ES2229492T3 - Plasmidos bacterianos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a plásmidos y secuencias de ADN que tienen las secuencias de nucleótidos ilustradas en las figuras (1) o (4) y al empleo de éstas.

Description

Plásmidos bacterianos.

La invención se refiere a plásmidos bacterianos.

Los plásmidos son moléculas de ADN pequeñas, extracromosales, en su mayor parte circulares y auto-replicantes, que se originan en casi todas las bacterias y también en algunos eucariótidos así como en las mitocondrias. El tamaño de los plásmidos varia entre aproximadamente 1,5 a 300 kb.

Los plásmidos bacterianos son por lo general circulares, cerrados covalentemente y superenrrollados. Frecuentemente portan genes resistentes frente a antibióticos o metales pesados, genes para la metabolización de sustratos atípicos o genes para un conjunto de características de tipo específico, como propiedades metabólicas o factores de virulencia. Se pueden transferir varios plásmidos de una célula a otra célula. Debido a que la patogenicidad de las bacterias, según la visión actual, está en parte condicionada por las propiedades de los plásmidos, existe un gran interés creciente en el esclarecimiento de las propiedades del ADN de plásmido.

En la familia de las enterobacteriaceae, a la que pertenecen 14 variedades principales y otras 6 variedades, se conoce que se pueden desarrollar estas propiedades distintas. Ejemplos típicos son Escherichia, Salmonella, y Kebsiella. La Escherichia coli (E. coli) es el objeto clásico de la genética de bacterias. En un primer momento el descubrimiento y caracterización de distintos factores de virulencia de E. coli hizo posible, en general, encontrar aclaraciones satisfactorias de que cepas de este tipo presenten una patogenicidad diversa parcialmente extrema para humanos o animales, que va desde la avirulencia hasta una virulencia elevada, como en el caso de la variante conocida como "EHEC" recientemente difundida. De esta forma se han descrito, tanto cepas para E. coli extraintestinales como también intestinales, un conjunto de factores de virulencia, que están en parte bien caracterizados. Para las cepas de E. coli patógenas del serogrupo O6:K5 se encontraron factores de virulencia como, por ejemplo, hemolisinas y adhesinas fímbricas P, que como se puede comprobar no constituyen representantes apatógenos de este sero-grupo.

Los genes virulentos se encontraron en enterobacterias, por lo general, sobre plásmidos de gran tamaño (aproximadamente de 80 kb). Sin embargo también hay enterobacterias con los denominados plásmidos crípticos, de pequeño tamaño, cuya función hasta ahora no se ha podido determinar de forma segura.

Se sabe a este respecto que en el caso de E. coli se encuentran disponibles factores de virulencia al menos parcialmente también en los genes de los plásmidos, existiendo por tanto una necesidad de más estudios para el descubrimiento y caracterización de plásmidos en enterobacterias y especialmente en Escherichia, por ejemplo, para mejorar las posibilidades de diagnosis y terapia en enfermedades tras infecciones con enterobacterias. Los plásmidos o sus vehículos bacterianos o el correspondiente ADN sintetizado pueden ser de uso en la analítica o diagnóstico microbiológico, medicinalmente en la terapia o profilaxis y también para fines fisiológicos nutricionales o probióticos. Además de esto los plásmidos, y especialmente aquellos de E. coli, son vectores de expresión conocidos en la ingeniería genética, de modo que también, basado en esto, existe un interés en un conocimiento mejor de las propiedades de tales plásmidos.

Para este fin se llevaron a cabo estudios de genética molecular con la cepa de E. coli DSM 6801. Las secuencias de ADN obtenidas de esta cepa se sometieron con ayuda de programas de bases de datos a un análisis de secuencia de ADN y se compararon con secuencias de ADN ya documentadas de otras bacterias.

La cepa DSM 6601 posee dos plásmidos pequeños con un tamaño de 3177 o 5552 bp que se designaron como pMUT1 o pMUT2.

El ADN del plásmido pequeño pMUT1 se subclonó tras escisión con restricción con el enzima HindIII como fragmento lineal en el vector pUC18, a continuación se determinó la secuencia de ADN. Esto se aprecia en la figura 1 adjunta. La secuencia de ADN así obtenida se sometió a una comparación de homología con la base de datos GenEMBL; los resultados de esta contraposición se ponen de manifiesto a partir de la figura 2.

Para esta comparación se inmovilizan los interfaces del HindIII como posición 1. De la posición 200 a 800 bp el ADN del plásmido pMUT1 muestra homologías significativas respecto a los diferentes orígenes de la reduplicación (origins of replication) de otros plásmidos enterobacterianos, en especial respecto a los plásmidos NTP1, NTP18 y CloDF13. En el entorno de la posición 950 bp comienza una gran homología de 570 bp respecto al plásmido NTP16, que se aisló originalmente de Salmonella typhimurium. Esta homología comprende el gen mobA, el cual es necesario para la movilidad del plásmido NTP16 así como un origen de transferencia (oriT). Además de esto se encontraron de la posición 1790 a 1920 bp homologías significativas respecto a los genes parA y cer, que son de relevancia para la estabilidad y la transmisión y distribución continuas de moléculas de plásmido en la división celular. Para las regiones de ADN habituales no se podría identificar homología significativa alguna.

Además de esto se transcribió la secuencia de ADN del plásmido pMUT1 en una secuencia de aminoácidos y se analizó en cuanto a la presencia de marcos de lectura abiertos. Se estudiaron 6 posibilidades de marcos de lectura distintas. Se podría encontrar en total 5 marcos de lectura abiertos con un tamaño de 143, 82, 68, 56, 49 y 48 aminoácidos. Se da una representación gráfica del análisis en la figura 3.

El ADN del plásmido de gran tamaño pMUT2 se subclonó tras linealización con el enzima de restricción SphI del mismo modo que en el vector pUC18 y a continuación se secuenció completamente. La secuencia de ADN se aporta en la figura 4. La secuencia de ADN así obtenida se estudió con ayuda del programa de bases de datos genEMBL en cuanto a las homologías respecto a las secuencias de ADN ya conocidas. El resultado se representa gráficamente en la figura 5. El ADN del plásmido pMUT2 muestra homologías significativas respecto a la región de replicación de distintos plásmidos CoIE1 de R. coli en la posición 890 a 1660 pb. Se encuentra otra homología significativa respecto a los plásmidos CoIE1 en la región de la posición 3800 a 4950 bp. A este respecto se trata de homologías respecto a la región de movilización de plásmidos CoIE1. En el intervalo de la posición 3770 a 4980 bp se encontraron homologías respecto a un plásmido de la cepa pasteurella-hemolítica A1. En este plásmido se encuentran genes que codifican en la pasteurella para proteínas resistentes antimicrobios. La homología se extiende, sin embargo, sobre el intervalo intergénico, de modo que posiblemente se trata también de secuencias que son imprescindibles para la movilidad del plásmido.

Se identificaron dos regiones que presentan homologías significativas respecto a otros plásmidos enterobacterianos. A este respecto se trata de las regiones origen de la replicación y regiones mob, que son necesarios para la movilidad del plásmido. Para el pMUT2 no se podría identificar para los segmentos de ADN habituales homología significativa alguna.

También la secuencia de ADN del plásmido pMUT2 se transcribe a continuación en una secuencia de aminoácidos y se analiza en cuanto a la presencia de marcos de lectura abiertos. El resultado se representa gráficamente en la figura 3. Se encontraron 5 marcos de lectura abiertos con secuencias de aminoácidos en el orden de tamaños de 327, 318, 264, 76 y 63 aminoácidos.

Además de los plásmidos pMUT1 y pMUT2 desconocidos hasta ahora tampoco se ha encontrado hasta ahora su combinación en cepa alguna de E. coli u otras enterobacterias.

La precedencia de los plásmidos se encuentra posiblemente relacionada con las propiedades metabólicas y medicinales y/o fisiológicas nutricionales o prebióticas de utilidad de la cepa DSM 8801.

El estudio de los plásmidos hace posible una determinación y análisis más exactos de las enterobacterias y especialmente del grupo de Eacherichia. Además de esto se proponen estos plásmidos como vectores de expresión no dañinos para la ingeniería genética.

En lo sucesivo se aclarará la invención más detalladamente a partir de los ejemplos:

Ejemplo 1 Aislamiento del plásmido

El aislamiento del ADN del plásmido tuvo lugar de forma análoga al procedimiento Birnboim y col. (Birnboim, A. C. y Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1513-1523 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA).

Se vacunan 3 ml de medio BL con una colonia de bacterias y se agita durante la noche a 37ºC. Este cultivo se centrifuga en un recipiente Eppendorf, se separa el residuo del medio con una pipeta. Se resuspende el sedimento celular con 100 \mul de solución I (glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8, tris-HCl 25 mM, pH 8). Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se añade a esto 200 \mul de solución II (NaOH 0,2 N; SDS al 1%), se mezcla hasta que aclara y se deja reposar el recipiente Eppendorf otros 5 minutos sobre hielo. Luego se añade a esto 150 \mul de solución III (acetato de sodio 3M, pH 4,8), se agita brevemente hasta que precipita en forma de copos el ADN cromosomal y se deja la carga sobre hielo de nuevo durante 5 minutos. El ADN cromosomal precipitado y los restos celulares se agregan durante 5 minutos en la centrífuga y se transfiere el sobrenadante con el ADN del plásmido a un nuevo recipiente. Para la purificación del ADN del plásmido se añaden 50 \mul de fenol y 150 \mul de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y se centrifuga tras una breve agitación de 2 minutos. La fase acuosa se pipetea a un nuevo recipiente. El ADN del plásmido precipita con 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo y se centrifuga durante 10 minutos. Se lava el agregado con etanol al 70% y se seca en el Speedvac. Se resuspende el ADN del plásmido en 20 \mul de H_{2}O bidestilada y se conserva a -20ºC.

Ejemplo 2 Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN tuvo lugar de forma análoga al procedimiento de F. Sanger y col. (Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 74:5463 - 5467 DNA sequencing with chain terminating inhibitors).

La secuenciación de AND tuvo lugar con el kit T7-Sequenzier de la compañía Pharmacia LKB.

Para la etapa de desnaturalización se mezclan 8 \mul (de 1,5 a 2 \mug) de ADN de plásmido con 2 \mul de NaOH 2 N; se centrifuga brevemente y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se precipita el ADN durante 15 minutos a -70ºC con 3 \mul de acetato de sodio 3 M, pH 4,8, así como 7 \mul de H_{2}O bidestilada y 60 \mul de etanol absoluto enfriado con hielo. El ADN precipitado se centrifuga durante 10 minutos se lava con etanol al 70% y se seca.

Para la reacción de hibridación se suspende el ADN desnaturalizado en 10 \mul de H_{2}O bidestilada y se mezcla con 2 \mul de tampón de hibridación y 2 \mul de cebador (40 ng). Se incuba la carga durante 20 minutos a 37º C, de modo que puede tener lugar una unión del cebador al ADN del templado. Se enfría la carga de la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego, bien se usa de forma inmediata para la reacción de marcado, o se congela a -20ºC. Para la reacción de marcado se pipetean a la carga de la reacción de hibridación 3 \mul de mezcla de marcado, 1 \mul de [\alpha-P^{32}]dATP y 2 \mul de polimerasa T7 (la polimerasa T7 se diluyó a 1:5 con tampón de dilución de enzima) y tras una breve mezcla durante 5 minutos se incubó a temperatura ambiente. Durante esto se precalientan las mezclas de secuencias ya dispuestas para la reacción de terminación (por cada uno de los recipientes 2,5 \mul de "G"-, "A"-, "T"- y "C"-mix "short") a 37ºC. Tras finalización de la reacción de marcado se añaden respectivamente 4 \mul de esta a las cuatro mezclas de secuencia y se mezcla brevemente con la pipeta. Las reacciones de terminación se incuban durante 5 minutos a 37ºC. Para finalizar las reacciones de terminación se añade a cada una 5 \mul de solución de parada. Se transfieren las cargas finalmente a un incubador a 95ºC, se desnaturalizan durante 2 minutos y luego se colocan sobre hielo. Por cada 2,5 \mul de las reacciones se aplican sobre un gel de secuencia [25,2 g de urea, 22 ml de H_{2}O bidestilada, 6 ml de TBE diez veces, 10 ml de poliacrilamida (40%), 2 ml de persulfato de amonio (16 mg/ml), 60 \mul de TEMED] en la secuencia "G", "A", "T", "C". La electroforesis tiene lugar a 40 watios y 1500 voltios durante 4,5 horas.

Claims (6)

1. Plásmido con la secuencia de ADN representada en la figura 1.

2. Plásmido con la secuencia de ADN representada en la figura 4.

3. Moléculas de ADN con la secuencia de nucleótidos representada en la figura 1.

4. Moléculas de ADN con la secuencia de nucleótidos representada en la figura 4.

5. Uso de los plásmidos o moléculas de ADN según la reivindicación 1 a 4 en análisis microbiológicos y/o en diagnóstico in vitro.

6. Uso de los plásmidos o moléculas de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 como vectores de expresión.