CZ302282B6 - Zpusob prípravy adenoviru a souprava pro studium terapeuticky úcinných sloucenin - Google Patents
Zpusob prípravy adenoviru a souprava pro studium terapeuticky úcinných sloucenin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302282B6 CZ302282B6 CZ20021215A CZ20021215A CZ302282B6 CZ 302282 B6 CZ302282 B6 CZ 302282B6 CZ 20021215 A CZ20021215 A CZ 20021215A CZ 20021215 A CZ20021215 A CZ 20021215A CZ 302282 B6 CZ302282 B6 CZ 302282B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plasmid
- genome
- adenoviral
- recombinant
- plasmids
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 112
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 323
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 89
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 58
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 56
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 52
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 52
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 30
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 30
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920006385 Geon Polymers 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 34
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 22
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 22
- 230000006870 function Effects 0.000 description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 11
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 10
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 10
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 10
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 4
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 4
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- -1 α-1ΑΤ Proteins 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 2
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 2
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 2
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 2
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 2
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 2
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 2
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 2
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 2
- 101150047856 Cav2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100035888 Caveolin-1 Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 2
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 2
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 2
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000715467 Homo sapiens Caveolin-1 Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 2
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 2
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 2
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 2
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 2
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 2
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 2
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 2
- 241000589196 Sinorhizobium meliloti Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 2
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 2
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 2-[(e)-[[2-(4-benzylpiperazin-1-ium-1-yl)acetyl]hydrazinylidene]methyl]-6-prop-2-enylphenolate Chemical compound [O-]C1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N\NC(=O)C[NH+]1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101100462537 Caenorhabditis elegans pac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000588629 Moraxella lacunata Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100117764 Mus musculus Dusp2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000053208 Porcellio laevis Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241001518258 Streptomyces pristinaespiralis Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150102092 ccdB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010366 cell biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 101150083835 codB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000007463 endoscopic sphincterotomy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229940005483 opioid analgesics Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rešení se týká zpusobu prípravy adenoviru, zahrnujícího a) prípravu prvního plazmidu nazývaného kyvadlovým plazmidem, výhodne prokarytotického plazmidu, který obsahuje první zkrácený rekombinantní adenovirový genom obsahující alespon jednu heterologní nukleovou kyselinu, b) provedení kontaktu prvního plazmidu s druhým plazmidem nazývaným rodicovským plazmidem, který obsahuje druhý zkrácený rekombinantní adenovirový genom, který je komplementární ke genomu prvního plazmidu, pricemž oba plazmidy jsou v cyklické forme, a umožnení prostrednictvím homologní rekombinace vzniku konecného plazmidu obsahujícího úplný rekombinantní adenovirový genom, a c) vyštepení úplného lineárního rekombinantního adenovirového genomu z konecného plazmidu a jeho vnesení do enkapsidacní linie, címž se pripraví rekombinantní adenoviry obsahující úplný rekombinantní adenovirový genom, pricemž jak kyvadlový plazmid, tak i rodicovský plazmid obsahují identickou adenovirovou homologní oblast, oba tyto plazmidy obsahují pocátek replikace a odlišný selekcní marker pro selekci každého clenu a oba plazmidy obsahují ITR ohranicenou restrikcním místem, které není prítomno v adenovirovém genomu, a jeden nebo druhý plazmid obsahuje enkapsidacní sekvenci, jakož i soupravy pro studium terapeuticky úcinných sloucenin.
Description
Způsob přípravy adenovírů a souprava pro studium terapeuticky účinných sloučenin
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká kompozic a způsobů přípravy rekombinantních adenovírů. Získané adenoviry lze využít k přenosu a/nebo expresi genů v buňkách, in vitro, ex vivo či in vivo, nebo také ve ftinkční genomice. Předkládaný vynález se týká zejména vysoce účinných způsobů přípravy adenovirových knihoven a využití těchto knihoven pro funkční genomíku. Týká se také plazmidů využívaných ke konstrukci těchto adenovirů, buněk nesoucích tyto plazmidy a souprav obsahujících tyto plazmidy, buňky či adenovirové knihovny.
Dosavadní stav techniky
Adenoviry se vyznačují určitými vlastnostmi výhodnými pro genový přenos a/nebo genovou expresi v buňkách. Je to zejména fakt, že mají relativně široké spektrum hostitelů, jsou schopné infikovat klidové buňky, mají velkou klonovací kapacitu a neintegrují se do genomu infikované buňky. Navíc se dosud neprokázalo žádné jejich spojení s jakoukoli významnou lidskou choro20 bou, a proto byly využity in vitro či in vivo pro přenos důležitých genů do různých lidských tkání jako např. do svalů (Ragot et al., Nátuře 361 (1993) 647), jater (Jaffe et al., Nátuře genetics 1 (1992) 372), nervového systému (Akli et al., Nátuře genetics 3 (1993) 224), nádorů, hladkého svalstva apod. Tyto vlastnosti předurčují adenovirové vektory jako ideální nástroje pro využití dat získaných v genomice.
Funkční genomika je chápána jako vědní oblast zabývající se využitím genomů či genomových dat z různých organismů k jejich vyjádření z funkčního hlediska. Na základě svých vlastností mohou být adenoviry nesoucí exogenní sekvenci využity k určení funkce této sekvence v řadě experimentálních modelů. Adenovirové vektory mohou být využity zejména ke studiu terapeu30 tického cíle (ve smyslu jak je chápán ve farmaceutickém průmyslu) v buněčném modelu in vitro nebo v živočišném modelu in vivo. Je-li daná sekvence známa a charakterizována, mohou být adenovirové vektory využity k funkčnímu potvrzení tohoto cíle. V širším smyslu, v kontextu zvaném funkční genomika, může adenovirový přenosový vektor představovat účinný nástroj k určení funkce sekvence nukleové kyseliny v experimentálním eukaryotíckém modelu, aniž jsou předem k dispozici konkrétní informace o podstatě či funkci této sekvence, včetně situace kdy je třeba současně prostudovat velký počet sekvencí.
Presto je průmyslové a terapeutické využití adenovirů či jejich využití ve funkční genomice zatím omezeno, zejména existujícími metodami přípravy těchto rekombinantních virů. Jde hlavně o to, že současně dostupné metody neumožňují jednoduchou, rychlou a klonální přípravu adenovirových populací schopných inkorporovat heterologní nukleovou kyselinu, zejména v případě, kdy je třeba studovat velké množství heterologních nukleových kyselin, jak je to obvyklé ve funkční genomice.
Předkládaný vynález proto poskytuje specifické řešení těchto problémů.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob přípravy adenovirů, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
a) přípravu prvního plazmidů nazývaného kyvadlovým plazmidem, výhodně prokaryotického plazmidů, který obsahuje první zkrácený rekombinantní adenovirový genom obsahující alespoň jednu heterologní nukleovou kyselinu,
- 1 CZ 302282 B6
b) provedení kontaktu prvního plazmidu s druhým plazmidem nazývaným rodičovským plazmidem, který obsahuje druhý zkrácený rekombinantní adenovirový genom, který je komplementární ke genomu prvního plazmidu, přičemž oba plazmidy jsou v cyklické formě, a umožnění prostřednictvím homologní rekombinace vzniku konečného plazmidu obsahujícího úplný rekom5 binantní adenovirový genom, a
c) vyštěpení úplného lineárního rekombinantního adenovirového genomu z konečného plazmidu a jeho vnesení do enkapsidační linie, čímž se připraví rekombinantní adenoviry obsahující úplný rekombinantní adenovirový genom, přičemž io jak kyvadlový plazmid, tak i rodičovský plazmid obsahují identickou adenovirovou homologní oblast, oba tyto plazmidy obsahují počátek replikace a odlišný selekční markér pro selekci každého členu a oba plazmidy obsahují ITR ohraničenou restrikčním místem, které není přítomno v adenovirovém genomu, a jeden nebo druhý plazmid obsahuje enkapsidační sekvenci.
i5 Výhodně způsob podle vynálezu dodatečně obsahuje:
- použití připravených rekombinantních adenovirů k infekci:
biologického materiálu obsahujícího buňky s cílem analyzovat vlastnosti nukleové kyseliny,
- buněčné kultury in vitro nebo ex vivo s cílem produkovat protein, polypeptid nebo peptid kódovaný heterologní nukleovou kyselinou.
Výhodně se způsob podle vynálezu použije pro přípravu expresních adenovirových knihoven.
Předmětem vynálezu je rovněž souprava pro studium terapeuticky účinných sloučenin obsahující:
- kyvadlový plazmid obsahující první zkrácený genom adenovirů obsahující alespoň jednu hete25 rologní nukleovou kyselinu a
- rodičovský plazmid obsahující druhý zkrácený genom adenovirů a obsahující alespoň jednu heterologní nukleovou kyselinu, přičemž oba plazmidy jsou schopné prostřednictvím homologní rekombinace obou zkrácených adenovirových genomů produkce konečného plazmidu obsahujícího úplný lineární rekombinant30 ní adenovirový genom ohraničený jedním nebo více restrikčními místy, které nejsou přítomné v uvedeném geonomu, přičemž jak kyvadlový plazmid, tak i rodičovský plazmid obsahující identickou adenovirovou homologní oblast, oba tyto plazmidy obsahují počátek replikace a odlišný selekční markér pro selekci každého členu a oba plazmidy obsahují ITR ohraničenou restrikčním místem, které není přítomno v adenovirovém genomu, a jeden nebo druhý plazmid obsahuje enkapsidační sekvenci.
Tento vynález tedy popisuje nové nástroje a způsoby přípravy rekombinantních adenovirů. Zejména popisuje genové konstrukty (plazmidy), buňky a postupy pro rychlou přípravu vysoce kvalitních adenovirů. Konkrétně umožňuje tento vynález přípravu adenovirových knihoven obsahujících velké množství heterologních nukleových kyselin.
Jednou stránkou předkládaného vynálezu je tedy použití rekombinantních adenovirů k určení biologické funkce nukleové kyseliny nebo proteinu.
Další stránku tohoto vynálezu představuje použití adenovirů k přípravě expresních knihoven pro analýzu nukleových kyselin s neznámou funkcí a/nebo strukturou.
Předkládaný vynález se dále týká adenovirových expresních knihoven, tj. adenovirových popula50 cí, které obsahují inzerty nukleových kyselin odvozených z jakékoli knihovny DNA.
Tento vynález se také týká způsobů a nástrojů pro přípravu těchto adenovirů, zejména těchto knihoven, a ve výhodném provedení souběžnou přípravou rekombinantních adenovirů z knihoven nukleovýeh kyselin.
Adenoviry jsou lineární dvouvláknové DNA viry o velikosti asi 36 kb. Jejích genom obsahuje zejména sekvenci s obrácenou repeticí (inverted repeat sequence, ITR) na obou koncích, enkapsidační sekvenci (umožňující zabalení viru do kapsidy) (Psi), časné geny a pozdní geny. Nejdůležitější časné geny jsou obsaženy v oblastech El, E2, E3 a E4. Přitom geny obsažené v oblasti El jsou potřebné k propagaci viru. Oblast E4 je také důležitá pro regulaci replikace adenovirového i o genomu. Nej důležitější pozdní geny jsou obsaženy v oblastech LI až L5. Byla získána úplná sekvence adenovirů Ad5 a je k dispozici v databázích (viz zejména Genbank M7326O). Podobně bvly získány částečné nebo úplné sekvence genomů dalších lidských či živočišných adenovirů (Ád2, Ad7, Ad 12, CAV-2 apod.).
Navíc, jak již bylo zmíněno, adenovirů již bylo využito k přenosu genů in vivo. Pro tento účel byly připraveny různé vektory odvozené z adenovirů, obsahující řadu různých genů (β-gal, OTC, α-1ΑΤ, cytokiny, enzymy, růstové faktory apod.). V každém z těchto konstruktů byl adenovirový genom modifikován tak, aby se adenovirus po genovém přenosu nemohl samostatně replikovat a/nebo propagovat. Konstrukty popisované v dosavadním stavu techniky tedy předsta20 v ují adenoviry, v nichž byla deletována jedna nebo více oblastí vybraných z El, E2, E3, E4, plX, Iva2 apod. Z konkrétních konstruktů tedy byla odstraněna bud’ oblast El, nebo oblasti El a E3. oblasti El a E4, oblasti El, E3 a E4, anebo všechny kódující oblasti adenovirů (prázdný vektor). Tyto vektory obvykle obsahují heterologní nukleovou kyselinu, která má být přenesena do buněk nebo studována. Tato nukleová kyselina může být vložena do různých míst rekombinantního genomu, a to jako náhrada za odstraněné oblasti či jinam. Konkrétní příklady adenovirových vektorů byly popsány v publikacích Levrero et al.. Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et aL, Gene 50 (1986) 161, WO94/12Ó49, WO94/28152, WO94/28938, WO95/34671, W096/10088, WO95/02679, WO95/27071 atd., jež jsou uvedeny níže v seznamu literatury.
Rekombinantní adenoviry se připravují transfekci DNA rekombinantního viru do kompetentní enkapsidační buněčné linie. Transfekce může být buď jednoduchá, pokud je k dispozici konstrukt nesoucí celý genom rekombinantního viru, nebo, což bývá nejčastější případ, se provádí současná transfekce (kotransfekce) několika fragmentů DNA, které dohromady poskytnou různé nezbytné součásti genomu rekombinantního viru. Tento postup pak zahrnuje jeden nebo více kroků homologní rekombinace mezi různými konstrukty, které probíhají uvnitř enkapsidační linie a jejichž výsledkem je DNA rekombinantního viru. K provedení jednoho z těchto postupuje tedy třeba mít k dispozici vhodné konstrukty nesoucí celý genom nebo části genomu rekombinantního adenovirů, který má být připraven.
Dosavadní stav techniky popisuje řadu metod pro přípravu těchto konstruktů in vitro. Nejrozšířenější technikou je izolace virové DNA a její modifikace in vitro pomocí obvyklých molekulárně biologických metod (štěpení, ligace atd.). Výsledné konstrukty jsou poté čištěny a užity k transfekci enkapsidačních buněčných linií. U této techniky je však třeba připravit zásobní virový preparát a vyčistit virovou DNA pro každý konstrukt či pro jakoukoli manipulaci s DNA rekom45 binantního víru, a proto se nehodí pro přípravu různých zásobních virových preparátů či knihoven. Aby se tento nedostatek vyřešil, bylo navrženo využít k přípravě virových DNA pro transfekci prokaryotické plazmídy. Konkrétní příklad uvádí Bett et al. (PNAS 91 (1994) 8802), který popisuje přípravu plazmidu replikujícího se v E, coli a obsahujícího modifikovaný adenovirový genom (plazmid pBHGlO). Tento plazmid obsahuje konkrétně adenovirový genom, ze kterého byly deletovány oblasti El, E3 a Psi a který byl cirkularizován spojením sekvencí ITR, a dále část plazmidu pBR322 vloženou do genomové oblasti 188-1339 adenovirového genomu. Ačkoliv se tento plazmid může replikovat v E. coli a lze do nej genovou manipulací vložit žádané geny, jeho užití má ještě jisté nevýhody. Jde zejména o to, že při přípravě viru je třeba linearizovat přilehlé oblasti ITR a provést rekombinací, která díky přítomnosti konstruktů vede ke vnesení oblastí odvozených z prokaryotického plazmidu do rekombinantního adenovirového genomu.
- 3 CZ 302282 B6
Další plazmidy téhož typu vykazující stejné nedostatky popsal např Graham (EMBO J. 3(12) (1984) 2917). V současné době byly popsány nové metody založené zejména na homologní rekombinaci dvou plazmidů a využívající umělých kvasničných chromosomů (YAC, Ketner et al., 1994) či bakterií (Chartier et al., 1996, Crouzet et al., 1997, He et al., 1998). Tyto metody, byť účinnější než předešle popsané, jsou složitější. Systém využívající YAC vyžaduje kultivaci a manipulaci kvasinek (Ketner et at., 1994). Systém využívající E. coli zahrnuje několik následných kroku (z nichž některé, např. elektrotransformace či sacharózová selekce, jsou pro úspěšné provedení rozhodující). V každém případě je však třeba provést opakované vyhledávání klonů k selekci konečného rekombinantního klonálního vektoru nesoucího infekční adenovirový genom. ιο Ačkoli tyto postupy umožňují účinnou klonální přípravu zásobních adenovirových preparátů nesoucích požadovaný terapeutický gen, nelze je uspokojivě využít k přípravě rekombinantních adenovirů s vysokou výtěžností, zejména k souběžné přípravě velkého počtu rekombinantních adenovirů nesoucích různé nukleové kyseliny.
Překážkou ve využití adenovirových vektorů jako systému pro genový přenos či analýzu je tedy složitost a počet operací nutných k přípravě těchto virů. Ze současného stavu techniky tak vyplývá potřeba mít pro přípravu genomů rekombinantních adenovirů k dispozici vhodné plazmidy, s nimiž se snadno manipuluje a jež se snadno amplifíkují in vitro. Je také důležité, aby takto připravené genomy neobsahovaly prakticky žádné oblasti plazmidového původu, které by mohly (i) vyvolat imunitní odpověď, (ii) kódovat proteiny odpovědné za rezistenci a (iii) snižovat kapacitu viru jako vektoru. Je také třeba mít k dispozici metodologie umožňující zjednodušenou přípravu rekombinantních adenovirů klonátně, rychle a ve velkém množství.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález umožňuje vyřešit právě tyto nedostatky. Tento vynález popisuje zejména nové látky a postupy pro přípravu rekombinantních adenovirů odpovídajících těmto požadavkům. Látky a postupy popisované v tomto vynálezu umožňují zejména rychlou a účinnou klonální příprávu velkých množství rekombinantních adenovirů k terapeutickému využití nebo pro vyhledávání farmaceutických cílů.
Podstatou předkládaného vynálezu je využití dvou plazmidů (konkrétně prokaryotických) k přípravě plazmidů nesoucího kompletní adenovirový genom, z něhož je možno jednoduchou excizí připravit rekombinantní adenoviry, a to v jediném kroku homologní rekombinace v hostitelské buňce (konkrétně prokaryotické).
Obecně tedy způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje:
- V prvním kroku přípravu prvního plazmidů (tzv. kyvadlového, „shuttle“), nejlépe prokaryotic40 kého, nesoucího zkrácený genom prvního rekombinantního adenovirů obsahující alespoň jednu sekvenci heterologní nukleové kyseliny (klonovací krok). Výhodně obsahuje první zkrácený genom oblast 1TR, sekvenci heterologní nukleové kyseliny, oblast adenovirové homologie, a eventuálně enkapsidační oblast,
- Ve druhém kroku dochází ke kontaktu prvního plazmidů s druhým plazmidem (zvaným „rodi45 čovský“), obsahujícím zkrácený genom druhého rekombinantního adenovirů komplementárního s prvním adenovirem a umožňujícím homologní rekombinaci, takže výsledkem je produkce konečného plazmidů nesoucího úplný genom rekombinantního adenovirů (rekombinační krok). Výhodně obsahuje zkrácený genom druhého rekombinantního adenovirů nejméně jednu oblast ITR, oblast adenovirové homologie totožnou s tou, která je přítomna v prvním plaz50 midu, a enkapsidační sekvenci (pokud ji neobsahuje první plazmid). Tento druhý zkrácený adenovirový genom může též obsahovat sekvenci jiné požadované nukleové kyseliny.
- Ve třetím krokuje úplný genom rekombinantního adenovirů vyštěpen z konečného plazmidů a vnesen do enkapsidační linie, takže jsou produkovány rekombinantní adenoviry obsahující kompletní genom rekombinantního adenovirů (krok produkce adenovirů).
-4CZ 302282 Bó
- Ve čtvrtém, fakultativním kroku jsou rekombinantní adenoviry využity k infekci:
- biologického materiálu obsahujícího buňky, s cílem analyzovat vlastnosti vnesené nukleové kyseliny (krok funkční analýzy),
- buněčné kultury in vitro či ex vivo, s cílem produkovat protein, polypeptid či peptid kódo5 váný heterologní nukleovou kyselinou,
- buňky, tkáně, orgánu či organismu, s cílem produkovat protein, polypeptid či peptid kódovaný heterologní nukleovou kyselinou in vivo.
Předkládaný vynález tedy umožňuje v jediném kroku (homologní rekombinace) získat prokaryoio tický plazmid nesoucí funkční adenovirový genom (úplný), vyštěpitelný jedním či více odpovídajícími enzymy. Tento konečný plazmid je tedy výsledkem integrace prvního plazmidu (kyvadlového), nesoucího adenovirové sekvence (minimálně jedné sekvence ITR a enkapsidační sekvence) a požadovanou heterologní nukleovou kyselinu, do druhého plazmidu (rodičovského), který nese komplementární adenovirové sekvence (minimálně další sekvenci ITR), a to procesem homologní rekombinace pomocí sekvence společné pro oba plazmidy (sekvence adenovirové homologie). Tímto procesem homologní rekombinace vznikne ze tohoto koagregátu funkční adenovirový genom.
Jednou z výhod předkládaného vynálezu je jeho jednoduchost, umožňující paralelní využití pro velký počet kyvadlových plazmidu. Ve výhodném provedení je tedy prvním krokem popisovaného postupu klonována knihovna nukleových kyselin v kyvadlových plazmidech, čímž se připraví knihovna konečných plazmidů nesoucích funkční adenovirový genom s totožnou strukturou lišící se pouze inzertem, který obsahují. Tento klon ovací krok se optimálně provádí tak, aby byly klony od sebe vzájemně odděleny, např. v důlcích mikrotítracních destiček. Lze ho tedy provádět např.
automatizovaně. Získaná knihovna kyvadlových plazmidů je poté využita v rekombinačním kroku, kde dochází ke kontaktu každého kyvadlového plazmidu s rodičovským plazmidem. Tímto postupem je tedy současně připraven velký počet paralelních rekombinantních adenovirů obsahujících heterologní nukleové kyseliny (tj. Adenovirové expresní knihovna). Tato knihovna může pak být testována na biologickém materiálu (4. krok), aby byly identifikovány klony s hledanou biologickou aktivitou.
Předkládaný vynález lze využít pro všechny typy adenovirů a prokaryotických buněk, s využitím různých knihoven nukleových kyselin, jak bude detailně ukázáno v následujícím textu.
Definice termínů užitých v popisu • Rekombinantní adenovirus: Termínem rekombinantní adenovirus je ve smyslu předkládaného vynálezu míněn adenovirus, jehož genom byl modifikován delecí a/nebo inzercí a/nebo substitucí některých bází. V užším slova smyslu je tedy míněna virová partikule, obvykle infekční, obsahující rekombinantní adenovirový genom. V závislosti na typu modifikace genomu může být rekombinantní virus replikačně defekt)vní, což znamená že není schopen se replikovat a/nebo samostatně propagovat v buňce. Rekombinantní adenovirus může být připraven ze všech sérotypů adenovirů, zejména z lidských (např. typu C, jako jsou Ad5, Ad2, Ad7, Ad 12 atd.) či živočišných adenovirů, (např. psích adenovirů jako je CAV-2).
• Adenovirový genom: Termínem „adenovirový genom“ je míněna molekula DNA obsažená v adenovirů, nebo jeho sekvence, kopie či replika. Rekombinantní adenovirový genom je nukleová kyselina, jejíž sekvence odpovídá sekvenci adenovirového genomu a obsahuje jednu či více modifikací. Modifikacemi jsou míněny např. delece (např. všech nebo některých oblastí El, E2, E3, E4 atd.), inzerce, (např. jedné či více heterologních sekvencí nukleové kyseliny) nebo změny v užití kodonů.
Výhodou rekombinantního adenovirového genomu připraveného pomocí kompozic a postupů popsaných v předkládaném vynálezu je to, že jde o „úplný“ či „funkční „ genom, tj. genom nevyžadující k produkci zásobních virových preparátů ve vybraných enkapsidačních liniích rekombi- 5 CZ 302282 B6 naci či ligaci dalších oblastí. Takový „úplný“ genom tedy výhodně obsahuje nejméně jednu enk a psi dač ní sekvenci a sekvenci heterologní nukleové kyseliny, ukončené na obou stranách sekvencemi ITR. Další výhodnou charakteristikou plazmidů v tomto vynálezu je to, že získaný úplný rekombinantní adenovirový genom není přerušen oblastmi prokaryotického plazmidů. To znamená, že získané genomy v podstatě neobsahují plazmidové oblasti, jejichž nevýhodná přítomnost byla popsána výše. Navíc plazmidy popsané v tomto vynálezu obsahují oblasti ITR, které se nemohou spojit, což umožňuje získání lineárních rekombínantních virových genomů, které lze přímo použít k produkci rekombínantních virů.
Rekombinantní adenovirový genom výhodně obsahuje alespoň sekvence ITR a sekvenci umožňující cnkapsidaci. Sekvence ITR slouží jako počátek replikace adenovirů. Jsou umístěny na koncích virového genomu, odkud mohou být snadno izolovány obvyklými technikami molekulární biologie známými odborníkům. Nukleotidová sekvence ITR lidských adenovirů (zejména sérotypů Ad2 a Ad5) byla popsána v literatuře, podobně jako u psích adenovirů (zejména CAV1 a i5 CAV2). Např. u adenovirů Ad5 levá sekvence ITR odpovídá oblasti zahrnující nukleotidy 1 až
103.
Enkapsidační sekvence (označovaná též jako sekvence Psi) je nezbytná pro zabalení virového genomu do kapsid. V genomu divokých adenovirů se nachází mezi levým ITR a oblastí El.
Může být izolována nebo uměle syntetizována obvyklými technikami molekulární biologie. Nukleotidová sekvence enkapsidační oblasti lidských adenovirů (zejména sérotypu Ad2 a Ad5) byla popsána v literatuře, podobně jako u psích adenovirů (zejména CAV1 a CAV2). Např. u adenovirů Ad5 se funkční enkapsidační sekvence nachází mezi nukleotidy 194-358.
V jednom výhodném provedení předkládaného vynálezu je z adenovirového genomu odstraněna celá oblast El nebo její část. Oblast El je nezbytná pro virovou replikaci a její inaktivace vede k tvorbě replikačně defektivních virů, tj. virů, které se po genovém přenosu in vivo nejsou schopny samostatně replikovat. Oblast El či kterákoli jiná vhodná oblast může být zbavena funkce jakoukoli technikou obecně známou odborníkům, zejména celkovou delecí, substitucí, částečnou dele3o cí, nebo inzercí jedné čí více bází do jednoho či více odpovídajících genů. Tyto modifikace lze snadno provést přímo v plazmidech popsaných v tomto vynálezu, např. technikami genového inženýrství. Ve výhodném provedení je genom připravovaného adenovirů zbaven části oblasti El mezi nukleotidy 454 a 3328 (fragment PvuII-BglII) nebo 382 a 3446 (fragment HinflI-Sau3A).
Zkráceným rekombinantním adenovirovým genomem je míněna DNA, jejíž sekvence odpovídá sekvenci koncového úseku adenovirového genomu, tj, jednomu koncovému ITR. Dva zkrácené rekombinantní genomy jsou považovány za komplementární, jestliže oba nesou vzájemně komplementární úseky adenovirového genomu a jestliže jsou schopny homologní rekombinací vytvořit úplný rekombinantní adenovirový genom.
• Heterologní nukleová kyselina: Termínem „heterologní nukleová kyselina“ je míněna jakákoli nukleová kyselina vložená do rekombinantní ho adenovirového genomu, jejíž přenos, exprese či funkční analýza jsou zamýšleny. Má to být nukleová kyselina v zásadě jiného původu než adenovirového („heterologní“), např. pocházející z lidských, živočišných, rost45 linných, virových (jiných než adenovirus použitý jako vektor), prokaryotických či nižších eukaryotických buněk, nebo syntetického či polosyntetického původu. Velikost heterologní nukleové kyseliny může být různá a je omezena pouze tím, že rekombinantní adenovirový genom, do kterého byla vnesena, nesmí přesáhnout maximální velikost, která ještě umožňuje zabalení do adenovirové kapsidy a vytvoření virové partikule (celkově má tedy být kratší než 40 kb). To znamená, že to může být i nukleová kyselina delší než 30 kb, pokud z adenovirového vektoru byl deletován dostatečný počet oblastí. V tomto ohledu může nukleová kyselina obsahovat kódující oblasti pro určitý protein, polypeptid či peptid, např. cDNA, genomovou DNA (gDNA) či syntetickou DNA. Může také jít o DNA neznámé struktury, pocházející např. z nějakého klonu knihovny nukteových kyselin. Rekombinantní adeno-6CZ 302282 B6 virový genom může navíc obsahovat několik různých heterologních nukleových kyselin vložených do různých míst genomu.
Popis plazmidu
Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález využívá dva plazmidy (prokaryotické), kyvadlový a rodičovský, které obsahují vzájemně komplementární fragmenty rekombinantního adenovirového genomu. Nejméně jeden z těchto plazmidů nese heterologní nukleovou kyselinu (či inzerční místo pro tuto nukleovou kyselinu), využitelnou např. pro genovou terapii, produkci rekombiio nantního proteinu či pro postupy funkční genomiky.
Ve výhodném provedení jsou koncové úseky (sekvence ITR) obou zkrácených genomů nesených každým plazmidem ukončeny (ve směru 5' u levého ITR a 3' u pravého ITR) restrikčním místem chybějícím v daném genomu, aby bylo možno po rekombinaci celý genom vyštěpit. Tyto plazmi15 dy nesou zkrácený adenovirový genom a nejsou schopny samostatně vytvořit infekční adenovirový genom. Každý z těchto piazmidů obsahuje sekvenci komplementární k tomu druhému, takže integraci vytvoří konečný plazmid nesoucí úplný adenovirový genom ohraničený dvěma ITR a alespoň jedním restrikčním místem nepřítomným v tomto genomu. Úsek rekombinantního adenovirového genomu obsažený v těchto plazmidech je přitom neúplným genomem, který se
2o následně nemůže samostatně projevovat jako infekční. To je zvláště důležité, protože funkční genom lze získat pouze pomocí konečného plazmidu vytvořeného integrací obou plazmidů.
Takovéto plazmidy jsou zobrazeny např. na obr. 1 a detailněji jsou popsány v následujícím textu. Jsou to výhodně plazmidy prokaryotické, obsahující obvykle plazmidovou oblast a adenovirovou oblast. Přítomnost plazmidové oblasti umožňuje replikaci a/nebo selekci plazmidu v hostitelské buňce, zejména prokaryotické. Adenovirová oblast (zkrácený genom) je tou částí genomu rekombinantního adenoviru, která po rekombinaci s adenovirovou oblastí komplementárního plazmidu (rodičovského nebo kyvadlového) zajišťuje vznik úplného rekombinantního adenovirového genomu.
Oblastí umožňující replikaci plazmidů předkládaného vynálezu v prokaryotických buňkách může být jakýkoli počátek replikace (origine) fungující ve vybraných buňkách. Může to být počátek replikace pocházející z plazmidu skupiny inkompatibility P (např, pRK290), který umožňuje replikaci v kmenech „pol A E. coli“. V širším slova smyslu se může jedna o jakoukoli oblast počátku replikace pocházející z plazmidu replikujícího se prokaryotických buňkách. Tento plazmid může být odvozen od pBR322 (Bolivar et al., 1997), od pUC (Viera a Messing, 1982), či od jiných plazmidů odvozených ze stejné skupiny inkompatibility, tj. např. ColEl nebo pMBl. Takové plazmidy mohou kromě toho být vybrány i z plazmidů jiných skupin inkompatibility replikujících se v Escherichia coli. Může jít o plazmidy odvozené např. z plazmidů skupin inkompatibility A, B, FI, FII, Fill, FIV, Hl, Hl 1, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z či 9. Lze využít i dalších plazmidů, včetně těch, které se nereplikují v E. coli, ale v jiných hostitelích jako např. B, subtilis, Streptomyces. P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis.Enterococcus faecium či Clostridium. Výhodné jsou počátky replikace pocházejícím z plazmidů replikujících sevE.
Coli.
Oblastí umožňující selekci prokaryotických buněk obsahujících plazmidy tohoto vynálezu může být jakýkoli gen navozující rezistenci k nějaké látce, zejména k nějakému antibiotiku.Lze zde uvést např. geny navozující rezistenci ke kanamycinu (Kanr), ampicilinu (Ampř), tetracyklinu (teť) či spektinomycinu, běžně užívané v molekulární biologii (Maniatis et al., 1989). Selekci plazmidů lze také provádět pomocí jiných genů než genů kódujících rezistenci k nějakému antibiotiku. Obecně by mělo jít o gen, který bakterii poskytuje vlastnost, již sama nemá (což může být gen, který byl na jejím chromozomu deletován či inaktivován), a v níž tuto funkci gen nesený plazmidem obnoví. Může tedy např. jít o gen pro transferovou RNA, která obnovuje deftcientní chromozomální funkci (Somoes et al., 1991).
- 7 CZ 302282 B6
Ve výhodném provedení kyvadlový plazmid a rodičovský plazmid obsahují odlišné počátky replikace a/nebo markéry, aby bylo možno selektovat každý jednotlivý prvek.
Adenovirová oblast obsažená v každém z plazmidů v podstatě odpovídá sekvenci zkráceného adenovirového genomu. Tyto zkrácené genomy nesené oběma typy plazmidů jsou vzájemně komplementární, tj. schopné vytvořit po homologní rekombinaci úplný (a lineární) rekombinantní adenovirový genom. Kromě toho jsou ve výhodném provedení zkrácené genomy nesené oběma typy plazmidů po stranách opatřeny jedním nebo více restrikční mi místy, která v adenovirovém io genomu nejsou obsažena, takže úplný rekombinantní adenovirový genom vzniklý rekombinaci je těmito místy ohraničen.
Zkrácený genom nesený kyvadlovým plazmidem
Jak bylo uvedeno výše, kyvadlový plazmid je určen k tomu, aby nesl požadovanou nukleovou kyselinu a mohl ji vložit do rekombinantního adenovirového genomu.
Adenovirová oblast kyvadlového plazmidu odpovídá levé čí pravé části adenovirového genomu od jejího konce (sekvence ITR) až po vybranou oblast adenovirové homologie, jež umožní homo20 logní rekombinaci mezi oběma plazmidy. Navíc obsahuje adenovirový genom jednu Či více genových modifikací.
V prvním provedení odpovídá zkrácený genom v kyvadlovém plazmidu levé části konečného rekombinantního adenovirového genomu. V tomto provedení obsahuje např. sekvenci od levého
ITR po oblast kódující protein pIX (a/nebo Iva2), přičemž heterologní nukleová kyselina je vložena substitucí celé oblasti El nebo její části. V tomto určitém provedení je oblastí adenovirové homologie oblast kódující protein pIX (a/nebo Iva2).
V jiném provedení odpovídá zkrácený genom v kyvadlovém plazmidu pravé části konečného rekombinantního adenovirového genomu. V tomto provedení obsahuje např. sekvenci od pravého
ITR po oblast kódující protein pIX (a/nebo Iva2), přičemž heterologní nukleová kyselina je vložena substitucí celé oblasti E3 či E4 nebo jejich částí. V tomto určitém provedení je oblastí adenovirové homologie také oblast kódující protein pIX (a/nebo Iva2).
A dále v jiném určitém provedení může být navíc oblastí homologie modifikovaná adenovirová sekvence. Oblast homologie tedy může představovat např. adenovirovou oblast modifikovanou změněným užitím baží založeným na degenerovaném genetickém kódu. Podobné modifikace popisuje patentová přihláška WO99/25861, která je zahrnuta v seznamu literatury. V jednom určitém provedení předkládaného vynálezu je oblastí adenovirové homologie oblast kódující
4o degenerovaný protein pIX (a/nebo Iva2).
Je zřejmé, že podle vybrané struktury konečného rekombinantního adenovirového genomu (vzniklého po rekombinaci) může oblast adenovirové homologie odpovídat různým oblastem genomu. To znamená, že adenovirová oblast rodičovského plazmidu může zaujímat část od levé45 ho ITR až po oblast E3, a tato oblast je pak oblastí adenovirové homologie. V obecnějším smyslu je oblastí adenovirové homologie sekvence odpovídající jakékoli oblasti adenovirového genomu divokého typu nebo modifikovaného genomu, která umožňuje rekombinaci mezi kyvadlovým a rodičovským plazmidem, přičemž vznikne konečný rekombinantní adenovirový genom. Tato oblast homologie je tedy v podstatě identická jak v kyvadlovém, tak v rodičovském plazmidu.
Podle typu použitých konstruktů může odpovídat různým částem adenovirového genomu.
Jedno určité provedení předkládaného vynálezu spočívá v tom, že kyvadlový plazmid obsahuje zkrácený genom obsahující levou oblast ITR, enkapsidační oblast, sekvenci heterologní nukleové kyseliny a oblast adenovirové homologie představovanou oblastí kódující protein pIX (a/nebo lva2) divokého typu nebo degenerovaný protein pIX (srov. např. plazmidy pJJl a p!G5).
-8CZ 302282 B6
Navíc ve výhodném provedení tohoto vynálezu je zkrácený adenovirový genom ze strany ITR ohraničen restrikčním místem, které se nevyskytuje v adenovirovém genomu, např. místem Pacl.
Zkrácený genom nesený rodičovským plazmidem
Jak bylo uvedeno výše, rodičovský plazmid nese zkrácený adenovirový genom, který je schopen rekombinací kompletovat zkrácený genom nesený kyvadlovým plazmidem. Jeho struktura tedy závisí na struktuře kyvadlového plazmidu. Navíc může rodičovský plazmid také obsahovat sekvenci nukleové kyseliny odlišnou od té, kterou nese kyvadlový plazmid.
io
To znamená, že pokud adenovirová oblast kyvadlového plazmidu odpovídá levé části adenovirového genomu, zkrácený genom rodičovského plazmidu odpovídá jeho pravé části zaujímající oblast od ITR až po oblast adenovirové homologie. A naopak, pokud adenovirová oblast kyvadlového plazmidu odpovídá pravé Části adenovirového genomu, zkrácený genom rodičovského plazmidu odpovídá jeho levé části zaujímající oblast od ITR až po oblast adenovirové homologie.
V jednom provedení tohoto vynálezu odpovídá zkrácený genom v rodičovském plazmidu pravé části konečného rekombinantního adenovirového genomu. V tomto provedení obsahuje např. sekvenci od pravého ITR po oblast kódující protein pIX (a/nebo Iva2). Navíc může genom obsa20 hovat genové modifikace jako např. delece celé oblasti E3 nebo E4 či jejich části.
V jiném provedení odpovídá zkrácený genom v rodičovském plazmidu levé části konečného rekombinantního adenovirového genomu. V tomto provedení zujímá např. sekvenci od levého ITR až po sekvenci blízkou oblasti E4. Navíc může genom obsahovat genové modifikace jako např. delece celé oblasti El či její části.
Ve výhodném provedení nese rodičovský plazmid zkrácený genom odpovídající pravé části adenovirového genomu a obsahuje jednu nefunkční oblast E3. V ještě výhodnějším provedení obsahuje nefunkční oblast E4. V nej výhodnějším provedení zahrnuje deleci čtecích rámců ORF3 a/nebo ORF6 oblasti E4 či jejich části. V jiném určitém provedení nese rodičovský plazmid zkrácený genom odpovídající pravé části adenovirového geonomu a obsahuje funkční oblasti E3 a E4.
Konkrétními příklady takových plazmidu jsou pOSEl, pOSElO-OO, pOSE3000, pOSE17-00 a pOSE37-00 (srov. obr. 1 a 4).
V tomto provedení nese kyvadlový plazmid zkrácený genom odpovídající levé části adenovirového genomu a obsahuje deleci celé oblasti El nebo její části.
Dvěma plazmidy zvláště výhodnými pro tento vynález jsou plazmid pOSE 17-00 a plazmid pIG5. pOSE 17-00 (rodičovský plazmid) obsahuje počátek replikace plazmidu RK2, gen pro rezistenci k tetracyklinu a úsek adenovirového genomu od báze 3520 Ad5 až po pravé ITR ohraničené restrikčním místem Pacl. Tento úsek genomu obsahuje nefunkční oblast E3 a modifikovanou sekvenci pro pIX a Iva2, jak je uvedeno v přihlášce WO99/25861. Plazmid pIG5 (kyvadlový plazmid) obsahuje počátek replikace RK6 a nemůže se replikovat v kmenech pir- E. coli. plG5 dále obsahuje oblast ITR a enkapsidační oblast, které předchází restrikční místo pro Pacl, dále požadovanou expresní kazetu a oblast homologní s pOSE 17-00 (modifikovanou sekvenci pro pIX a lva2, jak je uvedeno v přihlášce WO99/25861). Požadovaný genom je tedy připraven homologní rekombinací díky přítomnosti oblasti homologní pro oba plazmidy (tj. modifikované sekvence pro pIX a Iva2, jak je uvedeno v přihlášce WO99/25861).
Způsobem popsaným ve vynálezu je tedy možno připravit úplný (infekční) rekombinantní genom pomocí dvou plazmidů, z nichž každý dodává jednu část genomu (jeden nese levou sekvenci ITR ukončenou restrikčním místem Pacl a soubor virových či nevirových sekvencí a druhý virové a nevirové sekvence následované pravým ITR ukončeným restrikčním místem Pacl, přičemž výběr
-9CZ 302282 B6 virových či nevirových sekvencí záleží na výběru plánovaného konstruktu, rekombinantního adenovirového vektoru s částečně ěi úplně deletovanými virovými geny); oba plazmidy přitom nesou společné sekvence postačující k homologní rekombinaci a obsahují přesahující sekvenci tak, aby se homologní rekombinace mohla uskutečnit. Na základě schématu podobného postupu vnášení exogenních sekvencí do oblasti El tento postup umožňuje zejména vnesení exogenních sekvencí do oblasti E4 pomocí odpovídajících plazmidů. V tomto případě se rekombinace uskutečňuje mezí rodičovským plazmídem (nesoucím levé 1TR a enkapsidační sekvenci, jimž předchází restrikční místo pro enzym PacI a zkrácený adenovirový genom sousedící s oblastí E4) a kyvadlovým plazmídem (nesoucím poblíž oblasti E4 sekvenci totožnou s tou, kterou nese rodilo čovský plazmid - s jejíž pomocí proběhne rekombinace - a za ní expresní kazetu pro požadovanou sekvenci, oblast ITR a unikátní místo pro Pacl).
Ve zvláště výhodném provedení je výsledný adenovirový genom zbaven také celé oblasti E3 a/nebo E4 a/nebo IVA2. Tyto doplňkové delece umožňují zvýšit bezpečnost vektoru a jeho kapa15 citu. Ve výhodném provedení je adenovirový genom zbaven části oblasti E4 obsahující alespoň čtecí rámce ORF3 a ORF6. Adenovirový genom může být též modifikován jak bylo popsáno v patentové přihlášce FR 9 413 355, která je uvedena v seznamu literatury, aby se vyloučilo riziko kontaminace replikujícími se partíkulemi. V jednom určitém provedení je získaným úplným rekombinantním adenovirovým genomem tzv. prázdný („gutless“) genom, tj. zbavený všech kódujících oblastí adenoviru. V tomto provedení obsahuje plazmidový zkrácený genom na jedné straně ITR a enkapsidační oblast a na druhé straně ITR, přičemž oblastí homologíe může být buď samotná heterologní nukleová kyselina, nebo umělá sekvence obsažená v obou plazmidech.
Z tohoto hlediska může být oblast homologíe obsažená v obou plazmidech obecně nevirovou sekvencí, umělou nebo přirozenou, umožňující homologní rekombinaci.
Rekombinantní genom může také obsahovat kazety vyštěpitelné in vivo (WO97/47757) nebo modifikované genové sekvence (geny kódující vlákna či penton) umožňující změnit virový tropismus. Kromě toho může být také modifikována organizace virového genomu, aby se zvýšila .io bezpečnost produkovaných virů (WO96/13596).
Jak bylo uvedeno výše, genom rekombinantního adenoviru je výhodně ohraničen jedním či více restrikční mi místy nevyskytujícími se v daném genomu. Toto místo nebo tato místa umožňují jednoduše a účinně vyštěpit z plazmidů rekombinantní adenovirový genom. Sekvence adenoviro35 vého genomu je známá a dostupná a pracovníci v oboru mohou rutinními experimenty vybrat vhodná restrikční místa nenacházející se v daném genomu. Jde např. o místa Pacl, NspV a Swal (u Ad5) či Snabl (u Ad2). Pozměněním sekvence adenovirového genomu je také možno z některých restrikčních míst vytvořit místa unikátní. Lze tak využít další enzymy, v nichž byla odpovídající restrikční místa z adenovirové sekvence konstruktu v E. co li odstraněna, modifikována či deletována. Tato místa mohou být vložena přímo na konce adenovirového genomu nebo do vzdálenosti několika párů bází od nich.
Plazmidy popsané v předkládaném vynálezu mohou být připraveny z adenoviru různého původu. Různé sérotypy adenoviru, jejichž struktura a vlastnosti se mírně liší, již byly popsány. Z těchto sérotypů je v rámci předkládaného vynálezu výhodné využít lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 či Ad 5) či adenoviry živočišného původu (viz přihláška WO 94/26914). Mezi adenoviry živočišného původu využitelné v rámci předkládaného vynálezu lze uvést adenoviry původu psího, hovězího, myšího (např. Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího (např. SAV). Výhodným adenovirem živočišného původu je psí adenovirus, nejlépe adenovirus CAV2 [např. kmen Manhattan či A26/61 (ATCC VR-800)]. V jednom určitém provedení tohoto vynálezu je použitým adenovirem adenovirus lidského původu. V jiném výhodném provedení jde o adenovirus živočišného původu.
- 10CZ 302282 B6
Homologní rekombinace a produkce virů
Krok homologní rekombinace (umožňující rekonstrukci úplného genomu) lze provádět technikami známými odborníkům, a to transfekcí (nebo kotransfekcí) plazmidů do příslušné buňky, nejlépe prokaryotické. V jednom konkrétním provedení předkládaného vynálezu se homologní rekombinace provádí v E. coli kmenu polA, který umožňuje selektovat získané rekombinanty. Samozřejmě lze dané konstrukty získat i v systémech neumožňujících selekci rekombinant. Rekombinanty je pak možno vyhledávat minipreparací plazmidů, na základě ztráty či získání nějakého markéru či pomocí radioaktivních sond specifických pro rekombi načni spoje, které byly získány nebo ztraceny. Navíc existují další techniky umožňující selekci rekombinant vzniklých homologní rekombinací v E. coli. Mezi nimi lze uvést využití replikačně termosenzitivních plazmidů (Hamilton et al., 1989), využití cirkulámích nereplikativních molekul (popsaných např. Slaterem a Maurerem, 1993), využití bakteriálních kmenů v nichž se použitý vektor nerepiikuje (Miller a Mekalanos, 1988, Zeef et al., 1994) atd. Kterýkoli z těchto systémů lze využít místo kmenů polA a místo transformace plazmidy odvozenými od pBR322 či jeho četnými odvozeninami, nebo jiných plazmidů jejichž replikace je závislá na PolA, nebo konečně plazmidů nereplikujících se v Escherichia coli.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je jakákoli prokaryotická buňka obsahující výše definovaný plazmid. Může se jednat zejména o jakoukoli bakteriální buňku, pro kterou existuje systém vektorů, v nichž lze vnášet rekombinantní DNA. Jde např. o Escherichia coli, Salmonella typhiumurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobíum meliloti. nebo bakterie rodu Streptomyces. Tyto buňky lze výhodně získat transformaci, s použitím technik obecně známých odborníkům. Transformaci lze provést zejména technikou využívající CaCb (Dagert a Ehrlich, 1979), technikou vypracovanou Hanahanem et al. (1983) nebo všemi technikami od ní odvozenými (Maniatis et al., 1989), jakož i elektrotransformací (Wirth et al., 1989). Viz též obecné techniky molekulární biologie uvedené níže.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je postup přípravy rekombinantních adenovirových genomů. Podle tohoto postupu jsou prokaryotické buňky popsané výše kultivovány a ve druhém kroku jsou z nich izolovány plazmidy. Ve výhodném provedení kultivace probíhá tak dlouho, až je získáno dostatečné množství plazmidů. Plazmidy lze izolovat jakoukoli technikou přípravy plazmidové DNA známou odborníkům. Lze je tedy připravit metodu čirého lyzátu s následnou centrifugací v gradientu chloridu česného (Maniatis et al., 1989). Lze využít i jiných technik, kde se lýze buněk provádí jinými způsoby, jako např. Tritonem X-100 (Ausubel et al., 1987), nebo kde je plazmidová DNA po lýzi a separaci od chromozomální DNA a proteinů purifikována na koloně iontoměniče. Takto získané plazmidy pak lze vyčistit a opracovat restrikčním enzymem s cílovými místy ohraničenými virový genom. Tak lze v jednom kroku připravit lineární rekombinantní adenovirus, který je možno přímo využít ke klonální produkci rekombinantních virů.
To znamená, že prvním způsobem přípravy rekombinantních virů je transfekce virového genomu získaného pomocí plazmidů popsaných v tomto vynálezu do kompetentní enkapsidační buněčné linie, tj. linie obsahující intermolekulámě (trans) veškeré potřebné funkce ke komplementaci defektivního viru. Tyto funkce jsou výhodně integrovány v buněčném genomu, čímž se snižuje riziko rekombinace a zvyšuje stabilita dané buněčné linie.
Druhý přístup spočívá v kotransfekcí připraveného rekombinantního genomu s DNA jednoho či více pomocných virů nebo plazmidů. U tohoto postupu není nutné mít k dispozici kompetentní buněčnou linii schopnou komplementovat všechny defektivní funkce rekombinantního adenoviru, protože tyto funkce jsou komplementovány pomocným virem nebo viry. Tento virus (viry) je sám o sobě také defektivní.
Jako využitelné buněčné linie lze zejména uvést např. lidskou zárodečnou linii ledvinných buněk 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Tato linie má ve svém genomu integrovanou
-11CZ 302282 B6 zejména levou část lidského adenoviru Ad5 (12%). Transfekci lze výhodně provést přímo s produktem štěpení plazmidu získaným při výše popsaném postupu, bez jakéhokoli čištění adenovirového genomu. Dalšími vhodnými liniemi jsou např. linie připravené ze zárodečných buněk rohovky (HER), jatém ích buněk apod. Muže jít o linie komplementující funkce El (293, buňky
PERC-6). El a E4 (IGRP2), El a E2 apod. Tyto líne byly popsány a pracovníci v oboru je rutinně využívají.
Takto připravené adenoviry lze izolovat a puriflkovat technikami obecně známými odborníkům (chlorid česný, chromatografie apod.). Lze je využít v různých aplikacích, jako např. k přípravě io terapeutických a profylaktických kompozic in vitro, ex vivo či in vivo, nebo k funkční analýze genomu (a tvorbě knihoven).
Výhody využití nového postupu jsou následující: příprava rekombinant je zjednodušena a zrychlena, není třeba provádět vyhledávání spojené s nutností použít řadu selekčních systémů odpoví15 dajících danému postupu a struktuře nefunkčního rodičovského vektoru.
Oproti známým popsaným metodám je robustnost tohoto postupu založena na souběžně probíhající selekci, takže konečný plazmid nesoucí funkční adenovírový genom je získán v jediném kroku. Ve srovnání se známými metodami příprava nového rekombinantního vektoru v jediném kroku značně snižuje nezbytný pracovní čas. Není třeba vyhledávat rekombinanty, a tím je ušetřeno velké množství práce. Navíc, bez nutného vyhledávání je možno připravit řadu adenovirových vektorů prostřednictvím jediného meziproduktu.
Další výhodou postupu popsaného v předkládaném vynálezu je neživotaschopnost obou plazmidu použitých k přípravě konečného plazmidu nesoucího funkční genom. Žádný z těchto výchozích plazmidu nemá sám o sobě všechny funkce, které by mu umožnily vytvořit funkční adenovírový genom. Pokud by navíc při zavedené selekci (antibiotiky) došlo v extrémním případě k úniku a kdyby po rekombinaci v bakteriálním kmenu vedle sebe existovaly dva typy konstruktů (požadovaný konstrukt a původní ptazmidy), tato událost by po transfekci produkčních eukaryotických .io buněk uvedenou směsí nijak neovlivnila tvorbu požadovaného rekombinantního vektoru. Jedině požadovaný konstrukt získaný homologní rekombinaci je životaschopný a ampliflkuje se v produkčních eukaiyotických buňkách, zatímco původní plazmidy nepřežijí (každému žních chybí minimálně jedna oblast ITR).
Výše jmenované charakteristiky postupu popsaného v předkládaném vynálezu přispívají k zjednodušení přípravy adenovirových vektorů a otevírají možnost přípravy rekombinantních vektorů s velkým výtěžkem. Je možno buď současně připravit řadu rekombinantních adenovirových vektorů nesoucích známé sekvence, jejichž funkce má být potvrzena, nebo připravit soubor rekombinantních vektorů nesoucích sekvence neznámého původu, jejichž funkce má být zjištěna.
•»o V posledním uvedeném případě jde o expresní adenovirové knihovny.
Aplikace v genové terapii
Adenoviry mohou být využity v terapeutických aplikacích. Pro tento účel mohou heterologní sekvence nukleových kyselin obsahovat jeden či více terapeuticky významných genů a/nebo genů kódujících antigenní peptidy.
Terapeuticky významné geny, které lze tímto postupem přenášet, jsou geny, jejichž transkripce a eventuálně i translace v cílové buňce vede k tvorbě produktů s terapeutickým účinkem.
Může jít o produkt homologní s produktem cílové buňky (tj. produkt, který je v normální buňce exprimován, pokud tato buňka není patologicky pozměněna). V tomto případě může vnesená exprese posílit nedostatečnou expresi proteinů v dané buňce, napravit pozměněnou expresi proteinu, jejímž výsledkem byl protein inaktivní či slabě aktivní, či způsobit zvýšenou expresi dané55 ho proteinu. Terapeuticky významný gen může též kódovat mutovaný buněčný protein se zvýše- 12CZ 302282 B6 nou stabilitou, modifikovanou aktivitou apod. Daný produkt může též být ve vztahu k cílové buňce heterologní. V tomto případě může exprimovaný protein např. kompiementovat či poskytovat aktivitu, kteráje v buňce deficientní, a tím potlačovat nějaký patologický jev.
Mezi terapeutickými produkty lze uvést např. enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF apod. (WO93/19191), růstové faktory, neurotransmitéry či jejich prekursory nebo syntetizující enzymy, trofické faktory; BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 apod.; apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE apod. (WO94/25073), dystrofin či minidystrofin (FR 9111947), nádorově supresorové geny: p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev io apod. (WO9424297), geny kódující faktory krevní srážlivosti: faktory VII, VIII, IX, tzv. sebevražedné („suicidní“) geny (TK apod.), atd.
Terapeuticky významným genem může být též tzv. „antisense“ (protismyslný) gen nebo sekvence, jehož exprese v cílové buňce umožňuje kontrolovat genovou expresí či transkripcí buněč15 né mRNA. Takové sekvence mohou být např. transkribovány v cílové buňce na RNA komplementární k buněčné mRNA a tím blokovat jejich translaci na protein, jak bylo popsáno v patentové přihlášce EP 140 308.
Jak bylo uvedeno výše, požadovaná nukleová kyselina může též obsahovat jeden či více genů
2o kódujících antigenní peptid, který může u člověka vyvolat imunitní odpověď. V tomto konkrétním provedení umožňuje předkládaný vynález přípravu vakcín pro imunizaci člověka, zejména proti mikroorganismům či virům. Vakcínou mohou být zejména antigenní peptidy specifické pro virus Epsteina-Barrové, HIV, virus hepatitidy B (EP 185 573), virus pseudorabies, nebo nádorově specifické peptidy (EP 259 212).
Požadovaná nukleová kyselina obvykle též obsahuje sekvence umožňující expresi terapeuticky významného genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid v infikované buňce. Může jít o sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi daného genu, pokud je možné, aby v infikované buňce fungovaly. Může jít také o sekvence jiného původu (odpovědné za expresi jiných proteinů, či dokonce syntetické). Může jít např. o sekvence promotorů eukaryotických či virových genů. Jsou to např. sekvence promotorů odvozené z genomu buňky, která má být infikována, Může jít také o sekvence promotorů odvozené z virového genomu, včetně použitého adenovirů. V tomto ohledu lze uvést promotory genů El A, MLP (hlavní pozdní promotor), CMV (cytomegalovirus), RSV (virus Rousova sarkomu) apod. Kromě toho mohou být tyto expresní sekvence modifiková35 ny přidáním aktivačních či regulačních sekvencí apod. Výhodné je použít promotory typu Tet off/on či on/off, které lze regulovat tetracyklinem, nebo promotory indukovatelné ekdysonem či dexamethasonem. Navíc, pokud vnesenému genu chybí expresní sekvence, může být takový gen vložen do genomu defektivního viru za tuto sekvenci. A konečně může požadovaná nukleová kyselina také obsahovat signální sekvenci, která směruje syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečních drah cílové buňky, umístěnou před terapeuticky významným genem. Tato signální sekvence může být buď přirozenou signální sekvencí pro terapeutický produkt, nebo může jít o jakoukoli umělou funkční signální sekvenci.
Předkládaný vynález se také týká jakýchkoli farmaceutických produktů obsahujících jeden či více rekombinantních adenovirů připravených uvedeným postupem. Farmaceutické látky popsané v tomto vynálezu mohou být navrženy pro podání lokální, perorální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí, hypodermální apod.
Farmaceutický přípravek výhodně obsahuje vhodné farmaceutické vehikulum (excipient) pro přípravu injektovatelné látky. Může jít zejména o sterilní, izotonické roztoky solí (fosforečnan či hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý či horečnatý apod., nebo směsi těchto solí), nebo může jít o suché látky, zejména lyofilizované, jejichž přidáním do vody či do fyziologického roztoku se vytvoří injektovatelný roztok.
- 13CZ 302282 B6
Dávky viru použité k injekci mohou být přizpůsobeny různým parametrům, zejména v závislosti na způsobu podání, na daném patologickém jevu, na genu, který má být exprimován, či na délce předpokládané léčby. Obecně jsou rekombinantní adenoviry popsané v předkládaném vynálezu navrženy a podávány v dávce IO4 až 1014 pfu, optimálně 106 až 10l() pfu. Zkratka pfu („plaque forming unit) vyjadřuje infekční schopnost viru určenou infekci odpovídající buněčné kultury měřenou obvykle po 15 dnech růstu jako počet plaků infikovaných buněk. Techniky pro určení titru pfu virového preparátu byly dobře popsány v literatuře.
V závislosti na sekvenci vložené heterologní DNA mohou být adenoviry popsané v předkládalo ném vynálezu využity k léčbě či prevenci různých chorob, včetně genetických chorob (dystrofíe, cystická fibróza apod.), neurodegenerativních poruch (Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba, ALS apod.), nádorů, patologických stavů spojených s poruchami krevní srážlivosti či dyslipoproteinemiemi, patologických stavů spojených s virovými infekcemi (hepatitidy, AIDS aj.) apod.
Aplikace pro přípravu rekombinantních proteinů
Postup popsaný v předkládaném vynálezu umožňuje přípravu adernovirových vektorů k produkci rekombinantních proteinů, zejména v kulturách lidských buněk. Může jít o proteiny jako např. lidský sérový albumin, lidské interferony, lidské protilátky, lidský inzulín, hematopoetické fakto20 ry, koagulační faktory IX či VII, trombolytické faktory jako aktivátor tkáňového plasminogenu, různé růstové faktory, trofické faktory, cytokiny, peptidy centrálního nervového systému, opioidy, enzymy, virové antigeny, ale také o proteiny jiných organismů jako např. rostlin.
Aplikace ve funkční genomic
Stejnými prostředky přípravy jaké byly popsány výše lze uvedený postup aplikovat při ověřování či hledání nových terapeutických cílů ve smyslu užívaném ve farmaceutickém průmyslu.
Předkládaný vynález se týká též jakéhokoli využití kompozice popsaným postupem. Jde zejména .to o jakékoli preparáty umožňující získání či vložení sekvence nukleové kyseliny jakéhokoli typu do prvního, kyvadlového plazmidů jak bylo popsáno v tomto vynálezu, jakož i využití daných plazmidů k přípravě jednoho čí více rekombinantních adenovirů různými automatizovanými metodami. Tyto rekombinantní adenoviry pak mohou být využity v četných modelech in vitro a in vivo k vyhodnocení funkce vnesených sekvencí. Funkce sekvencí vnesených do připravených adenovirových vektorů může být vyhodnocována různými funkčními testy, které jsou odborníkům k dispozici.
Jedním z předmětů předkládaného vynálezu je tedy také způsob přípravy expresních adenovirových knihoven, zahrnující tyto kroky:
4d - Příprava primární knihovny v kyvadlovém vektoru, jak byl popsán výše,
- Transformace bakteriální kultury pomocí této primární knihovny za přítomnosti rodičovského plazmidů, jak byl popsán v tomto vynálezu,
- Vnesení získaných plazmidů nebo úplných adenovirových genomů po jejich vyštěpení restrikčními enzymy do produkční adenovirové buňky.
- Případnou infekci biologického materiálu obsahujícího buňky k analýze klonů knihovny.
Tento postup tedy zahrnuje první krok přípravy primární knihovny nukleových kyselin v kyvadlovém plazmidů popsaném v předkládaném vynálezu před aplikací tohoto vynálezu a využitím adenovirové knihovny v experimentálním modelu. Přípravu takové primární knihovny v plazmi50 du podle tohoto vynálezu (kyvadlový plazmid) lze uskutečnit metodami molekulární biologie známými odborníkům. Konkrétně lze připravit primární knihovnu v následujících krocích: a) izolace mRNA (či celkové RNA) z buněčné populace, b) příprava komplementárních DNA z izolovaných mRNA, c) eventuálně příprava knihovny nukleových kyselin, ve kterých jsou cDNA umístěny pod kontrolu silného promotoru, nebo přesněji pod kontrolu regulovatelného pro- 14CZ 302282 B6 motoru, d) vložení molekul cDNA (nebo expresní kazety) do kyvadlového plazmidu popsaného v tomto vynálezu.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy také knihovna nukleových kyselin klonovaná ve vektoru nebo v kyvadlovém plazmidu, jak byl popsán výše.
Ve druhém kroku umožňuje společná transformace primární knihovny kyvadlových plazmidů s rodičovským plazmidem popsaným v tomto vynálezu získání knihovny plazmidů nesoucích funkční adenovirové genomy. Tento krok lze uskutečnit bud’ společnou transformací bakterií oběma plazmidy, nebo dvěma následnými transformacemi každým z nich. Tak lze nejprve vnést do bakterií rodičovský plazmid a v druhém kroku provést transfekci kyvadlovým plazmidem.
Ve třetím kroku jsou plazmidy (či vyštěpené funkční rekombinantní genomy) transfekovány do transkomplementujících buněk, čímž je umožněn vznik knihovny rekombinantních adenovirů. Je výhodné získané plazmidy izolovat a/nebo purifikovat a vy štěpit z nich rekombinantní genomy odpovídajícím enzymem (či enzymy), který neštěpí adenovirový genom.
Ve čtvrtém kroku je pomocí knihovny rekombinantních adenovirů infikována vybraná buněčná populace (či biologický materiál), čímž je možno analyzovat biologické či funkční vlastnosti klonů knihovny. K tomu je možno vybranou buněčnou populaci, která byla infikována, umístit do podmínek zajišťujících expresi nukleové kyseliny a tak identifikovat fenotyp hledaný danou analýzou buněčné populace. Pak je možno vrátit se k indukujícímu vektoru a charakterizovat DNA odpovědnou za hledaný fenotyp.
Pro robustnější funkční analýzy je výhodné testovat každý klon zvlášť a ne jejich soubor jako celek. Klony primární knihovny v kyvadlovém plazmidu, z nichž mají vzniknout mikroplaky, jsou tedy individuálně transformovány do bakterií, které již obsahují zkrácený rodičovský adenovirový plazmid. Po nárůstu mikroplaků pod selekčním tlakem (antibiotika) jsou získané DNA přečištěny a po vyštěpení genomu odpovídajícím enzymem (např. Pacl) transfekovány do pro30 dukčních eukaryotických buněk. Tento postup je znázorněn na obr. 2.
Ve výhodném provedení způsobu přípravy expresních adenovirových knihoven popsaném v předkládaném vynálezu lze využít klonovací technologii Gateway® vyvinout firmou Life Technologies, lne. (LTÍ, Rockville, MA, USA) a umožňující zejména souběžnou přípravu souboru adenovirů nesoucích inzerty odvozené např. z komplementární knihovny DNA či ze skupiny sekvencí charakterizovaných a selektovaných různými metodami známými odborníkům,
Klonovací technologie Gateway®, která je mimo jiné popsána v patentové přihlášce US 5 888 732, umožňuje během reakce in vitro přenášet inzerty např. mezi dvěma plazmidovými vektory pomocí rekombinačních reakcí na úrovni specifických míst attL, azzR, #//B a att? fakteriofága lambda (λ) Escherichia coli. Vložení genu již nevyžaduje přítomnost odpovídajících restrikěních míst uvnitř vektoru, nýbrž pouze přítomnost krátkých rekombinačních sekvencí zvaných sekvence att.
Podstatou klonovacího systému Gateway® je na jedné straně provedení reakce zvané LR, během které tzv. „Vstupní klon“ obsahující požadovaný inzert ohraničený místy aZZL rekombinuje s tzv. „Cílovým klonem“ obsahujícím místa aZZR, čímž vznikne tzv. „Expresní klon“. Požadovaný inzert nesený „Vstupním klonem“ je přenesen do „Expresního vektoru“, pocházejícího z „Cílového klonu“ obsahujícího místa attB. Na druhé straně spočívá klonovací systém Gateway® v proso vedení opačné reakce, označené jako BP, během které „Expresní klon“ obsahující požadovaný inzert ohraničený rekombinačními místy attB rekombinuje s tzv. „Dárcovským vektorem“ nesoucím místa ΰΖΖΡ, aby vznikl „Vstupní klon“ obsahující místa attL,
V konkrétním případě lze první strategii modifikovat kyvadlový plazmid jak byl popsán výše, např. pJJl, a připravit plazmid kompatibilní se systémem Gateway® obsahující příslušná místa
- 15CZ 302282 Β6 att. Tímto prvním způsobem jsou místa att přednostně zavedena mezi promotor (CMV) a polyadeny lační signál z SV40 v expresní kazetě kyvadlového plazmidu. Podle technologie Gateway10 je takto získaný plazmid označen jako „Cílový plazmid“ a může se následně zapojit do reakce se „Vstupními klony“ technologie Gateway“. V důsledku toho jakýkoli inzert pocházející z knihovny DNA či ze skupiny vybraných sekvencí, který je klonován do vektoru či „Vstupního klonu“, může být přenesen do kyvadlového plazmidu ve smyslu předkládaného vynálezu a poskytnout tak „Expresní kyvadlový plazmid“, který lze využít v tomto vynálezu k přípravě odpovídajícího adenovirového vektoru.
Další strategií je úplný adenovirový plazmid modifikován tak, aby byl kompatibilní s technologií Gateway'10. Jde tedy o to vnést odpovídající místa att do plazmidu nesoucího adenovirový genom, aby bylo možno provést reakce popsané v systému Gateway Místa att by měla výhodně nahradit oblasti El adenovirového genomu mezi promotorem a po lyadeny lační sekvencí. Takto lze popsanou strategií připravit plazmidy nesoucí adenovirové genomy obsahující různé inzerty, které původně byly součástí „Vstupních klonů“. Mohou to být inzerty pocházející z připravených knihoven cDNA, inzerty představující geny jedné a téže rodiny či inzerty jiného původu. Připraví se plazmid nesoucí adenovirový genom, který je modifikován a obsahuje sekvence att, takže představuje „Cílový klon“ ve smyslu technologie Gateway^ a ten se označí pAdDEST (příklad 6, obr. 10). Takto získaný „Cílový klon“ pAdDEST může reagovat s kterýmkoli „Vstupním klonem“ a vytvořit „Expresní plazmid“ nesoucí adenovirový genom: pAdExp, tak jak je popsán níže v příkladu 6 a na obr. 11.
Předkládaný vynález tedy představuje nový postup potvrzení (val i dače) či určení (identifikace) sekvence spojené s nějakým fyziologickým či genetickým účinkem vyvolávajícím charakteristický fenotyp. Může jít zejména o gen způsobující nějakou genetickou poruchu nebo o gen, který by mohl naznačovat výskyt určité genetické anomálie nebojí charakterizovat.
V aplikaci zaměřené na potvrzení či určení funkce jedné nebo více sekvencí v rámci funkční genomiky může jít o sekvence různého původu, zejména o sekvence uvedené výše, ale též o soubory sekvencí neznámého a odlišného původu. Tyto sekvence mohou být vneseny vedle sebe do různých expresních kazet, aby je bylo později možno vložit do požadovaného adenovirového genomu.
Tyto sekvence mohou pocházet z jakéhokoli typu živých buněk nebo mohou být připraveny uměle různými postupy jako např. syntézou de novo, mutagenezí, kombinací sekvencí apod.
V rámci předkládaného vynálezu může být využit jako zdroj nukleotidových sekvencí velký počet knihoven, včetně knihoven genomové DNA (zejména chromozomálních úseků — např, knihoven v YAC nebo BAC), ale nejen jich, knihoven cDNA, knihoven syntetických DNA, ať už jsou tyto knihovny normalizované či nikoli, pocházejí z různých typů živých tkání pro expresi „sense“ či „antisense“, z náhodně připravených sekvencí z nichž mohou vzniknout různé peptidy, z degenerovaných sekvencí odvozených od jedné známé sekvence, z mozaikové sekvence odvozené od známých sekvencí apod.
Studované primární sekvence tedy mohou tvořit zejména molekuly „antisense“ nebo oblasti sloužící k supresi genů. Jde o sekvence, který svou expresí mohou ve zkoumaném biologickém systému inaktivovat určitý gen. Může jít také o ribozymové sekvence.
Sekvence využité pro konstrukci knihovny mohou být připraveny různými syntetickými postupy.
V konkrétním případě umožňuje simulace řízené molekulární evoluce s využitím rekombinace připravit řadu různých genů (Curr. Op. in Biotech. 1997, 8: 724-733) pomocí dříve identifikovaných evolučních mechanismů.
Sekvence využité k přípravě knihoven také mohou pocházet a bioinformatické analýzy databází registrujících údaje z lidského genomu. Dají se selektovat pomocí analýzy genové exprese pro- 16CZ 302282 B6 vedené různými metodami (EST, microarrays, DNA chips, differential display) TIBtech 1996, 14 p294-298; Nátuře Biotechnology 1998, 16, p27-31.
Způsob podle vynálezu zejména umožňuje připravit expresní adenovirovou knihovnu randomizovaných peptidových sekvencí. Tím je pak možno selektovat a identifikovat sekvence náhodných peptidů schopných vázat se na požadovaný protein. Knihovna oligonukleotidů o náhodné sekvenci se vnese do místa (polylinkeru) odpovídajícího ohebné smyčce přirozeného či syntetického proteinu tak, aby peptidy byly prezentovány na povrchu proteinu. Proteiny mohou být prezentovány intracelulámě (Colas et al., 1996, Nátuře 380: 548-550) nebo na povrchu buňky (Tramonto et al., 1994, J. Mol. Recognit, 7: 9 až 24). Peptidy mohou být také prezentovány vně buňky, je-li do expresní kazety vnesen sekreění signál (Rice et al., 1992, PNAS 89, 5467 až 5471).
Do vektoru může být vložena jedna či více požadovaných sekvencí.
A konečně je možno hodnotit kombinaci sekvencí (expresních kazet) nebo společně exprimovanou požadovanou sekvenci a jiný důležitý gen, např. gen pro nějaký markér. Pak lze rozhodnout, zda se využije buď polycistronických sekvencí, nebo zda sekvence, která má být exprimována (či exprimovány) bude vložena do jiného místa uvnitř adenovirového genomu než požadovaná sekvence. Využitelných polycistronických sekvencí je řada Tzv. elementy IRES umožňují účinnou translaci dvou čí více otevřených čtecích rámců z jediné mRNA. V tomto případě jeden čtecí rámec kóduje požadovaný protein (pocházející z knihovny cDNA) a druhý čtecí rámec kóduje nějaký markér, jako např. GFP.
Uvedený postup umožňuje využít vkládací/vyštěpovací systémy spojené s nějakou enzymatickou aktivitou. Může jít např. o systém CRE-Lox (Baubonis et al., Nucl. Acíds Res. 21: 2025 až 2029), systém FLP rekombináza - FRT (Dang et at, Dev. Gent. 13: 367 až 375), systém Piv z Moraxella lacunata (Leníc et al., 1994, J. Bacteriol. 176 až 4160) nebo systém integrázy lambda (Kwon et al., 1997, Science 276, 126). V tomto případě je sekvence expresní kazety cDNA spojena s epizomálním replikativním vektorem, vyštěpena systémem Cre-Iow z adenovirového genomu a přenáší se do dělicích se infikovaných buněk (WO97/47757).
Uvedený postup zjednodušuje průkaz interakcí DNA s proteiny. V tomto případě je knihovnou populace sekvencí schopných vázat se na DNA. Jde buď o polypeptidy odvozené z proteinů s přirozenou schopností vázat se na DNA, nebo o umělé polypeptidy. Hledá se sekvence s nejvyšší spécifítou k dané sekvenci DNA.
Tímto způsobem je také možno prokazovat interakce mezi proteiny. Využívá se zde schopnosti současné infekce adenovirových vektorů. Výhodně se využívá komplementačního testu s LacZ (PNAS 1997, 94, 8405 až 8410). Buněčný systém se infikuje současně prvním konstruktem a knihovnou cDNA.
Funkčních testů, které mohou být prováděny pro analýzu expresní adenovirové knihovny popsané v předkládaném vynálezu, je velký počet a mnoho druhů.
Lze např. využít komplementační testy, kterými se identifikuje nukleotidová sekvence pocházející z knihovny, jejíž exprese vede k hledanému buněčnému fenotypu. V tomto případě může být použita adenovirová expresní knihovna k infekci lidské buňky, která je deficientní pro nějaký fenotypový znak. Následuje analýza infikovaných buněk a identifikace buněk, které potom nesou hledaný fenotypový znak, a dále analýza cDNA nesené virem odpovídajícím za projev fenotypového znaku. Lze také zjistit míru vymizení fenotypového znaku po infekci, které je výsledkem „antisense“ aktivity nebo funkčního vyřazení genu („knock-out“).
Postup zjednodušuje hledání mechanismu účinku chemických molekul v biologickém systému. Adenovirová expresní knihovna slouží k infekci buněk biologického systému reagujícího na úči- 17CZ 302282 B6 nek léčiva. Po infekci může být účinek léčiva nezměněn, zvýšen nebo snížen. V obou posledních případech zjednodušuje analýza cDNA nesených virovými genomy odhalení i ntracelu lárních a/nebo extracelulárních cest zapojených do účinku chemické sloučeniny.
Postup popsaný v předkládaném vynálezu tedy může být aplikován za účelem:
- hledání nukleovýeh kyselin (cílů) umožňujících účinky p53 v procesu zástavy růstu a apoptó- identifikace cytokinů
- identifikace syntetických peptidů ovlivňujících buněční procesy
- hledání molekul schopných extracelulámí prezentace peptidů
- identifikace cílů pro nádorové buňky, které nevykazují nádorové specifické supresory
- identifikace genů účastnících se metastatického procesu.
Předkládaný vynález se také týká soupravy (kitu), která obsahuje:
- kyvadlový plazmid nesoucí zkrácený adenovirový genom, a
- rodičovský plazmid nesoucí druhý zkrácený adenovirový genom, přičemž oba plazmidy jsou schopny homologní rekombinací zkrácených adenovirových genomů, které obsahují, vytvořit konečný plazmid nesoucí úplný lineární genom rekombinantního adenoviru ohraničený jedním či více restrikčními místy nevyskytujícími se v daném genomu.
Předkládaný vynález bude úplněji popsán pomocí následujících příkladů, které jsou pouze ilustrativní a neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Schéma principu předkládaného vynálezu. Kyvadlový plazmid pJJI a rodičovský plazmid pOSEl, nesoucí vzájemně komplementární úseky, vytvářejí v E. coli homologní rekombinací koagregát a výsledkem je úplný adenovirový genom obsahující exogenní sekvenci.
KmR: gen pro rezistenci ke kanamycinu. TetR: gen pro rezistenci k tetracyklinu. RK2 Ori: počátek replikace plazmidu RK2. RK6 Ori: počátek replikace plazmidu RK6.
Obr. 2. Souběžná příprava 96 rekombinantních adenovirů nesoucích cDNA pocházející z knihovny cDNA v kyvadlovém plazmidu. Aplikace možných postupů technologie OSEDRAG.
Obr. 3. Příprava rodičovského plazmidu nesoucího neúplnou a tedy nefunkční sekvenci adenovirového genomu technologií EDRAG podle předkládaného vynálezu (Crouzet et al.). Mapy plazmidu pJJ301, pXL32I5 a pOSE 17-00.
Obr. 4. Mapy různých verzí rodičovských plazmidu využitelných v předkládaném vynálezu k přípravě různých verzí rekombinantních adenovirových vektorů, zejména vektorů s deletovanými oblastmi El a E3 (pOSE 10-00), vektorů s deletovanými oblastmi El a E3 a vybavených oblastí plX ve formě syngen#2 (WO99/25861) - (pOSE 17-00), vektorů s deletovanými oblastmi El, E3 a E4 (pOSE 30-00) a vektorů s deletovanými oblastmi El, E3 a E4 a vybavených oblastí plX ve formě syngen#2 (pOSE 37-00).
Obr. 5. Příprava rekombinantního adenovirového genomu nesoucího expresní kazetu pro gen LacZ postupem předkládaného vynálezu. Mapa kyvadlového plazmidu pIG5, rodičovského plazmidu pOSE17-00 a konečného plazmidu pAdl7-01. Mapy plazmidu pIG5, pOSE17-00 a pAd 174)1.
- 18CZ 302282 B6
Obr. 6. Příprava adenovirových genomů postupem předkládaného vynálezu pomocí tří různých kyvadlových plazmidů (pIG5: nesoucího expresní kazetu pro gen LacZ; plazmidů pIG18: nesoucího expresní kazetu pro luciferázový gen a pIG7: bez expresní kazety). Enzymatické štěpení výsledných klonů po společné transformaci kyvadlovým a rodičovským plazmidem.
Obr. 7. Příprava adenovirových vektorů postupem předkládaného vynálezu po transfekci různých klonů plazmidů pAD 17-01 do produkčních buněk 293. Enzymatické štěpení puntíkovaných virových DNA získaných po amplifikaci virů v buňkách 293.
io Obr. 8. Příprava knihovny adenovirových genomů získaných pomocí primární knihovny cDNA v kyvadlovém plazmidů pTAOO postupem předkládaného vynálezu. Knihovna adenovirových genomů byla získána pomocí rodičovského plazmidů pOSE37-10, což je plazmid odvozený z pOSE37-O0. Mapy plazmidů pTAOO, pOSE37-10 a pAd37-10.
Obr. 9. Příprava expresního plazmidů pAdGWExpLacZ kompatibilního se systémem Gateway'10 (LTI, Rockeville, MA, USA) homologní rekombinací plazmidů pSHExpLacZ a Px 12689.
Obr. 10. Příprava „Cílového plazmidů“ pAdDEST, nesoucího úplný adenovirový genom a gen codB letální pro E. coli reakcí zvanou BP. Adenovirový genom je ohraničen rekombinačními místy aZZRI a UZZR2.
Obr. 11. Příprava adenovirového plazmidů pAdExp nesoucího požadovaný inzert reakcí zvanou LR.
Příklady provedení vynálezu
Obecné techniky klonování, molekulární biologie a buněčné biologie, použité ve vynálezu.
Obecné metody molekulární biologie jako centrifugace plazmidové DNA v gradientu chloridu česného a ethidiumbromidu, štěpení restrikčními enzymy, gelová elektroforéza, transformace E. coli, srážení nukleových kyselin apod. jsou popsány v literatuře (Maniatis et al., 1989).
Enzymy byly dodány firmou New-England Biolabs (Baverly, MA). Pro ligaci se fragmenty DNA oddělí podle velikosti na 0,8 až 1,5% agarózových gelech, vyčistí pomocí GeneClean (BIO101, LaJolla, CA) a inkubují pres noc při 14 °C v 50 mM pufru Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP za přítomnosti DNA ligázy fága T4.
Ligované DNA se využijí k transformaci kompetentních bakterií E. coli kmene TG1 [Aflae proA,B), supE, thi, hsdD5/F' traD36, proA\ B+, laclq, lacZAM151 (Maniatis et al., 1982), kmene ToplO E. coli (TOP10 One Shot kit, Invitrogen, Nizozemí) Či kmene polA E. coli SF800 (Heffron etal., 1977).
Amplifikace v polymerázové řetězové reakci, PCR (polymerase chain reaction) byla též prováděna podle Maniatise et al., 1989, s následujícími specifikacemi:
- de nátur ační teplota 95 °C, hybrid izační teplota 55 °C, prodlužovací teplota 72 °C. Tento cyklus byl opakován 25x v cykleru PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Massachusetts, USA).
Oligonukleotidy byly syntetizovány společností GEN SET (Evry, Francie). Sekvenování bylo prováděno společností ESGS (Evry, Francie).
- 19CZ 302282 B6
Příklad I
Příprava rodičovských plazmidů
Tento příklad popisuje přípravu adenovirového genomu, lidského adenoviru typu 5, zkráceného na 5'-konci, deletovaného v oblastech El a E3 a ohraničeného v 3'-oblasti unikátním restrikčním místem, vneseného do plazmidu skupiny inkompatibility P replikujícího se v E. coli.
Plazmidy popsané v předkládaném vynálezu mohou být připraveny různými způsoby. Ve výhodném provedení se metodologií EDRAG (FR2,730,504) připraví plazmid pOSE 17-00 z plazmidů pXL3215 a pJJ301. Plazmid pXL3215 obsahuje celý genom AD (bez dvou deleci v oblastech El a E3) a nese v oblasti El expresní kazetu pro gen LacZ řízenou promotorem RSV. Plazmid pXL3215 je odvozen z plazmidu pXL2689 a obsahuje počátek replikace plazmidu RK2 a gen pro rezistenci k tetracyklinu (J. Crouzet, PNAS, 1997).
Plazmid pJJ301 obsahuje počátek replikace RK6 a nemůže se replikovat v bakteriálních kmenech pir- E. coli. Tento plazmid obsahuje gen pro rezistenci ke kanamycinu. Plazmid pJJ301 obsahuje oblast homologní s počátečním úsekem adenovirového genomu neseného plazmidem pOSEI700. Jde o zvláštní verzi oblasti pIX zvanou syngen#2, která je popsána v přihlášce WO 99/25861. Před tuto sekvenci je vložena sekvence homologní k oblasti předcházející úplný adenovirový genom v plazmidu pXL3215. Dvojitou rekombinací plazmidů pXL3215 a pJJ301 vznikne pOSE 17 00. Tento plazmid pOSE17-00 odpovídá rodičovskému plazmidu ve smyslu postupu popsaného v předkládaném vynálezu a je schematicky znázorněn na obr. 3.
Další rodičovské plazmidy (pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE37-00) byly připraveny podle téhož schématu umožňujícího přípravu adenovirových genomů deletovaných v oblastech El a E3 (verze s oblastí pIX divokého typu či verze s degenerovanou oblastí pIX) (WO99/25861) či adenovirových genomů deletovaných v oblastech El, E3 a E4 (verze s oblastí pIX divokého typu či verze s degenerovanou oblastí pIX) (obr. 4).
Příklad 2
Příprava kyvadlových plazmidů
V tomto příkladu je popsána příprava kyvadlového plazmidu nesoucího 5 -oblast adenovirového genomu (oblast ITR a enkapsidační oblast) lidského adenoviru typu 5, před kterou se nachází restrikční místo pro Pacl.
Tento plazmid obsahuje počátek replikace RK6 a není schopen replikovat se v kmenech E. coli, které nemohou transkomplementovat protein pir. Tento plazmid pIG5 obsahuje expresní kazetu pro LacZ, které předchází sekvence homologní k sekvenci nesené plazmidem pOSE17-00 (sekvence odpovídající části oblasti pIX Iva2). Tento plazmid se nazývá kyvadlový ve smyslu předkládaného vynálezu a obsahuje gen pro rezistenci ke kanamycinu (obr. 5).
Příklad 3
Příprava funkčního rekombinantního adenovirového genomu
V tomto příkladu je popsáno vnesení funkčního adenovirového genomu deletovaného v oblastech El a E3 lidského adenoviru typu 5, ohraničeného na koncích restrikčním i místy pro Pacl, do plazmidu skupiny inkompatibility P replikujícím se v E. coli a nesoucím expresní kazetu pro gen LacZ.
-20CZ 302282 B6
Strategií pro stabilní integrací je homologní rekombinace plazmidů pOSE17-00 a pIG5 v E. coli. Plazmid pOSE 17-00 byl vnesen do bakterií kmene E. coli JM83 Rec+ lacZ. Posléze byly z klonu rezistentního k tetracyklinu připraveny kompetentní buňky, transformovány plazmídem pIG5 a vysety na půdu LB s tetracyklinem a kanamycinem. Jelikož plazmid pIG5 se nereplikuje v kmenu JM83, rezistence k tetracyklinu a kanamycinu může být navozena pouze homologní rekombinaci mezi oběma plazmidy. Ta se může odehrát proto, že tyto dva plazmidy mají společnou oblast pIX genomu Ad5. Výsledný plazmid obsahuje úplný genom rekombinantního adenovirového vektoru ohraničený restrikčním místem pro Pacl. Štěpení enzymy Pacl a HindlII, EcoRI ěi Pacl a Dral umožňuje kontrolu získané plazmídové struktury. Tento konečný plazmid nesoucí io funkční adenovirový genom byl pojmenován pAd 17-00 (obr. 5).
Stejným způsobem vzniká z plazmidů pIG5 a pOSE37-00 plazmid nesoucí úplný adenovirový genom deletovaný v El, E3 a E4 a obsahující oblast pIX ve formě syngen#2 (WO99/25861).
Kromě toho lze toutéž strategií připravit další rekombinantní genomy téže rodiny, ať už nesoucí expresní kazetu či bez ní. Využívají se plazmidy plG7 a pIG18 odvozené zpíG5: pIG7 nemá expresní kazetu, pIG18 nese expresní kazetu s genem pro luciferázu. Pokud expresní kazeta nevykazuje sekvenční homologii sgenomovou sekvencí bakteriálního chromozomu, 100% klonů by mělo být pozitivních. Obr. 6 dokumentuje, že 100 % klonů analyzovaných na konci tohoto pokusu vykazovalo přítomnost očekávaných nukleotidových sekvencí.
Plazmid pAd!7-01 byl štěpen enzymem Pacl, čímž se zněj uvolnil genom rekombinantního adenoviru. Produkt tohoto štěpení může být sám o sobě využit k transfekci savčích buněk transkomplementujících funkce El adenoviru (buňky 293).
Příklad 4
Příprava rekombinantních adenovirů
Klony rekombinantních adenovirů mohou být připraveny v Escherichia coli, a to (i) vnesením úseků nesoucích jeden čí více genů s odpovídajícími regulačními signály pro expresi těchto genů ve studovaných savčích buňkách nebo (ii) delccí určitých úseků adenovirového genomu, nebo také kombinací obou těchto postupů; po transfekci produkčních buněk pak může být získán zásobní preparát daného rekombinantního viru.
Plazmid pAd 17-01 se izoluje a puntíkuje z kultury kompetentních transformovaných buněk E. coli DH5. Adenovirový genom se vyštěpí pomocí restrikčního enzymu Pacl. Produkt štěpení se přímo využije k přípravě rekombinantních adenovirů. Za tímto účelem jsou buňky linie 293 transfekovány produktem štěpení pAd 17-01 za přítomnosti Effectene (Qiagen, Německo). Rekombinantní adenovirus se v buňkách linie 293 pomnoží tak, že supematant kultury obsahuje nečištěný rekombinantní adenovirus o titru cca IO10 pfu/ml.
Odpovídající struktura vírové DNA se ověří enzymatickým štěpením po vyčištění DNA získané z pomnožených virů (obr. 7).
Virové partikule se poté vyčistí na gradientu chloridu česného známými technikami (viz zvi. Graham et al., Virology 52 (1973) 456) nebo chromatograficky. Adenovirus lze uchovávat při 80 °C ve 20% glycerolu.
Příklad 5
Příprava expresních adenovirových knihoven
-21 CZ 302282 B6
K přípravě primární knihovny kyvadlových plazmidů se využívá kyvadlového plazmidu s počátkem replikace RK6. Homologní rekombmaeí pak tato knihovna poskytne knihovnu rekombínantníeli adenovirovýeh genomů v plazmidu nesoucím počátek replikace RK2. Tato knihovna plazπι idu s rekombinantnimi adenovirovými genomy se trans fekuje do produkčních transkompiemen5 tujících buněk k získání knihovny rekombinantních adenovirů.
Přehled kroků tohoto postupu je znázorněn na obr. 2 a plazmidové struktury sloužící k získání expresní adenovirové knihovny jsou na obr. 8.
Příklad 5.1
Příprava knihovny cDNA v kyvadlovém plazmidu
Pro přípravu knihovny v kyvadlovém vektoru (odvozeném od pIG5, z něhož byl vyštepen gen LacZ a nahrazen polyklonovacími místy, zejména pro Xhol a EcoRl) bylo 10 až 20 pg vektoru purifikovaného v gradientu chloridu česného štěpeno 5 U/pg enzymů Xhol a EcoRl po dobu 90 min při 37 °C. Restrikční směs byla nanesena na agarózový gel (1% Seakem GTG) a linearizovaný vektor byl elektroforeticky separován v pufru TAE. Proužek odpovídající vektoru byl po vizualizaci na UV prohlížeči vyříznut z gelu. Vektor byl eluován zagarózy (Qiaquick DNA Cíeanup Systém, Quiagen, Německo) a vyčištěn extrakcí směsí fenolu a chloroformu s následným etanolovým srážením. Pomocí tohoto vektoru lze po ligaci testovacího inzertu štěpeného EcoRl a Xhol získat asi 5 milionů klonů/pg při pozadí 10 %.
Příprava cDNA: syntéza cDNA vychází z populace RNA obohacené o mRNA. Syntéza prvního vlákna se provádí podle obecně známých protokolů s využitím transkriptázy Superscript II (Stratagene) pomocí primeru oligo dT nesoucího sekvenci pro místa Xhol na 5'-konci. Syntéza druhého vlákna se provádí pomocí enzymu DNA polymerázy z E.coli za přítomnosti RNázy H a DNA ligázy z E, coli. Koncové sekvence vytvořené druhým vláknem jsou doplněny pomocí .in DNA polymerázy T4.
Získané cDNA jsou frakcionovány podle velikosti gelově filtrační chromatografií pomocí Biogel A50M jak bylo popsáno (Soares et al., PNAS 91: 9228 až 9232). Frakce cDNA rozdělené podle velikosti jsou ligovány s komerčními adaptéry EcoRl (Stratagene) a štěpeny EcoRl, čímž vznik.15 nou fragmenty cDNA ohraničené místy pro EcoRl na 5'-konci a Xhol na 3'-konci. Neligované adaptéry se chrom atograficky odstraní na koloně Sepharose CL4B (Pharmacia). cDNA nesoucí adaptéry jsou fosfory lovány pomocí polynukleotid-kinázy T4 a ligovány pomocí DNA ligázy T4 do míst EcoRl a Xhol kyvadlového vektoru připraveného výše popsaným postupem při 16 °C po dobu až 48 h (600 ng vektoru + 300 ng inzertu v objemu 10 až 20 pl). Knihovna je amplifikována
4o elektroporací v kmenu pir.l 16+ umožňujícím replikaci plazmidů nesoucích počátek replikace RK6 a vyseta na 100 agarových (LB agar) ploten o průměru 150 mm obsahujících kanamycin. Takto je získána knihovna o 5 milionech klonů. Primární knihovna cDNA v kyvadlovém plazmidu se poté normalizuje postupem, který popsal Soares et al., 1994. Technikami umožňujícími určit expresní profil klonů, např. DNA čípky (Amersham, Molecular Dynamics, Affymetrix), může být provedena selekce vybraného souboru klonů.
Selektované klony z normalizované knihovny cDNA v kyvadlovém plazmidu se nanesou na mikrodestičky s 96 hlubokými důlky, vždy jeden klon do důlku. Tyto klony se namnoží v kapalném médiu (LB) za přítomnosti odpovídajícího antibiotika (kanamycin). Příprava DNA z každého klonu se provádí současně pro všech 96 kultivovaných vzorků pomocí robota Quiagen (Quiagen Biorobot 9600) a sestavou Quiaprep 96 Turbo Biorobot (Quiagen, Německo). Vzorky DNA jsou odebrány v 50 pl Ix Te. Poradí všech 96 vzorků plazmidové DNA se seřadí podle tzv. primární destičky.
Příklad 5.2
Příprava plazmidové knihovny funkčních adenovirových genomů nesoucích cDNA.
Rodičovský adenovirový genom v plazmidu RK2 (pOSE37-00) se vnese klasickou transformací do bakterií kmene JM83. Standardními technikami postupného promývání ve 100 mM CaCl2 se připraví kultura kompetentních bakterií obsahujících plazmid (JM83xpOSE37-00).
Kompetentní buňky (JM38xpOSE37-00) se po 40 μΙ nanesou na mikrodestičku s 96 hlubokými io důlky. DNA každého kyvadlového plazmidu je transformována do buněk tohoto kmene, aby homologní rekombinaci byl získán funkční adenovirový genom. 5 μΙ DNA získané z tzv. primární destičky se poté přidá k 40 μΐ kompetentních buněk při zachování pořadí vzorků. Destička se na 1 min přenese do 42 °C a poté se umístí na 2 min na led. Do každého důlku se přidá 1 ml média (LB) obsahujícího dva odpovídající druhy antibiotik (kanamycin, tetracyklin). Po počáteč15 ním 6 h růstu je 50 μΐ této kultury vyseto na novou destičku s 96 hlubokými důlky obsahujícími l ml média (LB) a dva odpovídající druhy antibiotik (kanamycin, tetracyklin). Buňky jsou dále kultivovány po dobu 14 h.
Plazmidová DNA získaná z této kultury je vyčištěna pomocí robotu Quiagen (Quiagen Biorobot
9600) a sestavy R.E.A.L. Prepr 96 Biorobot, přičemž se před srážením izopropanolem přidá separační krok Quiawell ze sestavy Qiawell 96 Ultra Biorobot Kit (Quiagen, Německo). DNA je odebrána v 50 μΐ Ix TE.
μΙ každého vzorku DNA (cca 0,4 μg) se pak přenese na novou mikrodestičku o 96 důlcích při zachování pořadí. Tato DNA se štěpí enzymem PacI, aby se uvolnil virový genom. Do každého důlku s 20 μΙ DNA se přidá 10 μΐ reakční směsi (3 μΐ pufru Nel, 6 μΐ H2O, 1 μΐ (2,5 U) Pacl). Reakce probíhá při 37 °C po dobu 1 h 30 min. Destička je centrifugována a zmražena na -20 °C do dalšího použití.
Virová DNA musí být štěpena enzymem Pacl, aby se uvolnil adenovirový genom, a poté transfekována do transkomplementujících eukaryotických buněk pro přípravu virové knihovny.
Příklad 5.3
Příprava expresní adenovirové knihovny
Destička s 96 hlubokými důlky obsahujícími DNA štěpenou Pacl je temperována na laboratorní teplotu. Do každého důlku s 30 μΐ DNA štěpené Pacl se přidají 2 μΐ Enhanceru a 15 μΐ Effectene (Effectene Transfection Reagent, Quiagen, Německo). Transfekční směs je poté přenesena na novou destičku s 96 nebo 48 důlky, do kteiých bylo předem vyseto 105/cm2 buněk IGRP2 (WO96/22378).
Čtrnáct dní po transfekci se odebere 50 až 75 μΐ supematantu kultury z každého důlku a použije jako inokulum pro infekci na nové destičce obsahující čerstvě vyseté transkomplementující buňky. Tento amplifikační krok je 3 až 5krát zopakován, aby byla zajištěna homogenita získaného virového titru v každém důlku. Titr činí na každý důlek 5 x 108 až 5 x 109 virových partikulí na ml. Destička je centrifugována a zamražena při -20 °C.
Takto získané viry mohou být aplikovány přímo na odpovídající biologický systém. Po infekci buněčného modelu virovou knihovnou jsou stanoveny podmínky funkční analýzy, která je pak provedena. Hledá se zejména proapoptotická, antiangíogenetická či antiapoptotická aktivita v závislosti na použitém modelu. Pořadí klonů a tedy i virů určené v průběhu přípravy knihovny
-23 CZ 302282 B6 umožňuje snadné vyhledání nuklcotidové sekvence spojené s funkční aktivitou a tím i určení nového terapeutického cíle.
s Příklad 6
Příprava plazmidu nesoucího adenovírový genom kompatibilní s klonovacím systémem Gateway0 nabízeným firmou Life Technologies (LTI, Rockeville, MA. USA) io Připraví se plazmid pSHExplacZ, obsahující promotor CMV, místo <a//B 1, gen LacZ, místo a//B2 a polyadenylační signál SV40 v kyvadlovém vektoru genu LacZ pocházejícího z plazmidu pSV40-lacZ (Promega) štěpena HindlII a Dral a vložena do restrikěních míst XmnI a EcoRV plazmidu pENTR-1 A popsaného firmou Life Technologies v přihlášce US 5 888 732, čímž se získá plazmid pENTR-LacZ. Reakcí typu LR (Gateway* cloning technology) mezi pENTR15 LacZ a pDest!2.2 vznikne pExpLacZ (název podle technologie Gateway*). Konečné získání pSHExpLacZ bylo zjednodušeno dvěma subklonovacími kroky: fragment Ncol/Asel z pExpLacZ byl vložen do míst pro Asel a Ncol plazmidu pCA35O (odvozeného z pIG5), čímž vznikl plazmid pS Exp LacZ. A konečně fragment Pacl/Sall z pSExpLacZ byl vložen do Pacl/Sal I plazmidu pIG7 (odvozeného z pIG5). Ve finální podobě se sekvence: promotor CMV, místo attB 1, gen LacZ,
2o místo attB2 a polyadenylační signál SV40 nacházejí v místě, kde byla expresní kazeta kyvadlového plazmidu plG5 (příklad 2). Takto získaný plazmid je označen jako pSHExpLacZ a je znázorněn na obr. 9.
Poté se metodologií EDRAG (FR 2,730,504) z plazrnidů pSHExpLacZ a pXL2689 připraví plazmid označený jako pAdGWExpLacZ kompatibilní se systémem Gateway*.
Plazmid pXL2689 popsaný Crouzetem et al. (PNAS 1997) obsahuje počátek replikace plazmidu RK2, gen pro rezistenci ktetracyklinu a infekční adenovírový genom sdelecemi v El a E3. Rekombinaci plazmidu pXL2689 a pSHExpLacZ vznikne plazmid pAdGWExpLacZ nesoucí adenovírový genom a inzert obsahující promotor CMV, místo attB 1, gen LacZ, místo «Ζ/Β2 a polyadenylační signál SV40 (obr. 9).
Takto získaný plazmid pAdGWxpLacZ obsahuje požadovaný gen, jímž je LacZ, mezi dvěma rekombinačními místy attB fága lambda E. coli a reaguje s tzv. „Dárcovským vektorem“ systému
Gateway* (pDONR20t) nesoucím místa attB, gen pro rezistenci ke kanamycinu (Kn*) a gen ccdB letální pro E. coli. Výsledný plazmid této tzv. reakce BP podle nomenklatury technologie klonovacího systému Gateway* je nazván pAdDEST („Cílový plazmid“) a je znázorněn na obr. 10.
•w A konečně plazmid pAdDEST reaguje díky místům z/ZZRl a rz//R2 stzv. „Vstupním klonem“ systému Gateway* nesoucím požadovaný inzert ohraničený rekombinačními místy o/íLI a att\J2 v tzv. reakci LR. Takto získaný plazmid je nazván pAdExp a nese jak úplný adenovírový genom, tak i požadovaný inzert (obr. 11).
Literatura
Ausubel et al., 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Wiley and Sons, New York.
Bolivar et al., 1977. Gene 2:95.
CrouzetetaL, 1997, PNAS 94, 1414-1419
Dagert et al., 1979. Gene, 6, 23-28.
Dittaetal., 1980. Plazmid, 13, 149-154.
Ghosh-Choundhurry et al., 1986. Gene, 50, 161-171.
Hamilton et al., 1989. J. Bacteriol. 171:4617^4622.
-24CZ 302282 B6
Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol. 166:557.
HefFron et al.. 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 702-706.
Maniatis T., et al., 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoiy, New York.
Miller, et al., 1988. J. Bacteriol. 170:2575-2583.
Simoes, et al. 1991. New York Acad. Sci. 646:254-258.
Sinha N. D. et al. 1984. Nucl. Acids. Res., 12,4539-4557.
Slater, etal. 1993. J. Bacteriol. 175:4260-4262.
Viera,etal., 1982. Gene, 19,259-268.
Wirth, etal. 1989. Mol. Gen. Genet., 216, 175-177.
Zeef, etal. 1994. EMBOJ. 13:5113-5120.
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy adenovirů, vyznačený tím, že zahrnuje:a) přípravu prvního plazmidu nazývaného kyvadlovým plazmidem, výhodně prokaryotického plazmidu, který obsahuje první zkrácený rekombinantní adenovirový genom obsahující alespoň jednu heterologní nukleovou kyselinu,b) provedení kontaktu prvního plazmidu s druhým plazmidem nazývaným rodičovským plazmidem, který obsahuje druhý zkrácený rekombinantní adenovirový genom, který je komplementární ke genomu prvního plazmidu, přičemž oba plazmidy jsou v cyklické formě, a umožnění prostřednictvím homologní rekombinace vzniku konečného plazmidu obsahujícího úplný rekombinantní adenovirový genom, ac) vyštěpení úplného lineárního rekombínantního adenovirového genomu z konečného plazmidu a jeho vnesení do enkapsidační linie, čímž se připraví rekombinantní adenoviry obsahující úplný rekombinantní adenovirový genom, přičemž jak kyvadlový plazmid, tak í rodičovský plazmid obsahují identickou adenovirovou homologní oblast, oba tyto plazmidy obsahují počátek replikace a odlišný selekční markér pro selekci každého členu a oba plazmidy obsahují ITR ohraničenou restrikčním místem, které není přítomno v adenovirovém genomu, a jeden nebo druhý plazmid obsahuje enkapsidační sekvenci.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dodatečně obsahuje:- použití připravených rekombinantních adenovirů k infekci:- biologického materiálu obsahujícího buňky s cílem analyzovat vlastnosti nukleové kyseliny,- buněčné kultury in vitro nebo ex vivo s cílem produkovat protein, polypeptid nebo peptid kódovaný heterologní nukleovou kyselinou.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že se použije pro přípravu expresních adenovirových knihoven.
- 4. Souprava pro studium terapeuticky účinných sloučenin, vyznačená tím, že obsahuje:- kyvadlový plazmid obsahující první zkrácený genom adenovirů obsahující alespoň jednu heterologní nukleovou kyselinu a-25CZ 302282 B6- rodičovský plazmid obsahující druhý zkrácený genom adenovirů a obsahující alespoň jednu heterologní nukleovou kyselinu, přičemž oba plazmidy jsou schopné prostřednictvím homologní rekombinace obou zkrácených adenovirových genomů produkce konečného plazmidů obsahujícího úplný lineární
- 5 rekombinantní adenovirový genom ohraničený jedním nebo více restrikčními místy, které nejsou přítomné v uvedeném geonomu, přičemž jak kyvadlový plazmid, tak ί rodičovský plazmid obsahující identickou adenovirovou homologní oblast, oba tyto plazmidy obsahují počátek replikace a odlišný selekční markér pro selekci každého Členu a oba plazmidy obsahují ITR ohraničenou restrikčním místem, které io není přítomno v adenovírovém genomu, a jeden nebo druhý plazmid obsahuje enkapsídační sekvenci.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9912521A FR2799472B1 (fr) | 1999-10-07 | 1999-10-07 | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| US16835699P | 1999-12-01 | 1999-12-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021215A3 CZ20021215A3 (cs) | 2002-08-14 |
| CZ302282B6 true CZ302282B6 (cs) | 2011-02-02 |
Family
ID=26235132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021215A CZ302282B6 (cs) | 1999-10-07 | 2000-10-05 | Zpusob prípravy adenoviru a souprava pro studium terapeuticky úcinných sloucenin |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8263395B2 (cs) |
| EP (1) | EP1224310B1 (cs) |
| JP (1) | JP5260815B2 (cs) |
| KR (1) | KR100928105B1 (cs) |
| CN (1) | CN1384885B (cs) |
| AT (1) | ATE355385T1 (cs) |
| AU (1) | AU785431B2 (cs) |
| BR (1) | BR0014489B1 (cs) |
| CA (1) | CA2383225C (cs) |
| CZ (1) | CZ302282B6 (cs) |
| DE (1) | DE60033679T2 (cs) |
| DK (1) | DK1224310T3 (cs) |
| FR (1) | FR2799472B1 (cs) |
| HK (1) | HK1050211B (cs) |
| HU (1) | HU228933B1 (cs) |
| IL (2) | IL148493A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02003247A (cs) |
| NO (1) | NO330916B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ518763A (cs) |
| PL (1) | PL210590B1 (cs) |
| WO (1) | WO2001025463A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200202481B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001059071A2 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-16 | Genvec, Inc. | Methods of preparing and using a viral vector library |
| EP2471909A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-04 | SIRION BIOTECH GmbH | Nucleic acid molecules for generating adenoviral vectors |
| GB201322851D0 (en) * | 2013-12-23 | 2014-02-12 | Psioxus Therapeutics Ltd | Method |
| CN109576231B (zh) * | 2017-09-28 | 2022-03-25 | 北京康万达医药科技有限公司 | 分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途 |
| WO2019155833A1 (ja) * | 2018-02-07 | 2019-08-15 | 学校法人日本医科大学 | 改良型アデノ随伴ウイルスベクター |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2718150A1 (fr) * | 1994-03-29 | 1995-10-06 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| FR2730504A1 (fr) * | 1995-02-13 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| FR2755975A1 (fr) * | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants bicistroniques utiles pour le traitement de pathologies liees aux dyslipoproteinemies |
| US5922576A (en) * | 1998-02-27 | 1999-07-13 | The John Hopkins University | Simplified system for generating recombinant adenoviruses |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3486053T3 (de) | 1983-10-20 | 2004-01-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS. |
| US6696420B1 (en) * | 1984-11-20 | 2004-02-24 | Institut Pasteur | Adenoviral vector with a deletion in the E1A coding region expressing a hetorologous protein |
| FR2573436B1 (fr) | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
| US6007806A (en) * | 1986-08-13 | 1999-12-28 | Transgene S.A. | Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor |
| US5744133A (en) * | 1986-08-13 | 1998-04-28 | Transgene S.A. | Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventitive or curative treatment of the corresponding tumor |
| FR2602790B1 (fr) | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
| FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
| EP1024198A3 (en) | 1992-12-03 | 2002-05-29 | Genzyme Corporation | Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae |
| FR2704556B1 (fr) | 1993-04-30 | 1995-07-13 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique. |
| FR2705363B1 (fr) | 1993-05-13 | 1995-08-11 | Clecim Sa | Procédé de fusion de ferraille dans un four électrique et installation pour la mise en Óoeuvre du procédé. |
| FR2705361B1 (fr) | 1993-05-18 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| US6133028A (en) * | 1993-05-28 | 2000-10-17 | Transgene S.A. | Defective adenoviruses and corresponding complementation lines |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| SK282843B6 (sk) | 1993-07-13 | 2002-12-03 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom |
| US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
| ATE336587T1 (de) | 1994-06-10 | 2006-09-15 | Genvec Inc | Adenoviren-vektor systeme und zelllinien |
| FR2724945B1 (fr) * | 1994-09-27 | 1996-12-27 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
| FR2726285B1 (fr) | 1994-10-28 | 1996-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation |
| FR2730411B1 (fr) * | 1995-02-14 | 1997-03-28 | Centre Nat Rech Scient | Association medicamenteuse utile pour la transfection et l'expression in vivo d'exogenes |
| EP2322614A1 (en) * | 1995-06-07 | 2011-05-18 | Life Technologies Corporation | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
| US5783431A (en) * | 1996-04-24 | 1998-07-21 | Chromaxome Corporation | Methods for generating and screening novel metabolic pathways |
| FR2749857B1 (fr) | 1996-06-12 | 1998-08-14 | Centre Nat Rech Scient | Generation de molecules replicatives in vivo |
| US5846812A (en) * | 1996-11-22 | 1998-12-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Zearalenone detoxification compositions and methods |
| FR2774699B1 (fr) * | 1997-11-17 | 2003-10-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de reduction des evenements de recombinaison homologue |
| US6844270B2 (en) * | 2000-11-26 | 2005-01-18 | Shipley Company, L.L.C. | Polymers and photoresist compositions for short wavelength imaging |
| SE523617C2 (sv) * | 2001-10-01 | 2004-05-04 | Sandvik Ab | Skär för spånavskiljande bearbetning försedd med spånbrytande geometri |
| JP4308485B2 (ja) * | 2002-07-08 | 2009-08-05 | パナソニック株式会社 | 容量素子の製造方法 |
| US6856551B2 (en) * | 2003-02-06 | 2005-02-15 | Sandisk Corporation | System and method for programming cells in non-volatile integrated memory devices |
-
1999
- 1999-10-07 FR FR9912521A patent/FR2799472B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-10-05 MX MXPA02003247A patent/MXPA02003247A/es active IP Right Grant
- 2000-10-05 CN CN008149038A patent/CN1384885B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-05 DK DK00967960T patent/DK1224310T3/da active
- 2000-10-05 AT AT00967960T patent/ATE355385T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-10-05 PL PL354099A patent/PL210590B1/pl unknown
- 2000-10-05 CZ CZ20021215A patent/CZ302282B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-10-05 NZ NZ518763A patent/NZ518763A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-10-05 EP EP00967960A patent/EP1224310B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 WO PCT/FR2000/002774 patent/WO2001025463A1/fr not_active Ceased
- 2000-10-05 DE DE60033679T patent/DE60033679T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-05 CA CA2383225A patent/CA2383225C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-05 JP JP2001528614A patent/JP5260815B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-10-05 IL IL14849300A patent/IL148493A0/xx unknown
- 2000-10-05 AU AU77947/00A patent/AU785431B2/en not_active Ceased
- 2000-10-05 BR BRPI0014489-4A patent/BR0014489B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-10-05 HK HK03100648.3A patent/HK1050211B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-10-05 HU HU0203801A patent/HU228933B1/hu unknown
- 2000-10-05 KR KR1020027004452A patent/KR100928105B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-03-04 IL IL148493A patent/IL148493A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-03-27 ZA ZA200202481A patent/ZA200202481B/xx unknown
- 2002-04-05 NO NO20021634A patent/NO330916B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-12-08 US US12/329,772 patent/US8263395B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2718150A1 (fr) * | 1994-03-29 | 1995-10-06 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| FR2730504A1 (fr) * | 1995-02-13 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| FR2755975A1 (fr) * | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants bicistroniques utiles pour le traitement de pathologies liees aux dyslipoproteinemies |
| US5922576A (en) * | 1998-02-27 | 1999-07-13 | The John Hopkins University | Simplified system for generating recombinant adenoviruses |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Bett A.J. et al.: "An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3ö, PNAS, Vol. 91, 8802-8806, 1994 * |
| Crouzet J. et al.: "Recombinational construction in Escherichia coli of infectious adenoviral genomesö, PNAS, Vol. 94, 1414-1419, 1997 * |
| Tong-Chuan He et al.: "A simplified system for generating recombinant adenoviruses", PNAS, Vol. 95, 2509-22514, 1998 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3672494B2 (ja) | 機能的ゲノム適用にライブラリーを使用される遺伝子機能に関する高度処理能力スクリーニング法 | |
| CN100374574C (zh) | 稳定的腺病毒载体及其增殖方法 | |
| JP3842818B2 (ja) | 組換えアデノウイルスゲノムの製造方法 | |
| CZ230697A3 (en) | Cells for producing recombinant adenoviruses | |
| US8263395B2 (en) | Recombinant adenoviruses preparation and adenovirus banks | |
| US8709778B2 (en) | Method of adenoviral vector synthesis | |
| EP1135514B1 (en) | E1b-deleted adenoviral shuttle vectors | |
| CZ413199A3 (cs) | Způsob výroby adenovirových vektorů nepatřících do skupiny C |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20141005 |