CZ296065B6 - Zkrácené deriváty lidského inzulinu - Google Patents
Zkrácené deriváty lidského inzulinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296065B6 CZ296065B6 CZ20000401A CZ2000401A CZ296065B6 CZ 296065 B6 CZ296065 B6 CZ 296065B6 CZ 20000401 A CZ20000401 A CZ 20000401A CZ 2000401 A CZ2000401 A CZ 2000401A CZ 296065 B6 CZ296065 B6 CZ 296065B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- phe
- gly
- insulin
- phenhi2
- human insulin
- Prior art date
Links
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims abstract description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical group N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract 2
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- CBENHWCORLVGEQ-HJOGWXRNSA-N Phe-Phe-Phe Chemical group C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CBENHWCORLVGEQ-HJOGWXRNSA-N 0.000 claims 1
- 108010065135 phenylalanyl-phenylalanyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- -1 Boc - t-Butoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 4
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-(n-(4-methylphenyl)sulfonylanilino)propanoic acid Chemical compound C=1C=C(C)C=CC=1S(=O)(=O)N([C@@H](C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028250 desoctapeptide- insulin Proteins 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;n,n-dimethylformamide Chemical compound ClCCl.CN(C)C=O MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- LLYKPZOWCPVRPD-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine;n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=CC=N1 LLYKPZOWCPVRPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical group [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zkrácené deriváty lidského inzulinu obecného vzorce I X - Gly - Y (I), kde X=desoktapeptidinzulin, Y=Phe-Phe-PheNH.sub.2.n. nebo Phe-Phe-N(CH.sub.3.n.)PheNH.sub.2.n. nebo Phe-N(CH.sub.3.n.)-Phe-PheNH.sub.2.n.. Zpusob výroby techto derivátu, kde se desoktapeptid izulinu kondenzuje s tetrapeptidy vzorce Gly-Phe-Phe-Phe-NH.sub.2.n. nebo Gly-Phe-Phe-N(CH.sub.3.n.)PheNH.sub.2.n. nebo Gly-Phe-N(CH.sub.3.n.)-Phe-PheNH.sub.2 .n. v prítomnosti tosylfenylalaminchlorketon trypsinu v 50 - 65% dimethylformamidu pri teplote 4-25 .degree.C po dobu 3-24 h, nacez se vzniklé produkty izolují, zejména vysokoúcinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi.
Description
Vynález se týká nových semisynteticky připravených zkrácených derivátů lidského inzulínu.
Dosavadní stav techniky
Krácení karboxyterminální sekvence B-řetězce lidského inzulínu je možné, ale má ve vztahu k biologickému účinku své limity. Kritická délka B řetězce inzulínu je 25 aminokyselin a to ještě za předpokladu, že koncový karboxyl fenylalaninu 25 je amidován
23 24 25 26 27 28 29 30
-----Arg-Gly-Phe-Phe-T yr-Thr-Pro-Lys-Thr
Jiné řešení je zachování sekvence B22-B26, u analogů lidského inzulínu připravených semisynteticky z desoktapeptid inzulínu a tetrapeptidů je viditelnější dopad následných záměn provedených v dané oblasti molekuly lépe než je tomu u despentapeptid analogů lidského inzulínu (CZ Užitný vzor 6381). V CZ užitném vzoru č. 6381 byla pozornost soustředěna na destetrapeptid inzulíny, v jejichž karboxyterminální části B-řetězce B23-B26 byla modifikována peptidová vazba, tj. byl substituován vodík - NH - skupiny methylovou skupinou. Cílem bylo zajistit vyšší metabolickou stabilitu proti endopeptidázovému štěpení. Zavedením N-methylované aminokyseliny (N(CH3) fenylalaninu) do jednotlivých pozic bezpochybně zvýší odolnost vazeb vůči chymotrypsinu, ale odrazí se v prostorovém uspořádání té části řetězce, která je považována za rozhodující pro interakci inzulínového analogu s receptorem. Zavedením N-methylované aminokyseliny ztrácí peptidová vazba schopnost tvořit vodíkový můstek. Se změnou konformace peptidové vazby je spojena změna lokální flexibility peptidového řetězce a vzroste hydrofobicita peptidu.
Postupem peptidové syntézy na pevné fázi byly připraveny tři analogy sekvence B23-B26, které byly pomocí enzymově katalyzované semisyntézy připojeny na karboxyl argininu B22. Produkty byly izolovány a charakterizovány.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou zkrácené deriváty lidského inzulínu obecného vzorce I
X-Gly-Y (I) kde X = desoktapeptidinzulin,
Y = Phe-Phe-PheNH2 (látka I) nebo
Phe-Phe-N(CH3)PheNH3 (látka Π) nebo Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 (látka ΠΙ).
Tetrapeptidy, které se připraví syntézou na pevné fázi, se kondenzují s desoktapeptid inzulínem v přítomnosti tosylfenylalaninchlorketon trypsinu v 50-65 % DMF při teplotě 4-25 °C po dobu
3-24 hodin. Vzniklé produkty se izolují, zejména vysokoůčinnou kapalinovou chromatografíí na reverzní fázi.
-1 CZ 296065 B6
Příklady provedení
Vysvětlení zkratek
Boc - t-Butoxykarbonyl,
DIEA - Diizopropylethylamin,
DCM - Dichlormetan,
HOBt ester - Hydroxybenztriazolový ester,
DCC - Dicyklohexylkarbodiimid,
DMF - Dimethylformamid,
DMAP - Dimethylaminopyridin,
TFA - Kyselina trifluoroctová,
RP-HPLC - Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi,
TPCK - Tosylfenylalaninchlorketon
Příklad 1
Tetrapeptidy byly syntezovány na pevné fázi dle Merriflelda. K syntéze byla použita 4-methylbenzhydrylaminová (MBHA) pryskyřice (substituce 0,57 mmol/g). Jako semipermanentní Nkoncové chránění byla použita t-butyloxykarbonylová skupina (Boc). Syntéza byla prováděna v 0,3 mmol měřítku. Byl použit následující protokol syntézy. Pryskyřice byla neutralizována opakovaným promytím 10 % DIPEA v DCM (2x5 min), potom byla promyta DCM (3 x 1 min). Poté byl do reaktoru s pryskyřicí přidán trojnásobný molámí přebytek HOBt esteru chráněné aminokyseliny. Reakce probíhala 1 hodinu. (Ester byl připraven z Boc-aminokyseliny a HOBt působením DCC ve směsi DCM-DMF (9 : 1), reakční doba byla 30 minut při 0 °C. Od vzniklého esteru byla odfiltrována vysrážená dicklohexylmočovina, tato promyta DCM a filtrát zahuštěn za laboratorní teploty a poté přidán DMF do výsledné koncentrace přibližné 0,1 M. Výjimkou byly kondenzace Boc-N(CH3)Phe, kdy kondenzace byla prováděna bud činidlem ByBrop/DMAP nebo HBTU/DIEA. Průběh reakce byl sledován kvalitním Kaiserovým testem, pouze však při kondenzaci nemethylovaných aminokyselin. Pokud byl test negativní, následoval další reakční krok. V případě pozitivního nálezu byla kondenzační reakce opakována. Po ukončení výstavby peptidového řetězce byla odštěpena N-koncová Boc skupina působením 50 % TFA v DCM, reakce probíhala 25 min. Poté se pryskyřice promyla DCM, 4 x 1 min, objem DCM byl vždy 50 ml. Pryskyřice byla vysušena do konstantní váhy. Odštěpení peptidů z nosiče spolu s odštěpením chránících skupin v postranních řetězcích bylo provedeno kapalným fluorovodíkem ve směsi s anisolem (9 : 1) při 0 °C. Fluorovodík byl vyfoukán dusíkem při 0 °C a anisol extrahován vychlazeným diethyletherem (4 x 50 ml). Uvolněné peptidy byly extrahovány 20 % kyselinou octovou (5 x 50 ml), pryskyřice odfiltrována a roztok peptidů lyofílizován. Čistota peptidů byla kontrolována stanovením aminokyselinového složení, RP-HPLC a hmotovou spektrometrií.
Příklad 2
Příprava [Gly23-Phe24-Phe25-Phe26-NH2 ] destetrapeptid B27-B30 inzulínu. Pro přípravu tohoto kráceného analogu byl použit následující protokol. 23 mg tetrapeptidu bylo smícháno s 195 μΐ DMF a 55 μΐ 0,05 M a CaCL. Bylo přidáno 22 mg desoktapeptid inzulínu (DOI) a reakční směs jemně protřepána. 3 mg TPCK-trypsinu byly rozpuštěny v 50 μΐ 0,05 M CaCI2 a přidány do reakční směsi. pH reakční směsi bylo upraveno N-methylmorfolinem na hodnotu 7,0. Reakce probíhala za míchání po dobu 3 až 24 hodin, konverze byla monitorována. Reakce byla zastavena přidáním 1 ml acetonu. Sraženina byla odstředěna a supernatant oddělen, sraženina byla opětovně promyta 1 ml acetonu. Sediment byl rozpuštěn v 1,2 ml 10 % kyseliny octové a výsledný roztok
-2CZ 296065 B6 byl jímán a lyofílizován. Výsledný produkt byl charakterizován RP-HPLC, hmotovou spektrometrií a kapilární elektroforézou.
Příklad 3
Příprava (Gly23-Phe24-Phe25-N(CH3) Phe26-NH2] destetrapeptid B27-B30 inzulínu. 10 mg peptidu bylo rozpuštěno v 98 μΐ DMF a přidáno 27 μΐ 0,05 M CaCI2. Poté bylo přidáno 9,1 mg DOI, šetrně zamícháno a přidáno 1,5 mg TPCK trypsinu rozpuštěného v 25 μΐ 0,05 M CaCI2. Poté bylo postupováno postupem uvedeným v příkladu 2. Reakční doba byla nejméně 3 hodiny, teplota byla mezi 5-29 °C.
Příklad 4
Příprava [Gly23-Phe24-N(CH3)Phe25-Phe26-NH2)destetrapeptid B27-B30 inzulínu. 11 mg příslušného tetrapeptidu bylo rozpuštěno ve 110 μΐ DMF a přidáno 30 μΐ 0,05 M CaCl2. Poté bylo postupováno dle příkladu 2. Reakční doba byla nejméně 3 hodiny při teplotě 5-25 °C.
Příklad 5
Kapilární zónová elektroforéza (CZE). Analýza čistoty připravených peptidů byla prováděna metodou CZE se zdrojem vysokého napětí 0-15 kV. Separačním prostorem byla křemenná kapilára s vnějším polyimidovým povlakem o vnitřním průměru 0,056 mm, vnějším průměrem 0,200 mm, celkové délce 315 mm a efektivní délce (od startu k detektoru) 200 mm. Peptidy byly analyzovány v 0,5 M kyseliny octové, nebo v roztoku o složení 0,04 M Tris a 0,04 M Tricinu pH 8,1. Vzorek byl nanášen manuálně a měření bylo prováděno při laboratorní teplotě. Separace probíhala v režimu konstantního napětí 10,0 kV a proud dosahoval hodnot 9,5-10,8 μΑ. Detekce byla prováděna spektrofotometricky při 206 nm.
Příklad 6
Hmotová spektra jednotlivých peptidů. Měření bylo prováděno metodou FAB, která spočívá v ionizaci testovaných vzorků pomocí urychlených atomů xenonu. Vzorek byl umístěn na glycerinovou matrici. Snímání spekter bylo prováděno vícekanálovou analýzou při nízké rozlišovací schopnosti. Byl použit třísektorový hmotový spektrometr YAB-EQ s geometrií BEQQ vyrobený firmou VG Analytical Manchester. Iontový zdroj pracoval při urychlovacím napětí 8 kV.
Příklad 7
Aminokyselinové složení peptidů. Peptidy byly hydrolyzovány v 6 M HC1 při teplotě 110 °C po dobu 20 hodin a jednotlivé aminokyseliny separovány na přístroji D-500 (Durrum corp.) Zastoupení prolinu a cystinu nebylo vyhodnocováno.
Průmyslová využitelnost
Zkrácené deriváty lidského inzulínu podle vynálezu lze využít pro základní biochemický a farmakologický výzkum a jako látky s hormonálním účinkem.
-3CZ 296065 B6
Claims (2)
1. Zkrácené deriváty lidského inzulínu obecného vzorce I
X - Gly - Y (I) kde X = desoktapeptidinzulin,
Y = Phe-Phe-PheNH2 nebo
Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 nebo
Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2
2. Způsob výroby zkrácených derivátů lidského inzulínu podle nároku 1, vyznačující se t í m , že se desoktapeptid inzulínu kondenzuje s tetrapeptidy vzorce Gly-Phe-Phe-PheNH2 nebo Gly-Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 nebo Gly-Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 v přítomnosti tosylfenylalaminchlorketon trypsinu v 50-65% dimethylformamidu při teplotě 4-25 °C po dobu 3 až 24 h, načež se vzniklé produkty izolují, zejména vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi.
Konec dokumentu
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20000401A CZ296065B6 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského inzulinu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20000401A CZ296065B6 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského inzulinu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000401A3 CZ2000401A3 (cs) | 2001-09-12 |
| CZ296065B6 true CZ296065B6 (cs) | 2006-01-11 |
Family
ID=5469491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20000401A CZ296065B6 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského inzulinu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ296065B6 (cs) |
-
2000
- 2000-02-03 CZ CZ20000401A patent/CZ296065B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2000401A3 (cs) | 2001-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5478810A (en) | Peptide amides, processes for the preparation thereof and agents containing these as fibrin/thrombin clotting inhibitors | |
| Marshall et al. | Synthesis of angiotensins by the solid-phase method | |
| Beyermann et al. | Rapid continuous peptide synthesis via FMOC amino acid chloride coupling and 4-(aminomethyl) piperidine deblocking | |
| Hojo et al. | Development of a Linker with an Enhanced Stability for the Preparation of Peptide Thioesters and Its Application to the Synthesis of a Stable-Isotope-Labelled HU-Type DNA-Binding Protein. | |
| AU2017286333B2 (en) | Metabolically stable spexin peptide analogs | |
| US8377891B2 (en) | Process for synthesis of cyclic octapeptide | |
| EP0082568B1 (en) | Retro-inverso analogues of c-terminal penta and hexapeptides of substance p. | |
| Aimoto et al. | Development of a facile method for polypeptide synthesis. Synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). | |
| EP1756141B1 (en) | Process for the preparation of peptides | |
| CN108047323B (zh) | 一种固相片段法合成GpTx-1及其类似物和合成方法 | |
| XUE et al. | Synthesis of S‐alkyl and C‐terminal analogs of the Saccharomyces cerevisiae a‐factor: Influence of temperature on the stability of Fmoc and OFm groups toward HF | |
| CZ296065B6 (cs) | Zkrácené deriváty lidského inzulinu | |
| Cordeau et al. | Selenazolidine: A selenium containing proline surrogate in peptide science | |
| Pawlak et al. | Synthesis of a novel side‐chain to side‐chain cyclized enkephalin analogue containing a carbonyl bridge | |
| CZ9735U1 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| US11692007B2 (en) | Amino deprotection using 3-(diethylamino)propylamine | |
| Hendrix et al. | Synthesis of a protected peptide corresponding to residues 1-25 of the. beta.-amyloid protein of Alzheimer's disease | |
| US7193039B2 (en) | Synthesis of a potent parmagnetic agonist (epm-3) of the melanocyte stimulating hormone containing amino acid-type stable free radical | |
| CZ10670U1 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| CZ9803U1 (cs) | Synthetické analogy Desmopressinu chráněné v C-terminální sekvenci proti karboxyamidasovému štěpení | |
| Byrnes et al. | SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF DENDROTOXIN: A POTENT POTASSIUM CHANNEL | |
| CZ292131B6 (cs) | Synthetické analogy Desmopressinu chráněné v C-terminální sekvenci proti karboxyamidasovému štěpení | |
| Hojo et al. | Chemical synthesis of palmitoylated histone H4. | |
| JPH07252299A (ja) | ヒルジン誘導体およびその製造方法 | |
| Szewczuk et al. | New conformationally restricted analog of the immunosuppressory mini-domain of HLA-DQ and its biological properties |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20000203 |