CZ294867B6 - Bakteriální plasmid, sekvence DNA a jejich použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nového bakteriálního plasmidu pMUT2, použitelného jako vektor pro expresi, k analytickým a diagnostickým účelům v mikrobiologii nebo k léčebným účelům. Řešení se týká také sekvencí DNA v tomto plasmidu.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká bakteriálního plasmidu, odpovídající sekvence DNA a jejich použití při mikrobiologických analytických a/nebo diagnostických postupech.

Dosavadní stav techniky

Bakteriální plasmidy jsou zpravidla cirkulámí, uzavřené kovalentním způsobem a šroubovicové. Často obsahují geny pro odolnost proti antibiotikům nebo těžkým kovům, geny pro metabolizaci netypických substrátů nebo geny, typické pro určitý druh organismu, například metabolické 15 vlastnosti nebo faktory virulence. Radu plasmidu je možno přenést z určitých buněk do jiných buněk. Vzhledem k tomu, že podle současných názorů je patogenita bakterií podmíněna také vlastnostmi plasmidů, soustředí se na plasmidy a na vysvětlení jejich vlastností velký zájem.

Mezi organismy enterobacteriaceae, k nimž náleží 14 hlavních čeledí a 6 dalších čeledí je známo, 20 že tyto bakterie mohou vytvářet odlišné vlastnosti. Typickým příkladem mohou být Escherichia.

Salmonella a Klebsiella. Escherichia coli je klasickým objektem genetiky bakterií. Až objev a vysvětlení různých faktorů virulence u tohoto mikroorganismu umožnily nalézt uspokojivé vysvětlení jevu, který spočívá v tom, že kmeny tohoto mikroorganismu mají rozdílnou patogenitu pro člověka a další živočichy, a to od avirulentních kmenů až ke kmenům s vysokou virulencí, 25 jako tomu je v případě nově zjištěné varianty EHEC. Pro kmeny E. coli, žijící ve střevech i mimo střevo již byla zjištěna celá řada faktorů virulence a některé z těchto faktorů jsou již dobře charakterizovány. V případě patogeních kmenů Sero-skupiny 06:K5 byly například prokázány jako faktory virulence haemolysin a adhesin na fimbrie, které se nevyskytují u nepatogeních bakterií této skupiny.

Geny pro virulenci je možno nalézt u enterobakterií zpravidla ve velkých plasmidech s molekulovou hmotností přibližně 60 000. Vyskytují se však také enterobakterie s malými, tzv. kryptickými plasmidy, jejichž funkce až dosud nebyla s jistotou prokázána.

Vzhledem k tomu, že je známo, že v případě E. coli jsou faktory pro virulenci alespoň z části uloženy v genech plasmidů, je zapotřebí dále zkoumat a charakterizovat plasmidy enterobakterií a zvláště a escherichií pro zlepšení diagnózy a léčení onemocnění, vyvolaných těmito mikroorganismy. Plasmidy nebo jejich bakteriální nosiče nebo odpovídajícím způsobem syntetizovaná DNA mohou být využity pro mikrobiologickou analýzu nebo k diagnostickým účelům a také 40 k léčení poruch zažívacího ústrojí. Mimo to jsou plasmidy a zvláště právě plasmidy E. coli známými vektory pro expresi v genetické technologii, což zvyšuje zájem o lepší poznání jejich vlastností.

K tomuto účelu byly provedeny genetické výzkumy kmene E. coli DSM 6601. Sekvence DNA, 45 získané z tohoto kmene byly analyzovány pomocí počítače a automatického analyzátoru sekvencí a srovnávány se známými sekvencemi DNA jiných bakterií.

Podstata vynálezu

Kmen DSM 6601 obsahuje 2 malé plasmidy s velikostí 3177 a 5552 párů bází (bp), tyto plasmidy byly označeny jako pMUTl a pMUT2. Podstatu vynálezu tvoří plasmid pMUT2 se sekvencí, znázorněnou na obr. 2.

- 1 CZ 294867 B6

DNA velkého plasmidu pMUT2 byla po linearizaci pomocí restrikčního enzymu Sphl subklonována ve vektoru pUC18 a pak byla úplně stanovena její sekvence nukleotidů. Tato sekvence je znázorněna na obr. 2. Takto získaná sekvence byla pomocí banky GenEMBL vyšetřena na homologii s již známými sekvencemi DNA. Výsledek je graficky znázorněn na obr. 3. DNA 5 plasmidu pMUT2 má významnou homologii s oblastí replikonu různých plasmidů COIE1 zE.

coli od polohy 890 do polohy 1660 bp. Další význačná homologie s uvedenými plasmidy se nachází v oblasti poloh 3800 až 4950 bp. Jde o homologii mobilizačních oblastí plasmidů COIE1. V oblasti poloh 3770 až 4980 bp byla prokázána homologie s plasmidem kmene Al Pasteurella haemolytica. Na tomto plasmidu se nacházejí kódové geny pro odolnost uvedeného 10 mikroorganismu proti antimikrobiálním látkám. Homologie zasahuje až do oblasti mezi jednotlivými geny, takže jde pravděpodobně také o sekvence, nezbytné pro mobilizovatelnost plasmidu.

Byly také identifikovány dvě oblasti s význačnou homologii s jinými plasmidy enterobakterií. Jde o oblasti počátku replikace a o oblasti mob, které jsou nutné pro mobilizovatelnost plasmidu. 15 V případě plasmidu pMUT2 nebylo možno ve zbývajících úsecích DNA prokázat žádnou další význačnou homologii.

Sekvence DNA plasmidu pMUT2 byla přepsána do sekvence aminokyselin a analyzována na přítomnost otevřených čtecích rámců. Výsledek tohoto sledování je graficky znázorněn na obr. 1. 20 Bylo prokázáno 5 otevřených čtecích rámců se sekvencí aminokyselin, obsahující 327, 318, 264, a 63 aminokyselin.

Kromě až dosud neznámých plasmidů pMUTl a pMUT2 nebyla dosud nalezena ani kombinace těchto plasmidů v žádném kmenu E. coli ani v jiných enterobakteriích.

Přítomnost plasmidu je pravděpodobně spojená s metabolickými, k léčebným účelům využitelnými vlastnostmi kmene DSM 6601. Další možnost využití je ke zlepšení výživy nebo k probiotickým účelům.

Analýza plasmidu umožňuje přesnější stanovení a analýzu vlastností enterobakterií a zvláště skupiny Escherichia. Mimo to jsou plasmidy využitelné jako vektory pro expresi při genetických technologiích.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 vyjadřuje analýzu otevřených čtecích rámců v plasmidech pMUTl a pMUT2.

Obr. 2 znázorňuje sekvenci DNA plasmidu pMLJT2.

Obr. 3 graficky vyjadřuje oblasti homologie plasmidu pMUT2 se sekvencemi jiných plasmidů.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: izolace plasmidu

DNA plasmidu byla izolována podle publikace Birnboim. A. C. a Doly. J. 1979, Nucl. Acids Res. 7:1513-1523: A rapid alkaline extraction proceduře for screening recombinant plasmid DNA.

ml prostředí LB bylo naočkováno kolonií bakterií a inkubováno přes noc za protřepávání při teplotě 37 °C. Pak byla kultura odstředěna v Eppendorfově nádobce a zbytek prostředí byl odstraněn pomocí pipety. Usazenina buněk byla uvedena v suspenzi ve 100 mikrolitrech roztoku 1, který obsahoval 50 mM glukózy, 10 mM EDTA, pH 8 a 25 mM Tris-HCI, pH 8. Po inkubaci 5 minut při teplotě místnosti bylo přidáno 200 mikrolitrů roztoku II s obsahem 0,2 N NaOH a 1 % SDS, směs byla míchána až do vzniku čirého roztoku a Eppendorfova nádobka pak byla ještě na 5 minut uložena do ledu. Pak bylo přidáno 150 mikrolitrů roztoku III s obsahem 3 M octanu sodného o pH 4,8, nádobka byla krátce protřepána až do vysrážení chromosomální DNA ve formě vloček, načež byla směs ještě na 5 minut uložena do ledu. Vysrážená chromosomální DNA a zbytky buněk byly 5 minut odstředěny a supernatant, obsahující DNA plasmidu byl přenesen do jiné nádobky. K čištění této DNA bylo přidáno 50 mikrolitrů fenolu a 150 mikrolitrů směsi chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 24:1 a po krátkém protřepání na 2 minuty byla směs odstředěna. Vodná fáze byla pipetou přenesena do nové nádobky. DNA plasmidu byla vysrážená přidáním 2 objemů ledového ethanolu a směs byla 10 minut odstředěna. Usazenina byla promyta 70 % ethanolem a usušena v zařízení Speedvac. DNA plasmidu byla znovu uvedena do suspenze ve 20 mikrolitrech bidestilované vody a suspenze byla uložena při teplotě -20 °C.

Příklad 2: analýza sekvence DNA

Sekvence DNA byla analyzována způsobem podle publikace Sanger, F., Nicklen, S. a Coulson, A. R. 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463-5467: DNA sequencing with chain terminating inhibitors.

Analýza sekvence DNA byla uskutečněna při použití balíčku pro analýzu T7 (Pharmacia LK.B).

V denaturačním stupni bylo smíseno 8 mikrolitrů (1,5 až 2 mikrogramy DNA plasmidu se 2 mikrolitry 2N NaOH, směs byla krátce odstředěna a inkubována 10 minut při teplotě místnosti. DNA pak byla vysrážená přidáním 3 mikrolitrů 3 M octanu sodného o pH 4, 8,7 mikrolitrů bidestilované vody a 60 mikrolitrů ledově chladného absolutního ethanolu, srážení bylo prováděno 15 minut při teplotě -70 °C. Vysrážená DNA byla 10 minut odstředěna, promyta 70 % ethanolem a usušena.

Pro vaznou reakci byla denaturovaná DNA uvedena do suspenze v 10 mikrolitrech bidestilované vody a byly přidány 2 mikrolitry pufru pro provedení vazby a 2 mikrolitry primeru (40 ng). Výsledná směs byla inkubována 20 minut při teplotě 37 °C k uskutečnění vazby primeru na matrici DNA. Reakční směs pak byla ponechána 10 minut ke zchladnutí na teplotu místnosti a pak bylo provedeno značení nebo byla směs zmrazená na -20 °C do dalšího použití. Značení bylo prováděno tak, že byly 3 mikrolitry směsi pro značení, 1 mikrolitr (alfa-P³² dATP a 2 mikroliry polymerázy T7 (polymeráza byla zředěna v poměru 1:5 pufrem pro ředění enzymů) pipetou uloženy jako reakční směs k uskutečnění vazby a po krátkém promíchání byla směs inkubována 5 minut při teplotě místnosti. V průběhu této doby byla již připravena směs pro analýzu sekvence a pro terminační reakci a byla předem zahřáta na teplotu 37 °C (do jedné nádobky bylo přidáno vždy 2,5 mikrolitrů směsi G, A, T a C). Po ukončení značení byly vždy 4 mikrolitry směsi přidány do 4 směsí pro analýzu sekvence a všechny směsi byly krátce promíchány. Terminační reakční směsi byly inkubovány 5 minut při teplotě 37 °C. K ukončení terminační reakce bylo přidáno vždy 5 mikrolitrů roztoku pro zastavení reakce. Reakční směsi byly přeneseny do inkubátoru s teplotou 95 °C, směsi byly 2 minuty denaturovány a pak uloženy do ledu. Vždy 2,5 mikrolitrů reakční směsi bylo naneseno na gel pro analýzu sekvence, obsahující 25,5 g močoviny, 22 ml bidestilované vody, 6 ml ΙΟχ TBE, 10 ml 40% polyakrylamidu, 2 ml persíranu amonného s koncentrací 16 mg/ml a 60 mikrolitrů TEMED, postupně byly nanášeny směsi G, A, T a C. Elektroforéza probíhala při 40 W a napětí 1500 V po dobu 4,5 h.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Plasmid se sekvencí DNA, znázorněnou na obr. 2 a jeho allelové variace.
2. 2. Sekvence DNA se sledem nukleotidů, znázorněným na obr. 3.
3. 3. Použití plasmidu nebo sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2 k mikrobiologické analýze a/nebo diagnostice in vitro.
4. 4. Použití plasmidu nebo sekvence DNA podle nároku 1 nebo 2 jako vektorů pro expresi in vitro.