CZ371297A3 - Modifikované/chimerické superantigeny a jejich použití - Google Patents

Description

Vynález se týká funkčně aktivních modifikovaných superantigenů, které náleží k divokému typu superantigenů (SA I), jenž mají jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituovaných při zachování superantigenové funkce. V případě, že je substituován jeden nebo více zbytků (nebo chráněných aminkyselinových zbytků) dochází v odpovídajících polohách ke vzniku jiného typu divokého superantigenů (SA II), a tento superantigen se nazývá chiméra (hybrid). Chimérické superantigeny proto obsahují část sekvencí/regionů odvozených od alespoň dvou různých superantigenů divokého typu.

Termínem odpovídající je míněno, že zbytky, část sekvencí a regiony nahrazující jeden druhý mají funkci stejné polohy v superantigenech I a II, takže substituce vede chimérické formě, která je schopna fungovat jako superantigen.

Terminologie odvozené je používána ve spojení s částmi plné sekvence superantigenů II, které mají nahradit odpovídající části superantigenů I, dokonce i v tom případě, že je přemístěna jenom jediná aminokyselina.

Modifikované/chimérické superantigeny také zahrnují funkční superantigeny modifikované jinými cestami, např. modifikované přemístěnými aminokyselin v regionech, která jsou prováděna jinak, než ty které se týkají tohoto vynálezu, konjugovaných s skupinami hledajícími cíl, včetně kondenzovaných forem, kde skupinou je polypeptid/protein. Pravidlo pro provádění těchto modifikací se může měnit viz dále.

Podle úplně první definice (kolem roku 1988 až 1993),

Superantigeny jsou superantigeny bakteriální nebo virové proteiny schopné vázat se k antigenům MHC třídy II intracelulárního procesu a aktivovat T bez předchozího buňky vazbou k β-řetězci různého regionu (νβ) T buněčného receptorú (TCR).

Vazba způsobuje restrikční aktivaci rodiny νβ, o relativně velkém rozměru T buněk a rozklad buněk exprimujících MHC třídu II (superantigen dependent cell-mediated cytolysis =

SDCC).

Dobře známé supergantigeny divokého typu podle shora stafylokoků (SEA, SEB, příklady také uvedené definice jsou , SED, SEE a šoku Toxinem exfoliačními exotoxinem A, struku

SECI, SEC2 toxického původu), pyrogenním nádoru myšího Clostridia perfringens arthritidy mykoplasmy, jej ich enterotoxiny

SEH). Dalšími (TSST-1, toxiny (EXft),

B a C (SPE A, B a (MMTV), endotoxin jsou syndrom stafylokokového streptokokovým C), protein viru streptokokový M protein, (CPET), superantigeny atd. Pro přehled superantigenů a vlastností viz Kotzin et al.

1993.

V průběhu začátku 90tých let bylo objeveno, že aktivace a následný buněčný rozklad se mohou projevit u MHC II nezávisle v případě , že superantigen byl konjugován s cíl hledající skupinou, schopnou vázat se k struktuře buněčného povrchu (Dohlsten et al. W09201470 a Abrahmsén et al. W09601650). Při inkubaci cílových buněk (nesoucích cílovou • strukturu pro cíl hledající skupiny) a efektorových buněk (T buněk) s konjugáty, dochází k rozkladu cílových buněk (superantigen antibody dependent cell-mediated cytolysis =

SADCC) přičemž není ani nikterak nutná exprese třídy II.

Podle dnešní koncepce superantigenu a použití v kontextu • · • · · ·

-> · · ··· · · · ···· · ·· ···· ·· ·· 'W podle vynálezu, pokud není uvedeno jinak, patří mezi ně jakákoli sloučenina (výhodně polypeptidové struktury), která je schopna vázat se ke struktuře buněčného povrchu (cílové struktuře) a k jednomu nebo více polymorfním TCR řetězcům, zejména k νβ řetězci, a tím aktivovat podsoubor T buněk exprimujících specifický TCR řetězec sloužící k navázáni. T buňky se pak stávají cytotoxickými pro buňky, nesoucí na povrchu strukturu (cílová struktura, cílové buňky). Normálně aktivovaný podsoubor T buněk obsahuje asi 1 až 20 % individuálních z celkového množství T buněk.

Dosavadní stav techniky

Strukturní a funkční studie využívající mutované a chimérické superantigeny.

Chimérické superantigeny včetně záměrně mutovaných forem jsou již známy (Kappler et al. WO 9314364, Kappler et al. 1992, Grossman et al. 1991, Hufnagle et al. 1991, Hartwig et al. 1993, Fraser et al. 1993, Mollick et al. 1993, Irwin et al. 1992, Hudson et al. 1993, and Blanco et al. 1990). Mollick et al. a Hudson et al. ukazují na studiích chimér, že νβ specifita SEA a SEE míst u některých aminokyselinových sekvencí je přítomna v regionu s karboxylovým zakončením (např. aminokyselinové zbytky 200, 206 a 207). Kromě νβ specifity, převážně závislé na tomto regionu, dokázaly Mollick et al., že pro kompletní rekonstituci SEE typu aktivity SEA obsahujících SEE roubů na νβ8 byl nutný fragment, obsahující N-terminální 70ti aminokyselinové zbytky z SEE. Tento fragment obsahující části a řetězce MHC třídy II • typu SEE, nesoucí místa a chimérické SEA/SEE molekuly obsahující tuto část z SEE, inhibovaly vazbu SEA k MHC třídy

II DR1 způsobem jako typ SEE.

Nyní jsou už známy SEE-SEA chiméry umožňující výměnu • · · ·

regionů, schopných vazby k TCRVP (Lamphaer et al., J. Immunol. 156 (March 15, 1996) 2178-2185)z Protein FAB protilátky SEE antigenů, ve kterém SEE domény umožňují při interakci s T buňkami záměnu za odpovídající nehomologní SEA domény, byl popsán v ABRF 1996: Biomolecular Techniques, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, California March 30 - April 2, 1996 (Bjórk et al., M45).

Terapeutické použití superantigenů

Nekonjugované superantigeny byly již navrženy pro terapii s předpokládaným léčebným účinkem dosaženým všeobecnou aktivací imunitního systému (Kalland et al. W09104053, Terman et al. W09110680 a WO9324136, Newall et al 1991).

Bylo také navrženo používat modifikované superantigeny konjugované se skupinami hledajícími cíl. (Dohlsten et al. W09201470, Abrahmsén et al. W09601650, obě tyto přihlášky jsou zde vloženy do popisu formou odkazu). Umožňuje to široké terapeutické použití aktivace T buněk prostřednictvím νβ. Studie konjugátů došly k tomu, že byla vydělena afinita třídy II, která vede na druhé straně kc snížení systémického nebezpečí toxicity, normálně doprovázející superantigeny divokého typu.

Terman et al. (W09110680, WO9324136) v okrajových větách navrhuje léčit rakovinu pomocí modifikovaných superantigenů a jejich fragmentů.

Kappler et al. (WO9314634) navrhl použít nekonjugované » superantigeny (SEB mutované tak, že ztratily svou schopnost νβ vazby nebo MHC třídy II vazby (v souvislosti s vakcinami a ' neutralizací toxických účinků superantigenů). Abrahmsén et al. (W09601650) navrhl léčení rakoviny konjugovanými superantigeny, které mají modifikovanou, výhodně sníženou, • · • · ·· · · · · · · · ··· ·· ··· · · -) · · ··· ··· schopnost vázat se na antigeny třídy II. Modifikace zahrnují prosté mutace stejně tak jako konstrukce chimér mezi různými superantigeny.

Problémy, které má za úkol řeši tento vynález.

Séra lidských populací normálně obsahují vysoké titry protilátek proti superantigenům. Proti stafylokokovým superantigenům jsou např. relativní titry TSST-1 > SEB > SECI > SE3 > SEC2 > SEA > SED > SEE. Tyto relativní titry ukazují problémy s imunogenicitou a problémy se zneškodněním protilátek v případě, že jsou superantigeny (SE) jsou podávány parenterálně. Na bázi těchto problémů by měl být SEE výhodný stafylokokový superantigen. V kontextu z prací o fúzi proteinů, jsme však zjistily, že schopnost T buněk MHC třídy II dosáhnout nezávislé cytotoxicity, superantigen - progilátkově závislé buněčné cytotoxicity (SADCC), SEE konjugátů je malá. Anti-SE titry také ukazují, že by mohlo být výhodné modifikovat vysoký titr superantigenu na více méně nízký titr superantigeny.

Cíle vynálezu

Prvním úkolem je zlepšit dosud známé antigeny se zřetelem na snížení jejich imunogenicitu a reakci s neutralizujícími protilátkami.

Druhým úkolem je získání superantigenů s menším množstvím vedlejších účinků při použití jako léčiva.

Třetím úkolem je získat vylepšené superantigeny, které se mohou použít jako účinná látka při ošetřování savců trpících rakovinami, poruchami autoimunity, napadení parazity, virovými infekcemi nebo dalšími nemocemi spjatými s buňkami, které na svém povrchu exprimuj i antigeny a nebo • · • · • · ·· · ····

6_ . · · · · · · · ··· · · • · ·· · ··· ···· · ·· ···♦ 99 99 struktury MHC třídy II, které jsou specifické pro danou nemoc a vážou se na skupiny hledající cíl, inkorporované do superantigenu.

Objev, který vedl k vynálezu

Analýza sekvenční homologie SEA a SEE (obr.2) ukázala, že neidentické aminokyselinové zbytky jsou koncentrovány do osmi oddělených regionů. Vně těchto osmi regionů se vyskytuje 34% sekvencí, jejichž indentita s SE je 97%, s konzervativními aminokyselinovými substitucemi včetně ostatních diferencí. 4 z těchto regionů jsou strukturně uzavřeny vůči vazebným místům dvou MHC třídy II (B: AA 37-50, D: 71-78, E: 136-149, a G 189-195), a nemají tendenci interagovat s TCR. Na okraji molekuly v vicinitě putativního TCR vazebného místa jsou umístěny další 4 regiony (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 a H: 200-207) roubováním jednotlivých regionů (vzájemnou záměnou aminokyselinových zbytků, které se od sebe liší), jsme nyní zjistili, že vlastnosti SEA konjugátu vyvolávají cytotoxickou odezvu, a že potenciují proliferativní odezvu za nepřítomnosti MHC třídy II, přemístěných v jednom regionu v SEA, která nese TCR. Tento region (A) je přemístitelný na SEE a má velký vliv na aktivitu za nepřítomnosti třídy II, avšak omezené účinky na νβ specifitu superantigenu (obr. 6 tab. 2). Všechny tyto regiony (A, C, F a H) se podílejí , přímo nebo nepřímo, ne interakci s TCR, manifestovanými alterovaným stimulačním efektem na hybridomy murinových T-bunék (tab. 2).

Vzhledem k analogickému mechanizmu působení, je možno předpokládat, že podobná strukturální separace těchto vlastností, spojených s TCRVp je možná také u analogů superantigenů vůči SEA a SEE. totéž lze také aplikovat v rámciostatních tzpů superantigenů, ve kterých jsou vazné struktury organizovány různě. Náš objev nám umožnil navázat ·· ··♦· konstrukci chimérických superantigenů, které mají potenciálně mimořádně velkou hodnotu jako terapeutické prostředky.

Podstata vynálezu

Prvním aspektem vynálezu je způsob léčení choroby savců aktivací jeho imunitního systému prostřednictvím podávání terapeuticky účinného (imunitu aktivujícího) množství modifikovaného, výhodně chimérického superantigenu. Savcem je výhodně člověk. Nemoci, kterých se to týká, jsou převážně takové nemoci, které jsou spojeny s expresí cílových struktur, schopných vazby k superantigenu, na povrchu buněk. Cílová struktura je ve většině případů odlišná od TCR epitopu normálně vázaného k superantigenům. Vazba cílové struktury dovoluje také navázáni k TCR a aktivaci T buněk. Ilustativními příklady jsou MHC třídy II antigeny a další struktury buněčného povrchu, které mohou být exprimovány na buňkách, spojených s průběhem nemoci. Ilustrativními chorobami jsou maligní nádory včetně veškerých typů rakovin, (jako karcinom, sarkom, melanom, limfom atd.), virálních infekcí, parasitických chorob a onemocnění autoimunity. Rakovina, která se má léčit, může být lokalizována ve střevě, prsu, ledvinách, žaludku, dvanácterníku, prostatě, varlatech, kůži, plicích, játrech, slinivce, v kostře atd. včetně všech metastáz v nejrůznějších místech. Vynalezený účinný prostředek je také použitelný pro tzv. multidrogové formy odolnosti rakovin. Buňkami, exprimujícími cílové struktury, mohou být také buňky, které určitou cestou kontrolují nebo regulují vývoj nemoci, která se má léčit.

Charakteristickým znakem způsobu, je použití modifikovaného superantigenu, ve kterém je jeden nebo více aminokyselinových zbytků v regionu (region 1) upraven pro navázání k subsouboru T buněk přes polymorfní TCR řetězec, zejména TCRvp, čímž je u divokého typu superantigenu (SA I) nahrazen a aminokyselinový zbytek vyvolávající superantigenovou aktivitu tak, že vzniká modifikovaný superantigen. Ve výhodných chimérického superantigenu, aminokyselinových zbytků v superantigenu divokého typu provedeních, týkajících se ve kterém jeden nebo více regionu (region 1) původního (SA I) nahrazen odpovídajícími zbytky aminokyselin nebo jedním zbytkem aminokyseliny z odpovídajícího regionu (region II) antigenu jiného divokého typu (SA II). Regiony 1 a 2 se liší z hlediska sekvencí aminokyselin. Supergantigeny 1 a 2 se také vybírají tak, že regiony 1 a 2 jsou nahraditelné jeden druhým, aniž by došlo k ztrátě superantigenové funkce. V tomto kontextu je třeba počítat s faktem, že skutečný region 1 sám nemusí být zaměnitelný s odpovídajícím regionem jiného divokého typu superantigenu, avšak při záměně s jinými regiony, determinujícími TCR vazbu a T buněčnou aktivaci, je výsledkem funkce aktivní superantigen. Regiony, kterých se to týká, normálně obsahují méně než 20 zbytků, zejmén v případě superantigenů analogních k SEA. Tato záměna aminokyselinových zbytků je tedy odlišná od záměny zbytků, a obvykle zahrnuje také konzervativní substituce a další aminokyselinové substituce, které vedou k funkčně aktivním modifikovaným superantigenům schopným se vázat na ΤΟΗνβ a aktivovat podsoubor T buněk. To znamená, že se inventivně modifikují superantigeny v jejich nejširších vlastnostech a funkcích za vzniku modifkovaného modifikovaného antigenu, ve kterém je jedna nebo více aminokyselin v shora zmíněných regionech funkčně obměněných.

Termín konzervativní substituce označuje záměnu aminokyselinového zbytku chemicky podobných zbytkem, např. hydrofobním zbytkem se nahradí odlišný hydrofobní zbytek, polarizovaným zbytkem se nahradí polarizovaný zbytek atd.

Jako superantigeny I, II atd. byly v den objevu • 4 ·

a vzniku priority vyzkoušeny výhodné stafylokokové enterotoxiny, zejména takové, které představují koordinované sloučeniny zinku, tj. SEA, SEE, SED a případně také SEH.

Regiony mohou obsahovat buď shora zmíněné funkce (viz část popisu nazvaná Objev, který vedl k vynálezu a experimentální část popisu):

1. Velký vliv na aktivitu superantigenu jako takový a limitující vliv na TCR specifitu, zejména na νβ specifitu. Pro SEA typ superantigenů to znamená region A (místa navázání aminokyselin 20 až 27).

2. Nově nalezený vliv na specifitu s respektem k vazbě na polymorfní TCR řetězce, jako je νβ řetězec. Pro SEA-typ superantigenů to znamená region C (umístění aminokyselin 60 až 62), F (umístění aminokyselin 110 až 126) a H (umístění aminkyselin 200 až 207).

Pro superantigeny podobné SEA toto znamená jeden nebo více substituentů (navázaných na roubovaný řetězec ze SEA k SEE, SEE/A chiméry):

Region A: R20G, N21T, S24G, R27K

Region C: G60D, P62S,

Region F: H111R, H114Q, G115Y, F117Y, G118N, S124V,

G126,

Region H: D200G, P206S, D207N.

V den priority byly výhodně provedeny všechny substitutce pro každý region. Pro jiné superantigeny se mohou provést obdobné substituce mezi odpovídajícími umístěními/regiony analogicky.

Obvykle se může začít od prvního superantigenu, jako je SEE a SED, a pak nahradit jeden nebo více jeho νβ «««<·« ·· «· ·* »0 • · a « 0 9 · to · · 0

0 · · Í 9 9 9 9 _ in _ · · 00000 ·

X V 0 0 0*0 *0*

00*0 * «0 000* *0 *· vázajících regionů odpovídajícím regionem(y) druhého superantigenu (např. SEA), přičemž první a druhý superantigen jsou výhodně voleny tak, že protilátkový titr v normálním lidském séru pro první superantigen je nižší než pro druhý superantigen. Pro SEA a SEE chiméry, je nej lepším způsobem náhrada za vzniku chimér SEE/A-A, SEE/A-AH a SEA/E-BDEG, přičemž absolutně nejvýhodnější je SEE/A-A. Viz experimentální část a obrázky. Spolu s regiony A, C, F a H lze také zaměnit aminokyselinové zbytky v jiných částech. Jedním typem takové záměny je snížení schopnosti vázat třídu II, neboř tato vlastnost je spojena s mnoha vedlejšími účinky, které s sebou přináší superantigenová terapie (všeobecná aktivace imunity s spolu jdoucím systemickým uvolňování faktoru nádorové nekrózy (tumor necrosis factor = TNF) a interfenon gama). Pro superantigeny jako je SEA, SED a SEE jsou důležité pozice aminokyselin, umožňující koordinaci zinkových iontů, výhodně změněné, tj. jde o pozice aminokyselin 225 a 227, např. při SEA mutaci H225A a zejména D227A, které mají pozitivní vliv na snížení postranních toxických efektů (viz Abrahmsén et al. W096/01650 a Fraser et al. 1993). Lze provést i další substituce kdekoliv na molekule, pokud nedojde ke ztrátě superantigenové funkce, např. konzervativní substituce v určité části mimo regiony vnese možnost vazby k třídě II a TCR. Změna v sekvenci DNA pro alteraci MHC třídy II vazby nebo jakákoli jiná změna na úrovni DNA se dá provést před nebo po změně v regionech, zaměřené na vazbu k TCR. Tyto další typy modifiakcí mohou být stejně dobře provedeny před záměnou aminokyseliny v regionu 1. V souladu s vynálezem, je koncepce využívající superantigeny divokého typu, popsaná shora, tedy modifikace podle nároků tímto primárně daná, zaměřena na divoké typy aminokyselinových sekvencí v regionu 1, mimo které se však mohou shora uvedené modifikace také provést.

Konstrukce chimérických a mutovaných superantigenů se ·· ·· ·· ·* • · · · · · ·· · .

• · · · ···· • · · · · · ··· · » • · · · · · · * ·· ···· ·· ··

·· ·*·· dá provádět technikami, které jsou v oboru dobře známy. Spojení od specifického regionu jednoho superantigenu k odpovídajícímu regionu jiného superantigenu je dáno úrovní genomu a může provést náhradou kompletní sekvence nebo mutacemi v jednotlivých místech těchto specifických baží, které jsou požadovány jako ukončení vhodné aminokyselinové sekvence. Viz např. experimentální část a známý stav techniky v tomto popisu. Termín mutace zahrnuje nahrazení, vložení, nebo přemístění jednoho nebo více aminokyselinových zbytků modifikací DNA sekvence kódující daný protein, který má být mutován.

Superantigen, který se má použít při metodě podle vynálezu může být nekonjugovaný superantigen modifikovaný způsobem popsaným shora, tj. modifikovaný superantigen, kterému chybí specifická připojená cíl hledající skupina, ale má schopnost vázat se k MHC třídy II antigenům a podsouboru T buněk přes TCR. Výhodně je modifikovaný superantigen, výhodně chimérický superantigen, konjugován s cíl hledající skupinou. V jiném případě jsou výhodné varianty fúze mezi cíl hledající skupinou a modifikovaným superantigenem. Konjugáty jako takové jsou nové a představují samostatný aspekt tohoto vynálezu.

Struktury vynalezených konjugátů jsou analogické dříve známým konjugátům protilátka-superantigen (Dohlsten et al. W092/0147, Abrahmsén et al. W096/01650, což jsou publikace zde začleněné formou odkazu), tedy jde o konjugáty, které většinou odpovídají vzorci:

T-B-SA(m) kde T představuje cíl hledající skupinu, SA(m) modifikovaný, výhodně chimérický superantigen, jak je definován shora a B je kovalentní můstek spojující T a SA(m). T může principiálně obsahovat další superantigenové skupiny, přičemž ve výhodných konjugátech je pouze jedna cíl hledající skupina a jedna modifikovaná skupina superantigenu, jak je shora definovaná.

T může být principiálně jakákoliv struktura, která je schopna navázat se na strukturu buněčného povrchu, výhodně struktura specifická pro určitou chorobu. Struktura, proti T nasměrováno, je obvykle odlišná od a) epitopu νβ ke kterému se váže SA(m), a b) epitopy MHC třídy II, se váží superantigeny. Cíl hledající skupina se interleukiny (např. interleukin-2), včetně antigenu nesoucího fragmenty faktory atd. Viz např. Woodwordth, Developement and Cytokine toxins, konferenci Molecular approaches to cancer Ashville, North Carolina, November 7-11, které je řetězce, k kterým primárně hormony, protilátek, Preclinical and váží volí mezi protilátkami, růstovými Clinical prezentovaná na Immunotherapy 1993 .

V den že T je

Fv, a antigen priority bylo s výhodou zjištěno, protilátka (protilátka plné délky, Fab, F(ab)₂, protilátka s jedním řetězcem a jakýkoliv další nesoucí fragment protilátky), s určitou specifitou pro účinné jako protilátky (např. Fab), řízené proti epitopům (Lindholm et al. W09301303). Toto však možnost použití specifických protilátek proti , které může fungovat stejně dobře nebo protilátka zahrnuje monoklonální nebo jako výhodné se předpokládají fragmenty tzv. C242 nevylučuje jiným druhům rakoviny dokonce lépe. Termín polyklonální varianty, přičemž monoklonální přípravky.

T může být také řízené proti jednotlivé struktuře nebo víceméně zdravým buňkám, které regulují nebo kontrolují vývoj nemoci.

Můstek B může být volen, jak bylo v předešlém textu • · · ·

popsáno (Dohlsten et al. W092/0147, Abrahmsén et al. W096/01650), tj. B znamená výhodně hydrofilní můstek a je tvořeno jednou nebo více strukturami, vybranými ze skupiny zahrnující amid, thioeter, disulfid atd. Nej lepší můstky jsou ty, které lze získat metodami rekombinace, tj. konjugace se používá na úrovni genomu. V takových případech oligopeptidové můstky obsahují hydrofilní aminkyselinové zbytky, jako je Gin, Ser, Gly, Glu, Pro, His a Arg jsou výhodné. Zejména výhodnými můstky B jsou peptidické můstky sestávající z jedné až deseti aminokyselinových zbytků, přičemž absolutně nejvýhodnější jsou zbytky o třech až sedmi aminokyselinách. Typickým můstkem je tripeptid GlyGlyPro, SEQ ID NO 1.

Výroba nových vynalezených konugátů se dá uskutečnit na principu dvou hlavních syntéz: 1. rekombinantní metody a 2. chemické připojení cíl hledající skupiny T k modifikovanému, výhodně chimérickému, superantigenů (SA(m), jak je definováno shora. Tyto způsoby jsou dobře proveditelné pro zběhlého pracovníka v oboru a zahrnují velké množství variant.

Chemické připojení modifikovaného nekonjugovaného superantigenů, cíl hledající skupině T je často prováděno s použitím funkčních skupin (např. primárních aminoskupin nebo akrboxyskupin), které jsou přítomny v četných pozicích ve sloučenině. Z toho plyne, že finální produkt obsahuje směs konjugovaných molekul, lišících se v místě navázání, a hetero- a homo- konjugáty.

Pro rekombinantní konjugáty (fúzní proteiny) je získaná konjugovaná látka jednotná co do místa navázání. Aminozakončení chimérického superantigenů je buď navázáno ke karboxy zakončení cíl hledající skupiny nebo naopak. Pro protilátky, jako jsou intaktní protilátky a fragmenty nesoucí antigen (Fab, Fv protilátky s jedním řetězcem atd.), přičemž • · • · pro fúzi se může použít lehký nebo těžký řetězec. V současné době jsou výhodnější konjugáty získané rekombinací, přičemž většinou je výhodný Fab fragment a napojení aminoterminální skupiny chimérického superantigenu k první konstantní doméně těžkého protilátkového řetězce (CH1), včetně analogního napojení na lehký řetězec nebo k VH a VL doméně, která může také dávat dobré výsledky.

Hlavní používanou buňkou pro produkci vynalezených modifikovaných superangitenů rekombinací ve velkém měřítku, přičemž substituované formy superantigenů jsou vyrobitelné stejně dobře jako nekonjugované formy, je Escherichia coli.

Tato buňka funguje v principu produkcí a sekrecí. Druhá čištění jemně sebraných kultivačního roztoku. To co by nebylo možno produkovat dvěma cestami: intraceulární cesta je výhodná, nebot nabízí proteinů z periplazmy a z bylo shora uvedeno neznamená, že aktivní konjugáty také v jiné hostitelské buňce, např. v eukaryotických buňkách, jako jsou např. kvasnice nebo savčí buňky.

Farmaceutické kompozice, dávkování a způsoby podávání

Třetím aspektem vynálezu je farmaceutická kompozice, obsahující vynalezené modifikované výhodně chimérické superantigeny, jak je uvedeno shora (jde o konjugované i nekonjugované formy). Kompozice, které se používají, jsou v oboru známé, kromě toho že obsahují přísadu vynalezeného superantigenu. Proto mohou mít kompozice formu lyofilizovaného částečkovité hmoty, sterilních nebo asepticky vyrobených roztoků, tablet, ampulí atd. Nosiče jako je voda (výhodně pufrovaná na fyziologicky přijatelnou hodnotu pH např. použitím PBS) nebo jiné inertní pevné nebo kapalné materiály, kompozice konjugátu, které mohou tvořit další přísady. Obecně se připravují smísením konjugátu, rozpuštěním navázáním konjugátu nebo jiným kombinováním

konjugátu s jedním nebo více ve vodě rozpustnými nebo ve vodě neropustnými vodnými nebo nevodnými vehikuly. Pokud je to nutné, přidávají se další vhodná aditiva a adjuvanty. Je nutné, aby vehikula a ostatní podmínky nepůsobily na aktivitu modifikovaného superantigenu nežádoucím účinkem.

Vynalezený superantigen lze běžně prodávat a podávat v předem upravených dávkách, přičemž každá obsahuje účinné množství konjugátu, který byl zde popsán, přičemž je možno předpokládat, že půjde o dávku v rozmezí 10 ng až 50 mg, např. v rámci rozmezí 10 ng až 1 mg nebo uvnitř rozmezí 10 μg až 50 mg. Přesná dávka se mění případ od případu v závislosti na hmotnosti a věku pacienta, způsobu podávání, typu choroby, cíl hledající skupině, superantigenu, navázání (-B-) atd.

Cesty podávání jsou také stejné, jak se obvykle používají v tomto oboru, tj. účinné množství antigenu, které postačujek zabíjení cílových buněk nebo má terapeutickou aktivitu, přičemž jde o antigen modifikovaný podle vynálezu, se přivádí do kontaktu s cílovými buňkami. Pro indikace, uvedené shora to většinou znamená parenterální podání, jako je injekce nebo infuze (subkutánní, intravenózní,

intraarteriální, jako je např. superantigeny, o systémicky.

intramuskulární, intraperitoneální) savců, člověk. Modifikované, výhodně chmérické které jde, mohou být podávány lokálně nebo

Termínem množství dostačující k zabíjení cílových buněk se míní, že množství je účinné pro aktivaci a řízení T buněk pro zničení cílových buněk.

Výhodnou cestou podání je v den priority tatáž cesta, jaká byla volena pro superantigenové konjugáty podle Dohlstena et al. W092/01470 a Abrahmséna et al. W096/01650.

Το znamená jedno až pětihodinová intravenózní infuze (výhodně čtyřhodinová) denně kombinovaná s látkou, snižující teplotu (paracetamol). Podávání se může po několika dnech zopakovat, např. může být opakováno 4 dny, se zřetelem na riziko vlivu protilátek řízených na konjugát.

Vynalezené superantigeny lze podávat buď jako hlavní terapii nebo ve výhodném provedení jako doplňkovou terapii ve spojení s chirurgickým zákrokem nebo ve spojení s jiným léčivem.

V kontextu s terapií jsme zjistili, že protilátkové přípravky, které jsou čistě zaměřeny na nekovalentně asociované těžké a lehké protilátkové řetězce mají výhody oproti přípravkům, které obsahují protilátky, ve kterých řetězce jsou připojeny cystinovým napojením. Podle čtvrtého aspektu vynálezu je řešením terapeutické použití přípravku z protilátek, zejména Fab přípravku, ve kterých jsou cysteinové zbytky napojené k řetězcům zaměněné aminokyselinami, neumožňujícími tvorbu disulfidu, např. serinem. Nejvýhodnější protilátkovou specifitou pro účely tohoto vynálezu byla ke dni priority stanovena C242mab (Lindholm et al. W093/01302) a dále pět T4mab jak je definovaná v odkazech citovaných shora. Ve výhodných variantách je jeden z protilátkových řetězců napojen na superantigen, který je schopný aktivace podsouboru T buněk νβ specifickým způsobem, jak je popsáno shora. Superantigen může být divokého typu, chiméra nebo v jednom místě zmutovaná verze (a jejich kombinace) jak je popsáno shora nebo Dohlstenem et al. W092/01470 nebo Abrahmsénem et al. W096/01650. Tento aspekt vynálezu také zahrnuje farmaceutické kompozice jako jsou popsány shora, ale obsahující protilátkový přípravek jak je definován pro tento aspekt vynálezu místo chimérického superantigenu.

V době priority tohoto vynálezu bylo výhodné používat • · • · · · • · • · • · _ Ί7 - · · ·· · · · ···· · -*- · · · · · · ··· ···· · ·· ···· ·· ··

Fab fragment 5T4 protilátky (Stern et al. W089/07947) v kombinaci s SEE/A-A chimérou s mutací D227A. Výhodným Fab byla mutace v obou řetězcích v místech umožňujícíh meziřetězcové disulfidové spojení (Cys na SER). Za účelem zvýšení výtěžku protilátky/napojení proteinů při výrobě v E.coli, byly také prováděny mutace ve Vkappa v určitých místech řetězce. Viz experimentální část.

MATERIÁLY A PODKLADY

Konstrukce SEA/SEE chimérických genů

Konstrukce SEA/SEE chimér byla provedena pomocí metody, založené na reakci polymerázového řetězce (PCR), čímž se prodlužuje sekvence (Horton et al.). Reakce PCR byly prováděny tak, že řetězec byl prodlužován (UlTma) (Perkin-Elmer) podle doporučení k výrobě PCR fragmentů, které byly klonovány v PCR-metodou (Stratagene, USA) a sekvencovány pro ověření jejich přesného pořadí aminokyseliny. Geny chimérických superantigenů pak byly subklonovány v expresním vektoru pKP889 (Abrahmsén et al. 1995), napojením SE konstrukcí k části těžkého řetězce a Fab fragmentu murinové monklonální protilátky C215. SEA a SEE rekombinantní fúzní proteiny byly vyrobeny jako polypeptidy plné délky podle sekvencí pro signální peptid (von Heijne 1986).

Exprese a čištění proteinů

Pro expresy Fab-SE fůzních proteinů a SEA mutantů popsaných dříve (Abrahmsén et al. 1995) byl použit kmen UL635 bakterie Escherichia coli. Fab-SE fúzní proteiny byly získány odstředěním při 5000 g a supernatantové frakce byly podrobeny dalšímu čištění na proteinové G-sepharose (Pharmacia Biotech AB Uppsala, Sweden) jak bylo popsáno dříve (Abahmsén et al. 1995). Čistota afinity čištěných Fab-SE • · • · · · • · variant byla > 90 % podle analýzy čistoty pomocí SDS-page.

Buňky

Buňky lymfomu lidských B-buněk linie RAI a karcinomu lidského tlustého střeva Colo205 byly kultivovány v úplném R-živném roztoku (RPMI-1640 doplněný 10% fetálním telecím sérem (GibcoBRL, Life technologies, Limited, Paisley Scotland) 1 mM glutaminu, HyClone Europe, Ltd. Cramlington 5x10^-5M β-merkaptoelanolu, ICN Biomedicals INC., Costa Mesa CA, 0,1 M NaHCO₃, seromet - Biochrome, lxlO^-2 M Hepes pufru, HyClone Europe Ltd. Cramlington, 0,1 mg/ml gentamycinu, Biological Industries Kibbuts Beit Haemek Israel, lxlO^-3

M pyruvátu sodného, HyClone Europe, Ltd, Cramlington). CHO buňky transfektované lidskými C215 a CD80 molekulami byly kultivovány v úplném R roztoku doplněném (G418) GipcoBRL, Life technologies, LTD.

Periferní krevní mononukleární buňky PBM

0,5 mg/ml Genintic

Paisley Scotland).

(byly připraveny z heparinizované krve z od normálních dárců. Buňky byly izolovány úpravou hustoty nad Ficoll-pague jak bylo dříve popsáno (Dohlsten et al. 1991). Lidské T lymfocity byly čištěny pro dosažení homogennosti pozitivní selekcí pomocí

MiniMACS kolon ve spojení s magnetickými korálky povlečenými monoklonálními protilátkami specifickými pro lidské CD4 a CD8 (Miltenyi Biotec GmBh, Germany) podle specifikací výrobců. Lidské SEA a SEE reaktivní buněčné linie byly namnoženy podle předchozího popisu (Dohlsten et al. 1994).

Lidská TCR νβ 22 exprimující buněčná linie byla získána z primárně stimulovaných SEA reaktivní buněčné linie pomocí pozitivní selekce s magnetickými korálky Dynabeads (Dynal A.S., Norway) povlečenými TCR νβ 22 specifickou monoklonální protilátkou (immunotech, Francie). Obohacené buňky obsahovaly > 95 % TCR νβ22⁺ T buněk jak bylo determinováno průtokovou cytometrií (výsledky se neuvádějí). Hybridomy murinové T buňky (I1B3, 2B4 a 11.40) byly namnoženy jak je uvedeno v

literatuře (Fleuri et al. 1991).

Testy Cytotoxicity

Cytotoxicita byla měřena standardním testěm uvolňování Crpo čtyřech nebo 6ti hodinách, jak bylo popsáno shora (Dohlsten et al. 1991). Jako cílové buňky byly používána lidské buňky kmenů Colo205 a Ráji. Efektorové buňky, SEA nebo SEE reaktivní lidské T buněčné linie nebo linie TCR νβ22 byly přidány jako efektor v konečném poměru 30:1. Při stanovení cytotoxicity byly použity ⁵¹Cr značené cílové buňky v úplném živném roztoku při koncentraci 2500 buněk/200 ml v mikrotitračních nádobkách s špičatým dnem. Byly přidány C215Fab-SEA/E hybridy při různých koncentracích a uvolňování ^OJ-Cr bylo měřeno gama počítačem. Procento specifické toxicity bylo vyhodnoceno jako 100x[(c.p.m. experimentálně uvolněné - c.p.m. pozadí uvolněné)/(c.p.m. celkově uvolněné - c.p.m. pozadí uvolněné)].

Testy proliferace lymfocitu

Pro změření proliferace 10⁵ lidských C buněk byly tyto buňky inkubovány při 37°C s 10⁴ ozářenými (200.000 Rad) stimulátorových buněk v 200 ml úplného živného roztoku v 96 mikrotitračních jamkách s různými množstvími hybridů C215Fab-SEA/E po dobu 72 hodin. Proliferace byla stanovena podle inkorporace [³H]-thymidinu, jak je popsáno (Dohlsten et al. 1988).

Analýza Fab-SAg indukované IL-2 produkce.

Buňky hybridomů murinu T-T byly inkubovány v 200 ml úplného R-roztoku s C215Fab-SEA/E chimérickými proteiny za přítomnosti 2x10⁴ Ráji stimulátorových buněk. Po 48 hodinách byl sebrán Supematant a analyzován na přítomnost murinu • · · · · ···· _ 9Π — ♦ · ··· ·· ··· · · w · · · · · ···

IL-2. Stručně, obsah cytokinu byl analyzován pomocí krysího antimouse cytokinu mAb jako protilátka ve funkci catcheru. Čištěný krysí antimouse IL-2, biotinem značený krysí antimouse IL-2 a rIL-2 byly získány od firmy PharMingen (San Diego, CA). Biotinem značený anticytokián mAb, byl získán jako Vectastain ABC kit od firmy (Vector Laboratořies, CA) a perxidasa od firmy (Bio-Rad Laboratories, CA). Takto získané látky byly používány pro detekci cytokinu. Absorbance byla stanovena pomocí zařízení ImmunoReader NJ2000 (InterMed Roskilde, Denmark) při 405 nebo 450 nm.

Mutace 5T4Fab

Konstrukce vektoru pro expresy 5T4Fab-SEA v E.coli.

Fv-kodující části 5T4 byly klonovány z hybridomu 5T4 získaného od Dr. Peter Sterna (Stern etl al. W089/07947). Podrobněji: cDNA byla vyrobena z mRNA, regiony veškerých proměnlivých domén a částí signální frekvence a také první konstantní doména těžkého řetězce a konstantní doména lehkého řetězce byly amplifikovány pomocí PCR. Oligonukleotidy:

5'-CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC-3' (SEQ ID NO: 2) a

5'-ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATIyTCTT-3' (SEQ ID NO 3) byly použity pro těžký řetězec, přičemž vznikl fragment 553bp, a oligonukletodiy:

5'-ACTAGTCGACATGGGCITCAAGATGGAGTCACAkwyyCwGG-3' (SEQ

ID NO: 4) a

5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3' (SEQ ID NO: 5) byly použity pro lehký řetězec, přičemž vznikl fragment 724bp, a oligonukletodiy. Pro každý řetězec byly sekvencovány 3 oddělené kolony a bylo zjištěno, že jsou indentické. DNA fragmenty vhoné pro vložení do exprexního vektoru (ref) byly získány ve druhém stupni PCR. Za účelem sestavení Fab expresního plasmidu byly různé regiony 5T4 navázány k sekvencím kódujícím pro konstantní regiony od murinu IgGl/k • · • 9 protilátky C242 mab (Lindholm et al. W093/01302). Region kódující superantigen odvozený od stafylokokového enterotoxinu A (SEA byl navázán za těžký řetězec). Ověřená sekvence pro Vkappa řetězec protilátky používaného typu pro 5T4 protilátku je uvedena v přehledu výsledků.

Mutagenéze 5T4

Do regionů, kódujících výrobu protilátky bylo uvedeno sedm záměn aminokyselin. Byly to PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser a Leu78Val. Podobně byly nahrazeny Cys zbytky, poskytující řetězci interdoménovou disulfidovou vazbu, nahrazeny serinovými zbytky, což vedlo k mutacím Cys458Ser v těžkém řetězci a Cys214Ser v lehkém řetězci. Mutace byly zavedeny s použitím PCR mutagenéze a DNA sekvence, která byla získána, byla potvrzena pomocí sekvencování.

Fermentační exprese a čištění 5T4Fab-SEA.

Exprese plazmidu obsahujícího gen resistence proti kanamycinu a lacUV5 promotoru, který může být vyvolán IPTG. Fúzované proteiny byly přečištěny z čištěného kultivačního média pomocí protein G sepharosy a SP sepharosy (Pharmacia Biotec Uppsala, Sweden) a formulovány v cytrátovém pufru s použitím Sephadexu G-25, v podstatě podle uvedeného popisu. Charakterizace pomocí SDS-page, HPLC s reverzí fází a hmotová spektroskopie ukázaly, že čištěné fúzní proteiny byly více než z 95 % čisté a měly odpovídající molekulovou hmotnost.

Výsledky: Modifikace superantigenu

Pomocí SEA- a SEE-reaktivních lidských T buněk jako buněčných linií efektoru, byla analyzována závislost superantigenově závislé buněčné cytotoxicity (superantigen • ·

dependent cellular cytotoxicity (SDCC)) C215Fab-SEA a C215Fab-SEE v závislosti na buňkách MHC třídy II⁺ Ráji. Přes rozdíly v νβ specifitě mezi SEA a SEE oba superantigeny vykazují indukci ve srovnatelném stupni cytotoxicity s oběma efektorovými buněčnými liniemi (obr. 1). Pro rozlišení účin ků MHC třídy II a přímých účinků SEA a SEE v TCR rozlišení byly testovány na superantigen-protilátka závislou buněčnou (cytotoxicitu suiperantigen-antibody dependent cellular cytotoxicity (SADCC)) proti C215 exprimujícím Colo205 buňkám. V testu Fab skupiny řídí fúzi proteinu na C215 exprimující cílové buňky a výsledky, ukazující fúze SE molekul k cytotoxickým T buňkám (CTL) nezávislých na MHC třídy II molekulách (Dohlsten et al. 1994). Přestože > 80 % sekvencí aminokyselin indentifikovaných mezi SEA a SEE, interakce TCR SEA a SEE ukazuje kvalitativní rozdíly v tomto typu testu. C215Fab-SEA fúzní protein si uchovává svou schopnost řídit SEA a SEE reaktivní CTL proti MHC třídy II^- cílovým buňkám (obr.l), zatímco C215 Fab-SEE není schopen indukovat cytotoxicitu vůči MHC třídy II^- cílovým buňkám ani u SEA ani u SEE reaktivních CTL (obr.l)

Bylo již dříve popsáno jinými výzkumníky, že rozdíly v νβ specifitě mezi SEA a SEE se primárně týkají tří aminokyselinových rozdílů v loopu předcházejícím a umístěným v irregulárním a5 helixu (Irwin et al. 1992, Hudson et al. 1993, Fraser et al. 1993 a Mollick et al. 1993). Rozdíly v TCR interakci popsané v těchto publikacích se netýkají νβ specifity alterovaných TCR, nebot schopnost C12Fab-SEA indukovat MHC třídy II nezávislou toxicitu není omezena na SEA reaktivní CTL, ale projevuje se u SEE reaktivních CTL.

Analýza potvrdila, že soustředěny do sekvenční homologie SEA a SEE (obr.2) neidentické aminokyselinové zbytky jsou osmi oddělených regionů. Mimo těchto osmi regionů tvořících 34 % sekvence, se identita dvou uvedených

SE uplatňuje z 97 % včetně konzervativních aminokyselinových substitucí a přetrvávajících diferencí. 4 z těchto nehomologních regionů jsou strukturálně blízké dvěma místům MHC třídy II (B, D, E aG) a nejsou schopny interragovat s TCR (obr. 3). Další čtyři regiony (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 a H: 200-207) jsou umístěny na okraji molekuly (obr.3) Vicinálně vůči TCR vazebným místům, umístěným v prohlubni mezi dvěma subdoménami (Kappler et al. 1992). Pro výzkum kvalitativních rozdílů v rozpoznání TCR SEA od SEE jsme vyrobily hybridní proteiny naroubováním regionů z SEA na SEE jako jednu z regionových chimér (SEE/A-A, -C, -F, H) jako dvojitý regionový hybrid (SEE/A-AH) a roubováním regionů umístěných vicinálně vůči MHC třídy II vazebným místům na SEE k SEA (SEA/E-BDEG) (obr.4). Všechny chimérické SE byly exprimovány jako C215Fab fúzní proteiny, aby byly schopny detekovat diference ohledně jejich aktivity za nepřítomnosti MHC třídy II.

SEA/E hybridní proteiny fúzované s C215Fab skupinou vykazují rozdíly ve Fab cílených cytotoxických testech. SDCC aktivita C215Fab-SEE/A hybridních proteinů byla analyzována v závislosti na MHC třídy II⁺ Ráji buněčné linii pomocí SEA-reaktivních lidských T buněk jako efektorů. Hodnoty EC50 všech C15Fab-SE hybridů stejně jako C15Fab-SEAwt a -SEEwt se neuplatňují pro velké množství chyb (např. 10¹² až 10¹¹ M, obr. 5). Jediný detekovatelný rozdíl je mírně redukovaná kultura C215Fab-SEE/A-AH hybridu, indikující ztrátu odpovídajících T buněk. Na druhé straně u experimentu s SADCC kde cytotoxicita je řízena proti MHC třídy II^-/215+ Colo205 buněčné linii, pouze C215Fab -SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-AH a C215Fab-SEA/E-BDEG indukovaly srovnatelnou cytotoxicitu jako C215Fab-SEAwt (obr.5). Tento C215Fab-SEE/A-F hybrid je schopen indukovat C215 cílenou cytotoxicitu ve vyšších koncentracích (EC50 přes 10^-10 M). Také uvedený 215Fab-SEE/A-H hybrid je schopen indukovat C215 cílenou

cytotoxicitu při podobné koncentraci pro polovinu maximální účinnosti, jako C215Fab-SEAwt (např. EC_5Q ~ 10^-13M), přičemž absolutní úroveň cytotoxicity je silně snížena (obr. 5). Tato diference může být následkem restrikce νβ specifity u linie C215 Fab-SEE/A-H zatímco schopnost indukovat C215 cílenou cytotoxicitu spočívá v odpovídajících subpopulaci T buněk.

Aby se tato zjištění dále prozkoumala, byly připraveny oligoklonální v tom lidské νβ analogní k specifické.

(Mollick et primárně obsažen v třech murinu νβ 3 Ve znáném al.1993),

Lidské νβ 22 jsou jsou SEA a ne SEE již bylo ukázáno že hlavní přínos SEA a SEE νβ je rozdílech v aminokyselinách mezi SEA stavu

CTL linie.

smyslu, že techniky přínos a SEE v regionu H (AA 200-207). V testech SDCC na cílové MHC třídy II⁺ Ráji buněčné linie, při použití νβ 22 oligoklonální

CTL linie jako obsahující SEA-H odezvu (např. se efektorů, byly schopny pouze hybridy region poskytnout C215Fab-SEAwt podobnou jedná o C215Fab-SEE/AH, C215Fab-SEE/A-AH a

C215Fab-SEA/E-BDEG, obr.6). Hybrid C215Fab-SEE/A-A, který byl schopen indukovat plnou SECC odezvu u celé CTL populace jako efektorů má v této zkoušce velice nízké obě poloviční maximální koncentrace a výsledky na vzorku (obr. 6). Jestliže je cytotoxicita νβ 22 CTL řízena proti MHC třídy II“/C215⁺ colo 205 buněčné linii, jsou schopny indukovat cytotoxickou odezvu, srovnatelnou s C215Fab-SEAwt pouze hybridy obsahující jak SEA-A tak i SEA-H (např. jsou to C215Fab-SEE/A-AH a C215Fab-SEA/E-BDEG). Hybrid obsahující samotný SEA region A (C215Fab—SEE/A-A) indukuje nižší hladinu cytotoxicity se srovnatelnou EC_5Q hodnotou. To ukazuje, že zbytková aktivita pozorovaná u C215Fab-SEE/A-H hybridu v SADCC s celou T buněčnou populací jako efektorů, není příčinou hybridem indukované odezvy u restrikční populace T buněk. Lepší vysvětlení pro tato pozorování je, že schopnost indukovat

SADCC odezvu u C215Fab-SE hybridních proteinů je primárně obsažena v SEA/A regionu a přínos SEA-H a -F regionů je nepatrný. Není žádný důvod se domnívat, že tato kvalita je omezena na jakýkoliv subsoubor T buněčných linií v kombinaci SEA-SEE odpovídající T buněčné populaci, nebot C215Fab-SEA je schopna indukovat stejnou odezvu u SEE reaktivních CTL a C215Fab-SEE/A-A je schopna plné rekonstituce odezvy, pozorované u C215Fab-SEA.

SEA/E hybridní proteiny, fúzované s C215Fab skupinou ukazují rozdíly ve Fab cílených testech proliferace.

Bylo již ukázáno, že čištěné zbytky lidských T buněk jsou indukovány k proliferaci působení C215Fab-SEA na buněčnou líni MHC třídy II“/C215⁺/CD80⁺ (Lando et al. 1993). Schopnost C215Fab-SEA indukovat MHC II nezávislou proliferaci je nicméně znatelně snížena u -C215Fab/SEE (tab. 1). Pro stanovení a zkoumání, zda tato diference v kvalitě ukazuje na stejné příčiny a rozdíly v SEA region A, jako byly pozorovány u SADCC, testovaly jsme proliferativní kapacitu C215Fab-SE hybridů, přítomných v bud CHO-DR1⁺/CD80⁺ nebo CHO-C215⁺/CD80⁺ transfektovaných buněčných liniích, na čištěných zbytcích lidských T buněk. Pokud prezentované Fab-SE konjugáty na CHO-DR1⁺/CD80⁺ nevykazují žádné rozdíly pro různé SE proteiny, je třeba v tom spatřovat odlišnost od předešlých výsledků. Nicméně rouby SEA regionů A, C a H v SEE potenciují proliferativní aktivitu srovnatelnou s C215Fab-SEE. Nej lepší výsledky byly získány rouborávním SEA regionů A a H, indikujících významnou úlohu pro region A jak byla zaznamenána pro MHC třídy II nezávislou toxicitu. Použitím negativní selekce je možné, že diference-Fab-SEA a -SEE by mohly být v některých případech významnější.

νβ specifita SE hybridů

Pro další výzkum, zda C15Fab-SEA/SEE hybridní fúzní proteiny byly spojeny s určitou νβ specifitou jsme použili SEA reaktivní murinové T buněčné hybridomy exprimující νβΐ, φ* φφφφ ··· Λ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ «Φ

Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ φ · Φ . Φ Φ ΦΦ

Φ · Φ Φ Φ Φ ··· · · φ · Φ Φ * Φ ·

Φ ΦΦ ΦΦΦΦ .ΦΦ Φ· νβ3 a νβΐΐ. Z těchto dat je vidět, že všechny zkouměné regiony přímo nebo nepřímo, působí na interakci s TCR. Roubováním SEA regionů C a F v C215Fab-SEE aktivitě proti SEA a SEE se křížově reaktivní νβΐ hybridom I1B3 zničil. Stejné chiméry, jak bylo zjištěno, nemají žádné účinky, nebo mají jen nepatrný vliv na aktivitu νβ3 a νβΐΐ hybridomů (2.B4 all.40) ve srovnání s C215Fab-SEE. Roubováním SEA regionu A v C215Fab-SEE se aktivita vůči νβ3 (2.B4) zvýší alespoň lOOkrát, ve srovnání s C215Fab-SEE. Výraznější účinky byly pozorovány u stejné buněčné linie při roubování SEA regionu H v C215Fab-SEE. Tento výraznější efekt, který spočívá ve vlivu na Εβ specifitu u SEA regionu H byl také zaznamenán při dřívějších experimentech (Mollick et al.). Nicméně stejná chiméra (C215Fab-SEE/A-H, projevuje snížení aktivity vůči SEA/SEE křížově reaktivním νβΐ a νβΐΐ hybridomům (I1B3 a 11.40) asi desetinásobně. V souladu s tím, pozorovaná TCR interakce u SEA se jeví jako významná pro všechny SEA-SEE různé regiony A, C, F a H.

Séroreaktivita

Séroreaktivita vzorků lidského séra na chimérické SE byla testována jednak na spojených vzorcích z různých částí světa a také na vzorcích individuálních. Roubováním SEA regionů A a H v SEE jsme získaly průměrnou séroreaktivitu (obr. 8). Podobná Séroreaktivita byla také pozorována u chiméry C215FAb-SEE/A. Nicméně, jednoduché rouby na SEA regionu A v SEE (C215Fab-SEE/A-A) poskytla séroreaktivitu podobnou C215Fab-SEE, odpovědný za zachování Také to ukazuje, že což ukazuje, že SEA region H je séroreaktivity vůči C215Fab-SEE/A-AH. SEA region H je částí dominujícího antigenního epitopu v SEA. Séroreaktivita získaná měřením na spojených vzorcích SEA z různých částí světa (Japonsko a USA) a 14 vzorků individuálních ze Švédská potvrzuji stejnou obecnou závislost (data nejsou znázorněna).

·· ····

44

4 4 4

4 44

Φ·· · 4 · 4 >· 44

- .** ···· ·· • 4 4 ·· φ · ·· • Φ 4 44 φ

4 44

Φ ··4444

Výsledky: Mutace Fab části fúzních proteinů.

Exprese konstrukcí 5T4Fab-SEA

Produkční úroveň u E.coli s 5T4Fab-SEA ve fermentoru byla signifikantně nižší než u jiných Fab superantigenových konstrukcí, které jsme již dříve studovali v naší laboratoři. Pro zvýšení této produkční úrovně byly zavedeny z tohoto důvodu dva typy modifikací. Za prvé, bylo zavedeno sedm různých bodových mutaci do regionu pracovní oblasti lehkého řetězce. Byly to PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser a Leu78Val. Za druhé cysteinové zbytky, které tvoří disulfidové vazby, tím že jsou připojeny k těžkému i lehkému řetězci, byly nahrazeny serinovými zbytky. Tato druhá modifikace měla za následek trojnásobný vzrůst produkce a sedm bodových mutací další dvanáctinásobný vzrůst produkční úrovně. Kromě signifikantnímu růstu produkce, odstranění disulfidové vazby také poskytuje homogenější produkt vzhledem k možnosti těchto reaktivních thiolových skupin reagovat si jinými thiol obsahujícími činidly.

Modifikované 5T4 molekuly byly testovány na afinitu k těmto antigenům a stejně tak na biologickou aktivitu na SADCC. Při těchto testech nebyla detekována žádná rozdílná aktivita mezi mutanty a divokými formami.

Cys/Ser mutace byla dále provedena v těžkém řetězci i v lehkém řetězci u Fab fragmentů několika jiných monoklonálních protilátek. Produkty se staly homogenními a plně si podržovaly schopnost nést antigen.

Sekvence regionu pracovní oblasti protilátky pro 5T4

Vkappa řetězec:

DAVMTQTPTF LLVSAGDRVT ITCKASQSVS NDVAWYOOKP GQSPTLLISY

TSSRYAGVPD RFIGSGYGTD FTFTISTLQA EDLAVYFCQQ DYNSPPTFGG • · · ·· ·

GTKLEIK (SEQ ID NO 6)

Podtržené sekvence jsou CDR. Tučně psaná písmena znamenají pozice, kde byly provedeny mutace: PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Ile63Thr, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val.

Tabulka 1:

	Proliferač* ECsn(pM)
C215Fab-SEAwt	2.2
C215Fab-SEEwt	6.9
C215Fab-SEE/A-A	0.9
C215Fab-SEE/A-C	2.8
C2I5Fab-SEE/A-F	5.7
|C215Fab-SEE/A-H	1.0
Č2I5Fab-SEE/A-AH	0.3

C215Fab-SEA/E-BDEG í

Tabulka 2:

C215Fab-SEA

C215Fab-SEE

C215Fab-SEE/A-A <

>1000 10 >1000 >300

0.05 • · · · • ·

Popis přiložených obrázků

Obrázek 1. Cytotoxicita závislá a nezávislá na MHC třídy II pro lidské SEE a SEA CTL.

Buněčná cytotoxicita závislá na MHC třídy II (A a B) a buněčná toxicita závislá na C215 (C a D) s C215Fab-SEA () a C215Fab-SEE (♦) jako efektorové molekuly. Cytotoxicita byla stanovena pomoci standardního 4-h testu uvolňování ⁵¹Cr pomocí SEE-reaktivní lidské T buněčné linie (A a C) a SEA-reaktivní lidské T buněčné linie (B a D). Linie cílových buněk byly MHC třídy II⁺/C215⁺ Ráji (A a B) a MHC třídy II⁺/C215⁺ Colo 205 (C a D). Data jsou z jednotlivých zkoušek, což představuje dva (A a C) až pčt (B a D) nezávislých experimentů.

Obrázek 2. Posouzení homologie SEA a SEE.

SEA/SEE různé regiony jsou poblíž TCR vazebných míst (A, C, F a H) a různé regiony jsou blízko vazebných míst dvou MHC třídy II.

Obrázek 3. Papírový model SEA.

Popis modelu (Kraulis 1991) SEA krystalu (Schad et al. 1995). SEA/SEE různé regiony jsou blízké TCR vazebným místům (A, C, F a H) a různé regiony blízké vazebným místům dvou MHC třídy II. Koordinačním iontem je zinek.

Obrázek 4. Schematické znázornění chimérických SE molekul.

Napětí SEA sekvencí jsou snížená. SEA/SEE různé regiony představují A, B, C, D, E, F, G a H.

• · • · • · · • · · ·

Obrázek 5. Cytotoxicita na lidské SEA reaktivní CTL závislá a nezávislá na MHC třídy II.

(A) MHC třídy II - závislá buněčná cytotoxicita a (B) C215 závislá buněčná cytotoxicita,

C215Fab-SEE/A-A (♦) , C215Fab-SEE/A-C (□) , C215FabSEE/A-F (0) , C215Fab-SEE/A-H (·) , C215Fab-SEE/A-H (Δ) a C215Fab-SEA/E-BDEG (O) . Cytotoxicita byla stanovena standardním 4-h testem uvolňování 51CR s použitím SEA-reaktivní linie lidských T buněk. Cílové buňky byly z linie MHC třídy II⁺/C215⁺ Ráji (A) a MHC třídy II⁺/C215⁺Colo 205(B). Data z jedné zkoušky jsou výsledkem pěti nezávislých experimentů.

Obrázek 6. Cytotoxicita na lidské Vb22⁺ reaktivní CTL závislá a nezávislá na MHC třídy II.

(A) MHC třídy II - závislá buněčná cytotoxicita a (B)

C215 závislá buněčná cytotoxicita, C215Fab-SEA

()

C215Fab-SEE (♦; C215Fab-SEE/A-A ( φ )

C215Fab-SEE/A-F ( <> ) C215Fab-SEA/A-H a C215Fab-SEA/E-BDEG i.O'_; .Cytotoxicita

C215Fab-SEE/A-C< π λ

C215Fab-SEE/A-AH byla stanovena standardním 4-h testem uvolňování 51CR s použitím

SEA-reaktivní linie lidských T buněk. Cílové buňky byly z linie MHC třídy II⁺/C215⁺ Ráji (A) a MHC třídy II~/C215*Colo

205(B). Data z jedné zkoušky jsou výsledkem pěti nezávislých experimentů.

Obrázek 7. Proliferace závislá a nezávislá na MHC třídy I. (není uvedeno v prioritní přihlášce).

Vliv Fab-SE hybridů na proliferaci T buněk závislou (A) nezávislou (B) na MHC třídy II. Přečištěné lidské T buňky byly stimulovány 96 hodin působením C215Fab-SEA (Λ) ,

C215Fab-SEE (φ ) , C215Fab-SE/A-A (♦) , C15Fab-SEE/A-C ( Qý ,

C215Fab-SEE/A-F(<>), C215Fab-SEE/A-H (·), C215Fab-SEE/A-AH (ZŮj a C215Fab-SEA/E-BDEG^o)prezentované na MHC třídy II⁺/C215⁺ ·· ···· ·· ·’· ·· ··

···· · ·· ···· ·· ··

CHO—DR4/C215 transfektantech (A) na MHC třídy II⁺/C215⁺CHO-CD80/C215 (B). Po 72 hodinách byly buněčné kultury uvedeny do kontaktu s ^H-thymidinem po dobu 24 hodin a množství inkorporovaného značeného vodíku bylo změřeno jako reprezentativní pro polovinu maximální koncentrace (EC₅₀). Data jsou udaná pro jeden test a představují průměr z dvou nezávislých experimentů.

Obrázek 8. Séroreaktivita lidského Ig poolu.

Pool od více než 5000 dárců z jižní evropy byl testován na C215Fab-SE fúzní proteiny. Postupně ředěný lidský Ig byl uveden do interakce po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě s C215Fab-SEAwt, C215Fab-SEEwt, C215Fab-SE/A-A, C215Fab-SEE/A-H a FabSEE/A-AH. Immobilizace do mikrotitrových prohlubní při koncentraci 1 ng/nádoba. Oprava na 215Fab-vazbu k proteinům séra byla provedena subtrakcí hodnoty OD pro C215Fab v každém bodě. Každý bod představuje průměr ze dvou vzorků. Další detaily viz materiály a metody.

Tabulka 1. Přečištěné lidské T buňky byly stimulovány 96 hodin působením C215Fab-SE na transfektantech MCH třídy II negativních CHO-CD80/C215. Po 72 hodinách bylo na buněčnou kulturu působeno ³H-thymidinem po dobu dalších 24 hodin a inkorporovaná radioaktivita byla změřena a představovala polovinu maximální koncentrace (EC₅₀).

Tabulka 2. Přírodní nebo chimérický Fab konjugovaným superantigenem byly stimulovány po dobu 24 hodin murinové T buňky hybridomu. Aktivita byla měřena jako IL-2 produkce a představuje polovinu maximální koncentrace (EC_5Q).

Práce v průběhu roku od priority.

• · protilátky

Ve snaze minimalizovat toxicitu fúze superantigenové chiméry C242Fab-SEE/A-A byla chiméra SEE/A-A třídy II způsobem, popsaným ve k mutována v vazebných místech WO 96/01650 a připojena C215Fab-SEE/A-A-D227A,

C215Fab—SEE/A-A—H187A/D227A,

C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A, nebo C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. na schopnost identifikovat srovnání s

C215Fab. Konstrukce jsou

C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A,

C215Fab-SEE/A-A-Wl3 0A/D2 2 7A,

C215Fab-SEE/A-A-N50S/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A Všechny fúze byly testovány indukovat proliferaci mutanty, kteří mají C215Fab-SEE/A-A-D227A.

aktivita byla pozorována u C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A nebo Některé chimérické fúze protilátek v normálním lidském C215Fab-SEE/A-A-D70A-D227A a Srovnání bylo C215Fab-SEE-D227A. mnohem nižší u všech lidských PBNC s cílem sníženou aktivitu ve Snížená proliferativní

C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. také testovány na titr byly séru (C215Fab-SEE/A-A-D227/A, C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A).

s C215Fab/SEA-D227A titr C215Fab-SEA-D227A provedeno

Relativní i chimér, které byly testovány.

byl více pozicích, odpovídající jednomu

187, ID č.

Tyto změny na pozicím 47, 50, 70, 130, jsou definovány v sekvencích nebo výhodně dvěma provedeny, jak obr. 2.

227 byly na

Vzhledem rámci četné které koncepce obměny a mmohou který k tomu, že v zde byl vysvětlen, jsou možné a vzhledem k modifikacím, provedeních v detailech uplatněny v požadavky práva, je třeba rozumět, že interpretovány jako ilustrativní, podstaty vynálezu.

souladu vynálezu různá provedení být v těchto i s taxativními detaily, neznamenaj i které zde jsou omezení • · · ···· · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · · ···· · ·· · · · · · ♦ · ·

- 33 ODKAZY

Abrahmsén L et al (1995) Characterization of two distinct MHC Class II binding sites in the superantigen staphylococcal enterotoxin A. EMBO J 14:2978-86.

Abrahmsén et al (1996) W09601650 (patent application). A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate.

Antonsson P et al (1996) Staphylococcal enterotoxin A and E chiméra with reduced seroreactivity and retained ability to target cytotoxic T cells for use in tumor therapy. ABRF '96: Biomolecular Technioues, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, California. March 30-April 2, 1996.

Dohlsten et al (1988) Two subsets of human peripheral blood CD4+ T helper cells differing in the capacity to produce IL-2 and interferon-gama can be defined by the Leu-18 and UCHL1 monoclonal antibodies. Eur J Immunol 18:1173-1178.

Blanco et al (1990) Mutants of staphylococcal toxic shock syndrome toxin 1: Mitogenicity and recognition by a neutralizing monoclonal antibody. Infect. Immun. 58 (1990) 3020-3028.

Dohlsten M et al (1994) Monoclonal antibody-superantigen fusion proteins: Tumor specific agents for T cell based tumor therapy. Proč Nati Acad Sci USA 91:8945-8949.

Dohlsten M et al (1991) Monoclonal antibody-targeted superantigens: A different class of anti-tumor agents. Proč Nati Acad Sci USA 88:9287-9291.

Dohlsten et al (1992) W09201470 (patent application). Target specific antibody -superantigen conjugates and their preparation.

Fleury S et al (1991) Mutational analysis of the interaction between CD4 and class II MHC: class II antigens. Cell 66:103749 .

• ·· ···· ·· · ·

Fraser JD et al (1993) Structural model of Staphylococcal enterotoxin A interactions with MHC class II antigens. In: Huber,BT Palmer, E (eds) Current Communications in Cell and Molecular Biology 7. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. pp 7-29.

Grossman et al (1991) Mutation of the disulfide loop in staphylococcal enterotoxin A. Consequences for T cell recognition. J Immunol 147:3274-3281.

Hartwig UF et al (1993) Mutations affecting MHC class II binding of the superantigen streptococcal erythrogenic toxin A. Int. Immunol. 5 (8) 869-875.

Horton HM et al (1990) Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques 8:528-535

Hudson et al (1993) Two adjacent residues in staphylococcal enterotoxins A and Ξ determine T cell receptor V beta specificity. J Exp Med 177:175-184.

Hufnagle WO et al (1991) The carboxyl-terminál region of staphylococcal enterotoxin type A is required for a fullv active molecule. Infect Immun 59:2126-2134.

Irwin MJ et al (1992) Enterotoxin residues deterr.ining T-cell receptor Vb binding specificity. Nátuře 359:841-r

Kalland et al (1991) WO 9104053 (patent application). Pharmaceutical composition that makes cells expressing MHC Class II antigens targets for cytotoxic cells.

Kappler OW et al (1992) Mutations defining functional regions of the superantigen staphylococcal enterotoxin B. J Exp Med 175:387-396

Kappler et al (1993) WO9314634 (patent application). Protective effects of mutated superantigens.

• · • · ··· · · · ···· · ·· ···· ·· ··

Kotzin BL et al (1993) Superantigens and their potential role in human disease. Adv Immunol 54:99-166.

Kraulis PJ (1991) MOLSCRIPT: A program to produce both detailed. and schematic plots of protein structures. J Appl Cryst 24:946950.

Lamphear JG et al (1996) Residues near the amino and carboxy termini of staphylococcal enterotoxin E independently mediate TCRVP-specific interactions. J Immunol 156: 2178-2185 (March 15, 1996)

Lando PA et al (1993) Co-stimulation with B7 and targeted superantigen is required for MHC class II-independent T-cell proliferation but not cytotoxicity. Immunology 80: 236-241.

Lindholm et al (1993) 9301302 (patent application). Tumor, carbohydrate antigen specific monoclonal antibody and cell line.

Mollick JA et al (1993) Localization of a site on bacterial superantigens that determines T cell receptor beta chain specificity. J Exp Med 177:283-293.

Newall et al (1991) In vivo T-cell activation by staphylococcal enterotoxin B prevents outgrowth of a malignant tumor. Proč Nati Acad Sci USA 88 1074-1078

Schad EM et al (1995) Crystal structure of the superantigen, Staphylococcal enterotoxin type A. EMBO J 14:3292-3301

Stern et al (1989) WO8907947 (patent application). Improvements relating to anigens.

Terman et al (1991) W09110680 (patent application). Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds.

Terman et al (1993) WO9324136 (patent application). Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds.

von Heijne, G (1986) . A new method for predicting signál sequence cleavage sites. Nucleic Acid Res, 14, 1483-1490.

• · · · · ·

PŘEHLED SEKVENCÍ (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 3 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 1: Gly Gly Pro (3) Informace pro sekvence SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jeden (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 2: CAATTTTCTT GTCCACCTTG GTGC (4) Informace pro sekvence SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 35 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3: ACTAGTCGAC ATGGATGGAG CTITATCATI YTCTT (5) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 41 základních párů (B) Typ: nukleoavá kyselina (C) Druh řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 4:

ACTAGTCGAC ATGGGCITCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G (6) Informace pro sekvence SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 základních párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: jednoduchý (D) Topologie: lineární

	(xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCATTCCTGT TGAA
(7)	Informace pro sekvence SEQ ID NO: 6: (i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 107 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptidy
(xi)	Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO:	6:
Asp	Ala Val Met Thr Gin Thr Pro	Thr	Phe
1	5		10
Leu	Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg 15	Val	Thr 20

• · ··· · • ·

	- 38	• · • • • · · ·	• · • · • · · • · •	• · • ' • · • · • · · · ·
Ile	Thr	Cys	Lys	Ala	Ser	Gin	Ser	Val	Ser
				25					30
Asn	Asp	Val	Ala	Trp	Tyr	Gin	Gin	Lys	Pro
				35					40
Gly	Gin	Ser	Pro	Thr	Leu	Leu	Ile	Ser	Tyr
				45					50
Thr	Ser	Ser	Arg	Tyr	Ala	Gly	Val	Pro	Asp
				55					60
Arg	Phe	Ile	Gly	Ser	Gly	Tyr	Gly	Thr	Asp
				65					70
Phe	Thr	Phe	Thr	Ile	Ser	Thr	Leu	Gin	Ala
				75					80
Glu	Asp	Leu	Ala	Val	Tyr	Phe	Cys	Gin	Gin
				85					90
Asp	Tyr	Asn	Ser	Pro	Pro	Thr	Phe	Gly	Gly
				95					100
Gly	Thr	Lys	Leu	Glu	Ile	Lys

105 (8) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 233 aminokyselin (B) Typ: amino kyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 7:

Ser	Glu	Lys	Ser	Glu 5	Glu	Ile	Asn	Glu	Lys 10	Asp	Leu
Arg	Lys	Lys	Ser	Glu 15	Leu	Gin	Gly 20	Thr	Ala	Leu	Gly
Asn	Leu	Lys	Gin	Ile	Tyr	Tyr	Tyr	Asn	Glu	Lys	Ala

30 35

	- 39	• · · • · · • •	• · · «0 · 0 * · · · · • · · · • · · · 0 • · · ·	• 0 • 0 • ' · • 0 0 0 0 • 0	0 · 0 · • 0 0 · • · • 0
• 00	0 00 0
Lys	Thr	Glu	Asn 40	Lys	Glu	Ser	His	Asp 45	Gin	Phe	Leu
Gin	His 50	Thr	Ile	Leu	Phe	Lys 55	Gly	Phe	Phe	Thr	Asp 60
His	Ser	Trp	Tyr	Asn 65	Asp	Leu	Leu	Val	Asp 70	Phe	Asp
Ser	Lys	Asp 75	Ile	Val	Asp	Lys	Tyr 80	Lys	Gly	Lys	Lys
Val 85	Asp	Leu	Tyr	Gly	Ala 90	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Gin 95	Cys
Ala	Gly	Gly	Thr 100	Pro	Asn	Lys	Thr	Ala 105	Cys	Met	Tyr
Gly	Gly 110	Val	Thr	Leu	His	Asp 115	Asn	Asn	Arg	Leu	Thr 120
Glu	Glu	Lys	Lys	Val 125	Pro	Ile	Asn	Leu	Trp 130	Leu	Asp
Gly	Lys	Gin 135	Asn	Thr	Val	Pro	Leu 140	Glu	Thr	Val	Lys
Thr 145	Asn	Lys	Lys	Asn	Val 150	Thr	Val	Gin	Glu	Leu 155	Asp
Leu	Gin	Ala	Arg	Arg 160	Tyr	Leu	Gin	Glu 165	Lys	Tyr	Asn
Leu	Tyr 170	Asn	Ser	Asp	Val	Phe 175	Asp	Gly	Lys	Val	Gin 180
Arg	Gly	Leu	Ile	Val 185	Phe	His	Thr	Ser	Thr 190	Glu	Pro
Ser	Val	Asn 195	Tyr	Asp	Leu	Phe	Gly 200	Ala	Gin	Gly	Gin
Tyr 205	Ser	Asn	Thr	Leu	Leu 210	Arg	Ile	Tyr	Arg	Asp 215	Asn
Lys	Thr	Ile	Asn 220	Ser	Glu	Asn	Met	His 225	Ile	Asp	Ile

Tyr Leu Tyr Thr Ser

230 • *

- 40 - ,·’ «ΦΦΦ φ · φ Φ·Φ φφ φφ Φ· ·φ » φ φφ φ φ φφ φ φ φφ φ φ φ · φ φ Φφ φ « φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ

Φ ΛΦ ΦΦΦΦ Φ · ·Φ (9) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 233 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence SEQ ID NO: 8:

Ser	Glu	Lys	Ser	Glu 5	Glu	Ile	Asn	Glu	Lys 10	Asp	Leu
Arg	Lys	Lys 15	Ser	Glu	Leu	Gin	Arg 20	Asn	Ala	Leu	Ser
Asn 25	Leu	Arg	Gin	Ile	Tyr 30	Tyr	Tyr	Asn	Glu	Lys 35	Ala
Ile	Thr	Glu	Asn 40	Lys	Glu	Ser	Asp 45	Asp	Gin	Phe	Leu
Glu	Asn 50	Thr	Leu	Leu	Phe	Lys 55	Gly	Phe	Phe	Thr	Gly 60
His	Pro	Trp	Tyr	Asn 65	Asp	Leu	Leu	Val	Asp 70	Leu	Gly
Ser	Lys	Asp 75	Ala	Thr	Asn	Lys	Tyr 80	Lys	Gly	Lys	Lys
Val 85	Asp	Leu	Tyr	Gly	Ala 90	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Gin 95	Cys
Ala	Gly	Gly	Thr 100	Pro	Asn	Lys	Thr	Ala 105	Cys	Met	Tyr
Gly	Gly 110	Val	Thr	Leu	His	Asp 115	Asn	Asn	Arg	Leu	Thr 120
Glu	Glu	Lys	Lys	Val 125	Pro	Ile	Asn	Leu	Trp 130	Ile	Asp
Gly	Lys	Gin 135	Thr	Thr	Val	Pro	Ile 140	Asp	Lys	Val	Lys
Thr 145	Ser	Lys	Lys	Glu	Val 150	Thr	Val	Gin	Glu	Leu 155	Asp

• 0 ···· ·· ·· ·· ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99

9 «>·.· · 9 999 9 · “ · ' · · ·· 9 9 9

9999 9 99 9999 99 99

Leu	Gin	Ala	Arg 160	His	Tyr
Leu	Tyr 170	Asn	Ser	Asp	Ser
Arg	Gly	Leu	Ile	Val 185	Phe
Thr	Val	Ser 195	Tyr	Asp	Leu
Tyr 205	Pro	Asp	Thr	Leu 210	Leu
Lys	Thr	Ile	Asn 220	Ser	Glu
Tyr	Leu	Tyr	Thr	Thr

Leu	His	Gly 165	Lys	Phe	Gly
Phe 175	Gly	Gly	Lys	Val	Gin 180
His	Ser	Ser	Glu 190	Gly	Ser
Phe	Asp 200	Ala	Gin	Gly	Gin
Arg	Ile	Tyr	Arg	Asp 215	Asn
Asn	Leu	His	Ile	Asp	Leu

225

Claims (31)

1. Konjugát mezi

a) superantigenem divokého typu, který je modifikován a

b) skupinou hledající cíl, přičemž uvedený modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci superantigenu prvního divokého typu, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků v alespoň jednom regionu

i) který je přítomen uvnitř uvedené aminokyselinové sekvence superantigenu prvního divokého typu a ii) jehož funkce při determinaci vazby k TCR a aktivaci subsouboru T buněk je zaměněna odlišným aminokyselinovým zbytkem, přičemž uvedený modifikovaný antigen si zachovává schopnost aktivovat subsoubor T buněk.

2. Konjugát podle nároku 1, kde uvedený alespoň jeden region má význam při determinaci vazby k ΤΰΚνβ.

3. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 2, kde uvedený superantigen divokého typu je SEA, SED nebo SEE nebo analogické superantigeny.

4. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde uvedený superantigen divokého tpu je SEE a uvedený alespoň jeden region je zvolen ze skupiny sestávající z regionů A, C, F a H, jak jsou definovány v identifikaci SEQ ID NO 8.

5. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde uvedený superantigen divokého typu je SEE, ve kterém jsou provedeny následující substituce aminokyselinových zbytků: R20G, N21T, S24G a R27K, kde pozice jsou definovány v • · · ·

SEQ ID NO 8 na obr. 2.

6. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde modifikovaný superantigen je chiméra mezi

a) uvedeným superantigenem prvního divokého typu

b) jedním nebo více přídavnými superantigeny divokého typu, kde v každém z uvedených jednoho nebo více aminokyselinových zbytků v alespoň jednom regionu superantigenu uvedeného prvního divokého typu je zaměněn odpovídájícíh aminokyselinovým zbytkem, přítomným v odpovídajícím regionu v uvedeném jednom nebo více přídavných antigenů divokého typu.

7. Konjugát podle nároku 6, kde alespoň jeden první a přídavný superantigen divokého typu jsou zvoleny ze skupiny sestávající z SEA, SED, SEE a analogů superantigenů.

8. Konjugát podle nároku 7, kde alespoň jeden region je zvolen ze skupiny sestávající z regionů odpovídajících A, C, F a H, jak jsou definovány na obr. 2 sekvencemi SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO 8.

9. Konjugát podle nároku 8, kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek v pozici odpovídající 20, 21, 24 a 27 v regionu A, definovaný v SEQ ID NO 7a SEQ ID NO 8, obr. 2, je zaměněn odpovídajícími aminokyselinovými zbytky v regionu A uvedeného jednoho nebo více přídavného antigenů divokého typu.

10. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 6 až 9, kde uvedený superantigen prvního divokého typu je SEE a uvedené jeden nebo více přídavné antigeny divokého typu představuje SEA.

11. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 7 až 10, kde náhrady uvedené jedné nebo více aminokyselin jsou v pozicích odpovídajícíh 20, 21, 24, 27 (pro region A) a/nebo 60, 62 (pro region C) a/nebo 111, 114, 115 117, 118, 124, 126 (pro region F) a/nebo 200, 206, 207 (pro region H) jak je definováno na obr. 2, SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO 8, přičemž s výhodou, pokud ve všech čtyřech pozicích v regionu A je zbytek zaměněn, první superantigen je SEE a jeden nebo více přídavných antigenů představuje SEA.

12. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, kde uvedené superantigeny divokého typu jsou zvoleny z těch antigenů, které vyžadují pro vazbu k MHO třídy II antigenům zinkový iont a kde uvedený superantigen prvního divokého typu, pokud je v konjugátu přítomen, má sekvenci, ve které aminokyselinový zbytek v pozici, umožňující vazbu k zinkovému iontu, je zaměněn pro snížení schopnosti této vazby, s důrazem na pozice 225 a/nebo 227, jak je definováno v obr. 2 SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO 8.

13. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, kde uvedená cíl hledající skupina je protilátka, zejména aktivní fragment protilátky.

14. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 13, kde cíl hledající skupina je Fab fragment.

15. Způsob léčení chorob savců aktivací imunitního systému léčeného savce, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství superantigenů obsahujícího superantigenem divokého typu, který je modifikován a skupinou hledající cíl, přičemž uvedený modifikovaný superantigen zahrnuje aminokyselinovou sekvenci superantigenů prvního divokého typu, ve kterém jeden nebo více aminokyselinových zbytků v alespoň jednom regionu

i) který je přítomen uvnitř uvedené • · · · • · aminokyselinové sekvence superantigenu prvního divokého typu a ii) jehož funkce při determinaci vazby k TCR a aktivaci subsouboru T buněk je zaměněna odlišným aminokyselinovým zbytkem, přičemž uvedený modifikovaný antigen si zachovává schopnost aktivovat subsoubor T buněk.

16. Způsob podle nároku 16, ve kterém uvedený modifikovaný superantigen je chimérický superantigenem prvního divokého typu a přídavnými superantigeny divokého typu, jednoho nebo více aminokyselinových zbytků jednom regionu uvedeného superantigenu superantigen mezi jedním nebo více přičemž každý z v uvedeném alespoň prvního typu je nahrazen odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem, přítomným v odpovídajícím regionu uvedeného superantigenu nebo superantigenů jednoho nebo více přídavných divokých typů.

17. Způsob podle kteréhokoli z nároků 15 až 16, ve kterém nemoc je spojena s tím, že buňky exprimují povrchovou cílovou strukturu, která váže na svém epitopu superantigen, přičemž tento epitop je strukturálně odlišný od epitopu vážícího se k TCR a ve kterém vazba k povrchu vázající struktury umožňuje vazbu k TCR se subsekventní aktivací subsouboru T buněk.

18. Způsob podle kteréhokoli z nároků 15 až 17, ve kterém nemoc je zvolena ze skupiny sestávající z rakovin, virových infekcí, parazitických napadení a autoimunitních chorob.

19. Způsob podle kteréhokoli z nároků 15 až 18, v němž superantigeny divokého typu jsou zvoleny ze skupiny sestávající z SEA, SED a SEE a analogických superantigenů.

20. Způsob podle nároku 19, ve kterém alespoň jeden • · • · region je zvolen ze skupiny sestávající z regionů odpovídajícím regionům A, C, F nebo H jak jsou definovány v obr. 2, SEQ ID NO 7 a SEQ ID NO 8.

21. Způsob podle kteréhokoli z nároků 15 až 20, ve kterém uvedený superantigen prvního divokého typu je SEE a uvedený region je zvolen ze skupiny sestávající z A, C, F a H jak jsou definovány v SEQ ID NO 8, obr. 2.

22. Způsob podle nároku 21, ve kterém uvedený alespoň jeden region je region A a dále jsou provedeny následující substituce aminokyselinových zbytků: R20G, N21T, S24G a R27K, přičemž pozice jsou definovány v SEQ ID NO 8 na obr. 2.

23. Způsob podle kteréhokoli z nároků 15 až 22, ve kterém alespoň jeden přídavný superantigen divokého typu je SEA.

24. Způsob podle nároku 15 až 23, přičemž uvedeným superantigenem je konjugát, definovaný v kterémkoli z nároků 1 až 14.

25. Způsob podle nároku 24, ve kterém superantigeny divokého typu jsou zvoleny z takových superantigenů, které vyžadují vazbu k zinkovým iontům, aby se mohly navázat k MHC třídy II, přičemž aminokyselinový zbytek v sekvenci superantigenu prvního divokého typu je zaměněn v pozici, umožňující vazbu k zinku, za účelem snížení schopnosti vazby MHC třídy II.

26. Způsob podle nároku 25, ve kterém uvedené pozice odpovídají 227, jak je definováno na obr. 2, SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8, s důrazem na mutaci D227A.

27. Způsob podle kteréhokoli z nároků 24 až 26, při • · · · · · kterém skupinou hledající cíl je Fab fragment, ve kterém každý z cysteinových zbytků, navázaný jako můstek mezi řetězci, je zaměněn aminokyselinovým zbytkem, neumožňujícím vazbu mezi řetězci, přičemž výhodně je nahrazen serinem.

28. Farmaceutický prostředek obsahující modifikovanou protilátku, ve které cysteiny, zajištující cysteinové můstky mezi řetězci u přírodní protilátky, jsou zaměněny tak, aby se znemožnila tvorba cystinu.

29. Farmaceutický prostředek podle nároku 28, v němž náhradní zbytek je serionový zbytek.

30. Farmaceutický prostředek podle nároku 29, v němž protilátkou je Fab fragment.

31. Farmaceutický prostředek podle nároku 30, ve kterém protilátka je napojena na peptidovou skupinu, zajištující aktivaci T buněk νβ specifickým způsobem.