CZ295438B6 - Vakcína a způsob její výroby - Google Patents
Vakcína a způsob její výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295438B6 CZ295438B6 CZ19984189A CZ418998A CZ295438B6 CZ 295438 B6 CZ295438 B6 CZ 295438B6 CZ 19984189 A CZ19984189 A CZ 19984189A CZ 418998 A CZ418998 A CZ 418998A CZ 295438 B6 CZ295438 B6 CZ 295438B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vaccine
- pleuropneumoniae
- dna
- capsule
- fragment
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims abstract description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims abstract description 52
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 35
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims abstract description 12
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 60
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 25
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 68
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 67
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 37
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 37
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 37
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 21
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 19
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 19
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 19
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 101100005430 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) cpsA1 gene Proteins 0.000 description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 101150091586 cpsC gene Proteins 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 6
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 6
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 6
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000178944 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 5 Species 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 101150115143 shroom2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101100379376 Caenorhabditis elegans apx-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100491553 Escherichia coli (strain K12) arcA gene Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 101150095807 cpxA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001478285 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 2 Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 101100437444 Haemophilus influenzae bexA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437448 Haemophilus influenzae bexC gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437449 Haemophilus influenzae bexD gene Proteins 0.000 description 1
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 description 1
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 1
- 101710134502 Mgp-operon protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 229940124867 Poliovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010037368 Pulmonary congestion Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010046685 Rho Factor Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N azaperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCN(C=2N=CC=CC=2)CC1 XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150090146 bexB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150114385 bexD gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940029583 inactivated polio vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N phenol;hydrate Chemical compound O.OC1=CC=CC=C1 KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Řešení se týká vakcíny proti nemocem způsobeným zapouzdřenými organismy sestávající z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, postrádající sekvence DNA kódující syntézu pouzdra. Tato vakcína proti nemocem způsobeným normálně zapouzdřenými organismy se připravuje genetickou modifikací těchto organismů delecí genů kódujících syntézu pouzdra nebo jeho části dostatečné k tvorbě nezapouzdřeného mutantu tohoto organismu. Živý, oslabený kmen Actinobacillus pleuropneumoniae geneticky modifikovaný velkou delecí v chromozomální oblasti DNA kódující syntézu pouzdra je bezpečnou a účinnou vakcínou proti prasečí pleuropneumonii.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se obecně týká vakcín používaných ve veterinárních aplikacích a obzvláště živých, rekombinantních, oslabených vakcín pro chorobné stavy, které jsou způsobované organismy, jež obsahují pouzdra, kde přítomnost pouzdra je vyžadována pro virulenci, avšak nikoli pro imunitní ochranu, a způsobu její výroby. Vynález má specifické aplikace pro rekombinantně produkovanou vakcínu, která byla připravena tak, že postrádá pouzdro.
Dosavadní stav techniky
Vakcíny jsou přípravky používané k prevenci specifických nemocí u zvířat a lidí tím, že vyvolávají jejich imunitu. To se provádí tak, že pacient je vystaven antigenu konkrétní choroby, což vede k tomu, že imunitní systém pacienta produkuje velká množství protilátek. Přítomnost protilátek v pacientově krvi chrání pacienta před pozdějšími útoky agens, které způsobuje chorobu. Vakcíny mohou být buď složeny z podjednotek tohoto agens, nebo ze živého nebo usmrceného agens samého. Tak například, proti poliomyelitidě, běžně označované jako „polio“, je běžnou obranou buď orální podání živé, oslabené vakcíny polioviru, což je běžná praxe pro ošetřování dětí, nebo podání usmrcené nebo inaktivované vakcíny polioviru, což je běžná praxe pro ošetřování dospělých, u kterých je obecně vyšší nebezpečí získání polio z živé vakcíny. Jestliže se má použít živá vakcína, její virulence se musí nějakým způsobem oslabit, jinak virus obsažený ve vakcíně způsobí nemoc, proti které by měl chránit.
Rada nemocí je způsobována zapouzdřenými bakteriemi, přičemž pouzdro, které představuje jakoby pryskyřičná vrstva polysacharidů nebo polypeptidů pokrývající vnějšek buněčné stěny těchto bakterií, je potřebné pro patogenezi. Jedním takovým příkladem je prasečí pleuropneumonie a virulentní faktory Actinobacillus pleuropneumoniae, bakterie, která způsobuje nemoc, zahrnuje pouzdrový (kapsulámí) polysacharid, endotoxin a proteinové exotoxiny. Prasečí pleuropneumonie, současný zánět pohrudnice a plic, je jednou z hlavních chorob dýchacích cest dopadajících na chov prasat na celém světě. Roční ztráty tohoto odvětví jen ve Spojených státech dosahují výše milionů dolarů.
US patent č. 5 429 818 (Inzana) uvádí, že nezapouzdřené mutanty Actinobacillus pleuropneumoniae jsou avirulentní a schopné poskytnout vynikající ochranu proti následné expozici virulentní bakterie. Nezapouzdřené mutanty popsané Inzanou byly připravené etylmetansulfonátovou mutagenezí. Avšak tyto postupy mají své nevýhody spočívající v tom, že některé spontánně nebo chemicky vytvářené mutanty nejsou stabilní a povaha mutace (mutací) není známá.
Cílem tohoto vynálezu je připravit bezpečnou a účinnou, živou, oslabenou rekombinantní vakcínu proti nemocím způsobeným bakteriemi a houbami, jež jsou obvykle zapouzdřené a kde pouzdro je potřebné pro virulenci, nikoli však pro imunitní ochranu.
Dalším cílem tohoto vynálezu je upravit genetickým inženýrstvím určité bakterie nebo houby takovým způsobem, aby jim chybělo pouzdro, takže budou avirulentní a bude známá genetická povaha mutace.
Hlavním cílem tohoto vynálezu je dále poskytnout bezpečnou, účinnou, živou, oslabenou rekombinantní vakcínu proti pleuropneumonii.
-1 CZ 295438 B6
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je vakcína, jejíž podstata spočívá v tom, že sestává z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, postrádající DNA sekvence, kódující syntézu pouzdra.
Dalším význakem předmětného vynálezu je vakcína, jež sestává z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, jež má DNA sekvence kódující syntézu pouzdra lokalizované před hybridizačním místem BamHl-Xbal fragmentu v pCW-lC, postrádající tyto sekvence.
Význakem předmětného vynálezu je dále vakcína jež sestává z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované baktérie Actinobacillus pleuropneumoniae, která má DNA sekvence kódující syntézu pouzdra lokalizované před genem na export pouzdra, postrádající tyto sekvence. Genem na export pouzdra je cpxD.
Předmětný vynález rovněž zahrnuje použití předmětné vakcíny pro imunizaci prasat proti pleuropneumonii. Imunizaci prasat proti pleuropneumonii vakcínou podle předmětného vynálezu lze provádět injekcí vakcíny nitrosvalově nebo podkožně.
Význakem vynálezu je dále způsob přípravy předmětné vakcíny k prevenci nemocí způsobených bakterií Actinobacillus pleuropneumoniae, jehož podstata spočívá v tom, že se provede nejprve identifikace genů kódujících syntézu pouzdra v uvedené bakterii, a poté delece genů kódujících syntézu pouzdra, za získání nezapouzdřeného mutantu uvedených bakterií.
Dalším význakem vynálezu je způsob přípravy vakcíny k prevenci nemocí způsobených bakterií Actinobacillus pleuropneumoniae, jehož podstata spočívá v tom, že se nejprve provede identifikace DNA sekvencí kódujících syntézu pouzdra v bakteriích, které jsou lokalizované před hybridizačním místem BamHl-Xbal fragmentu v pCW-lC, a poté delece uvedených DNA sekvencí kódujících syntézu pouzdra za získání nezapouzdřených mutantů uvedených bakterií.
Podle předmětného vynálezu byl vyprodukován rekombinantní, živý, oslabený kmen Actinobacillus pleuropneumoniae, který byl geneticky upraven tak, aby mu chybělo pouzdro. Protože pouzdro je potřebné pro virulenci, ale nikoli pro imunitní ochranu, kmen bude užitečný jako vakcína proti prasečí pleuropneumonii, současnému zánětu pohrudnice a plic. Vakcína byla produkována klonovaným plazmidovým vektorem, který se nemůže replikovat v A. pleuropneumoniae. Byly sekvencovány geny exportu pouzdra a jeho syntézy v A. pleuropneumoniae sérotypu 5. U klonovaných genů syntézy pouzdra byla provedena značná delece určitých částí a geny kódující odolnost proti kanamycinu a citlivost vůči sacharóze byly potom klonovány na uvolněné místo tak, aby sloužily jako markerové geny. Tento suicidní vektor byl vložen do virulentního kmene A. pleuropneumoniae sérotypu 5 za použití elektroporace tak, aby byla získaná homologická rekombinace dvojnásobným překřížením mezi homologickými regiony chromozomu a plazmidu. Byly získány čtyři izoláty, a každý postrádal iridescenci, což bylo znakem toho, že chybí pouzdro. To, že chybí pouzdro a deletovaný region (oblast) pouzdemího genu, bylo potvrzeno u jednoho kmene metodou dot blotting (tečková hybridizace), případně Southem blotting. Také byla potvrzena přítomnost markerových genů v rekombinantním kmenu. Nebylo možno zjistit žádné jiné změny jakýchkoli jiných fenotypových vlastností a markerové geny nebyly nalezeny ani v jiných oblastech chromozomu. Rekombinantní kmen, označovaný jako J45-100, byl velmi sérově senzitivní, měl sníženou virulenci pro prasata na jednu desetinu 50% smrtelné dávky pro mateřský kmen a měl by poskytovat ochranu prasatům proti pleuropneumonii.
Tento vynález bude užitečný pro výrobu vakcín proti všem zapouzdřeným organismům, které produkují toxiny nebo proti jiným virulentním faktorům, kde pouzdro je potřebné pro virulent
-2CZ 295438 B6 nost, nikoli však pro imunitní ochranu. Všechno, co bude potřebné, bude klonovat geny kódující syntézu pouzdra organismu a pak odstranit a nahradit části klonovaného genu markerovým genem na suicidním vektoru a potom zavést vektor do žádaného organismu a vyšetřit, zda jde o geneticky modifikovaný organismus bez pouzdra. Vynález by měl být užitečný při výrobě vakem proti dalším infekčním bakteriím včetně, nikoliv však výhradně, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica a Pseudomonas aerugionosa, stejně tak jako houbám jako je Cryptococcus neoformans, který je patogenem spojeným se syndromem získané imunitní nedostatečnosti (AIDS) u koček a lidí.
Přehled obrázků na výkresech
Výše uvedené význaky vynálezu a další záměry, hlediska a výhody budou lépe pochopitelné z následujícího podrobného popisu výhodných provedení vynálezu s odvoláním na výkresy, ve kterých obr. 1 je fyzikální mapou pCW-llE klonované DNA z regionu syntézy pouzdra A. pleuropneumoniae J45. Umístění a směrování transkripce dvou kompletních ORF (otevřených čtecích rámů) (cpsA a cpsB, plné vyplnění) je naznačeno identifikací dideoxy sekvencováním. Rovněž je naznačeno umístění parciálního třetího potenciálního ORF (cpsC). Ukázáno je také umístění a směrování transkripce nekompletního genu exportu pouzdra cpxD umístěného na tomto fragmentu parciálního třetího potenciálního ORF (cpsC). Ukázáno je také umístění a směrování transkripce nekompletního genu exportu pouzdra cpxD umístěného na tomto fragmentu DNA. Také je uveden 2,1 kb Bg/II-Stul fragment, používaný jako DNA sonda na obrázku 2. Tečkované vyplnění označuje nekompletní ORF.
Obr. 2 je analýzou typu Southem blot genomické BNA A. pleuropneumoniae hybridizované na digoxigeninem značený 2,1 kb Bg/II-Stul fragment pCWllE. BamHl-štěpená genomická DNA ze sérotypu 1 kmene 4074 (pruh 1), sérotypu 2 kmene 1536 (pruh 2), sérotypu 5a kmene J45 (pruh 3), sérotypu 5a kmene K17 (pruh 4), sérotypu 5 kmene 178 (pruh 5), sérotypu 7 kmene 29628 (pruh 6) a sérotypu 9 kmene 13261 (pruh 7) byly hybridizovány sondou podle následujícího popisu. Molekulární hmotnost hybridizovaných pásů (v kb) je uvedena.
Na obr. 3a a 3b jsou prezentovány nukleotidové sekvence 3,2 kb HindlII-EcoRV fragmentu pCW-llE, obsahující sérotypově specifickou DNA J45 A.pleuropneumoniae (sekvence s identifikačním číslem 1). Dedukované sekvence aminokyselin dvou kompletních ORF zjištěné v této sekvenci, cpsA (sekvence s id. č. 2) a cpsB (sekvence s id. č. 3), a pod nukleotidovou sekvencí jsou uvedeny dedukované N-terminálové sekvence třetího nekompletního ORF, cpsC (sekvence s id. č. 4). Předpokládaná vázací místa ribosomů předcházející každý ORF jsou značena tučně a předpokládané -10 a -35 promotorové sekvence směrem nahoru od cpsA.
Obr. 4 popisuje konstrukci suicidního vektoru obsahujícího deleční DNA syntézy pouzdra, pCWllEAlKSl a produkci nezapouzdřeného mutantu A. pleuropneumoniae J45 alelickou výměnou. Plazmidový vektor pCWll ΕΔ1 KS1 byl konstruován štěpením pCW-ΠΕ pomocí Bg/II a Stul, které působí, že konce jsou tupé zakončené a vázající velký fragment 6,4 kb na 3,8 kb BamHl fragment pKS (rovněž otupený), obsahující kartridž nptl-sacRB (KanrSucr). Restrikční místa v závorkách naznačují původní konce fragmentů navázaných na pCWl 1ΕΔ1 KS1. Vektor pCWl 1ΕΔ1 KS1 byl elektrotransformován do A. pleuropneumoniae a nezapouzdřené transformanty Kanr byly vyšetřeny zda chybí iridescence v prostředí obsahujícím 85 pg/ml kanamycinu.
Obr. 5 je Southem blot analýza genomické DNA izolované zÁ pleuropneumoniae J45 (pruh 1) nebo J45-100 (pruh 2) s digoxigeninem značenými sondami specifickými pro nptl nebo části místa pro zapouzdření A. pleuropneumoniae. Genomická DNA A. pleuropneumoniae J45 (pruh 1) nebo J45-100 (pruh 2) byla štěpena pomocí Xbal (panely A a C) nebo BamHl (panel B) a hybridizována buď 1,24 kb Pstl fragmentem pKS (nptl-specifický), panel A; 2,1 kb Bg/II-Stul
-3 CZ 295438 B6 fragmentem pCW-llE (cpsaABC-specifícký, viz obr. 1), panel B; nebo 2,1 kb C/al fragmentem pCW-lC (cpxCBA-specifický, viz obr. 3.2), panel C.
Obr. 6 je imunoblot kolonií A. pleuropneumoniae J45 a J45-100 zreagovaných s kapsulámím polysacharidově specifickým prasečím antisérem. Na nitrocelulózovou membránu bylo přeneseno přibližně 5 x 105 (pruh 1) nebo 5 x 104 (pruh 2) CFU/jamku. Membrána byla rozpuštěna v chloroformu a inkubována prasečím antisérem, které obsahovalo protilátky k sérotypu 5a kapsulámího polysacharidu, ale ne jiné povrchové protilátky A. pleuropneumoniae.
Obr. 7 ukazuje imunobloty A. pleuropneumoniae J45 (pruh 1) a J45-100 (pruh 2) koncentrovaných supematantů kultury obsahující převážné exotoxiny Apxl a Apxll. Na panel A bylo působeno monoklonální protilátkou Apxl-specifickou a na panel B monoklonální protilátkou Apxllspecifickou. Do panelu A byla zahrnuta koncentrovaná kultura supematantu A. pleuropneumoniae sérotyp 2 kmen 1536 (pruh 3) jako negativní kontrola, protože tento sérotyp nesyntetizuje Apxl. Na blot na panelu A bylo působeno monoklonální protilátkou specifickou Apxl.
Obr. 8 ukazuje elektroforetické profily LPS izolované z A. pleuropneumoniae J45 (pruh 1) a rekombinantního nezapouzdřeného mutantu J45-100 (pruh 2). LPS byla podrobena elektroforéze přes 15% separační gel a zbarvena amoniakálním stříbrem.
Obr. 9 ukazuje baktericidní aktivitu prekolostrálního telecího séra pro A. pleuropneumoniae J45 a J45-100. Procento životnosti bakteriálních kmenů bylo vyhodnoceno po 60 minutách inkubace při 37 °C. Každý datový bod reprezentuje průměr ze tří separátních pokusů prováděných duplicitně. Chybové čáry představují standardní odchylku každého průměru. Maximální procento životnosti zaznamenané pro J45 bylo 100 %, třebaže tyto hodnoty byly obvykle vyšší, protože bakterie obvykle během pokusu rostla. Hodnoty větší než 100 % nebyly zaznamenávány, protože by nemohly být přesně stanovené.
Obr.lOa, 10b představují nukleotidovou sekvenci 3,2 kb Xbal-Clal fragmentu pCW-lC kódující geny DNA exportu pouzdra A. pleuropneumoniae J45 (sekvence s id. č. 5). Jsou prezentovány dedukované sekvence aminokyselin (sekvence s id. č. 6-8) proteinů zapojených do exportu pouzdemiho polysacharidu A. pleuropneumoniae sérotyp 5a.
Obr. lije fyzikální mapou pCW-lC DNA z A. pleuropneumoniae J45.
Podrobný popis nejvýhodnějšího provedení vynálezu
Vynález předkládá použití živého, rekombinantně produkovaného avirulentního kmene mikroorganismu (to znamená bakterie nebo houby), který byl genetickým inženýrstvím upraven tak, aby byl nezapouzdřený, jako vakcíny proti nemocím způsobeným tímto mikroorganismem. Vynález bude mít použití pro prevenci nemoci, u kterých se pouzdro mikroorganismu vyžaduje pro virulentnost, nikoli však pro imunitní ochranu, a kde nemoc je způsobována toxiny nebo jinými virulentními faktory. Jako konkrétní příklad vynálezu byl produkován nezapouzdřený kmen Actinobacillus pleuropneumoniae, který by mohl být použit jako vakcína proti prasečí pleuropneumonii, tj. současnému zánětu pohrudnice a plic. Hlavním charakteristickým rysem vynálezu je genetická modifikace mikroorganismu, kterým je v konkrétním provedení Actinobacillus pleuropneumoniae, tak aby zahrnovala deleci jeho deoxyribonukleové kyseliny (DNA) v regionu (oblasti) kódujícím syntézu pouzdra. Pouze pro příklad se uvádí syntéza transformovaného mutantu Actinobacillu pleuropneumoniae sérotyp 5, ovšem je třeba si uvědomit, že ostatní sérotypy se dají připravit způsobem podobným tomu, který je popsaný níže a budou užitečné ve vakcíně samé nebo v kombinaci s jedním nebo více rekombinantními mutanty různých sérotypů.
Níže popsaný kmen, současně s jinými kmeny nezapouzdřených, toxigenních bakterií nebo jiných mikroorganismů, vytvářených podle postupu popsaného níže, budou představovat vynikající vakcíny, protože jsou avirulentní, ale produkují všechny antigeny nezbytné pro hostitele, k
-4CZ 295438 B6 vytvoření imunitní odpovědi. Vakcíny se mohou podávat různými způsoby, ovšem intramuskulární nebo subkutánní injekce jsou nej výhodnější. Výhodou těchto živých vakcín je, že toxiny, které v první řadě způsobují nemoc a další komponenty, které jsou produkovány pouze živými organismy nebo in vivo, budou produkovány v místě imunizace a hostitel takto získá imunitní reakci, která ho bude chránit před poškozeními vyvolanými toxiny. V důsledku toho se nemoc (akutní nebo chronická) neprojeví. Organismy se nemohou rozšiřovat, protože bez pouzdra jsou tyto organismy mimořádně sérově citlivé a okamžitě jsou vylučovány do krevního oběhu nebo dýchacího traktu. Navíc, jako živé vakcíny, buňkami zprostředkovaná imunitní odpověď bude větší a ochrana bude trvat déle než u usmrcených vakcín.
Příklad provedení vynálezu
Příklad
Byl identifikován a charakterizován region DNA, který je zapojen do biosyntézy pouzdrového polysacharidu u Actinobacillu pleuropneumoniae. Sonda specifická pro gen cpxD, který je zapojen do exportu A. pleuropneumoniae sérotyp 5a J45 pouzdemího polysacharidu, byla použita k identifkaci a klonování sousední 5,8 kilobáze BamHl fragmetu genomické DNA J45. Southem blot analýzy demonstrovaly, že část DNA obsažené v tomto regionu, byla sérotypově specifická. Sekvenční analýza DNA demonstrovala, že tento region obsahoval dva kompletní otevřené čtecí rámce, cpsA a cpsB a nekompletní potenciální třetí otevřený čtecí rámec cpsC. Rámce cpsA a cpsB jsou do určité míry mírně homologické s glykosyltransferázami, které jsou zapojeny do biologické syntézy lipopolysacharidů Escherichia coli a případně pouzdrových polysacharidů Haemophilu influenzae typu b. Byla provedena delece 2,1 kilobáze, která překlenovala klonovaný cpsABC otevřeného čtecího rámce a rekombinována do chromozomu J45 alelickou výměnou, tak aby vznikl mutant J45-100. Tento mutant neprodukoval nitrobuněčné ani mimobuněčné pouzderní polysacharidy, což naznačuje, že cpsA, cpsB a/nebo cpsC byly zapojeny do biosyntézy pouzdrových polysacharidů u Actinobacillu pleuropneumoniae. Toxin Apx a lipopolysacharidové profily J45-100 byly identické opouzdřenému mateřskému kmeni J45. Avšak J45-100 rostl in vitro rychleji než J45. J45-100 byl senzitivní na usmrcení v prekolostrálním telecím séru, zatímco J45 nebyl. J45-100 byl avirulentní když byl použit u vepřů intratracheálně v trojnásobku 50% smrtelné dávky kmene J45. Šestinásobná 50% smrtelná dávka J45 způsobila v případě J45-100 mírné až střední poškození plic, nikoli však smrt. Tyto výsledky demonstrovaly, že pouzdrové polysacharidy jsou hlavním determinantem sérové rezistence a virulence Actinobacillu pleuropneumoniae.
Materiály a metody
Bakteriální kmeny, plazmidy a růstové podmínky
Bakteriální kmeny a plazmidy použité v této studii jsou popsány v tabulce 1. Pro extrakci genomické DNA a pro baktericidní zkoušky byly pěstovány kmeny A. pleuropneumoniae vytřepáváním při 37 °C v bujónu z mozku a srdce (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) obsahujícím 5 pg/ml dinukleotidu nikotinamid adeninu (NAD) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Pro elektroporaci byly kmeny A. pleuropneumoniae pěstovány vytřepáváním při 37 °C v bujónu tryptické sóji (Difco Laboratories) obsahujícím 0,6 % drožďového extraktu (Difco Laboratories) a 5 pg/ml NAD (TSY-N). Pro pokusy na prasatech byly kmeny A. pleuropneumoniae pěstovány vytřepáváním při 37 °C v kolumbijském bujónu (Difco Laboratories) obsahujícím 5 pg/ml NAD. Kmeny Escherichia coli byly pěstovány v bujónu Luria-Bertani (Sambrook a j., 1989) pro rutinní kultivaci nebo v Terrific bujónu (Tartof aHobbes, 1387) pro extrakci plazmidů. Pro udržování plazmidu v E. coli byla v živném prostředí používána antibiotika v následujících koncentracích: ampicilin (Amp) 100 pg/ml a kanamycin (Kan) 50 pg/ml. Kanamycin byl používán v koncentraci 85 pg/ml pro selekci rekombinantních mutantůT. pleuropneumoniae.
-5CZ 295438 B6
Tabulka 1
| POUŽITÉ BAKTERIÁLNÍ KMENY A PLAZMIDY | |
| A. pleuropneumoniae kmeny 4074 | sérotyp 1; (ATCC 27088) |
| ATCC3 1536 | sérotyp 2; (ATCC 27089) |
| ATCC3 J45 | sérotyp 5 a |
| Fenwick a j.,1986a K17 | sérotyp 5a |
| Nielsen, 1986a 178 | sérotyp 5 |
| M. Mulks 29628 | sérotyp 7 |
| L. Hoffman 13261 | sérotyp 9 |
| J. Nicolet J45-C | nezapouzdřený mutant izolovaný po etylmetansulfonátové mutagenezi kmene |
| J-45 Inzana a j.,1993a J-45-100 | rekombinantní nezapouzdřený mutant derivovaný z kmene J45 |
| E.coli kmeny XLl-Blue | recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 re/Al lac(F+proAB laclq ZA M15 Tn 10); hostitelský organismus pro rekombinantní plazmidy |
| Stratagene, La Jolla, Kalifornie, plazmidy pGEM-3Z | klonovací vektor, 2,74 kb; Ampr |
| Promega pCW-lC | 5,3 kb Xbal fragment J45 klonovaný do pGEM-3Z |
| pCW-HE | 5,8 kb BamHl fragment J45 klonovaný do pGEM-3Z |
| pKS | 3,8 kb BamHl fragment obsahující nptl b-sacRB kartridž0 klonovaný do BamHl místa v pGEM-3Z; Ampr, Kanr |
| S.M. Boyle pCWllEAlKSl | pCW-11E s deletovaným fragmentem 2,1 kb Bg/ΠStul a s 3,8 kb BamHl nptl-sacRB kartridží z pKS vázanou v této kapitole |
| 3 AmericanType Culture Collection, Rockville, MD | |
| b Tento markér byl původně odvozen z Tn903 nptl genu pUC4K (Pharmacia Biotech, Piscatawayn, NJ) | |
| 0 Tato kartridž byla již dříve popsána (Ried a Collmer, 1987) |
Kalkulace generační doby
Generační doba logaritmické fáze kmenů A. pleuropneumoniae pěstovaných v TSY-N se kalkulovala za použití rovnice: R = 1/g, kde R je průměrná rychlost bakteriálního růstu a g je generační doba bakteriální populace (Pelczar a j., 1993). Průměrná rychlost růstu R se kalkulovala za použití následující rovnice: R = 3,32 (log10 N - logio N0)/t, kde t = prošlá doba, N je počet bakterií v čase = t a No je počáteční počet bakterií v čase = 0 (Pelczar a j., 1993).
Hybridizační analýza DNA
Restrikční endonukleázou rozštěpená DNA (přibližně 5 pg na jeden pruh) byla podrobena elektroforéze přes 0,7% agarózový gel a přenesena kapilárním přenosem na nylonové membrány MagnaGraph (Micron Separation In., Westboro, Mass.) za použití 20X fyziologického roztoku s citranem sodným (20X fyziologického roztoku s citranem sodným [SSC] je 3 M NaCl, 300 mM citranu sodného, pH 7) jak již bylo dříve popsáno (Sambrook aj., 1939; Southem, 1975). DNA byla kovalentně vázaná na nylonové membrány UV zářením za použití UV Stratalinkeru (Stratagene, La Jolla, Kalifornie). Digoxigeninem značené sondy pro hybridizaci DNA byly syntetizovány náhodnou příměrovou metodou za použití neradioaktivního značení Genius Systém a detekční soupravy (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) podle pokynů výrobce. Hybridizace DNA se prováděla při 68 °C v roztocích obsahujících 5X SSC. Membrány byly promývány a zpracovány podle pokynů Genius Systém pro kolorimetrickou detekci.
-6CZ 295438 B6
Rekombinantní DNA metody a činidla
Genomická DNA byla izolována z buněk A. pleuropneumoniae pěstovaných v bujónu za použití metod popsaných S. Spinolou. Stručně, bakterie byly resuspendovány vlOmM Tris-1 mM EDTA (pH 8) a inkubovány dodecylsulfátem sodným (0,66 %) a RNAázou (100 pg/ml) po dobu jedné hodiny při 37 °C. Ke konečné koncentraci 100 pg/ml byla přidána proteináza K a směs byla inkubována po dobu 1 hodiny při 59 °C. Směs byla potom jednou extrahována pufrovaným fenolem a čtyřikrát pufrovaným fenol-chloroformem (Amresco, lne., Solon, Ohio) a genomická DNA byla vysrážena etylalkoholem a resuspendována v 10 mM tris-1 mM EDTA (pH 8). Plazmid DNA byl izolován rychlou metodou alkalolýzy (Ish-Horowicz a Burke, 1981). Restrikční fragmenty požadované pro klonování a syntézu sondy byly vymyty z agarózových gelů tak jak je popsáno (Zhen a Swank, 1993). Restrikční štěpení, elektroforéza na agarózovém gelu a ligace DNA byly provedeny tak jak bylo již popsáno (Sambrook aj., 1989). Konce restrikčních fragmentů byly tupě zakončeny vyplněním 5’ převisu pomocí nukleotidů (dNTp) za použití Klenowova fragmentu DNA polymerázy I, jak již bylo dříve popsáno (Sambrook a j., 1989). Plazmid DNA byl transformován do kmenů E. coli elektroporací (Dower a j., 1988) za použití elektroporátoru BTX ECM 600 (BTX, Ing., San Diego, Kalifornie).
Restrikční endonukleázy a Klenowův fragment DNA polymerázy 1 byly získány od Promega Corporation (Madison, Wisconsin). T4 DNA ligáza byla získána od Gibco BRL (Gaithersburg, Md). Nukleotidy (dNTPs) pro naplňovací reakce byly získány od Boehringer Mannheim Corporation (Indianapolis, Indiana).
Sekvencování a analýza DNA
Nukleotidové sekvence obou řetězců 2,7 kilobáze (kb) Xbal-EcoRV DNA fragmentu pCW-llE byla stanovena dideoxy metodou ukončení řetězce (Sanger a j., 1977) za použití Sequenase verze 2.0 DNA sekvenovací soupravy (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) s a35[S]dATP (DuPont/NEN Research Products, Boston, Mass.). Dvouřetězcové matrice DNA byly sekvenovány za použití běžných, oligonukleotidových primerů (DNAgency, lne., Malveme, Pa.) tak, aby bylo možno pokračovat ve čtení podél každého řetězce.
Získaná nukleotidové sekvence byla kombinována s nukleotidovou sekvencí 4,6 kb Xbal-Clal DNA fragmentu z pCW-lC kódujícího pro strukturální geny pouzdra směrem nahoru (obr. 10) a byla analyzována za použití analytického software DNASTAR (DNASTAR, lne., Madison, Wis.). Hledání sekvenční podobnosti v EMBUGenBank/DDBJ databází se prováděla za použití BLAST software (Altschul aj., 1990) v Národním středisku pro biotechnologické informace (Bethesda, Md.).
Zachované regiony H. influenzae typu b místa cap (capb) zapojené do exportu pouzdrového polysacharidu byly použity k identifikaci, klonování a charakterizaci části A. pleuropneumoniae sérotypu 5a. Prováděly se Southem blot analýzy genomické DNA A. pleuropneumoniae sérotypu 5a kmene J45 se sondami specifickými pro přilehlé regiony H. influenzae typu b místa kapsulace (capb). Tyto sondy za velmi přísných podmínek (68 °C, 5x SSC) nehybridizovaly ke genomické DNA A. pleuropneumoniae, ale hybridizovaly za podmínek středně přísných (55 °C, 5x SSC). Fragment 4,4 kb EcoRI H. influenzae místa capb z plazmidu pSKHl obsahující region genu 1 bexD zapojený do exportu pouzdrového polysacharidu a dva regiony 2 otevřených čtecích rámců (ORF) zapojených do biosyntézy pouzdrového polysacharidu hybridizovaly k 1,2 kb HindlII a 5,3 kb Xbal fragmentům genomické DNA J45. Fragment 9,0 kb EcoRI H. influenzae místa capb z plazmidu pSKH2, obsahující region 1 genů bexCBA zapojených do exportu pouzdrového polysacharidu, poněkud necharakterizovaný region 3 DNA společný různým sérotypům H. influenzae a určitý region 2 DNA zapojený do biosyntézy pouzdrového polysacharidu hybridizovaly k 1,5 kb HindlII, 5,3 kb Xbal a 2,5 kb Xhol fragmentům genomické DNA J45. Tato data naznačovala, že H. influenzae typu b a A. pleuropneumoniae sérotypu 5a místa genu pouzdra
-7 CZ 295438 B6 sdílejí homologické regiony. H. influenzae capb specifické sondy obsahovaly obě region 1 DNA zapojený do exportu pouzdrového polysacharidů, což naznačuje, že 5,3 Xbal fragment genomické DNA z J45, který hybridizoval k oběma sondám H. influenzae capb může obsahovat geny, které kódují proteiny zapojené do exportu kapsulámího polysacharidů A. pleuropneumoniae sérotypu 5a. Fragment 5,3 Xbal genomické DNA z J45, který hybridizoval ke dvěma sondám H. influenzae capb byl klonován na místo Xbal plazmidu pGEM-3Z (v obou orientacích) z Xbalštěpených fragmentů genomické DNA J45 v rozsahu 4,8 až 6,0 kb, které byly elektrovyluhovány (po elektroforetické separaci) z agarózového gelu. Jeden z výsledných plazmidů byl označen pCW-1 G. Byla provedena Southem blot analýza k určení, zda H. influenzae typ b bexD, bexC, bexB a bexA hybridizovaly k přilehlým fragmentům pCW-1 C ve stejném pořadí (bexDCBA) v jakém se tyto geny vyskytují v H. influenzae. Výsledky naznačují, že region DNA A. pleuropneumoniae sérotypu 5 a potřebný pro export pouzdrového polysacharidů byl úspěšně klonován a že tento region byl organizován obdobným způsobem jako H. influenzae typu b místa bex.
Byla stanovena nukleotidová sekvence 4,6 kb Xbal-Clal restrikčního fragmentu pCW-1 C a restrikční fragment 3,2 kb Xbal-Clal je prezentován na obrázcích lOa-b (sekvence s id. č. 5). V těsné blízkosti stejného řetězce DNA byly odhaleny čtyři ORF (uvedeno na obr. lOa-b a na obr. 11) označené cpxDCBA (cpx se používá pro označování místa exportu pouzdrového polysacharidu). Iniciační kodon AUG z cpxC (sekvence s id. č. 7) byl o 26 nukleotidů níže od terminačního kodonu UAA z cpxD (sekvence s id. č. 6), zatímco iniciační kodon AUG z cpxB (sekvence s id. č. 8) přesahoval terminační kodon UAA z cpxC (sekvence s id. č. 7) a iniciační kodon AUG z cpxA přesahoval terminační kodon UGA z cpxB, který byl částečně přítomen (sekvence s id. č. 8). Shine-Dalgamové ribosom vázající konvenční sekvence byly identifikovány v 17 bázích směrem vzhůru od každého iniciačního kodonu AUG a směrem nahoru byl identifikován domnělý promotor obsahující sekvence podobné E coli cc7o-10(TATAAT) a -35(TTGACA) konvenční sekvence z cpxD (sekvence s id. č. 6). Směrem dolů z cpxA (neukázáno) byla identifikována palindromická sekvence, která může fungovat jako na ró-faktoru nezávislý transkripční terminační signál. Genetická organizace naznačuje, že cpxDCBA jsou přepisovány do jednoduché, polycistronické mRNA.
Elektrotransformace A. pleuropneumoniae
A. pleuropneumoniae byla pěstována do střední logaritmické fáze v TSY-N, peletizována odstředěním při 7000 x g při 4 °C a promývána 4 x v chlazeném (4 °C) filtračně sterilizovaném pufru obsahujícím 272 mM mannitolu, 2,43 mM K2HPO4, 0,57 mM KH2PO4, 15 % glycerinu, pH 7,5. Tento pufr byl modifikován (aby obsahoval mannitol místo sacharózy) z dříve popsaného pufru používaného pro promývání buněk A. pleuropneumoniae před elektroporací (Lalonde aj., 1989b). Buňky byly potom jednou promyty v chlazeném, filtrovaném a sterilizovaném 15% glycerinu a resuspendovány přibližně do 1010 CFU/ml v 15% glycerinu. Alikvotní podíly této suspenze (90 pl) byly smíchány s 1,5-2,0 pg plazmidu DNA (v 1,5 pl destilované vody), který byl vyčištěn hustotním gradientem cezium chloridu ultracentrifugací (Sambrook aj., 1989), umístěny do chlazených elektroporačních kyvet (BTX, lne.) s 2 mm spárou a zpracovány elektroporací za použití BTX ECM 600 elektroporátoru (BTX, lne.) nastaveného na nabíjecí napětí 2,5 kV a s nastaveným odporem R7 (246 ohmů). Generovaný skutečný pulz činil 2,39 kV poskytovaných během 10,7 milisekund. Po elektroporací byly buňky získány zpět v 1 ml TSY-N obsahujícího 5 mM MgCl2 jemným třepáním po dobu 3,5 hodiny při 37 °C. Po znovuzískání byly tyto buňky kultivovány na TSY-N agaru obsahujícím 85 pg kanamycinu na 1 ml a byly inkubovány při 37 °C.
Imunoblotování. Pro imunobloty kolonií A. pleuropneumoniae byly celé buňky, které vyrostly přes noc na agarových deskách TSY-N seškrábnuty do fosfátového pufru fyziologického roztoku (PBS) a upraveny na 109 CFU/ml, tak jak bylo stanoveno spektrofotometricky. Na nitrocelulózovou membránu (NitroBind; Micron Separations lne.) bylo aplikováno přibližně 5 x 104 nebo 5 x 105 CFU na dávku s použitím Bio-Dot přístroje (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornie). Membrány byly umístěny do chloroformu na 15 minut při teplotě místnosti pro
-8CZ 295438 B6 uskutečnění lyže bakteriálních buněk na membráně. Membrána byla úplně vysušena na vzduchu a inkubována jednu hodinu při teplotě místnosti ve fyziologickém roztoku Tris-pufru, pH 7,5 (TBS) obsahujícím 2 % odstředěného mléka pro blokování nespecifických vázacích míst na membráně. Membrána byla inkubována po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti v zředění 1:200 (v 2% mléčném-TBS) adsorbovaného prasečího antiséra, které obsahovalo protilátky k sérotypu 5a pouzdrového polysacharidu, avšak nikoli jiné povrchové protilátky A. pleuropneumoniae. Toto pouzdrovým polysacharidem obohacené antisérum bylo připraveno adsorpcí hyperimunního prasečího antiséra k A. pleuropneumoniae ΥΑΊ se spontánním nezapouzdřeným mutantem K17-C (Inzana a Mathison,1987), jak již bylo dříve popsáno (Inzana, 1995). Membrána byla promyta TBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20, potom inkubována 1 hodinu při teplotě místnosti ve zředění 1:1000 králičího antiprasečího imunoglobulinu konjugovaného k peroxidáze selského křenu (těžké a lehké řetězce; Cappel, Durham, N.C.). Membrána byla promyta v TBS, potom zpracována 4-chlor-l-naftolem (Bio-Rad Laboratories) v TBS obsahujícím 0,02 % H2O2.
Imunoblotace A. pleuropneumoniae koncentrovaných kultur supernatantů se prováděla tak jak již bylo dříve popsáno (Ma a Inzana, 1990). Stručně, přibližně 15 pg celkového proteinu kultury supematantu bylo separováno diskontinuitním postupem SDS-PAGE (Laemmli,1970) přes 8% separační gel. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (NitroBind; Micron Separations lne.) metodou vypracovanou Towbinem a j. (1979). Membrána byla inkubována v TBS obsahujícím 2 % hovězího sérového albuminu pro blokování nespecifických vazeb a byla rozřezána na proužky. Proužky byly inkubovány přes noc při 4 °C buď s monoklonální protilátkou specifickou pro toxin Apxll (Ma a Inzana, 1990), nebo monoklonální protilátkou specifickou pro toxin Apxl (Devendish a j., 1989; Frey a j., 1999) a omyty v TBS. Blot reagující s monoklonální protilátkou specifickou pro Apxll byl inkubován s 1:2000 zředěním kozího protimyšího imunoglobulinu konjugovaného k peroxidáze polního křenu (Cappel), promyt v TBS a zpracován jak popsáno výše. Blot reagující s monoklonální protilátkou specifickou pro Apxl byl inkubován 1:2000 zředěním kozího protimyšího imunoglobulinu konjugovaného na alkalickou fosfatázu a zpracován jak bylo již dříve popsáno (Fey aj., 1992).
Extrakce a elektroforéza LPS
LPS byl izolován z A. pleuropneumoniae za použití mikroextrakční metody horkou fenolovou vodou, jak již bylo dříve popsáno (Inzana, 1983). Čištěný LPS byl podroben elektroforéze přes 15% polyakrylamidový separační gel obsahující močovinu, jak již bylo popsáno (Inzana aj., 1988). Elektroforetické profily LPS byly vizualizovány zbarvením gelu amoniakálním stříbrem (Tsai aFrasch,1982).
Sérová baktericidní zkouška
Byla stanovována citlivost A. pleuropneumoniae na baktericidní aktivitu prekolostrálního telecího séra. Procento životnosti bakteriálních kmenů v 5,10, 15,20, 30, 40 a 50 % prekolostrálního telecího séra byla vyhodnocována po 60minutové inkubaci při 37 °C.
Studie virulence až 9 týdenní prasata byla získána z místních dvou stád prostých infekce A. pleuropneumoniae a byla rozdělena namátkově do skupin. Skupiny prasat byly ustájeny v separátních stáních, kde nedocházelo k přímému fyzickému kontaktu mezi jednotlivými skupinami. Živočišná zařízení na Virginském polytechnickém institutu a Státní univerzity jsou provozována a udržována v souladu s požadavky Americké asociace pro akreditaci laboratoří pro živočišnou péči. Kmeny potřebné pro nákazový experiment s A. pleuropneumoniae byly pěstovány za třepání v Kolumbijském bujónu (Difco Laboratories) doplněném 5 pg/ml NAD při 7000 x g a resuspendovány na přibližně 109 CFU/ml ve fosfátovém pufru fyziologického roztoku (PBS). Prasata byla nakažena intratracheálně 10 ml roztoku této suspenze po mírném uklidnění Stresnilem (Pittman-Moore, lne., Washington Crossing, N.J.). Prasata byla pitvána co možná nejdříve hned po uhynutí, pří
-9CZ 295438 B6 padne bezprostředně po utracení pomocí pentobarbitalu sodného. Poškození plic zjišťoval veterinární patolog podle následujících kritérií: 0, nepozorovatelné poškození plic (bez větších poškození); 1+, 1 až 10 % plicní tkáně ovlivněno určitou kombinací kongesce, edému, krvácení, konsolidace a/nebo pleuritidy; 2+, 11 až 49 % plicní tkáně zasaženo; 3+, ovlivněno 50 až 74 % plicní tkáně; 4+, 75 % nebo větší část plic. Plicní vzorky byly odebrány při pitvě z pravé kraniálně dorsální strany kaudálního laloku a pěstovány v mozkově srdečním infuzním médiu obsahujícím NAD k zjištění přítomnosti. A. pleuropneumoniae.
Výsledky
Identifikace a klonování sérotypově specifického regionu DNAÁ. pleuropneumoniae
Pro identifikaci a klonování DNA A. pleuropneumoniae J45 zapojené do biosyntézy pouzdrového polysacharidu byly prováděny analýzy postupem Southem blot a identifikován přilehlý region DNA směrem nahoru (ve směru 5’) z genového klastru cpxDCBA zapojeného do exportu pouzdrového polysacharidu tak jak bylo popsáno výše (obrázky lOa-b a 11). Očekávalo se, že tento region DNA směrem vzhůru by mohl kódovat sérotypově specifické geny zapojené do biosyntézy pouzdrového polysacharidu, protože umístění genu pro pouzdření A. pleuropneumoniae (cap) se zdálo být organizováno stejným způsobem jako místo pro zapouzdření Haemophilu influenzae typu b a Neisseria meningitidis skupiny B. Genomická DNA A. pleuropneumoniae J45 štěpená BamHl byla hybridizována pomocí digoxigeninem značeného fragmentu 1,2 kb BamHl-Xbal z pCW-lC, který obsahoval část genu cpxD. Tato pro cpxD specifická sonda byla hybridizována na jednoduchý, přibližně 5,8 kb BamHl J45 fragment genomové DNA (data se neuvádějí). Tento fragment 5,8 kb BamHl byl klonován do místa BamHl na pGEM-3Z z genomových fragmentů DNA J45 štěpených BamHl v rozsahu 5,0 - 6,5 kb, které byly elektroeluovány (po elektroforetické separaci) z agarového gelu. Výsledný plazmid byl označen pCW11E a byl restrikčně mapován (obr. 1). Část inzertu DNA pCW-llE (1,2 kb BamHl-Xbal fragment) překrýval DNA přítomnou na inzertu z pCW-lC.
Genomová DNA štěpená BamHl z několika různých sérotypů A. pleuropneumoniae byla hybridizována pomocí 2,1 kb Bg/II-Stul fragmentu pCW-ΠΕ (obrázek 1) k určení sérotypově specifičnosti tohoto regionu DNA (obrázek 2). 2,1 kb Bg/II-Stul fragment DNA hybridizoval na 5,8 kb BamHl fragmentu genomové DAN za tří testovaných kmenů A. pleuropneumoniae sérotypů 5, nikoli však na genomovou DNA ze sérotypů 1, 2, 7 a 9 (obrázek 2). V důsledku toho DNA A. pleuropneumoniae v pCW-11E obsahovala DNA, která byla specifická pro kmeny sérotypů 6. Protože tato DNA byla sérotypově specifická, bylo pravděpodobné, že je zapojena do biosyntézy pouzdrového polysacharidu.
Nukleotidová sekvence a analýza sérotypově specifického regionu DNAA pleuropneumoniae
Byla stanovena nukleotidová sekvence 2,7 kb Xbal-EcoRV fragmentu DNA z pCW-11E. Tato nukleotidová sekvence byla kombinována s nukleotidovou sekvencí 4,6 kb Clal-Xbal fragmentu pCW-1 C a byla vyšetřována na přítomnost otevřených čtecích rámců (ORF), které nebyly dříve identifikovány. Nukleotidová sekvence 3,2 kb HindlII-EcoRV fragmentu pCW-11E obsahující nově identifikované ORF je na obrázku 3. Směrem vzhůru byly identifikovány dva kompletní ORF označené cpsA a cpsB (cps zde znamená syntáza polysacharidového pouzdra), a na protilehlém řetězci genu cpxD zapojeného do exportu pouzdrového polysacharidu A. pleuropneumoniae (obrázek 1 a obrázek 3). Iniciační kodon AUG z cpsB se nacházel 3 nukleotidy směrem dolů od terminačního kodonu UAA z cpsA. Iniciační kodon AUG třetího potenciálního ORF, a sice cpsC, byl zjištěn 15 bází směrem dolů od terminačního kodonu UAA cpsB. ShineDalgamo ribosomové-vázací konvenční sekvence (Shine a Dalgarno, 1974), byly zjištěné v rozsahu 13 bází směrem nahoru od iniciačního kodonu AUG cpsA, cpsB a cpsC (obrázek 3). Předpokládaný promotor obsahující sekvence podobné k E. coli70 -IO(TATAAT) a -35(TTGACA) konvenčním sekvencím (Hewley a McClure, 1986), byly zjištěny směrem nahoru od cpsA (obrázek 3). Těsná blízkost cpsABC a identifikace předpokládaného promotoru smě
-10CZ 295438 B6 rem nahoru naznačovaly, že tyto ORF by mohly být ko-transkribovány: Obsah G+C pro region DNA kódující cpsABC činil 28 %.
Předpovídané polypeptidy a cpsA a cpsB sestávaly z 321 (CpsA) a 526 (CpaB) aminokyselin (obrázek 3). Předpovídané molekulární hmotnosti CpsA a CpsB byly 36,9 a 61,7 kiloDaltonů (kDa). Hydropatické diagramy demonstrovaly, že CpsA a CpsB jsou relativně hydrofílní proteiny, což naznačuje, že tyto proteiny mohou být spojeny s cytoplazmickým úsekem A. pleuropneumoniae (data neuváděna). Vyhledávání BLAST (Altschul aj., 1990) kombinovaného, neredundantního nukleotidu a proteinových databází v Národním středisku pro biotechnologické informace nezjistila žádnou podstatnou homologii mezi cpsABC na nukleotidové nebo aminokyselinové úrovni s jiným sekvencemi v databázích (data neuváděna). Avšak byla pozorována nízká úroveň homologie (15 % podobnosti) mezi CpsA a proteinem E. coli Rfb, O-antigenová glykosyltransferáza zapojená do biosyntézy LPS (Cheah a Manning, 1993). Nízká úroveň homologie (přibližně 14 % podobnosti) byla zjištěna mezi CpsB a regionem 2 ORF 3 předpověděného proteinového produktu místa zapouzdření H. influenzae typu b. Předpovídaný protein ORF 3 je zapojen do biosyntézy polyribosylribitol fosfátového pouzdrového polysacharidů H. influanzae typu b (Van Eldere a j., 1995). Nebyla pozorována žádná významnější homologie mezi N-terminálem 83 aminokyselin CpsC a žádnými proteiny v databázích.
Produkce nezapouzdřených transformantů A. pleuropneumoniae sérotypu 5a rezistentních vůči kanamycinu
Na obrázku 4 jsou schematicky naznačené postupy použité k přípravě rekombinantních, nezapouzdřených A. pleuropneumoniae J45 mutantů homologickou rekombinací a alelickou výměnou. Jako první byl konstruován vektor pCWl 1ΕΔ1 KS1 k použití jako nereplikační, suicidní vektor na podporu výměny DNA pouzdra divokého typu A. pleuropneumoniae s geneticky změněnou DNA pouzdra A. pleuropneumoniae dvojitou homologickou rekombinací (crossing-over). Vektor pCWl 1ΕΔ1 KS1 byl konstruován nejdříve štěpením pCW-llE pomocí Bg/11 a Stul k vytvoření velké delece v pouzdrové DNA u sérotypově specifického A. pleuropneumoniae. Konce této rozštěpené DNA byly tupě zakončeny a velký fragment 6,4 kb byl navázán na 3,8 kb BamHl fragment pKS (rovněž tupě ukončený), obsahující kartridž nptl-sacR-samB. Tato kartridž obsahuje Tn903 nptl gen, o kterém je známo, že dodává rezistenci vůči kanamycinu (Kan1) na A. pleuropneumoniae (Tascon a j., 1994) a sekvence sacRB, které dodávají citlivost na sacharózu (Suc1) mnoha gram-negativním bakteriím (Gay aj., 1983; Ried aCollmer, 1987). Delece vytvořená v pCWl 1ΕΔ1 KS1 překlenula cpsABC (obr. 1, obr. 4) a proto pravděpodobně mohla ovlivnit proteinové produkty těchto ORF.
Vektor pCWl 1ΕΔ1 KS1 se nereplikoval do A. pleuropneumoniae a proto fungoval jako suicidální vektor. Poté co pCWl 1ΕΔ1 KS1 byl elektroporován do A. pleuropneumoniae J45 bylo, po inkubaci znovuzískaných směsí při 37 °C po dobu 2 dní, získáno sedm vůči kanamycinu rezistentních transformantů.
Čtyři z těchto J45 transformantů odolných proti kanamycinu nebyly iridescentní při vizualizaci na deskách běžně pronikajícím světelným zdrojem, což předpovídá, že tyto transformanty nebyly zapouzdřené (data nejsou uváděna). Médium používané pro pěstování A. pleuropneumoniae před elektroporací s pCWl 1ΕΔ1 KS1 bylo faktor, protože nezapouzdřené transformanty odolné proti kanamycinu nebyly nikdy získány, když byl A. pleuropneumoniae pěstován v mozkově srdečním nálevu doplněném NAD.
Genotypová charakteristika transformantů A. pleuropneumoniae odolných proti kanamycinu
Předběžné koloniové hybridizační analýzy sedmi transformantů odolných vůči kanamycinu odhalily, že čtyři transformanty, které se jevily jako nezapouzdřené (vizuální prohlídkou) hybridizovaly s nptl specifickou sondou DNA (1,24 kb Pstl fragmentem z pKS), ale nikoli se sondami specifickými pro pGEM-3Z (1,1 kb Bg/II fragment pGEM-3Z) nebo se sérotypově specifickým 2,1 kb Bg/II-Stul fragmentem pCW-llE (údaje nejsou uváděné). Tyto výsledky naznačují, že u každého z těchto čtyř transformantů odolných proti kanamycinu došlo ke dvojité rekombinací.
-11 CZ 295438 B6
Naopak, kolonie dalších tří transformantů rezistentních proti kanamycinu hybridizovaly k sondám specifickým pro gen nptl, pGEM-3Z a 2,1 kb Bg/II-Stul fragmentu pCW-llE, což naznačuje, že došlo k jednomu prostému překřížení a celý suicidální vektor pCWl 1ΕΔ1 KS1 se integroval do chromozomu těchto transformantů (data neuváděna). Southem blot analýzy genomické DNA vyčištěné ze čtyř potenciálně nezapouzdřených transformantů odolných vůči kanamycinu (za použití výše popsaných sond) byly identické, což naznačuje, že u každého z těchto transformantů došlo ke stejné dvojité rekombinační události. Jeden z těchto transformantů byl náhodně vybrán k dalšímu studiu a byl označen jako J45-100.
Byly provedeny Southem blot analýzy genomové DNA izolované z J45 a J45-100 se sondami DNA specifickými pro gen nptl, 2,1 kb Bg/II-Stul fragment z pCW-flE a 2,1 kb fragment Clal zpCW-lC (obr. 5). nptl-specifická DNA sonda hybridizovala k 5,0 kb fragmentu z Xbald štěpené DNA J45-100, ale ne k DNA J45, čímž se ověřilo, že markér nptl byl v chromozomu J45100 (obr. 5A). Hybridizace sondy nptl k 5,0 kb Xbal fragmentu genomové DNA J45-100 byla konzistentní s velikostí tohoto fragmentu Xbal v suicidálním vektoru pCWl 1ΕΔ1 KS1 použitému k produkci J45-100. 2,1 kb Bg/II-Stul fragment z pCW-llE hybridizoval k5,8 kb fragmentu BamHl-štěpen8ho J45, nikoli však k DNA z J45-100, což ověřilo, že tento fragment byl vynechán (deletován) v J45-100 (obr. 5B). Sonda specifická pro geny cpxCBA (2,1 kb fragment Clal z pCW-lC) zapojené do exportu pouzdrového polysacharidu hybridizovala k 5,3 kb fragmentu Xbal jak J45 tak i J45-100 (obr. 5C). Tento výsledek prokázal, že tato část místa zapouzdření A. pleuropneumoniae byla nedotčena dvojitou rekombinační událostí, ke které došlo v přiléhajícím regionu DNA. Sonda specifická pro pGEM-3Z nehybridizovala ke genomické DNA ani z J45 ani J45-100, čímž se ověřilo, že v genomu J45-100 nebyl obsažen žádný vektor DNA. Souhrnně, tyto hybridizační výsledky DNA naznačují, že u J45-100 došlo k žádané dvojité rekombinaci a alelické výměně.
Fenotypová charakterizace J45-100 - transformantů A. pleuropneumoniae odolné proti kanamycinu
J45-100 byl vyhodnocován z hlediska produkce pouzdrového polysacharidu hybridizací kolonií (koloniovým imunoblotováním) a latexovou aglutinací. Antisérum obsahující protilátky specifické pro pouzdrový polysacharid A. pleuropneumoniae sérotyp 5a, ne však žádné další povrchové bakteriální složky, reagovalo s J45, nereagovalo však s J45-100 (obr. 6). Protože bakteriální kolonie na membráně byly lyžovány v chloroformu, tyto výsledky naznačují, že J45-100 neprodukuje nitrobuněčné nebo mimobuněčné pouzdrové polysacharidy. Celý nebo ultrazvukově upravený J45-100 neaglutinoval latexové částice, které byly kovalentně spojeny k vyčištěné protilátce pouzdrového polysacharidu A. pleuropneumoniae sérotypu 5a (Inzana, 1995), zatímco celé buňky J45 a ultrazvukově upravené buňky J45-C silně aglutinovaly latexové činidlo (data nejsou uváděna). Tyto výsledky ověřily, že delece zavedená do místa cap A. pleuropneumoniae J45-100 měla za následek ztrátu biosyntézy pouzdrového polysacharidu. Dále, tyto výsledky naznačily, že nezapouzdřený mutant J45 izolovaný po etylmetansulfonátové mutagenezi (Inzana aj., 1993a), J45-C, produkoval sice nitrobuněčný, avšak nikoli mimobuněčný pouzdrový polysacharid.
Exprese apx toxinu a elektroforetické profily LPS J45 a J45-100 byly porovnány, aby se určilo, zda mutace zavedená do místa cap J145-100 ovlivnila tyto důležité determinanty virulence. Nebyl zjištěn rozdíl ve vylučování 105 kDa Apxl a Apxll toxinových proteinů do kultury supernatantu mezi J45 a J45-100 (obr. 7). Navíc, nebyla zjištěna žádná diference v elektroforetických profilech LPS u J45 a J45-100 (obr. 8).
Prošetřoval se růst J45 a J45-100 v TSY-N a citlivost J45 s J45-100 na baktericidní aktivitu prekolostrálního telecího séra, aby se stanovil dopad ztráty zapouzdření na tyto fenotypové vlastnosti. Růstové křivky J45 a J45-100 v TSY-N byly podobné, nikoli však identické (data se neuvádějí). Ovšem proveditelné sčítání životaschopnosti na deskách demonstrovalo, že během logaritmické fáze růstu rostl J45-100 rychleji (generační doba asi 23 minut) než mateřský zapouz
-12CZ 295438 B6 dřený kmen J45 (generační doba asi 28 minut) (data se neuvádějí). Rekombinantní nezapouzdřený mutant J45-100 byl během 60 minut v 10 až 50% prekolostrálním telecím séru jako komplementárním zdroji efektivně usmrcen, zatímco opouzdřený mateřský kmen J45 usmrcen nebyl (obr. 9).
Citlivost J45-100 na sacharózu se prošetřovala proto, aby se určilo, zda by sekvence sacRB mohly fungovat jako kontraselektivní markér u A. pleuropneumoniae a následně indukovat excisi kartridže nptl-sacRB z chromozomu J45-100. V bujónu pěstovaný J45-100 silně rostl, jestliže byl dáván přímo na desky nebo když byl zředěn a potom dáván na desky TSY-N nebo na médium ío Luria-Bertani obsahující 5 % nebo 8 % sacharózy (ke kterému bylo přidáno 5 pg/ml NAD). Přítomnost sacRB sekvencí v chromozomu J45-100 byla ověřena metodou Southem blotting. Tyto výsledky naznačují, že buď markér sacRB nebyl v A. pleuropneumoniae exprimován nebo je možné, že fruktosanový produkt vytvořený sacRB fruktosansacharózou za přítomnosti sacharózy nebyl toxický pro J45-100.
Intratracheální nákaza prasat rekombinantním nezapouzdřeným mutantem A. pleuropneumoniae J45-100.
Rekombinantní nezapouzdřený mutant J40-100 podávaný v dávkách 3 x a 6 x (1,45 x 107 CFU a 20 2,95 x 107 CFU) 50 % smrtelné dávky (LD50) zapouzdřeného mateřského kmene J45 (5 x 106
CFU) (Inzana a j., 1999a) (tabulka 2) nezpůsoboval úmrtnost prasat. Na rozdíl od toho se u tří prasat nakažených 6,5 násobkem LD50 J45 rozvinulo vážné poškození plic a uhynula (tabulka 2).
Tabulka 2
| VIRULENCE A. pleuropneumoniae J45 A J40-100 PRO PRASATA | ||||
| Počet pozitivních/celkový počet zkoušených | ||||
| Nákazový kmen | Nákazová dávka | Průměrný stav poškození plic | Úmrtnost | Znovuzískánía |
| J45 | l,6-3,3X107 CFUb | 4+ | 3/4c | 4/4 |
| J45-100 | l,5X107CFU | 0 | 0/5 | 0/5 |
| J45-100 | 3,0X107 CFU | 1+ | 0/5 | 2/5d |
| J45-100 | 8,4X107CFU | 1+ | l/4e | 4/4d |
| J45-100 | l,8X108CFU | 2+ | 0/4 | 4/4d |
| J45-ď | l,7X108 CFU | 1+ | 0/2 | 2/2d |
| a Znovuzískání nákazového kmene ze vzor J45-100, a byla pitvána 4 dny po nákaze. | cu plic odebraného při pitvě. Prasata byla nakažena | |||
| b Tato dávka je 6,6 násobkem 50% smrtelná dávky (5X1O8 CFU), uváděné v předcházející studii (Inzana a j., 1993a). | ||||
| c Všechna prasata v této skupině uhynula během 36 hodin po nákaze. | ||||
| d A. pleuropneumoniae byl znovu získán z plic a nedostatkem iridescence a neschopností aglutinovat senzitizované latexové částice specifické pro sérotyp 5 bylo potvrzeno, že není zapouzdřen. | ||||
| e Pitva jednoho uhynulého prasete naznačila, že smrt byla následkem špatného podání nákazové dávky. | ||||
| 1J45-G je chemicky indukovaný, nezapouzdřený mutant, který byl již dříve charakterizován. |
Pět prasat nakažených nižší dávkou J45-100 (1,45 x 107 CFU) nevykazovalo žádné klinické symptomy charakteristické pro prasečí pleuropneumonii tj. současný zánět pohrudnice a plic, a nedošlo u nich vůbec k poškození plic. Dále, A. pleuropneumoniae nebyl kultivován z plicních 30 vzorků odebraných při pitvě čtyři dny po nákaze. Dvě z pěti prasat nakažených vyšší dávkou
J45-100 (2,97 x 107 CFU) byla klinicky normální a při pitvě nebylo pozorováno žádné poškození plic. Jedno prase z této skupiny nakažené vyšší dávkou J45-100 vykazovalo střední dušnost a při pitvě bylo pozorováno určité překrvení plic a mírné krvácení (hodnocení poškození plic = 1+).
-13CZ 295438 B6
Zbývající dvě prasata v této skupině vykazovala mírnou dusnost a při pitvě byla pozorována jistá pleuritida a zhojení (poškození plic = 2+). A. pleuropneumoniae J45-100 byl kultivován pouze z těchto dvou prasat s nejzávažnějším poškozením plic. Bakterie získané z těchto prasat nesrážely latexové části aglutinačního činidla sérotypu 5a. V důsledku toho takto získané bakterie byly stále nezapouzdřené, což naznačuje, že J45-100 se in vivo nezměnil zpět na zapouzdřený fenotyp.
Třebaže geny nptl (dává rezistenci vůči kanamycinuja SacB/SacR (dává citlivost vůči sacharóze) byly klonovány do delečního místa, tyto geny byly zamýšleny pouze k tomu, aby byly použity jako markerové geny. Je možné použít i alternativní markerové geny. Může být také výhodné vyhnout se použití markéru rezistentního proti antibiotikům, jako je nptl z důvodů zdravotních a bezpečnostních, nebo získat mechanismus pro konzervování nebo inaktivaci antibiotického markéru. Vhodné neantibiotické markéry by mohly zahrnovat odolnost vůči rtuti.
Nezapouzdřený kmen Actinobacillus pleuropneumoniae sérotyp B produkovaný podle výše uvedených postupů produkuje pouze dva ze tří toxinů produkovaných Actinobacillem pleuropneumoniae. Třebaže modifikovaný Actinobacilluspleuropneumoniae je ochranný a imunogenní, může být také užitečný pro klonování třetího genu toxinu RTX do delečního místa. To se může provést klonováním genu toxinu RTX do kazety genu kanamycinu kmene J45-100, a takto inaktivovat kanamycinový gen.
Vakcína by měla být přednostně poskytována formou podobnou ostatním vakcínám, která je v oboru běžně známá. Je výhodné, aby vakcína byla v lahvičkách jako lyofilizovaná směs a může obsahovat jeden nebo více sérotypů mutantních kmenů. Aby se uchovala životnost, měla by obsahovat také látky jako Columbijský bujón, trehalózu nebo albumin, glycerin nebo některá jiná činidla. Obsah lyofilizované směsi by bylo pouze třeba znovu hydratovat sterilní vodou nebo fyziologickým roztokem a aplikovat injekcí (intramuskulámě, nitrožilně, intraperitoneálně, subkutánně atd.). Vakcína by mohla být také formulována pro jiné způsoby podávání (například orálně, transdermálně, pod jazykem atd.) za použití vhodné nosné matrice, například škrob, polysacharidy, oleje, liposomy, pryskyřice atd.
Dávka vakcíny podávaná zvířeti bude záviset na takových faktorech, jako je stáří nebo pohlaví zvířete a na způsobu podání. Ve všech případech by mělo být poskytnuto dostačující množství živého, avirulentního, nezapouzdřeného Actinobacillu pleuropneumoniae tak, aby se zvýšila imunitní reakce vakcinovaného zvířete. Úspěšné výsledky byly získány dvěma imunizacemi v rozpětí 2 až 3 týdnů v množství 109 kolonií vytvářejících jednotek (CFU).
Třebaže vynález byl popisován z hlediska jeho nej výhodnějšího provedení, ti, kdo jsou zběhlí v oboru, rozeznají, že vynález může být dále modifikován v duchu a rozsahu připojených nároků.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Vakcína, vyznačená tím, že sestává z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, postrádající DNA sekvence, kódující syntézu pouzdra.
- 2. Vakcína podle nároku 1, vyznačená tím, že sestává z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované baktérie Actinobacillus pleuropneumoniae, která má DNA sekvence kódující syntézu pouzdra lokalizované před hybridizačním místem BamHl-Xbal fragmentu v pCW-lC, postrádající tyto sekvence.
- 3. Vakcína podle nároku 1, vyznačená tím, že sestává z avirulentní nezapouzdřené, geneticky modifikované baktérie Actinobacillus pleuropneumoniae, která má DNA sekvence kódující syntézu pouzdra lokalizované před genem na export pouzdra, postrádající tyto sekvence.
- 4. Vakcína podle nároku 3, vyznačená tím, že genem na export pouzdra je cpxD.
- 5. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, pro imunizaci prasat proti pleuropneumonii.
- 6. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, pro imunizaci prasat proti pleuropneumonii injekcí vakcíny nitrosvalově nebo podkožně.
- 7. Způsob přípravy vakcíny k prevenci nemocí způsobených bakterií Actinobacillus pleuropneumoniae podle nároku 1, vyznačený tím, že se provede nejprve identifikace genů kódujících syntézu pouzdra v uvedené bakterii a poté delece genů kódujících syntézu pouzdra, za získání nezapouzdřeného mutantu uvedených bakterií.
- 8. Způsob přípravy vakcíny k prevenci nemocí způsobených bakterií Actinobacillus pleuropneumoniae podle nároku 2, vyznačený tím, že se nejprve provede identifikace DNA sekvencí kódujících syntézu pouzdra v bakteriích, které jsou lokalizované před hybridizačním místem BamHl-Xbal fragmentu v pCW-lC, a poté delece uvedených DNA sekvencí kódujících syntézu pouzdra za získání nezapouzdřených mutantů uvedených bakterií.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/673,814 US6086894A (en) | 1996-06-27 | 1996-06-27 | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ418998A3 CZ418998A3 (cs) | 1999-07-14 |
| CZ295438B6 true CZ295438B6 (cs) | 2005-08-17 |
Family
ID=24704213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19984189A CZ295438B6 (cs) | 1996-06-27 | 1997-06-17 | Vakcína a způsob její výroby |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6086894A (cs) |
| EP (1) | EP0964689A4 (cs) |
| JP (1) | JP2001522347A (cs) |
| CN (1) | CN1092069C (cs) |
| AR (1) | AR008615A1 (cs) |
| AU (1) | AU734254B2 (cs) |
| BR (1) | BR9710986A (cs) |
| CA (1) | CA2258168A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ295438B6 (cs) |
| NO (1) | NO986099L (cs) |
| NZ (1) | NZ333387A (cs) |
| PL (1) | PL186728B1 (cs) |
| RU (1) | RU2234941C2 (cs) |
| SK (1) | SK284610B6 (cs) |
| TR (1) | TR199802716T2 (cs) |
| UA (1) | UA70287C2 (cs) |
| WO (1) | WO1997049416A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA975586B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1832662B1 (en) * | 1998-04-02 | 2011-03-09 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | DNA encoding chondroitin synthase from Pasteurella multocida and methods of use |
| US7708642B2 (en) | 2001-10-15 | 2010-05-04 | Igt | Gaming device having pitch-shifted sound and music |
| DK1350796T3 (da) * | 2002-04-05 | 2009-03-02 | Merial Sas | Attenuerede gramnegative bakterier |
| US7449178B2 (en) | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
| GB0228691D0 (en) * | 2002-12-09 | 2003-01-15 | Imp College Innovations Ltd | Bacterial virulence genes |
| DE602004003582T2 (de) * | 2003-07-02 | 2007-09-20 | Biotechnology Research And Development Corp., Peoria | Akapsuläre i p. multocida hyae deletionsmutanten |
| CN102209725B (zh) * | 2008-11-10 | 2016-02-24 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 缺乏功能性ii组荚膜基因簇的大肠埃希氏菌bl21菌株 |
| TWI548746B (zh) * | 2009-08-06 | 2016-09-11 | 英特威特國際股份有限公司 | 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法 |
| CN106866800B (zh) * | 2016-09-14 | 2020-08-18 | 四川农业大学 | 胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US549818A (en) * | 1895-11-12 | Rolling-mill | ||
| AR241545A1 (es) * | 1985-07-12 | 1992-08-31 | Cornell Res Foundation Inc | Un metodo para preparar una cepa de s. equi avirulenta a.t.c.c. 53186 para equinos. |
| US4980163A (en) * | 1989-03-01 | 1990-12-25 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Novel bacteriocin compositions for use as enhanced broad range bactericides and methods of preventing and treating microbial infection |
| WO1993010815A1 (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-10 | Center For Innovated Technology | Non-capsulated mutants of bacteria useful as vaccines |
| JP2717481B2 (ja) * | 1992-08-25 | 1998-02-18 | 富士写真フイルム株式会社 | ハロゲン化銀カラー写真感光材料 |
| US5441736A (en) * | 1992-11-05 | 1995-08-15 | University Of Saskatchewan | Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane lipoprotein A and uses thereof |
-
1996
- 1996-06-27 US US08/673,814 patent/US6086894A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-17 AU AU33904/97A patent/AU734254B2/en not_active Ceased
- 1997-06-17 CZ CZ19984189A patent/CZ295438B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-17 WO PCT/US1997/010236 patent/WO1997049416A1/en not_active Ceased
- 1997-06-17 CN CN97195844A patent/CN1092069C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-17 PL PL97330863A patent/PL186728B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-06-17 NZ NZ333387A patent/NZ333387A/en unknown
- 1997-06-17 RU RU99101907/13A patent/RU2234941C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-06-17 CA CA002258168A patent/CA2258168A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-17 JP JP50314698A patent/JP2001522347A/ja not_active Ceased
- 1997-06-17 UA UA98126639A patent/UA70287C2/uk unknown
- 1997-06-17 TR TR1998/02716T patent/TR199802716T2/xx unknown
- 1997-06-17 EP EP97929967A patent/EP0964689A4/en not_active Withdrawn
- 1997-06-17 BR BR9710986-0A patent/BR9710986A/pt active Search and Examination
- 1997-06-17 SK SK1771-98A patent/SK284610B6/sk unknown
- 1997-06-24 ZA ZA9705586A patent/ZA975586B/xx unknown
- 1997-06-24 AR ARP970102777A patent/AR008615A1/es unknown
-
1998
- 1998-07-15 US US09/115,824 patent/US6326001B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-23 NO NO986099A patent/NO986099L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2258168A1 (en) | 1997-12-31 |
| JP2001522347A (ja) | 2001-11-13 |
| WO1997049416A1 (en) | 1997-12-31 |
| NZ333387A (en) | 2000-06-23 |
| TR199802716T2 (xx) | 2001-06-21 |
| AU734254B2 (en) | 2001-06-07 |
| US6086894A (en) | 2000-07-11 |
| SK284610B6 (sk) | 2005-07-01 |
| CZ418998A3 (cs) | 1999-07-14 |
| HK1020004A1 (en) | 2000-03-10 |
| NO986099L (no) | 1999-01-13 |
| CN1092069C (zh) | 2002-10-09 |
| AU3390497A (en) | 1998-01-14 |
| EP0964689A1 (en) | 1999-12-22 |
| CN1223586A (zh) | 1999-07-21 |
| UA70287C2 (en) | 2004-10-15 |
| BR9710986A (pt) | 2001-12-11 |
| US6326001B1 (en) | 2001-12-04 |
| PL186728B1 (pl) | 2004-02-27 |
| ZA975586B (en) | 1998-03-23 |
| PL330863A1 (en) | 1999-06-07 |
| AR008615A1 (es) | 2000-02-09 |
| SK177198A3 (en) | 2000-03-13 |
| NO986099D0 (no) | 1998-12-23 |
| RU2234941C2 (ru) | 2004-08-27 |
| EP0964689A4 (en) | 2004-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Carniel et al. | The gene coding for the 190,000-dalton iron-regulated protein of Yersinia species is present only in the highly pathogenic strains | |
| US20090117142A1 (en) | Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof | |
| US20080254062A1 (en) | Use of an avirulent bordetella mutant as a live vaccine vector | |
| EP0656014B1 (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group b streptococcus; process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| Shimoji et al. | Construction and vaccine potential of acapsular mutants of Erysipelothrix rhusiopathiae: use of excision of Tn 916 to inactivate a target gene | |
| CZ295438B6 (cs) | Vakcína a způsob její výroby | |
| JPH09512703A (ja) | 空胞形成毒素欠損Ｈ．ｐｙｌｏｒｉおよび関連する方法 | |
| WO2002061070A2 (en) | Environmentally regulated genes, involved in the virulence of streptococcus suis | |
| US7449310B2 (en) | Recombinant Fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof | |
| US20030044431A1 (en) | Over-expressing homologous antigen vaccine and a method of making the same | |
| US6149920A (en) | Over-expressing homologous antigen vaccine and a method of making the same | |
| AU2001259138A1 (en) | Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof | |
| KR100567351B1 (ko) | 피낭형세균에의해유발되는질병에대한재조합백신 | |
| US6770273B1 (en) | Vaccine based on attenuated Haemophilus somnus | |
| HK1020004B (en) | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms | |
| Zhang | Proteomics analysis of outer membrane proteins of leptospira interrogans | |
| Pandher | Molecular and immunological analyses of 38 kDA and 45 kDA protein antigens of Pasteurella haemolytica S1 | |
| CA2239226A1 (en) | Transferrin binding proteins of pasteurella haemolytica and vaccines containing same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20070617 |