CZ294686B6 - Bakteriální plazmid, sekvence DNA a jejich použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nového bakteriálního plazmidu pMUT1, použitelného jako vektoru pro expresi, k analytickým a diagnostickým účelům in vitro v mikrobiologii nebo k léčebným účelům. Řešení se týká také sekvencí DNA v tomto plazmidu.ŕ

Description

Vynález se týká bakteriálního plazmidu, odpovídajících sekvencí DNA a jejich použití při mikrobiologických analytických a/nebo diagnostických postupech.

Dosavadní stav techniky

Bakteriální plazmidy jsou zpravidla cirkulámí, uzavřené kovalentním způsobem a šroubovicové. Často obsahují geny pro odolnost proti antibiotikům nebo těžkým kovům, geny pro metabolizaci netypických substrátů nebo geny, typické pro určitý druh organismu, například metabolické vlastnosti nebo faktory virulence. Radu plazmidů je možno přenést z určitých buněk do jiných buněk. Vzhledem k tomu, že podle současných názorů je pathogenita bakterií podmíněna také vlastnostmi plazmidů, soustředí se na plazmidy a na vy světlení jejich vlastností velký zájem.

Mezi organismy enterobacteriaceae, k nimž náleží 14 hlavních čeledí a 6 dalších čeledí je známo, že tyto bakterie mohou vytvářet odlišné vlastnosti. Typickým příkladem mohou být Escherichia. Salmonella a Klebsiella. Escherichia coli je klasickým objektem genetiky bakterií. Až objev a vysvětlení různých faktorů virulence u tohoto mikroorganismu umožnily nalézt uspokojivé vysvětlení jevu, který spočívá v tom, že kmeny tohoto mikroorganismu mají rozdílnou patogenitu pro člověka a další živočichy, a to od avirulentních kmenů až ke kmenům s vysokou virulencí, jako tomu je v případě nově zjištěné varianty EHEC. Pro kmeny E. coli, žijící ve střevech i mimo střevo již byla zjištěna celá řada faktorů virulence a některé z těchto faktorů jsou již dobře charakterizovány. V případě patogenních kmenů Sero-skupiny 06:K5 byly například prokázány jako faktory virulence haemolysin a adhesin na fímbrie, které se nevyskytují u nepatogenních bakterií této skupiny.

Geny pro virulenci je možno nalézt u enterobakterií zpravidla ve velkých plazmidech s molekulovou hmotností přibližně 60 000. Vyskytují se však také enterobakterie s malými, tzv. kryptickými plazmidy, jejichž funkce až dosud nebyla s jistotou prokázána.

Vzhledem k tomu, že je známo, že v případě E. coli jsou faktory pro virulenci alespoň z části uloženy v genech plazmidů, je zapotřebí dále zkoumat a charakterizovat plazmidy enterobakterií a zvláště a escherichií pro zlepšení diagnózy a léčení onemocnění, vyvolaných těmito mikroorganismy. Plazmidy nebo jejich bakteriální nosiče nebo odpovídajícím způsobem syntetizovaná DNA mohou být využity pro mikrobiologickou analýzu nebo k diagnostickým účelům a také k léčení poruch zažívacího ústrojí. Mimo to jsou plazmidy a zvláště právě plazmidy E. coli známými vektory pro expresi v genetické technologii, což zvyšuje zájem o lepší poznání jejich vlastností.

K tomuto účelu byly provedeny genetické výzkumy kmene E. coli DSM 6601. Sekvence DNA, získané z tohoto kmene byly analyzovány pomocí počítače a automatického analyzátoru sekvencí a srovnávány se známými sekvencemi DNA jiných bakterií.

Podstata vynálezu

Kmen DSM 6601 obsahuje 2 malé plazmidy s velikostí 3177 a 5552 párů bází (bp), tyto plazmidy byly označeny jako pMUTl a pMUT2. Podstatu vynálezu tvoří plazmid pMUTl se sekvencí, znázorněnou na obr. 1.

- 1 CZ 294686 B6

DNA menšího plazmidů pMUTl byla po rozštěpení restrikčním enzymem HindlII subklonována jako lineární fragment ve vektoru pUC18 a pak byla stanovena sekvence DNA. Tato sekvence je také znázorněna na obr. 1. Takto získaná sekvence DNA byla podrobena srovnání homologie při použití banky sekvencí GenEMBL. Výsledky tohoto postupu jsou znázorněny na obr. 2.

Pro toto srovnání bylo místo štěpení enzymem HindlII označeno jako poloha 1. Od polohy 200 až 800 bp měla DNA plazmidů pMUTl značnou homologii s různými počátky replikace jiných plazmidů enterobakterií, zvláště s plazmidy NTP1, NTP16 a CIoDF13. V oblasti polohy 950 bp začíná úsek o 570 bp s vysokou homologii s plazmidem NTP16, který byl původně izolován ze Salmonella typhimurium. Tato homologie zahrnuje gen mobA, který je důležitý pro mobilizovatelnost plazmidů NTP16 a také počátek přenosu (oriT). Mimo to je možno od polohy 1790 do polohy 1920 bp pozorovat značnou homologii s geny parA a cer, které mají význam pro stálost a kontinuální rozdělování a doplňování molekul plazmidů při dělení buněk. Pro zbývající oblasti DNA nebylo možno prokázat žádnou významnou homologii.

Mimo to byla sekvence DNA plazmidů pMUTl přepsána do sekvence aminokyselin a analyzována na přítomnost otevřených čtecích rámců. Bylo analyzováno 6 různých možností čtecích rámců, čímž bylo prokázáno 5 otevřených čtecích rámců s velikostí 143, 62, 56, 48 a 49 aminokyselin. Grafické vyjádření analýzy je znázorněno na obr. 3.

Kromě až dosud neznámých plazmidů pMUTl a pMUT2 nebyla dosud nalezena ani kombinace těchto plazmidů v žádném kmenu E. coli ani v jiných enterobakteriích.

Přítomnost plazmidů je pravděpodobně spojená s metabolickými, k léčebným účelům využitelnými vlastnostmi kmene DSM 6601. Další možnost využití je ke zlepšení výživy nebo k probiotickým účelům.

Analýza plazmidů umožňuje přesnější stanovení a analýzu vlastností enterobakterií a zvláště skupiny Escherichia. Mimoto jsou plazmidy využitelné jako vektory pro expresi při genetických technologiích.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 vyjadřuje sekvenci DNA plazmidů pMUTl.

Obr. 2 znázorňuje oblasti homologie plazmidů pMUTl se sekvencí jiných plazmidů.

Obr. 3 vyjadřuje analýzu otevřených čtecích rámců v plazmidech pMUTl a pMUT2.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: izolace plazmidů

DNA plazmidů byla izolována podle publikace Bimboim. A. C. a Doly. J. 1979, Nucl. Acids Res. 7:1513-1523: A rapid alkaline extraction proceduře for screening recombinant plazmid DNA.

ml prostředí LB bylo naočkováno kolonií bakterií a inkubováno přes noc za protřepávání při teplotě 37 °C. Pak byla kultura odstředěna v Eppendorfově nádobce a zbytek prostředí byl

-2CZ 294686 B6 odstraněn pomocí pipety. Usazenina buněk byla uvedena v suspenzi ve 100 mikrolitrech roztoku I, který obsahoval 50 mM glukózy, 10 mM EDTA, pH 8 a 25 mM Tris-HCl, pH 8. Po inkubaci 5 minut při teplotě místnosti bylo přidáno 200 mikrolitrů roztoku II s obsahem 0,2 N NaOH a 1 % SDS, směs byla míchána až do vzniku čirého roztoku a Eppendorfova nádobka pak byla ještě na 5 minut uložena do ledu. Pak bylo přidáno 150 mikrolitrů roztoku III s obsahem 3 M octanu sodného o pH 4, 8, nádobka byla krátce protřepána až do vysrážení chromosomální DNA ve formě vloček, načež byla směs ještě na 5 minut uložena do ledu. Vysrážená chromosomální DNA a zbytky buněk byly 5 minut odstředěny a supematant, obsahující DNA plazmidu byl přenesen do jiné nádobky. K čištění této DNA bylo přidáno 50 mikrolitrů fenolu a 150 mikrolitrů směsi chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24:1 a po krátkém protřepání na 2 minuty byla směs odstředěna. Vodná fáze byla pipetou přenesena do nové nádobky. DNA plazmidu byla vysrážená přidáním 2 objemů ledového ethanolu a směs byla 10 minut odstředěna. Usazenina byla promyta 70 % ethanolem a usušena v zařízení Speedvac. DNA plazmidu byla znovu uvedena do suspenze ve 20 mikrolitrech bidestilované vody a suspenze byla uložena při teplotě 20 °C.

Příklad 2: analýza sekvence DNA

Sekvence DNA byla analyzována způsobem podle publikace Sanger. F., Nicklen. S. a Coulson. A. R. 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463-5467: DNA sequencing with chain terminating inhibitors.

Analýza sekvence DNA byla uskutečněna při použití balíčku pro analýzu T7 (Pharmacia LKB).

V denaturačním stupni bylo smíseno 8 mikrolitrů (1,5 až 2 mikrogramy) DNA plazmidu se 2 mikrolitry 2 N NaOH, směs byla krátce odstředěna a inkubována 10 minut při teplotě místnosti. DNA pak byla vysrážená přidáním 3 mikrolitrů 3 M octanu sodného o pH 4, 8,7 mikrolitrů bidestilované vody a 60 mikrolitrů ledově chladného absolutního ethanolu, srážení bylo prováděno 15 minut při teplotě -70 °C. Vysrážená DNA byla 10 minut odstředěna, promyta 70% ethanolem a usušena.

Pro vaznou reakci byla denaturovaná DNA uvedena do suspenze v 10 mikrolitrech bidestilované vody a byly přidány 2 mikrolitry pufru pro provedení vazby a 2 mikrolitry primeru (40 ng). Výsledná směs byla inkubována 20 minut při teplotě 37 °C k uskutečnění vazby primeru na matrici DNA. Reakční směs pak byla ponechána 10 minut ke zchladnutí na teplotu místnosti a pak bylo provedeno značení nebo byla směs zmrazená na -20 °C do dalšího použití. Značení bylo prováděno tak, že byly 3 mikrolitry směsi pro značení, 1 mikrolitr (alfa-P³²)dATP a 2 mikroliry polymerázy T7 (polymeráza byla zředěna v poměru 1:5 pufrem pro ředění enzymů) pipetou uloženy jako reakční směs k uskutečnění vazby a po krátkém promíchání byla směs inkubována 5 minut při teplotě místnosti. V průběhu této doby byla již připravena směs pro analýzu sekvence a pro terminační reakci a byla předem zahřáta na teplotu 37 °C (do jedné nádobky bylo přidáno vždy 2,5 mikrolitrů směsi G, A, T a C). Po ukončení značení byly vždy 4 mikrolitry směsi přidány do 4 směsí pro analýzu sekvence a všechny směsi byly krátce promíchány. Terminační reakční směsi byly inkubovány 5 minut při teplotě 37 °C. K ukončení terminační reakce bylo přidáno vždy 5 mikrolitrů roztoku pro zastavení reakce. Reakční směsi byly přeneseny do inkubátoru s teplotou 95 °C, směsi byly 2 minuty denaturovány a pak uloženy do ledu. Vždy 2,5 mikrolitrů reakční směsi bylo naneseno na gel pro analýzu sekvence, obsahující 25,5 g močoviny, 22 ml bidestilované vody, 6 ml ΙΟχ TBE, 10 ml 40 % polyakrylamidu, 2 ml persíranu amonného s koncentrací 16 mg/ml a 60 mikrolitrů TEMED, postupně byly nanášeny směsi G, A, T a C. Elektroforéza probíhala při 40 W a napětí 1500 V po dobu 4,5 h.

Claims (4)

1. Plazmid se sekvencí DNA, znázorněnou na obr. 1 a jeho allelové variace.

2. Sekvence DNA se sledem nukleotidů, znázorněným na obr. 1.

3. Použití plazmidu nebo sekvence nukleotidů podle nároku 1 nebo 2 k mikrobiologické analýze a/nebo diagnostice in vitro.

4. Použití plazmidu nebo sekvence nukleotidů podle nároku 1 nebo 2 jako vektorů pro expresi in vitro.