CZ295597B6

CZ295597B6 - Nemrznoucí polypeptidy mrkve

Info

Publication number: CZ295597B6
Application number: CZ19991777A
Authority: CZ
Inventors: Louise Jane Byass; Charlotte Juliette Doucet; Richard Anthony Fenn; Andrew John Mcarthur; Christopher Michael Sidebottom; Margaret Felicia Smallwood
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-06
Publication date: 2005-08-17
Also published as: ZA9710338B; TR199901695T2; PT941332E; IL129970A0; SK65799A3; DK0941332T3; JP2000513578A; HUP0000258A3; UY24786A1; EP0941332B1; EP0843010A1; ATE319829T1; US6797690B1; CZ177799A3; CN1244895A; ES2259807T3; DE69735441D1; DE69735441T2; AR013874A1; BR9713984A

Abstract

Podstatu řešení tvoří nemrznoucí polypeptid, obsahující sekvence aminokyselin (A) až (E), (A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS, (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS, (C) LEU-THR-XAA-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS, (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-XAA-LYS, (E) XAA-XAA-GLY-VAL-ILE-PRO-XAA-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU-LYS, kde XAA znamená jakoukoliv aminokyselinu. Ve výhodném provedení se jedná o nemrznoucí polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 nebo sekvenci s alespoň 85% identitou s touto sekvencí.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nemrznoucích polypeptidů (AFP) a potravinářských produktů, které je obsahují.

Dosavadní stav techniky

Nemrznoucí polypeptidy (AFP) mají schopnost zvýšit toleranci potravin při zmrazování.

Termín „nemrznoucí polypeptidy“ (AFP) je dobře nám v oboru a znamená ty proteiny, které inhibují růst krystalů ledu. Popisují se v dokumentu US 5 118 792.

V dokumentu WO 90/13571 se popisují nemrznoucí peptidy, které se získávají z rostlin chemickou cestou nebo metodami rekombinace DNA. Peptidy AFP jsou vhodné pro použití v potravinářských produktech, jako jsou zmrzliny. V příkladu 3B se popisuje modifikované tvary krystalu, v případě, že směs voda-led se zmrazuje ve filmu v kombinaci s 0,01 % (hmotnostní procenta) AFP.

V dokumentu WO 92/22581 se popisují nemrznoucí polypeptidy AFP, které pocházejí z rostlin a které je možné použít při ovlivňování tvaru krystalů ledu ve zmrzlině. Tento dokument také popisuje postup extrakce kompozice polypeptidů z mezibuněěných prostorů rostlin. Uvedený postup zahrnuje infiltraci extrakčního média do listů, aniž dojde k poškození rostlinných buněk.

Dokument 92/03617 popisuje izolaci nemrznoucích polypeptidů (AFP) z kvasinek a možnost jejich použití ve zmrzlině. Dokument WO 96/11586 popisuje nemrznoucí polypeptidy (AFP) produkovaný mikroorganizmy.

Do současnosti se však nemrznoucí polypeptidy (AFP) nepoužily v běžně dostupných produktech vhodných pro konzumaci. Jedním z důvodů jsou vysoké náklady a složitý způsob získávání. Dalším problémem je skutečnost, že zdroj nemrznoucích polypeptidů (AFP) jsou obtížně získatelné v dostatečném množství (jsou to například ryby obsahující AFP) nebo tyto zdroje nejsou vhodné pro přímé použití v potravinářských produktech.

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu tvoří nemrznoucí polypeptid, obsahující sekvence aminokyselin (A) až (E) (A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS, (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS, (C) LEU-THR-XAA-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS, (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL-PRO-LEUPHE-PHE-PRO-GLN-LEU-XAA-LYS, (E) XAA-XAA-GLY-VAL-ILE-PRO-XAA-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASNLEU-LYS, kde XAA znamená jakoukoliv aminokyselinu.

V jednom z výhodných provedení tvoří podstatu vynálezu nemrznoucí polypeptid, obsahující sekvenci 1 aminokyselin nebo sekvenci s alespoň 85% identitou s touto sekvencí.

-1 CZ 295597 B6

Zjistilo se, že nemrznoucí polypeptidy, kterém mají dobré inhibiční vlastnosti rekrystalizace, je možné získat z mrkve. Zvláště se zjistilo, že nemrznoucí polypeptidy (AFP) získané z mrkve vykazují značně lepší vlastnosti ve srovnání s polypeptidy izolovanými z jiné kořenové zeleniny. Nemrznoucí polypeptidy (AFP) podle vynálezu jsou schopny poskytovat dobré inhibiční vlastnosti rekrystalizace, aniž dochází k podstatným změnám tvaru krystalů ledu. Tato skutečnost vede ke zlepšení vlastností například ke změkčení zmrzliny.

Zjistilo se, že účinné nemrznoucí polypeptidy, které pochází z mrkve, se obecně charakterizují tím, že jejich zdánlivé molekulová hmotnost zjištěná způsobem SDS-PAGE je 36 000. Vynález se tedy týká nemrznoucí polypeptidů (AFP), které lze získat z mrkve a jejichž zdánlivá molekulová hmotnost stanovená způsobem SDS-PAGE je 36 000.

Odborníkovi je zřejmé, že metoda stanovení, například SDS-PAGE, způsobuje odchylky a proto molekulovou hmotnost lze stanovit pouze s odchylkami. Z tohoto důvodu vynález zahrnuje tyto odchylky, což znamená, že termín „zdánlivá molekulová hmotnost 36 000“ zahrnuje také například variace od 30 000 do 40 000 nebo od 34 000 do 38 000.

Upřednostňují se nemrznoucí polypeptidy (AFP) podle vynálezu, které obsahují všechny částečné sekvence (A až E).

Celá aminokyselinová sekvence preferovaného nemrznoucího polypeptidů AFP podle vynálezu je uvedena dále v textu. Dále vynález zahrnuje nemrznoucí protein, který vykazuje následující aminokyselinovou sekvenci:

Sekvence 1

ATGAATATTGAATCA7CTTTCTGCCCTATTTTGTGCATATGCA~GATTTTCCTCTGCCTT

13-------+--------------------------—4.—----------------------72

MNIĚSSFCPILCICHZFLCL

CCAAACCTCTCTGCATCACAAAGATGCAACAACAACGACAAGCAAGCTTTACTCCAAATC

73-------+------·---+-----------------+---------+---------+— 132

ONLSASQRCNHNOKQALLQl AAAACAGCCTTGAAAAACCCCACCATTACAGACTCATGGGTGTCAGACGACGATTGTTGT

133-----------------+---------+---------*--------------------+— 192

KTALKNPTITDSWVŠDDDCC

GGT7GGGACCTAGTCGAATGTGACGAAACCAGCAACCGCATÁATTTCCCTCATAATTCAA

193 ——-—+—--———*————> —~4+— 252

GWDLVECDETSNRITSL IIQ

GACGACGAAGCTCTCACCGGCCAAATCCCACCTCAGGTGGGAGACCTACCATÁCCTCCAA

253 -------+

3Í2

D D EALTGQI PPQVGD LPYLQ

GCCTTATGGTTCCGTAAACTCCCCAATCTTTTCGGAAAAATCGCPJGAAGAAATTTCTGCA

313

ALWFRKLP NLFGK ——+ ------+— 372

P £ £ Γ S A

-2CZ 295597 B6

CTCAAAGACCTAAAATCCCTCAGACTCAGCTCGACCAGTCTCAGTGGCCCTGTCCCTTTA

3 _______

LKDLKSL.RLSSTSL.SGPVPL

TTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTTTAGACTTATCGTTTAACAAACTTTTGGGT

33------—ř----------------------------------------₊---------₊— ₄g₂

FFFQtTKLTCLDLSFNKLLG

GTAATCCCTCCTCAGCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCrGCACTTAGAACGTAAC

93 -------+----------+---------+-------------------+----------+— 552

VIPPQLSTLPNLKALHbERN

GAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGATCCCCGGACATATAT

553 -----------------+---------·----------+:---------+---------+— 612

ELTGEIPDIFGNFAGSPĎIY

CTTTCGCATAACCAGCTCACCGGGTTTGTTCCCAAAAČTTTTGCTAGAGCAGATCOAATT

613 ------+------——+—---------672

LSHNQLTGFVPKTFARADPI

AGGCTCGACTTCTCAGGGAACAGACTAGAAGGTGATATTTCATTGTTGTTTGGGCCTAAA

3-------+---------+---------+- —+—------+----------+— 732

RLDFSGNRLEGDISFLFGPK

AAACGCTTGGAAATGCTAGATTTTTCAGGAAACGTGGTTAGTTTCAATTTCTCCAGGGTG

733 —_----+---------+-------—+---------+ .------+---------+— 792

KRLEMLDFSG NVL SFNF SRV caggagtttccaccctctttgacatacttagacttgaaccataaccagatcágcggaagt

793 ——----+---------*---------^4-1--------—+---------+—~'——-+— 852 qefppsltyldlnhnqisgs ctgtcgagtgaattggctaaattggacctgcagacatttaacgtcagťgataataatctc

853 -------+— -----—+----------—-—- ‘+--------—+---------+— 912

LSSELAKLDLQT FNVSDŇNL tgcggcaagattccaacagggggaaacctccagagattcgaccgtacggcctatctccac

913-----------------+-----------------—+_—---——+------—-+— 992

CGKIPTGGNLQR FĎRTAYLH

AACAGTTGCTtGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAG

973-----—+---------+—-------+---------+- ion

NSCLCGAPLPE C*

Vynález dále popisuje izoformy a deriváty shora v textu uvedených polypeptidů, které vykazují nemrznoucí vlastnosti. Upřednostňuje se, aby deriváty vykazovaly alespoň 75% homologií 5 s polypeptidem uvedeným v seznamu 1 nebo s polypeptidem, který obsahuje částečné sekvence (A až E). Více se upřednostňuje homologie vyšší jak 85 %, nejvíce se upřednostňuje homologií vyšší jak 95 %. Pro účely vynálezu termín „derivát“ také zahrnuje modifikované polypeptidy, které stále vykazují vlastnosti nemrznoucího polypeptidů. Jsou to například glykosylované formy shora uvedených polypeptidů.

-3CZ 295597 B6

Vynález dále zahrnuje nukleotidové sekvence kódující shora popsané aminokyseliny. Vynález zvláště popisuje nukleotidové sekvence uvedené v seznamu 1 a jejich alely.

Vynález také popisuje nukleotidové fragmenty získané z kódující oblasti, která je schopna hybridizovat s příbuznými geny,které kódují nemrznoucí peptidy.

Ačkoli proteiny podle vynálezu se mohou jednoduše izolovat přímo z mrkve, mohou se také použít metody genové manipulace za vzniku proteinů podle vynálezu.

Vhodná hostitelská buňka nebo organizmus se bude transformovat genovou konstrukcí, která kóduje požadovaný polypeptid. Nukleotidové sekvence kódující polypeptid se může začlenit do vhodného expresivního vektoru, který obsahuje nezbytné elementy pro transkripci a translaci, způsobem, jenž umožní za vhodných podmínek její expresi (například ve správné orientaci a ve správném čtecím rámci a s vhodnými sekvencemi exprese a s vhodným cílením). Metody nutné ke konstrukci těchto expresivních vektorů jsou dobře známy v oboru.

Při expresi sekvence kódující polypeptid se může využít řada expresivních systémů. Mezi ně patří, ale neomezují se na bakterie, kvasinky, systémy buněk hmyzu, systémy kultur rostliny buněk a rostliny, přičemž všechny jsou transformované vhodnými expresivními vektory. Preferují se kvasinky, rostliny a systémy rostlinných kultur.

Rada odrůd rostlin a systémy rostlinných buněk se mohou transformovat konstrukce nukleových kyselin polypeptidů. Preferovaná provedení podle vynálezu zahrnují, ale neomezují se na kukuřici, rajčata, tabák, mrkve, jahody, semena hroznového vína a cukrovou řepu.

Jedno preferované provedení vynálezu se vztahuje na použití nemrznoucích polypeptidů podle vynálezu za účelem zvýšení tolerance rostlin při zmrazování. Tento příklad se může provést shora uvedenou metodou, přičemž se rostliny transformují za účelem zajištění (zvýšené) produkce nemrznoucích polypeptidů (AFP) podle vynálezu, čímž se zvýší tolerance uvedených rostlin při zmrazování.

Vynález také popisuje protilátky, které se specificky váží na polypeptidy (epitop polypeptidů) podle vynálezu. Vynález dále zahrnuje polypeptidy, které jsou imunologicky příbuzné, jak se stanoví jejich zkříženou reaktivitou s protilátkami vytvořenými proti shora uvedeným polypeptidům.

Na základě této informace je také možné geneticky modifikovat jejich přirozené zdroje tak, že produkují výhodné nemrznoucí polypeptidy (AFP), jak se uvádí shora v textu. Přednostně se vybírají ty nemrznoucí polypeptidy, které vykazují podstatné inhibiční vlastnosti proti re-krystalizaci ledu. Vhodný test pro stanovení inhibičních vlastností rekrystalizace se uvádí v příkladu 1. Preferované nemrznoucí polypeptidy (AFP) podle vynálezu způsobují, že velikost částic ledu ve zmrazených produktech (střední délka krystalů) po rekrystalizací je menší než 50 pm. Více se preferuje, aby tato délka ležela i intervalu 5 až 40 pm.

Nemrznoucí polypeptidy (AFP) se z výhodou používají v několika produktech, přednostně v potravinářských produktech, které se zmrazují nebojsou určeny ke zmrazení.

Mrkev, která obsahuje polypeptidy proti zamrzání (AFP) v přirozeně se vyskytujícím množství, není předmětem vynálezu. Potravinářský produkt, obsahující mrkev nebo její části však do rozsahu vynálezu spadá. Vynález také popisuje mrkev, která byla transformována za účelem nadměrné exprese nemrznoucích polypeptidů (AFP) podle vynálezu, to znamená mrkev, která obsahuje podstatně vyšší množství nemrznoucích polypeptidů AFP než mrkev, která nebyla transformována.

-4CZ 295597 B6

Příklady takových potravinářských produktů jsou mrazené potravinářské produkty, jako je zelenina, omáčky, polévky, šneky, mražené cukrářské produkty, jako je zmrzlina nebo ovocná zmrzlina z vody, mléčné výrobky, atd.

Preferovanými produkty, kde se používají nemrznoucí polypeptidy je zmrazená zelenina nebo zmrazené cukrářské produkty, jako je zmrzlina nebo ovocná zmrzlina z vody. Upřednostňuje se, aby množství nemrznoucích polypeptidů se pohybovalo v rozsahu 0,00001 až 0,5 % (hmotnostní procenta) na základě konečného produktu.

Jestliže se používají suché směsi nebo koncentráty, pak koncentrace AFP může být vyšší, aby se zajistilo, že množství konečného zmrazeného produktu je na horní hranici. Překvapivě se zjistilo, že kompozice podle vynálezu mohou obsahovat velmi malé množství nemrznoucích polypeptidů a stále zůstávají v dobré kvalitě. Preferované množství AFP je v rozmezí 0,00001 až 0,5 % (hmotnostní procenta), více se upřednostňuje, aby toto množství bylo v intervalu 0,00005 až 0,3 % (hmotnostní procenta). Nejvýhodnější množství AFP je v rozmezí 0,0001 až 0,2 % (hmotnostní procenta).

Pro účely vynálezu je nezbytné přidat k potravinářskému produktu nemrznoucí polypeptidy (AFP) v čištěné formě. Je možné také přidat kompozice obsahující AFP, například extrakt přírodního materiálu, který produkuje AFP.

Také je možné modifikovat potravinářský produkt tak, že AFP se produkuje in sítu. Což se děje například přidáním genově modifikovaných mikroorganizmů, které jsou schopny produkovat AFP v potravinářských produktech nebo dokonce genově modifikovat potravinářský produkt (například zeleninu) tak, že (zelenina) je schopen samostatně produkovat AFP in sítu.

V případě vynálezu termín „zmrazený cukrářský produkt“ zahrnuje mléko obsahující zavařeninu, jako je zmrzlina, mražený jogurt, šerbet, sorbet, mrazené mléko a mražený pudink, ovocnou zmrzlinu, dřeň a mražené ovocné pyré.

Upřednostňuje se, aby množství pevných částic ve zmrazených cukrářských produktech (například cukr, tuk, přísady, atd) nebylo více jak 3 % (hmotnostní procenta), více se preferuje 10 až 70 % (hmotnostní procenta). Například 40 až 70 % (hmotnostní procenta).

Mrazené cukrářské výrobky podle vynálezu se mohou připravovat libovolným způsobem, který je vhodný pro přípravu mražených cukrářských výrobků. Zvláště se preferuje, když všechny ingredience formulace jsou před začátkem procesu zmrazování zcela rozmělněny.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Mrkev (Daucus carota cv Autumn King) se pěstovala v jednotlivých kořenáčích. Když rostliny dosáhly stáří dvanácti týdnů, přenesly se do chladné místnosti a za účelem aklimatizace na chlad se uchovávaly po dobu čtyř týdnů při teplotě 4 °C a při konstantním záření světla. Zálivka se prováděla třikrát za týden.

Čerstvá tkáň mrkve se rozmělnila v misce tloučkem (byly vychlazeny na teplotu 4 °C) ve stejném objemu pufru A (10 mM EDTA, 20 mM kyselina askorbová, pH se upravilo na hodnotu 7,4 Tris). Vše se uchovávalo na ledu. Homogenáty se filtrovaly jednu vrstvou mušelínu a vše se před dalším použití uchovávalo na ledu.

-5CZ 295597 B6

Za účelem porovnání se pěstovaly rostliny i jiné kořenové zeleniny a z kořenů se připravily homogenáty, způsobem, který se popisuje shora v textu.

Za použití modifikovaného „štěrbinového testu“ („splát assay“) se měřila aktivita proti zmrznutí (Knight et al., 1988). 2,5 ul zkoumaného roztoku ve 30 % (hmotnost/hmotnost) sacharózy se přenesl na čisté, vhodně značené, 16 mm velké, kruhové podložní sklíčko. Druhé podložní sklíčko se umístil na povrch kapky roztoku a sendvič se stlačil mezi dvěma prsty. Sendvič se uložil do lázně s hexanem, která se uchovávala při teplotě -80 °C v boxu se suchým ledem. Když se připravily všechny sendviče, přinesly se pinzetou ochlazenou na suchém ledu z lázně s hexanem, kde byla teplota -80 °C, do pozorovací komory, která obsahuje hexan s teplotou -6 °C. Bylo možné sledovat, jak se mění sendviče z transparentních na opálové. Vzhled se natáčel videokamerou a vnesl se do systému analýzy obrazu (LUČIN, Nikon) za použití objektivu s 20-ti násobným zvětšením. Zobrazení každého sendviče se natáčelo v čase 0 a opakovalo se po 30 až 60 minutách. Porovnala se velikost krystalů ledu v obou časech. Jestliže velikost ve 30 až 60 minutě je podobná nebo pouze nepatrně vzrostla (řekněme méně než 20 % zvětšení, upřednostňuje se méně než 10% zvětšení, více se upřednostňuje zvětšení méně než 10%, více se upřednostňuje zvětšení menší než 5 %) ve srovnání s velikostí v čase 0, značí to dobré inhibiční vlastnosti re-krystalizace.

Výsledky: ze štěrbinového sendvičového testu je zřejmé, že vzorky kořenů mrkve, stonku a listů vykazují podstatné inhibiční vlastnosti re-krystalizace ledu, přičemž kořen a listy vykazují největší aktivitu. Testované vzorky kořenů mrkve, které nebyly aklimatizovány, vykazují podstatně nižší aktivitu. Dále se v příkladech pro další testování používaly vzorky tkáně kořenů.

Pro porovnání se provedla analýza několika dalších druhů kořenové zeleniny stejným způsobem sendvičovým štěrbinovým testem ve 30% sacharóze. Mezi touto zeleninou byly vodnice, kapusta, petržel, růžičková kapusta, libavka, brukev, pak choi, pastiňák a jahody. Žádný z těchto zdrojů materiálu neposkytuje podstatnou inhibiční aktivitu re-krystalizace ledu.

Příklad 2:

Kořenová tkáň mrkve se homogenizovala ve třech objemech (hmotnost/objemem) pufru (20 mM kyselina askorbová, 10 mM EDTA, 50 mM Tris/HCL, pH 7,2) v misce tloučkem a směs se filtrovala skrz jednu vrstvu mušelínu. Filtrát se centrifugoval při 6000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, shromáždil se supematant a centrifugoval se při 100 000 g po dobu 1 hodiny při teplotě 4 °C. Supematant vzniklý v tomto kroku je rozpustnou frakcí a pelet je mikrozomální frakcí.

Supematant se nanesl na kolonu Q Sepharose (Pharmacia) s rychlým průtokem s objemem 30 ml. Kolona se uvedla do rovnováhy 50 mM Tris/HCl pH 7,4; rychlost průtoku je 5 ml/min a udržuje ji čerpadlo HiLoad P-50. Kolonu řídí nízkotlaký chromatografický systém Gradifrac (Pharmacia) a pracuje při teplotě 4 °C a eluát se sleduje při OD 280 monitorem UV (Monitor UV1, Pharmacia) a zaznamenává se do grafu (REC 102, Pharmacia). Sebralo se 5 ml frakcí. Kolona se promývala 50 mM Tris/HCl pH 7,4 při stejné rychlosti průtoku až hodnota OD 280 byla opět nula. Pak se na kolonu aplikovat gradient o objemu 150 ml od 0-0,4 M NaCl v roztoku Tris/HCl pH 7,4 a následuje promytí kolony 2 M NaCl. Eluované frakce se podrobily testu stlačení, jak se popisuje v příkladu 1.

Spojily se frakce vykazující aktivitu proti zmrznutí jako důkaz inhibice re-krystalizace a koncentrovaly se za použití polyethylenglykolu následujícím způsobem: frakce se přenesly do dialyzačních střev (Sigma), které se promyly vodou z kohoutku, vyvařily se v 50 mM EDTA pH 7,5 po dobu 10 minut a promyly se vodou milli Q. Dialyzační střeva obsahující vzorek k zakoncentrování se překryly pevným polyethylenglykolem o molekulové hmotnosti 15 000 až

-6CZ 295597 B6

000 (Sigma) a inkubovaly se při teplotě 4 °C po dobu 4 hodin nebo do té doby, než se objem vzorku uvnitř dialyzačního střeva desetkrát snížil.

Spojené koncentráty pocházející zQ sefarózové kolony se aplikovaly buď na kolonu fenyl-sacharóza, na gelovou kolonu SMART superdex 75, nebo na gelovou kolonu FPLC superdex 75.

Nemrznoucí proteiny kořene mrkve se čistily gelovou chromatografíí následujícím způsobem:

Alikvót vzorku o objemu 20 ul se aplikoval na kolonu SMART superdex 75 (Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 50 mM Tris/JCl pH 7,4 obsahující 0,15 M NaCl (pufr E) při rychlosti průtoku 40 μΐ/min a komponenty se separovaly na gelu v rovnovážném pufru při stejné rychlosti průtoku. Eluát se monitoroval při OD 280 a OD 215. Frakce o objemu 80 μΐ se sebraly mezi 0,85 až 0,89 ml, frakce o objemu 40 μΐ se sebraly mezi 0,89 a 1,24 ml a frakce o objemu 100 μΐ mezi 1,24 a 3,0 ml. Mezerový objem (Vo) kolony byl 0,91 ml, což se stanovilo retenčním objemem roztoku modrého dextranu. Kolona supedex se uvedla do rovnováhy aplikací 10 μΐ roztoku, který obsahuje 5 mg/ml BSA (molekulová hmotnost je 66 000, retence (Ve)=l,02 ml), 3 mg/ml karbonatdehydratasa (molekulová hmotnost 29 000, Ve=l,22 ml), 2 mg/ml cytochromu C (molekulová hmotnost 12 400, Ve=l,41 ml) a 2 mg/ml aprotininu (molekulová hmotnost 6 500, Ve=l,59 ml) a do grafu se vynesla standardní křivka Ve/Vo proti logaritmu molekulové hmotnosti. Frakce obsahující aktivitu proti zamrzání se určily testem stlačení, jak se popisuje v příkladu 1. Maximální aktivity se dosáhlo při retenčním objemu 1,16 ml a molekulová hmotnost je 40 000. Toto měření potvrdilo, že pruh o molekulové hmotnosti 36 000 pocházející z mrkve aklimatizované na chladno je peptid proti zamrzání.

Test SDS-PAGE se provedl podle Laemmli (1970) za použití mini-systému Biorad. Vzorky, které jsou určeny pro analýzu testem SDS-PAGE, se rozpustily ve vzorkovém pufru pro SDS-PAGE (Laemmli 1970), zahřívaly se po dobu 5 minut při teplotě 100 °C v suchém zahřívacím bloku (Techne) a centrifugovaly se po dobu 3 minut při 10 000 g při teplotě místnosti. Vzorky (10 až 50 μΐ) se aplikovaly na mini-gely (Biorad, tloušťka minigelů je 0,75, 1,0 nebo 1,5 mm; složení gelů je 10, 12, 15 % akrylamid nebo 10 až 20 % gradient akrylamidu (Biorad, jde o předem vylité gely) a elektroforeticky se separovaly. Separované polypeptidy se v gelu fixovaly a barvily buď Coomassieovou modří (0,1 % (hmotnost/objemem) Coomassieovou briliantovou modří v roztoku kyselina octová/metanol/miliQ voda (5:4:31; objemový poměr)), nebo stříbrem za použití kitu barvení stříbrem od firmy Biorad podle pokynů výrobce. Gely se sušily mezi dvěma listy celofánu Gelair v sušičce Biorad gelair podle pokynů výrobce. Pro stanovení zdánlivé molekulové hmotnosti metodou SDS-PAGE se použily kity markérů vysokých a nízkých molekulových hmotností podle instrukcí výrobce.

Kořeny mrkve aklimatizované na chlad a neaklimatizované kořeny mrkve se podrobily chromatografii s výměnou iontů. Výsledky gelové SDS-PAGE vykazují u vzorků aklimatizovaných na chladno přítomnost pruhu o molekulové hmotnosti 36 000. Tento pruh byl daleko méně výrazný u kořene mrkve, která nebyla aklimatizována na chlad. Tomuto pruhu o molekulové hmotnosti 36 000 se proto přičítá aktivita proti zamrzání.

Příklad 3:

V případě sekvenování proteinu se protein kořene mrkve o molekulové hmotnosti 36 00 čistil způsobem, který se popisuje v předchozím příkladu a pak, aby se zajistila vyšší čistota vzorku určeného pro sekvenci, se vyřízl z gelu SDS-PAGE a proteolyticky se štěpil in šitu v pruhu polyakrylového gelu.

Přípravek vysoce čistého proteinu o molekulové hmotnosti 36 000, který stále obsahuje malé množství kontaminujících proteinů, se nanesl na 12 % polyakrylamidový gel. Na gel se do každé

-7 CZ 295597 B6 dráhy nanesly 2 pg proteinu, proběhla elektroforéza až barvivo dosáhlo dolní části gelu. Gel se pak barvil 0,2% Coomassieovou briliantovou modří (hmotnost/objemem), 30% metanolem (objem/objem), 1% kyselinou octovou (objem/objem) po dobu 20 minut a pak se odbarvil 30% metanolem až byly možné protein zviditelnit. Pruh o molekulové hmotnosti 36 000 se určil porovnáním s markéry molekulových hmotností, které se nanesly do přilehlých drah, a pruh se vyřízl ostřím skalpelu tak, aby se vyloučila kontaminace jinými pruhy.

Proužky gelu se přenesly do čisté eppendorfovy zkumavky a dvakrát se promyly 0,5 ml 50% acetonitrilu (objem/objem), 100 mM Tris/Cl, pH 8,5. Promýváním se částečně odstranilo Coomasseovo barvení a také dehydratované pruhy gelu. Pruhy gelu se pak odstranily ze zkumavky a sušily se na vzduchu na laboratorním stole až podstatně seschly a začaly se rolovat. Pak se přenesly zpět do eppendorfovy zkumavky a nejdříve se znovu hydratovaly 10 μΐ roztoku 100 mM Tris/HCl pH 8,5, který obsahuje 1 pg endoproteinázy Lys C (Boehringer Mannheim). Endoproteináza Lys C je proteináza, která specificky štěpí polypeptidové řetězce na straně C-konce lysinových zbytků. Dále se ke gelovým pruhům přidal pufr Tris až došlo k jejich úplné dehydrataci. Inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin.

Poté, co se do zkumavky za účelem ukončení reakce přidal 1 μΐ kyseliny trifluoroctové, se pruhy gelu dvakrát promyly 0,3 ml 60% acetonitrilu (objem/objem), 0,1 % TFA (objem/objem) při teplotě 30 °C po dobu 30 minut. Pruhy gelů se opět částečně dehydratovaly, čímž se zkrabatily a eluovaly se peptidy. Supematant se přenesl do jiné čisté eppendorfovy zkumavky a pak se sušil na centrifugační odparce po dobu dvou hodin, až vzorky byly skoro suché. Pak se resuspendovaly v 0,1 ml 0, 1 % TFA.

Peptidy se pak separovaly HPLC s reverzními fázemi mikročisticím systémem Smart (Pharmacia). Směs peptidů po štěpení se nanesla na kolonu Cl8 (rozměry kolony jsou 2,1 x 100 mm), která se uvedla do rovnovážného stavu 0,1 % TFA (rozpouštědlo A) při rychlosti průtoku 0,1 ml/min. Kolona se pak eluovala gradientem 0 až 70 % rozpouštědla B (90 % acetonitril (objem/objem), 0,085 % TFA (objem/objem)) po dobu delší než 70 minut při stejné rychlosti průtoku. Optická hustota se zaznamenávala při vlnové délce 214 nm a pomocí trakčního kolektoru s ručním krokováním se shromáždily jednotlivé peptidové píky. Na proteinový sekvenátor Perkin Elmermodel 492 nanesly polypeptidy a sekvence proběhla v cyklech s kapalnou fází podle postupu výrobce.

V pruhu o molekulové hmotnosti 36 000 se analyzovalo několik polypeptidových fragmentů (A až E). Zjistilo se, že vykazují sekvence v podstatě homologní s následujícími sekvencemi:

(A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS, (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS, (C) LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS, (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL-PRO-LEUPHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS, (E) X-X-GLY-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU-LYS,

Příklad 4a: Kultivace buněk mrkve

Suspenze kultivační linie (NOR) buněk mrkve se získala z instituce Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Leeds. Kultura se udržovala sub-kultivací.

V sedmi-denních cyklech se 10 ml kultury kultivovaly v 90 ml Murashige a Skoog kultivačního média (Sigma), které obsahuje 25 g/1 sacharózy a 1 mg/1 2,4-D. Kultury se inkubovaly v inkubátoru s orbitálním míchání při 150 ot./min. a při teplotě 25 °C ve tmě.

-8CZ 295597 B6

Kultura NOR se vystavila chladu následujícím způsobem:

Kultury NOR se přenesly do chladu (teplota 4 °C) po 4 a 7 dnech kultivace při teplotě 25 °C. Kultury se sklízely v čase 0 a v čase 7 dní a 14 dní. Při sklizni buněk se stanovil pro každou buněčnou linii v každém časovém bodě buněčný objem (PCV). Vzorky kultivačního média suspenze NOR se analyzovaly následujícím způsobem. Rozmrazila se přibližně 1/10 objemu mraženého alikvotu upraveného kultivačního média suspenze. Odebrala se rozmražená část a testovala se její aktivita pomocí testu stlačení sendviče, jak se popisuje v příkladu 1. Zjistilo se, že kultivační médium kultury aklimatizované na chlad vykazuje podstatně vyšší aktivitu ve srovnání s kultivačním médiem kultu, které nejsou aklimatizované na chlad.

Kultivační médium NOR mrkve aklimatizované na chlad se upravilo přidáním 100 μΐ pufru 1 M Tris/HCl pH 7,4. Aktivita se specifikovala gelovou chromatografíí a chromatografíí s výměnou iont za použití metod založených na postupech uvedených v příkladu 2: Pufrem upravené kultivační médium se naneslo na Q sefarózovou kolonu (Pharmacia) o objemu 1 ml s průtokovou rychlostí 1 ml/min a navázané molekuly se eluovaly alikvoty 500 mM Tris/HCl pH 7,4 o objemu 3 ml, které obsahují NaCl o koncentraci rostoucí od 0,1 M do 0,5 M po 0,1 M. Sbíraly se frakce o objemu 1 ml a testovala se jejich aktivita, jak se popisuje v příkladu 1. Aktivní frakce se srážely acetonem a pelet se re-suspendoval v 50 μΐ 50 mM Tris/HCl + 0,15 M NaCl, pH 7,2. Vše se centrifugovalo při 10 000 g po dobu 10 minut a 20 μΐ se naneslo na gelovou kolonu Superdex 75 na systém SMART Pharmacia. Rychlost průtoku je 40 pl(min a mobilní fází je 50 mM Tris/HCl + 0,15 M NaCl, pH 7,2. Sebraly se frakce o objemu 80 μΐ a podrobily se sendvičovému štěrbinovému testu. U frakcí,které se vztahují k retenčnímu objemu 1,16 ml se detekovala aktivita.

Další izolace aktivních proteinů je možné provést testem SDS-PAGE v souladu s příkladem 2.

Příklad 4b: Kořenová kultura mrkve.

Za účelem přípravy jednotlivých kultur se 10 povrchových sterilizovaných semen Daucus carote cv „Autumn King“ umístilo do 100 ml kultivačního média MS ve sterilních Erlenmayerových sklenicích, přičemž uvedené kultivační médium obsahuje 25 g/1 sacharózy a 0,5 g/1 MES. Semena se nechala vyklíčit ve tmě, při teplotě 25 °C, po dobu tří týdnů za stálého míchání. Pak se asepticky odstranily výhonky a kořeny. Kořeny se přenesly do čerstvého kultivačního média o objemu 100 ml a inkubovaly se po dobu dvou týdnů za stálého míchání.

Dále uvedeným způsobem se připravily homogenáty z kořenových kultur, které se vystavily nebo nevystavily působení chladu. Rychle zmrazené kořeny se 3x rozmělnily v kapalném dusíku ve vychlazené misce tloučkem, pak se přenesly do dalšího vychlazené misky s tloučkem se drtily s 0,5-ti násobkem objemu ledem chlazeného roztoku 50 mM Tris-HCl + 10 mM EDTA pH 7,4, který obsahuje 30 % (hmotnost/hmotnost) sacharózy. Homogenáty se centrifugovaly při 10000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a v supematantech se testovala aktivita způsobem, který se popisuje v příkladu 1.

Podstata silnější aktivity vykazují kořenové kultury vystavené působení chladu než ty, jenž se tomuto působení nevystavily.

Příklad 5: Příprava zmrzliny.

Čerstvě vytažená mrkve aklimatizované na chlad (jak se popisuje v příkladu 1) se oškrábala ve studené vodě a použila se pro přípravu kořenového extraktu. Odstranily se vršky mrkve a za použití domácího extraktoru (Russell Hobbs, model č. 9915) se připravila šťáva. Šťáva se zmrazila do bloků o objemu 1 1 a uskladnila se při teplotě -20 °C. Při přípravě zmrzliny se do šťávy přidaly následující formulace:

-9CZ 295597 B6

Ingredience	Váhové části
Odstředěné sušené mléko	10,000
Sacharóza	13,000
MD40	4,00
Guma lusku rohovníku	0,144
GenulactaLlOO	0,016
MGP	0,300
Buteroil	8,000
Vanilin	0,012
Voda	64,528
Mrkvový extrakt (vytvořený z mrkve aklimatizované na chladno, který obsahuje 1 až 10 mg AFP najeden kilogram	4,472

Zmrzlina se připravila zmrazením shora uvedené formulace a areace byla 106%.

Měření se provedlo u čerstvého vzorku a u vzorků, které se poškodily uchováváním při teplotě -10 °C po dobu 10 dní. Pro srovnání se provedlo stejné měření ve vzorcích, které neobsahuje mrkvový extrakt. Měření se provedlo následujícím způsobem:

Vzorky se uvedly do rovnovážného stavu při teplotě -18 °C vProlanově boxu (Prolan Environmental cabinet) po dobu 12 hodin. Z každé vsádky zmrzliny se vybraly tři reprezentativní vzorky a ze středu každého bloku vzorku v boxu, kde je teplota řízena kryostatem, se setřela tenká vrstva na mikroskopické sklíčko. Na každé sklíčko se kápla kapka bílého alkoholu a přiklopilo se krycí sklíčko. Každé sklíčko se pak přeneslo na plošinu mikroskopu, kde je udržována nízká teplota (Leit LaborLux S, objektiv 10 x, Leica, teplota -10 °C). Videokamerou (Sonyo CCD) se zaznamenávalo zobrazení krystalů ledu (přibližně 400 jednotlivých krystalů ledu) a uložilo se v analyzačním systému (LEICA Q520MC).

Uložené vyobrazení krystalů ledu se zdůraznilo ručním vybarvením okolí hranic krystalu, což vedlo k vyjasnění celého krystalu. Vyobrazení vyjasněných krystalů se pak měřilo za použití software pro analýzu zobrazení, které počítá počet pixelů nutných pro celou nejdelší přímou čáru (délka), nejkratší přímou čáru (šířka) a poměr stran obrazu (délka/šířka). Data pro každý jednotlivý krystal ledu bloku zmrzliny se vnesly do tabulek a provedla se analýza dat. Určil se průměr a standardní odchylka.

Za použití testovacího univerzálního zařízení Hounsfíeld H10KM, komory Hounsfield 100N a cylindrické bezbarvé ocelové sondy o délce 10 cm se měřila tvrdost zmrzliny. Vzorky zmrzliny se připravily inkubací po dobu 16 hodin v blocích o objemu 486 ml v Prolanově boxu s řízenou teplotou při teplotě -18 °C.

Blok zmrzliny se přenesl zProlanova boxu do univerzálního testovacího zařízení Hounsfield H10KM. Deseti centimetrová sonda se vtlačovala konstantní rychlostí 400 mm/min do bloku zmrzliny do hloubky 20 mm. Použila se maximální síla zaznamenaná během stlačení a vyjádřila se jako tvrdost zmrzliny. Jestliže se zaznamenal vznik prasklin vzorku zaznamenalo se to do pravého sloupce.

Získaly se následující výsledky:

	Parametry velikosti krystalů ledu	Vlastnosti materiálu
Vzorek	Průměrná délka krystalu (um)	Průměrná šířka krystalu (um)	Průměrný faktor tvaru krystalu	Průměrný poměr stran obrazu krystalu	Tvrdost (N)	Pozorování prasklin
AFP mrkve-Čerstvé	26,79+ 1,3	19,00 + 0,9	1,15 + 0,013	1,43 ±0,024	40,8	ano
AFP mrkve-porušené	33,48 + 1,3	24,61 ±0,9	1,13 + 0,013	1,37 ±0,020	59,9	ano
Kontrola-čerstvá	33,67 ± 1,1	24,79 + 0,8	1,12 ±0,008	1,38 ±0,018	27,3	Ne
Kontrola-porušená	61,77 + 2,7	46,54 + 2,0	1,11+0,010	1,37 ±0,020	32,7	Ne

-10CZ 295597 B6

Tyto výsledky dokazují, že AFP mrkve vykazují dobré inhibiční vlastnosti rekrystalizace ledu.

Příklad 6:

Analyzovalo se, zda peptidové sekvence uvedené v příkladu 3 jsou vhodné pro přípravu oligonukleotidových primerů. Vybrala se část peptidů D (GLY-PRO-VAL-PRO-LEU-PHE-PHEPRO) a syntetizoval se primer cp3 (GGI CCI GTICCIYTITTY TTY CC, kde I je inosin a Y je C nebo T) (Genosys).

První řetězec cDNA se připravil z 5 pg RNA kořene mrkve aklimatizované na chlad (1 měsíc, jak se uvádí v příkladu 1) za použití reverzní transkriptázy Superscript (Stratagen) a oligonukleotidového primerů OG1 (GAGAGAGGATCCTCGAG (T)¹⁵ podle instrukcí výrobce. 1 % reakce cDNA prvního řetězce se použilo jako templát v následné PCR dohromady s primery cp3 a OG1. Reakce proběhly v teplotním cyklem za použití Taq DNA polymerázy (Gibci BRL) ve 30 cyklech (po dobu 1 minuty při polymerázy (Gibco BRL) ve 30 cyklech (po dobu 1 minuty při teplotě 94 °C, po dobu 1 minuty při teplotě 50 °C a po dobu 1 minuty při teplotě 72 °C) podle instrukcí výrobce. Všechny primery se použily v koncentraci 1 μΜ. Výsledný produkt PCR o velikosti přibližně 800 bp se čistil na gelu a klonoval se do vektoru pTAg (R and D Systems) podle instrukcí výrobce. Klonovaný cp3 PCR produkt se sekvenoval za použití dideoxysekvenačních metod za použití kitu Sequenase (USB). Nukleotidová sekvence cp3 a odvozená aminokyselinová sekvence byly v podstatě podobné s dále uvedenou sekvencí:

-11 CZ 295597 B6

Sekvence 2

GGGCCGGTGCCSCTGTTCTTCCCTCAGCTTACGAAACTAACTTGTŤTAGACTTATCGTTT

1-------------------+---------₊----------₊;---------₊---------_{r+ g0}

GPVPLFFP QLT KLTCLDLSF .AACAAACTTTTGGGTGTAATCCCTCCTCAGCTTTCCACTCTTCCGAACCTTAAAGCCCTG

61---------+---------+— ----+-—-—_—+—_—.---+120

NKLLGVIPPQL STLPNLKAL

CACTTAGAACGTAACGAACTCACCGGTGAAATCCCCGATATCTTTGGGAATTTTGCTGGA

121---------+---------+-------—* ------+-------—+—---+ 130

HLERNELTGEIP0IFGN’FAG

TCCCCGGACATATATCTTTCGCATAACCAGCTGACCGGGTTTGTTCCCAAAACTTTTGCT

131---------+—-------·+---------4·---------+-— ------+------+ 240

SPDIYLS HNQLTGFVPKTFA aGagcagatccaattaggctcgacttctcagggaacagactagaaggtgatatttcattc

241---------+-------—-+-------—+- -----+_--------+.-------—+ 300 radpirldfsgnrlegdisf ttgtttgggcctaaaaaacgcttggaaatgctagattťttcaggaaacgtgcttagtttc

301---------+---------+-------------------_--------—₊.--------._+ 360

LFGPKKRLEKLDFSGNVLSF aatttctccagggtgcaggagtttccaccctctttgacatacttagacttgaaccataac

361-------------------------------------------------------------+ 420

NFSRVQEFPPSLTYLDLNHN

CAGATCAGCGGAAGTCTGTCGAGTGAATTGGCTAAATTGGACCTGCAGACATTTAACGTC

421 --------+---------+---------+-----------------—+—— -----+ 480

QISGSLSSELAKLDLQTFNV agtgataatmtctctgcggcaagattccaacagggggaaacgtccagagattcgaccgt

481 ——-----+--— ----+---------+---------+---------4.—--——-+ 54 0 sonnlcgkiptggnlqrfdr

ACGGCCTATCTCCACAACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAGTTACCA

541---------+---------*---------*---------+--------------------+ 600 tay£,hnsgx.cgapu?ec*'

TGCAAAATGTGCCTTAAGGTTATCTTTGTAATGAGATATATTATGCAGCTGAAGGCAGAG

601---------+--------------------+- —-—+-----------— ------+ 660 caataagttttcctaatttgttatagtaagatattattgtatttcacagaaagtgtctac

661 ---------+---------+---------+-------------------+---------+ 720 taggattcgtaatatattataattgctcataattgtatctgtttaatctgtaatccaaaa

721--------------------+---------+-------+-------_-₊_.-------_* 780 acctttatgtattggtttgacacttttgagctttawuwaaaaaaaaa

781 ---------+---------*--------—*—Ί-----------------829

-12CZ 295597 B6

Za účelem získání celé sekvence kódující AFP mrkve se zkonstruovala knihovna cDNA. Pro izolaci mRNA z 500 pg celkové RNA mrkve aklimatizované na chlad (1 měsíc) se použila poly(A)+ quick kolona podle instrukcí výrobce. Všechny výsledné poly(A)+ RNA se použily při syntéze cDNA a následné konstrukci knihovny za použití kitu vektoru lambda ZAP (Stratagene). 5 1 x 10⁵ rekombinantních klonů se testovalo hybridizací, kde se jako sonda značená ³²P použil produkt PCR cp3.

U pozitivních plaků se testovala čistota a jejich DNA se sekvenovala. Pro úplnost se sekvenovaly dva klony cDNA. Ačkoli 5' a 3' nepřekládané oblasti zahrnovaly několik odchylek v sekvenci, ío kódující oblasti byly stejné. Kódující oblasti dvou klonů cDNA byly v podstatě podobné s následující sekvencí:

-13CZ 295597 B6

Sekvence 1

ATGAATArTGAATCATCTTTCTGCCCTATTTTGTGCATATGCAŤGATTTTCCTCTGCCTT £3 ------——-----—+·----—₊„,,-------₊-------------------₊ „ ₇₂

MNIESSFCPILCXCMI FLCL

CCAAACCTCTCTGCAŤCACAAAGATGCAACAACAACuACAAGCAAGCTTTACTCCAAATC

73-------+---------+---------------------₊---------₊—--------4.— 132

PNLSASQRCNNND KQALLQZ aaaacagccttgaaaaaccccaccattacagactcatgggtgtcagacgacgattgttgt

133-------+----------k----------------------------+---------4.— 132

KTALKNPTITOS WVSDD DCC ggttgggacctagtcgaatgtgacgaaaccagcaaccgcataatttccctcataattcaa

193 -------*--------—---------------. 4.---------+---------₊— ₂₅₂

GWDLVECDETSNR-IS LirQ gacgacgaagctctcaccggccaaatcccagctcaggtgggagacctaccatacctccaa

253 —-----———h--------------------₊---------—4— 312 ooealtgqi ppqvgdlpylq gccttatggttccgtaaactccccaatcttttcggaaaaatcccagaagaaatttgtgca

313--------------·---+,----------------------------------------+— 372

ALWFRKLPNL FG K Iř EE-ISA ctcaaagacctaaaatccctcagactcagctcgaccagtctcagtggccctgtcccttta

373-------k----------+-------------------+---------------------- 432

LKDLKSLR LS STSLS GPVPL ttcttccctcagcttacgaaactaacttgtttagacttatcgtttaacaaacttttgggt

33 ----------------- -------+---------*---------+---------+— 4 92

FFPQLT K L T CLDLSFNKLLG gtaatccctcctcagctttccactcttccgaaccttaaagccctgcacttagaacgtaac

93 -------+----------*----———k-----i----+---------₊---------*— 552 vippqlstlpnlkalhlern gaactcaccggtgaaaťccccgatatctttgggaattttgctggatcgccggacatatat

SS3-------+-------------------*----------+-------------------*— 612

ELTGEI PDIFGHFAGSPD ÍY ctttcgcataaccagctcaccgggtttgttcccaaaacttttgctagagcagatccáatt

513 ——----—+— ----——4.———-————+——— -----„4.—.-----—-r—-------—672

LSHN QLTGF VPKTFÁRADPI aggctcgacttctcagggaacagactagaaggtgatatttcattcttgttťgggcctaáá

3 ————+——'·—+------——————-+—-----.->—*4 -k —-—·+—— 7 32 rldfsgnrl egoisflfg pk aaacgcttggaaatgctagatttttcaggaaacgtgcttagtttcaatttctccagggtg

733 -------+-----------------------------------------+----:-------- 7 92

KRLEMLDFSGNVLSFNFSRV caggagtttccaccgtctttgacatacttagacttgaaccataaccagatcagcggaagt

793 -------------------+------——---------+---------+---------+— 952

QEFPPSLTYLDLNHNQISGS ctgtcgagtgaattggctaaattggacctgcagacatttaacgtcagtgataataatctc

853 -------*---------+---------*---------+---------+---------912

LSSELAKLDLQ TFNVSDNN L tgcggcaagattccaacagggggaaacctccagagattcgaccgtacggcgtatctccac

913-------------------------+---------------------+— -------+— 97 2

C G K I P T G G N L Q R F D R T A Y L H

AACAGTTGCTTGTGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCTAG

973-------+---------+---------*---------+- 1011

NSCLCGAPLPEC*

Částečná sekvenční analýza 4 dalších klonů také ukazuje, že tyto klony obsahovaly stejnou kódující oblast jako zcela sekvenované klony a tak je pravděpodobné, že všechny pozitivní klony 5 při testování knihovny představují transkripty stejného genu. Existuje pouze jedné kopie genu

-14CZ 295597 B6

AFP vgenomu mrkve je dále podpořena skutečností, že analýza genomové DNA mrkve

Southernovým přenosem naznačuje, že se sonda hybridizuje pouze jeden fragment.

Příklad 7:

Za účelem dokázat, že cDNA mrkve, jak se uvádí v příklad 6, reprezentuje AFP, se provedla exprese kódující oblasti následujícím způsobem. Jedna z cDNA se nejdříve klonovala do plazmidového vektoru pUC (Messing, 1983), který obsahuje expresivní kazetu s dvojitým promotorem CaMV 35A (Guerineau, J.F. Woolsten, S., Broiks, L. and. Mollineaux, P. (1988)). Pak se klonovala do binárního vektoru, jak se popisuje dále v textu. Všechny použité enzymy se získaly od firmy Gibco BRL a použily se podle instrukcí výrobce.

Fágemid pBlueskript (Stratagene), který obsahuje klon cDNA, se štěpil restrikčním enzymem Xho / a 3' konec se upravil Klenow fragmentem DNA polymerázy I. Fragment cDNA se pak z vektoru uvolnil trávením restrikčním enzymem EcoRI. Restrikční fragment enzymu EcoRI s tupým koncem se pak klonoval do plazmidového vektoru pUC štěpeného restrikčním enzymem EcoRI s tupým koncem. Expresivní kazeta CaMV 35A-cDNA se pak sub-klonovala jako částečný fragment restrikčního enzymu Hind III do binárního vektoru pBin 19 štěpeného restrikčním enzymem Hind ΙΠ (Bevan 1984). Konstrukce binárního vektoru se pak zavedla do rostlin tabáku transformací zprostředkovanou bakterií Agrobacterium (jak se popisuje v publikacích Draper, J., Scott, R., Armetage, P. a Walden, R. (1988)).

Ihned po regeneraci materiálu rezistentního na kanamycin se u transgenního kalasu rostlin tabáku zjišťovala exprese inhibiční aktivity re-krystalizace. Z několika kalů rezistentních na kanamycin a s několika kalusů rostlin tabáku divokého typu se připravily extrakty proteinů v malém měřítku. Přibližně 2 g tkáně se rozmělnily v 1 až 2 ml sacharózového pufru (30 % sacharózy, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 20 mM askorbát, pH 7,2) za použití misky a tloučku. Roztok se centrifugoval při 10 000 x g po dobu 2 minut a supematant se přenesl do nové zkumavky. Alikvot proteinového extraktu o objemu 3 μΐ se podrobil testu za účelem stanovení rekrystalizační aktivity, přičemž se použil sacharózový sendvičový štěrbinový test podle příkladu 1. Všechny extrakty kalusu rezistentní na kanamycin vykazují inhibiční aktivitu rekrystalizace.

Připravily se také stabilní transgenní rostliny tabáku, které exprimují AFP mrkve. Extrakty listů z rostlin divokého typu a z transgenních rostlin se podrobily northemově analýze za použití cDNA AFP jako sondy. mRNA AFP se detekoval pouze v transgenních rostlinách tabáku. To naznačuje, že mRNA AFP je stabilní v transgenních rostlinách tabáku, také rostly ve skleníku. Když se porovná s transkriptem přirozené mrkve, AFP transkript rostlin tabáku se zdá být trochu větší. Tento rozdíl lze snadno vysvětlit konstrukcí AFP expresivní kazety. Vzhledem k tomu, že polyadenylační signál CaMV 35A je většinou na 3' konci konstrukce, je pravděpodobně, že tento signál se používá v transgenní mRNA AFP za vzniku delšího transkriptu. Extrakty listů z rostlin tabáku divokého typu a z transgenních rostlin se také analyzovaly testem westernovým přenosem za použití protilátek proti AFP mrkve. V transgenních rostlinách tabáku se detekovaly pouze křížově reagující protein. Navzdory rozdílu ve velikosti transkriptu má protein vznikající v rostlinách tabáku stejnou velikost jako přirození AFP mrkve.

Shora v testu uvedená data dokazují, že protein izolovaný z mrkve a odpovídající cDNA reprezentuje aktivní AFP.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Nemrznoucí polypeptid, obsahující sekvence aminokyselin (A) až (E) (A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS, (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS, (C) LEU-THR-XAA-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS, (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL-PRO-LEUPHE-PHE-PRO-GLN-LEU-XAA-LYS, (E) XAA-XAA-GLY-VAL-ILE-PRO-XAA-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASNLEU-LYS, kde XAA znamená jakoukoliv aminokyselinu.
2. Nemrznoucí polypeptid, obsahují aminokyselinovou sekvenci 1 nebo sekvenci s alespoň 85% identitou s touto sekvencí.
3. Izolovaná kódující sekvence nukleové kyseliny pro nemrznoucí polypeptid z nároku 1 nebo 2.
4. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny odpovídající nukleotidové sekvenci 1.
5. Způsob získávání polypeptidů podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se polypeptid izoluje z mrkve aklimatizované na chlad.
6. Způsob získávání polypeptidů podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se polypeptid exprimuje v geneticky modifikovaném organismu.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že geneticky modifikovaným organismem je mikroorganismus, rostlina nebo buněčná kultura.
8. Protilátka, schopná se specificky vázat na polypeptid podle nároku 1 nebo 2.
9. Potravinářský produkt, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 nebo 2 za předpokladu, že se nejedná o mrkev.
10. Potravinářský produkt podle nároku 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že tímto produktem je zmrazený cukrářský produkt nebo zmrazená zelenina.
11. Způsob výroby potravinářského produktu, obsahujícího nemrznoucí polypeptid podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se

a) k potravinářskému produktu přidá přípravek, obsahující nemrznoucí polypeptid nebo se

b) nemrznoucí polypeptid vytvoří in sítu expresí v geneticky modifikovaném organismu.
12. Použití nemrznoucího polypeptidů podle nároku 1 nebo 2 pro zvýšení tolerance rostlin proti mrazu.
13. Použití sekvence nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4 pro zvýšení tolerance rostlin proti mrazu.

-16CZ 295597 B6
14. Mikroorganismus, buněčná linie nebo rostlina, transformovaná sekvencí nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4 za předpokladu, že se nejedná o nemodifikovanou rostlinu mrkve.