CZ301662B6 - Kmen deltathyA Vibrio cholerae postrádající funkci genu thyA - Google Patents
Kmen deltathyA Vibrio cholerae postrádající funkci genu thyA Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301662B6 CZ301662B6 CZ20004354A CZ20004354A CZ301662B6 CZ 301662 B6 CZ301662 B6 CZ 301662B6 CZ 20004354 A CZ20004354 A CZ 20004354A CZ 20004354 A CZ20004354 A CZ 20004354A CZ 301662 B6 CZ301662 B6 CZ 301662B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- strain
- thy
- vibrio cholerae
- thya
- Prior art date
Links
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 title claims abstract description 69
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 145
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 125
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 49
- 101150072314 thyA gene Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 19
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 101710142847 Glutathione S-transferase class-mu 26 kDa isozyme Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 101001034449 Arabidopsis thaliana Glutathione S-transferase F12 Proteins 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 101100153154 Escherichia phage T5 thy gene Proteins 0.000 abstract description 93
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 abstract description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 12
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 10
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 101100427060 Bacillus spizizenii (strain ATCC 23059 / NRRL B-14472 / W23) thyA1 gene Proteins 0.000 description 7
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 101100313751 Rickettsia conorii (strain ATCC VR-613 / Malish 7) thyX gene Proteins 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 6
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 6
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 6
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000005497 Thymidylate Synthase Human genes 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000510930 Brachyspira pilosicoli Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000078280 Escherichia coli S17 Species 0.000 description 1
- 241000242711 Fasciola hepatica Species 0.000 description 1
- 101710151190 Flagellin A Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150025711 TF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 229960005004 cholera vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 208000006275 fascioliasis Diseases 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N levan Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(CO[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 AIHDCSAXVMAMJH-GFBKWZILSA-N 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001884 polyglutamylation Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
- C07K14/43559—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from trematodes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Electrical Discharge Machining, Electrochemical Machining, And Combined Machining (AREA)
Abstract
Kmen .DELTA.thyA Vibrio cholerae, který postrádá v chromosomu celý gen thyA, který má nukleotidovou sekvenci id. c. 1, a nebo kmen .DELTA.thyA Vibrio cholerae, který obsahuje v genu thyA deleci a soucasne inzerci nekódující DNA, a který je pripravitelný zpusobem, který zahrnuje kroky: poskytnutí thymin-dependentního kmene Vibrio cholerae, provedení místnecílené inzerce genu kanamycinové rezistence ve forme genového bloku Kan.sup.R.n. do PstI místa genu thyA, a delece 209 páru bází z genu thyA upstream od místa inzerce a 261 páru bází z genového bloku Kan.sup.R.n.. Výhodne kmen obsahuje jeden nebo nekolik episomálních autonomne se replikujících DNA elementu majících funkcní gen thyA, což umožnuje kmenu rust v rustovém médiu za neprítomnosti thyminu, pricemž jeden nebo nekolik episomálních autonomne se replikujících DNA elementu dále obsahuje strukturní gen kódující protein. Kódovaný protein je výhodne B-podjednotka tepelne labilního enterotoxinu E. coli (LTB) nebo 26 kD protein glutathion-S-transferázy ze Schistosoma japonicum (GST 26 kD).
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká kmenů Δ/ΛχΑ Vibrio cholerae a způsobů přípravy těchto kmenů. Vynález se zejména týká kmenu Vibrio cholerae, který byl zbaven genu z chromozómu, tj. thy A” kmenu Vibrio cholerae, který postrádá funkci genu thy A. Tento kmen obsahuje jeden nebo několik epizomálních autonomně se replikujících DNA elementů, jako jsou např. plazmidy, obsahujíio cích cizorodý gen thy A, např. gen z E. coli, který umožňuje kmenu růst v nepřítomnosti thyminu v kultivačním médiu, a případně obsahujících strukturní gen kódující homologní nebo heterologní protein. Vynález se dále týká nukleotidových sekvencí genů thy A a proteinů kódovaných těmito sekvencemi.
Dosavadní stav techniky
Exprese rekombinantních genů v bakteriální buňce se nejčastěji provádí tak, že se do hostitelské baktérie vnesou epizomální prvky schopné autoreplikace (např. plazmidy), které kódují strukturní gen pro požadovaný protein, který je řízen vhodným promotorem. Takové plazmidy jsou zpravidla udržovány pomocí vloženého genu pro selekční markér, který kóduje protein udělující rezistenci např. ke specifickému antibiotiku (jako je např. ampicilin, chloramfenikol, kanamycin, tetracyklin a další). V hostitelských buňkách se plazmidy udržují tím, že se odpovídající antibiotikum přidá do kultivačního média. Trvalé udržování plazmidů v hostitelském kmenu vyžaduje selekci užitím antibiotika, bez které by docházelo k segregaci a vzniku významného počtu buněk, které neobsahují plazmid a tudíž neexprimují požadovaný produkt. Avšak použití antibiotik při produkci rekombinantních proteinů je z mnoha důvodů nežádoucí. Kromě zjevného zvyšování nákladů je dodávání antibiotik do kultivačního média považováno za značně problematické při výrobě jakýchkoliv rekombinantních proteinů pro použití v humánní nebo veterinární medicíně.
K tomu jsou nejméně tři hlavní důvody. Za prvé, reziduální antibiotika mohou u vnímavých jedinců vyvolat silnou alergickou reakci. Za druhé, existuje možnost selekce bakterií rezistentních k antibiotiku v přirozené bakteriální flóře uživatelů daného proteinového produktu, a nakonec za třetí, DNA kódující rezistenci k antibiotiku by mohla být přenesena do vnímavých bakterií u jedince užívajícího daný proteinový produkt, čímž rezistence k antibiotiku v nežádoucí míře další baktérie.
Existují vynálezy, které se zabývají tímto problémem, a jedním z nich je využití genu par, který účinně usmrtí každou buňku, která neobsahuje kopii plazmidu po každém buněčném dělení [1].
Jiná patentová přihláška [2], která souvisí s předmětem předkládaného vynálezu, popisuje vynález založený na znalosti DNA sekvence thy A z E. coli. Původci vnesli do buněk gen thy A v plazmidu, ale užili hostitelský kmen, kterým byla spontánní mutanta thy A- selektovaná na základě rezistence k trimethoprimu. Takové mutanty však nejsou dobře definovány (nesou bodové mutace nebo malé delece) a mohou snadno divoký typ (tj. thy A+) s nepřijatelně vysokou frek45 věnci. To by vedlo buď k eliminaci plazmidu z hostitelské baktérie a tudíž ke ztrátě produkce nebo k nekonzistentní a nespolehlivé produkci požadovaného rekombinantního produktu. Kromě toho dalším problémem při selekci trimethoprimem je možnost, že výsledná závislost na thyminu vzniká důsledkem mutace v genu pro díhydrofolátreduktázu (folÁ) a tudíž pak není komplementována genem thy A obsaženým v plazmidu [3]. Řízení o této patentové přihlášce bylo navíc zastaveno, alespoň v Evropě.
Bylo ukázáno, že použití V. cholerae pro expresi rekombinantních genů je výhodnější než užití jiných prokaryotických expresních systémů dosud obecně užívaných, a sice proto, že rekombinantní produkty se tvoří ve velkých množstvích a jsou secemovány do kultivačního média, což usnadňuje následující kroky izolace a purifikace. To je odlišné od E. coli, kde se rekombinantní
-1 CZ 301662 B6 produkt zpravidla hromadí v periplazmatickém prostoru [4]. Jedním z důležitých faktorů, který je příčinou této vlastnosti, je gen eps ve V. cholerae [5].
Thymidylátsyntetáza kódovaná genem thyA z E.coli a jiných baktérii katalyzuje methylaci deoxy uridy latu (dIJMP) na deoxythymídylát (dTMP) a je nezbytným enzymem v biosyntéze deoxyribothymidintrifosfátu (dTTP) pro inkorporaci do DNA. V nepřítomnosti tohoto enzymu se baktérie stává závislá na vnějším zdroji thyminu, který je inkorporován do dTTP náhradní metabolickou dráhou zprostředkovanou geny deo [6].
io Spontánní mutanty thy A“ mohou být ihned izolovány na základě rezistence ktrimethoprimu. Toto antibiotikum inhibuje regeneraci tetrahydrofolátu z dihydrofolátu tvořeného při syntéze dTMP katalyzované thymidylátsyntetázou. Takže pokud jsou buňky thy A“, stanou se závislými na thyminu, ale v přítomnosti trimethoprimu již dále nespotřebovávají tetrahy drofo lát.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen na nové nukleotidové sekvenci genu thy A z Vibrio cholera. Gen thy A je výhodně použit k udržování rekombinantních plazmidů, které se užívají k produkci rekombinantních proteinů ve K cholerae, a dále je tato sekvence užita pro vložení cizorodých genů do chromozómu V. cholerae selektovatelným a místně-specifíckým způsobem.
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy kmenu thy A- Vibrio cholerae, který obsahuje krok místně-cílené mutageneze v chromozómu V. cholerae delecí a/nebo inzercí nukleotidů v lokusu genu thy A, který má v podstatě nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 na obr. 1.
Termín „má v podstatě nukleotidovou sekvenci“ v předkládaném popisu a patentových nárocích zahrnuje nukleotidové sekvence, které obsahují nějaké přirozené či umělé prodloužení nebo zkrácení, nebo delece a adice, přičemž však nedochází k ovlivnění původní přirozené funkce této nukleotidové sekvence.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká /AyA'kmenu, kteiým je thyA kmen Vibrio cholerae postrádající funkční gen thy A. V tomto provedení vynálezu kmen Athy A Vibrio cholerae obsahuje jeden nebo několik autonomně se replikujících elementů DNA, které nesou funkci genu thy A, což dovoluje kmenu růst i v nepřítomnosti thyminu v kultivačním médiu. Ve výhodném provedení je autonomně se replikující DNA element plazmid.
V jiném výhodném provedení vynálezu Athy A kmen Vibrio cholerae podle vynálezu obsahuje v epizomálním autonomně se replikujícím prvku DNA, zejména plazmidu,. cizorodý gen thy A, E. coli.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu Athy A kmen Vibrio cholerae podle vynálezu obsahuje vjednom nebo několika epizomálních autonomně se replikujících DNA elementech, zejména plazmidech, kromě cizorodého genu thy A, jako je např. gen z E. coli, také strukturní gen kódující homologní nebo heterologní protein, jako je např. tepelně labilní B-podjednotka enterotoxinu E. coli (LTB) nebo glutathion-S-transferázový protein velikosti 26 kD (GST 26 kD) ze Schistosóma japonicum.
Třetí aspekt předkládaného vynálezu se týká úseku nukleotidové sekvence sousedící s 5'-koncem strukturního genu thy A z Vibrio cholerae, který má v podstatě nukleotidovou sekvenci id. č. 2 na obr. 2.
-2CZ 301662 B6
Čtvrtý aspekt předkládaného vynálezu se týká úseku nukleotidové sekvence sousedícího s3'koncem strukturního genu /Ary A z Vibrio cholerae, který má v podstatě nukleotidovou sekvenci id. č. 3 na obr. 3.
Nukleotidová sekvence id. č. 1 je užitečná pro vkládání cizorodých genů selektovatelným a místně cíleným způsobem do chromozómu V. cholerae a pro místně cílenou mutagenezí při přípravě kmenů thy A Vibrio cholerae.
Pátý aspekt předkládaného vynálezu se týká proteinu, „který je kódován nukleotidovou sekvencí genu thy A z Vibrio cholerae podle předkládaného vynálezu, jako je např. protein mající aminokyselinovou sekvenci id. č. 4 na obr. 4.
Šestý aspekt předkládaného vynálezu se týká proteinu, který je kódován nukleotidovou sekvencí úseku lemujícího 5-konec strukturního genu thy A z Vibrio cholerae podle vynálezu, jako je např. protein, který má aminokyselinovou sekvenci Íd. č. 5 na obr. 5.
Proteiny podle pátého a šestého aspektu předkládaného, jsou zvláště užitečné pro účely výzkumu potenciální cíle antimíkrobiální terapie.
Sedmý aspekt předkládaného vynálezu se týká vakcíny, která obsahuje jakožto imunizační složku Mhy A kmen V. cholerae podle vynálezu nebo thy A' kmen Vibrio cholerae připravený způsobem podle vynálezu. Vakcína je určena pro použití k profylaxi nebo k léčení cholery a případně i jiných infekčních nemocí, zvláště v případě, kdy použitý kmen byl metodami genového inženýrství modifikován tak, aby exprimoval cizorodé proteiny. Vakcína kromě imunizační složky obsahuje vehikulum, např, fyziologický roztok, a daiší složky obvykle užívané ve vakcínách jako jsou pufry a adjuvans. Vhodná vehikula, pufry a adjuvans a další složky jsou odborníkům známy a jsou popsány např. v Evropském lékopisu nebo Lékopisu USA.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci id. č. I genu thy A z Vibrio cholerae.
Obr. 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci id. Č. 2, tj. sekvenci 5'-lemujícího úseku strukturního genu thy A z Vibrio cholerae.
Obr.3 ukazuje nukleotidovou sekvenci id. č. 3, tj. sekvenci 3'-lemujícího úseku strukturního genu thy A z Vibrio cholerae.
Obr. 4 ukazuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 4, tj. sekvenci proteinu kódovaného strukturním genem thy A z Vibrio cholera.
Obr. 5 ukazuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 5, tj. sekvenci proteinu kódovaného 5-lemujícím úsekem strukturního genu thy A z Vibrio cholera.
Obr, 6 ukazuje klonování fragmentu EcoRPHindffl, který obsahuje gen thy A z Vibrio cholerae, do pUC19.
Obr. 7 ukazuje srovnání produktů genu thy A z E. coli [16], V. cholerae a H. influenzae [17], které so demonstruje vysoký stupeň homologie mezi V. cholerae a H. influenzae, na rozdíl od E. coli.
Obr. 8 ukazuje inzerci bloku genu kanamycinové rezistence KanR do místa Pstl v genu thy A z Vibrio cholerae v pUC 19.
Obr. 9 ukazuje polymerázovou řetězovou reakci (PCR) pro fragmentu Zy/íZ-Kan s konci XbaL
-3CZ 301662 B6
Obr. 10 ukazuje ligaci fragmentu í/ryJ-Kan s konci Xbal do plazmidu pNQ705.
Obr. 11 ukazuje částečnou delecí genu thyA a počátku genu Kan Tf pNEB193.
Obr. 12 ukazuje štěpení Xbal, kterým byl vystřižen gen A/AryAKan z pNEB193 a ligaci do pDM4 naštěpeného Xbal.
Obr. 13 schematicky znázorňuje strategii kúplnému odstranění (úplné deleci) genu thyA io zVibrio cholerae.
Obr. 14 ukazuje vložení 5-úseku proti směru transkripce od genu thyA vpMT-SUICIDE a vytvoření pMT s 5prim.
Obr. 15 vložení 3'-úseku po směru transkripce (downstream) od genu thyA v pMT s 5prim a vytvoření ρΜΤΔ/AyA V. cholera.
Obr. 16 ukazuje expresní vektor pMT-eltB (thyA) použitý pro expresi LTB v V, cholerae JS 1569 MhyA.
Obr. 17 ukazuje expresní vektor pMT-GST (thyA) použitý pro expresi GST v V. cholerae JS 1569 Mhy A.
Příklady provedení vynálezu Strategie experimentů
Pro přípravu definovaných thy A mutant K cholerae, které mohou být užity jako vhodné produk30 ční kmeny pro přípravu rekombínantních proteinů kódovaných plazmidy, které jsou udržovány komplementací thyA bylo nejdříve potřeba klonovat a charakterizovat gen divokého typu a úseky lemující jeho 5 - a 3'-konec. Zvolená strategie byla taková, že nejdříve byl klonován gen thyA z V. cholerae do plazmidu, a to pomocí komplementace thy A auxotrofie kmenu E. coli K12.
Restrikční analýza a subklonovací experimenty byly provedeny proto, aby byl lokalizován strukturní gen thyA ve velkém fragmentu DNA, který byl nejdříve získán. Vhodný úsek obsahující gen thyA a úseky lemující jeho 5' - a 3- konec (5 - a 3'-lemuj ící úseky) byl pak sekvencován.
Pro ověření toho, že byl klonován a sekvencován skutečně gen thyA z V. cholerae bylo provede40 no srovnání se sekvencemi thyA z jiných organismů. Klonovaný gen byl navíc schopen komplementovat thy A fenotyp Vibrio cholerae získaný selekcí na rezistenci k trimethoprimu. Analýza sekvence této mutanty ukázala, že v genu, který byl identifikován jako gen thyA, obsahuje skutečně jednu nukleotidovou záměnu, kterou vzniká stop-kodon a tudíž gen poskytuje nefunkční zkrácený produkt.
Znalost sekvence genu thyA a úseků lemujících tento gen umožnila využít vhodné suicidální („sebevražedné“) vektory pro místně-cílenou mutagenezi. Byly zvoleny následující strategie:
a) inzerční inaktivace, so b) kombinace inzerční inaktivace a delece genu, a c) odstranění celého genu, které jsou dále podrobněji popsány:
-4CZ 301662 B6
a) Inzerční inaktivace genu thy A byla provedena vložením genového bloku KanR (se suicidálním vektorem pNQ705 [14]).
b) Delece úseku přibližné velikosti 400 bp byla provedena u kmenu nesoucího blok KanR, čímž byl odstraněn úsek velikosti asi 200 bp jak z genu thy A proti směru transkripce od místa inzerce, tak i z genu KanR rezistence ke kanamycinu, který tím byl inaktivován. Byl tak získán deletovaný gen thy A, kde delece byla v centrální Části genu, a pak následovala inzerce nekódujícího úseku DNA. Tento konstrukt byl vložen, do chromozómu V. cholerae pomocí suicidálního vektoru pDM4 výsledný kmen byl pojmenován JS 1569A/ZryAAKan.
10
c) Úplné odstranění genu thy A bylo provedeno vzájemnou ligací (spojením) úseků lemujících strukturní gen, přičemž byla věnována pozornost tomu, aby se nenarušily další otevřené čtecí rámce (narušení přilehlého genu Igt je také letální). DNA nesoucí delecí byla klonována nového suicidálního vektoru (PMT-SUICIDE-I) užitého k vložení sekvence do chromozó15 mu T. cholerae. Výsledný kmen byl pojmenován JS 1569A/AyA.
Pro expresi rekombinantních genů v těchto AthyA kmenech V. cholerae byly zkonstruovány dva expresní vektory. Každý obsahoval thy A gen z E. coli, replikační počátek z obecně užívaného víceúčelového vektoru pUC 19, promotor tac a terminátor transkripce trp A nezávislý na faktoru rhó. V jednom z těchto vektorů byl vložen také gen Iaclq, aby reguloval expresi z promotoru tac, který obsahuje také sekvenci lac operátoru. Do těchto plazmidů byly klonovány dva geny a byly exprímovány vnově vytvořených kmenech V. cholerae s delecí thy A, JS1569A//ryA. První gen kódoval B-subjednotku lidského tepelně zE. coli (LTB) (viz obr. 16) a druhý labilního enterotoxinu byl gen sj26 kódující glutathion-S-transferázu (GST) ze Schistosoma japonicum (viz obr. 17).
LTB je strukturně podobný B-podjednotce cholerického toxinu přirozeně produkovaného hostitelským kmenem a byl secemován do kultivačního média. Druhý protein je eukaryotického původu a pochází z asijské jatemí motolice. Sj26 GST exprimována ve vysoké hladině v E. coli a aku30 muluje se v cytoplazmě. Exprese obou rekombinantních proteinů byla vyhodnocena v případě LTB pomocí GM1 ELISA testu supematantu kultivačního média a v případě GST pomocí komerčně dostupného testu. Oba proteiny byly také analyzovány pomocí SDS-PAGE a westernovým přenosem.
Původ genu thy A
Gen thy A byl klonován z kmenu K cholerae JS 1569. Tento kmen pochází z kmenu V. cholerae Inaba 569B klasického biotypu (sbírka ATCC č. 25870). Kmen má deleci v genu ctxA [7] a byl modifikován tak, že získal rezistenci k rifampicinu [8].
Klonování fragmentu HindlII/EcoRI velikosti 1.4 kb obsahujícího gen thy A. z K cholerae
Chromozómová DNA připravená metodou užívající CTAB [9] byla úplně štěpena restrikčním enzymem HindlII. Naštěpená DNA byla ligována do obecně užívaného vektoru pBR322 (New
England Biolabs, lne., Beverly, MA, USA), který byl předtím štěpen HindlII a ošetřen alkalickou fosfatázou. Ligační směs byla elektroporací [10] vnesena do buněk kmenu E. coli HB 101, který byl feno typově thy A' (selektován na základě rezistence k trimethoprimu) a kultury byly naneseny na plotny s modifikovaným Syncase (MS) agarem [11], s přídavkem ampicilinu, ale neobsahovaly thymin. Takže transformanty byly selektovány jak na základě toho, že obsahovaly získaný plazmid, tak i na přítomnost funkčního genu thy A. Buňky byly izolovány tak, že buňky z jediné kolonie byly očkovací kličkou přeneseny na stejný typ agarových ploten a rostly pak na médiu MS s ampicilinem. Plazmidová DNA byla izolována užitím soupravy „Wizard minipreps“ (ProMega Corp. Madison Wis.) a pak naštěpena HindlII. Fragment o velikosti 10 až 12 kb byl izolován a tento klon byl nazván Thy A. B2.
•5CZ 301662 B6
Aby se zmenšila velikost fragmentu, byl plazmid naštěpen EcoRl a znovu spojen T4 li gázou.
Ligovaná DNA byla elektroporací opět vnesena do buněk kmenu E. coli popsaného výše za stejných selekčních podmínek pro růst transformant. Kolonie vzniklé z této transformace byly izolovány, jak bylo popsáno výše, a byla izolována plazmidová DNA, která byla analyzována dvojitým štěpením EcoRl a HindlIL Zůstal fragment DNA velikosti přibližně 1,4 kb, který umožňoval komplementovat thy A mutaci v hostitelském kmenu E. coli. Tento fragment byl klonován do plazmidu pUC19 (New England Biolabs), který byl naštěpen stejnými dvěma enzymy a ošetřen alkalickou fosfatázou. Po elektroporací byly transformanty z tohoto experimentu izolovány stejně jak bylo popsáno výše. Tento klon byl nazván thy A 1:2 (obr. 6).
io
Ověření fragmentu HindlII!EcoRl velikosti 1,4 kb obsahujícího gen thy A
Pro ověření toho, že fragment skutečně pocházel z chromozómu V. cholerae, byla DNA z kmenu JS 1569 úplně naštěpena HindlII a EcoRl společně s HindlIL Fragmenty DNA pak byly analy15 zovány elektroforézou na agarozovém gelu společně s klonem Thy A B2 naštěpeným HindlII a klonem thy A 1:2 naštěpeným EcoRl a HindlII. Po elektroforéze byla DNA přenesena na nylonovou membránu, imobilizována UV zářením a pak hybridizována (za stringentních podmínek) s fragmentem velikosti 1,5 kb vystřiženým z klonu thy A 1:2, který byl označen 32P dCTP užitím soupravy Multiprime kit od firmy Amersham.
Výsledky: Jak v chromozómové DNA štěpené; HindlII, tak klonu Thy A B2 štěpeném HindlII byl evidentní fragment velikosti přibližně 10 kb. Stejně tak v chromozómové DNA štěpené EcoRl!HindlII tak klonu thy A 1:2 štěpeném EcoRl!HindlII byl evidentní fragment velikosti přibližně 1,4 kb (data nejsou ukázána). To dokazuje, že klonovaný fragment pocházel z DNA
V. cholerae JS 1569.
Transformace J51569 thy A“ plazmidem thy A 1:2
Pro ověření toho, že klonovaný fragment EcoRl!HindlII podporuje růst V. cholerae fenotypu thyA-, mutanta závislá na thyminu JS 1569 (V. cholerae JS 1569 4.4) byla elektroporací transformována plazmidem thy A 1:2. Elektroporace a selektivní médium byly popsány výše. Mutanta JSI 569 4.4 nerostla na médiu MS bez přídavku thyminu.
Výsledky: Byly izolovány kolonie JS 1569 4.4, které rostly na médiu bez thyminu. Bylo ukázáno, že všechny nesly plazmid thy A 1:2, což podporuje předpoklad, že klonovaný fragment obsahuje gen thyA z K cholerae.
Sekvencování DNA z plazmidu Thy A 1:2
Plazmidová DNA byla sekvencována metodou využívající terminace syntézy řetězce dideoxynukleotidy [12], a sice pomocí sekvenační soupravy ABI PRISM™ Dye terminátor cycle sequencing kit (Perkin Elmer). Byly použity jak komerčně dostupné tak i vlastní oligonukleotidové primery. Sekvence DNA byla analyzována na automatickém sekvenačním zařízení ABI PRISM 373 (Perkin Elmer) a získaná data byla analyzována užitím softwaru AutoAssembler
Software Package (Perkin Elmer). Dále byla data analyzována vyhledáváním homologických sekvencí pomocí programu GCG [13].
Výsledky: Jako gen s nej lepší homologií byla nalezena thymidylátynthetáza z různých biologických druhů. Za povšimnutí stojí, že homologie s thymidylátsynthetázou zE. coli je velmi slabá (obr. 7).
-6CZ 301662 B6
Strategie pro deleci genu thyA z V. cholerae JSI569
Pro získání definovaných thy A mutant V. cholerae byly použity dvě strategie. První zahrnuje ínaktivaci genu thyA vložením genového bloku KanR a pak následnou parciální deleci genu thy A a genového bloku KanR.
Druhá strategie je zaměřena na úplnou deleci genu thyA z chromozómu V. cholerae pomocí nového suicidálního vektoru pMT SU1CIDE-1. Tento vektor obsahuje 5 - a 3-lemující úseky to genu thyA a také replikační počátek R6K a geny RP4 mob.
K nahrazení genu thyA kmenu JS 1569 bylo rozhodnuto použít na thyminu závislý J51569 4.4, neboť předběžné pokusy ukázaly, že je zde silná selektivní nevýhoda pri přechodu z divokého typu na thyminovou závislost, dokonce i za přítomnosti vysoké hladiny exogenního thyminu.
Inaktivace genu thyA inzercí genového bloku KanR
Zde strategie zahrnovala ínaktivaci genu thyA inzercí (vložením) genu rezistence ke kanamycinu do jedinečného místa Pstl v genu thyA ve formě genového bloku KanR (Pharmacia) (viz obr. 8).
Tento konstrukt byl amplifikován pomocí PCR (užitím systému Expand™ High Fidelity PCR, Boehringer Mannheim) s oligonukleotidovými primery, které vnesly do konstruktu konce Xbal, aby mohl být vložen do suicidálního plazmidů pNQ705 [14], který nesen jedinečné místo Xbal v genu rezistence k chloramfenikolu. Pro amplifikaci inzerčně inaktivovaného genu v PCR byly použity následující oligonukleotidové primery:
ThyA-10: 5»- GCT CTA GAG CCT TAG AAG GCG TGG TTC -3’, odpovídající nukleotidům 557 až 575 v sekvence id. č. 2 (obr. 2) s přidaným místem Xbal (tučně), a
ThyA-ll: 5'- GCT CTA GAG CTA CGG TCT TGA TTT ACG GTA T -3', odpovídající komplementární sekvenci nukleotidů 235 az 257 v sekvenci id. č. 2 (obr. 3) s přidaným místem, Xbal (tučně) (obr. 9 + 10) .
Výsledné plazmidy byly vneseny do E. coli S-l 7, které byly užity pro konjugaČní experimenty.
Jelikož recipientní kmen JS 1569 4.4 je rezistentní rífampicinu a senzitivní k chloramfenikolu adonorový kmen E,coli S-l7 je rezistentní jak k chloramfenikolu, tak kanamycinu, transkonjuganty byly selektovány na rezistenci k dvěma antibiotikům, rífampicinu a kanamycinu. Výsledné kmeny K cholerae budou však rezistentní také k chloramfenikolu, neboť celý plazmid bude na počátku vložen do chromozómu. Exkonjuganty, které inkorporovaly inaktivovaný gen thy A nesoucí genový blok KanR do chromozómu a ztratily plazmid pNQ705 pak mohou být selektovány z těch, které jsou citlivé k chloramfenikolu, ale zůstaly rezistentní ke kanamycinu.
Pro ověření inzerce genu rezistence ke kanamycinu do genu thy A byl celý gen thy A amplífikován pomocí PCR s oligonukleotidovými primery thyA-10 a /ÁyA-l 1, a velikost takto vznik40 lého fragmentu byla porovnána s velikostí nativního genu thy A. Byl nalezen očekávaný fragment velikosti 2,6 kb na rozdíl od nativního genu thy A velikosti 1,4 kb.
-ΊCZ 301662 B6
Výsledky: Exkonjuganty byly rezistentní ke kanamycinu a vnímavé ke chloramfeníkolu a když byly amplifikovaný pomocí PCR, ukázalo se, že mají do chromozómu vložený genový blok
KanR. Sekvencování amplifikovaného fragmentu ukázalo, že jediný defekt v genu byl způsoben inzercí genu rezistence ke kanamycinu. To ukazuje, že rekombinační událost, která vedla k inkorporaci inzerčně inaktivovaného genu do chromozómu, také eliminovala bodovou mutaci, která způsobovala, že recipientní kmen (JS 1569 4.4) byl závislý na thyminu. Růst získaných kmenů byl pozorován pouze, když bylo kultivační médium obohaceno thyminem (200 pg/ml).
io Částečná delece genu thy A. a genového bloku KanR
Pro další zajištění stálosti mutace thy A byl inzerčně inaktivovaný thy A subklonován jako Xbal fragment do plazmidu pNEB 193 ,(New England Biolabs). PCR primery byly navrženy tak, že došlo k delecí úseku 209 páru bází z genu thy A a 261 páru bází z genového bloku KanR.
Takže gen /AyA byl dále narušen a také gen rezistence ke kanamycinu byl inaktivován (tím, že byl odstraněn počáteční úsek kódující oblasti). Celkovým výsledkem tohoto postupu byl kmen nesoucí deletovaný gen thy A, který současně obsahuje inzerci nekódující DNA.
ThyA-14: 5’- GGG GGC TCG AGG GGC ACA TCA CAT GAA -3' ThyA-15: 5‘- CCC CCC TCG AGC GCC AGA GTT GTT TCT GAA -3'
Tučná písmena označují štěpné místo Xhol (obr. 11).
Po PCR amplifikaci byl získán fragment DNA obsahující celý plazmid s výjimkou deletované oblasti. Amplifikovaná DNA byla štěpena Xhol, self-lígována (konce jedné molekuly byly navzájem spojeny) a pak byla transformována do buněk kmenu E. coli HB 101. Kolonie pak byly selektovány na plotnách obsahujících ampicilin. Byly izolovány jednotlivé kolonie a znovu očkovací kličkou naneseny na plotny. DNA získaná minipreparací plazmidu z jednotlivých kolonií po štěpení restrikčními enzymy Xbal, Xhol, Hindffl a Rsal poskytla očekávaný restrikční vzorec.
Neúplný gen thy A nesoucí inaktivovaný gen rezistence ke kanamycinu byl z vektoru vyštěpen enzymem Xbal, purifikován a ligován do plazmidu pDM4 [15] (viz obr, 15). PDM4 je suicidální vektor odvozený zpNQ705 obsahující gen SacBR z Bacillus subtilis a modifikované vícečetné klonovací místo.
Po přenosu plazmidu pDM4 (A//íyAAKan) do buněk kmenu E. coli S—17 byly provedeny trans35 konjugační experimenty, V tomto případě byl kmen V, cholerae JS 1569 Z/iyAKan použit jako recipientní kmen. Konjugace byla provedena, jak bylo popsáno výše se selekcí na rezistenci k rifampicinu a chloramfeníkolu. Po růstu na tomto selekčním médiu byly kolonie dále selektovány na médiu obsahujícím 10% sacharózu bez přítomnosti chloramfeníkolu, Saeharóza indukovala gen sacBR, který kóduje enzym levansacharázu, který přeměňuje sacharózu na levan. Tato slou40 cenina je toxická pro většinu Gram-negativních organismů. Tímto způsobem byly usmrceny klony nesoucí sebevražedný plazmid a byly zachovány pouze exkonjuganty, které plazmid ztratíly·
Výsledky: byla selektována kolonie vnímavá k chloramfeníkolu a kanamycinu. PCR amplifikace úseku thy As primery ΓΛγΑ-ΙΟ a ThyA-11 potvrdila, že fragment „thy A Kan“ (2,6 kb) v chromozómu byl nahrazen fragmentem „Mhy A AKan“ (2,1 kb). Růst výsledného kmene byl pozorován pouze když do kultivačního média byl přidán thymin (200 pg/ml). Kmen byl pojmenován V. cholerae JSI569 A/AyAAKan,
-8CZ 301662 B6
Přímá delece genu Z/ry A z E cholerae
Pro tento experiment byly užity 5- a 3-lemující sekvence genu thy A. Byl zkonstruován nový suicidální vektor pMT SUICIDE-1 (obr. 14), který obsahuje replikační počátek R6K, gen mob z RP4, gen rezistence k chloramfenikolu a vícečetné klonovací místo z plazmidu Litmus (New England Biolabs). Byl připraven modifikovaný fragment, kde kódující oblast genu thy A byla nahrazena vícečetným klonovacím místem (odvozeným z Litmus 28) a byly ponechány jen úseky lemující 5'a 3-konec lokusu thy A V. cholerae (tzv. 5' a 3-lemující úseky). Takto vzniklý plazmid byl použit k vytvoření kmenu E cholerae, kde je odstraněn celý gen thy A.
o
Jako výchozí materiál pro tuto konstrukci byl použit plazmid pMT SUICIDE-l (poskytl M. Lebens, nepublikováno). Na základě 5' a 3'-lemujících ůseků lokusu thy A byly navrženy následující oligonukleotidové primery:
ThyA-33: 5'- GGA CTA GTG GGT TTC CTT TTT GCT AT -3', odpovídající nukleotidům 109 až 126 v sekvence id. č. 2 (obr.
2) (5-úsek oblasti thy A) se štěpným místem Spěl (označeno tučně) a
ThyA-34: 5'- CCC CGC TCG AGA CCC TAT TTT GCT GCT AC -3', odpovídající komplementární sekvenci bází 815 až 832 v sekvence id. č. 2 s připojeným štěpným místem Xhol (označeno tučně).
Tento pár oligonukleotidových primerů poskytuje v PCR fragment velikosti 743 baží odpovídající 5'-lemujícímu úseku genu thy A.
ThyK-31: 5'- CGG GGT ACC TGG CTT GAT GGG TTT TAT -3', odpovídající nukleotidům 22 až 39 v sekvence id. č. 3 {obr.
3) (3-lemující úsek lokusu thyA) se štěpným místem KpnI (uvedeno tučně), a
ThyA-32: 5'- GAA GGC CTT CGC CTC TGC TTG CGA CT -3', odpovídající komplementární sekvenci bází 731 až 749 v sekvence id. č. 3 se štěpným místem Stul (uvedeno tučně).
Tento pár oligonukleotidových primerů v PCR poskytuje fragment velikosti 746 baží odpovídající 3'-lemujíčímu úseku genu thy A.
-9CZ 301662 B6
Jako templát pro PCR byl použit preparát chromozómové DNA z f cholerae JSI569 (obr. 13).
Amplifikovaná DNA byla naštěpena vhodnými restrikčními enzymy a klonována do vektoru pMT-SUICIDE 1 (obr. 14 a 15), čímž byl vytvořen plazmid ρΜΤΔζΛχΑ V. cholerae, který obsahuje asi 700 bp dlouhý úsek upstream (proti směru transkripce) od 5 -konce genu thy A a stejně velký úsek downstream (po směru transkripce) od 3-konce genu thy A (tj. 5 - a 3'lemující úseky).
Tento plazmid byl vnesen do E. coli S17—1 a použit v konjugaěních experimentech jak bylo již io popsáno výše. Jako příjemce (recipient) byl použit kmen V. cholerae JSI569 4.4. Konjugace byla provedena na LB agaru s přídavkem rifampicinu, chloramfenikolu a thyminu. Exkonjugáty, které ztratily sebevražedný plazmid byly selektovány na základě vnímavosti k chloramfenikolu.
Výsledky: Kolonie vnímavé k chloramfenikolu a rezistentní k rifampicinu byly selektovány. PCR amplifikace thy A s primery TAyA-lO a ThyA-11 vedla ke vzniku velikosti 1,4 kb z nativního genu thy A a fragmentu velikosti 0,6 kb z genu Athy A. Tím bylo potvrzeno, že gen thy A byl v chromozómu deletován. Kromě toho 'tyto baktérie byly schopné růstu pouze na médiu s přídavkem thyminu. Tento kmen byl pojmenován V. cholerae J51569.
Exprese B-podjednotky teplotně labilního enterotoxinu z E. coli (LTB) a sj26 glutathion-Stransferázy (GST) ze Schistosoma japonicum ve V. cholerae JS1569 AthyA
Byly zkonstruovány expresní vektory, obsahující gen thy A z A. coli, replikační počátek z vektoru s vysokým kopií pUC19, promotor tac a terminátor transkripce trp A nezávislý na faktoru rhó.
V jednom z těchto dvou vektorů byl vložen gen /aclq, aby byla regulována exprese z promotoru tac, který obsahuje také sekvenci lac operátoru (obr. 16 a 17).
Exprese proteinu LTB v kmenu V. cholerae JSI569 AthyA
Expresní vektor ukázaný na obr. 16 byl eíektroporací vnesen do buněk V. cholerae JSI569 AthyA. Transformanty byly selektovány na MS-agaru. Jednotlivé kolonie byly namnoženy, aby bylo možné provést minipreparaci plazmidů, které pak byly ověřeny restrikční analýzou. Pro expresi byly transformanty kultivovány na, MS médiu při teplotě 37 °C v protřepávané kultuře. Kultivační médium pak bylo odebráno a testováno na přítomnost LTB testem GM1-ELISA.
Výsledky: V testu GM1-ELISA bylo zjištěno, že kultura vyprodukovala alespoň 300 pg/ml LTB. SDS-PAGE a westernový přenos se specifickými monoklonálními protilátkami dále že secernovaný protein byl LTB.
Exprese proteinu GST v kmenu K cholerae JSI569 AthyA
Gen sj26 glutathion-S-transferázy (GST) ze Schistosoma japonicum byl klonován do expresního vektoru uvedeného na obr. 17. Tento vektor je shodný s prvním vektorem, až na sekvenci genu faclq, která dovoluje regulovat expresi rekombinantního proteinu. Vektor byl eíektroporací vnesen do buněk V. cholerae JSI569 AthyA. Transformanty byly selektovány na MS-agaru. Jednotlivé kolonie byly namnoženy, aby bylo možné provést minipreparaci plazmidů, které pak byly ověřeny restrikční analýzou. Pro expresi byly transformanty kultivovány na MS médiu při teplotě 37 °C v protřepávané kultuře s přídavkem IPTG.
Výsledky: Rekombinantní protein byl nalezen v cytoplazmě V. cholerae SDS-PAGE a westernový přenos s monoklonálními protilátkami specifickými k GSM (Pharmacia BioTech, Uppsala) potvrdily, že byl exprimována skutečně GST. Hladinu exprese bylo obtížné stanovit, neboť GST protein byl exprimován intracelulámě, ale byla zhodnocena jako přibližně shodná s hladinou LTB.
- 10CZ 301662 B6
Použitá literatura
I. Molin, S., K. A. Gerdes. 1984. Stabilized plasmids. US Patent 4,760,022.
2. Morona, R., and S. R. Attridge. 1987. Non-antibiotic markér systém. EPC-A-0251579.
3. Green, J.M., Β. P. Nichols, and R. G. Matthews. 1996. Folate biosynthesis, reduction and polyglutamylation. In; F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, Κ. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and Η. E. Umbarger (Eds.) Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. ASM Press Washington D.C. pp665-673.
4. Neill, R. J., Β. E, Ivins, and R. K. Holmes. 1983. Synthesis and secretion of the plasmidcoded heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in Vibrio cholerae. Science. 221:289-290.
5. Sandkvist, Μ., M. Bagdasarian, S. P. Howard, and V. J. DiRita. 1995. Interaction between the autokinase EpsE and EpsL in the cytoplasmic membrane is required for extracellular secretion in
Vibrio cholerae. EMBO J, 14: 1 664-1 673.
6. Neuhard, J. and R. A. Kelln. 1996. Biosynthesis and conversions of pyrimidines. In: F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, Κ. B. Low, B. Magasanik,
W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and Η. E. Umbarger (Eds.) Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. ASM Press Washington D.C. pp580-599.
7. Kaper, J. Β., H. Lockman, Μ. M. Baldini, and Μ. M. Levine. 1984. A recombinant live oral cholera vaccine. Biotechnology 2: 345-349.
8. Sanchez, J., and J. Holmgren. 1989. Recombinant systém for overexpression of cholera toxin B subunit in Vibrio cholerae as a basis for vaccine development. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 86: 481—485.
9. Wilson, K. 1994. Preparation of genomic DNA from Bacteria. In Current protocols in Biology (F.A. Ausubel, R. Brent, R.E. Kíngston, D.D. Moore, J. G. Seidman, J.A. Smith, and K. Struhl, eds.) pp, 2.4.1-2.4.2 John Wiley & Sons, New York.
10. Sheen, J. 1994. High-efficency transformation by electroporation. In Current protocols in
Molecular Biology (F.A. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman,
J. A. Smith, and K. Struhl, eds.) pp. 1.8.4-1,8.5. John Wiley & Sons, New York.
11. Lebens, M., S. Johansson., J. Osek., M. Lindblad and J. Holmgren. 1993. Large-scale production of Vibrio cholerae toxin B subunits for use in oral vaccines. Biotechnology. 11: 1574—
1578.
12. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5 463-5 467.
13. Program Manual for the Wisconsin Package. Version 8. September 1994. Genetics Computer
Group, 575 Science Drive, Madison Wisconsin.
14. Milion, D. L., A. Nordqvist, and H. Wolf-Watz. 1992. Cloning a metalloprotease gene involved in the virulence mechanism of Vibrio anguillarum J. Bacteriol. 174: 7235-7244.
15. Milton, D. L., R. 0'Toole, P. Hógstedt, and H. Wolf-Watz. 1996. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum J. Bacteriol. 176: 1310—1319.
- 11 CZ 301662 B6
16. Belfort, M., G. Maley, J. Pedersen-Lane and F. Maley. 1983. Primary tnicture of the
Escherichia coli thyA gene and its thymidylate synthase product. Proč. Nati, Acad. Sci. USA 80:
4914-4918.
17. Fleischmann, R. D,, Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F., Kerlavage,
A. R., Bult, C J., Tomb, J-F., Dougherty, B. A., Merrick, J. M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fileds, C. A., Gocayne, J. D., Scott, J. D., Shirely, R,, Liu, L.-L, Glodek, A., Kelley, J.M. Weidman, J. F., Phillips, C. A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D., Utterback, T. R., Hanna, M. C., Nguyen, D. T., Saudek, D. M., Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritchman, J. L,, io Fuhrmann, J, L,, Geoghagen N.S.M., Gnehm, C. L., McDonald, L. A., Smáli, K. V., Fraser, C. M., Smith, H. O., and J. C. Venter. 1995. Whole-genome random sequencing and assembly of
Haemophilus influenzae RD. Science 269: 496-512.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY20 1. Kmen Mhy A Vibrio cholerae postrádající v chromozomu celý gen thyA, který má nukleotidovou sekvenci id. č. 1, nebo kmen AthyA Vibrio cholerae obsahující v genu thyA deleci a současně inzerci nekódující DNA, připravitelný způsobem, který zahrnuje kroky:poskytnutí thymin-dependentního kmene Vibrio cholerae, provedení místně-cílené inzerce genu kanamycinové rezistence ve formě genového bloku KanR do Pstl místa genu thyA, a delece 209 párů bází z genu thyA upstream od místa inzerce a 261 párů bází z genového bloku30 KanR, čímž se získá kmen AthyA.
- 2. Kmen A//ryA Vibrio cholerae podle nároku 1 obsahující jeden nebo několik episomálních35 autonomně se replikujících DNA elementů majících funkční gen thyA, což umožňuje kmenu růst v růstovém médiu za nepřítomnosti thyminu, přičemž jeden nebo několik episomálních autonomně se replikujících DNA elementů dále obsahuje strukturní gen kódující protein,
- 3. Kmen AthyA Vibrio cholerae podle nároku 2, kde episomální autonomně se replikující DNA40 element je plazmid.
- 4. Kmen AthyA Vibrio cholerae podle nároku 2, kde episomální autonomně se replikující DNA element obsahuje cizorodý gen thyA.45
- 5. Kmen AthyA Vibrio cholerae podle nároku 4, kde cizorodý gen thyA je gen z E. coli.
- 6. Kmen AthyA Vibrio cholerae podle nároku 2, kde kódovaný protein je vybrán z B-podjednotky tepelně labilního enterotoxinu Escherichia coli (LTB) a glutathion-S-transferázového 26 kD proteinu ze Schistosoma japonicum (GST 26 kD).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9801852A SE9801852D0 (sv) | 1998-05-26 | 1998-05-26 | Method of producing thy A-strains of Vibro cholerae, suck strains and their use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20004354A3 CZ20004354A3 (en) | 2001-05-16 |
| CZ301662B6 true CZ301662B6 (cs) | 2010-05-19 |
Family
ID=20411459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20004354A CZ301662B6 (cs) | 1998-05-26 | 1999-05-21 | Kmen deltathyA Vibrio cholerae postrádající funkci genu thyA |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7261899B1 (cs) |
| EP (1) | EP1080211B1 (cs) |
| AT (1) | ATE474055T1 (cs) |
| AU (1) | AU4499999A (cs) |
| BR (1) | BR9910703B1 (cs) |
| CA (1) | CA2329255C (cs) |
| CZ (1) | CZ301662B6 (cs) |
| DE (1) | DE69942579D1 (cs) |
| DK (1) | DK1080211T3 (cs) |
| EE (1) | EE05520B1 (cs) |
| HU (1) | HUP0102310A3 (cs) |
| IS (1) | IS2904B (cs) |
| NO (1) | NO327856B1 (cs) |
| PL (1) | PL197450B1 (cs) |
| RU (1) | RU2265657C2 (cs) |
| SE (1) | SE9801852D0 (cs) |
| WO (1) | WO1999061634A1 (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CU22661A1 (es) * | 1997-12-30 | 2001-04-27 | Cnic Ct Nac Investigaciones | Nuevos candidatos vacunales de vibrio cholerae y método de obtención |
| SE9801852D0 (sv) * | 1998-05-26 | 1998-05-26 | Sbl Vaccin Ab | Method of producing thy A-strains of Vibro cholerae, suck strains and their use |
| RU2193598C1 (ru) * | 2001-07-26 | 2002-11-27 | Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" | Штамм бактерий vibrio cholerae km 200 - продуцент холерного токсина и токсин - корегулируемых пилей адгезии |
| GB0121998D0 (en) | 2001-09-11 | 2001-10-31 | Acambis Res Ltd | Attenuated bacteria useful in vaccines |
| RU2236455C1 (ru) * | 2003-10-27 | 2004-09-20 | Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" | Штамм бактерий vibrio cholerae км 168 - основа для конструирования живых вакцин против диарейных заболеваний, вызываемых патогенными штаммами v. cholerae о139 |
| GB0325494D0 (en) * | 2003-10-31 | 2003-12-03 | Sbl Vaccin Ab | Expression system |
| JP2010088301A (ja) * | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| DK3503915T5 (da) * | 2016-08-26 | 2024-09-02 | Telesis Bio Inc | Genetisk modificerede Vibro natriegen |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0251579A2 (en) * | 1986-06-24 | 1988-01-07 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| US5470729A (en) * | 1983-03-04 | 1995-11-28 | University Of Maryland At Baltimore | Method of isolating restriction fragment deletions in Vibrio cholerae, and products thereof |
| EP1080211A1 (en) * | 1998-05-26 | 2001-03-07 | Active Biotech AB | Method of producing thy-a-deficient strains of vibrio cholerae, such strains and their use |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5399494A (en) * | 1983-03-04 | 1995-03-21 | The University Of Maryland System | Vibrio cholerae strain CVD103Hgr, method of making same, and vaccines derived therefrom |
| GB2177097A (en) | 1985-06-18 | 1987-01-14 | Genencor Inc | Stable maintenance of nucleic acid in recombinant cells |
| US5198343A (en) | 1986-08-05 | 1993-03-30 | Transgene, S.A. | Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained |
| IE892131A1 (en) * | 1989-06-30 | 1991-01-02 | Univ Cork | Marker genes for genetic manipulation |
| CA2156191A1 (en) * | 1993-02-22 | 1994-09-01 | Stephen B. Calderwood | Heterologous antigens in live cell vaccine strains |
| US5434065A (en) * | 1993-05-06 | 1995-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | In vivo selection of microbial virulence genes |
| MX9703017A (es) * | 1994-10-24 | 1997-10-31 | Texas A & M Univ Sys | Inmunizacion oral con plantas transgenicas. |
| US6251866B1 (en) * | 1997-08-05 | 2001-06-26 | Watson Laboratories, Inc. | Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor |
| CU22661A1 (es) * | 1997-12-30 | 2001-04-27 | Cnic Ct Nac Investigaciones | Nuevos candidatos vacunales de vibrio cholerae y método de obtención |
-
1998
- 1998-05-26 SE SE9801852A patent/SE9801852D0/xx unknown
-
1999
- 1999-05-21 PL PL344483A patent/PL197450B1/pl unknown
- 1999-05-21 EP EP99927745A patent/EP1080211B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-21 CA CA002329255A patent/CA2329255C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-21 RU RU2000132731/13A patent/RU2265657C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-05-21 DK DK99927745.2T patent/DK1080211T3/da active
- 1999-05-21 WO PCT/EP1999/003509 patent/WO1999061634A1/en not_active Ceased
- 1999-05-21 CZ CZ20004354A patent/CZ301662B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-05-21 EE EEP200000686A patent/EE05520B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-05-21 US US09/700,712 patent/US7261899B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-21 AU AU44999/99A patent/AU4499999A/en not_active Abandoned
- 1999-05-21 DE DE69942579T patent/DE69942579D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-21 AT AT99927745T patent/ATE474055T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-21 HU HU0102310A patent/HUP0102310A3/hu unknown
- 1999-05-21 BR BRPI9910703-1A patent/BR9910703B1/pt not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-11-23 IS IS5724A patent/IS2904B/is unknown
- 2000-11-24 NO NO20005950A patent/NO327856B1/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5470729A (en) * | 1983-03-04 | 1995-11-28 | University Of Maryland At Baltimore | Method of isolating restriction fragment deletions in Vibrio cholerae, and products thereof |
| EP0251579A2 (en) * | 1986-06-24 | 1988-01-07 | Enterovax Research Pty. Ltd. | Non-antibiotic marker system |
| EP1080211A1 (en) * | 1998-05-26 | 2001-03-07 | Active Biotech AB | Method of producing thy-a-deficient strains of vibrio cholerae, such strains and their use |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| databaze EMBL, pristupovÚ cislo AJ006514, 5.6.1998 * |
| databaze EMBL, pristupovÚ cislo Y17135, 1.5.1998 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7261899B1 (en) | 2007-08-28 |
| AU4499999A (en) | 1999-12-13 |
| NO20005950D0 (no) | 2000-11-24 |
| DE69942579D1 (de) | 2010-08-26 |
| IS2904B (is) | 2014-10-15 |
| WO1999061634A1 (en) | 1999-12-02 |
| BR9910703B1 (pt) | 2014-10-29 |
| HUP0102310A3 (en) | 2003-10-28 |
| CA2329255C (en) | 2009-03-10 |
| CA2329255A1 (en) | 1999-12-02 |
| PL344483A1 (en) | 2001-11-05 |
| HK1037206A1 (en) | 2002-02-01 |
| SE9801852D0 (sv) | 1998-05-26 |
| PL197450B1 (pl) | 2008-03-31 |
| EE200000686A (et) | 2002-04-15 |
| RU2265657C2 (ru) | 2005-12-10 |
| BR9910703A (pt) | 2001-01-30 |
| DK1080211T3 (da) | 2010-10-18 |
| EP1080211B1 (en) | 2010-07-14 |
| IS5724A (is) | 2000-11-23 |
| WO1999061634A9 (en) | 2001-12-13 |
| EP1080211A1 (en) | 2001-03-07 |
| CZ20004354A3 (en) | 2001-05-16 |
| HUP0102310A2 (hu) | 2001-10-28 |
| NO327856B1 (no) | 2009-10-05 |
| NO20005950L (no) | 2001-01-25 |
| EE05520B1 (et) | 2012-02-15 |
| ATE474055T1 (de) | 2010-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2096529C (en) | Recombinant avirulent salmonella antifertility vaccines | |
| KR101947945B1 (ko) | L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법 | |
| JP2003506007A (ja) | 抗原送達用プラスミド維持系 | |
| ES2346442T3 (es) | Mantenimiento de plasmido. | |
| AU2002321644B2 (en) | Bacterial vaccine | |
| JP5966018B2 (ja) | 改変ボルデテラ・パータシス株 | |
| JP2004236637A (ja) | 多糖類生成に関与する遺伝子及びその利用 | |
| EP1322766A2 (de) | Verfahren zur veränderung des genoms von corynebakterien | |
| CZ301662B6 (cs) | Kmen deltathyA Vibrio cholerae postrádající funkci genu thyA | |
| JP2026503706A (ja) | 産物製造のための発現システム | |
| EP1368480B1 (de) | Verfahren zur veränderung des genoms von gram-positiven bakterien mit einem neuen konditional negativ dominanten markergen | |
| CN114630896B (zh) | 由于yeeo基因失活而具有提高的芳香族氨基酸产生能力的菌株 | |
| CZ281078B6 (cs) | Mikroorganismy ke stabilizaci plasmidů | |
| JP2007505616A (ja) | 非抗生物質耐性選択マーカー含有選択システム | |
| CN112771168B (zh) | 包含变体inc编码链的核酸分子 | |
| MXPA00011604A (en) | Method of producing thy | |
| HK1037206B (en) | Method of producing thy-a-deficient strains of vibrio cholerae, such strains and their use | |
| US20170335360A1 (en) | Bacillus megaterium recombinant protein expression system | |
| HK1101704B (en) | Plasmid maintenance |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20150521 |