PL186728B1 - Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej - Google Patents
Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnejInfo
- Publication number
- PL186728B1 PL186728B1 PL97330863A PL33086397A PL186728B1 PL 186728 B1 PL186728 B1 PL 186728B1 PL 97330863 A PL97330863 A PL 97330863A PL 33086397 A PL33086397 A PL 33086397A PL 186728 B1 PL186728 B1 PL 186728B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- pleuropneumoniae
- dna
- fragment
- envelope
- serotype
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 13
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title description 6
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims abstract description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims abstract description 8
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 63
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 39
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 39
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 39
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 claims description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 claims description 4
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 claims description 4
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 claims description 3
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 claims description 3
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims description 3
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 claims description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 12
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 4
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 abstract 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 abstract 1
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 76
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 76
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 19
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 19
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 19
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 101100005430 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) cpsA1 gene Proteins 0.000 description 12
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 12
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 101150091586 cpsC gene Proteins 0.000 description 7
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 7
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 101000657454 Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-I toxin determinant A from serotypes 1/9 Proteins 0.000 description 3
- 241000178944 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 5 Species 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 101100491553 Escherichia coli (strain K12) arcA gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 101150095807 cpxA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101100379376 Caenorhabditis elegans apx-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100288094 Escherichia coli aphA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 description 2
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- PLKATZNSTYDYJW-UHFFFAOYSA-N azane silver Chemical compound N.[Ag] PLKATZNSTYDYJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000122975 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1 Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 101100437444 Haemophilus influenzae bexA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437448 Haemophilus influenzae bexC gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437449 Haemophilus influenzae bexD gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 101100309441 Lactococcus lactis subsp. lactis sacR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 229940124867 Poliovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010037368 Pulmonary congestion Diseases 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N azaperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCN(C=2N=CC=CC=2)CC1 XTKDAFGWCDAMPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150090146 bexB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150114385 bexD gene Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940029583 inactivated polio vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004170 methylsulfonyl group Chemical group [H]C([H])([H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 101150115143 shroom2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Szczepionka do im m unizacji sw in przeciw ko zapaleniu pluc i oplucnej, znam ienna tym , ze zawiera niezjadliwy, nie majacy otoczki, organizm taki jak A cti nobacillus pleuropneum oniae, Pasteurella m ultocida, Pasteurella haem olytica Iub Pseudomanas aeruginosa, który jest pozbawiony sekwencji DNA kodujacych synteze otoczki zlokalizowanych zgodnie z kierunkiem transkrypcji za m iejscem hybrydyzacji fragmentu Bam H I-Xbal pCW -1C albo za genem eksportu otoczki bakterii. 2. Szczepionka wedlug zastrz. 1, znam ienna tym , ze organizm jest bakteria A c- tinobacillus pleuropneumoniae. 3. Szczepionka wedlug zastrz. 2, znam ienna tym , ze genem eksportu otoczki jest gen cpxD. 4. Szczepionka wedlug zastrz. 1, znam ienna tym , ze organizm jest pozbawiony czynników zjadliwosci obejmujacych polisacharydy otoczki, endotoksyny Iub egzotok syny bialkowe. 5. Sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania chorobom spowodowanym przez Actinobacillus pleuropneumoniae, znam ienny tym , ze identyfikuje sie sekwen- cje DNA syntezy otoczki u tej bakterii, które sa zlokalizowane za miejscem hybrydy- zacji fragmentu Bam H I-Xbal CW-1C, a nastepnie usuwa sie sekwencje DNA syntezy otoczki otrzymujac nie majace otoczki mutanty tej bakterii. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są szczepionki stosowane na ogół w weterynarii, do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej.
Szczepionki są preparatami stosowanymi do zapobiegania szczególnym chorobom zwierząt i ludzi poprzez indukowanie odporności. Dokonuje się tego przez wystawienie pacjenta na działanie antygenu danej choroby, co powoduje, że układ odpornościowy pacjenta wytwarza duże ilości przeciwciał. Obecność przeciwciał w krwi pacjenta chroni go przed późniejszym atakiem czynnika powodującego chorobę. Szczepionki mogą być złożone albo z podjednostek czynnika, albo z samego czynnika, żywego lub zabitego. Na przykład w zapaleniu istoty szarej rdzenia, nazywanego powszechnie „polio”, zapobiega się typowo przez doustne podawanie żywej, atenuowanej szczepionki wirusa polio, co jest powszechną praktyką przy leczeniu dzieci, albo przez podawanie zabitej, dezaktywowanej szczepionki wirusa polio, co jest powszechnie stosowane przy leczeniu dorosłych, ponieważ u dorosłych jest wyższe ryzyko nabycia polio od żywej szczepionki. Jeżeli ma być stosowana żywa szczepionka, to jej zjadliwość musi być w jakiś sposób atenuowana, gdyż w przeciwnym razie wirus w szczepionce spowoduje chorobę zamiast chronić pacjenta przed chorobą.
Szereg chorób jest spowodowanych przez bakterie mające otoczkę, w których otoczka bakteryjna, będąca warstewką polisacharydu lub polipeptydu podobną do gumy, na zewnątrz ściany komórki bakterii, jest konieczna do patogenezy. Świńskie zapalenie płuc i opłucnej jest jednym z przykładów, a do czynników zjadliwości Actinobacillus pleuropneumoniae, bakterii, które powodują chorobę, należy polisacharyd otoczki, endotoksyna i egzotoksyny białkowe. Świńskie zapalenie płuc i opłucnej jest jedną z głównych chorób oddechowych wpływających na produkcję świń na świecie i jest odpowiedzialne za miliony dolarów strat rocznie w przemyśle w samych tylko Stanach Zjednoczonych..
186 728
Z amerykańskiego opisu patentowego Nr US 5429818 Inzany, włączonego jako odnośnik, znane są nie mające otoczki mutanty Actinobacillus pleuropneumoniae, które sąniezjadliwe i zdolne do zapewnienia doskonałej ochrony przed wystawieniem na atak bakterii zjadliwych. Niemające otoczki mutanty opisane u Inzany przygotowano drogą mutagenezy etylometanosulfonianowej. Jednakże takie postępowanie ma niedogodności polegające na tym, że niektóre samorzutne albo chemicznie indukowane mutanty mogą być nietrwałe, a natura mutacji jest nieznana.
Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie bezpiecznej i skutecznej, żywej, atenuowanej, rekombinacyjnej szczepionki przeciw chorobom spowodowanym przez bakterie i grzyby, które normalnie mają otoczkę, i w których otoczka bakteryjna jest konieczna dla zjadliwości, ale nie ochrony immunologicznej.
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej. Szczepionka ta zawiera niezjadliwy, nie mający otoczki, organizm taki jak Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica lub Pseudomanas aeruginosa, który jest pozbawiony sekwencji DNA kodujących syntezę otoczki zlokalizowanych zgodnie z kierunkiem transkrypcji za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamHI-X?fl/pCW-1C albo za genem eksportu otoczki bakterii.
Korzystnie organizm jest bakterią Actinobacillus pleuropneumoniae, korzystnie genem eksportu otoczki jest gen cpxD. W innym rozwiązaniu korzystnie organizm jest pozbawiony czynników zjadliwości obejmujących polisacharydy otoczki, endotoksyny lub egzotoksyny białkowe.
W innej odmianie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania chorobom spowodowanym przez Actinobacillus pleuropneumoniae, w którym identyfikuje się sekwencje DNA syntezy otoczki u tej bakterii, które są zlokalizowane za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamHI-XbaI CW-1C, a następnie usuwa się sekwencje DNA syntezy otoczki otrzymując nie mające otoczki mutanty tej bakterii.
Zgodnie z wynalazkiem wytworzono rekombinacyjny, żywy i atenuowany szczep Actinobacillus pleuropneumoniae, który poddano modyfikacji genetycznej w kierunku pozbawienia komórek otoczki bakteryjnej. Ponieważ otoczka jest konieczna do zjadliwości, lecz nie ochrony immunologicznej, to szczep będzie użyteczny jako szczepionka przeciw świńskiemu zapaleniu płuc i opłucnej. Szczepionkę wytworzono za pomocą sklonowanego wektora plazmidowego, który nie może ulegać replikacji w A. pleuropneumoniae. Poddano sekwencjonowaniu geny eksportu i syntezy otoczki A. pleuropneumoniae serotypu 5. W klonowanych genach syntezy otoczki wprowadzono dużądelecję, a następnie do poddanego delecji miejsca wklonowano geny kodujące odporność na kabamycynę i wrażliwość na sacharozę w celu posłużenia się nimi jako genami znacznikowymi. Taki samobójczy wektor wprowadzano stosując elektroporację do zjadliwego szczepu A. pleuropneumoniae serotyp 5, w celu uzyskania rekombinacji homologicznej przez podwójne krzyżowanie pomiędzy obszarami homologicznymi chromosomu i plazmidu. Uzyskano cztery izolaty, z których każdemu brakowało irydescencji, co sugeruje brak otoczki. Brak otoczki i obszary delecji genów otoczki potwierdzono w jednym szczepie odpowiednio metodą biotu punktowego i blotingu Southerna. Potwierdzono także obecność genów znacznikowych w szczepie rekombinacyjnym. Nie można było zidentyfikować żadnych innych zmian właściwości fenotypowych, a genów znacznikowych nie znaleziono w innych obszarach chromosomu. Szczep rekombinacyjny, oznaczony jako J45-100, był bardzo wrażliwy na surowice, miał zmniejszoną zjadliwość u świń przy 10 czasach 50% dawki śmiertelnej dla szczepu macierzystego i powinien zapewniać ochronę świń przed zapaleniem płuc i opłucnej.
Niniejszy wynalazek będzie użyteczny przy wytwarzaniu szczepionek przeciw ustrojowi mającemu otoczkę, który wytwarza toksyny albo inne czynniki zjadliwości, a otoczka jest konieczna do zjadliwości, ale nie do ochrony immunologicznej. Wszystko, co będzie konieczne, to klonowanie genów kodujących syntezę otoczki ustroju, delecja i zastąpienie odcinaka klonowanego genu genem znacznikowym na wektorze samobójczym, a następnie wprowadzenie wektora do żądanego organizmu i wybranie genetycznie zmodyfikowanego organizmu, który jest pozbawiony otoczki. Wynalazek powinien być uzyteczny przy wytwarzaniu szczepionek dla innych bakteryjnych organizmów zakażających, takich jak, między innymi,
186 728
Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica i Pseudomonas aeruginosa, jak również grzybów, takich jak Cryptococcus neoformans, który jest patogenicznie związany z zespołem nabytego niedoboru odpornościowego (AIDS) u kotów i ludzi.
Opis rysunku
Powyższe i inne cele, aspekty i zalety będą lepiej zrozumiałe z następującego szczegółowego opisu korzystnych rozwiązań wynalazku w odniesieniu do rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia mapę fizyczną DNA wklonowanego w pCW-11E, z obszaru syntezy otoczki A. pleuropneumonia J45. Przedstawiono lokalizację i kierunek transkrypcji dwóch pełnych ORFów (cpsA i cpsB, wypełnienie stałe), zidentyfikowanych drogą sekwencjonowania didezoksy. Pokazano lokalizację częściowego, trzeciego potencjalnego ORF-u (cpsC). Pokazano także lokalizację i kierunek transkrypcji niepełnego genu cpxD exportu otoczki, umiejscowionego w tym fragmencie DNA. Pokazano fragment Bg/II-Stul o długości 2,1 kb, stosowany jako sonda DNA. Wypełnienie kreskowe pokazuje niepełne ORF-y; na fig. 2 przedstawiono analizę blotingu Southerna genomowego DNA z A. pleuropneumoniae, hybrydyzowanego ze znakowanym digoksygeninąfragmentem Bg/II-StuI o długości 2,1 kb z pCW-11E. Trawiony BamHI genomowy DNA ze szczepu 4074 o serotypie 1 (tor 1), ze szczepu 1536 o serotypie 2 (ścieżka 2), szczepu J45 o serotypie 5a (ścieżka 3), szczepu K17 o serotypie 5a, szczepu 178 o serotypie 5 (ścieżka 3), szczepu 29628 o serotypie 7 (ścieżka 6) i szczepu 13261 o serotypie 9 (ścieżka 7) hybrydyzowano za pomocą sondy, jak opisano niżej. Pokazano ciężar cząsteczkowy hybrydyżujacych pasm (w kb); fig. 3a i 3b przedstawiają sekwencję nukleotydową fragmentu HindIII-EcoRV o długości 3,2 kb z pCW-11E, zawierającego serotypowo specyficzny DNA z A. pleuropneumoniae J45 (Seq. ID Nr 1). Wywnioskowane sekwencje aminokwasowe dwóch pełnych ORF-ów wykrytych w tej sekwencji, cpsA (Seq. ID Nr 2) i cpsB (Seq. ID Nr 3) i wydedukowaną sekwencję N-terminalną trzeciego niepełnego PRF, cpsC (Seq. ID Nr 4) pokazano poniżej sekwencji nukleotydów. Domniemane miejsca wiązania rybosomów, poprzedzające każdy ORF, są przedstawione tłustym drukiem oraz przedstawione są domniemane 10- i 35-promotorowe sekwencje za cpsA; na fig. 3 opisano strukturę wektora samobójczego, zawierającego DNA syntezy otoczek z delecją pCW11 E Δ1 KS1, oraz wytwarzanie nie mających otoczki mutantów A., pleuropmeumoniae drogą wymiany allelicznej. Wektor plazmidu pCWUEΔ1 KSl skonstruowano trawiąc pCW-11E Bg/II-Stul, wytwarzając ślepe końce i poddając ligacji duży fragment o długości 6,4 m kb z fragmentem BamHI o długości 3,8 kb z pKS (także ze ślepymi końcami), zawierającego wstawkę nptl-sacRB (KanrSucs). Miejsca restrykcyjne w nawiasach wskazują na wyjściowe końce fragmentów poddanych ligacji i w pCWUEΔΐ KS1. Wektor pCWUEA1 KS1 poddawano elektrotransformacji do A pleuropneumoniae, a niemające otoczki transforrnanty Kanr odsiano korzystając z braku irydescencji na pożywce zawierającej 85 (ug/ml kanamycyny; na fig. 5 przedstawiono analizę blotingu Southema genomowego DNA wydzielonego z A. pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1) albo J45-100 (ścieżka 2) ze znakowanymi za pomocą digoksygeniny sondami specyficznymi wobec nptl albo części lokus genu otoczki A. pleuropneumoniae. Genomowy DNA z A. pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1) albo J45-100 (ścieżka 2) trawiono Xbal (panele A i C) albo BamHI (panel B) i hybrydyzowano z fragmentem Pstl o długości 1,24 kb z pKS (specyficzny wobec nptl), panel A; fragmentem Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E (cpsABC-specyficzny, patrz fig. 1), Panel B, albo fragmentem C/al o długości 2,1 kb z pCW-1C (cpxCBA specyficzny, patrz fig. 3.2), panel C; na fig. 6 przedstawiono immunoblot kolonii A. pleuropneumoniae J45 i J45-100, poddanej reakcji ze świńską surowicą odpornościową specyficzną dla polisachrydu otoczki. Na nitrocelulozową błonę nakładano w przybliżeniu 5 x 105 (ścieżka 1) lub 5 x 104 CFU na wgłębienie płytki. Błonę poddano Clal w chloroformie i poddano inkubacji ze świńską surowicą odpornośc1ową, która zawierała przeciwciała polisacharydu otoczki o serotypie 5a, lecz nie zawierała innych antygenów powierzchmowych A. pleuropneumoniae; na fig. 7 przedstawiono immunobloty zatężonej pożywki znad hodowli A pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1) i J45-100 (ścieżka 2) zawierających głównie egzotoksyny Apxl i ApxII. Panel A poddano reakcji z specyficznym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko Apxl, a panel B poddano reakcji ze specyficznym antyciałem monoklonalnym ApxII. W panelu A zatężonej, pożywki znad hodowli szczepu 1536 A pleuropneumoniae o serotypie 2 (ścieżka 3) była
186 728 włączona jako kontrola negatywna, ponieważ ten serotyp nie syntetyzuje Apxl. Blot panelu A podano reakcji z A/zU-specyficznym przeciwciałem monoklonalnym; na fig. 8 przedstawiono profile elektroforetyczne LPS wydzielonego z A. pleuropneumoniae J45 (ścieżka 1), a rekombinacyjny, nie mający otoczki mutant J45-100 (ścieżka 1) poddano elekroforezie w 15% żelu rozdzielającym i barwiono srebrem amoniakalnym; na fig. 9 przedstawiono aktywność bakteriobójczą przedsiarowego osocza krwi cielęcej względem A. pleuropneumoniae J45 i J45-100. Stopień żywotności szczepów bakteryjnych oceniano po 45 minutach inkubacji w temperaturze 37°C. Każdy punkt danych oznacza średnią z trzech ostatnich doświadczeń przeprowadzonych dwukrotnie. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe od każdej średniej. Maksymalna żywotność procentowa zarejestrowana dla J45 wynosiła 100%, chociaż te wartości były typowo wyzsze ponieważ bakterie zwykle rozwijały się w czasie doświadczenia. Wartości większych niż 100% nie rejestrowano ponieważ nie mogły one być dokładnie określone; na fig. 10a i 10b przedstawiono sekwencję nukleotydową fragmentu Xbal-Clal o długości 3,2 kb z pCW-1C, genu kodującego eksport otoczki w A. pleuropneumoniae J45 DNA (Seq. ED Nr 5). Przedstawiono proponowane sekwencje aminokwasowe (Seq. ID Nr 6-8) białek biorących udział w eksporcie polisacharydów otoczki A. pleuropneumoniae o serotypie 5a; na fig. 11 przedstawiono mapę fizyczną DNA pCW-1C z A. pleuropneumoniae J45.
Wynalazek dotyczy stosowania żywego, wytwarzanego rekombinacyjnie, niezjadliwego szczepu drobnoustroju (to jest bakterii lub grzyba), który poddano modyfikacji genetycznej w kierunku pozbawienia otoczki, jako szczepionki przed chorobami spowodowanymi przez ten drobnoustrój. Wynalazek będzie miał zastosowanie przy zapobieganiu chorób, w których do zjadliwości, lecz nie do ochrony immunologicznej, jest konieczna otoczka, i w których choroba jest spowodowana przez toksyny lub inne czynniki zjadliwe. Jako szczególny przykład wynalazku został wytworzony nie mający otoczki szczep Actinobacillus pleuropneumoniae , który powinien być użyteczny jako szczepionka przed zapaleniem płuc i opłucnej u świń. Główną cechą wynalazku jest modyfikacja genetyczna drobnoustroju, którym w szczególnym rozwiązaniu jest Actinobacillus pleuropneumoniae, polegająca na wprowadzeniu delecji do kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w obszar kodujący syntezę otoczki. Tylko tytułem przykładu ujawnia się syntezę przekształconej bakterii Actinobacillus pleuropneumoniae, mutanta o serotypie 5, jakkolwiek rozumie się, że inne serotypy można otrzymać w sposób podobny do tego, który opisuje się niżej i byłyby użyteczne w szczepionce samodzielnie lub w połączeniu z jednym lub więcej niż jednym mutantem rekombinacyjnym różnego serotypu.
Szczep opisany niżej, wraz z innymi szczepami nie mającymi otoczki, toksygennych bakterii lub innych drobnoustrojów wytworzonych według opisanych niżej procedur, daje doskonałe szczepionki, ponieważ są one niezjadliwe, lecz wytwarzają wszystkie antygeny konieczne do reakcji ochrony immunologicznej gospodarza. Szczepionki można podawać w różny sposób, z tym, że zalecany jest zastrzyk domięśniowy lub podskórny. Zaleta takich żywych szczepionek polega na tym, że toksyny, które są przede wszystkim odpowiedzialne za chorobę, i inne składniki wytworzone tylko przez żywe organizmy albo in vivo, będą wytworzone w miejscu immunizacji, a gospodarz wywołuje reakcję immunologiczną, która zabezpiecza go przed obrażeniami spowodowanymi przez toksyny. Stąd me występuje choroba (ostra lub chroniczna). Organizmy nie mogąjednak rozprzestrzeniać się, ponieważ bez otoczki są one nadzwyczaj wrażliwe na osocze i są oczyszczane bezpośrednio w strumieniu krwi lub drogach oddechowych. Poza tym, ponieważ szczepionka zawiera atenuowane drobnoustroje, to odpowiedź immunologiczna z udziałem komórek będzie większa, a ochrona będzie trwała dłużej niż w przypadku szczepionek zawierających zabite drobnoustroje.
Przykład
Zidentyfikowano i scharakteryzowano obszar DNA biorący udział w biosyntezie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae. Sondę specyficzną dla genu cpxD biorącego udział w eksporcie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae J45 serotypu 5a wykorzystano do identyfikacji i klonowania przyległego fragmentu BamHI o długości 5,8 kilo zasad z genomowego DNA J45. Analiza blotingu Southerna wykazała, ze cześć obszaru zawierała DNA, który był serotypowo-specyficzny. Analiza sekwencji DNA wykazała, ze ten obszar zawierał dwie
186 728 kompletne, otwarte ramki odczytu, cpsA i cpsB, oraz niekompletną potencjalną trzecią otwartą ramkę odczytu, przy czym cpsC, cpsA i cpsB podzielały pewną niską homologię z glikozylotransferazami biorącymi udział w biosyntezie odpowiednio liposacharydu Escherichia coli i polisacharydu otoczki Haemophilus influenzae, typ b. Delecję o długości 2,1 kb, która rozciągała się od wklonowanych otwartych ramek odczytu cpsABC, skonstruowano i zrekombinowano z chromosomem J45 drogą wymiany allelowej z utworzeniem mutanta J45-100. Ten mutant nie wytwarzał wewnątrzkomórkowo lub pozakomórkowo polisacharydu otoczki, co wskazuje, że cpsA, cpsB i ewentualnie cpsC brały udział w biosyntezie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae. Profile toksyny Apx i liposacharydu J-45-100 były identyczne dla mającego otoczkę szczepu macierzystego J45. Jednak J45-W0 rozwijał się szybciej in vitro niż J45. J45-100 był wrażliwy na zabijanie w przedsiarowym surowicy cieląt, w przeciwieństwie do J45. J45-100 był niezjadliwy, gdy stosowano do indukowania u prosiąt trzy razy 50% dawką śmiertelną szczepu J45. Za szóstym razem 50% dawka śmiertelna J45, J45-100 spowodowała łagodne do umiarkowanych obrażenia płuc, lecz nie śmierć. Te wyniki wykazały, że polisacharyd otoczki jest głównym wyznacznikiem odporności na osocze i zjadliwości A. pleuropneumoniae.
Materiały i metody
Szczepy bakteryjne, plazmidy i czynniki wzrostu.
Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w tych badaniach są takie, jak przedstawiono w tabeli 1. Do ekstrakcji genomowego DNA i prób bakteryjnych szczepy A. pleuropneumoniae hodowano ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C w sercowo-mózgowym bulionie infuzyjnym (Difco Laboratories, Detroit, Mich.}, zawierającym 5 ug/ml dinukleotydu nikotynoamidu adeniny (NAD) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Do elektroporacji szczepy A. pleuropneumoniae hodowano ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C w potrójnym bulionie sojowym (Difco Laboratories), zawierającym -06% wyciągu drożdżowego (Difco Laboratories) i 5 ng/ml NAD (TSY-N). Do doświadczeń nad wywoływaniem odpowiedzi u prosiąt szczepy A. pleuropneumoniae hodowano ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C w bulionie Columbia (Difco Laboratories), zawierającym 5 pg/ml NAD. Szczepy Escherichia coli hodowano w bulionie Luria-Bertani (Sambrook i in., 1989) celem hodowli rutynowej albo w bulionie Terrific (Tartof and Hobbes, 1987) celem ekstrakcji plazmidów. Antybiotyki w pożywkach hodowlanych stosowano w celu utrzymania plazmidów w E. coli w następujących stężeniach: ampicylina (Amp) 100 pg/ml i kanamycyna (Kan) 50 pg/ml. Kanamycynę stosowano przy stężeniu 85 pg/ml w celu selekcji rekombinacyjnych mutantów A. pleuropneumoniae.
Tabela 1
| Stosowane szczepy bakteryjne i plazmidy | |
| 1 | 2 |
| Szczepy 4074 A. pleuropneumoniae | serotyp 1; (ATCC 27088) |
| MCC 1536 | serotyp 2, (ATCC 27089) |
| ATCCa J45 | serotyp 5a |
| Fenwick i wsp , 1986a Kl7 | serotyp 5a |
| Nielsen, 1986a 178 | serotyp 5 |
| M. Mulks 29628 | seiotyp 7 |
| L Hoffman 13261 | serotyp 9 |
| J. Nicolet J45-C | nie mający otoczki mutant wydzielony po metanosulfonia nowej mutagenezie |
186 728
c.d. tabeli 1
| 1 | 2 |
| J-45 Inzana i in., pochodzący od 1993aJ- | rekombinacyjny nie mający otoczki mutant ze szczepu J45 |
| Szczep E coli XLl-Blue | recAl endA\ gyrA96 thi-l hsdR17-supE44 relAl lac(F +proABlaclqZ AM 15Tn10), gospodarz |
| Stratagene, La Jolla, Calif Plazmidy pGEM-3Z | Wektor do klonowania, długość 1,74 kb, AmpT |
| Promega pCW-1C | Fragment Xbal o długości 5,3 kb z J45 klonowanego do pGEM-32 |
| pCW-11E | Fragment BamHI o długości 5,8 kb z J45 klonowanego do PGEM-3Z |
| pKS | Fragment BamHI o długości 3,8 kb, zawierający wstawkęc npth -sacRS klonowany w miejsca BamHI w pGEM- |
| S M. Boyle pCWl 1EA1KS1 | pCW-IIE z fragmentem Bg/II-Stul o długości 1,1 kb, poddanym delecji i wstawką BamHI nptl-sacRB z pKS |
| aAmerican Type Culture Collection, Rockville, MD | |
| b Ten znacznik pochodził oryginalnie z genu Tn903 nptl z pUC4K (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) | |
| c Wstawkę opisano poprzednio (Ried i Collmer, 1987) |
Obliczenie czasu generowania. Czas generowania fazy logarytmicznej szczepów A. pleuropneumomae w TSY-N obliczono korzystając z równania R = 1/g, gdzie R jest średnią szybkością wzrostu bakterii, a g jest czasem generowania populacji bakteryjnej (Pelczar i in., 1993). Średnią szybkość wzrostu R obliczono korzystając z następującego równania: R = 3,32 (log^N-log1)No)/t, gdzie t jest czasem zaniku, N jest liczbą bakterii w czasie t, a No jest początkową liczbą bakterii w czasie 0 (Pelczar i in., 1993).
Analiza hybrydyzacji DNA. Restrykcyjny, trawiony endonukleazą DNA (w przyblizemu 5 pg na ścieżkę) poddano elektroforezie w 0,7% żelu agarozowym i przenies1ono drogą kapilarną na błony nylonowe MagnaGraph (Micron Separations Inc., Westboro, Mass.) korzystając z cytrynianu sodu w solance 20X (20X SSC jest 3M NaCl, 300 mM cytrynian sodowy) jak opisano przedtem (Sambrook i in., 1989; Southern, 1975). DNA wiązał się kowalencyjnie z błonami nylonowymi drogą napromieniania korzystając z aparatu UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, Calif.). Znaczone digoksygeniną sondy do hybrydyzacji DNA syntezowano metodą losowego startera stosując zestaw do niepromieniotwórczego znakowania i detekcji układem Genius System (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) zgodnie z instrukcjami producenta. Hybrydyzację DNA prowadzono w temperaturze 68°C w roztworach zawierających 5X SSC. Błony przemywano i wywoływano według instrukcji Genius System do wykrywania kolorymetrycznego.
Metody rekombinacji DNA i odczynniki. Genomowy DNA wydzielano z komórek A. pleuropneumomae wyhodowanych w bulionie, stosując sposób opisany przez S. Spinola. W skrócie, bakterie zawieszono ponownie w 10 mM Tris-1/mM EDTA (pH 8) i poddawano inkubacji w dodecylo-siarczanie sodowym (0,66%) i RNA-zie (100 pg/ml) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Następnie dodawano proteinazę K do stężenia końcowego 100 pg/ml i poddawano mieszaninę inkubacji w temperaturze 56°C w ciągu 1 godziny. Mieszaninę ekstrahowano jeden raz za pomocą buforowanego fenolu i cztery razy za pomocą buforowanego fenolu/chloroformu (Amresco. Inc., Solon, Ohio), a genomowy GNA strącono etanolem
186 728 i ponownie zawieszono w 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8). Plazmid DNA wydzielano drogą szybkiej lizy alkalicznej (Ish-Horowicz i Burkę, 1981). Fragmenty restrykcyjne wymagane do klonowania i syntezy sondy eluowano z żelów agarozowych, jak opisano przez Zhena i Swanka, 1993. Trawienia restrykcyjne, elektroforezę w żelu agarozowym i ligację DNA prowadzono w sposób opisany wcześniej (Sambrook i in., 1989). Końce fragmentów restrykcyjnych przygotowano jako końce ślepe drogą wypełnienia występów w położeniu 5' nukleotydami (dNTP-y) korzystając z fragmentu Klenowa polimerazy 1 DNA, jak opisano poprzednio (Sambrook i in., 1989). Plazmidem DNA transformowano szczepy E. coli drogą elektroporacji (Dower i in., 1988) korzystając z elektroporatora ΒΤΧ ECM 600 (ΒΤΧ, Inc., San Diego, Cahf.).
Endonukleazy restrykcyjne i fragment Klenowa polimerazy I DNA otrzymano z Promega Corporation (Madison, Wiś.). Ligazę T4 DNA otrzymano z Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). Nukleotydy (dNTPs) do reakcji wypełnienia otrzymano z Boehringer-Mannheim Corporation (Indianapolis, Ind.).
Sekwencjonowanie i analiza DNA. Sekwencję nukleotydową obydwu nici fragmentu DNA A7?a/-EcoRV o długości 2,6 kilozasad (kb) z pCW-ΠΕ oznaczono metodą temnnacji didezoksy łańcucha (Sanger i in., 1977) korzystając z zestawu do sekwencjonowania DNA w wersji 2 0 Seąuenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) z a35[S]dATP (duPont/NEN Research Products, Boston, Mass.). Matryce dwuniciowego DNA poddano sekwencj ono waniu korzystając ze zwykłych starterów polinukleotydowych (DNAgency, Inc., Malveme, Pa.) celem kontynuowania odczytu wzdłuż każdej nici.
Uzyskaną sekwencję nukleotydów połączono z sekwencją nukleotydową fragmentu Xbal-Clal DNA o długości 4,6 kb z pCW-lC, kodującego geny strukturalne otoczki (fig. 10) i analizowano korzystając z oprogramowania analitycznego DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wis). Przeszukiwanie podobieństwa sekwencji baz danych EMBUGenBANK/DDBJ przeprowadzono korzystając z oprogramowania BLAST (Altschul i in., 1990) w National Center for Biotechnology Information (Bethesda, Md.).
Konserwowane obszary lokusa cap (capb) H. influenzae 2/1 typu b, biorącego udział w eksporcie polisacharydu otoczki, wykorzystano do identyfikacji, klonowania i charakteryzowania części lokusa otoczki serotypu 5a A. pleuropneumoniae, biorącego udział w eksporcie polisacharydu otoczki. Przeprowadzono analizy blotingiem Southema genomowego DNA szczepu J45 serotypu 5a A. pleuropneumoniae za pomocą sond specyficznych dla przyległych obszarów lokusa {capb) otoczki II. influenzae typu b. Sondy te nie hybrydyzowały z genomowym DNA A. pleuropneumoniae w ostrych warunkach (68°C, 5 x SSC), lecz hybrydyzowały w łagodnych i umiarkowanych warunkach (55°C, 5xSSC). Fragment EcoRI o długości 4,4 kb lokusa capb z H. influenzae z plazmidu pSKHI zawierającego obszar 1 genu bexD biorący udział w eksporcie sacharydu otoczki i dwie otwarte ramki odczytu (ORFy) obszaru 2, biorące udział w biosyntezie polisacharydu otoczki, hybrydyzował z fragmentami Hindlll o długości
1.2 kb i Xbal o długości 5,3 kb genomowego DNA z J45. Fragment EcoRI o długości 9,0 kb lokusa capb H. influenzae z plazmidu pSKH2, zawierającego obszar 1 genu Z?exCBA, biorące udział w eksporcie polisacharydu otoczki, pewien niescharakteryzowany obszar 3 DNA wspólny dla kilku serotypów H. influenzae i pewien obszar 2 DNA biorący udział w biosyntezie polisacharydu otoczki, hybrydyzowały z fragmentem Hindlll o długości 1,5 kb, Xbal o długości 5,3 kb i Xhol o długości 2,4 kb genomowego DNA z J45. Te dane wskazywały, ze lokusy genów otoczki H. influenzae typu b i A. pleuropneumoniae serotypu 5a podzielały obszary homologiczne. Obydwie sondy specyficzne dla capb H influenzae zawierały obszar 1 DNA biorący udział w eksporcie polisacharydu otoczki, co sugeruje, ze fragment Xbal o długości
5.3 kb genomowego DNA z J45, który hybrydyzował z obydwoma sondami capb H influenzae, może zawierać geny, które kodują białka biorące udział w eksporcie polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae serotyp 5a. Fragment Xbal genomowego DNA o długości 5,3 kb z J45, który hybrydyzował z obydwoma sondami capJb H. influenzae, był klonowany w miejsce Xbal plazmidu pGEM-3Z (w obydwu orientacjach) z fragmentów genomowego DNA z J45, trawionego Xbal, w przedziale długości od 4,8 do 6,0 kb, który poddano elektroelucji (po rozdzielaniu elektroforetycznym) z żelu agarozowego. Jeden z otrzymanych plazmidów oznaczono jako pCW-lC. Wykonano biot Southema w celu określenia, czy bexD, bexC, bexB
186 728 i bexA H influenzae typu b hybrydyzowały z przyległymi fragmentami pCW-1C w takiej samej kolejności (bexDCBA), w jakiej te geny występują w H. influenzae. Wyniki sugerowały, ze obszar DNA A. pleuropneumoniae serotypu 5a, wymagany do eksportu polisacharydu otoczki, został z powodzeniem sklonowany oraz że ten obszar był uorganizowany w podobny sposób, jak lokus bex H. influenzae typu b.
Oznaczono sekwencję nukleotydów restrykcyjnego fragmentu Xbal-Clal o długości 4,6 kb z pCW-1C, i fragment restrykcyjny Xbal-Clal o długości 3,2 kb przedstawiono na fig. 10a-b (Seq. ID Nr 5). Cztery ORF-y (pokazane na fig. 10a-b i fig. 11), oznaczone jako cpxDCBA (cpx stosuje się do oznaczenia eksportu polisacharydu otoczki), wykryto w bliskim sąsiedztwie na tej samej nici DNA. Kodon inicjacyjny AUG cpxC (Seq. ID Nr 7) znajdował się 26 nukleotydów przed kodonem terminacyjnym UAA cpxD (Seq. ID Nr 6), a kodon inicjacyjny AUD cpxB (Seq. ID Nr 8) nakładał się na kodon terminacyjny UAA cpxC (Seq. Id Nr 7), a kodon inicjacyjny AUG cpxA nakładał się na częściowo obecny kodon terminacyjny z cpxB (Seq. ID Nr 8). Sekwencje konsensusowe Shina-Dalgamo wiążące rybosomy zidentyfikowano w obrębie 17 zasad powyżej każdego kodonu inicjacyjnego AUG, a domniemany promotor zawierający sekwencje podobne do konsensusowych sekwencji E. coli σ7θ-10 (TATAAT) i -35 (TTGACA) zidentyfikowano za cpxD (Seq. ID Nr 6). Sekwencja palidromowa, która może funkcjonować jako niezależny od rho sygnał terminacji transkrypcji, zidentyfikowano przed cpxA (nie pokazany). Organizacja genetyczna sugeruje, ze cpxDCBA ulegają transkrypcji w pojedynczy, policistronowy DNA.
Elektrotransformacja A. pleuropneumoniae. A. pleuropneumoniae hodowano do osiągnięcia środka fazy logarytmicznej w TSY-N, osadzano drogą wirowania przy 7000 x g w temperaturze 4°C i przemywano cztery razy schłodzonym (4°C), sterylizowanym przez filtr buforem, zawierającym 272 mM manitolu, 2,43 mM K2HPO4, 0,57 mM KH2PO4, 15% gliceryny, pH 7,5. Ten bufor zmodyfikowano (manitol zamiast sacharozy) w porównaniu z poprzednio opisanym buforem stosowanym do przemywania komórek A. pleuropneumoniae przed elektroporacją (Lalonde i in., 1989b). Komórki przemyto następnie jeden raz schłodzoną, sterylizowaną przez filtr 15% gliceryną i ponownie zawieszono w 15% glicerynie do stężenia w przybliżeniu 1010 CFU/ml. Równe ilości tej zawiesiny (90 pl) zmieszano z 1,5-2,0 pg DNA plazmidowego (w 1,5 pl destylowanej wody), który oczyszczono drogą ultrawirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu (Sambrook i in., 1989), umieszczono w ochłodzonych kuwetach elektroporacyjnych ze szczeliną 2 mm (BTX, Inc.) i poddano elektroporacji korzystając z elektroporatora BTX ECM 600 (BTX, Inc.) nastawionego na napięcie ładowania 2,5 kV i do oporności R7 (246 omów). Generowany impuls rzeczywisty wynosił 2,39 kV w ciągu 10,7 milisekundy. Po elektroporacji komórki przywrócono do normalnego stanu w 1 ml TSY-N, zawierającym 5 mM MgCh z ostrożnym wstrząsaniem w ciągu 3,5 godziny w temperaturze 37°C. Następnie komórki hodowano w agarze TSY-N zawierającym 85 ng kanamycyny na ml i inkubowano w temperaturze 37°C.
Immunoblot. Celem wykonania immunoblotów kolonii, całe komórki A. pleuropneumoniae hodowane przez noc na szalkach pokrytych agarem TSY-N zdrapano do solanki buforowanej fosforanem (PBS) i ustalono stężenie 109 CFU/ml, oznaczone spektrofotometryczme. Następnie nakładano w przybliżeniu 5 x 104 aj^ 5 χ 105 CFU na błonę nitrocelulozową (NitroBind, Micron Separations Inc.) korzystając z urządzenia Bio-Dot (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Całif.). Błonę umieszczono w chloroformie na 15 minut w temperaturze pokojowej celem lizy komórek bakteryjnych. Następnie błonę wysuszono całkowicie na powietrzu i poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej w solance buforowanej Tris, pH 7,5 (TBS), zawierającej 2% chudego mleka w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania w błonie. Błonę poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej przy rozcieńczeniu 1:200 (w 2% mleku/TBS) zaadsorbowanej świńskiej surowicy odpornościowej, która zawierała przeciwciała przeciwko polisacharydowi otoczki serotypu 5a, lecz nie innych antygenów powierzchniowych A. pleuropneumoniae. Surowicę odpornościową wzbogaconą w przeciwciała przeciwko polisacharydowi otoczki przygotowano drogą adsorpcji hiperimmunologicznego świńskiej surowicy odpornościowej przeciw K17 A. pleuropneumoniae z samorzutnym mutantem nie mający otoczki, K17-C (Inzana i Mathison, 1987), jak opisano
186 728 wcześniej (Inzana, 1995). Błonę przemyto w TMS zawierającym 0,05% Tween 20, a następnie poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej w rozcieńczeniu 1:1000 króliczej antyświńskiej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanową (ciężkie i lekkie łańcuchy, Capel, Durham, N.C.). Błonę przemyto w TBS, a następnie wywołano za pomocą
4-chloro-1-naftolu (Bio-Rad Laboratories) w TBS zawierającym 0,02% H2O2.
Immunobloting zatężonej pożywki znad hodowli prowadzono w sposób opisany poprzednio (Ma i Inzana, 1990). Krótko mówiąc, w przybliżeniu 15 pg całkowitej ilości białek z całej pożywki znad hodowli oddzielono za pomocą nieciągłej SDS-PAGE (Laemmli, 1970) w 8% żelu oddzielającym. Białka przeniesiono na błony nitrocelulozowe (NitroBind, Micron Separations Inc.) metodą Towbina i in. (1979). Błonę inkubowano w TBS zawierającym 2% albuminy surowicy krwi bydlęcej celem zablokowania niespecyficznego wiązania i pocięto na paski. Paski poddawano inkubacji przez noc w temperaturze 4°C albo z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla toksyny ApxII (Ma and Inzana, 1990) albo z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla toksyny Apxl (Devendish i in., 1989, Frey i in., 1992). Blot reagujący z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla ApxII poddawano inkubacji z kozią antymysiąlgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (Cappel), w rozcieńczeniu 1:2000, przemyto w TBS i wywołano w sposób opisany wyżej. Blot reagujący z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla Apxl poddawano inkubacji z kozią antymysiąlgG sprzężoną z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:2000 i wywoływano w sposób opisany uprzednio (Frey i in., 1992).
Ekstrakcja i elektroforeza LPS. LPS wydzielano z A. pleuropneumoniae korzystając z metody mikroekstrakcji za pomocą gorącego fenolu/wody, jak opisano uprzednio (Inzana, 1983). Oczyszczony LPS poddawano elektroforezie w 15% rozdzielającym żelu poliakryloamidowym, zawierającym mocznik, jak już opisano (Inzana i in., 1988). Profile elektroforetyczne LPS wizualizowano drogą barwienia żelu za pomocą srebra amoniakalnego (Tsai i Frasch, 1982).
Bakteriobójcza próba surowicy. Oznaczano wrażliwość A. pleuropneumoniae na aktywność bakteriobójczą surowicy krwi cieląt przedsiarowych. Procent przezycia szczepów bakteryjnych w 5, 10, 15, 20, 30, 40 i 50% surowicy krwi cieląt przedsiarowych oceniano po 60 minutach inkubacji w temperaturze 37°C.
Badania zjadliwości. Prosięta w wieku 7 do 9 tygodni otrzymywano z dwóch lokalnych stad wolnych od infekcji A. pleuropneumoniae i rozdzielono losowo na grupy. Grupy zwierząt trzymano w oddzielnych małych ogrodzeniach bez żadnego bezpośredniego fizycznego kontaktu pomiędzy grupami. Zwierzętarnie w Virginia Polytechnic Institute and State University działały i były zarządzane zgodnie z wymaganiami American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Celem wywołania odpowiedzi szczepy A. pleuropneumoniae hodowano z wytrząsaniem w bulionie Columbia (Difco Laboratories), uzupełnione 5 pg/ml NAD, do środka fazy logarytmicznej (109 CFU/ml). Bakterie zebrano przez wirowanie przy prędkości wirowania 7000 x g i ponownie zawieszano do stężenia 109 CFU/ml w PBS. U prosiąt wywoływano odpowiedź dotchawicowo za pomocą 10 ml rozcieńczenia tej zawiesiny po łagodnym uspokojeniu za pomocą Stresnilu (Pittman-Moore, Inc. Washington Crossing, N.J.). Zwierzęta poddano sekcji możliwie szybko po śmierci albo natychmiast po eutanazji za pomocą pentobarbitalu sodowego. Obrażenia płuc były oceniane w punktach przez patologa weterynaryjnego zgodnie z następującymi kryteriami: 0 - niewidoczne zmiany w płucach (brak zaobserwowanych większych obrażeń), 1+ oznacza 1-10% tkanki płuc dotknięte łącznie w pewnym stopniu przekrwieniem, obrzękiem, krwotokiem, zagęszczeniem tkanki i ewentualnie zapaleniem opłucnej, 2+ oznacza dotknięte 11-49% tkanki płucnej, 4+ oznacza dotknięte więcej niż 75% tkanki płucnej. Próbki płuc pobierano przy sekcji z prawego czaszkowogrzbietowego płata ogonowego i hodowano w pożywce infuzyjnym mózgowo-sercowym, zawierającym NAD celem wykrycia obecności A. pleuropneumoniae.
Wyniki
Identyfikacja i klonowanie specyficznego serotypowo obszaru DNA z A pleuropneumoniae. Celem zidentyfikowania i sklonowania DNA z A. pleuropneumoniae J45, biorącego udział w biosyntezie polisacharydów otoczki, przeprowadzono analizy blotów Southerna
186 728 celem zidentyfikowania przyległego obszaru DNA powyżej (w kierunku 5') grupy genomów cpxDCBA biorącej udział w opisanym wyżej eksporcie polisacharydów otoczki (fig. 10a-b i 11). Spodziewano się, ze ten obszar DNA będzie kodować geny serotypowo specyficzne, biorące udział w biosyntezie polisacharydów otoczki, ponieważ lokus otoczki (cap) A. pleuropneumoniae wydaje się być zorganizowany w sposób podobny do lokusów otoczki Haemophilus influenzae typu b i grupy B Neisseria meningitidis. Genomowy DNA z A. pleuro-pneumoniaie, trawiony BamHI poddano sondowaniu za pomocą znaczonego digoksygeniną fragmentu BamHI-Xbal o długości 1,2 kb z pCW-1C, który zawierał część genu cpxD. Ta sonda specyficzna wobec cpxD hybrydyzowała z pojedynczym fragmentem BamHI o długości w przybliżeniu 5,8 genomowego DNA z J45 (dane nie pokazane). Ten fragment BamHI o długości 5,8 kb klonowano w miejsce BamHI pGEM-3Z z fragmentów genomowego DNA z J45, trawionych BamHI w przedziale 5,0-6,5 kb, który poddawano elektroelucji (po rozdzielaniu elektroforetycznym) z żelu agarozowego. Otrzymany plazmid oznaczono jako pCW-11E i został zmapowany restrykcyjnie (fig. 1). Część DNA z insertem pCW-11E DNA (fragment BamHI-Zbal o długości 1,2 kb) nakładała się z DNA obecnym w insercie pCW-1C.
Trawiony BamHI genomowy DNA z kilku różnych serotypów A. pleuropneumoniae, hybrydyzowano z fragmentem Bg/ll-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E (fig. 1) w celu oznaczenia specyficzności serotypowej tego obszaru DNA (fig. 2). Fragment DNA Bg/II-Stul o długości 2,1 kb, hybrydyzował z fragmentem BamHI o długości 5,8 kb genomowego DNA z testowanych trzech szczepów A. pleuropneumoniae serotypu 5, lecz nie z genomowym DNA z serotypów 1, 2, 7 i 9 (fig. 2). Zatem DNA z A. pleuropmeumoniae w pCW-11E zawierał DNA, który był specyficzny dla szczepów o serotypie 5. Ponieważ ten DNA był serotypowo specyficzny, to prawdopodobnie bierze on udział w biosyntezie polisacharydów otoczki.
Sekwencja nukleotydów i analiza serotypowo specyficznego obszaru DNA A. pleuropneumoniae. Oznaczono sekwencję nukleotydów we fragmencie DNA Xbal-EcoRV o długości 2,7 kb z pCW-11E. Tę sekwencję nukleotydów połączono z sekwencją nukleotydów fragmentu Clal-Xbal o długości 4,6 kb z pCW-1C i badano obecność otwartych ramek odczytu (ORF-y) jeszcze nie zidentyfikowanych poprzednio. Na fig. 3 przedstawiono sekwencję nukleotydów fragmentu HindlH-EcoRV o długości 3,2 kb z pCW-11E, zawierającego nowo zidentyfikowane ORF-y. Dwa pełne ORF-y, oznaczone jako cpsA i cpsB (cps oznacza syntezę polisacharydów otoczki) zidentyfikowano powyżej i na przeciwnej nici względem genu cpxD biorącego udział w eksporcie polisacharydów otoczki A. pleuropneumoniae (fig 1 i fig. 3) Kodon inicjacyjny AUG cpsB miał 3 nukleotydy przed kodonem terminalnym cpsA. Kodon inicjacyjny AUG trzeciego potencjalnego ORF, cpsC, zidentyfikowano jako mający 15 zasad przed kodonem terminacyjnym UAA cpsB. Konsensusowe sekwencje Shine-Dalgamo, wiążące rybosomy (Shine i Dalgamo, 1974) zidentyfikowano w 13 zasadach za kodonami inicjacyjnymi cpsA, cpsB i cpsC (fig. 3). Domniemany promotor, zawierający sekwencje podobne do konsensusowych sekwencji E. coli™ -10 (TATAAT) i -35 (TTGACA) (Hawley i McClure, 1983) zidentyfikowano za cpsA (fig. 3). Ścisła bliskość cpsABC i identyfikacja domniemanego promotora sugerowały, że te ORF-y mogą ulegać wspólnej transkrypcji. Zawartość G+C obszaru DNA kodującego cpsABC wynosiła 28%.
Przewidywane polipeptydy na podstawie cpsA i cpsB składały się z 321 (CpsA) i 526 (CpsB) aminokwasów (fig. 3). Przewidywane masy cząsteczkowe CpsA i CpsB wynosiły odpowiednio 36,9 i 61,7 kilodaltonów (kDa). Wykresy hydropatyczne wykazały, że CpsA i CpsB były białkami stosunkowo hydrofilowymi, co sugeruje, że te białka mogą być związane z przestrzenią cytoplazmatyczną (nie pokazane) A. pleuropneumoniae. Badania BLAST (Altschul i in., 1990) połączonych zredukowanych nienadmiarowych nukleotydów i białek w National Center for Biotechnology Information nie ujawniły żadnej istotnej homologii pomiędzy cpsABC na poziomie nukleotydowym i aminokwasowym z innymi sekwencjami w bazach danych (dane nie pokazane), jednak niski poziom homologii (15% podobieństwa) obserwowano pomiędzy CpsaA i białkiem Rfb z E coli, a antygenową Q glikozylotransferazą biorącą udział w biosyntezie LPS (Cheah i Manning, 1993). Niski poziom homologii (w przybliżeniu 14% podobieństwa) wykryto pomiędzy CpsB a produktem białkowym przewidywanym w obszarze 2 ORF 3 lokusa otoczki H influenzae typu b. Białko przewidywane na podstawie ORF 3 bierze
186 728 udział w biosyntezie fosforanu polirybozylorybitolu polisacharydów otoczki H. influenzae typu b (Van Eldere i in., 1995). Nie obserwowano żadnej znaczącej homologii pomiędzy 83 aminokwasami końca N CpsC i jakimikolwiek białkami w bazach danych.
Wytwarzanie odpornych na kanamycynę, nie mających otoczki transformantów A pleuropneumoniae serotypu 5a. Na fig. 4 przedstawiono schematycznie procedury stosowane do wytwarzania rekombinacyjnych, nie mających otoczki mutantów A. pleuropneumoniae J45 drogą rekombinacji homologicznej i wymiany allelowej. Wektor pCWUEA1 KS1 skonstruowano najpierw do wykorzystania jako niereplikujący wektor samobójczy do zapoczątkowania wymiany DNA otoczki A. pleuropneumoniae typu dzikiego z genetycznie zmienionym DNA otoczki A.. pleuropneumoniae, drogą podwójnego, homologicznego krzyżowania rekombinacyjnego. Wektor pCWUEA1 KS1 skonstruowano najpierw przez trawienie pCW-11E Bg/II i Stul wytwarzając dużą delecję w DNA otoczki serotypowo specyficznego A. pleuropneumoniae. Końce tego trawionego DNA zostały przeprowadzone w końce ślepe, a duży fragment o długości 6,4 kb poddano ligacji z fragmentem BamHI o długości 3,8 kb z pKS (także o ślepych końcach), zawierającym wstawkę nptl-sacR-sacB. Wstawka ta zawiera przedtem gen nptl Tn903, znany jako nadający odporność A pleuropneumoniae na kanamycynę (Kań')/ oraz sekwencje sacRB, które nadają wielu gram-ujemnym bakteriom wrażliwość na sacharozę (Sucs) (Gray i in., 1983; Ried i Collmer, 1987). Delecja wytworzona w pCWUEA1 KS1 obejmowała cpsABC (fig. 1, fig. 4) i powinna zatem w podobny sposób wpływać na białkowe produkty tych ORF-ów.
Wektor pCWUEA1 KS1 nie ulegał replikacji w A. pleuropneumoniae, a zatem funkcjonował jako wektor samobójczy. Po elektroporacji A. pleuropneumoniae J45 pCWUEA1 KS1 uzyskano siedem transformantów odpornych na kanamycynę po inkubacji mieszanin do przywrócenia stanu normalnego w temperaturze 37°C w ciągu 2 dni. Cztery z tych odpornych na kanamycynę transformantów J45 nie wykazywało irydyzacji po wizualizacji na płytkach z ukośnie przekazywanym źródłem światła, co sugeruje, ze te transformanty nie miały otoczki (dane nie pokazane). Pożywka stosowana do hodowli A. pleuropneumoniae przed elektroporacją pCWUEA1 KS1 była odczynnikiem, ponieważ nigdy nie uzyskano nie mający otoczki, odpornych na kanamycynę transformantów, gdy A. pleuropneumoniae hodowano w pożywce infuzyjnej mózgowo-sercowej, uzupełnionej NAD.
Charakteryzacja genotypowa transformantów A. pleuropneumoniae, odpornych na kanamycynę. Wstępne analizy hybrydyzacji kolonii siedmiu transformantów odpornych na kanamycynę ujawniły, ze cztery transformanty, które jak się okazało nie miały otoczki (drogą badania wizualnego), hybrydyzowały z sondą DNA specyficzną dla nptl (fragment Pstl o długości 1,24 kb z pKS), lecz nie z sondami specyficznymi dla pGEM-3Z (fragment Bgll z pGEM-3Z) albo serotypowo specyficznym fragmentem Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E (dane nie pokazane). Te wyniki wskazują, że podwójna rekombinacja ma miejsce w każdym z tych czterech, odpornych na kanamycynę transformantów. l odwrotnie, kolonie pozostałych trzech transformantów odpornych na kanamycynę hybrydyzowały z sondami specyficznymi dla genu nptl, pGEM-3Z i fragmentem Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E, co sugeruje, ze ma miejsce pojedyncze krzyżowanie, a cały wektor samobójczy pCWUEA1 KS1 zintegrował się z chromosomem tych transformantów (dane nie pokazane). Analizy blotów Southema oczyszczonego genomowego DNA z czterech transformantów odpornych na kanamycynę, potecjalnie nie mający otoczki (stosując opisane wyżej sondy), były identyczne, co wskazuje, ze taka sama podwójna rekombinacja miała miejsce w każdym z tych, transformantów. Jeden tych transformantów był losowo wybrany do dalszych badań i oznaczono go jako J45-100.
Przeprowadzono analizy blotów Southema genomowego DNA wydzielonego z J45 i J45-100 z sondami DNA specyficznymi dla genu nptl, fragmentu Bg/II-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E i fragmentu Clal o długości 2,1 kb pCW-1C (fig. 5). Sonda DNA specyficzna dla nptl hybrydyzowała z fragmentem o długości 5,0 kb z DNA J45-100 trawionym Xbal, lecz nie z DNA z J45, co oznacza, że znacznik nptl znajdował się w chromosomie J45-100 (fig. 5A). Hybrydyzacja sondy nptl Z fragmentem Xbal o długości 5,0 kb genomowego DNA z J45-100 była zgodna z wielkością tego fragmentu w wektorze samobójczym pCWUEA1 KS1 stosowanym do
186 728 wytwarzania J45-100. Fragmenty Bglll-Stul o długości 2,1 kb z pCW-11E hybrydyzowały z fragmentem o długości 5,8 kb J45 trawionym BamHII lecz nie do DNA J45-100, co znaczy że ten fragment uległ delecji w J45-100 (fig. 5B). Sonda specyficzna dla genów cpxCBA (fragment Clal o długości 2,1 kb z pCW-1C), biorących udział w eksporcie polisacharydów otoczki, hybrydyzowała z fragmentem Xbal o długości 5,3 kb zarówno z J45, jak i z J45-100 (fig. 5C). Ten wynik oznacza, że na tę cześć lokusa otoczki A. pleuropneumoniae nie wpływały podwójne rekombinacje, które miały miejsce w przyległym obszarze DNA. Sonda specyficzna dla pGEM-3Z nie hybrydyzowała z genomowym DNA z J45 lub J45-100, co oznacza, ze żaden wektor DNA nie znajdował się w genomowym J45-100. Podsumowując, takie wyniki hybrydyzacji DNA wskazywały, ze pożądana podwójna rekombinacja i wymiana allelowa miały miejsce w J45-100.
Charakterystyka fenotypowa odpornego na kanamycyne transformanta J45-100 A. pleuropneumoniae. J45-100 oceniano pod względem wytwarzania polisacharydów otoczki drogą immunoblotingu kolonii i aglutynacji lateksu. Surowica odpornościowa zawierająca przeciwciała specyficzne dla polisacharydów otoczki A. pleuropneumoniae serotypu 5a, lecz nie zawierające innych bakteryjnych składników powierzchniowych, reagowała z J45, lecz nie reagowała z J45-100 (fig. 6). Ponieważ kolonie bakteryjne na błonie ulegały lizie w chloroformie, to te wyniki wskazują że J45-100 nie wytwarzał wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych polisacharydów otoczki. Wszystkie lub sonikowane J45-100 nie powodowały zlepiania się perełek lateksowych, które były kowalencyjnie sprzężone z oczyszczonym przeciwciałem polisacharydu otoczki A. pleuropneumoniae serotypu 5a (lnzana, 1995), natomiast całe komórki J45 i poddane sonifikacji komórki J45 powodowały silną aglutynację reagenta z perełkami lateksowymi (dane nie pokazane). Wyniki te wskazują, ze delecja w lokus cap A. pleuropneumoniae J45-100 dała w wyniku utratę biosyntezy polisacharydów otoczki. Co więcej, wyniki te wskazują na to, że nie mający otoczki mutant J45 wydzielony po mutagenezie metasulfonianem etylu (lnzana i in., 1993 a), J45-C, wytwarzał wewnątrzkomórkowy, lecz nie zewnątrzkomórkowy polisacharyd otoczki.
Ekspresje toksyny Apx i profile elektroforetyczne LPS dla J45 i J45-100 porównywano celem określenia, czy mutacja wprowadzona drogą inżynierii genetycznej lokusa cap J45-100 miała wpływ na te ważne determinanty zjadliwości. Przy wydzielaniu białek toksynowych Apxl i ApxII o ciężarze cząsteczkowym 105 kDa do klarownej pożywki znad hodowli nie wykryto żadnej różnicy pomiędzy J45 a J45-100 (fig. 7). Ponadto nie wykryto żadnej różnicy w profilach elektroforetycznych LPS dla J45 i J45-100 (fig. 8).
Badano wzrost J45 i J45-100 w TSY-N i wrażliwość J45 i J45-100 na aktywność bakteriobójczą przedsiarowego osocza z krwi cieląt w celu oznaczenia wpływu braku otoczki na te właściwości fenotypowe. Krzywe wzrostu J45 i J45-100 w TSY-N były podobne, lecz nie identyczne (dane nie pokazane). Jednakże zliczenia przeżywalności na płytkach wykazały, ze w logarytmicznej fazie wzrostu J45-100 wzrastał szybciej (czas generowania około 23 minuty) niż macierzysty szczep nie mający otoczki, J45 (czas generowania około 28 minut) (dane nie pokazane). Nie mający otoczki mutant rekombinacyjny J45-100 był skutecznie zabijany w ciągu 60 minut w 10 do 50% przedsiarowej surowicy z krwi cielęcej, jako źródle dodatkowym, natomiast mający otoczkę szczep macierzysty J45, nie był zabijany (fig. 9).
Wrażliwość J45-100 na sacharozę badano w celu określenia, czy sekwencje sacRB mogłyby funkcjonować jako przeciwselektywny znacznik w A. Pleuropneumoniae, a następnie indukować usunięcie wstawki nptl-sacRB z chromosomu J45-100. J45-100 hodowany w bulionie wzrastał bardzo powoli, gdy był wysiany na szalce bezpośrednio lub rozcieńczany, a następnie wysiany na szalki albo w pożywce TSY-N lub Luria-Bertani (do której dodano 5 pg/ml NAD), zawierającym 5% lub 8% sacharozy. Obecność sekwencji sacRB w chromosomie J45-100 zweryfikowano drogą b1otu Southema. Te wyniki sugerują, że albo znacznik sacRB nie dawał ekspresji w A. pleuropneumoniae, albo możliwie, że produkt lewanowy utworzony przez lewanosacharozę sacRB w obecności sacharozy nie był toksyczny dla J45-100.
Wewnątrztchawicowe wywoływanie reakcji u prosiąt przez rekombinacyjnego, niemającego otoczki mutanta A. pleuropneumoniae, J45-100. Rekombinacyjny, nie mający otoczki mutant J45-100 nie powodował żadnej śmiertelności u prosiąt, gdy podawano go w dawkach 3 i 6 razy
186 728 (odpowiednio 1,45 x 107 CFU i 2,95 x 107 CFU) 50% dawka śmiertelna (LD50) mającego otoczkę szczepu macierzystego J45 (5 x 106 CFU) (Inzana i in., 1993a) (tabela 2). I odwrotnie, u wszystkich trzech prosiąt prowokowanych za pomocą 6,5-krotnej LD50 J45 rozwinęły się ostre obrażenia płuc, wskutek czego prosięta padły (tabela 2).
Tabela 2
| Zjadliwość A pleuropneumoniae J45 i J45-100 dla prosiąt | ||||
| Ilość pozytywnie/całkowita ilość testowana | ||||
| Szczep prowokujący | Dawka prowokująca | Średnia liczba punktów uszkodzenia płuc | Śmiertelność | Odzyskanie zdrowia3 |
| J45 | 1/6- 3,30X107CFUb | 4+ | 3/4c | 4/4 |
| J45-100 | 1,5X107CFU | 0 | 0/5 | 0/5 |
| J45-100 | 3,OX107CFU | 1+ | 0/5 | 2/5d |
| J45-100 | 8,4X107CFU | 1 + | 1/4° | 4/4d |
| J45-100 | 1, 8X108CFU | 2+ | 0/4 | -U —- Ω. |
| J45-Cf | 1,7X10b CFU | 1+ | 0/2 | 2/2d |
a Powrót do normalności szczepu wywołującego odpowiedź, z próbki płuc pobranej przy sekcji
Prosięta prowokowane za pomocą J45-100 poddano sekcji 4 dni po teście prowokacji b Ta dawka jest 6,6 razy większa niż 50% dawka śmiertelna (5X106 CFU) podana w poprzednich badaniach (Inzana i in , 993a) c Wszystkie prosięta w tej grupie zginęły w ciągu 36 godzin po teście prowokacji.
d A pleuropneumomae odzyskiwano z płuc i potwierdzono, ze nie miały otoczki drogą braku irydescencji i braku aglutynacji wrażliwych cząstek serotypowo-5 specyficznych e Sekcja jednego prosięcia, które zginęło, wskazywała, że śmierć była spowodowana brakiem podawania dawki prowokującej fJ45-C jest chemicznie indukowanym, nie mającym otoczki mutantem, który scharakteryzowano poprzednio
Pięć prosiąt prowokowanych niższą dawką J45-100 (1,45 x 107 CFU) nie przejawiało żadnych klinicznych objawów charakterystycznych dla świńskiego zapalenia płuc i opłucnej, i nie rozwinęły się u nich żadne obrażenia płuc. Co więcej, nie wyhodowano A. pleuropneumomae z próbek płuc pobranych przy sekcji po czterech dniach po teście prowokacji. Dwa lub trzy prosięta prowokowane wyższą dawką J45-100 (2,95 x 107 CFU) były klinicznie normalne i przy sekcji nie zaobserwowano żadnych obrażeń płuc. Jedno prosię w tej grupie, prowokowane wyższą dawką J45-100, przejawiało umiarkowaną duszność, a przy sekcji obserwowano pewne przekrwienie płuc i nieznaczny krwotok (punkty obrażenia płuc = 1+). Pozostałe dwa prosięta w tej grupie przejawiały umiarkowaną duszność, a przy sekcji zaobserwowano pewne zapalenie opłucnej i zagęszczenie tkanek (punkty obrażenia płuc = 2+). A pleuropneumomae J45-100 wyhodowano tylko z tych dwóch prosiąt z najostrzejszymi obrażeniami płuc. Bakterie odzyskane z tych prosiąt nie powodowały aglutynacji reagenta aglutynacyjnego z perełkami lateksowymi serotypu 5a. Zatem odzyskane bakterie wciąż nie miały otoczki, co wskazuje, ze J45-100 nie powracał do mającego otoczkę fenotypu in vivo.
Gdy geny nptl (nadaje odporność przeciw kanamycynie) i SacB/sacR (nadaje wrażliwość na sacharozę) klonowano w miejsce delecji, to geny te były przeznaczone tylko do
186 728 wykorzystania jako geny znacznikowe, przy czym można stosować także inne geny znacznikowe. Ze względu na zdrowie i przyczyny związane z bezpieczeństwem korzystne może okazać się unikanie stosowania znacznika odpornego na antybiotyki, takiego jak nptl, albo dostarczenie mechanizmu leczenia lub inaktywacji znacznika antybiotykowego. Odpowiednie znaczniki nieantybiotykowe mogą obejmować odporność na rtęć.
Nie mający otoczki szczep Actinobacillus pleuropneumoniae typu 5, otrzymany według powyższych procedur produkuje tylko dwie lub trzy toksyny wytwarzane przez Actinobacillus pleuropneumoniae. Podczas gdy zmodyfikowane Actinobacillus pleuropneumoniae może zabezpieczać i jest immunogenne, to może być także użyteczne do klonowania trzeciego genu toksyny RTX w miejsce delecji. Można tego dokonać przez klonowanie genu toksyny RTX do kasety genu kanamycyny szczepu J45-100, a zatem inaktywując gen kanamycyny.
Szczepionkę powinno się dostarczać w postaci podobnej do innych szczepionek dobrze znanych w tej dziedzinie. Korzystne jest, aby szczepionka była umieszczona w butelce jako mieszanina liofilizowana i mogła zawierać jeden lub więcej serotypów szczepów mutantów. W celu zachowania żywotności powinna ona zawierać taką substancję, jak bulion Columbia, trehalozę lub albuminę, glicerynę albo inny środek. Zawartość liofilizowanej mieszaniny wymagałaby tylko ponownego uwodnienia sterylną wodą lub solanką i wstrzyknięcia (domięśniowo, dożylnie, dootrzewnowo, podskórnie, itp.). Szczepionkę można także dostosować do innych sposobów podawania (na przykład doustnie, poprzezskómie, podjęzykowo, itp.), stosując odpowiednie nośniki (na przykład skrobię, polisacharydy, oleje, liposomy, gumy, itp.)
Dawka szczepionki dostarczona zwierzęciu zależy od takich czynników, jak wiek lub płeć zwierzęcia i sposób podawania. We wszystkich przypadkach powinna być podana wystarczająca ilość żywych, niezjadliwych, nie mających otoczki Actinobacillus pleuropneumoniae celem wywołania immunogennej reakcji u szczepionego zwierzęcia. Owocne wyniki uzyskano z 2 immunizacjami po 2 do 3 tygodni z jednostek tworzących kolonię 109.
Wynalazek został opisany w jego korzystnych rozwiązaniach, zatem dla specjalistów w tej dziedzinie jest oczywiste, ze wynalazek można przeprowadzić z modyfikacjami w ramach idei i zakresu załączonych zastrzeżeń.
186 728
186 728
5.S kb
2 3 4 5 6 7 ,
FIG.2
186 728 mgcmggcot τπτιμμορμ^^
ΜΠΠΚΕΑΜΤΠΧΜΕΜ^^
CpsA - I U I 1 I I ramoow™ ? i I B H ϊ B S I B 1 0 S C ! F 5 S i L E T r T 0 F ε S Β E F o a I Ϊ /mmwm
Β $ P I P E Π Η B 1 B8 P Β l f E ί l l P B$ U I Ϊ R li 5 l B IMCWIEGMCTg^
I P 8 P ł ί I ϊ T I F I P ί I B F ł f ł I I C l Β ϊ I 8 Β E I l I S II GOnTCCEMAOT^ l P E H 8 l F ϊ I P fl Ϊ 7 I ί l H f P ( 8 I 8 E I 5 S F 8 8 I I L (WCCTOGM^^
I* 5 ! I F C I Η i S 0 I ϊ l f [ l i I i l 8 P 8 0 F 8 F I f 8 6
I 0 I β I S U E I u l C f E i u JE i l P I Β I F 0 5 F T I I I
8 L.l ϊ C S 5 Β E C S P 15 I P E i L i i 5 I P I F S S I I 5 I P I i 8 8 1 B 1 8 I i L I l I l 0 P I 1 I i E 8 I I f I C L F 8 P S 1 F E
I I l 8 F S l I 8 S P S L A I 5 I [ 8 C I 8 8 I I l 8 8 I 8 I I 8 5
W0OT«
CpsB *♦ a s i s ι i a p a s i h t a a a a f s s f f s i i e a a a ι 111 f MMMwmmwmwoe
E U I I a 8 ί I 5 l T t F ί 8 $ I l t | ι Ϊ F 8 I Β I l I 1 E E E Ε
FIG.3A
186 728
ϊ ϊ ΐ * I U I t C I I P 5 1 P S l P I
FIG.3B
186 728
BamHi
BamHi
Trawienie Bb/ll i Stul Oczyszczony na żelu fragment 6,44 kb
T4 DNA LłGASE
BamHf
Trawienie BamHi i Oczyszczony na żelu fragment 3,8 kb (I (Bg/H/SamHf
(Stul/BamHI)
FIG.4
Oczyszczanie w gradiencie CsCI i elektrotransformacja A PLEUROPNEUMONIAE 145
Rekombinacja
I Szalka tryptynizowana soja/ekstrakt
Ϊ drożdżowy/NAD/kanamycyna (85ug/ml) cporni v__T TO*iicrnDii4nrrc rno. ·
Transformanty przeszukiwane pod kątem Kanr
1. brak produkqi polisacharydowej otoczki (immunoblot)
2. obecność znaczników nptl i sac-RB (biot Southema)
3. brak fragmentu DNA BG/ll-Stul (biot Southerna)
4. brak sekwencji wektora pGEM-3Z (biot Southerna)
186 728
A B
A.rr *' C-m·· * - ’ *· ·>
12 i 1 2
SC k
SSrt
,.,L -
FIG.5
186 728
105 kDa —
Reactetf
YY,th
ApyL-spec
MAb c ApKikspectfic
MAb
FIG.8
FIG.7
186 728
CTAGACATiACAIGATTAATFATAGGACGAGK^TTATGCTAGACAnAAAAATACTCCTGAAATACGAAT^GTiATGGAGTTACCCTA
GATAMWWCATCOTnCATAAATATMATGAmTnATCAACTATCTAGGGWACTCCGTATnTATATGGCn nAAAHATAATGTTTATCTGTATAACGCCCCTCKGAmACITTTTTnAAAAAAAATACATnmAAnWGTAAATfTCnA -35 -10
TAmAAmCTCHGAHAGCTAACnAnAAMTCAATCTnATGTGGAmrAAGACATACCTATATAGTTGTTAKCCnAATATA
TlGAAGAGMAnAGATGAAACrCATCAAACHAGAnACTCCnTCTfTGGGGCTGGiTGCrAGTITGGCTGCCTGCTCAAGCTTACCC
CpxD -* Η K L 1 I l R L L L S L G t V A S L A aVc S S L P ACnCAGGCCClAGCCATAGTGCGArrfTAGAGGCTAATTCCCAGAACrCAGATAAACCnTACCGGAAGITAArnAGTGGAGrFAGAT
T$6PSHSAJIEANSGIISDKPLPEVIIIY£LD
AAT(%mAGrCAGCAGRCTArCjmTCAGCAAA<nCAC(^KH(XGG(nKnAGGCA(XXIGGCGGTGCTGGATArgCC6GT
270
360 ♦50
540
630
Ν δ l Y <) Q l Y 0 Ϊ C 0 S 0 Q F S C F l G J A G G A δ Y A G GanCAATGTGGGGGATCTTCnGAOCAATnGGGAAGCGCCACCGGCAGTGTTGTITGGCGGTACTrrTAGTTCTtMGGCM
AY«VCDYLE!SliEAPPAYLFCGTFSSEGQ
GGTAGCGGGCAWCGCMnA(XG(XGCAAATGGnAAC(MACGGTACGGRACTGlGCCGWGGGlAATAnCGTCTTGCA
G $ G Η L i C l P A 0 U V H C H G I V T V P F Y G H I R Y A
GGFAMACACCGGAAGCGAnCAGTCrCAAATlGTiTOCATrGCAACGiAAAGCGAAlGAGCCACMGFAnAGIAAAAATTGCGAAT
G R T P Ε A I Q S Q I Y G A l Q R K A H C P Q Y L Y K I A «
AAmTOGTOFTO
R R S A 0 Y I Y I i Q G N S I R Β P L S A Ν Ν E R Y l 0 A Y GCAGCAGTAGGCGGTACAAtHGAAAATATIGAAGAOACCGTAAAAlTAACTCGFGGCTCGCWGTCAAAAGATiAGCGTITGAAACT
FIG. 10A
186 728
t R Υ I E A L L B R Ε I I I R ϊ Ε Β K H ί E F I ϊ l f Υ Ε Ρ
CTATTACTCACTnAWCGnTFGATGTGGAAATTTATCCGAGCGGATCGCGnTCCGATITAAATATrAKGCTrrTGTGATIACC ~.....................— 2970
I I ί I L F I Υ L Β ϊ K F I R Μ R Υ 5 0 ί Η I Α Γ V I I
GGTOTCOWTGGCCATWTGTGGC^TCCGTCAAACCGCACTATiXGTG(^mCC£^AACHGAG7CTTCTnATWTCCTAAT
-—-—-------- -----3060
Ε Υ Ρ Β * Β V I R 1 Α $ S R I I δ A I S Ε Η ί S L ί Υ H R 8
GTFEGCGTAKAWTACCnACTGGCTCCTGTCAT/CTGAAGTAGCAGC^GCMCGAHGCCCMkTCAKArrATGGCAnAGTCAn
Υ R Υ ί 0 ί L I A R Υ I ί Ε Υ A G ί Γ I A 0 I I I Β A Ε Υ I
FIG. 10B
186 728 żywotność w %
FIG.9
BamKl
EcoR!
Hindlll
| Xbal Hindlll I > i | Hindlll M . ... . Hindlll Clal Mlul III. I L | Sphl I Ndel EcoRV Li i ...... | Clal Ndel Xbal 1 1 1 |
| 1h J— | 1 1 [ 1 | | • 1 | T*- |
| 1.0 | 2.0 3.0 | 4.0 | 5.0 kb |
cpxD cpxC cpx8 cpxA
PROBE
FIG. 11
186 728
Hindlll
Xbfll
Spili
Ns3
I, M
I ' 1
1.0 2.0
Sphl
Xbol
Stul
EcoRV
Xbol
Smal
BamHI i 1 i |
3.0 4.0 5.0 kb ~~~~j c?xD cpsA cpsB cpsC
Sonda
FIG.1
2
JAS — ®
3*5-100 —
FIG.6
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej, znamienna tym, że zawiera niezjadliwy, nie mający otoczki, organizm taki jak Actino-bacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica lub Pseudomonas aeruginosa, który jest pozbawiony sekwencji DNA kodujących syntezę otoczki zlokalizowanych zgodnie z kierunkiem transkrypcji za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamH!-Xbal pCW-1C albo za genem eksportu otoczki bakterii.
- 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, ze organizm jest bakterią Actinobacillus pleuropneumoniae.
- 3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że genem eksportu otoczki jest gen cpxD.
- 4. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że organizm jest pozbawiony czynników zjadliwości obejmujących polisacharydy otoczki, endotoksyny Iub egzotoksyny białkowe.
- 5. Sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania chorobom spowodowanym przez Actinobacillus pleuropneumoniae, znamienny tym, ze identyfikuje się sekwencje DNA syntezy otoczki u tej bakterii, które są zlokalizowane za miejscem hybrydyzacji fragmentu BamHI-XbaI CW-1C, a następnie usuwa się sekwencje DNA syntezy otoczki otrzymując nie mające otoczki mutanty tej bakterii.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/673,814 US6086894A (en) | 1996-06-27 | 1996-06-27 | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms |
| PCT/US1997/010236 WO1997049416A1 (en) | 1996-06-27 | 1997-06-17 | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL330863A1 PL330863A1 (en) | 1999-06-07 |
| PL186728B1 true PL186728B1 (pl) | 2004-02-27 |
Family
ID=24704213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97330863A PL186728B1 (pl) | 1996-06-27 | 1997-06-17 | Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6086894A (pl) |
| EP (1) | EP0964689A4 (pl) |
| JP (1) | JP2001522347A (pl) |
| CN (1) | CN1092069C (pl) |
| AR (1) | AR008615A1 (pl) |
| AU (1) | AU734254B2 (pl) |
| BR (1) | BR9710986A (pl) |
| CA (1) | CA2258168A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ295438B6 (pl) |
| NO (1) | NO986099L (pl) |
| NZ (1) | NZ333387A (pl) |
| PL (1) | PL186728B1 (pl) |
| RU (1) | RU2234941C2 (pl) |
| SK (1) | SK284610B6 (pl) |
| TR (1) | TR199802716T2 (pl) |
| UA (1) | UA70287C2 (pl) |
| WO (1) | WO1997049416A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA975586B (pl) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE501275T1 (de) * | 1998-04-02 | 2011-03-15 | Univ Oklahoma State | Chondroitin-synthase kodierendes dna der pasteurella multocida und verwendungsverfahren |
| US7708642B2 (en) | 2001-10-15 | 2010-05-04 | Igt | Gaming device having pitch-shifted sound and music |
| US7449178B2 (en) | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
| ATE420105T1 (de) * | 2002-04-05 | 2009-01-15 | Merial Sas | Attenuirte gram-negative bakterien |
| GB0228691D0 (en) * | 2002-12-09 | 2003-01-15 | Imp College Innovations Ltd | Bacterial virulence genes |
| NZ543771A (en) * | 2003-07-02 | 2008-05-30 | Biotechnology Res & Dev | Acapsular Pasteurella multocida hyae deletion mutants |
| WO2010052335A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-14 | Novo Nordisk A/S | E. coli bl21 strain lacking a functional group ii capsular gene cluster |
| TWI548746B (zh) * | 2009-08-06 | 2016-09-11 | 英特威特國際股份有限公司 | 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法 |
| CN106866800B (zh) * | 2016-09-14 | 2020-08-18 | 四川农业大学 | 胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US549818A (en) * | 1895-11-12 | Rolling-mill | ||
| AR241545A1 (es) * | 1985-07-12 | 1992-08-31 | Cornell Res Foundation Inc | Un metodo para preparar una cepa de s. equi avirulenta a.t.c.c. 53186 para equinos. |
| US4980163A (en) * | 1989-03-01 | 1990-12-25 | Public Health Research Institute Of The City Of New York | Novel bacteriocin compositions for use as enhanced broad range bactericides and methods of preventing and treating microbial infection |
| WO1993010815A1 (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-10 | Center For Innovated Technology | Non-capsulated mutants of bacteria useful as vaccines |
| JP2717481B2 (ja) * | 1992-08-25 | 1998-02-18 | 富士写真フイルム株式会社 | ハロゲン化銀カラー写真感光材料 |
| US5441736A (en) * | 1992-11-05 | 1995-08-15 | University Of Saskatchewan | Actinobacillus pleuropneumoniae outer membrane lipoprotein A and uses thereof |
-
1996
- 1996-06-27 US US08/673,814 patent/US6086894A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-17 EP EP97929967A patent/EP0964689A4/en not_active Withdrawn
- 1997-06-17 UA UA98126639A patent/UA70287C2/uk unknown
- 1997-06-17 WO PCT/US1997/010236 patent/WO1997049416A1/en not_active Ceased
- 1997-06-17 JP JP50314698A patent/JP2001522347A/ja not_active Ceased
- 1997-06-17 CA CA002258168A patent/CA2258168A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-17 BR BR9710986-0A patent/BR9710986A/pt active Search and Examination
- 1997-06-17 TR TR1998/02716T patent/TR199802716T2/xx unknown
- 1997-06-17 AU AU33904/97A patent/AU734254B2/en not_active Ceased
- 1997-06-17 SK SK1771-98A patent/SK284610B6/sk unknown
- 1997-06-17 RU RU99101907/13A patent/RU2234941C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-06-17 CZ CZ19984189A patent/CZ295438B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-17 CN CN97195844A patent/CN1092069C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-17 PL PL97330863A patent/PL186728B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-06-17 NZ NZ333387A patent/NZ333387A/en unknown
- 1997-06-24 ZA ZA9705586A patent/ZA975586B/xx unknown
- 1997-06-24 AR ARP970102777A patent/AR008615A1/es unknown
-
1998
- 1998-07-15 US US09/115,824 patent/US6326001B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-23 NO NO986099A patent/NO986099L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO986099D0 (no) | 1998-12-23 |
| TR199802716T2 (xx) | 2001-06-21 |
| HK1020004A1 (en) | 2000-03-10 |
| JP2001522347A (ja) | 2001-11-13 |
| AU734254B2 (en) | 2001-06-07 |
| UA70287C2 (en) | 2004-10-15 |
| NZ333387A (en) | 2000-06-23 |
| US6086894A (en) | 2000-07-11 |
| PL330863A1 (en) | 1999-06-07 |
| BR9710986A (pt) | 2001-12-11 |
| CZ295438B6 (cs) | 2005-08-17 |
| EP0964689A4 (en) | 2004-09-08 |
| WO1997049416A1 (en) | 1997-12-31 |
| CN1223586A (zh) | 1999-07-21 |
| SK284610B6 (sk) | 2005-07-01 |
| CA2258168A1 (en) | 1997-12-31 |
| CZ418998A3 (cs) | 1999-07-14 |
| SK177198A3 (en) | 2000-03-13 |
| AR008615A1 (es) | 2000-02-09 |
| ZA975586B (en) | 1998-03-23 |
| AU3390497A (en) | 1998-01-14 |
| EP0964689A1 (en) | 1999-12-22 |
| CN1092069C (zh) | 2002-10-09 |
| US6326001B1 (en) | 2001-12-04 |
| NO986099L (no) | 1999-01-13 |
| RU2234941C2 (ru) | 2004-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Barry et al. | Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin and hemolytic activities require a second gene, cyaC, for activation | |
| Klugman et al. | Sequence of the structural gene (rmpM) for the class 4 outer membrane protein of Neisseria meningitidis, homology of the protein to gonococcal protein III and Escherichia coli OmpA, and construction of meningococcal strains that lack class 4 protein | |
| JP7657720B2 (ja) | 改変チフス菌株 | |
| HU228700B1 (en) | Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests | |
| EP2134359A2 (en) | Use of an avirulent bordetella mutant as a live vaccine vector | |
| JP3447713B2 (ja) | Ｂ群連鎖球菌に対する複合ワクチンを製造するための防御的タンパク質抗原をコードする遺伝子配列からなる組換え分子 | |
| JP2001186874A (ja) | サルモネラワクチン | |
| PL186728B1 (pl) | Szczepionka do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej i sposób wytwarzania szczepionki do immunizacji świń przeciwko zapaleniu płuc i opłucnej | |
| JP2001510342A (ja) | 新規微生物 | |
| EP0127153A2 (en) | Bivalent vaccines | |
| EP2244730B1 (en) | Vaccines | |
| WO2015138549A1 (en) | Compositions and methods of preparing leptospira | |
| KR100292413B1 (ko) | 세르풀리나 하이오다이센테리애 백신 | |
| CA2436530A1 (en) | Environmentally regulated genes of streptococcus suis | |
| US6180112B1 (en) | Pasteurella haemolytica vaccine | |
| EP0700440B1 (en) | Regulator of contact-mediated hemolysin | |
| CN108671227A (zh) | 一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗 | |
| KR100567351B1 (ko) | 피낭형세균에의해유발되는질병에대한재조합백신 | |
| HK1020004B (en) | Recombinant vaccine for diseases caused by encapsulated organisms | |
| Ward | The capsular polysaccharide of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5A: Role in serum resistance and characterization of the genetic basis for expression | |
| MacGregor | DNA rearrangements and variation in Bordetella pertussis | |
| GuidolÍn | and its Host Interactions | |
| Hedreyda | The use of TN4001 mutagenesis in the study of Mycoplasma pneumoniae cytadherence | |
| Humphries | The role of lipopolysaccharide phase variation in the pathogenesis of Haemophilus influenzae type B disease | |
| Shelton | Molecular analysis of virulence factors in Bordetella avium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20070617 |