UA70287C2 - Vaccine against pleuropneomonia of pigs, method fovaccine against pleuropneomonia of pigs, method for its preparation, and method for immunizing pigs r its preparation, and method for immunizing pigs against pleuropneomonia against pleuropneomonia - Google Patents

Description

Опис винаходу

Винахід стосується загалом вакцин, що використовуються за ветеринарними призначеннями, більш 2 конкретно, живої рекомбінантної атенуйованої вакцини для хворобливих станів, спричинених організмами, які включають капсулу, причому наявність капсули є потрібною для вірулентності, а не для імунозахисту. Винахід, зокрема, може бути використаний у виробництві рекомбінантно продукованої вакцини, яка одержується таким чином, щоб не мала капсули.

Вакцини є препаратами, які використовуються для попередження певних хвороб у тварин та людей шляхом 70 індукування імунітету. Це здійснюється шляхом піддавання пацієнта дії антигену до певної хвороби, який, в свою чергу, спричинює продукування імунною системою пацієнта великої кількості антитіл. Наявність антитіла у крові пацієнта захищає пацієнта від подальшого нападу збудника хвороби. Вакцини можуть складатись із субодиниць збудника, або з самого живого чи вбитого збудника. Наприклад, профілактику поліомієліту, який звичайно називають "поліо" (рос), типово здійснюють шляхом введення перорально живої атенуйованої 12 вакцини поліовірусу, що є звичайною практикою у лікування дітей, або шляхом введення вбитої чи інактивованої вакцини поліовірусу, що є звичайною практикою у лікуванні дорослих, оскільки вони загалом мають підвищений ризик захворювання на поліомієліт від живої вакцини. Якщо треба використовувати живу вакцину, Її вірулентність повинна бути якимось чином атенуйованою; інакше вірус у вакцині може спричинити хворобу, від якої вона повинна захищати.

Ряд хвороб спричинюється інкапсульованими бактеріями, у яких капсула, яка є смолоподібним шаром полісахариду чи поліпептиду, що знаходиться ззовні клітинної стінки цих бактерій, потрібна для патогенезу.

Одним з прикладів є плевропневмонія свиней, а фактори вірулентності бактерії Асііпобрасіїиз5 ріеигорпетопіаеє, яка спричинює хворобу, включають капсульний полісахарид, ендотоксин та білкові екзотоксини.

Плевропневмонія свиней є однією з головних респіраторних хвороб, які завдають шкоди виробництву свинини у с всьому світі та спричинюють у промисловості щорічні збитки на мільйони доларів у самих Сполучених Штатах. Ге)

У патенті США Мо5429818, виданому на ім'я Іпгапа, розкрито, що не-інкапсульовані мутанти Асііпорасійив ріеигорпептопіае є авірулентними і здатні забезпечити чудовий захист проти подальшої дії вірулентних бактерій. Не-інкапсульовані мутанти, описані у патенті Іпгапа, були одержані шляхом етилметансульфонатного мутагенезу. Однак така методика має ті недоліки, що деякі спонтанно чи хімічно індуковані мутанти можуть бути в нестабільними, а характер мутації (мутацій) є невідомим. с

Метою даного винаходу є створення безпечної та ефективної живої атенуйованої рекомбінантної вакцини для хвороб, спричинених бактеріями та грибками, які звичайно є інкапсульованими, і у яких капсула потрібна с для вірулентності, але не для імунозахисту. Га»)

Іншою метою даного винаходу є генетична інженерія певних бактерій та грибків з метою вилучення капсули, 3о щоб зробити їх авірулентними при відомій генетичній природі мутації. в

Ще іншою метою даного винаходу є створення безпечної та ефективної живої атенуйованої рекомбінантної вакцини проти плевропневмонії.

Згідно з винаходом, було одержано рекомбінантний живий атенуйований штам АсііпорасіШ5 « ріеигорпешйтопіає, який було позбавлено капсули методами генетичної інженерії. Оскільки капсула потрібна для З 70 вірулентності, а не для імунозахисту, штам може бути використаний як вакцина проти плевропневмонії свиней. с Вакцина була продукована за допомогою клонованого плазмідного вектора, який не може репродукуватись у А.

Із» ріеигорпештопіае. Було секвеновано гени екскреції та синтезу капсули серотипу 5 А.ріеигорпешйтопіае. У клонованих генах синтезу капсули було зроблено велику делецію, після чого гени, що кодують стійкість до канаміцину та чутливість до сахарози, було клоновано до вилученого сайта для використання як маркерні гени.

Суїцидальний вектор введено до вірулентного штаму серотипу 5 А.ріеогорпентопіде методом електропорації і для забезпечення гомологічної рекомбінації шляхом подвійного кросоверу між гомологічними ділянками ав | хромосоми та плазміди. Було одержано чотири ізоляти, кожен з яких не виявляв іридисценції, що дозволяє припустити відсутність капсули. Відсутність капсули та вилучення ділянки генів капсули було підтверджено для ді одного штаму методами дот-блотування та саузерн-блотування, відповідно. Було також підтверджено наявність о 20 у рекомбінантному штамі маркерних генів. Ніяких інших змін будь-яких фенотипічних властивостей виявлено не було, і маркерних генів в інших ділянках хромосоми знайдено не було. Рекомбінантний штам, який було тм позначено як 245-100, був дуже чутливим до сироватки, мав знижену вірулентність у свиней при введенні дози, яка у десять разів перевищувала дозу половинної смертності вихідного штаму, і повинен забезпечити захист свиней проти плевропневмонії. 25 Цей винахід буде корисним для одержання вакцин проти будь-якого інкапсульованого організму, що продукує

ГФ) токсини чи інші фактори вірулентності, у якого капсула потрібна для вірулентності, а не для імунозахисту. юю Потрібно лише здійснити тонування генів, що кодують синтез капсули в організмі, а потім вилучити та замінити ділянку клонованого гена маркерним геном на суїцидальному векторі, а потім ввести вектор до потрібного організму та відібрати генетично модифіковані організми, які позбавлені капсули. Винахід повинен бути 60 корисним у одержанні вакцин проти додаткових бактеріальних інфекцій, які включають РазіецгеїМйа тийосіда,

РазіешгеМа Нпаетоїуїйса та Рзепдотопаз аегидіпоза, а також грибки, такі як Стуріососсив пеоїогтапв, який є патогеном, асоційованим з синдромом набутого імунодефіциту (СНІД) у котячих та людини.

Вищевказані та інші цілі, аспекти та переваги можна краще зрозуміти із наведеного далі детального опису варіантів втілення винаходу, яким надається перевага, з посиланнями на креслення, на яких: бо Фігура 1 є фізичною картою клонованої ДНК рСМУ-11Е із ділянки синтезу капсули А.ріеигорпештопіае .)45.

Вказано місце знаходження та напрям транскрипції двох повних відкритих рамок зчитування (срзА та среВ, суцільна заливка), ідентифікованих дидезокси-методом визначення первинної структури. Вказано також положення часткової третьої потенційної відкритої рамки зчитування (среС). Вказано також положення та напрям транскрипції неповного гена екскреції капсули срхО, розміщеного на цьому фрагменті ДНК. Вказано фрагмент

Вайнйп-еші розміром 2,1тис.пар, що використовувався як ДНК-проба. Крапкова заливка вказує на неповні рамки зчитування.

Фігура 2 зображує результати саузерн-блот аналізу геномної ДНК А.ріеигорпеитопіае, гібридизованої до дигоксигенін-міченого 2,1тис.пар ВаП-еіш! фрагменту рСМУ11єЕ. Здійснювали гібридизацію ВатНі-гідролізованої 7/0 Геномної ДНК штаму 4074 серотипу 1 (смужка 1), штаму 1536 серотипу 2 (смужка 2), штаму У45 серотипу 5а (смужка 3), штаму К1І7 серотипу 5а (смужка 4), штаму 178 серотипу 5 (смужка 5), штаму 29628 серотипу 7 (смужка 6) та штаму 13261 серотипу 9 (смужка 7) з пробою, як описано нижче. Вказано молекулярну масу гібридизуючих смуг (у тис.пар).

Фігури За та 35 зображує нуклеотидну послідовність НіпаїП-ЕсокМ фрагменту рСМУ-11Е довжиною 3,2тис.пар, 15 який містить серотип-специфічну 945 ДНК А.ріеигорпешцтопіае (ідентифікатор послідовності Мої, ЗЕО ІЮ. Мо.1).

Одержані амінокислотні послідовності двох повних відкритих рамок зчитування, виявлених у цій послідовності - срзА (ідентифікатор послідовності Мо2. 5ЕО ІЮ Мо.2) та сраВ (ідентифікатор послідовності Мо3, ЗЕО ІЮО Мо.3) - та одержану М-термінальну послідовність третьої неповної відкритої рамки зчитування - срзС (ідентифікатор послідовності Мо4, 5ЕО ІЮ Мо.4) - вказано під нуклеотидною послідовністю. Гадані рибосомно-зв'язуючі сайти, 20 що передують кожній відкритій рамці зчитування, виділено жирним шрифтом, і вказано гадані -10 та -35 промоторні послідовності, які йдуть слідом за срзА.

Фігура 4 описує конструкцію суїцидального вектора, що містить вилучену ДНК синтезу капсули рСМУ11 Ел1

КВ1 та 245 А.ріеоигорпентопіае продукування некапсульованих мутантів шляхом алельного обміну. Плазмідний вектор РСМ/11ЕЛДІТКЗ1 було сконструйовано шляхом гідролізу рРСМУ-11Е за допомогою Во/ та ШІ, затуплення с 25 Кінців та лігування великого фрагмента довжиною б,4тис.пар з З,бтис.пар Ватні фрагментом рк5 (також о затупленого), що містить картридж прі!-заскВ (Кап'зис?). Сайти рестрикції у дужках вказують початкові кінці фрагментів, лігованих у РСМ/11ЕЛІТК51.

Вектор рСМУ11ЕЛІК51 був електротрансформований до А.ріеигорпейтопіде, і некапсульовані

Кап'-трансформанти відбирались за ознакою відсутності іридисценції на середовищі, що містило 85бмг/мл - 30 канаміцину. со

Фігура 5 зображує результати саузерн-блот аналізу геномної ДНК, ізольованої із 445 А.ріеигорпештопіае (смужка 1) або .)45-100 (смужка 2) за допомогою дигоксигенін-мічених проб, специфічних до прі! або ділянок с локусу капсуляції А.ріеигорпеитопіае. У45 (смужка 1) або 945-100 (смужка 2) геномну ДНК А.ріеигорпеутопіде («3 гідролізували за допомогою Хваї (стекла А та С) або Ватні (скло В) і гібридизували за допомогою 1,24тис.пар 35 Рей-фрагмента рКЗ (пріі-специфічний), скло А; 2,1тис.пар Во/ЛІ-ЗішІ фрагмента рСМУ-11Е (срвАВС-специфічний, - дивись Фіг.1), скло В; або 2,1тис.пар С/аІ фрагмента ресму-1сС (срхСВА-специфічний, дивись Фіг.3.2), скло С.

Фігура 6 зображує імуноблот колонії 445 та 945-100 А.ріеогорпештопіде після проведення реакції з антисироваткою свиней, специфічною до капсульного полісахариду. На нітроцелюлозну мембрану наносили /«Ф приблизно 5х10? (смужка 1) або 5х107 (смужка 2) колонієутворюючих одиниць (СЕ) на лунку. Мембрану З7З піддавали лізису у хлороформі та інкубували з антисироваткою свиней, яка містила антитіла до капсульного с полісахариду серотипу 5а і не містила інших поверхневих антигенів А.ріеигорпеитопіае. "з Фігура 7 зображує імуноблоти концентрованої надосадної рідини культур 945 (смужка 1) та 945-100 (смужка 2) А.ріенгорпештопіае, яка містить переважно екзотоксини Архі та АрхіЇ. Скло А обробляли АрхіІ-специфічним моноклональним антитілом, а скло В - АрхіІ-специфічним моноклональним антитілом. Препарат на склі А містив 75 як негативний контроль концентровану надосадну рідину культури штаму 1536 серотипу 2 А.ріеигорпештопіде - (смужка 3), оскільки цей серотип не синтезує Архі. Блот на склі А обробляли Архі-специфічним моноклональним

І ав | антитілом.

Фігура 8 зображує електрофоретичні профілі ліпополісахаридів (І РБ5), ізольованих із 245 А.ріеигорпеитопіае о (смужка 1) та рекомбінантного некапсульованого мутанта 445-100 (смужка 2). Ліпополісахариди піддавали (ее) 50 електрофорезу через 1595-ний розділюючий гель та забарвлювали аміачним розчином хлориду срібла. . Фігура 9 зображує бактерицидну активність преколостральної сироватки теляти щодо 945 та 445-100 і А.ріеоигорпеитопіае. Життєздатність бактеріальних штамів у відсотках оцінювали після 60 хвилин інкубації при 3776. Кожна точка даних є середнім значенням для трьох окремих експериментів, проведених з дублюванням. "Вуси" позначають стандартне відхилення для кожного середнього. Максимальна життєздатність у відсотках, 59 зареєстрована для 445, становила 10095, хоч звичайно ці величини були більше, оскільки бактерії звичайно

ГФ) росли під час експерименту. Величини, що перевищували 10095, не реєструвались, оскільки їх не можна було юю точно визначити.

Фігури 10а та 105 зображують нуклеотидну послідовність фрагмента ХваІ!-Сіа! рСМУ-1С довжиною 3,2тис.пар, який кодує гени 445 ДНК екскреції капсули А.ріеигорпештопіае (Ідентифікатор послідовності Мо5, ЕС ІЮ Мо.5). 60 Вказано виявлені амінокислотні послідовності (Ідентифікатори послідовності МоМоб-8, БЕО ІЮО Мов.6-8) протеїнів, що беруть участь у екскреції капсульного полісахариду А.ріеигорпештопіае серотипу 5а.

Фігура 11 є фізичною картою ДНК рСМу-1С, одержаної із 445 А.ріеигорпештопіаеє.

Винахід пропонує використання живого рекомбінантно-продукованого авірулентного штаму мікроорганізму (наприклад, бактерії чи грибка), який методом генетичної інженерії був позбавлений капсули, як вакцини проти бо хвороб, що спричинюються цим мікроорганізмом. Винахід може бути корисним у профілактиці хвороб, у яких капсула мікроорганізму потрібна для вірулентності, але не для імунозахисту, і хвороба викликана токсинами або іншими факторами вірулентності. Як конкретний приклад винаходу було продуковано некапсульований штам

Асіїпорасійиз ріеигорпештопіає, який може бути використаний як вакцина проти плевропневмонії свиней.

Головною ознакою винаходу є генетична модифікація мікроорганізму, яка, у конкретному варіанті втілення на

Асііпорасійив ріеигорпеитопіае, включає делецію у її дезоксирибонуклеїновій кислоті (ДНК) ділянки, яка кодує синтез капсули. Тільки як приклад описано синтез трансформованого мутанта серотипу 5 Асііпорасіив5 ріеигорпешйтопіає; однак, слід розуміти, що інші серотипи можуть бути одержані за методиками, аналогічними до описаної нижче, і можуть бути придатними для використання у вакцині самі або у сполученні з одним чи кількома 70 рекомбінантними мутантами інших серотипів.

Штам, який описано нижче, разом з іншими штамами некапсульованих токсигенних бактерій або інших мікроорганізмів, одержаних згідно з описаною нижче методикою, буде чудовою вакциною, оскільки вони є авірулентними, але продукують антигени, потрібні хазяїну для створення захисної імунної реакції. Вакцини можуть бути введені різними методами, однак перевага надається внутрішньом'язовій або підшкірній ін'єкції. 7/5 Перевагою цих живих вакцин є те, що токсини, які є головною причиною хвороби, та інші компоненти, що утворюються лише живими організмами або іп мімо, будуть утворюватись лише у місці імунізації і організм-хазяїн виробить імунну реакцію для свого захисту від ушкоджень, спричинених токсинами. Внаслідок цього хвороба (гостра або хронічна) не розвивається. Однак, організми не можуть поширюватись, оскільки без капсули вони є дуже чутливими до сироватки і негайно знищуються у кровотоку або респіраторному тракті. Крім 2о Того, імунна реакція, викликана клітинами живої вакцини, буде дужчою, і захист буде тривати довше, ніж при використанні вбитих вакцин.

ПРИКЛАД

Було ідентифіковано та проаналізовано ділянку ДНК, пов'язану з біосинтезом капсульного полісахариду

Асііпорасійиз ріеогорпештопіае. Пробу, специфічну до гена срхО, який бере участь у екскреції капсульного сч об полісахариду А.ріеигорпейтопіде серотипу ба 545, було використано для ідентифікації та клонування прилягаючого фрагмента Ватні розміром 5,втис.пар геномної ДНК 445. Саузерн-блот аналіз засвідчив, що і) частина цієї ділянки містить ДНК, яка є серотип-специфічною. Аналіз послідовності ДНК показав, що ця ділянка містить дві повні відкриті рамки зчитування - срзеА та среВ - та неповну третю потенційну відкриту рамку зчитування - сраС. срзА та среВ мають на низькому рівні спільну гомологію з глікозилтрансферазами, які беруть М зо участь у біосинтезі ліпополісахариду Езспегіспіа соїї та капсульного полісахариду Наеторпйшз іпіцепгає типу р, відповідно. Було сконструйовано вилучаемий фрагмент розміром 2,Ітис.пар, який охоплював клоновані со відкриті рамки зчитування срзАВС, який рекомбінували до хромосоми У45 методом алельного обміну для с одержання мутанта 445-100. Цей омутант не продукував внутрішньоклітинного чи зовнішньоклітинного капсульного полісахариду, що свідчить про те, що срзА, ср5В та/або среС беруть участь у біосинтезі о зв Ккапсульного полісахариду А.ріеигорпештопіде. Токсин Арх та ліпополісахаридні профілі 945-100 були ї- ідентичними до показників інкапсульованого батьківського штаму 445. Однак 945-100 іп міго ріс скоріше, ніж 345. 945-100 був чутливим до знищення у преколостральній сироватці теляти, а 945 - ні. 945-100 був авірулентним при використанні для введення свиням внутрішньотрахеально у дозах, які втричі перевищували дозу 50905-ної смертності штаму 945. При дозах, які у шість разів перевищували дозу 5095-ної смертності 445, « 345-100 спричинював ушкодження легень від слабкого до середнього ступеню, але не смерть. Ці результати з с демонструють, що капсульний полісахарид є важливим детермінантом стійкості до сироватки та вірулентності

А.ріеигорпештопіаеє. ;» Бактеріальні штами, плазміди та умови вирощування. Бактеріальні штами та плазміди, використані у цих дослідженнях, описані у Таблиці 1. Для екстракції геномної ДНК та проведення бактеріальних аналізів

А.ріеогорпентопіае вирощували зі струшуванням при 377"С на мозково-серцевому бульйоні (Оіїсо І арогайогієв, -І Оеїйгоїї, Місп.), який містив 5мкг/мл нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД) (Зідта СПпетіса! Со., ЗК оців, Мо).

Для електропорації штами А.ріеигорпештопіде вирощували зі струшуванням при 37"С на трипсинизованому о соєвому бульйоні (Ойсо Іарогайогіев), який містив 0,695 екстракту дріжджів (Ойсо Іарогайїгіев) та 5мкг/мл ко НАД (Т5У-М). Для проведення експериментів з провокаційними пробами на свинях штами А.ріеигорпейтопіае 5о Вирощували зі струшуванням при 377С на бульйоні СоЇштрбіа (Оіїсо І арогаїгіез), який містив 5мкг/мл НАД. со Штами ЕзспПегіспіа соїї вирощували на бульйоні Луріа-Бертані (І игіа-Вегапі) (ЗатргоокК та ін., 1989) для "М звичайної культивації, або на бульйоні Тегїтіїс (Тагої апа Норбрез, 1987) для екстракції плазмід. Антибіотики використовували у живильному середовищі для підтримування плазмід в Е.соїї у таких концентраціях: ампіцилін (Атр) - 10Омкг/мл, і канаміцин (Кап) - 5Омкг/мл. Для селекції рекомбінантних мутантів А.ріеигорпештопіае дв Канаміцин використовували у концентрації 85мкг/мл. о ю я де

У.Місоївеї 2Х45-С некапсульований мутант, ізольований після етилметансульфонатного метагенезу штаму плазмід і плазміди РОЕМ-37 рРОЕМ-37; Атр", Кап"

З ,втис.пар із рк5, який описано у цій главі

Ь Цей маркер було спочатку одержано із гена Тп903 прі! росСАК (Рпагтасіа Віоїесиі, Рівсагажау, М) с Цей картридж було описано раніше (Ківд апа СоїїІтег, 1987)

Розрахунок часу генерації. Час генерації логарифмічної фази росту штаму А.ріепигорпештопідае у Т5У-М розраховували за формулою: К-1/9, де. К позначає середню швидкість бактеріального росту, а 9 - час генерації популяції бактерій (Реїсгаг та ін., 1993). Середня швидкість росту К розраховувалась за такою формулою:

КЗ3,32(091оМ - І0910Мо) / Її, де Ї позначає час, що минув, М позначає кількість бактерій у момент часу -ї, і Мо позначає початкову кількість бактерій у момент часу -0 (Реїслаг та ін., 1993).

Аналіз гібридизації ДНК. Гідролізовану за допомогою ендонуклеази рестрикції ДНК (приблизно 5мкг на лунку) піддавали електрофорезу через 0,795 агарозні гелі і переносили під дією капілярних сил на найлонові мембрани

Мадпасгарії (Місгоп Зерагайоп:е Іпс., МУезірого, Мавгв.), використовуючи 20Х сольовий розчин цитрату натрію. с (20Х З5С (сольовий розчин цитрату натрію) відповідають ЗМ Масі, З00мМ цитрату натрію, рН7), як було описано раніше (ЗатрьгоокК та ін., 1989; Зошійегп, 1975). ДНК ковалентно зв'язували з найлоновими мембранами за о допомогою ультрафіолетового випромінювання, використовуючи ОМ Зігайа|йпКег (Зігаїадепе, Га доїІа, Саїїйї.).

Дигоксигенін-мічені проби для гібридизації ДНК синтезували за методом випадкового праймера, використовуючи набір нерадіоактивного мічення та детектування Сепішз Зувіет (Воепгіпдег Мапппеїт Согр., Іпаіапороїїв, Іпа.) - відповідно до інструкцій виробника. Гібридизацію ДНК здійснювали при 687С у розчинах, які містили 5Х 55.

Мембрани промивали та проявляли згідно з інструкціями Сепіиз Зузвіет для колориметричного Детектування. со

Методи та реагенти для рекомбінантної ДНК. Геномну ДНК ізолювали із вирощених на бульйоні клітин Ге

А.ріеигорпептопіае згідно з методом, описаним 5.Зріпоїаа Стисло, він полягав у тому, що бактерії ресуспендували у 10мМ Трис - 1мМ ЕДТА (рн8в) та інкубували з додецилсульфатом натрію (0,6695) та РНКазою о протягом 1 години при 37"С. Додавали протеїназу К до кінцевої концентрації 10Омкг/мл, і суміш інкубували при - 56"С протягом 1 години. Суміш екстрагували однократно буферизованим фенолом та чотири рази буферизованою сумішшю фенол-хлороформ (Атгезсо, Іпс., ЗоЇоп, ОПіо), геномну ДНК осаджували етанолом та ресуспендували у 10ММ Трис-їмМ ЕДТА (рнвВ). Плазмідну ДНК ізолювали методом швидкого лужного лізису « (Ізп-Ногоміс: апа Вигке, 1981). Фрагменти рестрикції, потрібні для клонування та синтезу проб, елюювали із агарозних гелів, як описано раніше (7/йеп апа Змапк, 1993). Рестрикційний гідроліз, електрофорез на агарозному /-- с гелі та лігування ДНК здійснювали, як було описано раніше (ЗатргооК та ін., 1989). Кінці фрагментів ц рестрикції затуплювали шляхом заповнення 5'-кінцевих надмірностей нуклеотидами (аМмТРз), використовуючи "» фрагмент Кльонова (Кіепом/ їтадтепі) ДНК-полімерази Ш, як було описано раніше (ЗатрбгоокК та ін., 1989).

Плазмідну ДНК трансформували до штамів Е.соїї методом електропорації (Оожмег та ін., 1988), використовуючи електропоратор ВТХ ЕСМ 600 (ВТУ, Іпс., Зап Оіедо, Саїїйї.). - | Ендонуклеази рестрикції та фрагмент Кльонова ДНК-полімерази | були одержані від Рготеда Согрогайоп (Мадізоп, УМів.). ДНК-лігаза Т4 була одержана від Сірсо ВКІ (Сайпегеригд, Ма.) Нуклеотиди (аМТРзв) для о реакцій заповнення були одержані від Воепгіпдег-Мапппеїт Согрогайоп (Іпаіапароїв, Іпа.). ко Секвенування та аналіз ДНК. Нуклеотидні послідовності обох нитей 2,7тис.пар (КБ) Храі-ЕсокМ фрагменту

ДНК рСМ/-116Е визначали дидезокси-методом встановлення первинної структури з обривом ланцюга (Запдег та со ін., 1977), з використанням набору для секвенування Зедцепазе мегвіоп 2.0 ОМА зедцепсіпу Кі (Опіеа (айез що Віоспетіса! Согр., Сіемеїапа, Опіс) з о-"ІЗ|ЗАТР (ОиРопу/МЕМ Кезеагсп Ргодисів, Вовіоп, Мавв). Двонитеві кодуючі фрагменти ДНК секвенували з використанням звичайних олігонуклеотидних праймерів (ОМАдепсу, Іпс.,

Маїмете, Ра.) для продовження зчитування кожної ниті.

Одержані нуклеотидні послідовності комбінували з нуклеотидною послідовністю 4,6 тис.пар Хрбаї-Сіаї о фрагмента ДНК рСМУ-1С, кодуючого структурні гени капсули (Фігура 10), і аналізували за допомогою комп'ютерної програми для проведення аналізу ОМАЗТАК (ОМАЗТАК, Іпс., Мадізоп, МУів.). Пошуки подібності їмо) послідовностей по базам даних ЕМВвОСепВапк/008 проводили з використанням комп'ютерної програми ВІ АЗТ (АїїБспш! та ін., 1990) у Національному центрі біотехнологічної інформації (Майопа! Сепіег 7ог Віобїесппоіоду 60 Іпогтаїййоп, Веїпезаа, Ма»).

Стійкі ділянки сар-локусу Н.іпПцепгае типу Б (сарб), який бере участь у екскреції капсульного полісахариду, були використані для ідентифікації, клонування та аналізу ділянки локусу А.ріеигорпетопіае серотипу Ба, який бере участь у екскреції капсульного полісахариду. Було проведено саузерн-блот аналіз геномної ДНК штаму 445 А.ріеигорпештопіае серотипу Ба з використанням проб, специфічних до зціплених б5 ділянок локусу капсуляції Н.іпйцепгае типу Б (сарб). Ці проби не гібридизувались з геномною ДНК

А.ріеоигорпетопіае за дуже жорстких умов (68"С, 5х555С), але гібридизувались за умов від середньої до низької жорсткості (557С, 5х55С). Фрагмент ЕсокіІ розміром 4,4тис.пар локусу сарб Н.іпПшепгаеєе із плазміди рР2КНІ, який містить ділянку 1 гена рехО, що бере участь у екскреції капсульного полісахариду та дві відкриті рамки зчитування ділянки 2, що беруть участь у біосинтезі капсульного полісахариду, гібридизували з фрагментами

Ніпаїй розміром 1,2тис.пар та Храі розміром 5,Зтис.пар геномної ДНК .)45. Фрагмент ЕсокК! локусу сарь

Н.іпїсепгає розміром 9,Отис.пар із плазміди рекн2, який містить ділянку 1 генів бехСВА, що беруть участь екскреції капсульного полісахариду, певну неохарактеризовану ділянку З ДНК, яка є спільною для кількох серотипів Н.іпі'їцеплає, та певні фрагменти ділянки 2 ДНК, що беруть участь у біосинтезі капсульного полісахариду, гібридизували з фрагментами 1,5бтис.пар НіпаїйІ, 5,Зтис.пар Хваї та 2,4тис.пар Хо! геномної ДНК 7/0..45. Ці дані вказують на те, що локуси капсульних генів Н.Іпїчепгае типу Б та А.ріеигорпетопіае серотипу 5а мають спільні гомологічні ділянки. Обидві проби, специфічні до Н.іпіепгає сарбр, містять ДНК ділянки 1, що бере участь у екскреції капсульного полісахариду, внаслідок чого можна припустити, що фрагмент 5.Зтис.пар

Хваї геномної ДНК 45, який гібридизується з обома Н.іп'їцчепгае сарбо-пробами, може містити гени, які кодують протеїни, що беруть участь у екскреції капсульного полісахариду серотипу 5а А.ріеигорпеитопіае. Фрагмент 5,3

Хваї!ї геномної ДНК 45, який гібридизується з двома Н.іпПшепгаеє саро-пробами, клонували до ділянки Хваї плазміди рРОЕМ-37 (в обох напрямках) із ХбаіІ-гідролізованих фрагментів геномної ДНК 445 в інтервалі від 4,8 до б,Отис.пар, які одержували електроелюцією (після електрофоретичного розділення) із агарозного гелю. Одну з одержаних плазмід було позначено рСМу-1С. Здійснювали саузерн-блот аналіз для визначення того, чи будуть рехО, рехсС, рехВ та пехА Н.іпПшепгае типу 6 гібридизуватись з прилягаючими фрагментами рСМУу-1С у такому 2о самому порядку (БбехрСВА), в якому ці гени знаходяться в Н.ІпПшепгае. Результати дають змогу припустити, що ділянка ДНК А.ріеигорпецтопіае серотипу 5а, потрібна для екскреції капсульного полісахариду, була клонована вдало, і що ця ділянка організована аналогічно до бех-локусу Н.іпічеплгає типу Б.

Визначали нуклеотидну послідовність фрагмента рестрикції 4,бтис.пар ХбраІ-Сіаї рСМУ-1С, і фрагмент рестрикції З,2тис.пар, ХраІ-Сіаї наведено на Фігурах 10а-6 (Ідентифікатор послідовності Мо5, ЗЕ ІЮО Мо.5). сч ов Зовсім поряд з ним на тій самій нитці ДНК було виявлено чотири відкриті рамки зчитування (зображені на

Фігурах 10а-6 та Фігурі 11), які позначено срхОСВА (срх використано для позначення екскреції капсульного і) полісахариду). Ініцюючий кодон АОС срхС (Ідентифікатор послідовності Мо7, ЗЕС ІЮО Мо.7) складався з 26 нуклеотидів, розміщених після термінуючого кодону ОАА срхО (Ідентифікатор послідовності Моб, ЕС ІЮ Мо.б), тоді як ініціюючий кодон А срхВ (Ідентифікатор послідовності Мов, ЗЕО ІЮ Мо.8) перекривав термінуючий М зо Кодон ОАА срхС (Ідентифікатор послідовності Мо/7, ЗЕ) ІЮО Мо.7), а ініціюючий кодон АОС срхА перекривав частково присутній термінуючий кодон ЮСА срхВ (Ідентифікатор послідовності Мо8, БЕО ІЮ Мо.8). Узагальнюючі со послідовності зв'язування рибосом Шайна-Далгарно (Зпіпе-ОаІдагпо) було ідентифіковано на відстані 17 основ с після кожного ініціюючого АОС-кодону, а гадані промотор-вміщуючі послідовності, аналогічні до узагальнюючих послідовностей -10 (ТАТААТ) та -35 (ТТОАСА) Ессоїї со, були ідентифіковані слідом за срхО (Ідентифікатор о послідовності Моб, ЗЕО ІЮ Мо.6). Паліндромна послідовність, яка може функціонувати як гпо-незалежний сигнал - термінації транскрипції, була ідентифікована перед срхА (не зображена). Генетична організація дає змогу припустити, що срхОСВА транскрибуються на окрему поліцистронну мРНК.

Електротрансформування А.ріеигорпештопіає. А.ріеигорпештопіде вирощували до фази середини « логарифмічного росту у Т5У-М, збирали центрифугуванням при 7000х9 при 47С і промивали чотири рази у охолодженому (4"С) стерилізованому на фільтрі буфері, який містив 272мММ манітолу, 2,43ММ КоНРО), 0,57ММ с КНоРО,, 1595 гліцерину, рН 7,5. Цей буфер було модифіковано (так, щоб він замість сахарози містив манітол) ц порівняно з раніше описаним буфером, який використовувався для промивання клітин А.ріеигорпештопіае перед "» електропорацією (і аІопае та ін., 19895). Потім клітини один раз промивали у охолодженому стерилізованому на фільтрі 1596-ному гліцерині та ресуспендували до приблизно 1019 колонієутворюючих одиниць (СЕШумл у 15906-ному гліцерині. Аліквоти цієї суспензії змішували з 1,5-2,О0мкг плазмідної ДНК (у 1,5мкл дистильованої -і води), яку очищали ультрацентрифугуванням у градієнті густини хлориду цезію (Ззатргоок та ін., 1989), поміщали о до охолоджуваних кювет для електропорації з 2мм зазором (ВТУ, Іпс.) і піддавали електропорації за допомогою електропоратора ВТХ ЕСМ 600 (ВТХ, Іпс.) при напрузі заряду 2,5кВ та регуляторі опору, встановленому у ко положення К7 (246Ом). Реально був генерований імпульс 2,39кВ тривалістю 10,7 мілісекунд. Після бо 50 електропорації клітини відновлювали у їмл ТЗУ-М, що містив мМ Масі», при слабкому струшуванні протягом 3,5 годин при 37"С. Після відновлювання клітини культивували на Т5У-М-агарі, який містив 85мкг канаміцину на що мл та інкубували при 377.

Імуноблотування. Для одержання імуноблотів колоній цілі клітини А.ріеоигорпеитопіае, які вирощували протягом ночі на планшетах з Т5У-М агаром, зішкрібали до фосфатно-сольового буфера (РВ5) та встановлювали концентрацію у 10 колонієутворюючих одиниць (СЕШумл, яку визначали спектрофотометрично.

Ге! Приблизно 5х107 або 5х107 колонієутворюючих одиниць (СЕ) на лунку наносили на нітроцелюлозну мембрану (МігоВіпа; Місгоп Зерагайопв пс.) за допомогою апарату Віо-Юбої (Віо-Кай Іарогафгіев, Кісптопа, Саїїйї.). де Мембрану поміщали на 15 хвилин у хлороформ при кімнатній температурі для лізису бактеріальних клітин на мембрані. Мембрану повністю висушували на повітрі і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі у 60 Трис-буферизованому сольовому розчині, рН7,5 (ТВ5), який містив 295 знежиреного молока для блокування неспецифічних місць зв'язування на мембрані. Мембрани інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з розведеною 1:200 (у 295 молоко-ТВ5) адсорбованою антисироваткою свиней, яка містила антитіла до капсульного полісахариду серотипу ба, але не до інших поверхневих антигенів А.ріепигорпештопіае. Ця збагачена капсульним полісахаридом антисироватка була одержана шляхом адсорбції гіперімунної 65 антисироватки свиней на А.ріеигорпештопіае К17 зі спонтанним некапсульованим мутантом К17-С (Іплапа апа

Маїйпізоп, 1987), як було описано раніше (Іпгапа, 1995). Мембрану промивали ТВ5, який містив 0,0595 Твін-20, а потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі у розведеному 1:1000 анти-свинячому дО кроля, кон'югованому з пероксидазою хрону (важкі та легкі ланцюги; Сарреї, бигпат, М.С.). Мембрану промивали у ТВ5, а потім проявляли 4-хлор-1-нафтолом (Віо-Каай І арогаюгіев) у ТВ5, який містив 0,0295 НьО».

Імуноблотування концентрованої надосадної рідини культур А.ріеогорпейтопіде проводили за описаною раніше методикою (Ма апа Іпгапа, 1990). Стисло, вона полягала у тому, що відокремлювали приблизно 15мкг загального протеїну надосадної рідини культури методом безперервного електрофорезу у поліакриламідному гелі, який містив додецилсульфат натрію 5О5-РАСЕ (І аеттії, 1970), через 8956 розділюючий гель. Протеїни переносили на нітроцелюлозну мембрану (МіИгоВіпа; Місгоп Зерагаїйоп5, іпс.) за методикою Том/ріп та ін. 7/0 (1979). Мембрану інкубували у ТВ5, який містив 295 бичачого сироваткового альбуміну для блокування неспецифічного зв'язування і розрізали на смужки. Смужки інкубували протягом ночі при 47С або з моноклональним антитілом, специфічним до токсину АрхіЇ (Ма апа Іплапа, 1990), або з моноклональним антитілом, специфічним до токсину Архі (Оемепаізй та ін., 1989; ЕРгеу та ін., 1992) і промивали у ТВ5.

Відбиток, що реагував з АрхіІ-специфічним моноклональним антитілом, інкубували з анти-мишачим козиним Ід, 7/5 Кон'югованим до пероксидази хрону, у розведенні 1:2000 (Сарреї), промивали у ТВ5 та проявляли, як описано вище. Відбиток, що реагував з Архі-специфічним моноклональним антитілом, інкубували з анти-мишачим козиним Ід, кон'югованим до лужної фосфатази, у розведенні 1:2000, і проявляли, як було описано раніше (Егеу та ін., 1992).

Екстракція та електрофорез ліпополісахаридів (І Р5). Ліпополісахариди ізолювали із А.ріеигорпештопіае за 2о Методом мікроекстракції у гарячому фенолі-воді, як було описано раніше (Іплапа, 1983). Очищені ліпополісахариди піддавали електрофорезу через 15956-ний розділюючий поліакриламідний гель, який містив сечовину, як було описано (Іплапа та ін., 1988). Електрофоретичні профілі ліпополісахаридів візуалізували шляхом забарвлення гелю аміачним розчином хлориду срібла (Тзаї апа Ргазсни, 1982).

Аналіз бактерицидності сироватки. Визначали чутливість А.ріеигорпейтопіае до бактерицидної активності сч преколостральної сироватки теляти. Відносну життєздатність бактеріальних штамів у 5, 10, 15, 20, 30, 40 та 50Ф0-ній преколостральній сироватці теляти визначали після 60 хвилин інкубування при 377С. і)

Дослідження вірулентності. Свиней у віці від 7 до 9 тижнів одержували із двох місцевих стад, не вражених інфекцією А.ріеигорпештопіае, і випадковим чином розподіляли на групи. Групи свиней поміщали до окремих загонів, не дозволяючи прямого фізичного контакту між групами. Приміщення для тварин Політехнічного М зо інституту та Університету штату Віргінія функціонують та утримуються у відповідності до вимог Американської асоціації акредитації догляду за тваринами у лабораторіях. Для проведення експерименту з контрольним со зараженням штами А.ріеигорпеитопіде вирощували зі струшуванням у бульйоні СоІштбіа (Осо І арогайогіев) з с доданням 5мкг/мл нікотинамідаденіндинуклеотиду (МАС) до середини лог-фази (109 СЕШ/мл). Бактерії збирали . як 9 | «в) центрифугуванням при 7000х4 і ресуспендували до концентрації приблизно 107 СЕШ/мл у фосфатно-сольовому буфері. Свиней заражали інтратрахеально 1їОмл розбавленого препарату цієї суспензії з наступним слабким /їЇч« заспокоєнням седативним засобом Зігезпі! (Рійтап-Мооге, Іпс., МУазпіпдіоп Стоззвіпо, М.9.). Аутопсію свиней здійснювали якомога скоріше після смерті або негайно після еутаназії пентобарбіталом натрію. Ступінь ушкодження легень оцінювалась патологом-ветеринаром у відповідності до таких критеріїв: 0 - непримітні легені « (великих ушкоджень не спостерігається); 1- -1-1095 тканини легень вражено будь-якою комбінацією гіперемії, набряку, кровотечі, консолідації та/або плевриту; 2-4 - вражено 11-4995 тканини легень; З- - вражено 50-7490 - с тканини легень; 4- - вражено 7595 або більше тканини легень. Зразки легень брали при аутопсії із правої а краніально-дорсальної сторони каудальної долі і культивували на мозково-серцевому живильному середовищі, "» яке містило нікотинамідаденіндинуклеотид (МАС) для виявлення присутності А.ріеигорпештопіаеє.

Ідентифікація та клонування серотип-специфічної ділянки ДНК А.ріеигорпештопіає. Для ідентифікації та клонування ДНК А.ріеигорпешцтопіае 445, що бере участь у біосинтезі капсульного полісахариду, було здійснено -і саузерн-блот аналізи для ідентифікації суміжної ділянки ДНК (в напрямку 5), розміщеної слідом за генним о кластером срхОСВА, що бере участь у екскреції капсульного полісахариду, який було описано вище (Фігури 10а-р та 11). Очікувалось, що ця наступна ділянка ДНК буде кодувати серотип-специфічні гени, які беруть ко участь біосинтезі капсульного полісахариду, оскільки, як вважалось, локус капсуляції (сар) А.ріеигорпеитопіае бо 50 організований аналогічно до локусів капсуляції Наеторпіїиз іпПйцепгае типу Б та Меїіззегіа тепіпойідів групи

В. Для аналізу Ватні-гідролізованої геномної ДНК А.ріеигорпептопіае 945 використовували мічений що дигоксигеніном 1,2тис.пар ВатНі-Храї фрагмент рСМуУ-1С, який містив частину гена срхО. Цю срхО-специфічну пробу гібридизували до окремого ВатНі-фрагмента геномної ДНК 2У45 розміром приблизно 5,втис.пар (дані не зображено). Цей 5,втис.пар ВатНі-фрагмент клонували до ВатнНі-ділянки рОЕМ-37 із ВатнНіІ-гідролізованих фрагментів геномної ДНК 3.45 в інтервалі 5,0-б,5тис.пар, які одержували електроелюцією (після електрофоретичного розділення) із агарозного гелю. Одержана плазміда була позначена рСМуУ-11Е, і було о складено її рестрикційну карту (Фіг.1). Частина рСМУ-11 Е-вставки ДНК (фрагмент 1,2тис.пар, ВатнНі-Хваї) іме) перекривала ДНК, присутню на вставці рСМУ-1с.

Ватні-гідролізована геномна ДНК від кількох різних серотипів А.ріеогорпештопіае гібридизували з 6о 2,тис.пар ВаП-еФші фрагментом рСМУ-11Е (Фіг.1) для визначення специфічності цієї ділянки ДНК щодо серотипу (Фіг.2). Фрагмент ДНК ВоПП-5іш! розміром 2,1тис.пар гібридизувались з ВатНі-фрагментом геномної ДНК розміром 5,втис.пар від Трьох протестованих штамів А.ріеигорпештопіае серотипу 5, але не гібридизувались з геномними ДНК від серотипів 1, 2, 7 та 9 (Фіг.2). Таким чином, ДНК А.ріеигорпештопіае у рСМУ-11Є містить ДНК, яке є специфічним до штамів серотипу 5. Оскільки ця ДНК була специфічною щодо серотипу, вона, імовірно, 65 брала участь у біосинтезі капсульного полісахариду.

Нуклеотидна послідовність та аналіз серотип-специфічної ділянки ДНК А.ріеигорпештопіае. Було визначено нуклеотидну послідовність Храї-ЕсокМ фрагмента ДНК рСМуУ-11мЄ розміром 2,7тис.пар. Цю нуклеотидну послідовність об'єднували з нуклеотидною послідовністю СіІаІ-ХраІ фрагмента рСМуУ-1С та аналізували на присутність відкритих рамок зчитування, які не були раніше ідентифіковані. Нуклеотидна послідовність

Ніпанп-ЕсоКУ фрагмента рСМУ-11Є розміром З3,2тис.пар, яка містила щойно ідентифіковані відкриті рамки зчитування, наведена на Фіг.3. Дві повні відкриті рамки зчитування, позначені срзА та среВ (срз використано для позначення синтезу капсульного полісахариду), були ідентифіковані далі та на протилежному ланцюгу від гена срхО, який бере участь у екскреції капсульного полісахариду А.ріеогорпептопіае (Фіг.1 та Фіг.3).

Ініціюючий кодон АОС сраеВ був розміщений через З нуклеотиди після термінуючого кодону ОАА срзаА. Ініціюючий 7/0 Кодон ЛО третьої потенційної відкритої рамки зчитування -среС - був ідентифікований на 15 нуклеотидів далі від термінуючого кодону ОАА среаеВ. Узагальнюючі послідовності зв'язування рибосом Шайна-Далгарно (Зпіпе апа

Оаїдагпо, 1974) були ідентифіковані у межах 13 основ від ініціюючих АОС-кодонів срзА, среВ та сресС (Фіг.3).

Гаданий промотор, який містив послідовності, аналогічні до узагальнюючих -10 (ТАТААТ) та -35 (ТТОАСА) послідовностей Е.соїі/? (Наміеу апа МесСішге, 1983), був ідентифікований після среА (Фіг.3). Близькість до 75 срзАВС та ідентифікація гаданого промотора, розміщеного далі по ланцюгу, дають змогу припустити, що ці відкриті рамки зчитування можуть бути спів-транскрибовані. Вміст З-С для ділянки ДНК, кодуючої срзАВС, становив 2895.

Передбачені поліпептиди срзА та среВ складались з 321 (СрзА) та 526 (СреВ) амінокислот (Фігура 3).

Передбачені молекулярні маси СрзА та СреВ становили 36,9 та 61,7 кілодальтонів (кДа), відповідно. Графіки гідропатії демонструють, що СрвА та СреВ є відносно гідрофільними протеїнами, що дає змогу припустити, що ці протеїни можуть бути асоційовані з цитоплазматичною ділянкою А.ріеигорпептопіае (дані не зображено).

Пошуки з використанням системи ВІАБЗТ (АїЇївспш! та ін., 1990) в об'єднаних базах даних нуклеотидів та протеїнів, що не містять надлишкових послідовностей, Національного центра біотехнологічної інформації не виявили скільки-небудь суттєвої гомології між срзАВС на нуклеотидному або амінокислотному рівні з іншими Га послідовностями у базах даних (дані не зображено). Однак спостерігався низький рівень гомології (ступінь подібності 1595) між СрзА та протеїном КТЬ Е.соїї, який є О-антигенглікозилтрансферазою, що бере участь у і9) біосинтезі ліпополісахаридів (Спеай апа Маппіпо, 1993). Було виявлено низький рівень гомології (приблизно 1490 подібності) між СреВ та ділянкою 2 відкритої рамки зчитування З передбачуваного протеїнового продукту локусу капсуляції Н.іпПшепгае типу 5. Передбачуваний протеїн відкритої рамки зчитування З бере участь у біосинтезі рч- капсульного полісахариду полірибосилрибітолу Н.іпймеплае типу Б (Мап ЕїІдеге та ін., 1995). Ніякої суттєвої гомології не спостерігалось між 83 М-термінальними амінокислотами СрзС та будь-якими протеїнами у базах со даних. с

Продукування канаміцин-стійких некапсульованих трансформантів А.ріеигорпештопіае серотипу 5а. На Фіг.4А схематично зображено процедури, які було використано для продукування рекомбінантних некапсульованих о мутантів А.ріеигорпештопіае 4-45 шляхом гомологічної рекомбінації та алельного обміну. Вектор рСМУ11Еаткз1 - було вперше сконструйовано для використання як суїцидальний вектор, що не реплікується, для сприяння обміну ДНК капсуляції А.ріеигорпештопіае дикого типу з генетично-зміненим ДНК капсуляції А.ріеигорпеитопіае шляхом подвійної гомологічної кросовер-рекомбінації. Вектор рСМУ11Е ДІК5ЗІ було сконструйовано шляхом « проведення спочатку гідролізу рСМУ-11ЕЄ за допомогою Ва/!І та 5іШІ для створення великої делеції у серотип-специфічній ДНК капсуляції А.ріеигорпеутопіае. Кінці цієї гідролізованої ДНК затуплювали, і великий - с б,.А4тис.пар фрагмент лігували до З,бтис.пар ВатНі-фрагмента ркК5 (кінці якого також затуплювали), що містив ц картридж прі!-заск-засвВ. Цей картридж містив ген Тп9ОЗ прії який, як було визначено раніше, надає -» А.ріеигорпеитопіає стійкість до канаміцину (Кап') (Тазсоп та ін., 1994), і послідовності засЕВ, які надають чутливість до сахарози (Зис?) багатьом грам-негативним бактеріям (Сау та ін., 1983; Ківа апа СоїІтег, 1987).

Ділянка делеції, створена у РСМ/11Е ЛІК51, охоплювала срзАВС (Фіг.1, Фіг.4) і тому, імовірно, впливала на - продукування протеїнів з цих відкритих рамок зчитування. о Вектор рСМУ11ЕДІТК5І1 не реплікується у А.ріеигорпешцтопіае і, таким чином, функціонує як суїцидальний вектор. Після електропорації РСМУ11Е ЛІК51 до А.ріеигорпеитопіае 945 та інкубування одержаних сумішей при о 37"С протягом 2 днів було одержано сім стійких до канаміцину трансформантів. Чотири з цих канаміцин-стійких (ее) 50 трансформантів 445 не давали іридисценції при візуалізації на планшетах з навскісним напрямом світла від . джерела, що дає змогу припустити, що ці трансформанти є некапсульованими (дані не зображено). Одним із і факторів впливу було середовище, яке використовували для вирощування А.ріеигорпештопідае перед електропорацією з РСМУ11ЕЛДІТК51, оскільки некапсульовані канаміцин-стійкі трансформанти ніколи не одержували при вирощуванні А.ріеигорпеитопіде на мозково-серцевому бульйоні з доданням МАЮ.

Генотипний аналіз канаміцин-стійких трансформантів А.ріеигорпептопіає. Попередні аналізи гібридизації

ГФ) колоній для семи канаміцин-стійких трансформантів показали, що чотири трансформанти, які здавались 7 некапсульованими (при візуальному спостереженні), гібридизувались з прі-специфічною ДНК-пробою (1,24тис.пар Рзій-фрагмент рК5), але не гібридизувались з пробами, специфічними до рОЕМ-37 (1,1тис.пар

Ваї-фрагмент рОЕМ-37) або з серотип-специфічним 2,Ітис.пар Воа/І-5(шІ фрагментом рсСМуУ-11м (дані не 60 зображені). Ці результати вказують на те, що подвійна рекомбінація відбулась в кожному з цих чотирьох канаміцин-стійких трансформантів. Навпаки, колонії інших трьох канаміцин-стійких трансформантів гібридизувались з пробами, специфічними до гена пріїЇ РОЕМ-37 та до 2,1тис.пар ВоЛІ-ЗФШІ фрагмента ресму-11 Е, що дає змогу припустити, що відбувся один кросовер, і суїцидальний вектор рСМУ11Е ДІК51 було цілком в5 інтегровано до хромосоми цих трансформантів (дані не зображені). Результати саузерн-блот аналізів геномної

ДНК, виділеної з чотирьох канаміцин-стійких, потенційно некапсульованих трансформантів (з використанням проб, як було описано вище), були ідентичними, що вказує на те, що одна й та сама подвійна рекомбінація відбулась у кожному з цих трансформантів. Один з цих трансформантів було обрано випадковим чином для подальших досліджень і позначено .)45-100.

Було здійснено саузерн-блот аналізи геномної ДНК, ізольованої із 945 та 445-100 за допомогою ДНК-проб, специфічних до гена прії, 2,1тис.пар Ваїй-5(шІ фрагмента рСМУ-11мЄ та 2,1тис.пар СіІаІ-фрагмента росМУу-1С (Фіг.5). пріі-специфічна ДНК-проба гібридизувалась з 5,Отис.пар, фрагментом Хбаї-гідролізованої ДНК 245-100, але не гібридизувалась з ДНК 2.45, що засвідчує наявність маркера прі в хромосомі 945-100 (Фіг.5А).

Гібридизація прі-проби з 5,Отис.пар ХраІ-фрагментом геномної ДНК 245-100 узгоджується з розміром цього 7/0 Хваі-фрагмента у суїцидальному векторі рСУУ1ТЕДІТКЗІ, який було використано для одержання .)45-100. 2,тис.пар ВаїЇІ-еКші фрагмент рСМУ-11Е гібридизувався з 5,втис.пар фрагментом Ватні-гідролізованої ДНК 45, але не гібридизувався з ДНК 945-100, що засвідчує делецію цього фрагмента у .)45-100 (Фіг.58). Проба, специфічна до генів срхСВА (2,1тис.пар Сіаї фрагмент рСМУ-1С), які беруть участь у екскреції капсульного полісахариду, гібридизувався з 5,Зтис.пар ХраІ-фрагментом як 445, так і 945-100 (Фіг.5С). Цей результат 7/5 засвідчує, що ця ділянка локусу капсуляції А.ріеигорпейтопіде залишається незачепленою подвійною рекомбінацією, яка відбувається на суміжній ділянці ДНК. Проба, специфічна до рОЕМ-37, не гібридизується з геномною ДНК як 445, так і 245-100, що засвідчує відсутність векторної ДНК у геномі 445-100. Загалом, ці результати гібридизації ДНК вказують на те, що у 445-100 відбулась бажана подвійна рекомбінація та алельний обмін.

Фенотипічний аналіз канаміцин-стійкого трансформанта А.ріеогорпештопіае .)45-100. Оцінювали рівень продукування капсульного полісахариду у 445-100 шляхом імуноблотування колоній та аглютинації з латексом.

Антисироватка, яка містила антитіла, специфічні до капсульного полісахариду А.ріеигорпештопіае серотипу 5а, але не містила інших поверхневих компонентів бактерій, вступала до реакції з 945, але не реагувала з 445-100 (Фіг.б). Оскільки бактеріальні колонії на мембрані було піддано лізису у хлороформі, ці результати вказують с на те, що 245-100 не продукує внутрішньоклітинного або зовнішньоклітинного капсульного полісахариду. Цілі або озвучені 945-100 не аглютинують з латексними кульками, ковалентно кон'югованими з очищеним антитілом до о капсульного полісахариду А.ріеигорпештопіае серотипу 5а (Іпгапа, 1995), тоді як цілі клітини .)45 та озвучені клітини У45-С сильно аглютинують з реагентом, нанесеним на латексні кульки (дані не зображено). Ці результати засвідчують, що делеція, зроблена у сар локусі А.ріеигорпештопіае 445-100, призвела до втрати здатності ча біосинтезу капсульного полісахариду. Крім того, ці результати вказують на те, що некапсульований мутант 445, ізольований після етилметансульфонатного мутагенезу (Іплапа та ін., 1993а), а саме 9У45-С. продукував со внутрішньоклітинний, але не зовнішньоклітинний капсульний полісахарид. Га

Було проведено порівняння експресії токсину Арх та електрофоретичних профілів ліпополісахаридів 445 та 445-100 для визначення того, чи вплинула мутація, здійснена у сар локусі 245-100, на ці важливі детермінанти - Вірулентності. Не було виявлено ніякої різниці у секреції протеїнів токсинів Арх! та АрхіЇ вагою 105кДа до ї- надосадної рідини культур між 945 та 445-100 (Фіг.7). Крім того, не було виявлено ніякої різниці між електрофоретичними профілями ліпополісахаридів 445 та 945-100 (Фіг.8).

Було досліджено ріст 945 та 945-100 у Т5У-М та чутливість 945 та 945-100 до бактерицидної дії преколостральної сироватки теляти для визначення впливу втрати капсуляції на ці фенотипічні властивості. «

Криві росту 945 та 945-100 у Т5У-М були аналогічними, але не ідентичними (дані не зображено). Однак, у) с визначення титру життєздатності на планшетах продемонструвало, що під час логарифмічної фази росту й 345-10Оріс скоріше (час генерації - біля 23 хвилин), ніж батьківський капсульований штам 945 (час генерації - «» біля 28 хвилин) (дані не зображено). Рекомбінантний некапсульований мутант 445-100 був ефективно знищений при витримуванні протягом 60 хвилин у 10-5095 преколостральній сироватці теляти як джерелі живлення, тоді як Капсульований батьківський штам 945 не був знищений (Фіг.9). -і Дослідили чутливість .45-100 до сахарози для визначення того, чи можуть послідовності заскВ функціонувати як контрселективний маркер у А.ріеогорпештопіде і внаслідок цього викликати ексцизію о картриджу прі!-заскВ із хромосоми .)45-100. Вирощені на бульйоні 445-100 росли дуже бурхливо при прямому ка висіванні або при розведенні з послідуючим висіванням на Т5У-М або середовище Луріа-Бертано (І игіа-Вегапі) (до якого було додано 5 Пд/мл МАО), що містило від 5 до 895 сахарози. Присутність послідовностей заскВ у бо хромосомі 945-100 була підтверджена саузерн-блотуванням. Ці результати дають змогу припустити, що або "І зас/к5-маркер не оекспресувався у А.ріеогорпештопіде, або, можливо, леван, який утворюється заск5-левансахарозою у присутності сахарози, був нетоксичним для 945-100.

Інтратрахеальне контрольне зараження свиней рекомбінантним некапсульованим /мутантом

А.рігигорпейитопіае У45-100. Рекомбінантний некапсульований мутант 445-100 не спричинював ніякої смертності о у свиней при введенні у дозах, які в З та в б разів (145 х10/ колонієутворюючих одиниць та 2,95х107 колонієутворюючих одиниць, відповідно) перевищували дозу половинної смертності (І Ово) о капсульованого батьківського штаму 945 (55105 колонієутворюючих одиниць) (Іпгапа та ін., 1993а) (Таблиця 2). Навпаки, у всіх трьох свиней, яких було заражено дозами, що у 6,5 разів перевищували І Ово 945, розвились 60 тяжкі ушкодження легень, які призвели до їх загибелі (Таблиця 2).

Штам, використаний для контрольного Доза контрольного | Середня оцінка ушкодження 6Е зараження зараження легень тестованих

Смертність Виділення 2 яю 00000000 вив 000060000195656 ; 70 а Виділення штаму, використаного для контрольного зараження, із зразка легень, взятого при аутопсії. Аутопсію свиней, заражених 445-100, проводили через 4 дні після зараження.

Ь Ця доза у 6,6 разів перевищує дозу 5095-ної смертності (5х106 СЕ), описану у попередніх дослідженнях (Іпгапа та ін., 1993а). с Всі свині у цій групі померли на протязі 36 годин після контрольного зараження. 9 А.ріеигорпештопіаеє виділяли з легень, а некапсульований характер встановлювали за відсутністю іридисценції та нездатності аглютинувати серотип 5-специфічні сенситизовані латексні частинки. е Аутопсія однієї з померлих свиней вказувала на те, що смерть була спричинена неналежним введенням контрольної дози.

Т )45-С є хімічно індукованим некапсульованим мутантом, який було описано раніше.

П'ять свиней, який було піддано контрольному зараженню низькою дозою 445-100 (1,45 х107 колонієутворюючих одиниць (СЕ))), не виявляли ніяких клінічних симптомів, характерних для плевропневмонії свиней, і у них не утворювалось ніяких ушкоджень легень. Крім того, із зразків легень, взятих при аутопсії через чотири дні після контрольного зараження, не було виділено культур А.ріеигорпештопіае. Дві з п'яти свиней, заражених більш високою дозою .)45-100 (2,95510! СЕМ), були клінічно нормальними, і при аутопсії ушкоджень легень у них виявлено не було. У однієї свині з цієї групи, зараженої більш високою дозою .)45-100, спостерігалась помірна задишка, а при аутопсії було виявлено певні ознаки гіперемії легень та легку кровотечу су (оцінка ушкодження легень - 15). У двох свиней з цієї групи, що залишились, спостерігалась слабка задишка, а при аутопсії було виявлено певні ознаки плевриту та консолідації (оцінка ушкодження легень -25). Культури о

А.ріеигорпештопіае уУ45-100 було виділено лише з цих двох свиней з найбільш тяжкими ушкодженнями легень.

Бактерії, виділені з цих двох свиней, не аглютинують латексні кульки з реагентом аглютинації серотипу 5а.

Таким чином, виділені бактерії залишались некапсульованими, що вказує на те, що 945-100 не перетворюються - на капсульований фенотип іп мімо.

Хоч гени прії (надає стійкості до канаміцину) та ЗасВ/Заск (надає чутливості до сахарози) були клоновані со до ділянки делеції, вони були призначені для використання лише як маркерні гени. Можуть бути також Га використані альтернативні варіанти маркерних генів. З причин, пов'язаних з охороною здоров'я та безпекою, може бути бажаним уникнення використання антибіотик-стійких маркерів, таких як прії, або створення механізму о

Вилучення або інактивації антибіотичного маркера. Придатні не-антибіотичні маркери можуть включати стійкість ча до ртуті.

Некапсульований штам Асііпорасіїйшз ріеигорпеотопіде серотипу 5, одержаний згідно з описаною вище процедурою, продукує лише два з трьох токсинів, які виробляються Асііпобрасіїїиз ріеигорпеотопіае. Крім того, що модифіковані Асііпорасіїйшз ріеигорпеотопідае мають захисну та імуногенну дію, вони можуть бути також «

Корисними для клонування до ділянки делеції гена третього КТХ токсину. Це можна зробити шляхом клонування 8 с гена токсину КТХ до касети гена канаміцину штаму 445-100, тим самим інактивуючи ген канаміцину. й Вакцина повинна бажано бути виготовлена у формі, аналогічної до інших вакцин, добре відомих фахівцям. "» Бажано, щоб вакцина була закупорена у вигляді ліофілізованої мікстури, і вона може включати один чи кілька серотипів мутантних штамів. Для збереження життєздатності може бути додана речовина, така як бульйон Соіцтбріа, трегапоза, або альбумін, гліцерин чи деякі інші агенти. Треба буде лише регідратувати вміст -І ліофілізованої мікстури стерильною водою або сольовим розчином та зробити ін'єкцію (внутрішньом'язову, внутрішньовенну, інтраперитонеальну, підшкірну і т.ін). Композиція вакцини може бути також сформульована і ші для інших шляхів введення (наприклад, перорального, трансдермального, сублінгвального і т.ін.), з ка використанням відповідних матриць носіїв (наприклад, крохмаль, полісахариди, масла, ліпосоми, смоли і т.ін.).

Доза вакцини, яка вводиться тварині" буде залежати від таких факторів, як вік або стать тварини, а також

Со спосіб введення. У всіх випадках, треба забезпечити введення достатньої кількості живої авірулентної "І некапсульованої Асііпорасійиз ріеигорпеотопіае для викликання у вакцинованої тварини імуногенної реакції.

Вдалі результати було одержано при 2 імунізаціях по 10 колоніеутворюючих одиниць, проведених через інтервал часу від 2 до З тижнів.

Хоч даний винахід було описано на, прикладі варіантів втілення, яким надається перевага, фахівцям у цій галузі зрозуміло, що винахід може бути використаний з певними модифікаціями у межах духу та обсягу

Ф, формули, що додається. іме) 60 б5 наш рії вк шо ще 2 | ! Ре ре сов, тає и М й в що БА тисхлар кеша кі Б ох що 70 2553 г 15 с . її . 1 с зи со фіг. уче пі м -

КОСООКОСТІ НКТ СТ САЄНКО те

ТКС НЕДОК ВАСТИСТ АСК НСАНСВНТАКСТКТю

Шщ.

ПОТОВКТИ « -10

РКК ТАТО ТАТА ТЕСТ ІСТОТА ОСКАР САТАКТОАТОС щ о, с т са 1511 й ОСТ ТКТТТНОКЕНТТО МСЕК КЛАСТИ СТАТТІ ТТЕОИКТ ве 2 " СГІЕЕТЕРЕВІО5ФІ 55 І ЕТ ТЕ КРЕНІЯ

ВОЛОС НСС ТТК САТ НОСОК СИМ ЛКТИС КМ СТЕК, «УФО ІРЕБИИТЯАТЕВРН(ЄЄСК(І РК СТІВА -іІ ВСАА ОСА ОЛОС НОСОВА ТАТА АТС ав) БРІРІТЯІІТАСІРЕТИ ІБ ВІКИ ГКІ

СОПКО ПАСТ СТОКТОСТЕНОСКТАМ СКАТ СНКТЬНК ОСПСКСКОМКТНТК у, ко Й і І

ІТК нсТ ОКУ ТИХК 1551117, о 20 ОБМОТАТИ АКТА ТОМ ТАС ТТ ААТОСАСАОСАТТТАМЛТАТТЬТСЇ що -ч сіф5фФТ ск фгфоАТЕс НІК, РТС

АСКТЕНТ КТС ОСС ТОСТИ ТЕСТЬ ТЕСТИ до

КВЕЗТ5КІГИ0ВІСТЕХКЕТТЕ КІР ТУ 05 КІ

ООН СТЕ ОСТ ОТЕСТК СЯ ОТ ТЕКСКОСТМК ТКСИКСЮКЯ ех пкннТТТтТТТнТнТиннтишни

УСІ ИС55АЕССРАКІРЕІ ІСТ РІЗКІ ІК

ГФ) СОСКА ТЕКСТА ОКА СКОКТНК ТТЛ ко ВТІК ХІІІ ЕЕВРОІОАЕДІКРІКІ(ХРИІЕЕ

АТАТМ ТИСА САТ СКС СТАС АКТ ТЕС ТТ АТП А МАКПНОСЯТМу565 во ІВ ГІ ІК Р5ІІЗ ЖЕК ФО КІ УТІК

ТАТСТОСА СТАС ОСТ ТКС АТ ХАТА СТЕТАСТ СТОК АОАААТАААТЬНАТАНСАТТІ 70

С058 -- ст гТУРІТІ ВІК РІЗ ЕР5ТЕЕФКТІВТКІ

МАКИ ТАСАТАТИСС ТИСК ОЄСТАТСТАТА СС ЗАААТАСАТА СПАТИ ОСТ 1575

ГККИфОЯІ5іІ ТТ 5 КЕ ІТ СКІФ ТІ ЕСЕ 65 ФІГ. ЗА ри

ЗАКПТОСТТТСТО ТАКА АТЛАС ТОААТАЛАТЕ ТАТА САС САТ ТАКТ АТОСТА ІБВО І шими ше шмат шле шин

КТААСТААОА САЛАТ КАСА ТС ТАТА АТОМ ТЕААТА ТОСТИ КА АТО ОА СТЕМИ АОС п 95 ІЕТЕСІТ КТК АТТЯУ АВ

ТАТКО ТА САКТСТСТОКТ ОТО САС ЛТАВА ТЕ ТАТ САТ ААААТАТА САС їхо

ЗЕ не уві: Еріх ТІ1

ПАТОКА ТАС ВАТ ТАТО АТЛАС ПА ГСАКМ ОСТ ААТА СА ТАТ АС ТАССТАТ ТАТ ТТАТА що

ТЕГІВ СЕТ 551и15 1

ААМСАТТ МТ СААКО ОДАТА ТАТ ААРОН ОАЄ ВАТА ОСТ КТ ОААААКТ АТС АСТеАГСТЬ п

ГКТЕ Зх 5 Ток икаІкк т І уУКкИКНУуУ (А! В;

ААКАТТНСТА АС АААСАК ТА ТАСТА КАСА ТОАТАНАТОА ТА СТАТ А АТАКА зів

ГІРКО ХРІІТНИІСФІІКВРЕКІЄТ КВІТ

ВАКАНСІЯ ААТССА ТАКТ ТАС ТАЛА СОС ААДАКТААТ АСОСТАСАТЬ ТА, й

ІТК: ЗІ Ес УУЕХКРАеРУЄЕККИНІИ І

СТАКАААТАТАА АКА ТТ ТАЛАН ТАКСТБААТС САДКА ТАТА САТОАСТАТСААТАААСААА ПАТТАМАСАКТСТ в

Тік ТЕР ККиТТ Касир

ДТЕК ТЕТ АКТИ ОВ ТОСТИ АТАК АЕС ТМ АВАНС хі

Гл чнч неУК ШЕ КИ ЯК М МИ СЛ Зк А ДК ЖИ МИ М А В ВЕНИ ЧИ МН

НЕСКПАТСАЄ ТТ АОАТА ТАТА ЕССТАКТСАСТАСТАСТАААТАААЄ ТАС ОСА СПАСА СТВА ТО АТС 5

ТІТОВ ФІ УБВЕТУЕКІ ТЕЦ ЕРЕВАН

ПАСТАТАТК ТАС СТАС ССС ТТАТСТАОМАТАТТААТТАСТАСТАТТ АТАКА ло -- - - - - ж Я «Я Я ло

ІТ І ЕКЗ У МІЯ! РЕКІРТІІРІУЄК

ТИССТА ОСТАП АНА СААТСТТАТАТОТ СА ПАССТААСТАПОЄ яв

ІРЕСКІКІІТЕРТОКОТУЕТ ЕІ ТІЯИУЄІРКТУ с

ВААСТЕК АНА ОСА ТАЗА САТ САС ТЕСТОВА ТТААТОТАТИТТССТ 2

ПК ХЕК Океан АТІА У о

КАТА ТАТА ТСТААТТАТСТ КАНТАТИ ТАТ ПАСА АВ АсАТ ОЇ АТС ТАТТТАСАТЕА з

ТК. бе КІТ аВІв икіаг 55 ІКТ»

СОСКА ТЕСТ АТС ТИС ЛСГ КСАМАС ТАТА ТА СТАС, чо М

ІСКІЗІ КІС ОІТ ЕІ АТІКА

ВТТККЄКОСАТТ НКТ АТМ т со

ТУТ ЕКС ЕК КІ

ФІГ3В сч (ав) в. 95/10

Вон Вс/ / боті й « у ДЕ сок о / пи с І РОЖАНЕ сова | ' в 8.54ко ! й Б ; т Х іх 5осе й срес, за в зосА р сш ееорое

Вотні " Ботні їх п, їз з ВОЛІ та ебші п із з Ватні ї ідроліз з і Н ідроліз з Ватні та виділення і виділення ча гелі та ДНК лігаза на. тет фрагмента ЗВ тис пер (ав) фрагмента 6,44 тис.пар / ( юю (щ8В5-7)

ДИ ї (Ввий/Ватні (бш/Зотні) (ее) зас щ ії (Мм-кінець) (С-кінець),

РОМ ЕЛІ КБ

10.24КЬ

Очищення центрифугуванням

Фіг. 4 І! у градієнті СвСї та " електротрансформування до

ГФ) А.рівигорпеутопіае 145 ко щу сере нВє» іх Подія .

Но вс анкет се снй рекомбінації капсульний полісахарид бо Висіювання на триптизованому соєвому ' середовищі/0,695 дріжджевого екстракту/ /МАр/канаміцин (85 мкг/мл)

Відбір Кап-трансформантів за ознаками: 1) відсутність продукування капсульного полісахариду (імуноблотування) 2) наявність маркерів прі! та зас-КВ (саузерн-бпотування) 3) відсутність фрагмента ДНК 2,1 тис.пар Вай/зші (саузерн-блотування) 4) відсутність послідовностей вектора ОСЕМ-32 (саузерн-бБпотування) б5 ще т їх кре росуеіовокрвовк ов сою І я шо. о ки о пеки сон, в пен сь. хх НІЙ

І ШИ вже, 001

Шк ША жив. г. ж й я у ше. і ния ЗЕНеУ скупий ки НИ те ТОННИ а ШИ с ЕЕ Ії

Е т хе п її і. п КВ я шо Ай

Я. в. ЕЕ не з Й А пен х она я, і ШИ «1 " БшШШнНи й г. пиши ше пе а

ВИШ нн майно 5 ковані са: ік жикрией ні і за НЕ ЗДАНИХ З

Ще і ФІГ. 5 т а. и . - ев ПВ В ех че

Мі нн и ОН ОН неї ел в и СТОПИ ка я ее Е ЗИ

НЕ вия дв ми Кк пе моя Й о вв ен и КЕ НАВИ, пода к ле пи ше. пн ою о пе ве М пи ей екв оо ж ЖЕ и ЕЕ Ка ї ен в а «ї сни ек о пня в ев я З ї Ба шо р тестер я кре та м в и а ОНА но : я М ук я де ЕК Я

Бен и ЕК КИ крики Нову М

ВИД еко о ВЗ НН ПОКИ оо НВ каш нн НН ЕН ч Шо: ооджкі мон и р й 2 в в в о ШИ не и

КИ п " па МК м я Мине прп веКЯ я вк я А НН у Те я ЕК АЕН

М АЛ ЖК и в ве ШИ я Я УК т дних КК й М ке вми ово ВИНИ Я

ОБ а АН й оййе ММ в ве ов пи а : шо и

І Шифр а й НН КК КВ

ЕК КВ А и а в:

Ше ов вн, нн в

Ши с ПН В а («в») -- 0 НН с ен ЗВО ОВ Й ПОЯВИ КО я ПАТО та 00 НН с СБ т ОДВЕ ка зов В ши ко жо дв Й ат СЕМ Мр лу и оо Й дою ій о. ес со А НК ше ши вх Пк ШК во о кот В ше» (Фе) Мои ЕНН войінти ВЕЕ ЕК ев ОЙ

Бе Жббувевенк 5 Е пн ак

М меш с ИН 5 ні я ет пліви ВОК м нний . МО же ве око вх во о. пр ие Кия о а

ЯКІ ШЕ о ол аа

Що и а МО а Я

Я доле НИ Б до «ода МЖК пн в в : ПИШЕ я Де ок в я о в и Ат о ШК А НК УКВ «й нак с ку ни ен НН НН

ИН мин а Б з Ман а в и ші

Ту дано т шк ШИ.

А А и я ско

БОТКН сни ро ле Ден з

РОЖЙ сей Бо злети ши ших

Ко да ий ДИКЕ меню дня й Кв с в г «ди ее Кн вами чи - т, ' ли . Ше ще « . Й ю ЕЕ. й З з» Я м : Ше о й 7 р о 100 , ї- й со дю

Е --- 5 с я - 345-100 о

Ф 60

Е

5 м. х 5 . (8) Я й й « 20

З с : . М 1 т т Т т "» 1о юю пи Бо

ВІДСОТОК ПРЕКОЛОСТРАЛЬНОЇ СИРОВАТКИ ТЕЛЯТИ

75 ФІГ.о -І о

По) со що

По) бо б5

СТАС АСК ТАК ПКС САСТСК КТС ОКСАНА ТАТО СТОЯТИ

СТАС СА ТААК ТТГ ОСС САТАААТАТАААТ СА САААТТТАТСААСТАТС ТАС САС ТО ССТАТ ТАТО ї-

ПААКТТАТАКТСТ ТАТІ ТАТААСС ОСС СТСТСАТТТАСТТТ ТТ ТААААААААТАСАТ А ТАКТ СТАТ т мані ЩО

ТАТПАКПТСТСТСАТАЄСТААС ПАТТАЛААТСААТСТТАТЬ ОСА ААСАСАТАССТАТАТАЄТТТАТІССТТАКТАТА що

ПЕМСАСААА ТАТ САААСТСАТСАААСТТАСАТТАСТОСТТТС ОСС СТОоТ СТАЄ ТС ССО сс - шо атаку я 5 сі і МК 5

АСТТСАССС СТАС ТАТО САТ АБС СТААТ ОСА САС ТАВАССТТ ТАС СОСКА ТАТА СТАТ щй

І5ре5кІаІ1 КИ: ОК5 ВІРУ:

АКТОССПАСТАСА САС ТТН САС САААСТ С АКТИТОСС ТЛАСССАСОСС ТО ТОСТ АТО ООТ ня усі: х8199500Р5; І стАсССЬСТ

СООСТСАА КТС ТОП АТТСАК ТТ АССОО САС ССС ТС СОТАТПАС ТС ТСАОСОСАА, то

КУКуУбВТІІ5 І ЯЕКРРАУМІЕССТРІ:

ССТАСССОССА ТАС ТАС ААТОС ТВА САН ОТОССТТАСТСТОС СС ТТ С КОССТААТАТССТЬТОСА зо сІсні с: ссірРкОокухаксі Тир уЄКІКТ

СТАДА ССС СВІТА ОСС ТС СТАС САС ОСС АСТАТТАСТМАЛАТСЮСМ чо сф рьиаифвіусїавкАХОоУЄМТХ

МКМСТЕТОС ТОК САС ПАТО НСС ТАКТ ПОСТИ ССО ТРАС ТОСОАТМ СМАССТОТО ПАСКИ ккса Ву каска АНКСТТУ"ОЬ

ССАОСАСТИ СТАС АТА ОМ СО СТ АСС СТ КАТА ОТО СТО ААААСАТАСОСТТТОМАСТ що ри стІс:втЕВУєУХ( ТВ 0ВУКТІА ЕТ

СТАТ СБОССс АВ ТАПАТСТАС Є ОСС САТЕТОЄ ТС ТОСТ АСИСТЕНТ ду

ІІТ ВРАвКІКІКАСОМУИ5(ІКТВУЗАТСЕС

СООСТОСО ТАС САС ААТСА СТАС ТИССА ТАС ААССТАТОСТААСАТОО ОТО СТТТОКТАТ по се 29 куска ктт5 5 сітку Го)

ССЛОССАТО САС ОЄСТАТССТСТТО СТАТЬ ТААСГ АСИСТ АсАТ ОСА САС п 50 КСУЄУЕАНУРЕ( 5 вОо0гОосАКЕ

ТАТОСТАТОССТАТО АТ ОТАС САС ТАТО ТВА ТАТА СОС АТСАС ТОЇ ГИТАТТАСААС С ПССОСАТОСАА, що

Тиса ртвтітуауК: ЕР (Гг І 042 - зо САТАААСАТАЛТІСТСТА СТАТ САААТОСАС ОСТ СТО СААТТОСАААААТ ТС САСААТСА ТТ СТАТИС ПОС СОССТАС «у

ВЕУ У КІ РІ З РРОКЕ(ИМІТИІ 09

ФІГЛОД с (ав) - - с . и» -І (ав) ко (ее) і ко 60 65

АСТАССАСТААТ СТАТ ССТОС СТАЛА АТАТ ОА ТТ АТАКА САС СТАТ СОТ ОСА АС во ше щи же ша що с-г тт АВР ЕК

НТИСНАНССТСПАААСЕННДАМАЄ ПОС ПАААААССТТАН СС ПАЛТІСССЕ СТІНОК ТОСТАС СТАТИС уекРУкКОх КЕ К ТУТ укІтТУ1

АБССТИТАСТОВС СТЕП СОСАТА ТАТА ТО ОКАТСААССТТСЬТОТААСАТСТО СТ СААААТСАСАССССТТААЄ 180

МЕТРІ 51115Е55Р/Аа0нОТ:І

ОСОТОТЕОоТо С ПАПАСАС ОСОБА СТ ОСА СААСАТОМАС ТАТА СТАС ААСААТА ТАТКО що суУск1І1 00565 вАОвоВТТ: вс УНАТІ

АСТАСААСАСТ ТАТО ТОССАТАССТ А АЄ ТАТА ААТС СОС САТАНА ПТК що

ЕТ ВВ. ІЕЕ Тс їкАЄКСРСК

ТААТАСТАЛА САД СТ ТТАТАААТАТ ТО САС ОСТААСТ СОС СТЄ ССС САОСТАССТАТОо --6щ--- ШИ ОЙ

Кік ТКІ г фЕ0215У79515615511

ОСКЕПААС СОС ААС АСОМ ТТ ААТСАМАК ТАС ПСО СС САААСССТАТАЄС СТ АААССААССТОСААС лі гар баб:кок ії АРгЕсСЕтТ кафе

МАМСМТАЄХАТ САТ ССС ААОСВО ТАС АААТАМ СТАС САС ССАААТОК ТТ ААСТАВАТАСОСТАТ пе оті гАЕФАЧТЕКЕНКНУКЄТЕКІ КТК

СААААКТАААА ТЕТ ТАС ААТ ССО Со САС ТОК АКТТОСАСС САМА СОААТТОМ СОТ СТАВАЛА з (ут іг019455751511 95 5

АСАКТТОССТСААПЕССААТ СТАТ СА Сов САСААСТТОАТОСАТОС ТАТО СЛАААААСТ ПАСОТААОСАААТОСА кі гі с' тавхв ау яв охі які

ТБАССМТ САЛАТ С САСТААСАСТ АТАК ТАТО ТАТО СА ПАССАС ОСТ ТАТ ОСАДАССАЄСТ БИ я шк шк ше шк пе ше ЖИ и в п п в Я м М о и МИ УНН

СЕС АС АОКЛ НСС ТКА ССО СОСЕН ТТСВАСТАКТСК ку

ІІІ 151 0К1ІКЕгІОЕОд ТІ

ТСАВОСААТ САС СС САСТ ОБО ААСАССС ТАТО ТАТАТААТАТТТАССАСАТТСТ ТАТСОСТ СТАТЬ ПТАТОСТОЇ ло

ПО КооЖАСЕРТУВІУНІ АРІ ТУ

КПМСТІТАТАМТ ОСААСС ТАС САСААСТАКТОСААТАС ОТО САТ СВТ ССС шин ше ни и и МИ М пе сч

Фа- и со011Рк0о5( 1 о

СОТ ТОВ АТАСТСАТООСо ВАТА ПАСОСЬТТ АС АСОААААААТТ ТОЮ ТТ ПАТО ГТСТОАВОЬ 280

СЕТІБ6 ЕІ ЧЕ ЕЕТІТ ЕТ СКС ЖІРИТ

СТАПАСТСАЄТТТА ТАТО ТТ ТСАТОТСОЛААЕ ТАТ ССО ПТОССАНТАААТАНАТ ОСТ ТСТОАГАЄС хв

ІІТЕРІ ЯСЕН ЖК КАВА ану

СОПАТССААТОСССАТ АТО ССС СТАС САС ССС ТАТ САТ ССС ОАСТАТСТТАТСАТОСТААТ хв о стві ні КАТІ СК тв со

СПСОСТАТТ АСАТАСС ТАС СТО ТЬ ТОМ АС А АО ТО АССАТТ С САААТСАТАКТАТОССАТАСТОМТ зво

ТЕТІЕЗТІгЕАІЗ І ЕУ САТ вх с

ФІГЛОВ

«в) і -

Ватні їсоні, з що - їй ВІ

Хо Но Ніс Сів! Мічі Міс! сам Со дек вої «

Ї

10 2.0 30 40 5.0 тиспар - с срхо срхс срхв срхА . о ШИЕЕДЕВ

ПРОБА

ФІГЛІ

-і («в) ко

Claims (1)

1. Формула винаходу ге» ШИ

   1. Вакцина для імунізації свиней проти плевропневмонії, яка відрізняється тим, що включає авірулентний "м некапсульований мікроорганізм Асіїіпобасіїййз ріеигорпеотопіае, при цьому у вказаного мікроорганізму відсутні ДНК-послідовності, що кодують біосинтез капсули, та вказані послідовності розміщені вище від сайта гібридизації для ВатНі-Хра! фрагмента рСМУ-1С або розміщені вище від гена капсулярного експорту вказаної го бактерії.

   о 2. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний ген капсулярного експорту являє собою срхо.

   З. Вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що Асііпорасійшз ріеигорпеотопіае представлена серотипом 5.

   ю 4. Вакцина за п.1, яка відрізняється тим, що у мікроорганізмі відсутні фактори вірулентності, вибрані з групи, що включає капсульні полісахариди, пептидні ендотоксини та екзотоксини. 60 5. Спосіб приготування вакцини для запобігання захворювань, спричинених Асііпобасіїїиз ріеигорпеотопіаеє, який відрізняється тим, що включає наступні етапи: ідентифікацію ДНК-послідовностей, що кодують біосинтез капсули у вказаній бактерії, при цьому вказані ДНК-послідовності для біосинтезу капсули розміщені вище від сайта гібридизації для ВатНі-ХраІ! фрагмента рСМуУ-1С; а також делецію вказаних ДНК-послідовностей для біосинтезу капсули для одержання некапсульованих мутантів вказаної бактерії. б5 6. Спосіб за пунктом 5, який відрізняється тим, що Асііпобасіїїшз ріеигорпеотопіае представлена серотипом

   5.

   7. Спосіб імунізації свиней проти плевропневмонії, який включає етап введення вказаним свиням імуногенної дози вакцини, що містить авірулентну некапсульовану бактерію Асііпобасіїййв ріеигорпеотопіаеє, в якій відсутні ДНК-послідовності, що кодують біосинтез капсули, при цьому вказані послідовності розміщені вище від сайта гібридизації для ВатНі-Хва!ї фрагмента ресму-1с.

   8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що Асіїпобасійив ріеигорпеотопіаеє представлена серотипом 5. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 10, 15.10.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і 7/о науки України. с щі 6) ча (ее) с «в) і - -

   с . и? -І («в) іме) ге» ШИ що іме) 60 б5