CZ298406B6 - Farmaceutický prostredek obsahující antimikrobiální prostredek pro lécbu lidské imunodeficience a dalších infekcních onemocnení - Google Patents

Farmaceutický prostredek obsahující antimikrobiální prostredek pro lécbu lidské imunodeficience a dalších infekcních onemocnení Download PDF

Info

Publication number
CZ298406B6
CZ298406B6 CZ0336899A CZ336899A CZ298406B6 CZ 298406 B6 CZ298406 B6 CZ 298406B6 CZ 0336899 A CZ0336899 A CZ 0336899A CZ 336899 A CZ336899 A CZ 336899A CZ 298406 B6 CZ298406 B6 CZ 298406B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
acid
drug
hiv
cells
comiforic
Prior art date
Application number
CZ0336899A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ336899A3 (cs
Inventor
J. Squires@Meryl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of CZ336899A3 publication Critical patent/CZ336899A3/cs
Publication of CZ298406B6 publication Critical patent/CZ298406B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/714—Cobalamins, e.g. cyanocobalamin, i.e. vitamin B12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/32—Burseraceae (Frankincense family)
    • A61K36/328—Commiphora, e.g. mecca myrrh or balm of Gilead
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Použití antimikrobiálního prostredku, který obsahuje inhibitory mikrobu, fytochemikálie nebo izoláty pro prípravu léciva pro lécení virové imunitní nedostatecnosti napr. pro rychlé a bezpecné rešení HIV a jiných mikrobiálních infekcí. Antimikrobiální prostredek ve výhodné forme obsahuje fytochemikálie Echinacea a Commophora myrrha, chlorid benzalkonia, sterilní vodný roztok a kyselinu listovou. Lécivo potom dále obsahuje surfaktant a vodný nosicnebo rozpouštedlo a živinu.

Description

Farmaceutický prostředek obsahující antimikrobiální prostředek pro léčbu lidské imunodeficience a dalších infekčních onemocnění
Oblast techniky
Současný vynález se týká farmaceutického prostředku obsahujícího antimikrobiální prostředek pro léčbu a prevenci lidské imunodeficience a dalších infekčních onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Je hlášeno, že v současné době je na světě 22 miliónů lidí nakažených lidským virem imunodeficience (HIV). Největší podíl nových případů HIV pochází z Afriky a Karibské oblasti. Typický zdroj HIV infekce se rozděluje do různých stadií: 1) přenos viru; 2) akutní retrovirový syndrom; 3) serokonverze; 4) klinicky němé období s nebo bez perzistentní generalizované lymfadenopatie (PGL); 5) časná symptomatická HIV infekce dříve známá jako komplex týkající se AIDS neboli ARC (AIDS-related complex) nověji označovaný jako „B příznaky“ podle klasifikace CDC z roku 1993; 6) syndrom získaného defektu imunity (AIDS) (ukazatelem podmínky ADIS podle kritérií CDC z roku 1987 a upravených z roku 1993 je počet buněk CD4 < 200 / mm3); a 7) pokročilá infekce HIV, pro kterou je typický počet buněk CD4 < 50 / mm3. CD4 jsou mízní buňky (lymfocyty), které jsou napadány virem HIV. V roce 1993 byla změněna definice AIDS, kde tento pojem zahrnuje všechny pacienty s počtem buněk CD4 < 200/mm3; tato definice zahrnuje všechny pacienty ve stadiích 4 až 7 bez ohledu na klinické příznaky.
Počáteční akutní retrovirový syndrom je doprovázen lychlým poklesem počtu buněk CD4, vysokou plasmatickou virémií s možností kultivací a vysokou hladinou HIV-RNA v plazmě. Objeví se klinické zotavení a vysoké hladiny virémie HIV-RNA v plazmě se snižují s rozvojem cytotoxické odpovědi T-lymfocytů (CPL). Počet buněk CD4 postupně klesá v průběhu několika let a následuje zrychlený pokles během 1,5 až 2 let před diagnózou AIDS dle definice. Koncentrace HIV RNA v plazmě jsou relativně stabilní až do doby kdy HIV dospěje k pozdnímu stadiu, kdy počet CD4 je < 200 / mm3 a klinický průběh je charakterizován infekcemi, vybranými nádory, hubnutím a neurologickým komplikacemi. Obecně se u 10 % pacientů rozvine AIDS dle definice dříve než poklesne počet CD4 pod 200 / mm3. Současný medián času k rozvoji komplikací AIDS po poklesu CD4 na 200 / mm3 je 12 až 18 měsíců. Pokud chybí léčba přímo proti HIV nebo prevence PCP (Pneumocystic Carini Pneumonia), průměrný čas od přenosu viru k diagnóze AIDS dle definice je 10 let, a přežívání po vzniku komplikací AIDS bylo doposud jeden rok.
Při sledování všech případů průměrný pacient, pokud nedostává léčbu přímo proti HIV, umírá přibližně do deseti let od serokonverze. Popisuje se, že medián času od serokonverze HIV k AIDS 7 let pro příjemce transfúzí, 10 let pro hemofiliky, 10 let pro narkomany a 8 až 12 let pro homosexuální muže. Stupeň progrese onemocnění je nezávislý na pohlaví, rase, rizikové kategorii, a závisí na kvalitě péče. Pro nemocné, kteří jsou v období serokonverze ve věku 16 až 24 let byl medián času 15 let; pro ty, kteří byli ve věku nad 35 let v období serokonverze byl medián 6 let.
Infekce HIV může být získána pohlavním stykem, transfúzemi nakažené krve, u narkomanů pomocí nakažených jehel nebo přenosem při porodu. Symptomatická primární infekce HIV, také popisována jako akutní retrovirový syndrom, se udává u předchozích rizikových kategorií s četností 50 až 90 %. Tento syndrom byl také zjištěn u sedmi nebo osmi pracovníků ve zdravotnictví, kteří byli vystaveni přenosu při výkonu povolání.
Období od expozice k nástupu příznaků trvá obvykle 2 až 4 týdny, ale inkubační doba může trvat až šest týdnů. Typickými příznaky jsou: zvýšená teplota, zvětšené uzliny, zánět nosohltanu, vyrážka, která obsahuje zčervenání se skvrnkami o velikosti 5 až 10 mm na obličeji a na trupu,
- 1 CZ 298406 B6 někdy i na končetinách na dlaních a na chodidlech nebo slizničně kožní vřídky v ústech, jícnu nebo na genitáliích, bolesti svalů nebo kloubů, průjem, bolesti hlavy, zvětšená játra a slezina, afty, nevolnost a zvracení. Mezi neurologické příznaky patří: zánět mozkomíšních blan, periferní neuropatie, obrna lícního nervu, syndrom Guillian-Barré, zánět pažního nervu, onemocnění nervových kořenů, zhoršení poznávacích schopností, a psychózy. Akutní onemocnění je všeobecně doprovázeno vysokou hladinou virémie HIV s vysokou hladinou antigenu p24, plasmatickou virémií, a vysokými titry HIV v periferních krevních jednojademých buňkách (monofágách).
Primární je cytotoxická odpověď T lymfocytu (CTL) a obvykle předchází měřitelnou humorální (protilátkovou) odpověď o několik týdnů. Cytotoxická odpověď T lymfocytu (CTL) je doprovázena poklesem koncentrace HIV v periferní krvi o 3 až 5 řádů. Vysoká hladina virémie během této akutní fáze onemocnění může souviset s rozšířením viru do CNS a lymfatických tkáních. Lymfatická tkáň slouží jako hlavní rezervoár pomnožování HIV. Infekce nelymfatických orgánů s vysokými hladinami HIV se začíná objevovat v pozdních stadiích HIV.
Přítomnost příznaků spíše než serokonverze bez příznaků stejně tak jako vleklé onemocnění delší než 14 dní koreluje s rychlejší progresí AIDS. K. serokonverzi s pozitivní sérologií HIV všeobecně dochází po 6 až 12 týdnech po přenosu, jako např. transfuzí nebo poraněním o jehlu u pracovníků ve zdravotnictví. Medián tohoto intervalu je 63 dní. Cytotoxická odpověď T lymfocytu (CTL) je doprovázena prudkou redukcí kvantitativního virového obsahu v krvi, klinické zotavení z akutního retrovirového syndromu a návrat počtu buněk CD4 k vyšším hladinám, které se pohybují ve většině laboratořích v normálním rozmezí.
HIV pacient se stává klinicky asymptomatickým a všeobecně nemá žádný nález na fyzikálním vyšetření kromě přetrvávajícího všeobecného postižení uzlin (Persistent Generalized Lymphadenopathy - PGL), kam patří zvětšení uzlin. Studie lymfatických uzlin dokazují vysoké koncentrace HIV, který je zachycen extracelulámě na folikulámích dendritických buňkách a intracelulámě je virus převážně ve skiyté formě. Lymfatická tkáň slouží jako hlavní rezervoár HIV, folikulámí dendritické buňky filtrují a zachycují volný virus a nakažené buňky CD4 a virová zátěž v periferních jednojademých buňkách (mononukleárech) je relativně nízká. S pokročilým onemocněním dochází v důsledku HIV k poškození uspořádání lymfatické uzliny.
Virologické studie pacientů s bezpříznakovou infekcí HIV ukazují vysoký stupeň pomnožování HIV s denní produkcí o průměru 109 virionů. Pomnožování viru je doprovázeno masivním ničením a produkcí 109 CD4 buněk denně. Obměna CD4 buněk představuje 6 až 7 % celkových CD4 buněk těla, takže veškerá zásoba se obnoví každých 15 dní. AIDS se pokládá za následek neustálého vysokého stupně pomnožování HIV-1, které vedou k virovému a imunitně zprostředkovanému zničení CD4 lymfocytů.
Pokročilá HIV infekce se objevuje u pacientů s počtem buněk CD4 < 50 /mm3. U těchto pacientů se předpokládá zkrácené přežívání s mediánem přežití 12 až 18 měsíců. Ve skutečnosti u všech pacientů, kteří zemřou na komplikace související s HIV je počet CD4 buněk na této hodnotě. Ve skutečnosti u všech nemocných, kteří zemřeli na komplikace HIV byl počet CD4 buněk na těchto hodnotách.
Úřad pro potraviny a léky (Food & Druh Administration - FDA) povolil mnoho inhibitorů reverzní transkriptázy (RT). RT enzymy přeměňují virovou RNA na DNA. Inhibitory RT dokážou přerušit tento proces. Inhibitor RT AZT od firmy Glaxo Wellcome povolil FDA v roce 1987 a prodává se pod obchodní značkou Retrovir a zivodudin. Inhibitor RT ddl, který se prodává pod obchodním jménem Videx a didanosin od firmy Bristol-Myers Squibb, FDA povolil v roce 1991. Inhibitor RT ddC, který se prodává pod obchodním jménem HIVID a dideoxycytidin od firmy Hoffman-LaRoche, FDA povolil v roce 1992. Inhibitor RT d4T, který se prodává pod obchodním jménem Zerit a stavudin od firmy Bristol-Myers Squibb, FDA povolil v roce 1994. Inhibitor RT 3TC, který se prodává pod obchodním jménem Epivir a lamivundin od firmy Glaxo Wellco-2CZ 298406 B6 me, který FDA povolil v roce 1995. Inhibitor RT Nevirapin, který se prodává pod obchodním jménem Viramune od firmy Boehringer Ingelheim, FDA povolil v roce 1996.
Úřad pro potraviny a léky (Food & Drug Administration - FDA) nyní povolil tři inhibitory proteázy k léčbě infekce lidským virem imunodeficience HIV. Saquinavir, který se prodává pod obchodním jménem Invirase od firmy Hoffman-LaRoche Laboratories, byla první látka inhibující proteázu, kterou FDA povolil. Ritonavir, další inhibitor proteázy, který se prodává pod obchodním jménem Norvir od firmy Abbott Laboratories, získal povolení FDA v březnu 1996, stejně tak, jako Indinavir, který se prodává pod obchodním jménem Crixivan od firmy Měrek & Co.
Inhibitory proteázy účinkují různými mechanizmy na rozdíl od léků, které se dříve používaly jako léky proti HIV, jako jsou například analogy nukleosidů AZT a 3TC, které se prodávají pod obchodními jmény zidovudin a lamivundin od firmy Glaxo Wellcome, ddl a d4T, které se prodávají pod obchodním jménem didanosin a stavudin od firmy Bristol-Myers Squibb, a ddC, který se prodává obchodním jménem dideoxycytidin od firmy Roche Laboratories. Inhibitory proteázy blokují enzym, který HIV potřebuje k dokončení replikačního cyklu a produkci životaschopných virů. Bez enzymu proteázy se správně nevytvoří strukturální bílkoviny a vytvoří se chybný neinfekční virus. Analogy nukleosidů blokují různé enzymové reverzní transkriptázy. Tento děj může zabránit virové RNA, aby vytvářela virovou DNA, která by potom byla začleněna do DNA lidských buněk. O kombinaci jednoho nebo více inhibitorů reverzní transkriptázy a inhibitoru proteázy, někdy označované jako „koktejl“, se tvrdí, že napadají replikaci HIV ve dvou bodech replikačního cyklu. Klinické pokusy, které kombinují saquinavir s AZT, ddC nebo oběmi, vykazují větší pokles v počtu částic HIV v krvi, někdy označovaných jako virová zátěž a větší vzestup buněk CD4 (T lymfocytů), než bylo dříve pozorováno u samotných inhibitorů reverzní transkriptázy. Koktejly bývají někdy pro některé pacienty toxické a neúčinné. Klinické výhody z pohledu zlepšení přežívání nebo zmírnění progrese onemocnění však nebyly pro kombinaci (koktejly) inhibitorů RT s inhibitory proteázy plně prokázány. Nicméně již lékaři začínají považovat HIV za chronické zvládnutelné onemocnění než rozsudek smrti.
Saquinavirové inhibitory proteázy povolil FDA pro použití v kombinaci s inhibitory reverzní transkriptázy u pacientů s pokročilým aIDS. Saquinavirové inhibitory proteázy bývají tolerovány některými nemocnými bez hematologických a neurologických toxicit v porovnání s analogy nukleosidů. Určité léky na lékařský předpis, mezi které patří rifampin, rifabutin, fenobarbital, dilantin a dexametazon, mohou významně snižovat plasmatické hladiny saquinavirových inhibitorů proteázy a neměly by se používat u nemocných, kteří užívají saquinavir. Byla popsána virová rezistence na saquinavirové inhibitory proteázy, stejně tak, jako i na další léky proti HIV.
Inhibitory proteázy ritonavir a indinavir se jeví být účinnější proti HIV než saquinovir. Rinonavirové inhibitory proteázy vyžadují chlazení. Rinonavirové inhibitory proteázy se v současné době používají v kombinaci s analogy nukleosidů (léky jako je AZT) nebo se používají v monoterapii. Ve dřívější studii bylo léčeno 32 nemocných pomocí ritonaviru s AZT a s ddC. Po 20 týdnech medián počtu CD4 buněk vzrostl ze základní hodnoty 83 buněk / mm3 na hodnotu 106 buněk / mm3. Virová zátěž, měřená jako počet virových kopií v krvi, se snížila 100-krát. Ritonavir se podíval v dávce 600 mg ústy dvakrát denně, což znamená 12 kapslí denně. Lék je k dispozici v kapslích po 100 mg. Vedlejší účinky jsou dosti běžné a zahrnují: gastrointestinální příznaky s nevolností, zvracením a průjmem. Mezi další vedlejší účinky patří snížená citlivost a brnění, zvláště okolo úst a zánět jater, který je druhem hepatitidy.
Indinavirové inhibitory proteázy získaly zrychlené povolení FDA na základě studií, které dokazují průměrný vzestup počtu CD4 100 buněk / mm3 a 100-násobný pokles virové zátěže při kombinaci AZT s 3TC a indinavirem. Indinavir se podával v dávce 800 mg ústy třikrát denně, (2 kapsle třikrát denně). Na rozdíl od ritonaviru indinavir se může podávat při prázdném žaludku pro zlepšení vstřebávání. Indinavir způsobuje méně gastrointestinálních vedlejších účinků než ritonavir a zdá se, že je některými nemocnými obecně lépe tolerován. Hlavním vedlejším účin-3CZ 298406 B6 kem indinavirových inhibitorů proteázy je vznik ledvinných kamenů. Lék je vylučován částečně močí, může krystalizovat a vytvářet kameny, pokud není zajištěna adekvátní hydratace. Indinavirové inhibitory proteázy mohou také poškodit játra, způsobí vzestup hladin bilirubinu v krvi, tzn. žlučového barviva, které vzniká po rozpadu červených krvinek. Indinavirové inhibitory proteázy mohou také způsobit lékové interakce.
Zatím není dokončen rozbor rezistence na inhibitory proteázy. Saquinavirové a ritonavirové inhibitory proteázy stojí v současné době jednoho nemocného v USA 600 dolarů na měsíc. Ceny za indinavirové inhibitory proteázy jsou o 30 % nižší. Kombinace tří léků ΑΖΤ s 3TC a ritonavirových inhibitorů proteázy stoji nemocného v USA přes 1000 dolarů / měsíc. Ceny kombinací (koktejly) inhibitorů RT a inhibitorů proteázy mohou dosahovat až 25 000 dolarů za rok. Ačkoliv inhibitory proteázy jsou prospěšné, lékařská veřejnost a společnost doposud nevyřešila finanční problémy s těmito drahými léky.
Herpes simplex virus (HSV), který se běžně označuje jako „herpes virus“ nebo „herpes“, je infekční onemocnění, které rovněž tvoří celostátně významný podíl. Odhaduje se počet 70 až 80 % infikovaných nemocných v naší populaci, jak bylo oznámeno americkou zdravotnickou společností (Američan Societal Health Association - ASHA). Tento počet roste ročně o 500 000 lidí. Existují dva běžné typy herpes virů: herpes simplex virus 1 (HSV 1) a herpes simplex virus 2 (HSV 2). Herpes proniká do lidského těla přes drobná poranění pokožky obvykle po kontaktu s infikovaným člověkem a vyznačuje se výsevem jednoho nebo více puchýřků, obvykle ve skupinách, po uplynutí inkubační doby, kteráje přibližně čtyři dni. Typicky probíhá onemocnění, tak, že začíná prodromálním stadiem; pokračuje výsevem puchýřků; následuje vznik vřídků; jejich splývání; vymizení a latentní období. Vypuknutí může trvat několik týdnů a průměrné trvá dva až tři týdny. U některých jedinců s oslabenou obranyschopností může vzplanutí trvat několik měsíců. Puchýřky se mohou objevit kdekoliv na kůži nebo na sliznicích, jako opar na rtech, žlázách, sliznici dutiny ústní, spojivce a rohovce, na genitáliích, na sliznici konečníku a ve tkáni kolem konečníku.
Mezi herpetické příznaky patří: otok třísel, horečka, malátnost, bolesti hlavy, bolesti svalů, a oteklé žlázy. Někteří jedinci, kteří mají trojklanný nerv postižený tímto virem, mají kruté bolesti na tváři, obtížně polykají, jedí a mají tvář oteklou. Jedinci, kteří mají postižený kostrční nerv, trpí velkými bolestmi horní části stehen, otokem a mají potíže s chůzí.
Infekce virem herpes simplex může probíhat opakovaně, udržuje se v nervových gangliích a opakovaně se objevuje jako důsledek nějakých doposud neznámých podnětů. Opakované herpetické infekce mohou být vyvolány téměř čímkoliv, a patří mezi ně: přílišné slunění; chyby ve výživě; stres; menstruace; imunosuprese; určité potraviny; léky; horečnatá onemocnění, atd. V poslední době byl herpetický virus izolován ze srdeční tkáně.
Infekce viry HSV1 a HSV 2 velmi vážně ohrožují zdravotní stav, často způsobují: slepotu; zvýšené riziko vzniku zhoubného nádoru děložního čípku; aseptický zánět mozkových blan a mozku; úmrtí novorozenců; virémie; atd. Toto onemocnění se vyznačuje devastujícími účinky a přesahují hranice lidského utrpení. Infekce HSV způsobují vážné psychologická a emocionální potíže stejně tak jako způsobují podstatné ekonomické ztráty pro lidstvo a pro svět.
Byly navrženy různé druhy léčby pro herpetické infekce a patří mezi ně místní aplikace takových látek jako je povodon-jod, idoxirudin, trifluorthymidin nebo acyklovir. Tyto druhy léčby dosáhly různé stupně úspěšnosti. Většina předchozích druhů léčby zklamala. Acyklovir, který se podává ústy k celkové léčbě HSV infekce, je dosti účinný. Nicméně, acyklovir je jediný úspěšný lék, který dokáže zastavit replikaci viru. Není účinný v léčbě infekčního onemocnění, které již propuklo ani systémově ani místně. Jsou již popsány kmeny, které jsou rezistentní na acyklovir. Jedinci se syndromem získaného defektu imunity (AIDS) mají silně narušenou imunitu trpí zvláště oslabujícími atakami HSV. Navíc jedinci s AIDS jsou nosiči kmenů rezistentních na acyklovir, což znamená, že je u těchto jedinců acyklovir neúčinný.
-4CZ 298406 B6
Je tedy žádoucí vyvinout bezpečnou a úspěšnou léčbu, aby bylo umožnění léčit a předcházet velmi závažným komplikacím HIV a dalších infekčních onemocnění.
Podstata vynálezu
Vynález se týká použití antimikrobiálního prostředku obsahujícího v hmotnostních procentech
- 40 až 60 % fytochemického koncentrátu bylinných botanikálií obsahující Commiphora myrrha a Echinacea purpurea, přičemž tento fytochemický koncentrát poskytuje antimikrobiální izoláty;
až 60 % sterilní vody, která poskytuje rozpouštědlo a nosič pro uvedený fytochemický koncentrát;
- 0,02 % až 0,3 % amoniové povrchově aktivní látky obsahující benzalkonium chlorid;
- 2 % až 12 % listové kyseliny poskytující živinu;
kde antimikrobiální izoláty z uvedeného fytochemického koncentrátu obsahují v hmotnostních procentech vztaženo na celkovou hmotnost léčivého prostředku:
- 0,3 až 9 % echinolinu,
- 0,1 až 7 % PS 1, kterým je 4-O-methylglukoronoarabinoxylan s rel. molekulovou hmotností 35 kDa a PS 2, kterým je ramnoarabinogalaktanová kyselina s rel. molekulovou hmotností 450 kDa);
- 0,1 až 10 % cynarinu (1,5-di-o-kafeoylchinolinové kyseliny) a chiorové kyseliny (2,3kafeoyl vinné kyseliny) a jejích derivátů;
- 0,2 až 4 % echinolonu;
- 0,2 až 8 % echinacinu B;
- 0,1 až 6 % echinacinu;
- 2 % až 7 % antonokyaninů obsahujících kyanidin 3-O-B-D-glukopyranosid a 3-0-(6-0malonyl)-B-D-glukopyranosid;
- 0,01 až 0,06 % pyrrolizidinových alkaloidů obsahující tusilagin a isotusilagin;
- 0,003 až 0,009 izomemích dodeka-izobutylamidů a tetroenové kyseliny; a kde fytochemické látky z Commiphora myrrha obsahují členy vybrané ze skupiny skládající se z karyofylenů, seskviterpenů, kurzerenonu, dihydrofhanodien-6-onu, 2-methoxyfuradinu, elemolu, lyndesterenu, kyseliny octové, α-amyronu, arabinos, a-bisabolenu, γ-bisabolenu, kadinenu, kampesterolu, cholesterolu, skořicového aldehydu, komiferinu, α-komiforové kyseliny, β-komiforové kyseliny, γ-komiforové kyseliny, komiforinové kyseliny, m-kresolu, kumylalkoholu, kuminaldehydu, dipentenu, elemolu, 3-epi-a-amyrinu, eugenolu, furandienu, furandienonu, galaktózy, rostlinné gumy, herabolenu, a-herabomyrolu, β-herabomyrolu, heraboresenu, limonenu, 4-(O-methyl-glukuronové kyseliny, n-nonakesanu, p-sitolsterolu, xylózy, pro výrobu léčiva pro léčení virové imunitní nedostatečnosti.
-5 CZ 298406 B6
Vynález se tedy týká použití antimikrobiálního prostředku pro výrobu léčiva pro zdokonalenou lékařskou péči a medikamentózní léčbu, které pokud je podáváno systémově, brání připojení lidského víru imunodeficience (lidský virus imunodeficience) (HIV) k cílovým buňkám a tím zabrání rozšíření HIV. Použití nového léčiva je prospěšné k prevenci sexuálního přenosu HIV a dalších virů. Zdokonalená lékařská péče a medikamentózní léčba je významně bezpečnější, levnější a účinnější.
Zdokonalená léčba, také označována jako Viracea 2 HIV-4, obsahuje léčivou sloučeninu, formulaci, antimikrobiální látku a roztok. Nová antimikrobiální léčba a mikrobicidní léky jsou úspěšné v systémové primární léčbě HIV infekce a mohou se používat při léčbě jiných mikrobiálních infekcí, včetně následujících, bez omezení: virus varicella zoster (herpes zoster), acytomegalovirus. Za některých okolností může být žádoucí podávat nový lék lokálně.
Zatímco nový lék a antimikrobiální látka jsou zvláště užitečné v překvapivé inhibici infekce lidským virem imunodeficience (HIV), může se použít i k léčbě jiných mikrobiálních infekcí (onemocnění vyvolaných mikroby) jako např. Epstein-Barr, papilloma virus, celulitida, stafylokok, streptokok, mykobakterie, chřipka, virové onemocnění podobné chřipce, adenoviry, zánět mozku, zánět mozkových blan, arbovirus, arenavirus, anaerobní bacily, varicella zoster virus a cytomegalovirus.
Zatímco léčba a lék je zvláště užitečný k inhibici HIV a dalších infekčních onemocnění u lidí (lidských jedinců) (homo sapiens), mohou se také použít pro veterinární účely k léčbě virových a bakteriálních infekcí a infekčních onemocnění u zvířat, jako jsou např.: psi, kočky, ptáci, koně, krávy, ovce, prasata, a jiná zemědělská zvířata, stejně tak jako i hlodavci a další zvířata, která jsou v zoologických zahradách.
Zdokonalená lékařská péče a medikamentózní léčba tohoto vynálezu přináší s výhodou překvapivě neočekávané dobré výsledky. Tento mikrobicidní roztok kjednoduchému použití zajišťuje okamžité vstřebání při parenterálním podání. Při podávání může dojít ke slabému mravenčení. Během několika minutového podávání se může vyskytnout pachuť v ústech. Testování nové léčby a léku ve zkumavce na počátku ukazovalo velmi překvapivý inhibiční účinek na HIV virus. Je žádoucí, aby byl nový lék vyráběn z hotových dostupných chemikálií (OTC) nebo výrobků a aby zajišťoval bezpečnou, pohodlnou a ekonomickou léčbu.
Je žádoucí, aby nový lék (léčivá sloučenina) obsahoval inhibitory mikrobů, které inhibují, potlačují a zastavují mikrobiální infekce. Inhibitory mikrobů obsahují antimikrobiální výtažky, rostlinné výtažky nebo fytochemikálie, nebo alespoň podíl jedné nebo více speciálních rostlin, které jsou uvedeny níže. Inhibitory mikrobů mohou obsahovat inhibitory virů k inhibici virových onemocnění, jako je např.: HIV, herpes simplex 1 virus (HSV 1), herpes simplex 2 virus (HSV 2), varicella zoster virus (herpes zoster), cytomegalovirus, virus Epstein-Barr, papilloma virus, virová chřipka, virové onemocnění podobné chřipce, adenovirus, virový zánět mozku, virový zánět mozkových blan, arbovirus, arenavirus, pikomavirus, koronavirus a syncitiální virus. Inhibitory mikrobů mohou obsahovat inhibitory baktérií k inhibici bakteriálních onemocnění, jako je např.: celulitida, stafylokoky, streptokoky, mykobakterie, bakteriální zánět mozku, bakteriální zánět mozkových blan a anaerobní bacily. Za někteiých okolností mohou inhibitory mikrobů obsahovat inhibitory plísní.
Lepších výsledků se dosáhne, pokud se Echinacea a Commophora (také označované jako Cimmiphora) nebo jiné rostliny nepoužívají v léčivu v syrovém neupraveném a nepokrájeném stavu. Pro ještě lepší výsledky se v léčivu nepoužívá: arabinóza, betain, celulóza, měď, fruktóza, mastné kyseliny, galaktóza, glukóza, železo, draslík, bílkovina, pryskyřice, sacharóza, a xylóza.
Zdokonalená léčba poskytuje nový způsob a postup používaný k léčbě výše zmíněných infekčních onemocnění. U některých infekčních onemocnění se inhibitory mikrobů aplikují a ponechávají na mikrobem infikovaném místě (oblasti nebo povrchu) dokud nevymizí zevní příznaky
-6CZ 298406 B6 a fyzikální projevy infikované oblasti. Léčivo se může podávat injekcí stříkačkou, pod jazyk, ve formě aerosolu, nanášením, rozprášením, potíráním štětičkou, houbou, kartáčkem, poléváním, dávkováním, překrytím a nebo silným nanesením na místa infikovaná mikrobem, jako jsou např.
lymfatické uzliny, lymfatický systém, T-buňky, sliznice dutiny ústní, sliznice dutiny nosní, poševní tkáň, tkáň pysků, tkáň kolem konečníku, rty, kůže, tkáň oka, spojivka a oční víčka.
Výhodněji se inhibitory mikrobů nebo antimikrobiální látky podávají systémově pomocí stříkačky do konečníku nebo do pochvy k léčbě nebo prevenci sexuálního přenosu HIV infekce. Inhibitory mikrobů nebo antimikrobiální látky se podávají předešlým způsobem 4 až 20 krát denně po dobu 4 až 18 po sobě jdoucích dní tak, aby došlo k podstatnému snížení virové zátěže u pacientů, kteří jsou nakaženi virem HIV, tzn. ke snížení množství viru HIV a AIDS v těle.
Výhodněji je zdokonalené léčivo, léčivá sloučenina nebo mikrobiální látka fytochemický koncentrát, který se při podávání kombinuje současně nebo následně se surfaktantem, živinou a nosičem, nebo rozpouštědlem nebo diluentem. Tím se získá mikrobicidní léčivý roztok. Živina slouží jako katalyzátor, aktivátor, fytochemický iniciátor, výživná náhražka a pomocný nosič. Živina může obsahovat jednu nebo více následujících látek: vitamín rozpustný ve vodě, vitamín rozpustný v tucích, vitamin A, komplex vitamínů skupiny Β, (B vitamínový komplex), vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin Bl, vitamin B2, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B15 a s výhodou kyselinu listovou.
Doposud zajímavý mikrobicidní roztok obsahuje antimikrobiální detergentní surfaktant s rostlinnými výtažky. Surfaktanty jsou nejlépe kladně nabité surfaktanty, které mohou obsahovat jednoduché nebo kvartémí chloridy amonné, které obsahují 6 až 18 atomů uhlíku, jako je např. chlorid alkylbenzyldimethylamonný, směsi chloridu alkylbenzyldimethylamonného, chloridu alkyldimethyl/ethylbenzylamonného, chloridu n-alkyldimethylbenzylamonného, chloridu diizobuthylfenoxyethoxyethyldimethylbenzylamonného, chloridu N-(C 12H14C16)-dimethylbenzylamonného, chloridu benzalkonia, chloridu oktyldecyldimethylamonného, chloridu didecyldimethylamonného, chloridu dioktyldimethylamonného, chloridu dialkyldimethylamonného, chloridu dialkylmethylbenzylamonného, chloridu oktyldecyldimethylamonného, chloridu dimethylbenzylamonného, chloridu lauryldimethylbenzylamonného, o-benzyl-p-chlorfenolu, chloridu didecyldimethylamonného, chloridu dioktyldimethylamonného, chloridu alkyHCfyCuC^j-dimethylbenzylamonného a s výhodou obsahují chlorid alkylbenzyldimethylamonný a nej výhodněji chlorid benzalkonia. Rozsah aktivity kladně nabitého surfaktantu je 5 až 90 %, ale nejlepší výsledky jsou od 8 až do 20 %. Kvartémí amonné soli jsou komerčně k dispozici již hotové. Za určitých okolností může být užitečné používání dalších surfaktantů, jako je např., ale bez omezení: DMSO, surfaktanty, kyseliny glykolové, enzymové surfaktanty, amfolytické surfaktanty, zwitterické surfaktanty a neionogenní surfaktanty. Surfaktanty mohou obsahovat detergenty, zvlhčující látky, emulgátory, odpěňovače a/nebo přídatné látky snižující povrchové napětí.
Nosiče jsou užitečné pro smísení jednotlivých složek, udržování složek v roztoku a k zajištění jednoduchého způsobu aplikace na postižené místo buď aerosolem, kapátkem, nebo aplikátorem. Zatímco se s lepšími výsledky používá vodný roztok, s výhodou sterilní vodný nosič nebo rozpouštědlo, za jistých okolností může být žádoucí použít jiné tekuté nebo pevné nosiče, jako je např.: glycerin, minerální olej, oxid křemičitý, olej z bavlněných semínek, kokosový olej, zeleninový olej, jádrový olej, rybí olej nebo zvířecí olej, alkohol, talek, kukuřičná moučka, včelí vosk, kamaubský vosk, beta karoten, česnekový olej, kafrový olej, rozpustné vitaminy, rozpustné minerály, olej řepky olejně, ořechový olej, olivový olej, lipozómy, kyselina askorbová, olej pupalky dvouleté, pyknogel, olej ze semen vinné révy, lanolin, ethocyn, kolagen, aloe vera, včelí pyl, mateří kašička, chondroitin sulfát A, mořské rostliny, EDTA, mastné kyseliny, byliny lecitin, bioflavonidy, obilný olej nebo prášek, řasy, čaje, octy, acidofily, buněčné soli, kyseliny askorbové, hydra 5, žlázy, aminokyseliny, psyllium, rostlinné deriváty nebo jiné sterilní nosiče.
Antimikrobiální izoláty rostlinných extraktů nebo fytochemikálie, které jsou obsaženy v tomto novém léčivu a používají se k léčbě, mohou obsahovat lepkavé pryskyřice myrhy, seskviterpeny,
-7CZ 298406 B6 kurzenon, dihydrofuranodien-6-on, 2-methoxyfurandien, elemol, kyselinu octovou, alfa-amyron, arabinózu, alfa-bisabolen, gama-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferin, kyselinu alfa-komiforovou, kyselinu beta-komiforovou, kyselina gama-komiforovou, kyselinu komiforovou, m-kresol, kumin alkohol, kumin aldehyd, dipenten, elemol, 3-epialfa-amyrin, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktózu, klovatinu, herabolen, alfa-herabomyrhol, beta-herabomyrhol, heraboresen, limonen, kyselinu 4-0-methylglukuronovou, nnonacesan, beta-sitoserol, xylózu, karofyleny, lindestyren, arabinózu, betain, měď, echinacen, chinacin B, echinakosid, echinolon, enzymy, fruktózu, mastné kyseliny, galaktózu, glukózu, kyselinu glukuronovou, inulin, inuloid, železo, pentadekadien, polyacetylenové látky; polysacharidy jako je např. bez omezení: arabinogalaktan; draslík, bílkovinu, pryskyřice, ramnózu, sacharózu, síru, taniny, vitaminy A, C, a E, alkylamidy, apigenin, arabinogalaktu, kyselinu askorbovou, kyselinu behenovou, kyselinu octovou, betain, bomeol, bomylacetát, kyselinu kávovou, kyselinu 2-0-kafeoyl-3-(5-alfakarboxybeta) 3, 4 dihydroxyfenylovou, kyselinu 2-0-kafeoyl-30-kumaroyltaraovou, 6-0-kafeoylechinakosid, kyselinu 2-0-kaffeoyl-3-0-feruloyltartarovou, kyselinu 2-0-kafeoyltartarovou, vápník, uhličitan, beta karoten, karofylen, karofylenepoxid, chlorid, kyselinu chlomou, kyselinu cikorovou, methylester kyseliny cikorové, kobalt, kyanadin3-0-(beta-d-glykopyranosid, cynadin-3-(6-0-malonyl-beta-d-glykopyranosid), cynarin, izobutylamid kyseliny deka-(2e,4e,6e)-trienové, des-ramnosylverbaskosid, kyselinu 3,5dikafeoylkvinnou, kyselinu 4-5-0-dikafeoylkvinnou, kyselinu 2-3-0-diferulotartarovou, izobutylamid kyseliny dodeka-(2e,4e)-dienové, dodeka-2,4-dien-l-yl izovalerát, izobutylamid kyseliny dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraenové, epizobunol, beta-femezen, kyselinu 2-0-ferulotartarovou, germakren, heptadeka-(8z,l 1 z)-dien-2-on, heteroxylan, humulen 8—12,(e)—10— hydroxy-4,10-dimethyl 4,11 -dodekadien-2-on, kyselinu 13-hydroxyoktadeka-(9z, 11 e, 15z)trienovou, inulin, železo, kyselinu izochlorovou, izohamnetin-3-rutinosid, izotusilagin, kampferol, kampferol-3-glukózid, kampferol-3-rutinosid, limonen, luteolin, luteolin-7-glukózid, hořčík, mangan, 2-methyltetradeka-5,12-dien, 2-methyltetradeka-6,12-dien, methyl-p-hydroxycinamát, marcen, niacin, kyselinu palmitovou, pentadeka-(8z,l 1 z)-dien-2-on, pentadeka(8z,l lz)-dien-l l-lyn-2-on, pentadeka-(8z,13z)-dien-l l-lyn-2-on, pentadeka-8en-2-on, pentadeka-(8z)-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-ll,13 dien-2-on, 1-pentadecen, penta-(l,8z)-dien, fosfor, alfa-pinen, beta-pinen, polyacetyleny, pontika epoxid, draslík, protein, kvercetagetin-7glukózid, kvercetin, kvercetin-3-galaktózid, kvercetin-3-glukózid, kvercetin-3-robinosid, kvercetin-3-xylózid, kvercetin-3-xylózylgalaktózid, ramnoarabinogalaktan, riboflavin, rutin, rutosid, selen, silikát, beta-sitosterol, sitosterol-3-beta o-glukózid, sodík, stigmasterol, sulfát, kyselinu tartarovou, tetradeka-(8z)-en-l 1,13 dien-2-on, tiamin, n-triakontanol, trideka-l-en-
3,5,7,9,10-pentayn, tussilagin, vanallin, verbaskosid. Lepších výsledků se dosahuje s koncentráty fytochemikálií, které obsahují výše zmíněné fytochemikálie, kromě arabinózy, betainu, celulózy, mědi, fruktózy, mastných kyselin, galaktózy, glukózy, železa, draslíku, proteinu, pryskyřice, sacharózy a xylózy.
Rostlinné výtažky, antimikrobiální izoláty a fytochemikálie se oddělují, extrahují a izolují z částí rostlin, jako je např.: pimpinella anisum, myroxylon, arctostaphylos, carům, capsicum, eugenia mytacea, koriandr, inula, allium, gentiana, juniperus, calendula, origanum, mentha labiate, commiphora, plantago, rosmarinus, rúta, lamiacea, meliosa, baptisa, artemisa, sage, mentha, pertheinum integrifolium, eucalyptus, asteriacea a s výhodou: (1) rodu Escherichia čeledi Asteriacea, jmenovitě: Echinacea purpurea, Echinacea angustifolium (Echinacea pallidae), Echinacea vegetalis, Echinacea atribactilus, Echinacea pallidum a jejich odrůdy, stejně tak jako zrodu Commiphora, jmenovitě Commiphora myrrha, Commiphora molmol a Commpihora erythrea a jejich odrůdy. Lepších výsledků se dosahuje s fytochemikáliemi a antimikrobiálními izoláty, které jsou výtažky z Echinacea purpurea, Echinacea angustifolium a Commiphora myrrha.
Objevená technologie, léčba a léčivo poskytují velmi atraktivní, nenákladné, překvapivě dobré a konzistentní výsledky. Testy dokazují, že mikrobicidní roztok (léčivo) a medikamentózní léčba jsou výjimečně užitečné k: regulaci HIV infekce, inhibici připojení viru HIV na cílové buňky, působení jakožto preventivní mikrobicid, prodloužení období latence HIV a jiných onemocnění
-8CZ 298406 B6 a významné inhibici HIV a jiných virů, a přesto jsou všeobecně bezpečné pro nemocného i pro životní prostředí.
Podrobnější vysvětlení tohoto vynálezu je obsaženo v následujícím popisu vynálezu a přídatných patentových nárocích.
Podrobný popis vynálezu
Poskytuje se prostředek ničící mikroby a léčba vedoucí k inhibici lidského viru imunodeficience, také uváděného jako lidského imunodeficientního viru nebo HIV. Je žádoucí, aby mikrobicidní prostředek a léčba kompletně inhibovaly HIV, stejně tak i další mikrobiální onemocnění a aby byly bezpečné a netoxické pro člověka, zvířata i pro životní prostředí.
Mikrobicidní látka HIV a léčivo může obsahovat surfaktant a rostlinný extrakt, fytochemikálie, antimikrobiální extrakt, antivirový extrakt, inhibitor mikrobů a inhibitor virů. Upřednostňovaná mikrobicidní sloučenina může obsahovat: surfaktant; vodný diluent; živinu; a rostlinné extrakty rodu Echinacea (E), druhu Assteracea, směsi: purpurea, angustifolia, pallidae, vegetalis, atribactilus, a jejich odrůdy, stejně tak jako i rostlinné extrakty rodu Commiphora: Commiphora myrrha, Commiphora molmol, Commiphora erythraea, a jejich odrůdy. Upřednostňované rostlinné extrakty obsahují fytochemikálie rodu Commiphora a Echinacea, tak, jak se nacházejí v extraktech z Commiphora myrrha, Echinacea purpurea, Echinacea pallidae a Echinacea angustofolia. Lepších výsledků se dosahuje, když léčivo a mikrobicidní látka obsahuje: kladně nabitý surfaktant, fytochemikálie z Echinacea purpurea, Echinacea angustofolia a Commiphora myrrha, sterilní vodný diluent a kyselinu listovou. Poměr Commiphora myrrha ku Echinacea purpurea a Echinacea angustofolia je výhodný v rozmezí 1:2 až 1:4.
Surfaktant zajišťuje určité vyčištění na buněčné úrovni se širokospektrým antimikrobiálním účinkem. Surfaktanty tohoto druhu mohou obsahovat kvartémí amonné soli, které obsahují 6 až 18 atomů uhlíku. Výhodnější surfaktant kvartémí amonné soli je směsí alkyl dimethylbenzylamonných chloridů, mezi které patří: benzalkoniový halogenid, bromid benzalkoniový, chlorid benzalthoniový a nejvýhodnější je chlorid benzalkoniový. Léčba HIV může obsahovat 100% aktivní vodný roztok, ale může se použít i jako koncentrát. Roztok může obsahovat hmotnostně různé koncentrace surfaktantů, jako např. od 0,005 do 0,8 %, s výhodou od 0,02 do 0,30 % a nejvýhodněji od 0,02 do 0,26 %.
Fytochemikálie z rodu Echinacea prokázaly obrovskou aktivitu proti baktériím, virům a některým plísním. Přesný mechanizmus není znám. Když byla objevená mikrobicidní látka testována lokálně u HIV a HSV 1 & 2, byla účinná při léčbě propuknuvší infekce herpes simplex. Když byla látka testována ve zkumavce, byla prokázána inhibiční aktivita proti HIV-1 a HSV 1 & 2.
Sloučenina z fytochemického koncentrátu obsahuje následující extrakty, rostlinné extrakty, inhibitory mikrobů a antimikrobiální izoláty: polysacharidy, echinacen, echinacein, echinacosid, (ester kyseliny kávové), echinolon; echinadiol, enzymy, kyselinu glukuronovou, inuloid, pentadekadien, polyacetylenové látky, arabinogalaktan, ramnózu, PS 1 (4-0-methylglukuronoarabinoxylan, rel. mol. hmotn. 35 kDa); PS 2 (kyselý ramnoarabinogalaktan, s rel. mol. hmotn. 450 kDa), cynarin, (kyselinu 1,5-di-0-kafeoylkvinovou), kyselinu cikorovou, (kyselinu 2,3-0-dikafeoyltartarovou), a jejich deriváty, alkylamidy, ketoalkiny a ketoalkeny, kvinony, oleje zahrnující: bomeol, bomylacetát; pentadeka-8(z)-en-2-on, germakren D; kaiyofylen, karyoíýlenepoxid, antokyanin, alkaloid pyrrolizidinu, lipofilní amid, izobutylamid; polyacetyleny; klovatinu z myrhy, kurzenon (furanoeudesmanového typu); dihydrofuranodien-6-on; 2-methoxyfurandien (furanoelemenového typu); elamol; lyndesteren (furanogemakranového typu); alkylamidy, apigenin, arabinogalaktu, kyselinu askorbovou, kyselinu behenovou, kyselinu octovou, betain, borneol, bomylacetát, kyselinu kávovou, kyselinou 2-0-kafeoyl-3-(5-alfa-karboxybeta)-3,4dihydroxyfenyl, 2-0-kafeoyl-3-0-kumaroyltartarovou, 6-0-kafeoyiekinakosid, kyselinu 2-0
-9CZ 298406 B6 kafeoyl-3-0-furuloyltartarovou, kyselinu 2-0-kafeoyltartarovou, kalcium, karbonát, beta karoten, karofylen, karyofylen-epoxid, chlorid, chlorogenní kyselinu, kyselinu cikorovou, methylester kyseliny cikorové, kobalt, kyanadin-3-0-(beta-d-glukopyranosid), kyanadin-3-(6-0malonyl-beta-d-glukopyranosid), cynarin, izobutylamid kyseliny deka-(2e,4e,6e)-trienové, desramnosylverbaskosid, kyselinu 3,5-dikafeoylkvinovou, kyselinu 4-5-0-dikafeoylkvinovou, kyselinu 2,3-0-diferuloltartarovou, izobutylamid kyseliny dodeka-(2e,4e)-dienové, dodeka-2,4dien-l-yl izovalerát, izobutylamid kyseliny dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraenové, epizobunol, beta-famezen, kyselinu 2-0-ferulotartarovou, germakren, heptadeka-(8z, 11 z)-dien-2-on, heteroxylan, humulen 8-12, (e)-10-hydroxy-4,10-dimethy 1-4,1 l-dodekadien-2-on, kyselinu 13-hydroxyoktadeka-(9z, 11 e, 15z)-trienovou, inulin, železo, izochlorogenní kyselinu, izohamnetin-3-rutinosid, izotussilagin, kampferol, kampferol-3-glukózid, kampferol-3-rutinosid, limonen, luteolin, luteolin-7-glukózid, hořčík, mangan, 2-methyltetradeka-5,12-dien, 2-methyltetradeka-6,12-dien, methyl-p-hydroxycinamát, marcen, niacin, kyselinu palmitovou, pentadeka-(8z,l lz)-dien-2-on, pentadeka-(8z,13z)-dien-l l-lyn-2-on, pentadeka-8-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-l 1,13-dien-2-on, 1-pentadecen, penta-(l,8z)-dien, fosfor, alfa pinen, beta pinen, polyacetyleny, pontika-epoxid, draslík, protein, kvercetagetin-7glukózid, kvercetin, kvercetin-3-galaktózid, kvercetin-3-glukózid, kvercetin-3-robinosid, kvercetin-3-xylózid, kvercetin-3-xylózylgalaktózid, ramnoarabinogalaktan, riboflavin, rutin, rutosid, selen, silikát, beta-sitosterol, sitosterol-3-beta-o-glukózid, sodík, stigmasterol, sulfát, kyselinu tartarovou, tetradeka-(8z)-en-l l,13-dien-2-on, thiamin, n-triakontanol, trideka-l-en-
3,5,7,9,10-pentayn, tussilagin, vanallin, verbaskosid, seskviterpeny, kyselinu octovou, alfaamyron, arabinózu, alfa-bisabolen, gama-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferin, kyselinu alfa-komiforovou, kyselinu beta-komiforovou, kyselinu gamakomiforovou, kyselinu komiforionovou, m-kresol, kumidinalkohol, kuminaldehyd, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrin, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktózu, klovatinu, herabolen, alfa-herabomyrhol, beta-herabomyrhol, herabosen, limonen, kyselinu 4-0-methylglukuronovou, n-nonacesan, beta-sitosterol, xylózu, karoíyleny, klovatinu myrhy, kurzenon, dihydrofuanodien-
6-on a 2-methoxyfurandien.
Lepších výsledků se dosahuje, když antimikrobiální izoláty koncentrátu fytochemikálií obsahují hmotnostně (vztaženo k celkové hmotnosti vynalezené léčebné sloučeniny): 0,3 až 9 % echinakosidu; 0,1 až 7 % PS 1 (4-0-methylglukuronoarabinoxylanu, rel. mol. hmotn. 35 kDa); PS 2 (kyselého ramnoarabinogalaktanu, rel. mol. hmotn. 450 kDa); 0,1 až 10 % cynarinu (kyseliny 1,5-di-o-kafeoylkvinické) a kyseliny chiorické (kyseliny 2,3-0-di-kafeoyltartarové) a jejich derivátů; 0,2 až 4 % echinolonu; 0,2 až 8 % echinacinu B; 0,1 až 6 % echinaceinu; 2 až 7 % antokyaninů obsahujících kyanidin 3-0-(3-D-glukopyranosid a 3-0-(ó-O-malonylj-f-D-glukopyranosid; 0,01 až 0,06 % alkaloidů pyrrolizidinu obsahujících tussilagin a izotussilagin; 0,003 až 0,009 % izomerických dodekaizobutylamidů a kyseliny tetroenové; 0,01 až 2 % karofýlenů dihydrofuanodien-6-on; 2-methoxyfurandien; lyndesteren; seskviterpeny, kyselinu octovou, alfa-amyron, arabinózu, alfa-bisabolen, gama-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferin, kyselinu alfa-komiforovou, kyselinu beta-komiforovou, kyselinu gama-komiforovou, kyselinu komiforionovou, m-kresol, kumidinalkohol, kuminaldehyd, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrin, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktózu, klovatinu, herabolen, alfa-herabomyrhol, beta-herabomyrhol, herabosen, limonen, kyselinu 4-0-methylglukuronovou, n-nonacesan, beta-sitosterol, xylózu, karoíyleny a lyndesteren.
Fytochemické koncentráty mohou obsahovat hmotnostně 2 až 90 % léčebné sloučeniny a roztoku a s výhodou neobsahuje méně než 15 % sloučeniny a roztoku a k dosažení nejlepších výsledků obsahuje 40 až 60 % léčebné sloučeniny a roztoku.
Diluent rozpouští chlorid benzalkoniový (surfaktant) a fytochemické koncentráty a slouží jako nosič v aerosolu, lahvičkách a kapacích lahvičkách. Výhodnější diluent je vodný diluent a nejvýhodnější diluent je sterilní vodný diluent. Poměr vody ve vodném roztoku k chloridu benzalkoniovému je v rozmezí od 30 000:1 do 250:1 s výhodou od 5000:1 do 750:1. Poměr vody ku kom-10CZ 298406 B6 binovaným koncentrátům chloridu benzalkoniového a fytochemikálií je v rozmezí od 2:1 do 100:1, výhodnější poměr je od 4:1 do 40:1 a nejlepších výsledků dosahují poměry od 6:1 do 20:1. Nejlepší výsledky jsou u zdokonalené mikrobicidní léčby a léčiva na herpes, které obsahuje dle hmotnosti: 0,02 až 0,3% chlorid benzalkoniový. Aby se předešlo toxicitě, je výhodnější méně než 0,26%; 40 až 60 % fytochemikálií Echinacea a Commiphora; 0,01 až 25 % a nejvýhodnější 2 až 12 % živin a 20 až 60 %, nejvýhodněji 29,74 až 59,8 % sterilní vody.
Je žádoucí, aby léčivo (mikrobicidní látka) obsahovalo vitaminovou živinu, která slouží jako nosič živiny a zajišťuje synergický účinek, když je skombinuje s Commiphora myrrha, Echinacea purpurea a Echinacea angustofolia. Živina může obsahovat jednu nebo více následujících látek: vitamin A, komplex vitamínů skupiny B, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitaminy rozpustné ve vodě, vitaminy rozpustné v tucích, vitamin Bl, vitamin B2, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B15, a s výhodou kyselinu listovou.
I když je voda upřednostňovaná jako rozpouštědlo a vodný nosič, za určitých okolností je žádoucí, aby se použilo jiných nosičů, které usnadní protlačení koncentrátu skrz jehlu nebo aerosol, nebo k dosažení lepší rozpustnosti a účinnosti. Je také žádoucí za určitých okolností zahrnout látku, která upravuje viskozitu. Dále, aby skladovatelnost zdokonaleného léčiva byla dva roky, je nutno přidat vhodné konzervační látky.
Aby byl zajištěn preventivní mikrobicidní účinek proti HIV, musí se léčebný roztok podávat systematicky pochvou nebo konečníkem. Způsob podání léčiva může být cestou: pomocí injekční stříkačky, aerosolem, jemným nanesením, kapkami nebo jiným způsobem. Podání nebo nanesení roztoku (léčiva) by mělo vydržet během pohlavního styku. Aniontová mýdla a aniontové detergenty a zvláště mýdla, která obsahují protein, mohou být kontraindikována. Místa, na která se léčivo podává, mají být umyta, vyčištěna a vysušena před jeho podáním. Léčivo za účelem antivirové HIV léčby se podává pomocí injekční stříkačky do konečníku nebo do pochvy nebo i dalšími způsoby.
Benzalkonium chlorid
Benzalkonium chlorid je upřednostňovaným surfaktantem. Benzalkonium chlorid je vodný roztok a je komerčně k dispozici pod obchodní značkou a obchodním jménem Zephiran® aje distribuován firmou Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (dříve Winthrop labs). Benzalkonium chlorid je rychle účinkující protiinfekční látka se středně dlouhou dobou účinku. Surfaktant je účinný proti baktériím a některým virům, plísním a prvokům. Bakteriální spory se považují za rezistentní. Podle koncentrace jsou roztoky benzalkonium chloridu bakteriostatické nebo bakteriocidní. Není znám přesný mechanizmus benzalkonium chloridu na baktérie, ale předpokládá se, že účinkuje přes inaktivaci enzymů. Účinek benzalkonium chloridu se obecně zvyšuje se stoupající teplotou a pH. Gram-pozitivní baktérie jsou citlivější na benzalkonium chlorid než gram-negativní baktérie.
Benzalkonium chlorid se bohužel inaktivuje mýdly, aniontovými detergenty, sérem a určitými proteiny. Pro tyto výše zmíněné důvody vypadl benzalkonium chlorid z obliby mnoha laboratoří. Benzalkonium chlorid byl neúčinný při vzplanutí infekce herpes simplex, když byl použit samostatně a testován lokálně in vivo. Když byl benzalkonium chlorid testován in vitro na HIV a HSV1 & 2, byla prokázána nežádoucí vysoká toxicita na buňky dokonce i u vysokých ředění, což je lékařsky nepřípustné. Chemický vzorec benzalkonium chloridu je znázorněn níže. Mohou se použít i jiné druhy benzalkonium chloridu.
-11 CZ 298406 B6
Sloučenina obecného vzorce I:
cr ch3
CH3(CH2)J4<±AUgH2 ch3
(I).
Fytochemikálie
Syrová, neupravená a neizolovaná Echinacea je obecně nevhodná k léčbě HIV a herpes k vnitřnímu použitím, avšak pokud se vhodně filtruje, je vhodná k vnitřnímu použití.
Bylo zjištěno, že některé, ne však všechny z izolovaných složek a botanických extraktů Echinacea a Commiphora (jak je již dříve výše popsáno) poskytují fytochemikálie, antimikrobiální 10 extrakty, botanické extrakty a inhibitory mikrobů, které mají nebo vykazují antimikrobiální účinek, který se jeví jako účinný při léčbě HIV, herpes virus a dalších virových onemocnění.
Jak je dříve uvedeno, fytochemická koncentrovaná sloučenina obsahuje následující izolované složky, botanické extrakty, inhibitory mikrobů a antimikrobiální extrakty: polysacharidy, echina15 cen, echinacein, echinakosid, (ester kyseliny kávové), echinolon echinadiol, enzymy, kyselinu glukuronovou, inuloid, pentadekadien, polyacetylenové látky, arabinogalaktan, ramnózu, PS 1 (4-0-methylglukuronara binoxylan s rel. mol. hmotností 35 kDa); PS 2 (kyselý ramnoarabinogalaktan s rel. mol. hmotností 450 kDa), cynarin, (kyselinu 1,5-di-0-kafeoylkvinovou), kyselinu 2-3-0-dikafeoyltartarovou, a jejich deriváty, alkylamidy, ketoalkiny aketoalkeny, kvinony; oleje 20 zahrnující: bomeol, bomylacetát; pentadeka-8(z)-en-2-on, germakren D; karyofylen; karyofylen-epoxid, antokyaniny, alkaloidy pyrrolizidinu, lipofilní amidy, izobutylamidy; polyacetyleny; klovatinu z myrhy, kurzenon (furanoeudesmanového typu;) dihydrofuranodien-6-on; 2methoxyfurandien (furanoelemenového typu); elamol; lyndesteren (furanogemakranového typu); alkylamidy, apigenin, arabinogalaktu, kyselinu askorbovou, kyselinu behenovou, kyselinu 25 octovou, betain, bomeol, bomylacetát, kyselinu kávovou, kyselinou 2-0-kafeoyl-3-(5-alfakarboxybeta)-3,4-dihydroxyfenyl, 2-0-kafeoyl-3-0-kumaroyltartarovou, 6-0-kafeoylekinakosid, kyselinou 2-0-kafeoyl-3-0-feruloyltartarovou, kyselinu 2-0-kafeoyltartarovou, kalcium, karbonát, beta karoten, karofylen, karyofylen-epoxid, chlorid, chlorogenní kyselinu, kyselinu cikorovou, methylester kyseliny cikorové, kobalt, kyanadin-3-0-(beta-d-glukopyranosid), 30 kyanadin-3-(6-0-malonyl-beta-d-glukopyranosid), cynarin, izobutylamid kyseliny deka(2e,4e,6e)-trienové, des-ramnosylverbaskosid, kyselinu 3,5-dikafeoylkvinovou, kyselinu 4-50-dikafeoylkvinovou, kyselinu 2,3-0-diferuloltartarovou, izobutylamid kyseliny dodeka(2e,4e)-dienové, dodeka-2,4-dien-l-yl izovalerát, izobutylamid kyseliny dodeka(2e,6z,8e,10e)-tetraenové, epizobunol, beta-famezen, kyselinu 2-0-ferulotartarovou, germakren, 35 heptadeka-(8z,l 1 z)-dien-2-on, heteroxylan, humulen 8-12, (e)-10-hydroxy-4,10-dimethyl-
4,1 l-dodekadien-2-on, kyselinu l3-hydroxyoktadeka-(9z,l le,15z)-trienovou, inulin, železo, izochlorogenní kyselinu, izohamnetin-3-rutinosid, izotussilagin, kampferol, kampferol-3glukózid, kampferol-3-rutinosid, limonen, luteolin, Iuteolin-7-glukózid, hořčík, mangan, 2methyltetradeka-5,12-dien, 2-methyltetradeka-6,12-dien, methyl-p-hydroxycinamát, marcen, 40 niacin, kyselinu palmitovou, pentadeka-(8z,l lz)-dien-2-on, pentadeka-(8z,13z)-dien-l 1-lyn
2-on, pentadeka-8-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-l 1,13-dien-2-on,
1-pentadecen, penta-(l,8z)-dien, fosfor, alfa pinen, beta pinen, polyacetyleny, pontika-epoxid, draslík, protein, kvercetagetin-7-glukózid, kvercetin, kvercetin-3-galaktózid, kvercetin-3glukózid, kvercetin-3-robinosid, kvercetin-3-xylózid, kvercetin-3-xylózylgalaktózid, ramno45 arabinogalaktan, riboflavin, rutin, rutosid, selen, silikát, beta-sitosterol, sitosterol-3-beta-o- 12CZ 298406 B6 glukózid, sodík, stigmasterol, sulfát, kyselinu tartarovou, tetradeka-(8z)-en-l 1,13-dien-2-on, thiamin, n-triakontanol, trideka-l-en-3,5,7,9,10-pentayn, tussilagin, vanallin, verbaskosid, seskviterpeny, kyselinu octovou, alfa amyron, arabinózu, alfa-bisabolen, gama-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferin, kyselinu alfa-komiforovou, kyselinu 5 beta-komiforovou, kyselinu gama-komiforovou, kyselinu komiforionovou, m-kresol, kumidinalkohol, kuminaldehyd, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrin, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktózu, klovatinu, herabolen, alfa-herabomyrhol, beta-herabomyrhol, herabosen, limonen, kyselinu 4-0-methylglukuronovou, n-nonacesan, beta-sitosterol, xylózu, karofyleny, lyndestyren, karofyleny, klovatinu myrhy, kurzenon, dihydrofuanodien-6-on a 2-methoxyfurandien, ío lyndestyren.
Chemické vzorce některých botanických extraktů Echinacea jsou obecného vzorce II, III, a IV a jsou znázorněny níže:
(II).
(III).
(IV).
- 13CZ 298406 B6
Chemické vzorce některých botanických extraktů Commiphora myrrha jsou obecného vzorce V,
VI, VII a VIII a jsou znázorněny níže:
curzerenon (furanoeudesmanový typ)
4,5-dihydrofuranodien-8-on 2-methoxyfuranodien (furanoelemenový typ) (V), (Vil),
lindestren (furanogernakranový typ)
(VII), (Vlil),
Myrha je někdy také uváděna jako: myrrh, mirre, myrrhis, gumi myrha, myrrha vera, gum myrrh, Commiphora resin, gruggal gum, gruggal resin, eerabol myrrh, myrrhe, Manniliche myrrhe, Opopanax, a Hirabol myrrh. Myrha také může obsahovat klovatinu, která se získává z řezů, které se provádějí do kůry stromů rodu Commiphora myrrha, tzn. stromu myrhy. Myrha také obsahuje balzámové šťávy z balsamodendron myrrha, tzn. arabské myrty. Myrha se také může extrahovat zOsmorhiza nebo Washingtonia, které se někdy uvádějí jako sladké cicely. Strom myrhy je původem z Erythrei, Habeše, Somálska, Jemenu, Súdánu a jinde.
Druhy Commiphory, které produkují myrhu jsou křoviny nebo malé stromy se širokými ostrými ostny na kmeni. Nestejné trojité listy jsou střídavé a drobné květy jsou uspořádány ve formě koncových dat. Pokud je poškozen, schizogenní pryskyřicové kanálky poskytují drogu myrhu.
Myrha je na vzduchu vyschlá olejová klejopryskyřice, která vykapává z kůry druhů Commiphora. Hmota obsahuje nepravidelná, okrouhlá zrníčka nebo hrudky, které se liší velikostí dírek a barevnými odstíny od tmavě hnědé a téměř černé až ke světlé nebo tmavě oranžově-hnědé barvě; některé části mohou být žluté nebo bezbarvé až bledě žluté. Povrch je většinou pokryt šedým až nažloutle šedým práškem; lomy jsou lasturové a poskytují tenké průhledné fragmenty. Myrha má sladkou vůni a ostrý aromatický zápach. Myrha má hořkou aromatickou chuť. Myrha je štiplavá a lepí se při žvýkání na zuby.
Commiphora molmol a jiné druhy Commiphora, pokud jde o chemické složení jejich klejopryskyřice, jsou srovnatelné s myrhou DAB 10. Je rozhodně zmatek v literatuře, která se týká zdrojů myrhy a shodnosti druhů Commiphora. Běžně používaná myrha pochází od Commiphora myrrha. Somálská myrha pochází z Commiphora molmol. Nicméně systematický (taxonomický) vztah mezi Commiphora myrrha a Commiphora molmol není objasněn. Původem habešské myrhy je Commiphora madagaskarská nebo Commiphora habešská. Má se za to, že Opopanax, která je také uváděn jako bisabolská myrha nebo parfémované bdelium pochází z jak Commiphora erythrea (Ehrenb) nebo Opopanax.
- 14CZ 298406 B6
Složení myrhy je velmi komplikované, a jen částečně známé z 40 až 60 %, myrha je rozpustná v ethanolu a obsahuje pryskyřici a esenciální olej. Myrha obsahuje téměř výhradně seskviterpeny. Hlavní složkou seskviterpenů jsou: furanoseskviterpeny germakran eleman, eudesman a typy guaian. Navíc obsahuje seskviterpeny cukrů, např. β a δ-elemen, β-bourbonen, β-karyofylen, humulen a seskviterpenové alkoholy, např. elemol. Pravděpodobně některé z furanoseskviterpenů jsou typické pro farmaceutickou myrhu. Surová klovatina myrhy nebo surový klíh obsahují 20 % proteinů a 65 % cukrů, které jsou tvořeny galaktózu, kyselinou 4-0-methylglukuronovou aarabinózou. Sloučeniny Commiphory myrrhaphyto obsahují: kyselinu octovou, alfa-amyron, arabinózu, alfa-bisabolen, gama-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferin, kyselinu alfa-komiforovou, kyselinu beta-komiforovou, kyselinu komiforovou, m-kresol, kuminalkohol, kuminaldehyd, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrin, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktózu, pryskyřici, herabolen, alfa-herabomyrhol, beta-herabomyrhol, heraboresen, limonen, kyselinou 4-0-methylglukuronovou, n-nonacesan, beta-siterol, xylózu, karopyleny (karofyleny), klejopryskyřici myrhy, kursenon, dihydrofuanodien-6-on, 2-methoxyfurandien a lyndestyren (lindestyren).
Tinktury myrhy mají protizánětlivý účinek. Makroskopicky a mikroskopicky se myrha jeví jako hnědožlutý prášek, s charakteristickými žlutavými střípky nebo okrouhlými zrnky různé velikosti společně s jemnou zrnitou látkou, která bobtná ve vodě. V chloralhydrátovém preparátu je jenom málo zlomků tkáně rostlinného původu: červenohnědé zlomky korku, jednotlivé nebo skupiny mnohostěnných až protáhlých buněk, částečně s velmi ztluštěnými a zdřevnatělými stěnami a hnědavým obsahem; zlomky tenkostěnného parenchymu a sklerenchymatostními vlákny a 10 až 25 pm nepravidelnými hranolovými až mnohostěnnými krystaly šťavelanu vápenatého.
Myrha se má chránit před světlem a vlhkostí v dobře uzavřených nádobách. Nejlepší je spolu s vysoušecím prostředkem, protože cukerná složka léčiva rychle absorbuje vodu. Myrha by neměla být skladována v práškové formě.
Kyselina listová
S nejlepšími výsledky se přednostně používá kyselina listová jako živina. Kyselina listová, také uváděná jako kyselina pteroylglutamová, foldin, folaemin, foliamin, folicet, folipac, folletes, folsan, folvite, incafolic, millafol nebo cytofol je žlutý, krystalický, ve vodě rozpustný vitamín skupiny B-komplexu, nezbytně nutný pro růst buněk a jejich reprodukci. Kyseliny listová jakožto koenzym spolu s vitamínem B12 a vitamínem C mají svoji funkci při štěpení a utilizaci proteinů a při tvorbě nukleových kyselin a hernu v hemoglobinu. Kyselina listová zvyšuje chuť k jídlu a stimuluje tvorbu kyseliny chlorovodíkové v zažívacím ústrojí. Kyselina listová se skladuje v játrech a je syntetizována bakteriální flórou v gastrointestinálním traktu. Nedostatek kyseliny listové vede k malému růstu, šedivění vlasů, zánětu jazyka, zánětu v dutině ústní, lézi v zažívacím ústrojí, průjmu a může vést k megaloblastické anémii. Nedostatek je způsoben neadekvátním příjmem vitamínu v potravě, malabsorpcí nebo metabolickými odchylkami. Spotřeba kyseliny listové se zvyšuje v těhotenství, v dětství a při stresu. Kyselina listová je nestabilní na světle a termolabilní a k významným ztrátám dochází, pokud se vitamín skladuje po dlouhou dobu. Kyselina listová je netoxická a je účinná při léčbě specifických stavů, kdy chybí. Obecný vzorec kyseliny listové IX je znázorněn níže:
-15CZ 298406 B6
I
CH, I
COOH kyselina listová (kyselina pteroylgiutamová) (IX),
Struktury kyseliny listové je znázorněna níže:
24mino-44iydroxy. kyselina p-aminobenzoová kyselina glutamové 6-methylptendin
O I! Η H C-N-C—CH,—CH.,—COOH
COOH kyselina pteroová kyselina pteroylgiutamová (kyselina listová) (X),
Molekula kyseliny listové obsahuje kyselinu glutamovou, kyselinu p-aminobenzoovou a pterin;
sloučením pterinu a kyseliny p-aminobenzoové vzniká kyselina pteroová. Uvedený vzorec je kyselinou pteroylglutamovou zjater. Kyselina listová, kterou produkují baktérie, obsahuje tři rezidua kyseliny glutamové, které jsou spojené γ-glutamovou vazbou. Mnoho tkání zvířat obsahuje kyselinu pteroylheptaglutamovou, rezidua kyseliny glutamové jsou opět spojeny γ-glutamovou vazbou. Syntetické kyseliny pteroylpolyglutamové, ve kterých jsou molekuly 10 kyseliny glutamové spojeny oc-glutamovými vazbami, jsou aktivní při testech bakteriálního růstu; kyseliny pteroyl-y-glutamové jsou účinné jak u bakterií, tak i při léčbě makrocytámí anémie u člověka. Enzym ve tkáni zvířat hydrolyzuje přirozeně se vyskytující sloučeniny pteroylglutamátu na kyselinu pteroylglutamovou a volné kyseliny glutamové.
Níže je znázorněn jiný obecný vzorec XI kyseliny pteroylglutamové (PteGluj):
Pitrsyl monoheptaglutamát
methyltetrahydrofolát kyselina folinová 10-formyltetrahydrofolát
5.10- methenyltetrahydrofolát
5.10- methylentetrahydrofoiát Formiminotetrahydrofolát hydroxymethyltetrahydrofolát pozice radikál kongener
N* -CH, CHjH/lcGlu
N* —CHO 5-CHOH/i<GU
—CHO IOCHOH4Pi.GIm
—CH- S,ŮKHH/t«Glu
Ns-w —CH,— 5,10-CHjH/ieGlu
N* —CHŇH CHNHHjfteGlv
Nl0 —CH,OH
Vzorce a názvosloví pteroylglutamové kyseliny (kyseliny listové) (XI).
- 16CZ 298406 B6
Hlavní část molekuly kyseliny listové obsahuje pteridinový kruh připojený pomocí methylenového můstku na paraaminobenzoovou kyselinu, která je připojena pomocí amidové vazby na kyselinu glutamovou. Zatímco kyselina pteroylglutamová je běžnou farmaceutickou formou kyseliny listové, není ani hlavním protějškem v potravě ani aktivním koenzymem nitrobuněčného metabolismu. Následně po vstřebání je PteGlui rychle redukována na pozicích 5, 6, 7 a 7 na kyselinu tetrahydrolistovou (H^PteGlui), která potom působí jako příjemce počtu jednouhlíkatých jednotek. Ty jsou napojeny buď na pozici 5, nebo na pozici 10 pteridinového kruhu nebo se tyto atomy přemostí a vytvoří nový pětičlenný kruh.
Vitamín B12 a kyselina listová jsou z hlediska potravy esenciální pro člověka. Nedostatek kteréhokoliv z těchto vitamínů vede k defektní syntéze DNA jakékoliv buňky, u které se chystá replikace chromozomů a dělení. Vzhledem ktomu, že tkáně s nejvyšším buněčným obratem vykazují nej dramatičtější změny, je hematopoetický systém obzvlášť citlivý na nedostatek těchto vitamínů. Klinicky se nej častějším příznakem nedostatku těchto vitamínů megaloblastická anémie, kde porucha syntézy DNA vede k charakteristickým morfologickým abnormalitách prekurzorových buněk v kostní dřeni. Výsledkem jsou abnormální makrocytární červené krevní buňky a pacient se stává těžce anemickým.
Methylkobalamin podporuje reakci methionin syntetázy, která je esenciální pro normální metabolismus kyseliny listové. Methylové skupiny, které jsou součástí kyseliny methyltetrahydrolistové (CH3H4PteGlui) se používají pro tvorbu methylkobalaminu, který potom působí jako dárce methylové skupiny při konverzi homocysteinu na methionin. Tato interakce kyselina listová - kobalamin je klíčová pro normální syntézu purinů a pyrimidnů a tím i DNA. Reakce methionin syntetázy je zodpovědná za kontrolu recyklujících kofaktorů kyseliny listové; udržování nitrobuněčných koncentrací folylpolyglutamátů a přes syntézu methioninu a jeho produktu S-adenosylmethioninu udržování počtu methylačních reakcí. Vzhledem ktomu, že kyselina methyltetrahydrolistováje hlavním reprezentantem kyseliny listové, kterou jsou zásobovány buňky, přenos methylové skupiny na kobalamin je esenciální pro dostatečný přísun kyseliny tetrahydrolistové (H4PteGlui), která je substrátem pro řadu metabolických kroků. Kyseliny tetrahydrolistová je prekurzorem pro vznik nitrobuněčných folylpolyglutamátů, také působí jako příjemce jednouhlíkatých jednotek při konverzi šeřinu na glycin, s výslednou tvorbou kyseliny
5.10- methylentetrahydrolistové (5,10-CH2H4PteGIU|). Další deriváty poskytují methylenové skupiny do deoxyuridylátu pro syntézu thymidylátu - velmi důležitou reakci pro syntézu DNA.
5.10- CH2H4PteGlui je v průběhu konvertována na kyselinu dihydrolistovou (H2PteGlui). Cyklus je potom dokončen redukcí H2PteGlui na H4PteGlui pomocí dihydrofolátreduktázy. Tento krok je blokován antagonisty kyseliny listové jako je např. methotrexát. I jiné cesty také vedou k syntéze kyseliny 5, 10 methylen tetrahydrolistové.
- 17CZ 298406 B6
Tabulka A: Biosyntéza kyseliny listové
Níže je znázorněna biosyntéza kyseliny listové. Symbol ppp představuje trifosfát.
OH
ribóza PPP
GTP(t)
dihydronsopterin trifosfát (IV)
2-amino-4-hydroxy-6-
kyseltna dihydropteroová (VU)
kyselina dihydrofolová (Vlil)
COOH
Kyselina listová může být do tkání transportována jako CH3H4PteGlu|. Játra aktivně redukují a methylují PteGlui (a H2 nebo H4 PteGlu,) a potom transportují CH3H4PteGlui do žluče. Pomocí té je reabsorbována střevem a následně dodána do tkání, CH^PteGlU] působí jako dárce
-18CZ 298406 B6 methylu při tvorbě methylkobalaminu a jako zdroj H4PteGlu| a dalších homologů kyseliny listové, jak byli již dříve uvedeno. Kyselina listová se skladuje v buňkách ve formě polyglutamátů.
Surfaktanty
I když benzalkonium chlorid je upřednostňovaným surfaktantem s nejlepšími výsledky, za určitých okolností může být žádoucí použití jiných kvartémích amonných surfaktantů a jiných surfaktantů.
Kvartémí amonnou látkou může být chlorid dikokodiamonný, který je také znám jako dikokoalkyldimethyl chlorid nebo jako dikokodimethyl amonium chlorid nebo Di-C8-18-alkyldimethyl chlorid. Ten se může použít v kombinaci s izopropanolem, jako je např. 20 až 30% izopropanol. Upřednostňovaný zdroj kvartémí látky obsahuje: 70 až 80% kvartémí amonnou látku a méně než 0,03% methyl chlorid, má specifickou hmotnost 0,87 při 115 °F (46 °C), parciální tlak je 4,4kPa (33 mmHg) při teplotě 68 °F (20 °C), výchozí teplota varu je 180 °F (82,2 °C) při 101 kPa (760 mmHg) a těkavost 20 až 30 %, a je vyráběný pod obchodním jménem CarSpray 300 firmou Witco Corporation, Dublim, Ohio, USA. Kvartémí amonná látka má dezinfekční vlastnosti a může se používat jako fungicid při léčbě houbových a plísňových infekcí.
Další kvartémí amonné látky, které jsou užitečné, jsou vyráběny pod obchodním jménem Jet Quat 2C-75 firmou Jetco Chemicals, lne., Corsicana, Texas, USA nebo jsou vyráběny pod obchodními jmény Carspray 400 a Camauba Spray 200 firmou Witco Corporation, Dublin, Ohio, USA, nebo obsahují 9% denaturovaný ethylalkohol, který se prodává pod obchodním jménem BTC2125M firmou Strephan Company, Northfield, Illinois, USA, nebo následující produkty MAQUAT, které obsahují n-alkyl dimethyl benzyl amonium chlorid, který vyrábí firma Mason Chemical Company, Arlington Heights, Illinois, USA. LC-12S (67% C12, 25% C14, 7% C16, 1% C18), MC 1416 (%C12, 60% C14, 30% C16, 5% C18), MC1412 (40% C12, 50% C14, 10% Cl6), SC-18 stearylová pasta nebo vločka (5% Cl6, 95% Cl8), TC-76 nebo MQ-2525 (5% C12, 60% C14, 30% C16 a 5% Cl8), a MC-6025-50% (25% C12, 60% C14 a 15% C16). Jet Quat 2C-75 obsahuje: 50 až 75 % dikokodimethyl kvartémí chlorid amonný, 20 až 50 % izopropyl alkoholu, má specifickou hmotnost 0,88 a teplota varu 180 °F (82,2 °C). CarSpray 400 obsahuje: 55 až 65 % kvartémích amonných látek, 20 až 30 % aminů, C14ažC18aC16až 18 nenasycený ethoxylovaný alkyl, 10 až 20 % izopropanolu a méně než 0,03 % methyl chloridu, má specifickou hmotnost 0,88 při teplotě 75 °F (23,9 °C), parciální tlak je 4,4 kPa (33 mmHg) při teplotě 68 °F (20 °C), výchozí teplota varu je 180 °F (82,2 °C) při tlaku 101 kPa (760 mmHg) a těkavost je 10 až 20 %. Camauba Spray 200 obsahuje: 50 až 60 % kvartémích amonných látek, 10 až 20 % izopropanolu, 15 až 25 % vody, 1 až 10 % alkoylovaného kamaubského vosku a méně než 0,03 % methyl chloridu, má specifickou hmotnost 0,90 při teplotě 80 °F (26,7 °C), parciální tlak je 4,4 kPa (33 mmHg) při teplotě 68 °F (20 °C), výchozí teplota varuje 180 °F (82,2 °C) při tlaku 101 kPa (760 mm/Hg) a těkavost je 20 až 40 %.
Neionické surfaktanty jsou látky působící povrchově, které neionizují ve vodném roztoku. Ty mají velmi často hydrofilní vlastnosti, protože obsahují oxygenovaný řetězec (např. polyoxyethylenový řetězec), lyofilní část molekuly je odvozená od mastných kyselin, fenolů, alkoholů, amidů nebo aminů. Ukázkovými látkami jsou kondenzáty polyethylenoxidů a alkylových fenolů, např. kondenzační produkt vzniklý z jednoho molu nonyl fenolu a deseti molů ethylenoxidu a kondenzační produkty alifatických alkoholů a ethylenoxidu, např. kondenzační produkt vzniklý z jednoho molu tridekanolu a 12 molů ethylenoxidu.
Neionické surfaktanty mohou obsahovat fenolethoxyláty, které obsahují kondenzační produkt ethylenoxidu a alkylfenolu nebo alifatického alkoholu. Neionické surfaktanty s výhodou obsahují nonolfenolethoxylát jako je T-DET a/nebo oktafenolethoxylát. Neionické surfaktanty jsou reakčními produkty ethylenoxidu a nonolfenolu a/nebo oktafenolu. Poměr fenolu ku ethylenoxidu se může pohybovat v rozmezí od 2:20 až k 4:16 a s výhodou je 8:12.
-19CZ 298406 B6
Neionické syntetické surfaktanty mohou zahrnovat i neionické detergenty. Neionické syntetické surfaktanty mohou také vznikat kondenzací ethylenoxidu s hydrofobní bází, která vzniká kondenzací propylenoxidu s propylenglykolem. Hydrofobní část molekuly, která se samozřejmě vyznačuje nerozpustností ve vodě, má molekulovou hmotnost od 1200 do 2500. Přidání polyoxyethylenových radikálů k takové hydrofobní části má tendenci ke zvýšení rozpustnosti molekuly jako celku ve vodě a tekutá povaha látky se udržuje až do té míry, kdy obsah polyethylenu je 50 % celkové hmotnosti kondenzační látky. Jiné neionické syntetické surfaktanty obsahují: polyethylenoxidové kondenzáty alkylfenolů, např. kondenzační látky alkylfenolů nebo dialkylfenolů, kde alkylová skupina obsahuje 6 až 12 atomů uhlíku v konfiguraci jak nerozvětvených, tak i rozvětvených řetězců s ethylenoxidem. Ethylenoxid je přítomný v množství ekvivalentním od 8 do 25 mol ethylenoxidu na mol alkylfenolů. Alkylový substituent v těchto látkách bývá odvozen od polymerovaného propylenu, diizobutylenu, n-oktenu nebo n-nonenu.
Neionické surfaktanty mohou také vzniknout kondenzací ethylenoxidu s reakčním produktem propylenoxidu a ethylendiaminu, např. látek, které obsahují od 40 do 80 % polyoxyethylenu podle hmotnosti a které mají molekulovou hmotnost od 5000 do 11 000. Vznikají reakcí ethylenoxidových skupin s hydrofobní bází, které obsahují reakční produkt ethylendiaminu a přebytek propylenoxidu; tyto báze mají molekulovou hmotnost od 2500 do 3000.
Mezi jiné neionické surfaktanty patří kondenzační produkt alifatických alkoholů, které obsahují od 8 do 18 atomů uhlíku v konfiguraci jak nerozvětvených, tak i rozvětvených řetězců s ethylenoxidem, např. kondenzace ethylenoxidu a kokosového alkoholu, kde koncentrace ethylenoxidu je 10 až 30 molů na mol kokosového alkoholu a frakce kokosového alkoholu obsahuje od 10 do 14 atomů uhlíku.
Mezi další neionické surfaktanty patří terciární aminoxidy s dlouhými řetězci obecného vzorce XII:
R,R3R2N->0 (XII), kde Ri je alkylový radikál o 8 až 18 atomech uhlíku, R2 a R3 jsou methylové nebo ethylové radikály. Šipka ve vzorci je konvenčním znázorněním semipolámí vazby. Mezi příklady aminoxidů vhodných pro použití patří: dimethyldodecylaminoxid, dimethyldecylaminoxid, dimethyltetradecylaminoxid a dimethylhexadecylaminoxid.
Mezi další neionické surfaktanty patří terciární fosfinoxidy s dlouhými řetězci obecného vzorce XIII:
R R' R P->O (XIII), kde R je alkyl, alkenyl nebo monohydroxyalkylový radikál s délkou řetězce o počtu atomů uhlíku od 10 do 18 a R' a R jsou alkylové nebo monohydroxyalkylové skupiny, které obsahují od 1 do 3 atomů uhlíku. Šipka ve vzorci je konvenčním znázorněním semipolámí vazby. Mezi příklady vhodných fosfinoxidů patří: dimethyldodecylfosfinoxid, dimethyltetradecylfosfinoxid, ethylmethyltetradecylfosfínoxid, cethyldimethylfosfmoxid, dimethylstearylfosfinoxid, cethylethylpropylfosfmoxid, diethyldodecylfosfinoxid, diethyltetradecylfosfinoxid, dipropyldodecylfosfínoxid, bis-(2-hydroxymethyl)dodecylfosfinoxid, bis-(2-hydroxyethyl)dodecylfosfinoxid, (2hydroxypropyljmethyltetradecylfosfinoxid, dimethyloleylfosfinoxid a dimethyl-(2-hydroxydodecyl)fosfínoxid.
Za některých okolností je užitečné použití jiných surfaktantů jako jsou např. jiné kationtové surfaktanty, amfolytické surfaktanty nebo zwitteriontové surfaktanty.
Kationtové surfaktanty obsahují kationtové detergenty. Kationtové surfaktanty obsahují látky, které ionizují ve vodném médiu za vzniku kationtů, které obsahují lyofilní skupinu. Typickým
-20CZ 298406 B6 příkladem takovýchto látek jsou kvartémí amonné soli, které obsahují alkylovou skupinu o 12 až atomech uhlíku, jako je např. laurylbenzyldimethylamonium chlorid.
Amfolytické surfaktanty jsou látky, které obsahují v jedné molekule jak aniontové tak i kationtové skupiny. Příkladem takovýchto látek jsou deriváty alifatických aminů, které obsahují dlouhé řetězce s 8 až 18 atomy uhlíku a aniontovou skupinu ve vodě rozpustných látek, např. karboxysulfo, sulfo nebo sulfátovou skupinu. Příkladem amfolytických detergentů jsou: 3-dodecylaminopropansulfonát sodný, N-methyltaurát sodný a podobné látky, jako např. vyšší alkylem substituované aminokyseliny, betainy, thetiny, sulfonované dlouhé řetězce nenasycených aminů a sulfonované deriváty imidazolinu.
Zwitteriontové surfaktanty obsahují syntetické detergenty. Zwitteriontové surfaktanty jsou obecně deriváty alifatických kvartémích látek, ve kterých alifatický radikál může obsahovat nerozvětvený nebo rozvětvený řetězec a kde jeden z alifatických substituentů obsahuje 8 až 18 atomů uhlíku a další obsahuje aniontovou skupinu ve vodě rozpustných látek, např. karboxy, sulfo nebo sulfáto skupinu. Příkladem látek vyhovující této definici jsou: 3-(N,N-dimethyl-N-hexadecylamonio)propan-l-sulfát a 3-(N,N-dimethyl-N-hexadecylamonio)-2-hydroxypropan-l-sulfát.
Klinická farmakologie.
Když se smísí fytochemikálie Echinacea a Commiphora (antimikrobiální izoláty, botanické extrakty a inhibitory mikrobů), sloučí se a aplikují společně s: surfaktantem, s výhodou benzalkonium chloridem; nosičem živiny, s výhodou kyselinou listovou; a sterilním vodným nosičem; bylo dosaženo nepředpokládaných a překvapivě dobrých výsledků při odstraňování (léčbě) HIV a jiných infekčních onemocnění a dramaticky se zvýšila účinnost léčiva (mikrobicidní látky). Při testování ve zkumavce unikátní látka vykazovala nepředpokládanou a překvapivě dobrou protivirovou aktivitu proti HIV, zahrnující inhibici přilnutí HIV na cílové buňky. Když bylo synergické léčivo testováno in vivo, byly okamžitě potlačeny infekce herpes simplex. Když bylo synergické léčivo testováno in vitro, benzalkonium chlorid byl významně méně toxický a v bezpečných hladinách vykazoval vyšší úroveň inhibičního účinku proti HIV a HSV 1 & 2. Byla dokázána a pozorována synergická interakce směsi fytochemikálií Echinacea a Commiphora, kyseliny listové a surfaktantu sledováním rychlé rozpustnosti směšovaných složek a vzhledem k vlastnostem roztoku bylo dosaženo mírné adhezívní schopnosti. Dále chemické zdokonalené vlastnosti fytochemikálií Echinacea a Commiphora, nosiče surfaktantové živiny (živiny) a vodného nosiče, jako je zlepšená stabilita a zvýšená reaktivita, která je užitečná při léčbě infekčních onemocnění.
Léčivo se může použít v různých roztocích na: ústní a nosní sliznici; tkáň pochvy, stydké pysky; konečníkovou a kolem konečníkovou tkáň; tkáň penisu; kožní tkáň; otevřenou podkožní tkáň a při vyšších ředěních se může použít na oční infekce a s výhodou pro podání pochvou nebo konečníkem. Změnou koncentrace se může podávat léčivo i parenterálně. Léčivo je kontraindikováno pro použití skrze pochvu nebo konečník; v balíčkové úpravě; do ušního kanálu; na tlakové obvazy; výplně nebo požití, neboť takovéto použití léku může způsobit podráždění a chemické spáleniny. Také se nedoporučuje použít léčivo k léčbě anaerobních plísňových infekcí, vzhledem k tomu, že některé plísně jsou rezistentní.
-21 CZ 298406 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 až 7
Testování in vivo
V prvotní in-vivo studii lokálního podání léčiva byly hodnoceny účinky léčby a léčiva současného vynálezu na sedmi testovaných osobách, které byly testovány jako pozitivní na HSV 1 nebo
2. Osoby byly léčeny lokálně pomocí léčiva, které obsahuje benzalkonium chloridový surfaktant ve vodném roztoku (v poměru 1:750) v kombinaci s Echinacea purpurea v práškové formě obsahující již uvedené fýtochemikálie. Podání sloučeniny bylo provedeno dvoukrokovým postupem, nejprve se navlhčilo postižené místo nebo puchýřek benzalkonium chloridovým surfaktantem ve vodném roztoku pomocí aerosolu, jemným nanesením nebo použitím kapátka. Potom se zvlhčené místo překrylo práškovými fytochemikáliemi buď štětičkou, nebo ručním nasýpáním na postižené místo. Důležitým hlediskem v této léčbě je udržování kompletního překrytí postiženého místa po celou dobu propuknutí onemocnění. Proto bylo postižené místo udržováno překryté léčebnou sloučeninou opakovaným nanášením dle potřeby.
Ze sedmi osob bylo 6 žen a jeden muž. Na počátku této studie byl věk může 38 let a ženy byly ve věku 8, 27, 30, 32, 38 a 39 let. Během 6 týdnů infekce vzplála přibližně 12-krát. V 9 případech se jednalo o HSV 2, genitální opar a v třech případech HSV 1 (opary). U S—lete a 27-leté ženy je vyskytl HSV 1 (opar). U 30-leté, 38-leté a 39-leté ženy se vyskytl HSV 2 (genitální opar). 38—létá žena měla také HSV 1 opar. U 38-letého muže se vyskytl HSV 2 (genitální opar). U všech sledovaných osob byla dobře sestavená anamnéza onemocnění a průběh jejich onemocnění byl označený za standardní. Žádná sledovaná osoba nevěděla nic o testované léčbě ani o účinku léčiva, aby byly získány objektivní údaje. Při opakovaných testech jim bylo sděleno, že ve vzorcích léčiva může být přimícháno placebo.
V sedmi případech byla antimikrobiální látka (léčivo) nanášena přímo na tkáň v prodromálním stadiu. V pěti případech byla antimikrobiální látka nanesena přímo na prasklé puchýřky. Antimikrobiální látka byla opakovaně nanášena dle potřeby, aby bylo se udrželo pokrytí.
Pozorování: Každý jednotlivec (sledovaná osoba) udávala pocit brnění několik sekund po každém nanesení látky. Také udávali, že byl výrazný stupeň přilnavosti léčebné (antimikrobiální) látky k puchýřkům nebo postižené oblasti. Přilnavost určitého stupně sloučeniny k epiteliálním tkáním přetrvávala dokonce i po osprchování nebo opláchnutí místa vodou.
Výsledky: Výsledky testování 7 osob s léčbou a léčivem byly překvapivě neočekávaně dobré a velmi shodné. Každá osoba šťastně udávala, že jakmile byla sloučenina jednou nanesena na postižené místo, bolest zcela vymizela během 10 až 20 minut, i když k určité úlevě došli již i před tím. V sedmi případech, ve kterých byla látka (léčivo) podávána v prodromálním stadiu, osoby udávaly, že bolest ustala, všechny příznaky, které by se dříve stupňovaly až k úplnému vzplanutí, se zmírnily a ke vzplanutí nikdy znovu nedošlo. Všechny vnější příznaky a fyzikální projevy herpes vymizely v průběhu několika hodin po podání léčiva. V pěti případech, u kterých byla látka (léčivo) nanášeno na prasklé puchýřky, osoby udávaly, že bolest ustala během několika minut a pálení a svědění a podráždění vymizely během dvou až čtyř hodin a puchýřky se vysušily a vymizely během dvaceti jedna hodin. Ve všech případech ustaly ostatní vyčerpávající příznaky: horečka, malátnost, otok třísel, mokvající rány a bolestivé močení, jakmile bylo léčivo jednou podáno.
V dalším sledování, kdy osoby obdržely zásobu sloučeniny (léčiva) pro testování při budoucích vzplanutích, bylo udáváno, že jakmile se objevily počáteční příznaky, které signalizovaly prodromální stadium vzplanutí infekce, látka (léčivo) byla ihned osobami nanesena podle návodu a vzplanutí infekce bylo plně zastaveno. Bylo také udáváno, že osoby, které měly dříve zkuše-22CZ 298406 B6 nosti s několika vzplanutími infekce za rok, pozorovaly významně delší období latence. Dále byla v tříletém období sledována jedna osoba, která udávala těžká vzplanutí infekce každý měsíc po dobu čtyř let před použitím tohoto léčiva. Ta nyní udávala, že se u ní nevyskytlo při použití tohoto léčiva nové vzplanutí infekce více než rok.
Další pozorování: Jedna sledovaná osoba mužského pohlaví udávala, že po počátečním podávání během prodromální fáze vzplanutí infekce, si osprchovala a zapomněla nanést sloučeninu (léčivo) po dobu přibližně 30 hodin. Několik puchýřků následně prasklo a začalo splývat. Osoba začala znovu sloučeninu (léčivo) nanášet a poté udržovala místo dobře pokryté sloučeninou. Vzplanutí vymizelo do 21 hodin stejným způsobem, který popisovaly i jiné osoby.
Jiné pozorování ukazuje, že sloučenina (léčivo) může být slabší nebo méně účinná za přítomnosti určitých proteinů nebo mýdel. Jedna sledovaná osoba ženského pohlaví byla příliš horlivá při čištění postiženého místa před nanášením sloučeniny (léčiva). Toto se přihodilo v průběhu třetího vzplanutí infekce po úspěšném použití sloučeniny (léčiva) na dvě předchozí vzplanutí infekce.
V tomto případě, kdy sloučenina (léčivo) byla nanášena, se nevyskytl známý pocit brnění a příznaky se nezmímily. Uběhlo přibližně 24 hodin, než vyhledala nějakou pomoc a vzplanutí infekce se vystupňovalo až do úplného stadia výsevu puchýřků se všemi doprovodnými příznaky tohoto onemocnění. Byla poučena, že místo se musí důkladně opláchnout od zbytků mýdla, místo se musí vysušit a potom se na místo opět nanese sloučenina (léčivo). Poté, co dodržovala instrukce, udávala, že vzplanutí infekce bylo pomocí léčebné sloučeniny plně vyléčeno, tak, jak tomu bylo u dvou předchozích vzplanutí infekce.
Příklady 8 až 13
Dermatologické a veterinární testování
Bylo provedeno testování zvířat, aby se určila jakákoliv možná dermatologická alergická reakce vyvolaná léčebnou sloučeninou (léčivem). Sledovalo se šest zvířat. Mezi zvířata patřily 3 králičí samice (neznámého věku); 2 psi (1 samice ve věku 2 let a 1 samec ve věku 9 let); a jeden vykastrovaný kocour ve věku 3 let. U těchto pokusů se zvířaty byla nanášena každému zvířeti výše zmíněná sloučenina (léčivo), již dříve zmíněným způsobem, na vnitřní část zevního ucha. Ve všech případech bylo místo určené k léčbě udržováno překryté látkou po dobu 24 hodin a bylo porovnáváno s časem, po který toto sledované osoby používaly. Test provedený na šesti zvířecích jedincích prokázaly, že nebyl zjištěn žádný příznak kožního podráždění nebo alergické reakce.
Příklad 14
Výše zmíněná sloučenina (léčivo), která obsahuje virové inhibitory, byla také testována na papilloma viru, který způsobuje bradavice na čenichu vykleštěného čistokrevného koně. Bradavice Papilloma viru se velmi obtížně léčí. Bradavice měřila v průměru 25 mm. Antimikrobiální látka (léčivo) byla nanášena dvakrát denně. Při každém nanášení byla měřena velikost bradavice.
Výsledky: Zcela nepředpokládané se bradavice dramaticky zmenšila co do velikosti přibližně o 3 mm denně, pokud bylo léčivo nanášeno na bradavici a vymizela kompletně pátý den. Bylo zjištěno, že bradavice začala ustupovat v prvních povrchových vrstvách, a odhalily se široké zčervenalé pupínky. Poté se bradavice nezmenšily jenom co do velikosti odrolením nebo odloupáním, zmenšily v místě nasednutí na pokožku a potom se odlouply aniž by zanechaly po sobě jizvy.
V probíhající dlouhodobé in vivo studii tohoto vynálezu, která začala s prvními sedmi osobami v dubnu 1989 a která již probíhá 7 let, bylo léčeno přibližně 100 infekčních vzplanutí pomocí
-23 CZ 298406 B6 léčiva v různých koncentracích, jak již bylo dříve popisováno. Ve všech případech bylo dosaženo překvapivě stejných dobrých výsledků: 1. Bolest vymizí během minut; 2. neobjeví se žádné vzplanutí infekce, pokud je sloučenina podávána v prodromálním stadiu; 3. Vzplanutí infekce odezní během dvaceti jedna hodin, pokud je látka podávána ve stadiu puchýřků.
Testování in vitro
Laboratorní testování bylo prováděno na Univerzitě v Chicagu, v laboratořích klinické mikrobiologie, aby se určila inhibiční aktivita in vitro léčby a sloučeniny (léčiva). Laboratorní testování 10 vedl zástupce přednosty PhDr., a docent patologie. Při testování léčebné sloučeniny in vitro, dále uváděné jako „lék“, bylo dosaženo překvapivě dobrých výsledků. Bylo zjištěno, že léčba a sloučenina poskytovaly neočekávaně, překvapivě vynikající inhibiční aktivitu proti HSV 1 a HSV 2. Patologové uvedli, že již testovali „stovky“ jiných látek a doposud nikdy neviděli tak dobrou látku jako je tato.
Následují lékařské testy, které byly provedeny a jejichž výsledky byly získány na Univerzitě v Chicagu. Pro jednodušší interpretaci některých vědeckých údajů a výsledků testů jsou níže uvedeny následující definice pojmů:
„MEM“ znamená minimální esenciální médium. To znamená kultivační médium, které se používá k růstu buněk, na kterých probíhá testování.
„Fibroblast“ je mezenchymální lidská buňka (buňka, která se nachází v pojivové tkáni, krvi, kosti, lymfatické tkáni a chrupavce).
„IC50“ znamená inhibiční koncentrace. Pro toto testování byl vybrán 50% koncový bod, jak je obvyklé. Číslo určuje největší ředění pod 50 %. Proto je toto definice koncového bodu.
Jestliže místo pod ředěním zůstává čisté, znamená to, že toto ředění může být toxické, test 30 nemá cenu hodnotit nebo nejsou k dispozici hodnotitelné údaje.
Pokud je místo pod ředěním označeno rozdělovači čárkou (-), znamená to, že nejsou žádné povlaky a tím, že došlo k úspěšné inhibicí herpes (HSV).
Příklady 15 až 17
U těchto in vitro testů byly použity následující léky (léčiva):
Lék č. 1 = Surfaktant benzalkonium chlorid ve vodném roztoku v poměru 1:750. Surfaktant ve vodném roztoku se před použitím filtruje a ředí v poměru rovném 2xMEM a pro zisk poměru 1:1500 lxMEM.
Lék č. 2 = Prášek Echinacea (fytochemikálie) ve vodném roztoku. Tento přípravek byl extra45 hován teplou extrakcí pomocí sterilní vody. Extrahované fytochemikálie byly před použitím centrifugovány a filtrovány. Filtrované fytochemikálie byly naředěny v poměru rovném 2xMEM a pro výrobu neředěného přípravku lxMEM.
Lék č. 3 = Prášek Echinacea (fytochemikálie) byl extrahován a sloučen se surfaktantem benz50 alkonium chlorid procesem studené extrakce. Sloučený přípravek byl před použitím centrifugován a filtrován a v poměru rovném 2xMEM a pro výrobu neředěného přípravku v lxMEM.
1. Tři 24-jamkové plotny byly naočkovány fibroblasty. Byly použity tři různé výtažky (pro porovnání) v pěti koncentracích k ověření protivirové aktivity v následujících koncentracích.
-24CZ 298406 B6
Neředěný, 1:2, 1:4, 1:8 a 1:16 v 1 xMEM. V každé plotně byly čtyři jamky, které obsahovaly
MEM bez léku.
2. Z jamek se odstranila růstová média a do každého kompartmentu horní poloviny plotny se přidalo 200 μΐ HSV-1. HSV-1 byl ředěn v poměru 1:5000 (2,0 μΐ kmene HSV-1 v 10 ml MEM). Virový titr byl 3x106 na ml. Do každé jamky dolní poloviny plotny se přidalo 200 μΐ HSV-2. HSV-2 byl ředěn v poměru 1:2000 (5,0 μΐ kmene EISV-2 v 10 ml MEM). Virový titr byl 6x105 na ml.
3. Plotny se nechaly inkubovat při teplotě 37 °C po dobu dvou hodin.
4. Odstranila se očkovací látka a do čtyř jamek se přidal 1 ml MEM obsahující léky č. 1 až 3. Níže je uvedená koncentrace léku v porovnání s MEM:
Tabulka 1
Koncentrace: Neředěno 1:2 1:4 1:8 1:16
Lék (μΐ): 4000 2000 1000 500 250
MEM (μΐ): - 2000 3000 3500 3750
5. Výsledky: HSV-1, překrytí tekutinou, lék přidán ihned po pohlcení viru.
Plotna 1, lék č. 1 kontaminována baktériemi !, žádný růst., zřejmě mrtvé.
Plotna 2, lék č. 2 kontaminována baktériemi !, žádný růst, zřejmě mrtvé.
Plotna 3, lék č. 3 výsledky jsou uvedeny níže v tabulce 2 a 3.
Tabulka 2 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č. 3
Koncentrace: Neředěno 1:2 1:4 1:8 1:16
plaky 54 toxické toxické — 6* 12**
plaky 42 toxické toxické - 4* 16**
Průměr: 48 5 14
IC5O>1:16
Tabulka 3 - Výsledky testu na HSV 2 s lékem č. 3
Koncentrace: Neředěno 1:2 1:4 1:8 1:16
plaky 46 toxické toxické — 22* 22**
plaky 49 toxické toxické — 21* 28**
Průměr: 48 22 30
IC5O>1:8 *mímá toxicita **velmi malé plaky
Poznámky: Při testování léčiva (léku č. 3) bylo dosaženo vynikajících výsledků. Buňky vypadaly dobře bez známek kontaminace. Přípravek může být na některé buňky toxický při nižších ředění.
Inhibiční aktivita tohoto přípravku byla neočekávaně úspěšná.
-25 CZ 298406 B6
Příklady 18 až 20
Tři 24-jamkové plotny byly naočkovány fibroblasty a následujícími léky.
Testovaný lék č. 1A = surfaktant benzalkonium chlorid ve vodném roztoku. Surfaktant benzalkonium chlorid byl připraven ředěním ve vodě v poměru 1:375 (32 μΐ ve 12,0 ml sterilní vody). Před použitím byl filtrován. Pak byl naředěn do objemu ekvivalentnímu 2xMEM a pro ředění 1:750 v lxMEM. Ředění se provádělo, aby byl zachován poměr.
Testovaný lék č. 2A = Prášek Echinacea purpurea (fytochemikálie) ve vodném roztoku. Tento přípravek byl roztok o koncentraci 50 mg/ml (300 mg v 6,0ml vody) prášku Echinaceapurpurea ve sterilní vodě. Tato směs se nechala míchat a chladit po dobu čtyř hodin. Přípravek prášku Echinacea byl před použitím centrifugován při 3500 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při teplotě 10 °C, filtrován a naředěn v ekvivalentním objemu 2xMEM a pro výrobu neředěného přípravku v lxMEM.
Testovaný lék č. 3A = Prášek Echinacea purpurea (fytochemikálie) rozpuštěný v surfaktantu benzalkonium chlorid. Tento přípravek byl roztok o koncentraci 50 mg/ml (300 mg v 6,0 ml benzalkonium chloridu, 1:375). Tato směs se nechala míchat a chladit po dobu čtyř hodin. Směs fytochemikálií a surfaktantu byla před použitím centrifugována při 3500 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při teplotě 10 °C, filtrována a potom naředěna v ekvivalentním objemu 2xMEM a pro výrobu naředěného přípravku v lxMEM.
1. Byly použity tři plotny k ověření tří přípravků léku. K ověření protivirové aktivity bylo zapotřebí koncentrace: 1:2, 1:4, 1:8 a 1:16 v lxMEM. V každé plotně byly čtyři kontrolní jamky, které obsahovaly MEM bez léku.
2. Z jamek se odstranila růstová média a do každé jamky horní poloviny plotny se přidalo 200 μΐ HSV-1. HSV-1 byl ředěn v poměru 1:5000 (2,0 μΐ kmene HSV-1 v 10 MEM). Virový titr byl 3x106 na ml.
3. Plotny se nechaly inkubovat při teplotě 37 °C po dobu čtyř hodin.
4. Odstranila se očkovací látka a do čtyř jamek se přidal 1 ml MEM obsahující léky č. 1A až 3 A. Níže je uvedená koncentrace léku v porovnání s MEM:
Tabulka 4
Koncentrace: Neředěno 1:2 1:4 1:8 1:16
Lék (μΐ): 4000 2000 1000 500 250
MEM (μΐ): - 2000 3000 3500 3750
5. Výsledky: HSV-1, překrytí tekutinou, sloučenina přidána ihned po pohlcení viru.
Tabulka 5 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č 1A
Koncentrace: plaky 70 plaky 68 plaky 58 plaky 74 Průměr: 70
1:2 1:4 toxické toxické
1:8 toxické
1:16 1:32 toxické toxické
IC50
-26CZ 298406 B6
Poznámky: Tyto jamky obsahovaly jemný precipitát pokrývající buňky. Benzalkonium chlorid pravděpodobně precipituje s proteinem média.
Tabulka 6 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č. 2A
Koncentrace: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
plaky 72 - - - 9* 12*
plaky 74 - - - 7 8
plaky 79 - - - 4 12
plaky 71 - - - 7 11
Průměr: 70
1CSO>1:32
Poznámky: Ačkoliv se objevily některé plaky, byly velmi malé.
Tabulka 7 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č. 3A
Koncentrace: 1:2 1:4 1:8 1:161:32 plaky 72 toxické toxické toxické toxické-* plaky 68plaky 67plaky 70Průměr: 70
IC5O>1:32
Poznámky: Ačkoliv se objevila určitá toxicita, lék byl velmi účinný ve virové inhibici, žádné plaky se neobjevily.
Příklady 21 až 24
Tři 24-jamkové plotny byly naočkovány fibroblasty.
Testovaný lék č. IB = Surfaktant benzalkonium chlorid ve vodném rozpouštědle. Surfaktant benzalkonium chlorid byl připraven ředěním ve vodě v poměru 1:1000 (10 μΐ ve 12,0 ml sterilní vody). Před použitím byl filtrován a naředěn v ekvivalentním objemu 2xMEM a pro ředění 1:2000 v lxMEM (500 μΐ léku plus 500 μΐ 2xMEM).
Testovaný lék č. 2B = Prášek Echinacea purpurea (fytochemikálie) ve vodném roztoku. Tento přípravek byl roztok o koncentraci 50 mg/ml (250 mg v 5,0 ml vody) prášku Echinaceapurpurea ve sterilní vodě. Tato směs se nechala míchat a chladit po dobu čtyř hodin. Tento práškový přípravek Echinacea byl před použitím centrifugován při 3500 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při teplotě 10 °C, filtrován a naředěn v ekvivalentním objemu 2xMEM a pro výrobu neředěného přípravku v lxMEM (500 μΐ léku plus 500 μΐ 2xMEM).
Testovaný lék č. 3B = Prášek Echinacea purpurea (fytochemikálie) rozpuštěný v surfaktantu benzalkonium chlorid. Tento přípravek byl roztok o koncentraci 50 mg/ml (250 mg v 5,0 ml benzalkonium chloridu, 1:1000). Tato směs se nechala míchat a chladit po dobu čtyř hodin. Fytochemikálie a surfaktant byly před použitím centrifugovány při 3500 otáčkách za minutu po dobu
-27CZ 298406 B6 minut při teplotě 10 °C, filtrována a potom naředěna v ekvivalentním objemu 2xMEM a pro výrobu neředěného přípravku v lxMEM. (500 μΐ léku plus 500 μΐ 2xMEM).
Testovaný lék č. 4B - Prášek Echinacea purpurea (íýtochemikálie) ve vodném roztoku (rozpouštědle) a potom smíchaný se surfaktantem benzalkonium chloridem v poměru 1:1000. Tento přípravek byl roztok o koncentraci 50 mg/ml (250 mg v 5,0 ml ve vodě) prášku Echinacea purpurea ve sterilní vodě. Tato směs se nechala míchat a chladit po dobu čtyř hodin. Vodné fýtochemikálie byly před použitím centrifugovány při 3500 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při teplotě 10 °C a filtrován. Přípravek se potom naředil v ekvivalentním objemu benzalkonium chloridu v poměru 1:1000 za vzniku směsi Echinacea - benzalkonium chlorid. Směs se potom naředila s ekvivalentním objemem 2xMEM za vzniku přípravku v poměru 1:4 v lxMEM. (500 μΐ léku č. 1 plus 500 μΐ 2xMEM).
1. K ověření čtyř přípravků léku byly použity čtyři plotny. K ověření protivirové aktivity bylo zapotřebí koncentrace: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 a 1:320 v lxMEM. V každé plotně byly čtyři kontrolní jamky, které obsahovaly MEM bez léku.
2. Z jamek se odstranila růstová média a do každé jamky horních dvou řádků každé plotny se přidalo 200 μΐ HSV-1. HSV-1 byl naředěn v poměru 1:5000 (2,0 μΐ kmene HSV-1 v 10 MEM). Virový titr byl 3x106 na ml. Do každé jamky dolní poloviny plotny se přidalo 200 μΐ HSV-2. HSV-2 byl naředěn v poměru 1:2000 (5,0 μΐ kmene HSV-2 v 10 ml MEM). Virový titr byl 6x105 na ml.
3. Plotny se nechaly inkubovat při teplotě 37 °C po dobu čtyř hodin.
4. Odstranila se očkovací látka a do čtyř jamek se přidal 1 ml MEM obsahující léky č. 1 až 4.
Tabulka 8
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
Lék (μΐ): 400 200 100 50 25
MEM (μΐ): 3600 3800 3900 3950 3975
5. Výsledky: HSV-1, překrytí tekutinou, léky přidány ihned po pohlcení viru.
Tabulka 9 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č. 1B
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
plaky 37 toxické toxické toxické toxické 15?*
plaky 45 18?*
Průměr: 41 IC50
Poznámky: Mírné toxické, bylo obtížné test odečítat.
Výsledky: HSV-1, překrytí tekutinou, léky přidány ihned po pohlcení viru.
-28CZ 298406 B6
Tabulka 10 - Výsledky testu na HSV 2 s lékem č. 1B
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
plaky 38 toxické toxické toxické toxické 21
plaky 42 17
Průměr: 40 19
IC50> 1:320
Poznámky: Test byl příliš toxický aby poskytl dobré odečítání.
Tabulka 11 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č. 2B
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
plaky 39 2* 8* 23* 24* 44
plaky 40 3 18 11 28 38
Průměr: 40 3 13 17 26
IC50>l:80
Poznámky: malé plaky.
Tabulka 12 - Výsledky testu na HSV 2 s lékem č. 2B
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
plaky 48 21 33
plaky 52 22 38
Průměr: 50 21,5 35,5
IC50>l:20
Tabulka 13 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č 3B
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
plaky 44 1 * 17 31 37
plaky 46 - 16 28 27
Průměr: 45 - 17 30 32
IC50>l:40
Poznámky: Ačkoliv se objevila určitá toxicita, lék byl velmi účinný ve virové inhibici, žádné plaky se neobjevily.
Tabulka 14 - Výsledky testu na HSV 2 s lékem č 3B
Koncentrace: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
několik buněk 11* 27 30 35
plaky 44 10 32
Průměr: 44 11 29,5
1C50>1:20
Poznámky: Obtížný test pro dobré odečítání. Nicméně lék vykazoval úspěšnou inhibiční aktivitu.
-29CZ 298406 B6
Tabulka 15 - Výsledky testu na HSV 1 s lékem č 4B
Koncentrace: 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640
plaky 47 toxické toxické toxické 33
plaky 48 28
Průměr: 48 30
IC50>l:320
Poznámky: Příliš toxické při vyšších hladinách. Nicméně inhibiční aktivita byla při 1:320.
Tabulka 16 - Výsledky testu na HSV 2 s lékem č 4B
Koncentrace: 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640
plaky 38 toxické toxické toxické 2* 16
plaky 40 4 20
Průměr: 40 3 IC5O>1:640 18
Poznámky: Toxicita pravděpodobně z důvodu benzalkonium chloridu. Lék vykazoval při ředění 1:320 velmi silnou inhibiční aktivitu.
U in vitro testů v příkladech 21 až 24 se používalo surových látek bez úprav. Přesto však tyto testy prokázaly překvapivě dobrou virovou inhibiční aktivitu a pravděpodobně synergii mezi složkami.
Předcházející in vitro testy, kde byly léky č. 3, 3A a 3B fytochemikálie Echinacea purpurea extrahovány a kombinovány se surfaktantem benzalkonium chloridem, výsledné léčivo prokázalo větší protivirovou aktivitu a nej znamenitěji prokázalo synergii mezi složkami: Echinacea purpurea a benzalkonium chloridem. Toto se pravděpodobně může vysvětlit podílem stability a zlepšené reaktivity mezi dvěma složkami. Benzalkonium chlorid v synergické směsi vykazoval menší stupeň toxicity a synergická kombinace (léčivo) větší stupeň protivirové aktivity, zvláště u HSV-
2.
Testy HIV
Viracea-1 a Viracea-2 byly testovány pro zhodnocení anti-HIV aktivity u modelu akutní infekce. Byly provedeny další testy k určení rozsahu a mechanismu působení dvou látek.
Látky Viracea-1 a Viracea-2 byly používány ve formě roztoků. Formulace zahrnovaly filtrování roztoku a centrifugaci. Vysoká testovaná koncentrace použitá v každém testu se měnila od ředění 1:5 až po 1:100 v médiu tkáňové kultury. Každá látka byla před použitím skladována při teplotě 70 °C.
Pomnožování a kvantifikace buněčných linií a virových kmenů
Buňky, které se používaly při testech k ověřování látek, byly buňky buněčné linie CEM-SS. Tyto buňky jsou vysoce citlivé na infekci HIV, rychle vytvářejí mnohojademé shluky a posléze jsou usmrceny HIV. Tyto buňky se jednoduše uchovávají (2 až 7 x 103 buněk na ml) v médiu tkáňové kultury RPMI 1640 s 10% fetálním hovězím sérem, glutaminem a antibiotiky. Tyto buňky se pasážují dvakrát týdně při ředění 1:20. Číslo pasážování se každý týden zaznamenává a buňky se vyřazují po dvaceti týdnech pasážování a čerstvé CEM-SS buňky se rozehřejí a používají v testech. Kmeny CEM-SS buněk se zamrazí v tekutém dusíku v 1 ml NUNC zkumavkách v 90 %
-30CZ 298406 B6 fetálního telecího séra a 10 % dimethylsulfoxidu (DMSO). Následně po rozmražení po dvou týdnech v kultuře jsou buňky běžně připraveny k použití v testech primárního ověřování. Před nahrazením později pasážované buněčné linie jsou nové CEM-SS buňky testované ověřovacím testem za použití stávajícího kmene infekčního viru a AZT. Pokud se infekčnost viru u nových buněk významně odlišuje nebo pokud se ukáže, že AZT je méně účinné, než se očekávalo, nové buňky se v ověřovacím programu nepoužijí. Mycoplasmatické testování se běžně provádělo na všech buněčných liniích (viz výše).
Jednotlivé várky viru se připravují a titrují na CEM-SS buňkách, uloží se do 5 ml alikvotních zkumavek a zamrazí se při teplotě -135 °C. Nepoužitý virus se po rozmražení vyhazuje, aby se předešlo změnám v infekčním titru. Testy optimalizace prokázaly, že dochází k redukci virového titru o jeden řád při prvním cyklu rozmražení a méně výraznému snižování titru při následujících cyklech zmrazování-rozmrazování. Dávky viru se připravují akutní infekcí 5x 105 CEM-SS buněk pomocí HIV v objemu 200 μΐ při několikanásobné infekci, která zajistí kompletní usmrcení buněk do 7 dnů po infekci (přibližně 0,05 pro izolát IIIB HIV-1 a 0,01 pro izolát RF HIV-1). Infekce se nechá působit po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C a potom se buňky přemístí do nádoby T25 a objem se zvýší na 2 ml. První den po infekci se objem zvýší na 5 ml a druhý den se zvýší na 10 ml. Počátkem čtvrtého dne se buňky peletují, supematant se stáhne a buňky se resuspendují do média tkáňových kultur v čerstvé lOml alikvotní zkumavce. Kompletní denní výměny média, dovolující růst buněk v médiu po delší dobu a umožňují použití očkovací látky k primárním testům s neochuzeným živným médiem při infikování buněk. Barvicí utilizační reakce vyžaduje, aby zůstaly koncentrace glukózy vysoké. V jamkách, ve kterých se při buněčném růstu spotřebovala glukóza nedochází k metabolické konverzi tetrazoliového barviva na formazan.
Supematant bez buněk z akutně infikovaných buněk se sbírá 4., 5., 6. a 7. den. Alikvotní zkumavka supematantu z každého dne se uchovává odděleně za účelem stanovení titru. Mezi stanovení titru patří test na stanovení aktivity reverzní transkriptázy, end-point titrace a test na kvantifikaci infekčních částic (CEM-SS) a kvantifikace kinetiky usmrcování buněk. Bylo zjištěno, že vrcholové hladiny infekčního viru se tvoří v akutně infikovaných kulturách, když se viabilita buněk snižuje na 50% úroveň. Primární vyhledávací test stanovuje kvantitativně ochranný účinek testované látky tak, že se hodnotí její schopnost inhibovat virem HIV způsobený cytopatický efekt. Stanovuje se množství viru potřebného na jednu jamku k usmrcení CEM-SS buněk v šesti dnech, které se běžně spotřebuje, určuje množství viru potřebného na jednu jamku. V primárním vyhledávacím testu XXT se titruje várka z každého dne tak, že se provede dvakrát ředění viru počínaje vysokými koncentracemi 50 μΐ viru na jednu jamku. Ke stanovení přesného množství viru potřebného k usmrcení všech buněk CEM-SS v každé jamce se používá metoda barvení pomocí tetrazoliového barviva a toto minimální množství viru se používá při provádění všech primárních testů. Stejné metody se používají k laboratorní přípravě všech virových izolátů, včetně laboratorně upravených kmenů HIV-1, HIV-2 a STV. Používané klinické izoláty se pasážují na čerstvých lidských buňkách a metody růstu těchto buněk a pomnožování virového fondu je popsán níže.
Mikrotitrační antivirový XTT test
Příprava buněk
V těchto pokusech se používají buňky CEM-SS nebo jiné vypěstované lidské buněčné linie, které byly pasážovány v lahvích T-150. Den před zahájením testu se buňky rozdělily v poměru 1:2, aby se zajistilo, že budou ve fázi exponenciálního růstu v době infekce. V den testu se buňky dvakrát promyjí pomocí tkáňového kultivačního média a resuspendují se v čerstvém tkáňovém kultivačním médiu. Stanoví se počet buněk a jejich životaschopnost pomocí hemacytometru a vyloučením barvivém trypanové modři. Životaschopnost buněk potřebných k testu byla větší než 95 %. Buňky se nechaly shlukovat a resuspendovaly se na 2,5 x 104 buněk najeden ml tkáňového kultivačního média. Buňky v objemu 50 μΐ se přidaly do ploten, které obsahovaly lék.
-31 CZ 298406 B6
Příprava viru
Předtitrovaná alikvotní zkumavka s virem se vyndala z mrazáku (-80 °C) a nechala se v biologicky zabezpečené skříňce pomalu rozmrazovat na teplotu místnosti. Tento virus se resuspendoval a naředil v tkáňovém kultivačním médiu tak, že množství viru přidaného do každé jamky o objemu 50 μΐ je stanovené množství, které zajišťuje kompletní usmrcení buněk do 6 dnů po infekci. Obecně se virový fond produkuje pomocí izolátu IIIB HIV viru tak, že se přidá 5 μΐ viru na jednu jamku. Fond RF viru byl opět až desetkrát silnější, bylo zapotřebí 0,5 až 1 μΐ na jednu jamku. Výpočet TCID50 pomocí end-point titrace v CENM-SS buňkách dokazuje, že mnohočetnost infekce se u těchto testů pohybuje v rozmezí 0,005 až 2,5.
Formát plotny
Formát plotny je standardizovaný a obsahuje kontrolní jamky na buňky (pouze buňky), kontrolní jamky na virus (buňky plus virus), kontrolní jamky na toxicitu léku (buňky plus lék) a stejně tak i experimentální buňky (lék plus buňky plus virus).
Příklady 25 až 48
XTT barvení vyhledávacích ploten
Po 6 denní inkubaci při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5% CO2 byly plotny analyzovány barvením pomocí tetrazoliového barviva XTT. XTT-tetrazolium je metabolizováno mitochondriálními enzymy metabolicky aktivních buněk na rozpustný formazan, který umožňuje rychlé kvantitativní stanovení inhibiee HIV indukovaných buněk usmrcených látkami anti-HIV. 6. den po infekci se plotny vyndaly z inkubátoru a sledovaly se. Používání mikrotitračních ploten s kulatým dnem umožňuje rychlé makroskopické stanovení aktivity dané látky tím, že se hodnotí velikost shlukování. Výsledky makroskopického pozorování byly potvrzeny další mikroskopickou analýzou. Roztok XTT se připravoval do zásoby v koncentraci 1 mg/ml v PBS. Roztok fenazinmethosulfátu (PMS) se připravoval v koncentraci 15 mg/ml v PBS a skladoval se v temnu při teplotě -20 °C, zásoba XTT/PMS se připravovala hned před použitím naředěním PMS v poměru 1:100 v PBS a přidáním roztoku XTT v množství 40 μΐ na 1 ml. Padesát mikrolitrú XTT/PMS se přidalo do každé jamky a plotna se nechala znovu inkubovat po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C. Místo víčka se používaly samolepicí fólie, zalepené plotny se několikrát obrátily, aby se promíchal rozpuštěný formazan a potom se odečítaly spektrofotometrem při vlnové délce 450 nm pomocí čtečky Molecular Devices Vmax. Použitím % CPE redukce, % životaschopnost buněk, IC25,50 & 95 se vypočítaly další parametry.
-32CZ 298406 B6
TABULKA 17
ANTIVIROVÉ VÝSLEDKY IN VITRO
TEST XTT
PRO VIRACEA 1
r^ XO O O* X! O E—< <zx O* Gx ox ** 04 <n xo o vn s 00 xo ’Τ
Γ*Ί O Q r** XO OO Ch Ch
> ·—« Os OO O 00
U> w—» cn «m>
·*· »*W *s
O r^* O o o
Li
km oo un ΟΙ <-r\ xr XO oo
Ή O Ca o 00 »m tzx
*· Ol ol Ol
bl O O •s. ·*·
on O O o O o cT*
o >
oo —H t- ol oo Γ—
o -X r—. oo o o
v co o NI C*4 Ol T— Ol 04 Ol
o C θ'* o* o* O* cT θ'*
Q- né
1Λ
Γ*Ί XO Ol Ch 04 xo
o o O —» Gx o
o. 04 Ol 04 04 ·— O<
ch cT ch o* »*» O θ'*
xo
X 'sr σχ 04 Γ— O sr
o o o- t— O0 OO co XO
o” H *· xr ’ςΓ ^r ··»
r—< *-'
ΓΧΟ \o \O XO tT Ol
X xo IZX o o
o ΤΓ C<L ol G\ wx
o H r—» ,,1% ·% *> ch ch
sn QO cn Ol o 00
1—' O o- GX Γ— r— xo sr
*—· cj· c Ol Ol ro f—· GX WX
c o o* ch o ch
φ o Ch
CO £ o oo XO O —« oo Ol
ΙΛ o* Ch CO Ol 00
tj co o r o o* «>· co o* XO) ch
N i c
O (Λ
CL □ Ό C4 DO o \C
> Ch OX c*x -ÍT Ch
xO —— ΟΊ -- o
Q. % ·> ·*
ch o o O o o
o ω > xo Ch ΓΛ 04
XO \D Ό Ol Ch hxj
f— C4 — OJ
·* o o s. ox ox
C^· X 00 Ch Ol Γ*Ί □0 rx| sC
Ό g. ) .· CD o ι/Ί
*· H *% ___>» *· C-4 O ** Ό ··
O
Kolorimetrické pozadí - nízké koncentrace Kolorimetrické pozadí - vysoké koncentrace ,
0.289 0,182 0 168 0 171 0,166 0,167 0,163 0,173 0,172 0,166 0,164 0,180
-33 CZ 298406 B6 _i O m ž s>
tn
s? O\ o f—*
oó o o Ό
o F· I
•ΖΊ —* r—« CM
O v> CM r-
tn \o Ό 'tí «·
CM »—< σχ
Lék Viracea 1 TC IC Antivirový index
QO CM TT
rM wn «ΖΧ
\O O CM
»*
O O
a> ntrola cu e Έ o
O O <ϋ
e c
Φ <c >Q
0> > >φ Ό
co o C N
<D kí 3 O
> m tt
-34CZ 298406 B6
>» o c Ό o T
w o _> >N
XD E •5 a.
w c o
KD c
XI
CJ ó oo cn u-. o — cn r- O O — — O O O O O O O o* o^o^cNo* o% £ O O O O O CA o o o o o o cn ’Τ 'šT oo -— m ·—< (N cn Ol Ol O m m rn cn m rn x 'x <% x X X
MD u-i o r- o rO O — O CN CN o o o o o — ο'ο'Ό''·θ' θ'· ov
A? A® X? v°N
0A p' O' QA p\Q>
o σ\ σ\ oi<n
O O CO r- ΌfS
TABULKA 19
VIRACEA 1
-o x© ,.o xss sO ©S θ'· ©N ©N CX‘ ©N
o o o o o o
o o —— υη m o
cn o
o o O O o o
NO sO NO SC.o oK O' Ox O' □'θ'*
O *4 rn ^4co
Ό O- ‘ΖΪ—
CN cn ττ »/n cn oo lt> o o o Ol o o oo σ\ ό oi o* o^c^c^o* θ'
n ; »
O — cn Ol O O O —m
O O O O O<-*
O O O O OO
·._-· ·ΖΖ> <_✓CZ>
Ol rn oi
O — cn oi θ'* O*OX- cn* —
KD
T5 ω co c v>
i
-35CZ 298406 B6
TABULKA 20
ANTIVIROVÉ VÝSLEDKY IN VITRO
TEST XTT
PRO VIRACEA 2
OO \o o Tox 1 m o ua ΓΟΟ 23 O o UA X \D O UA 1,501 CA O UA 8 o. Ό
CQ
O- o \o UA cn CM Ό CN G CN
Ό > O 'xT ua CN 00 00 Φ UA
O ϋ u UA xr ΤΓ r—< r—» »—» o r—
o x. -x -x o* cT* cA c 9 O*
Jc
O
st •^r CN oo 04 Γ- N
O l_ o r- Ol O CM
O T· 04 CM CM CM CM e
O* Φ o* ox cA o* cA o“ »
o
c TJ o
_ o co
XJ JMť N
cQ r- Φ 04 CM CN o UA Xf O \O
Ml AO Ol o O- CN CN O Q. o
o1 o κΝ c CM rM «—· f-m r~* CM *Φ —.
Q. Φ o* cA θ’ c> •x O cA o cN
> Ό G
o c Φ
w 04 ¢/) r^· O r- Γ- E \O
Γ- O' O CM o rn o ΊΖ o
0. O o OJ 04 CM CM 04 C4 O «—
cA 0. ox o gA o o% o o”
xr X ď ua m UA UA
0- o O O oo CN O Gx Ό
o H UA xr UA MM
X» s» x »x -x s
o o
o r- O CA r- 04 UA
Γ- X TJ* m UA T Ό
.—· o T m o> 04 CM
s X X. __“X s.
o r-1 o O o O O
L_
o o C Φ O o 0- CN \D CA OO O CM oo ^r O CA Ol Φ o E CA O
o* e o ox ox *·* G · θ'*
oj
o
75 o Γ'* ,_____, CN, c υϊ
Cm a> Ό o UA o O O \c r*A sQ
—— co 04 04 Γ- 04 r— 04 Φ —»
CD cA —,·> gA ox oA θ'·
£ -Φ
TJ c co __, Ό CN o oo £
CD Ό □ — CN Ό rn UA
N mm T r«* CM ·— 04 MM
O Q_ o CL θ'* _N o-''' —> ox Ό CG N o·
a
xO — r <r. Ό o r<- *φ s Cl
Ol C'· ’<Γ UA CN· 04 ι·-
Vf' r'·. <n fxi ·—· CM -..
cA í_> —?* _ S. c> o% ^?x S
E
θ'- X <X: C<i O o CN 00 <c CM šf o :/ |
rt r·· 0' ΓΜ — Ol o A
θ'* F— _ x o**
-36CZ 298406 B6 gs _J o Σ) < m a: ?>
95% 1:100
O
O .25
o o
m o Ol
OJ yT θ' O O?1
X
CM Φ Ό
CS C
Φ
o
CS >
u. > 2
-Φ o u > c
—1 H <
r, Ol
Ό -o Ol
CN Ol
.·-> >
to
O
j CD
e
O o
f Φ 4s .x
enci kon 'CS c >0
CD -CS >P *O
<C > E
φ P 3 o
> <D tr
-37CZ 298406 B6
TABULKA 22
VIRACEA 2
Kolorimetrická kontrola 0z004 -006 o — —. o o o o o o O o o ox O oi O sr> Γ- cn O rS O r5 O CN O o => Q. o o o .'ó' 6oKox
x: o° Ss 4? 4? 4° o? 4° 4? 4?
o O o o o o o O ČM un O o
CD o o o o o o O o \O
X o
o > >φ
o >N C
§ <= 5 o*· -Q
=
w
Φ
>t ♦r# O L. >ω
e E <—l -< ní Ό M- cm r- r- O
Ό .3 l''. m cn CM cn cn cn o o o
O t— m cn cn m m cn m ·”* o o o
T £L O '>r—Γ*—?* v —Λ > .s
τ> 4? k o ©· Q * θ'· os £ N? 'v .O χθ cO
φ «·>* o x: > lil Φ u O O O O O o cn O O O
*Φ > o Ό 2
> >
c
CD
Hodnoty Půměr ! O D. το o 0,002 o Ό 1—0 0 o ° O r O O 0 005 o oc O \O o cn o θ' o vr o% 0.002 m m vo o. O Λ <'
E
i CM
S^z cn
O ř— m ΓΜ
ó O O O ,—/-z. Ol
CM c o o O O O — rn Ol
CD Φ o o o o O o o o — cn rs) o <•^2
_ > c? οο'ο· o ο'οχ
O
CD
>
Ať >»
'Φ —1 (Λ £2 C C LU X O ca L·· z“> » I.J •.u -u rO
U
CD Ό N V) >
CD >02 z >
>φ <0 KU CD C
Ό CD c F
Na podkl sloupců 7 až 12 (pravá stí desky) =O‘g CD O Z ω CD >N CD CD Φ Φ
-38CZ 298406 B6
Příklady 49 až 54
Test na stanovení aktivity reverzní transkriptázy
Byla použita mikrotitrační reakce reverzní transkriptázy. Tritiem značený thymidin trifosfát (NEN) (TTP) byl resuspendován v destilované H2O při 5 Ci/ml. Póly rA a oligo dT byly připraveny do zásoby ve formě roztoků a skladovaly se při teplotě -20 °C. Reakční RT pufr se připravoval denně čerstvý a obsahoval 125 μΐ 1M EGTA, 125 μΐ dH2O, 125 μΐ Triton X-100, 10 50 μΐ 1M Tris (pH 7,4), 50 μΐ 1M DTT a 40 μΐ 1M MgCl2. Tyto tři roztoky se smíchaly dohromady v poměru 1 díl TTP, 2,5 dílů póly rA: oligo dT, 2,5 dílů reakčního pufiru a 4 díly destilované vody. Deset mikrolitrů této reakční směsi se dalo na kruhové dno mikrotitrační plotny, přidalo se 15 μΐ supematantu obsahujícího virus a obojí se smíchalo. Plotna se nechala inkubovat při teplotě 37 °C po dobu 60 minut. Po reakci se celý objem nakapal na filtrační papír, 6-krát se promyl 15 po dobu 5 minut v 5% sodno fosfátového pufru a 2-krát po dobu 1 minuty v destilované vodě, 2krát po dobu 1 minuty v 70% ethanolu a potom se nechal usušit. Potom se filtrační papír vložil do plastikového sáčku. Přidala se scintilační tekutina a sáček se teplem zavařil. Zachycená radioaktivita se měřila kvantitativně za pomoci scintilačního počítače Wallac Microbeta.
-39CZ 298406 B6
1:10 1742 cn tn CN 7551 7269 to tn CM
:32 tn tn O ♦—4
r-< xT σχ Xt tn CM CM O- o CM
Ol xt tn
O o 2715 7587 10896 10399 Ό vN cn
o CM Γ- 00 CM CN
Ol XT t- cn tn
m o \O 00 OO XO
o Ό oo |—« o-
04 Ol CM
O o tn oo CM CN
CM CN m »n
Qí O OO o xo N*
y: 00 tn XT CM
co 1—4 m Ol cn cn -4
z
ž H O o CN Γ\O σχ tn tn xt O cn
N σχ r- cn OO
o Ν’ cn CN cn
Qí m cn xr m T—«
lil
**>
UJ
0Í o
< 1- o xO o σχ oo σχ
o CM oo cn xO
o“ VX o 00 o tn
> CM Ol ·—4 tn Ol
XT m m cn r—<
f— —>
y;
< o
o oo r- Ol cn 00
o cn tn oo tn
1:32, 00 O*· o- xf xt
ΜΊ tn XT tn CM
m cn m cn
O
o o_ O cn Ox 00 34 00 m xr
o cn cn CN oC
o ·— tn xr cn r—·
·-* cn cn cn m i“4
r—
cn o- o- oo
m oc CM ,----1
tn <n XT O
t—· 00 xT CM 00 o
CN CM cn CM
CM cn M
ií Λί
ó (D E E E Q
c o o © O >
o IM N tj N
> > > > 5?
O 5 O al
< < H UJ
1:10 cn cn o oo vn o r-> 00 CM >» cn ro x xr mx <n
CM O to 00 CN
cn 00 <—4 CN to o- xr OO r_>
c> cN cN o
o o xr XO to ox to xr m o- m O* xr oó
r- cN o ox o m
O 04 cn to ox XO p.
\O o 1 XO X
σχ o CN CN
_·*· «4,
o O O
O O tn CM tn σχ Γxr CM CN
OO >s 00 σχ x xo
ř o σχ
X
o o tn CN
H o cn oo CM —<
Č o CM cn Ό Ol cl cn O cN σχ o o? xrx o
z
Q
O O
z O O* cn cn (_________
cn O tn cn xo
O ·—« Ol o
T7 CN* oř* c·? CN**
f—4
O
o <D O CN o cn
O XO Ό r-
CM CM f—1 r—. o
cn rT* CM* oř*
*“*
o
o
o b, xr xO CN —
o o O cn cn CM oř* o- CM* CN Zr cn o
σχ o o- CN o
CM CM Γ- ox
o ·—· oo θ
CM CM ΓΝ
v CM co M- j
Konc. 2 o £ E o N > E O NI > Φ O s cA
TABULKA 25
VIRACEA-2: PBMC/ROJO
o oo C*Y oo vy un OO VY CN OS
1:32 96 103 77 92 cn θ'
O o 463 265 309 xO Ν' cn CN
o cn XO 00 CN o\ σχ
m m r- Γ Ν’ σχ m 'št m Ox CNX cn
5 O r- o vy
00 *r\ CN CN r—
Q. CN vy 00 CN vn
TRANSKRI CN O CN i/n CN XO
o o CN O 00 o 74 r- O 'S
cn CN xr 1-^ CN cn
z -—· cn cn σχ o
2 UJ cn m CN CN
>
UJ o
o O m r··* c- OY
O I □0 O rn r-
< o oo r— \O o
i_r •ςΓ cn co XO o
rn CN CN CN «—
> 1—·
1 ¥
< o
o OO O CO Vi XO
o oo CN CN ^r
1:32, ·“-> 00 —. Ch
•%o m rn i o
m cn CN rn
O
o Ν' o Ν’ CN
cn vj ·— O co
o r— vx — OO ·χ
o —- Γ- 'ŇC r- o.
—- cn CN CN CN
O\ C- Γ- CO
o m 00 CN ·—<
— un VY o
— oo CN oc o
CN CN cn r-4
x— CN co
Konc E o £ Vzore E o £ E o £ u > x° o s
o XO ox CN \D O** m cn \O O* Ν' CN XO o O s. m
------------------------------------------------------------------------1 :32 oy CN Nt Ν' cn xt cn CO Ν' CN cn NT VY X CN
o θ' θ' o*1
xo O\ OY cn
o N“ CN VY o
un un τΓ un vT
— o o* θ' o- CN
:320 o \D r- CN Γ- 00 o <\
00 o 00 cn
O* o θ' o Ν'
O o Ox cn VY
VY oo rN vn VY
n. N CN m >
É XO
o
X o
o VY CN οχ CN
1- CN cn Ν’ O Ν’ rn CN
>- cn OX *«* XO. XQ ·*«. •X
í- 1—. r— 1—* 00
o
z_
D
O o
X o 00 CN o O
co CN CN r—· 1----<
o N* XO r- xo (->
•w *·
—* —’ oo
I—“
o
o o_ O 00 cn o
n- O CY CN
CN VY n· N
cn *·
Γ
O
O
O r-> m —- CN
Ν’ Q_j XO
νγ VY m Ν’ m
Λ r*
Gh o Ox OX o
Ό CN CN r- o
O 00 o O
! CN CN (N
CN co N-
_ Konc. E o S Jí fl> ιΟ > E o s E o N > u > 'ξ O '
-41 CZ 298406 B6
ELISA
Soupravy ELISA byly zakoupeny od firmy Coulter. Test se provádí podle návodu od výrobce. Před testem ELISA se rutinně prováděly testy na stanovení aktivity reverzní transkriptázy a hodnoty byly použity pro zachycenou radioaktivitu v testu na stanovení aktivity RT pro určení ředění vzorků potřebné pro ELISA. Při každém testu byly vytvořeny kontrolní křivky, aby bylo přesně kvantitativně stanoveno množství kapsidového proteinu v každém vzorku. Údaje se získávaly spektrofotometrickou analýzou při 450 nm za použití čtečky ploten Molecular Devices Vmax. Počítala se koncentrace p24 z hodnot optické denzity za použití balíku programů firmy Molecular Devices Soft Max.
Infekční částice
Infekční virové částice se stanovovaly kvantitativně za použití testu CEM-SS plaků a testu kvantitativní infektivity pro HIV-1 a HIV-2. Mikrotitrační plotny s 96 jamkami s plochými dny se potahovaly pomocí 50 μΐ poly-L-lysinu v 50 pg/ml po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Jamky se potom propláchly pomocí PBS a 2,5 x 105 CEM-SS buněk se dalo do jedné mikrotitrační jamky, které se přichytily na dno plotny. Přidal se dostatek buněk, aby se v každé jamce vytvořila jednoduchá vrstva buněk CEM-SS. Do každé jamky XTT fáze se přidal supematant obsahující virus, včetně virových a buněčných kontrol a včetně každého sériového ředění testované látky.
dny po infekci byl stanovován počet shluků kvantitativně na plochém dnu 96-jamkové plotny pomocí inverzního mikroskopu Olympus CK2. Každé syncytium vzniklo z jednoho infekčního HIV virionu.
Anti-HIV aktivita u čerstvých lidských buněk: Test na čerstvých lidských T-lymfocytech
Čerstvé lidské lymfocyty periferní krve (PBL) byly izolovány od dárců Červeného kříže, seronegativních na HIV a HBV. Leukoforezovaná krev byla naředěna 1:1 fosfátem pufrovaným íyziologickým roztokem (dle Dulbecca) (PBS) a převrstvena přes 14 ml Ficoll-Hypaque hustotního gradientu v 50 ml centrifugační zkumavce. Zkumavky byly centrifugovány po dobu 30 minut při 600 G. Shluky PBL se opatrně odsály z výsledného rozhraní a následně se 2-krát promyly pomocí PBS centrifugací při nízkých otáčkách. Po posledním promytí se buňky spočítaly vyloučením pomocí trypanové modři a resuspendovaly v 1 x 107/ml v RPMI 1640 s 15% fetálním hovězím sérem (FBS), 2 mM L-glutaminu, 4 pg/ml PHA-P a nechaly se inkubovat po dobu 48 až 72 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci se PBL nechaly centrifugovat a znovu se nasadily do RPMI 1640 s 15% fetálním hovězím sérem (FBS), 2 mM L-glutaminu, 100IU/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10 pg/ml gentamycinu a 20 IU/ml rekombinantního lidského IL-2. PBS se přechovávaly v tomto médiu až do použití v koncentraci 1 až 2 x 106/ml, médium se dvakrát týdně vyměňovalo.
Pro test PBL se získaly buňky stimulované pomocí PHA-P alespoň od dvou normálních dárců, umístily se do čerstvého média v koncentraci 2 x 106/ml, daly se do jamek 96-jamkové mikrotitrační desky s kruhovými dny v množství 50 μΙ/jamku. Ředění testovaných léků se připravovala ve 2 násobné koncentraci v mikrotitračních zkumavkách a 100 μΐ každé koncentrace se nalilo do příslušných jamek standardního formátu. Do každé testovací jamky se dalo 50 μΐ předem určeného ředění virového kmene. Jako virové kontroly se použily jamky s buňkami a samotným virem. Jednotlivé desky se připravily identicky bez viru pro sledování toxicity léku za použití testovacího systému XTT.
Při standardním PBL testu (MOI: 0,2) test končí 7. den po sesbírání vzorku supematantu bez buněk pro testy na stanovení aktivity reverzní transkriptázy. Při nízkém MO PBL testu (MOI: 0,02) se sbíraly vzorky supematantu 6., 11. a 14. den po infekci a testovaly se aktivitu RI. Tritiem značený thymidin trifosfát (NEN) (TTP) byl resuspendován v destilované H2O při
Ci/ml. Póly rA a oligo dT byly připraveny do zásoby ve formě roztoků a skladovaly se při
-42CZ 298406 B6 teplotě -20 °C. Reakční RT pufr se připravoval denně čerstvý a obsahoval 125 μΐ 1M EGTA, 125 μΐ dH2O, 110 μΐ 10% SDS, 50 μΐ 1M Tris (pH 7,4), 50 μΐ 1M DTT a 40 μΐ 1M MgCl2. Tyto tři roztoky se smíchaly dohromady v poměru 2 díly TTP, 1 díl póly rA:oligo dT, 1 díl reakčního pufru. Deset mikrolitrů této reakční směsi se dalo na kruhové dno mikrotitrační plotny, přidalo se 15 μΐ supernatantu obsahujícího virus a obojí se smíchalo. Plotna se nechala inkubovat při teplotě 37 °C po dobu 60 minut ve vodní lázni s pevnou oporou, aby se předešlo potopení plotny. Po reakci se celý objem nakapal na filtrační papír DE81, 5-krát se promyl po dobu 5 minut v 5% snadno fosfátovém pufru a 2-krát po dobu 1 minuty v destilované vodě, 2-krát po dobu 1 minuty v 70% ethanolu a potom se nechal usušit. Do každého vzorku se přidal Opti-Fluor O a zachycená radioaktivita se měřila kvantitativně za pomoci scintilačního čítače pro tekutiny 1450 Microbetaplus.
Zachycení tritiem značeného thymidinu se měřilo v paralelních kulturách 7. den. Každá jamka byla iniciována dávkou 1 pCi tritiovaného thymidinu a buňky se sbíraly o 18 hodin později pomocí sběrače buněk Skarton na filtrační papír ze skleněných vláken. Filtry se usušily, umístily se do scintilační nádobky s 1 ml scintilačního koktejlu a zachycená aktivita se měřila kvantitativně na scintilačním čítači pro tekutiny Packard Tri-Carbh 1900 TR.
Příklady 55 až 78
Anti HIV aktivita u čerstvých lidských buněk: Test na čerstvých lidských monocytámích makrofázích
K izolaci přilnutých buněk se resuspendovalo 3 x 106 periferních krvinek nestimulovaných pomocí PHA v Hanksově pufrovaném fyziologickém roztoku s 10% lidským AB sérem doplňujícím vápník a hořčík. Buňky se ponechaly ve 24-jamkové mikrotitrační plotně po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Nepřilnuté buňky se odstranily důkladným šestinásobným promýváním. Přilnuté buňky se kultivovaly po dobu 7 dnů v tkáňovém kultivačním médiu RPMI 1640 s 15% fetálním hovězím sérem. Kultury se po dobu inkubace pozorně monitorovaly na splývání buněk. Provedla se nákaza buněk pomocí monocytotropických kmenů HIV-1 BaL nebo ADA, a to přizpůsobenými dvojicemi virových izolátů AZT-senzitivními a AZT-rezistentními. Každý z těchto virových izolátů byl získán z NLAID AIDS Research and Reference Reagent Program. Vysoce titrové dávky každého z těchto virů se sbíraly z infikovaných kultur přilnutých periferních krvinek a zamrazily se v 1,0 ml alikvotních zkumavkách při teplotě -80 °C. Monocyto-makrofágové monovrstvy se nechaly infikovat 0,1 MOI. Látky sledované v monovrstvách se nechaly infikovat 0,1 MOL Látky sledované v monocytomakrofágovém testu se přidaly k monovrstvám krátce před infekcí aby se maximalizovala schopnost těchto určitých aktivních látek.
Dva dny po infekci se médium slilo a kultury se dvakrát promyly pomocí kompletního média, aby se odstranil přebytečný virus. Přidalo se samotné čerstvé médium nebo médium obsahující příslušnou koncentraci léků a dále pokračovala inkubace po dobu dalších 5 dnů. 7. den po infekci byly provedeny testy pomocí XTT-tetrazolia nebo test pomocí trypanové modři na stanovení životaschopnosti buněk a testy HIV p24 ELISA na stanovení tvorby p24 dřeňového antigenu. Soupravy ELISA byly zakoupeny od firmy Coulter. U každého testu byly vytvořeny kontrolní křivky, aby bylo přesně kvantitativně stanoveno množství kapsidového proteinu v každém vzorku. Údaje se získávaly spektrofotometrickou analýzou při 450 nm za použití čtečky ploten Molecular Devices Vmax. Počítala se koncentrace p24 z hodnot optické denzity za použití balíku programů firmy Molecular Devices Soft Max.
-43 CZ 298406 B6
TABULKA 27
TEST MAKROFÁGÚ NA VIRACEA 1 pg/ml Aktivita P-24
o\ oo* r- o Γ*Ί o CN V} V) CM* WD kD 1106,0 o UD* MS CM O v G\ r—4 1287,0 o CM*
s < 8 < U| to ir > o ·»» vo τφ cn r-^* oo CN •w Ό CM •^r X CO CN O V Vi O O oo* CN o O c^* MS O O V r- o v? cn O
θ'* CM xT O v CN r-“* OO o CN* CM O **» 00 v o O v? 00 o CC* o o cn v O r-·—<
Ředění o o CM CD Ό ΓCN «“< UD O co MS rD un CN CM O co CN CM CM m CD CN 1:291038 1:909494
m ro v CN CN •s. un CD Γ O c-'* CM r- V. O r- •x Vi O o r·· r-* CM O C*D *s» CM o O Γ' 00* r\O O Vt CN
AZT kontrola vs. ADA ro CM ·*· \r CN o* CM CN OO** CM rM- G<* C-' o MS CN* rCM o CN o** \o MS o o ·*» o v O O v. cM •ΖΊ CM
XT CN O* CM O O MS CN CM CN CO** CM ΓΟΟ cn o σ> 4· O co <□* rxr o o σ> CN O O */*>* O o
o e i CO O O* C*D O** C4 3 o- fC O O o o o* S O c> -'T o o o o*
-44CZ 298406 B6
TABULKA 28
TEST MAKROFÁGÚ NA VIRACEA 2 pg/ml Aktivita P-24
Ch XT TF* CO CN O rjxr cr? cn Ch roo o 00 o* 00 o oo c> ΜΊ TF o οχ ·*· xn co M“ o Ol X co OX o 00 o Ol 00
oj < WD to <o o o o o o
Q οχ Ol Ol xp to oo Ch XO
< Ol* cn <-> vo θ' ** co Ch o*
U, Ol r—· o- ^F Ch -4- Ch
czj Ό ol ‘ΖΊ Ch r-
> >
Ox WD o XT cx o O o o
r—< OJ t'· \O r- XO XO f— oo
·*»
OJ ΤΓ1 m oo 00^ ΙΖΊ oo NF
1— XO NT Τ' o xF
Ol co XO 00
OO ’φ
c OJ ol co Ch
>0) NO o co O
Ό o OJ XO »o co 00 >— r—« Ch
Q) o C o Χ/Ί Ch CO o. o
>oc — cn Os co ox OJ Ch CH Ch
*-* »—
Ό Ό tT co o O O o
’Τ r—* co Ό XO o Ol ·—*
vÝ* <T oT* XO* xď“ Ch co* 00 Ox
7—< Ol XO Ch —-t Ch oo
co OX
CD
O
c o < Q t/X vn o o o o o o o θ'
vc ·» xr % o XO ”3- θ' X. CH 00
OO XO o co Ol oo r—' o
czj 7—< r— r-~ XO Ch 05
2 > 00 XO
<zx o o 'Φ Ch o o o o
OJ XO r- 00 oo Ch Ox o
oo ·*► »% *s
□x m m OJ k/Y Tfr Γ'
r—< uo oo O <— OJ Ch
Ox 00 o
·“·
xr
— O ·— Ol ro NT 7— o
O 00 — ΓΟ xr ,—· o o o
E Ol ^4- r—· o o. o o
'tr O** %» O o o* o “·» o θ'
-45 CZ 298406 B6
TABULKA 29
TEST MAKROFÁGU NA VIRACEA 1 pg/ml Aktivita P-24
CN 00 o CN* cn CN <N CN CN ·*ψ m o CN V_ \o CN 00 vn oo m cn Ν’ CN* CN Ό CN* vn rCN CN*
5Í H rd H· Q Λ i- tn > XT vn r- o un oo ΓO o cn* o Γ· run o e? rn run X. 00 rCN x> CN i/n -s. 00 CN CN*
Ό cn CN on m co CN m o (Ν' o N o CN* O wn CN* m ro CN 0Ί CN CN ri* cn <=k CN VI O xr^ CN*
Ředěni O O CN cn χο r^ CN m o cn o <n <r» CN <N O 00 CN CN (N cn rn CN CO cn O CN cn xr G\ Xf CN O CN
Π5 o u -*-» o H H - X Η* vi CN <N O cn* rCN O cn* xt Ν’ CN* O ťc CN cn cn CN* O KO «t CN CN CN* xF 00 00 Ό Ό CN*
o in CN o CN* O o CN* m CN CN CN*“ un r- CN** XF O CN CN* wn CN rn c? CN O CN* CN OO m CN*
V'šT Os xr CN v. <N ir, O CN «*· CN Γ-. \o O CN* Γ un m *w CN \0 o c^i* CN rcn CN* OO MN un X CN rcn O CN*
o e i OO CN »· O XC o** 5* CN Ν’ o m O o xř o o o* XT O o o* xF O O o*
-46CZ 298406 B6
o OO CM m O\ m Ό en co CO VT o 'N. rGX ·» o ’φ TF^ 1,411 en ΓΓη *>
-11; < 5 9 o U- <ZJ ’ΤΓ CM vr on en 0Q CM en o en rn CN XT *^F TF IC, *o oi m \o >x.
p CM 00 O ·*· en Γ- CM 00 en o *TF ^r en ·*» CM o CM O\ \O 'v CM CO
Ředění O o CM en X0 ΓCN kT) o en XO m kC, Gs CM O CO CN Ol CM en fO & oo re O CN CM Φ CN Ck o CN
AZT kontrola vs. ADA F CM OO Ch θ'” CM CM »Z) en xt O O CM Γ •s. en kD m xF m O <n ΓΊ »* CM •Φ en
00 O* oo rn oo un ΓΜ •Xfc r~ 'ď* m vn CM r- »> O CM kTi CM O m 00 o
o TF f—* CM G> Ό <> <r> O kC) o. CM ^r m <Z) r—' CO oo ·*. oo o k/3 *··. \O oc ΓΊ un •φ
O E xr 00 CM ·**. o o m »*w O Ol o* CCi o* •φ O O O* Tt O O O* xr o o o o
-47CZ 298406 B6
TABULKA 31
ΑΝΤΙ-HIV TEST MAKROFÁGÚ (P24)
Pro VIRACEA # 2 až 4
1:100 o ox xo* xO M* xo*· o MC cm* ox wa 00* r- OO
CM οχ co Γ-
r—* o T—· ”>· CC
en CM r-__ θ' ox GX r-A
xo r- CM 00
00 o” oF xo Ox
Ch en ox O r- CM*
CM T—<
|NM
WC xt «—1 CC
O en cn o> •O* rn <5* o
04 CM
XO <jx CM o
cc VA Ox o^ OO rT o
<M 00 (M cc
m <M CC CC cm
r—«
E
δ
CM
CM 0- O 00 σχ (M wa S* wa WA *. CM r> o r- oo CM cc
’Τ m wn xT
<0 Xť > s r-R
< 04
CC xr CM σχ WA
cn 't* <M* cm* xo CM
σχ m oo ’Φ 00 o
— Ό ( xo xo wn
oo
cn _« 00 Ox xo r_
.* ·** ·*
Ώ- m xn
Qs CM Ox θ' o va
<N un o 00 xo
ΤΓ OX o
xr r- ř—« o xó cc
οχ ’Τ wa o Ό WA oo
o en r—* o F—
οχ **· t“·
r-*
oo 00 00 OO
xo XO* xo'” •R XO o
O \o XO XO xo o
CC CC CC CC o
r—*
CM co
k— ££ L-
c <D Φ KD
>φ Ό O u. O £ E u
Φ N > O •2 0. A%
O cc cc xn xr CM
o OX xo M en
r-M cc CM en en
cn* cc re en
CM r—·« cc 'ίο- CM OX CM en
CC o DO o CM
·* “ σχ
♦—· cc cc] CM en
xo m CM XO
Γ cc re en xo
o\ oo αχ Os o
en* w CM <M* ·· CM ox
WC o- oo xn en oo
o CM o en Ol
cc Ox r- o
f — CM cc s> CM cn* Ox
xo F 00 OO oo r-
m xn CM wa M ··.
uc xo 00 WA en __
σχ «a o
CC cn CM en ·—·
CM
o rn un 00 WA f—4
oo OX oo o Ox *»
ox \O xo co en en
CM S*
re re <M en t—·
F~J
CM
CC r- 04 Ό M-
cc Ch 00 'Φ OX o _ **
r* «·» wn •*-1 WA *· en CO o
cc cc CM en
oo
cc xo 04 00 o· xn
o Φ xo xo XO «* Ό *· en xo cA
CM cc re en en
TF
σχ M· σχ o αχ WA oo ec 3,005 o<r> ^r ren M* en 'Jř Tt·' o
—
cc en en m O
ox Ox σχ Ox o-
o CM oi CM CM
re m en en
CM co
l Λί. £ -* £ 2 >Φ E %CC
Έ O N O •2
tí. > > > 0-
-48CZ 298406 B6
TABULKA 33 v ΑΝΤΙ-HIV TEST MAKROFÁGU (P24) Pro VIRACEA # 2 až 5
1:100 MO CN s» ro 00 04 X Ό 04 rWO** O C4* 0.9 1
04 00 04 -x OX Γ- co r- xO <~4* co WO
CO XO oo 04 rT*
co
1:976 00 *x VN XO 04 ox Χίο xr XO* Ch xT o-1*
uo ro Ch 04 OO 'ŇT *x co
O co XD* Ch 04* O 04 04 co* r-
04
XO co w~>
co UO Ox v— Γr4 co’ OX ro *x \o Ch CO ’Τ vo ro ro r-'* 04
04
o Ch. oo n-
oo Ch Ol trT* t/O Ó* 00 r- s* co oc X» o- trt
04
ro CO o VO 04^ ^r ’νγ —
Ch 0Q O 00 oo
co 00 xo
00
co o ch XO 04 '/O oo
—» co od XO -τ'
Ch CN LO) 04 l>
04 o- 00 CN
ot
Ch. Γ-
o o ’Τ o*
Ch. WO »/x to OO
o CO ro ’Τ ro
CN ’— ·— — ·—·
—
04 04 CN, 04
x X. o
00 OO OO 00
o Ch Ch OX σχ o
Ol r4 04 04 o
04 CO
* — JZ u.
c 0) Φ Φ XD
KD “O ιΟ u. O o E u
CD n N ΰ •r?
>0í > > > ——· 0.
1:100 2,974 Ch O Ch oP l/o co co* 00 ro co 1 98.0 i______—i______
C4 co 04 T
O- co vo M0 o-
co *x o
ro co co CO
Ό co σχ ^r
r- *** rH 04 LiO ro*
ch co CO OO r—<
•x X»
co co 04 CO
T co 04 XO OQ
o co ro co Ό
CO —*· CO cn Ch
ro'’ 04** CN* řT* Ch
<D •xO C4 O· r— 04 tr>
O co xo ir, uo W0*
C tn co. ro O co
tu Ch «X *K •v O
jQ co co co ro r-H
O CD X3
<
t 04 O xr ro Γ- OO
r-* oo ro ro Ch co 1—X
X c? xO \r, 04 vr T—<
>> 04 co ro co rÝ
o
o
**
co C4
o ro r- co un Γ-
c ro o xO O xO vf- Ch O
Ό 0 »/r *»* WY *. 04 •w ^r ·>»
T — CO co CO co
00
ro O CN oc ι/Ί WO
xo »JO *x Ch 04 *x O OJ S. ΓΓΟ O
04 CO CO CO co
O 'T Ch o un ^r CO* GC O •x C4 00 04 04 Ch θΓ O
cn ro
o cn Ch /-k O
co ro CO ro
—- — — o
x Q
co CO rO
CN
c >0 Φ 2 <o E l_ XD E U
σ o o *D
>[ť N > $ o N > £L Q χ° o—
-49CZ 298406 B6
V
CM
D_
1:100 οχ od* Γ-* o XO ^r o rr oo* r- rxó* OOUl σχ co o CM Nfr 1/Ί r. xo cn οχ X to CM OX ΓNT*' oo
cm o ·** m NT m CM c» r- CM cr O ur V3 cn CM Γ- cr
cr ΓΟΟ kZX W, CM o cr o\ *·· 00 •s oo OO >» CM 00
xo Οχ V) 00 XO CM r- Οχ cn
r- o XO* CM v> O Γ Ch o co «—< xo
Ch οχ vr O xt- NT rr ox ox v o CM* o «V CM O CM^ co oo
vx *rx •3- o. Ch 1/0 v, cr o O xř oo CM* oo
O cr cm*- 4/n xO od*1 o\ ·*» oo o* CM lq 2 O cr o OX Γ- ·<»> o CM* 00 co
Φ
kO O o \T) o O XO Γ— XO cr
Γ0 xd* LQ* CM CM JQ u_ O rr XT) »/0 V) CM cr
V, O O νχ o tc Γ-- xO to co , <r < ví GX ťr o CM* <Ν* <m cr* Ox
V) <
E CM O o O Γ- CM
ν’ UJ _j o Γ
1 O 00 CA CM XO* xO CM oo o o cd*· \Γ> o o* Nt *T l-> O· r~ X >» O oo O\ CM XO VX 00 cr r- V0 m ro vx cr oo * XO o* oo
CM “* , . co a: o * · CM
Q. < > X tn
Γ
C0
CM O o o o CM
cr xó Γ> V7** θ'? — c cr rr 00 in CM CM
GX xo 00 NT CO O σ cr Γ· CM t—< t-K
C*·' O — o — — O X CA rt ΓΜ** οχ cM CM* CM CM** Ox
oo O o o o co
o o CM Γ'** oo CM ^r* VX Γ· cr* 0Γ o od CM O oo r> 00 O Cx CM CA \O CM* οχ vx vx ** O m O CM CM CM CA ur nP co
•— »—
T CA c- O o ‘O rf CA •ZX oc Vi cr oo
NT Ol <r> CQ Γ' I'-' σ' o Ch
o cr CA CM ·— rr CM o
o Ox r^· O O ΓΓ CA S CA ·% CM c-r cm CM* o
o O o O v. */··) m
*%· *· s. V,
r—· —- »—— (-· r- r- Γ-
O r- r- o r- C_? O CM CM CM CM o
—· — — CM* cJ* ΓΜ* CM* o
CM <T u. T— CM CO
c -X \Z >Φ · >Φ
Ό σ φ 2 o £ £ o £ Φ ν- Ο £ E •D u. Q_ O > -.C ď'· XD *σ Φ >X Φ O N > s o $ Φ g > E °E 0. o ω x° O
-50CZ 298406 B6
1:100 CA xT fO CA c> CN 42,19 CN cn“ cn 3/2 m 001Ί 1,289 xr xr CM X f“* rCM 00 Ό CN T—·· oo“ oo
ΓΜ σχ ι/ϊ <-n CM m xF r—« CA
m o x CN CN O\ cn CA cn un 00 o O CN o
*zx _x o X X X
xr XF CM * 1 «—* 1“·* r—» 00
\ο xF -<3* in O CA xo \O cn cn xf
r- xT 0 CN* r- m 00 r- o OO
o CA rn r> xf cn* CN σχ *n X I—* X O X
r—· oo
*-O o co ΜΊ xr un 00 CN CN •^F
r* CM Ό CN xt o r—· cn OO
m w 00 o* x m \£Í* XÍ^ cn ΜΊ O X xr. m X cns CA
XF 04 XO Ν'
<*-X
Ό O 0O O <05 r- 3 ma rn O 00
cn F 50 c cn t/A rn cn cn r-i
ΙΓ) CA o 00 un oc XT Ό O CM 50* CN OJ e un ca O X n. o X ZS oo* l>
o r—1
CA
co ™ Q
<
CN o O O < *£ Π CM CN
O co <zx O rn Q UJ O XT N cN
00 O\ CN o v~. XF ^n* xF CN θ'* OCN xF CN cn cn _j Q D < X G0 CA CN CA CA xr X cn m X xr xr X O o
m Oí o *—
< X
n> o
CM O O O rc CN
m O X 00 >fc 50 X oo o cn Ό XF N CM
rn o. ι/Ί m xr 05 3\ tn O cn oxt XF CN* xr o o cn σχ xr XF X un un X CN O X xr cn X cn* CA
**·* I
oo o o O oo
o σχ CM CN x m CF □x *t O xT CA x CO xr vr X cn O oo oo όΓ r* cn O CA CM xt X CM X CM O Ό x ΜΊ O xr X o r> σχ
xF O O O xT
CA 00 o 00 CA cn cn CN CA
xF qT o* rt** X rn XF r- Ό OO m
CA o ca CN OO 05 Γ- oc OO O oo r- CA O σχ m x X» , \ cN X Ό 00
i—· —
CF 3C .X 00 00 X CA CA CA OX
un O 5/Ί on rn cn cn cn
o xr N· xF Ν' o o xř N XT xr o
O o O O o X» X X ._> o
r—i
v* CM co CN ¢9
c >φ TJ J* Φ u,. O Ji s o ϋ 2. o KU ε O Έ >ω TJ 0) U 0> V· 2 o >φ E O
(D 1 N > £ £ Ol > Φ >ít s > s > £ Έ CL o '-V ox
-51 CZ 298406 B6
Příklady 79 až 90
Testy inhibice vazby a splývání
U těchto testů se používaly HeLa-CD4-LTR-p-galaktózidázové buňky, které používají tat proteinem indukovanou transaktivaci β-galaktózidázového genu řízeného HIV-1 LTR (long terminál repeat) promotorem. Test byl použit jak ke kvantitativnímu stanovení vazby infekčního virionu na buňky, tak i na stanovení splývání buněk navzájem. Infikované buňky vytváří shluky, které se snadno mikroskopicky počítají po inkubaci s X-gal. Test na stanovení inhibice vazby zahrnoval umístění 1 x 104 HeLa-CD4-LTR-p-galaktózidázových buněk do 200 μΐ 96-jamkových mikrotitračních ploten s plochým dnem. Tyto buňky se nechaly přes noc inkubovat, odstranilo se médium a nahradilo se 100 μΐ různých koncentrací ISIS 5320 nebo kontrolní látky. O hodinu později se do každé jamky přidalo 100 μΐ média obsahujícího virus. Buňky se nechaly inkubovat další hodinu a monovrstva se důkladně promyla, aby se odstranil nenavázaný virus a extracelulární látka. Po 48 hodinách se buňky fixovaly a nabarvily pomocí X-gal. Modré mnohojademé buňky se potom počítaly pod inverzním mikroskopem. Test na stanovení inhibice splývání buněk se také prováděl na 96-jamkových mikrotitračních plotnách s plochými dny. Do každé jamky se přidaly HeLa-CD4-LTR-P-galaktózidázové buňky (5 x 103) nechaly se inkubovat s testovanou látkou po dobu 1 hodiny před přidáním 5 x 103 HL2/3 buněk (28). Buňky se nechaly inkubovat po dobu dalších 48 hodin, potom se fixovaly a nabarvily pomocí X-gal. Modré shluky buněk se počítaly mikroskopicky. Barvení buněk se provádělo fixací buněk roztokem 1% formaldehydu a 0,2% glutaraldehydu a obarvením fixovaných buněk pomocí 4 μΜ ferrokyanidu draselného, 4μΜ ferrikyanidu draselného, 2 μΜ MgCl2 a 0,4% X-gal v PBS. Exprese transaktivace βgalaktózidázy byla také monitorována pomocí ELISA: Extrakty buněk se připravovaly zmrazováním a rozmrazováním a β-galaktózidázová aktivita se měřila podle návodu výrobce. Výsledky ELISA testu se hodnotily kvantitativně spektrofotometricky při 450 nm za použití čtečky ploten Molecular Devices Vmax.
-52CZ 298406 B6
TABULKA 39
Test fúze Beta-gal: Viracea #1 /SK1
o O *> co o oo* o o <rT ro un
CM O O o o l>
CO kcT- *» rT */o o rf*
F—1
O o o_ o co CO cM_
E WO cF t—M
CG t ,
C
O
Ί o CM O O o co o O
GJ
co cr. ^r wo Ch O oo
CM
Jd KD C
Z3
X)
n O
o O o o o co _______| CM
‘2? o
r—i T—ž* o o O CM
Ό CM
O e ' 1
Φ
>Q O o
o. o CM O o o co Oj CM
rn o UO »/o co oo SO
— r-H CM
o O O r- O CO
os“ cl c^l SO 100 cr*
CO wo 'šT cm
CM co EV
u. Q
o <D Φ >0) o >
><D u. O O c o E Q
N N N <O
>DÍ > > > £ οχ <Λ
o co SO ·—< WO xr uo^ e»~« cr CM SO *» o o
C-
SO co 00 CM o
CM r* co o Γ- *
co wo O co SO
X
' ř—’
o CM r* sO C-
o ^r WO τΓ θ'
r—« co »—1 SO Os CM
T~~' CM |M«
K WO DO SO OO SO
-C O Φ CM m CM Os ·*» CM sO SO oC o
c *“—*
Φ
o
o
t—
o. 1000
> S CO ^r m O. 00 *> υο CM 00 CM co
X *“· r—
o
o
1- o CM Os
o Γ· cr oo tr 1
CM CO </\ M3. co \o_ SO*' OS
SO 00 CM
OS r- sO r—<
WO WO SO SO o
o o
5— CM to
je XD ΖΞ
c ř 0> E E cti >
>Q) Ό o N o N O NI ’2
Φ Λ > > > 0.
-53CZ 298406 B6
TABULKA 41
Test fúze Beta-gal: Viracea #2/SK1
Počet modrých buněk na jednu jamku O JA O* Γ o* χζ^ cj*
CJ cn o o? o rF o rn* m CJ o V'( 2r
O O o o o m O ·*. i/n o Ό* oo cF rr-F
O CJ m o r-F O X O o o cT m xt xcF
1:1000 o XD* O o ·> o CJ rn rF m σ\ xp
1:3200 o CJ o íxT o cF CJ O »/n xt cn cjF
O o CA*' xT o CJ* m o o? Vn o xi~ o o r—* m oF CJ
Ředění Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 >Φ £ o CL % vc STD DEV
TABULKA 42 Test fúze Beta-gal: Viracea #2/SK2 S-. .c o <x> c Φ o o u. Q. > X o o o CA CJ oo o* CJ 00 oo o O0 vn rcF m CJ oo O \o xo” vn
CJ cn CJ cn c\ \o oo cn > * vn XT XT xo* o rF
O s CA ca rCA 00* XO m O* CJ* CA r—H m m
o CJ m CJ ro ·* vn en 00 Γ XD CO «—H »—< αχ oo O θ' m
0001-1 vn Ό CA m oo CA CO 00 vn ΓΟΟ O CJ
J- 1:3200 CA vn cn xjvi- XC cn vn oo vn ’/Ί CA só“ o
o Xř T—M vn vn rJ XT i/n vn Xtj i 0'001 _
Ředění s? o N > || Vzorek 2 Vzorek 3 || Průměr % životasch.
-54CZ 298406 B6
TABULKA 43
Test fúze Beta-gal: Viracea #1
3 E o 18 0 o„ • ro- O □Ί Γ- Γη ΓτΓ1 cn UM
cm en O un* l/M O o* un ΝΓ o <n X£? UM CN O 00*
1:100 o cm“ O en FUM cn UM* rn un i/M ·% XD CM
3 C Ό ω <0 c >0) c □ X) x: o *& Ό 1:320 o rn O r-Ί en O- 1 cn* UM rT xr oo xrř' o O cn* CN
0001M O r- O um” F- O oo M- r- ·*. XO UM -šT* μ- <3o -šT
o ε ω o o a. 1:3200 o r- en o % -roť en O 'M' m Γ-- en ^r* Ch Ch OO*
O o oo ΓΊ O oo -=3- o_ CM cn m ** O cn ο'οοι UM o CN
Konc. | Vzorek 1 I Vzorek 2 Vzorek 3 Průměr % vc STD DEV
-) ra οα φ < ca Η Φ N
O 1 644 rM UM v. -3- CN O 110,7
Ch UM CM CM XO
CM cn -^r cn I'- o C-l
cn O X CO G\ oo X
o kO cn m r- Os
o Ch en CM
·—· r- 00 00 oo (N
·· *
»“*
UM kO UM UM NT
xz o CN cn OO CN OO^ cn CM OO ** m->s <ro
Φ r—· »—»
c
Φ
o
o
CL O o cn CM Ch m
> OO 00 Tt Ό
<Q >·-* Ch Ch s Ch *» n
X ·
o
o
H o m un XO
o un r- -3- **
CM Ch Ch Ch Ch
cn X s
r—
un CM NT UM um o__
un Ν’ -3 o
O ** *> - o
r-H
+-»
T— CN CO 73
Q Φ Φ •X Φ u, >φ -O cC
c o ¥ u. O £ L. O £ ΙΟ > E •3 u, CL > ox
-55CZ 298406 B6
TABULKA 45
Test fúze Beta-gal: Viracea #2
O O o* O θ' o cT 0*0 O · o °<u O
Počet modrých buněk na jednu jamku CM cn o, θ' 'tí co tT m O* »/Ί 128,0 CN 00
1:100 O O* <zT O *» ctí* ir, σ\* r*» xo
O €4 cn o XD* Κ/Ί o * xr ' o c^T 'tí* Γ- ·* o 1ΖΊ 128,8 cn
1 :1000 O VX o r-M C' o •tí* c- t/Ί O ND* 'tí’ rT ^tí*
i* ........ 1:3200 O 'tí-'* kO O o vn o *> ^r -tí- r^ 'tí·' VTi O *> CT rC ....... 9 52
O o ccT O oo* XT o r? m cn c? m 100,0 v> o CM
Konc. Vzorek 1 Vzorek 2 'i I Vzorek 3 vKD ε •2 0- u O a- STD DEV
-56CZ 298406 B6
Test na stanovení topické mikrobicidní aktivity
Cervikální epiteliální buňky MEI 180 se daly dovnitř jamek 96-jamkových mikrotitračních ploten s plochým dnem o hustotě 5x10 buněk na jamku a nechaly se inkubovat přes noc. Chronicky infikované buňky H9 se léčily pomocí 200 pg/ml mitomycinu C v kompletním médiu po dobu jedné hodiny, důkladně se promyly a resuspendovaly se na 4 x 105 na ml. Použitá koncentrace mitomycinu C způsobila usmrcení chronicky infikovaných buněk během 48 hodin, což je dostatečná doba k mezibuněčnému přenosu viru na ME-180 buňky, avšak tato doba zajišťuje, že konečné množství viru nebude zahrnovat podíl od chronicky infikovaných buněk. Do každé jamky obsahující buňky ME 180 se přidaly antivirové látky a chronicky infikované buňky (2 x 104) a nechaly se inkubovat po dobu 6 hodin. Po kultivaci se monovrstva důkladně promyla a v době 24 a 48 hodin po infekci se přidalo čerstvé médium, aby se odstranily mrtvé lymfocyty. 6. den po infekci se odebraly vzorky supematantu a analyzovaly se na virový obsah pomocí testu p24 ELISA.
Testy exprese CD4
Bylo provedeno stanovení efektu Viracea na expresi CD4 za použití standardní techniky průtokového cytometru. Buňky se léčily pomocí Viracea po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C v tkáňovém kultivačním médiu. Stručně, 106 buněk CEM-SS se nechalo inkubovat s nebo bez látky po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Přidaly se anti-CD4 monoklonální protilátky (20 μΐ, 3 pg/ml) (Becton-Dickinson, San Jose, CA) a buňky se nechaly inkubovat při teplotě 4 °C po dobu 40 minut. Potom se buňky dvakrát propláchly pomocí PBS, resuspendovaly v 1 °C paraformaldehydu a analyzovaly za použití průtokového cytometru Becton-Dickinson FACSort.
Makromolekulámí syntéza
Buňky CEM-SS se nechaly kultivovat v tripletu za přítomnosti nebo nepřítomnosti látky po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C v inkubátoru se zvlhčeným CO2. Po 24 hodinách se ke kultuře přidalo 1 pCi [methyl-3H]-thymidinu, [5-3H]-uridinu nebo [3,4,5-3H]-leucinu a inkubace se nechala probíhat po dobu dalších 8 hodin. Buňky se přendaly na filtrační papír ze skleněných vláken za použití sběrače buněk Skarton. Skleněná vlákna se promyla destilovanou vodou, vložila se do scintilační nádobky a kvantitativně se měřila zachycená radioaktivita pomocí scintilačního čítače Packard Tri-Carb.
Výsledky testu HIV
Byly hodnoceny Viracea-1 a Viracea-2 mikrotitračním testem anti-HIV, který stanovuje kvantitativně schopnost testované látky inhibovat replikaci HIV a destrukci buněk vyvolanou HIV. Bylo zjištěno, že dvě látky jsou aktivní proti RF kmenům H1V-1 u CEM-SS buněk. Látka Viracea-1 inhibovala HlV-indukovaný cytopatický efekt (IC30) při ředění 1:400, zatímco Viracea-2 vykazovala IC25 při ředění 1:900 a nedosáhla 50% hodnoty inhibice. Jak Viracea-1, tak i Viracea-2 vykazovaly toxicitu (TC30) na buňkách CEM-SS při příslušných ředěních přibližně 1:20 a 1:250. Látka pozitivní kontroly, ddC, vykazovala očekávanou úroveň aktivity proti RF viru.
Byla stanovena aktivita látek Viracea-1 a Viracea-2 u čerstvých lidských buněk PBMC infikovaných klinických HIV izolátem ROJO. Tento nízko pasážovaný izolát byl určen jako virový izolát senzitivní na lék (AZT, ddC, nevirapin) a indukující tvorbu buněčných shluků. Ani Viracea-1 ani Viracea-2 neinhibovaly replikaci tohoto izolátu v netoxických koncentracích. Byla provedena další testování látek na buňkách PBMC infikovaných ROJO za použití stimulace buněk PBMC přednostně pomocí IL2 než PHA blastogenézou. Opět nebyla stanovena žádná aktivita pod koncentracemi, které inhibovaly růst buněk PBMC. AZT vykazovala v těchto testech očekávanou úroveň aktivity.
-57CZ 298406 B6
Látky Viracea-1 a Viracea-2 byly testovány na lidských monocyto-makrofázích infikovaných nízko pasážovaným klinickým izolátem ADA. Obě látky v těchto testech vykazovaly vysokou úroveň aktivity s Viracea-2, která byla jasně lepší. 50% účinná koncentrace Viracea-1 a Viracea-2 byla při ředění 1:4000 a 1:10 000. Při morfologickém vyšetření nebo při barvení pomocí XTT-tetrazolium nebyla zjištěna toxicita na monocyto-makrofágovou monovrstvu. AZT vykazovala v těchto testech očekávanou úroveň aktivity.
Bylo zjištěno, že látky Viracea-1 a Viracea-2 inhibují zachycení infekčního viru na HeLa-CD4LTR-p-galaktózidázové buňky s exprimovaným CD4. Byla zjištěna inhibice vazby viru na cílové buňky pro obě látky při ředěních přibližně 1:1000 až 1:3200. Žádná z látek neměla antivirový účinek na splývání buněk HL2/3 s exprimovaným pláštěm s HeLa-CD4-LTR-p-galaktózidázovými buňkami. Byla zjištěna toxicita obou látek v testu na splývání buněk, ve kterém byla látka přítomna v jamce v celém průběhu trvání testu stejně tak jako toxicita látky Viracea-2 v testu vazby, kde byla látka přítomna pouze po dobu 2 hodin. Chicago Sky Blue, sulfonované barvivo, vykazovalo v každém z těchto testů očekávanou úroveň aktivity.
Látka Viracea-2 zabránila přenosu viru z chronicky infikovaných lymfocytů na cervikální epiteliální buněčnou linii ΜΕ 180 při ředění přibližně 1:500 (IC30). U tohoto testu nebyla zjištěna toxicita na buňky ΜΕ 180. U tohoto testu byl lék přítomen pouze v době infekce (4 hodiny). Dextran sulfát (pozitivní kontrola, sulfonovaný polysacharid) a dextran (negativní kontrola) vykazovaly v těchto testech očekávanou úroveň aktivity.
Viracea-2 neměla žádný efekt na expresi CD4 na povrchu buněk.
Inhibice začlenění thymidinu (DNA), uridinu (RNA) nebo leucinu (protein) do makromolekul o vysoké molekulové hmotnosti byla zjištěna u ředění vyšších než 1:320. Inhibice makromolekulámí syntézy se shodovala s toxicitou látek u buněk CEM-SS.
Souhrnné výsledky testu HIV
Látky Viracea-1 a Viracea-2 inhibují HIV infekci s úzkým terapeutickým indexem u stanovených T-buněk. Látky Viracea-1 a Viracea-2 potenciálně inhibují replikaci HIV u monocytomakrofágů. Látky Viracea-1 a Viracea-2 inhibují připevnění viru na cílové buňky, ale nebrání splývání infikovaných buněk s neinfikovanými buňkami. Viracea-2 inhibuje přenos viru v testu na stanovení topické mikrobicidní aktivity a může být užitečná v prevenci sexuálního přenosu HIV. Viracea-2 nemá žádný efekt na expresi CD4 na povrchu buněk.
Prevence a léčba
Antimikrobiální látka zajišťuje antimikrobicidní látku a léčivo, které (1) pomáhá v prevenci sexuálního přenosu HIV; (2) řídí virovou zátěž virem HIV a jinými viry; (3) zajišťuje eradikaci HIV; (4) prodlužuje latentní období syndromu autoimunodeficience (AIDS) u nemocných, kteří onemocněli HIV; (5) zmírňují bolest a utrpení nemocných s HIV; (6) omezují rozšiřování infekce HIV; a (7) zajišťují lepší a úspěšnější léčbu nemocných s HIV. Medikamentózní léčba také zmírňuje fyzické příznaky vzplanutí infekce HIV, viru herpes simplex 1 nebo 2 (HSV 1 nebo HSV 2) nebo jiných infekčních mikrobiálních onemocnění. Výše zmíněných výsledků lze dosáhnout systematickou aplikací nebo injekčním podáváním výhodné výše popsané antimikrobiální látky (léčiva) pomocí jehly do konečníku (konečník, konečníková tkáň) nebo do pochvy (poševní tkáň) pacienta infikovaného HIV nebo jinými infekčními mikrobiálními onemocněními, a to 8 až 12krát denně, s výhodou 10-krát denně v intervalu každých dvou hodin, po dobu 10 až 18 po sobě jdoucích dnů, s výhodou nejlepších výsledků po dobu 14 po sobě jdoucích dnů (dvou týdnů). Dávka, koncentrace a množství antimikrobiální látky (léčiva) je různá v závislosti na závažnosti a rozsahu onemocnění stejně tak jako na věku, pohlaví, hmotnosti, rase a zdravotním stavu nemocného. Je žádoucí, aby se před aplikací antimikrobiální látky (léčiva) infikovaná oblast opláchla (omyla) a usušila, aby se z infikované oblasti odstranilo mýdlo nebo jeho zbytky. Anti-58CZ 298406 B6 mikrobiální látka se při léčbě viru herpes simplex 1 nebo 2 nanáší na infikované místo po dobu až 24 hodin. Výsev puchýřků herpes viru se zabrzdí během 19 až 24 hodin a postižená místa se následně zahojí.
Mezi mnoho výhod medikamentózní léčby a léčiva (sloučenin) tohoto vynálezu patří:
1. Skvělá léčba a prevence HIV a jiných infekčních onemocnění.
2. Vynikající výsledky s odstraněním bolesti u virových onemocnění HIV a herpes simplex a jiných infekčních onemocnění bez toxicity.
3. Vynikající působení při rychle se hojících vzplanutí u HIV, herpes simplex a jiných infekčních onemocnění.
4. Záchrana životů novorozenců, dětí, dospělých i zvířat.
5. Snižování světových ekonomických ztrát způsobených HIV, herpes simplex a jiných infekčních onemocnění.
6. Odstranění mnoha vážných emocionálních a mentálních trápení u nemocných trpících HIV a herpetickou infekcí.
7. Snadno dostupné látky (ingredience).
8. Ekonomika.
9. Bezpečnost.
10. Jednoduché použití.
11. Spolehlivost.
12. Účinnost.
Ačkoliv je zde popsána podstata vynálezu a příklady, znamená to, že jsou možné i různé obměny a záměny stejně tak jako i jiné uspořádání částí, složek a postupů, způsobu a léčby, prováděné odborníky, aniž by se odklonili od novosti a rozsahu tohoto vynálezu.

Claims (3)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. Použití antimikrobiálního prostředku obsahujícího v hmotnostních procentech
- 40 až 60 % fotochemického koncentrátu bylinných botanikálií obsahující Commiphora myrrha a Echinacea purpurea, přičemž tento fytochemický koncentrát poskytuje antimikrobiální izoláty;
- 20 až 60 % sterilní vody, která poskytuje rozpouštědlo a nosič pro uvedený fytochemický koncentrát;
- 0,02 % až 0,3 % amoniové povrchově aktivní látky obsahující benzalkonium chlorid;
- 2 % až 12 % listové kyseliny poskytující živinu;
kde antimikrobiální izoláty z uvedeného íytochemického koncentrátu obsahují v hmotnostních procentech vztaženo na celkovou hmotnost léčivého prostředku:
0,3 až 9 % echinolinu,
- 0,1 až 7 % 4-O-methylglukoronoarabinoxylanu srel. molekulovou hmotností 35 kDa a ramnoarabinogalaktanové kyseliny s rel. molekulovou hmotností 450 kDa;
- 0,1 až 10 % cynarinu (1,5-di-O-kafeoylchinolinové kyseliny) a chiorové kyseliny (2,3-0kafeoylvinné kyseliny) a jejích derivátů;
- 0,2 až 4 % echinolonu;
- 0,2 až 8 % echinacinu B;
- 0,1 až 6 % echinacinu;
- 2 % až 7 % antonokyaninů obsahujících kyanidin 3-O-B-D-glukopyranosid a 3-0-(6-0malonyl)-B-D-glukopyranosid;
- 0,01 až 0,06 % pyrolizidinových alkaloidů obsahující tusilagin a isotusilagin;
- 0,003 až 0,009 izomemích dodeka-izobutylamidů a tetroenové kyseliny; a kde fytochemické látky z Commiphora myrrha obsahují členy vybrané ze skupiny skládající se z karyofylenů, seskviterpenů, kurzerenonu, dihydrofhanodien-6-onu, 2-methoxyfuradinu, elemolu, lyndesterenu, kyseliny octové, α-amyronu, arabinos, a-bisabolenu, γ-bisabolenu, kadinenu, kampesterolu, cholesterolu, skořicového aldehydu, komiferinu, α-komiforové kyseliny, β-komiforové kyseliny, γ-komiforové kyseliny, komiforinové kyseliny, m-kresolu, kumylalkoholu, kuminaldehydu, dipentenu, elemolu, 3-epi-oc-amyrinu, eugenolu, furandienu, furandienonu, galaktózy, rostlinné gumy, herabolenu, a-herabomyrolu, β-herabomyrolu, heraboresenu, limonenu, 4-(O-methylglukuronové kyseliny, n-nonakesanu, p-sitosterolu, xylózy, pro výrobu léčiva pro léčení virové imunitní nedostatečnosti.
-60CZ 298406 B6
2. Použití antimikrobiálního prostředku obsahujícího v hmotnostních procentech:
- 40 až 60 % fotochemického koncentrátu bylinných botanikálií obsahující Commiphora myrrha a Echinacea purpurea;
- 20 až 60 % sterilní vody, která poskytuje rozpouštědlo a nosič pro uvedený fytochemický koncentrát;
- 2 % až 12 % listové kyseliny poskytující živinu; a kde antimikrobiální izoláty z uvedeného fytochemického koncentrátu obsahují v hmotnostních procentech vztaženo na celkovou hmotnost léčivého prostředku:
- 0,3 až 9 % echinakosidu,
- 0,1 až 7 % 4-O-methylglukoronoarabinoxylanu srel. molekulovou hmotností 35 kDa a ramnoarabinogalaktanové kyseliny s rel. molekulovou hmotností 450 kDa;
- 0,1 až 10 % cynarinu (1,5-di-O-kafeoylchinolinové kyseliny) a chiorové kyseliny (2,3-0kafeoylvinné kyseliny) a jejích derivátů;
- 0,2 až 4 % echinolonu;
- 0,2 až 8 % echinacinu B;
- 0,1 až 6 % echinacinu;
- 2 % až 7 % antonokyaninů obsahujících kyanidin
3-O-B-D-glukopyranosid a 3-0-(6-0malonyl)-B-D-gIukopyranosid;
- 0,01 až 0,06 % pyrrolizidinových alkaloidů obsahující tusilagin a isotusilagin;
- 0,003 až 0,009 izomemích dodeka-izobutylamidů a tetroenové kyseliny; a kde fytochemické látky z Commiphora myrrha obsahují členy vybrané ze skupiny skládající se z kaiyofylenů, seskviterpenů, kurzerenonu, dihydrofhanodien-6-onu, 2-methoxyfuradinu, elemolu, lyndesterenu, kyseliny octové, α-amyronu, arabinos, a-bisabolenu, γ-bisabolenu, kadinenu, kampesterolu, cholesterolu, skořicového aldehydu, komiferinu, α-komiforové kyseliny, β-komiforové kyseliny, γ-komiforové kyseliny, komiforinové kyseliny, m-kresolu, kumylalkoholu, kuminaldehydu, dipentenu, elemolu, 3-epi-a-amyrinu, eugenolu, furandienu, furandienonu, galaktózy, rostlinné gumy, herabolenu, oc-herabomyrolu, β-herabomyrolu, heraboresenu, limonenu, 4-(O-methylglukuronové kyseliny, n-nonakesanu, p-sitosterolu, xylózy, pro výrobu léčiva pro léčení virové imunitní nedostatečnosti.
CZ0336899A 1997-03-26 1998-03-24 Farmaceutický prostredek obsahující antimikrobiální prostredek pro lécbu lidské imunodeficience a dalších infekcních onemocnení CZ298406B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/824,041 US6350784B1 (en) 1996-02-12 1997-03-26 Antimicrobial prevention and treatment of human immunedeficiency virus and other infectious diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ336899A3 CZ336899A3 (cs) 2000-07-12
CZ298406B6 true CZ298406B6 (cs) 2007-09-26

Family

ID=25240459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0336899A CZ298406B6 (cs) 1997-03-26 1998-03-24 Farmaceutický prostredek obsahující antimikrobiální prostredek pro lécbu lidské imunodeficience a dalších infekcních onemocnení

Country Status (30)

Country Link
US (3) US6350784B1 (cs)
EP (1) EP0980203B1 (cs)
JP (2) JP2001527541A (cs)
KR (1) KR100403418B1 (cs)
CN (1) CN1258191A (cs)
AP (1) AP1163A (cs)
AT (1) ATE358418T1 (cs)
AU (1) AU727339B2 (cs)
BG (1) BG63612B1 (cs)
BR (1) BR9807892A (cs)
CA (1) CA2285394C (cs)
CZ (1) CZ298406B6 (cs)
DE (1) DE69837474T2 (cs)
DK (1) DK0980203T3 (cs)
EA (1) EA002423B1 (cs)
EE (1) EE9900436A (cs)
ES (1) ES2285765T3 (cs)
GE (1) GEP20022749B (cs)
HU (1) HU226910B1 (cs)
IL (1) IL132003A (cs)
IS (1) IS5191A (cs)
NO (1) NO325017B1 (cs)
NZ (1) NZ500002A (cs)
OA (1) OA11198A (cs)
PL (1) PL196036B1 (cs)
RS (1) RS49963B (cs)
SK (1) SK285810B6 (cs)
TR (1) TR199902674T2 (cs)
UA (1) UA65563C2 (cs)
WO (1) WO1998042188A1 (cs)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6350784B1 (en) * 1996-02-12 2002-02-26 Meryl J. Squires Antimicrobial prevention and treatment of human immunedeficiency virus and other infectious diseases
US20090191288A1 (en) * 1996-02-12 2009-07-30 Squires Meryl J Composition to Treat Herpes, Pseudomonas, Staph, Hepatitis and Other Infectious Diseases
US9662360B2 (en) 2008-10-09 2017-05-30 Meritus Corporation Treatment of herpes, pseudomonas, staph, and hepatitis
CA2368574C (en) 1999-03-26 2008-08-12 Sunstar Inc. Compositions for preventing and treating type i allergy
WO2001001947A1 (en) * 1999-06-30 2001-01-11 Unilever Plc Cosmetic skin care compositions containing cumic alcohol
AU6174900A (en) * 1999-07-08 2001-01-30 Patrick T. Prendergast Use of flavones, coumarins and related compounds to treat infections
US6759434B2 (en) 1999-09-22 2004-07-06 B. Ron Johnson Anti-infective compositions, methods and systems for treating disordered tissue
US6211243B1 (en) 1999-09-22 2001-04-03 B. Ron Johnson Methods for treating cold sores with anti-infective compositions
US8173709B2 (en) * 1999-09-22 2012-05-08 Quadex Pharmaceuticals, Llc Anti-infective methods for treating pathogen-induced disordered tissues
DE60003453T2 (de) * 1999-11-04 2004-04-15 Antoinette Maria Brandes Phytotherapeutische zubereitung
US7147859B2 (en) * 2000-05-15 2006-12-12 Laboratorios Biosintetica Ltda. Application of phytosterols (and their isomers), folic acid, cyanocobalamin and pyridoxin in dietetic (alimentary) fibers
ATE355071T1 (de) * 2000-06-19 2006-03-15 Skopichenko Dettwiler Victoria Kräuterzusammensetzung enthaltend calendula und eucalyptus für die behandlung und heilung von erkrankungen
EP1351678A2 (en) * 2001-01-02 2003-10-15 Elizabeth Shanahan-Prendergast Treatment for inhibiting neoplastic lesions using incensole and/or furanogermacrens
IL143318A0 (en) * 2001-05-23 2002-04-21 Herbal Synthesis Corp Herbal compositions for the treatment of mucosal lesions
EP2545937A1 (en) * 2001-06-05 2013-01-16 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
US7923023B2 (en) * 2002-02-25 2011-04-12 Astech International LLC Method and composition for delivery of medicants to animals
CH696628A5 (de) * 2002-02-26 2007-08-31 Eprova Ag Verwendung von Folaten zur Herstellung einer Zubereitung geeignet zur Vorbeugung und Behandlung von Entzündungen und entzündungsassoziierter Krankheiten, im Speziellen zur Beeinflussung der
GB0212405D0 (en) * 2002-05-29 2002-07-10 Insignion Holdings Ltd Composition and its therapeutic use
US7115563B2 (en) 2002-05-29 2006-10-03 Insignion Holding Limited Composition and its therapeutic use
US8492443B2 (en) * 2002-07-08 2013-07-23 Joe S. Wilkins, Jr. Treatment for herpes simplex virus and other infectious diseases
FR2843125B1 (fr) * 2002-08-02 2012-11-16 Coletica Principes actifs stimulant les beta-defensives humaines de type 2 et/ou de type 3, et compositions cosmetiques ou pharmaceutiques comprenant de tels principes actifs
EP2387883B2 (en) * 2002-08-12 2017-03-22 Lonza Inc. Antimicrobial compositions comprising sodium benzoate
US7273889B2 (en) * 2002-09-25 2007-09-25 Innovative Drug Delivery Systems, Inc. NMDA receptor antagonist formulation with reduced neurotoxicity
IL153124A (en) * 2002-11-27 2010-06-30 Herbal Synthesis Corp Solid composition that can be glued to the lining
US20050036972A1 (en) * 2003-03-10 2005-02-17 Hy-Gene Biomedical Corporation System for managing pathogens and irritants and monitoring usage of anti-bacterial formulations
RU2234313C1 (ru) * 2003-06-04 2004-08-20 Кривошеин Юрий Семенович Средство инактивации коронавирусов
GB0326518D0 (en) * 2003-11-13 2003-12-17 Compton Developments Ltd Anti-cancer compounds
WO2005046695A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-26 Maria Waithira Njuguna Injection vitamin b complex for treatment of non specific vaginitis (bacterial vaginitis)
US20080124408A1 (en) * 2004-07-07 2008-05-29 Mediherb Holdings Ltd. Echinacea Formulation
WO2006031230A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-23 Hy-Gene Biomedical Corporation System for managing pathogens and irritants and monitoring usage of anti-bacterial formulations
US10138279B2 (en) 2006-04-13 2018-11-27 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for Bacillus anthracis vaccination
US9839685B2 (en) * 2006-04-13 2017-12-12 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inducing human immunodeficiency virus-specific immune responses in a host comprising nasally administering compositions comprising a naonemulsion and recombinant GP120 immunogen
US20080038295A1 (en) * 2006-04-13 2008-02-14 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for orthopox virus vaccination
JP2007332126A (ja) * 2006-06-16 2007-12-27 Teikyo Univ ヒトおよび愛玩動物のための抗白癬入浴剤
CN101697966B (zh) * 2007-01-08 2011-10-19 杭州民生药业有限公司 蓬莪术环二烯在制备治疗由病毒引起的疾病的药物中的应用
CN100594896C (zh) * 2007-01-08 2010-03-24 杭州民生药业有限公司 蓬莪术环二烯在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用
DE102007029042A1 (de) * 2007-06-21 2008-12-24 Analyticon Discovery Gmbh Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Trihydroxychromenone-Derivate
US8637094B2 (en) 2007-07-18 2014-01-28 Iraj E. Kiani Composition and method for treating viral conditions
US7700137B1 (en) 2007-07-18 2010-04-20 Kiani Iraj E Anti-viral compositions and method
US7850998B2 (en) * 2007-07-18 2010-12-14 Kiani Iraj E Method of treating viral conditions
US8877208B2 (en) 2008-05-23 2014-11-04 The Regents Of The University Of Michigan Multivalent nanoemulsion vaccines
EA201170239A1 (ru) 2008-07-22 2011-08-30 Айзун Фармасьютикалз, Инк. Противовоспалительная композиция для местного применения
CH699653B1 (de) * 2008-09-08 2010-05-14 Bioforce Ag Roggwil Tg Zubereitung zur Prävention und/oder Behandlung und/oder Verhinderung der Weiterverbreitung von Atemwegserkrankungen.
US20100204181A1 (en) * 2009-02-06 2010-08-12 Alcon Research, Ltd. N-halogenated amino acid formulations comprising phosphine or amine oxides
US20100303935A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Squires Meryl J Medicinal Composition
EP3020412B1 (en) * 2009-06-16 2017-10-11 The Regents of the University of Michigan An immunogenic composition comprising nanoemulsion inactivated rsv
EP2324840B1 (en) * 2009-11-18 2019-03-20 Croda Italiana S.p.A. Production of caffeoylquinic acids from plant cell cultures of echinacea angustifolia
WO2011082835A1 (en) * 2010-01-11 2011-07-14 Vitro-Bio Sarl New synergistic compositions for the treatment of topical viral infections
WO2011116220A2 (en) * 2010-03-17 2011-09-22 Arbonne International Llc Oral supplement
WO2012069605A1 (en) 2010-11-26 2012-05-31 Dr. August Wolff Gmbh & Co. Kg Arzneimittel Novel e,e-diene compounds and their use as medicaments and cosmetics
US8287924B2 (en) 2011-03-17 2012-10-16 Sonia Pharma Gmbh Treatment of menopausal symptoms as novel indication for myrrh
DK2500026T3 (da) * 2011-03-17 2013-08-26 Sonia Pharma Gmbh Behandling af menopausale symptomer som moderne indikation for myrra
WO2012123539A1 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Sonia Pharma Gmbh Treatment of vaginal atrophy as novel indication for myrrh
KR101334348B1 (ko) * 2011-12-21 2013-11-29 한국생명공학연구원 바이러스 억제 활성을 갖는 플라보노이드 화합물
US9125911B2 (en) 2013-03-14 2015-09-08 Quadex Pharmaceuticals, Llc Combined systemic and topical treatment of disordered tissues
US9463180B2 (en) 2013-03-14 2016-10-11 Quadex Pharmaceuticals, Llc Treatment of molluscum contagiosum
US9549930B2 (en) 2013-03-14 2017-01-24 Quadex Pharmaceuticals, Llc Combined systemic and topical treatment of disordered and/or prodromal stage tissue
ES2761429T3 (es) * 2013-04-17 2020-05-19 Global Health Solutions Ag Composición farmacéutica antiviral, que contiene un extracto de Juncus acutus
US10512664B2 (en) 2014-07-22 2019-12-24 Ralco Nutrition, Inc. Antiviral compositions and methods
CN106496202B (zh) * 2015-09-06 2019-08-06 中国海洋大学 一种生物碱类化合物及其制备方法与作为抗单纯疱疹ⅰ型病毒剂的应用
KR102670487B1 (ko) * 2016-11-17 2024-05-30 주식회사 엘지생활건강 시나린을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물
US12357584B2 (en) 2018-12-07 2025-07-15 Global Biolife Inc. Composition and method of controlling infectious diseases with functional fragrances
WO2020123559A1 (en) * 2018-12-11 2020-06-18 Glyciome, Llc Topical, isotonic compositions for genital use
KR102416208B1 (ko) * 2020-01-08 2022-07-01 건국대학교 산학협력단 발효된 선복화 추출물을 포함하는 항인플루엔자 바이러스용 조성물
PH12022551856A1 (en) 2020-01-22 2024-01-03 Seelos Therapeutics Inc Reducing side effects of nmda antagonists
KR102762400B1 (ko) * 2020-04-09 2025-02-06 권두한 항코로나바이러스능을 가지는 플라보노이드 배당체
IT202000018970A1 (it) * 2020-08-03 2022-02-03 Asoltech Srl Composizione a base di mirra
LU102656B1 (de) 2021-03-11 2022-09-12 Prosecur Gmbh Flüssiges Nahrungsergänzungsmittel zur Immunstimulation, Verfahren zu dessen Herstellung sowie Verwendung
CN115414349B (zh) * 2022-08-26 2023-11-03 武汉科前生物股份有限公司 芹菜素在制备治疗猫鼻支气管炎药物中的用途
KR102924378B1 (ko) 2022-12-01 2026-02-10 서울여자대학교 산학협력단 카페산을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법
KR102842849B1 (ko) * 2024-08-07 2025-08-06 알투이랩 주식회사 다재내성균을 포함한 다양한 균주 대상 살균력 및 장기간 지속 항균력을 갖는 복합 항균 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3521143A1 (de) * 1985-06-13 1986-12-18 Robugen Gmbh Arzneimittel zur behandlung schwerer herpes-infektionen
US4797420A (en) * 1984-08-14 1989-01-10 Jabco Manufacturing, Inc. Disinfectant formulation and method of use
US5455033A (en) * 1993-05-21 1995-10-03 Degree/Silverman M.D. Inc. Medicinal composition for treatment of inflammation

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4283421A (en) * 1979-12-19 1981-08-11 Ray Frank F Anti-viral treatment
US4760079A (en) * 1983-01-10 1988-07-26 Baltech, Inc. Treatment of diseases caused by herpes viruses
US4935448A (en) * 1983-01-10 1990-06-19 Baldone Joseph A Treatment of diseases caused by herpes viruses
US4661354A (en) * 1984-06-21 1987-04-28 Finnerty Edmund F Topical treatment of herpes simplex with a zinc sulfate-camphor water solution
US4585656A (en) * 1984-08-20 1986-04-29 Rosenthal Harold R Treatment of herpes
DE3522075A1 (de) * 1985-06-20 1987-01-02 Lomapharm Rudolf Lohman Gmbh K Sesquiterpenverbindungen, verfahren zu ihrer isolierung und arzneimittel, enthaltend diese verbindungen
EP0213099A3 (de) * 1985-08-23 1989-07-19 Cederroth Nordic Aktiebolag Mittel mit antiphlogistischer, immunstimulierender und zytoprotektiver Wirkung, ihre Herstellung und pharmazeutische Verwendungen
DE3533563A1 (de) * 1985-09-20 1987-03-26 Michael Birzer Mep-aids mittel
FR2620698B1 (fr) * 1987-09-23 1990-08-10 Atlantic Pharma Prod Fluorure d'ammonium quaternaire et son application dans une substance inhibitrice ou destructrice d'etres vivants unicellulaires
US5149529A (en) * 1988-04-08 1992-09-22 Board Of Trustees Of Leland Chiron Corporation Compositions and treatment for herpes simplex
DE4017091A1 (de) 1990-05-27 1991-11-28 Walter Dr Mach Molekuelverbundsystem zur kontra-eskalativen therapie viraler infektionskrankheiten
US6348503B1 (en) * 1996-02-12 2002-02-19 Meryl J. Squires Method and topical treatment composition for herpesvirus hominis
US6355684B1 (en) * 1990-10-11 2002-03-12 Meryl J. Squires Antimicrobial treatment for herpes simplex virus and other infectious diseases
US6350784B1 (en) * 1996-02-12 2002-02-26 Meryl J. Squires Antimicrobial prevention and treatment of human immunedeficiency virus and other infectious diseases
US5248503A (en) * 1992-01-03 1993-09-28 Emanuel King Rosalba Herbal dietary supplement
US5461029A (en) * 1992-04-24 1995-10-24 American Cyanamid Company Method of treating herpes viral infections using HBNF and MK proteins
NL9500216A (nl) 1995-02-06 1996-09-02 Bio Pharma Sciences Bv Farmaceutische samenstelling voor de behandeling van herpes.
US5876728A (en) * 1995-02-15 1999-03-02 Howard David Kass Natural composition extracted from plants used in the treatment of cancer
AU679162B3 (en) * 1995-11-21 1997-06-19 Stolair Pty Ltd Therapeutic compositions

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797420A (en) * 1984-08-14 1989-01-10 Jabco Manufacturing, Inc. Disinfectant formulation and method of use
DE3521143A1 (de) * 1985-06-13 1986-12-18 Robugen Gmbh Arzneimittel zur behandlung schwerer herpes-infektionen
US5455033A (en) * 1993-05-21 1995-10-03 Degree/Silverman M.D. Inc. Medicinal composition for treatment of inflammation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WAINBERG ET AL "EFFECT OF BENZALKONIUM CHLORIDE ON HIV AND RELATED INFECTIONS AND ON OTHER INFECTIOUS AGENTS", ARCH. AIDS RES,1(1),1987, P.57-68 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0980203A1 (en) 2000-02-23
PL336168A1 (en) 2000-06-05
DE69837474T2 (de) 2007-12-13
SK131899A3 (en) 2000-12-11
BR9807892A (pt) 2000-02-22
US20060024393A1 (en) 2006-02-02
EA199900773A1 (ru) 2000-10-30
CZ336899A3 (cs) 2000-07-12
OA11198A (en) 2003-05-30
IS5191A (is) 1999-09-23
IL132003A (en) 2005-08-31
UA65563C2 (uk) 2004-04-15
EP0980203A4 (en) 2004-05-06
NO325017B1 (no) 2008-01-14
CA2285394C (en) 2013-01-08
IL132003A0 (en) 2001-03-19
CA2285394A1 (en) 1998-10-01
JP2000119188A (ja) 2000-04-25
AP1163A (en) 2003-06-30
EA002423B1 (ru) 2002-04-25
YU48099A (sh) 2002-03-18
DE69837474D1 (de) 2007-05-16
KR100403418B1 (ko) 2003-10-30
BG103786A (bg) 2000-10-31
GEP20022749B (en) 2002-08-26
SK285810B6 (sk) 2007-08-02
ES2285765T3 (es) 2007-11-16
TR199902674T2 (xx) 2000-02-21
US20030104082A1 (en) 2003-06-05
US6350784B1 (en) 2002-02-26
EE9900436A (et) 2000-04-17
HUP0001379A2 (hu) 2000-08-28
JP2001527541A (ja) 2001-12-25
DK0980203T3 (da) 2007-07-30
NO994639L (no) 1999-11-24
EP0980203B1 (en) 2007-04-04
NO994639D0 (no) 1999-09-24
CN1258191A (zh) 2000-06-28
BG63612B1 (bg) 2002-07-31
NZ500002A (en) 2001-09-28
US7071233B2 (en) 2006-07-04
AU6771898A (en) 1998-10-20
HUP0001379A3 (en) 2000-11-28
AP9901661A0 (en) 1999-09-30
RS49963B (sr) 2008-09-29
AU727339B2 (en) 2000-12-07
HU226910B1 (hu) 2010-03-01
PL196036B1 (pl) 2007-11-30
ATE358418T1 (de) 2007-04-15
WO1998042188A1 (en) 1998-10-01
KR20010005603A (ko) 2001-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP1163A (en) Antimicrobial prevention and treatment of human immunodeficiency virus and other infectious diseases.
US9662360B2 (en) Treatment of herpes, pseudomonas, staph, and hepatitis
US6355684B1 (en) Antimicrobial treatment for herpes simplex virus and other infectious diseases
EP0739208A1 (en) Flavin derivatives as anti-viral agents
US6638915B1 (en) Anti-viral composition
CN112274509B (zh) 西达本胺联合bcl2抑制剂在双表达型b细胞淋巴瘤中的应用
JP2000505433A (ja) レトロウイルス感染の処置のための３―アミノ―４―ヒドロキシ安息香酸の使用
MXPA99008750A (es) Prevencion y tratamiento antimicrobianos de virus de inmunodeficiencia humana y otras enfermedades infecciosas

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20100324