Med 175:387-396

Kappler et al (1993) W09314634 (patent application). Protective effects of mutated superantigens.

Kotzin BL et al (1993) Superantigens and their potential role in human disease. Adv Immunol 54:99-166.

Xraulis PJ (1991) MOLSCRIPT: A program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J Appl Cryst 24:946-950.

Lamphear JG et al (1996) Residues near the amino and carboxy termini of staphylococcal enterotoxin E independently mediate TCR νβ-specific interactions. J Immunol 156: 2178-2185 (March 15, 1996)

Lando PA et al (1993) Co-stimulation with B7 and targeted superantigen is required for MHC class II-independent T-cell li proliferation but not cytotoxicity. Immunology 80: 236-241.

Lindholia et al (1993) 9301302 (patent application). Tumor, carbohydrate antigen specific monoclonal antibody and cell line.

Mollick JA et al (1993) Localization of a site on bacterial superantigens that determines T cell receptor beta chain specificity. J Exp Med 177:283-293.

Newall et al (1991) In vivo T-cell activation by staphylococcal enterotoxin B prevents outgrowth of a malignant tumor. Proc Natl Acad Sci USA 88 1074-1078

Schad EM et al (1995) Crystal structure of the superantigen, Staphylococcal enterotoxin type A. EMBO J 14:3292-3301

Stern et al (1989) W08907947 (patent application). Improvements relating to anigens.

Terman et al (1991) W09110680 (patent application). Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds.

189 696

Terman et al (1993) W09324136 (patent application). Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds.

von Heijne, G (1986). A new method for predicting signal sequence cleavage sites. Nucleic Acid Res, 14, 1483-1490.

LISTA SEKWENCJI (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3 aminokwasy (b) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:1

Gly Gly Pro (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR:2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2

CAATTTTCTT GTCCACCTTG GTGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW⁷. NR: 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3 ACTAGTCGAC ATGGATGGAG CTITATCATI YTCTT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4 ACTAGTCGAC ATGGGCITCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5 GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCATTCCTGT TG AA

189 696 (2) INFOOMAAJA DO IDENTYFFIKAOOA. A EKW. NN: 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 107 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6

Asp 1 '	Ala	Val	Met	Thr 5	Gln	Thr	Pro	Thr	Phe 10
Leu	Leu	Val	Ser	Ala 15	Gly	Asp	Arg	Val	Thr 20
Ile	Thr*	Cyy	Lys	Ala 25	Ser	Gln	Ser	Val	Ser 30
Asn	Asp	Val	Ala	Trp 3 5	Tyr	Gln	dn	Lys	Pro <0
Gly	Gln	Sre	Pro	Tnr 45	Leu	Leu	Ile	Ser	Tyr 50
Thr	Ser	Sre	Aro	Tyr 55	Ala	Gly	wa	Pro	Asp 60
Arę	Phe	τ Ii	Gly	Ser 65	C-ly	Tyr	dy	Tr.r	Asp 7 θ'
Phe	Thr	Phe	Thr	Ile 75	Ser	ΤΙιγ	Leu	Gln	Ala 60
Glu	Asp	Leu	Al a	Val 85	Tyr	PPh	Cys	Gln	Gln 50
Asp	Tyr	Asn	Ser	Pro 95	Pro	Tltir	Phe	dy	Gly 100
Gly	Thr	Lys	Leu	Glu	Ile	Le·

105 (2) ][NFOOMAAJA DD O DENTYFIKKAYRA A SKW.NT: 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 233 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

189 696

Srr	Glu	Lys	Ser	GlU 5	Glu	11 e	Asn	Glu	Lys 10	Asp	Lec
Arg	Lys	Lys 15	Ser	Glu	Lru	Gln	Gly 20	Thr	Ala	Llu	Gly
Asn 25	Leu	Lys	GGl	Ile	Tyr 30	Tyr	Tyr	Asn	Glu	Lyy 35	Ala
His	Ser	Trp	Tyr	Asn 65	Asp	Lr u	Leu	Val	Asp 77	Phe	Asp
Srr	Lys	Asp 75	Ile	Val	Asp	Lys	Tyr 80	Lys	Gly	Lys	Lys
lal 85	Asp	Leu	Tyr	Gly	Ala 90	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Gln 90	Cys
Ala	Gly	Gly	Thr 100	Pro	Asn	Lys	Thr	Ala 105	Cys	Met	Tyr
Gly	Gly 110	Val	Thr	Leu	His	Asp 111	Asn	Asn	Arg	Leu	Thr 110
Glu	GlG	Lys	Lys	Val 125	Pro	111	AAn	Leu	Trp 130	Leu	Asp
Gly	Lys;	Gln 135	Asn	Thr	Val	Pro	Llu 110	Glu	Thr	Val	Lys
Thr 145	Asn	Lyy	Lys	Asn	Val 150	Thr	wa	Gln	Glu	Leu 155	Asp
Lru	GlG	All.	Arg 160	Arg	Tyr	Leu	GGl	Glu 165	Lys	Tyy	Asn
Lru	Tyr 170	Ass	Ser	Asp	Val	PPr 177	Aas	cly	Lys	wa	Gln 118
Arg	G1g	Lye	Ile	Val 185	Phe	Hii	TTh	Ser	Thr 110	Gll	Pro
Ser	Val	Am 195	Tyr	Asp	Lru	PPr	GGl 220	Ala	Gln	Gly	Gln
Tyr 205	See	Las	ΤΤΓ	Leu	Lru 210	AAg	1ll	Tyr	Arg	Aas 225	Asn
Lys	Tnr	Lle	Ass	Ser	Glu	A5s	HiU	His	Ul	Aas	lle

220 225

Tyr Leu Tyr Thr Ser 230

189 696 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 233 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8

Ser	Glu	Lys	Ser	Glu 5	Glu	Ile	Asn	Glu	Lvs 10	Asp	Leu
Arg	Lys	Lys 15	Ser	Glu	Leu	Gln	Arg 20	Asn	Ala	Leu	Ser
Asn 25	Leu	Arg	Gln	Ile	Tyr 30	Tyr	Tyr	Asn	Glu	Lys 35	Ala
Ile	Thr	Glu	Asn 40	Lys	Glu	Ser	Asp	Asp 45	Gln	Phe	Leu
Glu	Asn 50	Thr	Leu	Leu	Phe	Lys 55	Gly	Phe	Phe	Thr	Gly 60
His	Pro	Trp	Tyr	Asn 65	Asp	Leu	Leu	Val	Asp 70	Leu	Gly
Ser	Lys	Asp 75	Ala	Thr	Asn	Lys	Tyr 80	Lys	Gly	Lys	Lys
Val 85	Asp	Leu	Tyr	Gly	Ala 90	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Gln 95	cys
Ala	Gly	Gly	Thr 100	Pro	Asn	Lys	Thr	Ala 105	Cys	Met	Tyr
Gly	Gly 110	Val	Thr	Leu	His	Asp 115	Asn	A.sn	Arg	Leu	Thr 120
Glu	Glu	Lys	Lys	Val 125	Pro	Ile	Asn	Leu	Trp 130	Ile	Asp

189 696

Gly	Lys	Gln 135	Thr	Thr	Val	Pro	Ile 14 0	Asp	Lys	Val	Lys
Thr 145	Ser	Lys	Lys	Glu	Val 150	Thr	Val	Gln	Glu	Leu 155	Asp
Leu	Gln	Ala	Arg 160	His	Tyr	Leu	His	Gly 165	Lys	Phe	Gly
Leu	Tyr 170	Asn	Ser	Asp	Ser	Phe 175	Gly	Gly	Lys	Val	Gln 180
Arg	Gly	Leu	Ile	Val 185	Phe	His	Ser	Ser	Glu 190	Gly	Ser
Thr	Val	Ser 195	Tyr	Asp	Leu	Phe	Asp 200	Ala	Gln	Gly	Gln
Tyr 205	Pro	Asp	Thr	Leu	Leu 210	Arg	Ile	Tyr	Arg	Asp 215	Asn
Lys	Thr	Ile	Asn 220	Ser	Glu	Asn	Leu	His 225	Ile	Asp	Leu

Tyr Leu Tyr Thr Thr 230

189 696

Fig. 2 SEKWENCJA NR ID 7: SEA Λ SEKWENCJA HR ID S, SEE

CQ

SB O H

»-q	•-a
Pm
O	O
ca	ca
ta	ca
co	CO
Cal	pa
bd	bd
5ZS	tzi
pa	Pa
E-4	Ir·
bd	HM
Kt3	rd
Pd	bd
Pd	Pa
ES	tz;
Pm	Pm
PM	>M
>M	pM
HM	H-I
Ο»	Ο»
Pd	cd
»-44	•-a
SB	:s
CO	co
	•-a
rd	•«3
EM	Pd
cn	cd
O	o
9-3	na
pa	pa
co	co
Pd	td
bd	bd
Cd	cd
>-s	-q
a	Ca
bd	td
pa	pa
S5	ss
1—1	HM
ω	pa
pa	P3
co	CO
bd	bd
pa	pa
co	co

•o: łq w w co eo

CJ>

EM	EM
CO	CO
CO	CO
rd	rd
CO	C->
ca*	Ο»
pM	pM
to	co
pM	pM
Pm	Pm
rd	rd
co	cn
b-·	PM
na	i-44
C=ł	ca
s*	s-
bd	td
bd	bd
co	CO
td	td
PM	PM
td	bd
ca	SS
s-	EM
1—1	rd
ca	ca
bd	bd
co	CO
ca	CO
Pm	►a
ca	ca
t-	s-
►a	nł
»-a	»-a
ca	ca
Es	tz;
>M	PM
J3=	Sc
CO	CM
ca	cc 1
ca	co
EM	Em
Pm	Pm
Pm	Pm
CO	CO
bd	bd
Pm	Pm
»-a
HM
	1

i*	s*
t=s	pa
td	td
bd	bd
es	CO
EM	Em
td	td
s-	s-
EM	bd
pa	ca
*-a	HM
CM	CM
>-	s-
E-4	E-l
ES	EM
CM	Oi
td	td
CO	CO
ca	ca
m	HM
Ϊ3Ε	Cc
»-a	»-a
ES	os
HM	ł—1
CM	CM
s=-	s-
bS	td
td	td
pa	pa
ta	pa
Em	EM
	►a
cd	cd
ss	ES
es	ES
ca	ca
ta	ca
m	»-a
EM	EM
s-	s-
co	co
co	co
PM	pM
=s	3Ξ
c_>	CJ
rd	rd
EM	EM
td	td
τζϊ	ES
CM	CM

CD

Osi co

Łjm
»-a	►a
ca	ca
Pm	PM
ss	co
1	fc*
co	EM
CM	co
pa	CO
EM	pa
1 01	ίΛ
EM	CO
td	td
Pu	P-.
	i=~
HM	HM
•-a	•-a
co	co
cd	cd
cx	ca»
s-	s-
bd	bd
CO	CO
ca	co
1	bM |
	CO
Λ	Λ
co	co
ES	CS
PM	Pm
»-a	na
ES	co
PM	Pm
td	1
pa	co
ca»	ta
»-a	•-a
>M	Pm
cd	ta
cd	cd
r<	Π3
Ο»	o
-a	»-a
ca	ca
»-a
td	pa
o	o
s-	s-
Em	EM

c η Η H • H

W Ui I-i μι

O O O O ·—¹ < O U

II II U II ►m Cs >

(0 c

>»

N

O c

(JP <

ii

5s m

m

CN

EM	EM
pM	PM
•-a	»-a
PM	pM
HM	na
ca	ca
HM	HM
ta	ta
se	»-a
sc	ss
tCJ	pa
co	co
ss	Es
HM	HM
EM	EM
bd	bd
ES	SS
ca	ca
cd	cd
PM	PM
HM	HM
cd	cd
»-a	»-a
»-a	»-a
EM	EM
3S	ca
CO	CM
PM	pM
O	ca»
co	CD
o	O
rd	rd

£

CO co d CO E3 po co co rd Cd cd w co co «< w p3 pa co co

189 696 % Cytotoksyczność

Fig. 3 ^20-27 θ1Β6-195 ; H

B

37-50

60-62

D

71-78 '200-207

SEE/A-A

SEE/A-C

SEE/A-F

SEE/A-H

SEE/A-AH

SEA/E-BDEG

Stężenie (M)

Fig. 5

189 696 % Cytotoksyczność

Stężenie (M)

stężenie (M)

Stężenie (M)

Fig. 7

189 696

Fig- 8

			I
		<£	<	X
	?	<	<	1 <
<	LU	Lil	UJ	LU
LU	UJ	LL!	LU	LU
CO	CO I	CO	ω	(O
XI	XJ	XI	X2	x>
ro	ro	ro	ro	ro
LU	LU	LU	LU	LU
LO	10	m	10	m
ν	τ—	T-		V
CN	CN	CN	CM	CN
O	O	O	o	O

ł ł t ł

SOtOO

189 696 ytotOKsyczność % Cytotoksyczność

Stężenie (M) Stężenie (M)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (24)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Koniugat pomiędzy a) superantygenem typu dzikiego, który został zmodyfikowany, i b) domeną poszukującą celu, znamienny tym, że zmodyfikowanym superantygenem jest SEE, w którym jedna albo wiele reszt aminokwasowych w regionie I, który to region I jest w miejscu wiążącym receptora limfocytu T (TCR) i określa wiązanie do łańcucha νβ TCR i aktywację limfocytów T, zostały zastąpione przez jedną lub więcej reszt aminokwasowych z odpowiadającej pozycji w SEA, tak, że zmodyfikowany superantygen wykazuje polepszoną zdolność do indukowania cytotoksyczności limfocytów T w porównaniu z SEE oraz zmniejszoną seroreaktywność w porównaniu z SEA, oraz zmodyfikowany superantygen zawiera ponadto mutację, która zmniejsza jego zdolność do wiązania z antygenami MHC klasy II w porównaniu z którymkolwiek z wyżej wymienionych superantygenów typu dzikiego.
2. 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że region I jest regionem A, składającym się z reszt aminokwasowych 20 do 27 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
3. 3. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że region I jest regionem C, składającym się z reszt aminokwasowych 60 do 62 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
4. 4. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że region I jest regionem F, składającym się z reszt aminokwasowych 161 do 176 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
5. 5. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że region I jest regionem H, składającym się z reszt aminokwasowych 200 do 207 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
6. 6. Koniugat według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera następujące podstawienia aminokwasowe: R20G, N21T, S24G i R27K, przy czym pozycje określono jak w Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
7. 7. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera ponadto mutację w pozycji 227 jak określono w Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
8. 8. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że mutacjąjest mutacja D227A.
9. 9. Koniugat według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że domena poszukująca celu jest wybrana z grupy składającej się z wiążącego antygen aktywnego fragmentu przeciwciała, przeciwciała wiążącego antygen, przeciwciała jednołańcuchowego, Fab; F(ab)2 oraz Fv.
10. 10. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje terapeutycznie skuteczną ilość koniugatu pomiędzy:

    a) superantygenem typu dzikiego, który został zmodyfikowany, i

    b) domeną poszukującą celu, do zastosowania w leczeniu choroby u ssaka przez aktywowanie układu odpornościowego tego ssaka, przy czym zmodyfikowanym superantygenem w koniugacie jest SEE, w którym jedna albo wiele reszt aminokwasowych w regionie I, który to region I jest w miejscu wiążącym receptora limfocytu T (TCR) i określa wiązanie do łańcucha νβ TCR i aktywację limfocytów T, zostały zastąpione przez jedną lub więcej reszt aminokwasowych z odpowiadającej pozycji w SEA, tak, że zmodyfikowany superantygen wykazuje polepszoną zdolność do indukowania cytotoksyczności limfocytów T w porównaniu z SEE oraz zmniejszoną seroreaktywność w porównaniu z SEA, oraz zmodyfikowany superantygen zawiera ponadto mutację, która zmniejsza jego zdolność do wiązania z antygenami MHC klasy II w porównaniu z którymkolwiek z wyżej wymienionych superantygenów typu dzikiego.
11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że choroba jest związana z komórkami wyrażającymi docelową strukturę powierzchniową, która wiąże się z fuzją superantygenu w epitopie superantygenu strukturalnie innym niż epitop wiążący TCR, przy czym wiązanie to pozwala na wiązanie do TCR i aktywację limfocytów T przez superantygen.
12. 12. Kompozycja według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że choroba jest wybrana z grupy składającej się z nowotworów, zakażeń wirusowych, inwazji pasożytniczych i chorób autoagresyjnych.

    189 696
13. 13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że choroba jest rakiem.
14. 14. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że region I jest regionem A, składającym się z reszt aminokwasowych 20 do 27 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
15. 15. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że region I jest regionem C, składającym się z reszt aminokwasowych 60 do 62 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
16. 16. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że region I jest regionem F, składającym się z reszt aminokwasowych 161 do 176 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
17. 17. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że region I jest regionem H, składającym się z reszt aminokwasowych 200 do 207 z sekwencji o Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
18. 18. Kompozycja według zastrz. 14, znamienna tym, że wprowadzono następujące podstawienia aminokwasowe: R20G, N21T, S24G i R27K, przy czym pozycje określono w Identyfikatorze Sekw. Nr 7.
19. 19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że zawiera ponadto mutację w pozycji 227 jak określono w Identyfikatorze Sekw-. Nr 7.
20. 20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że mutacjąjest mutacja D227A.
21. 21. Kompozycja według zastrz. 10 albo 11, albo 12, albo 13, albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, znamienna tym, że domena poszukująca celu jest wybrana z grupy składającej się z wiążącego antygen aktywnego fragmentu przeciwciała, przeciwciała wiążącego antygen, przeciwciała jednołancuchowego, Fab; F(ab)2 oraz Fv.
22. 22. Koniugat określony w zastrz. 1 do zastosowania jako lek.
23. 23. Zastosowanie koniugatu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia choroby u ssaka przez aktywację układu odpornościowego, przy czym choroba jest wybrana z grupy obejmującej nowotwory, zakażenia wirusowe, inwazje pasożytnicze i choroby autoagresyjne.
24. 24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że choroba jest rakiem.