PL210590B1 - Sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa i zestaw do wytworzenia rekombinacyjnego genomu adenowirusa - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa i zestaw do wytworzenia rekombinacyjnego genomu adenowirusa. Wytworzone adenowirusy moż na wykorzystywać do przenoszenia i/lub ekspresji genów w komórkach in vitro, in vivo i ex vivo lub w genomice funkcjonalnej. W szczególności, przedmiotem niniejszego wynalazku są szczególnie skuteczne sposoby wytwarzania banków adenowirusowych umożliwiających zastosowanie takich banków w genomice funkcjonalnej. W niniejszym wynalazku ujawnia się również plazmidy wykorzystywane do tworzenia tych adenowirusów, komórki zawierające te plazmidy i zestawy zawierające te plazmidy komórki i/lub banki adenowirusowe.

Adenowirusy pod kątem przenoszenia i/lub ekspresji genów do komórek wykazują kilka interesujących cech. W szczególności, wykazują dosyć szerokie spektrum komórek gospodarzy, są zdolne do zakażania komórek w stanie spoczynku, mają dużą zdolność do klonowania i nie integrują się z genomem zainfekowanej komórki. Poza tym, jak do tej pory nie stwierdzono ich powią zania z istotnymi chorobami człowieka, tak więc stosuje się je do przenoszenia korzystnych genów do różnych tkanek ludzkich in vitro lub in vivo, na przykład do mięśni (Ragot i wsp., Nature 361 (1993) 647), wątroby (Jaffe i wsp., Nature Genetics 1 (1992) 372), układu nerwowego (Akli i wsp., Nature Genetics 3 (1993) 224), guzów nowotworowych, mięśniówki gładkiej, itd. Te same właściwości czynią z wektora adenowirusowego narzędzie z wyboru do wykorzystywania danych pochodzących z genomiki.

Pod pojęciem genomiki funkcjonalnej rozumie się dziedzinę nauki wykorzystującą genomy lub dane z genomów różnych organizmów do wytłumaczenia funkcji genomu. Biorąc pod uwagę właściwości adenowirusów, wektory adenowirusowe z sekwencją egzogenną można wykorzystywać do oznaczania funkcji tej sekwencji w różnych modelach doświadczalnych. W szczególności, wektory adenowirusowe można wykorzystywać do badania celu terapeutycznego (w znaczeniu wykorzystywanym w przemyśle farmaceutycznym) w modelu komórkowym in vitro lub in vivo u zwierząt. Ponieważ sekwencja ta jest znana i znane są jej właściwości, wektory adenowirusowe mogą służyć do funkcjonalnego potwierdzenia tego celu. W szerszym znaczeniu, to znaczy w genomice funkcjonalnej wektor adenowirusowy przenoszący gen mógłby stanowić narzędzie do ustalenia funkcji sekwencji kwasu nukleinowego w eukariotycznym modelu doświadczalnym, mimo uprzedniego braku dokładnych informacji na temat rodzaju i funkcji tej sekwencji, również w sytuacjach, w których konieczne jest badanie wielu sekwencji na raz.

Jednakże, wykorzystanie adenowirusów w przemyśle, terapii i genomice funkcjonalnej jest jeszcze ograniczone, ze względu na dotychczasowe metody wytwarzania tych rekombinacyjnych wirusów. W szczególności, dostępne obecnie metody nie pozwalają na wytworzenie w sposób prosty, szybki i klonalny populacji adenowirusów zawierających heterologiczne kwasy nukleinowe, zw ł aszcza dlatego, że konieczne jest zbadanie wielu heterologicznych kwasów nukleinowych, jak to jest w przypadku genomiki funkcjonalnej. Niniejszy wynalazek przynosi rozwiązanie właśnie tych problemów. W niniejszym wynalazku opisano w istocie nowe narzędzia i nowe sposoby wytwarzania rekombinacyjnych adenowirusów. W wynalazku opisano w szczególności konstrukcje genetyczne (plazmidy), komórki i protokoł y umoż liwiające wytwarzanie adenowirusów ze znaczną szybkoś cią i dobrej jakoś ci. Wynalazek umożliwia bardziej szczegółowo tworzenie banków adenowirusowych zawierających dużą liczbę heterologicznych kwasów nukleinowych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa, polegający na tym, że:

a) wytwarza się pierwszy plazmid (zwany „wahadłowym”), zawierający region 5' genomu adenowirusa ludzkiego typu 5 i zawierający co najmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy, przy czym plazmid ten nie podlega linearyzacji przed etapem rekombinacji i korzystnie jest plazmidem prokariotycznym;

b) doprowadza się do zetknięcia tego pierwszego plazmidu, z drugim plazmidem (zwanym „rodzicielskim”), skróconym w regionie 5' genomu adenowirusa ludzkiego typu 5 o regiony E1 i E2, zawierający co najmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy, komplementarny do pierwszego genomu, przy czym oba plazmidy są plazmidami o postaci kolistej co umożliwia za pomocą homologicznej rekombinacji wytworzenie końcowego plazmidu, zawierającego pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy, przy czym rekombinację homologiczną prowadzi się w żywej komórce E. coli;

c) wycina się pełny, liniowy rekombinacyjny genom adenowirusowowy z plazmidu końcowego i wprowadza się go do komórkowej linii enkapsydacji, w celu wytworzenia adenowirusów rekombinaPL 210 590 B1 cyjnych obejmujących pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy, przy czym wspomniany plazmid „wahadłowy” i wspomniany plazmid „rodzicielski”, oba zawierają identyczny adenowirusowy region homologiczny, oba zawierają miejsce origin replikacji i dwa różne markery selekcji do selekcji każdego elementu i oba zawierają sekwencję odwróconego powtórzenia końcowego (ITR) otoczone miejscami restrykcyjnymi nie obecnymi w genomie adenowirusowym i jeden lub drugi zawiera sekwencję enkapsydacji.

W korzystnym wykonaniu wynalazku sposób obejmuje ponadto zastosowanie wytworzonych adenowirusów rekombinacyjnych do zakażania:

- materiału biologicznego zawierającego komórki oprócz człowieka, dla analizy właściwości kwasu nukleinowego,

- hodowli komórkowej in vitro lub ex vivo, dla wytwarzania biał ka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez ten heterologiczny kwas nukleinowy, przy czym wszystkie etapy zastosowania przeprowadza się poza organizmem człowieka lub zwierzęcia.

W kolejnym korzystnym wykonaniu sposób według wynalazku jest zastosowany do wytwarzania adenowirusowych bibliotek ekspresji.

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw charakteryzujący się tym, że zawiera plazmid „wahadłowy”, jak zdefiniowano powyżej i plazmid „rodzicielski”, jak zdefiniowano powyżej, za pomocą obu plazmidów mogący wytworzyć poprzez homologiczną rekombinację między dwoma skróconymi genomami adenowirusa plazmid końcowy, który zawiera pełny liniowy rekombinacyjny genom adenowirusa, otoczony przez jedno lub kilka miejsc restrykcyjnych, które są nieobecne w tym genomie, przy czym wspomniany plazmid „wahadłowy” i wspomniany plazmid „rodzicielski”, oba zawierają identyczny adenowirusowy region homologi rozciągający się od lewego ITR do regionu E3, oba zawierają miejsce origin replikacji i dwa różne markery selekcyjne dla selekcji każdego elementu i oba zawierają sekwencję odwróconego powtórzenia końcowego (ITR) otoczoną miejscami restrykcyjnymi nie obecnymi w genomie adenowirusowym i jeden lub drugi zawiera sekwencję enkapsydacji.

Jednym z aspektów niniejszego wynalazku jest zatem zastosowanie rekombinacyjnych adenowirusów do ustalenia funkcji biologicznej kwasu nukleinowego lub białka.

Innym aspektem niniejszego wynalazku jest zastosowanie adenowirusów do konstrukcji banków ekspresji w celu analizy kwasów nukleinowych o nieznanej funkcji i/lub strukturze.

Niniejszy wynalazek umożliwia stworzenie adenowirusowych banków ekspresji, to znaczy populacji adenowirusów zawierających inserty nukleinowe, pochodzące ze wszystkich banków DNA.

W wynalazku opracowano w tym celu sposoby i narzę dzia umoż liwiają ce wytwarzanie takich adenowirusów, zwłaszcza takich banków, a w szczególności, korzystnie, jednoczesną konstrukcję rekombinacyjnych adenowirusów w oparciu o banki kwasów nukleinowych.

Adenowirusy są wirusami DNA, dwuniciowymi, linowymi, o wielkości około 36 kb. Ich genom zawiera w szczególności odwrotną powtórzoną sekwencję (ITR) na każdym końcu, sekwencję enkapsydacji (Psi), geny wczesne i geny późne. Główne geny wczesne znajdują się w rejonach E1, E2, E3 i E4. Spośród tych genów, geny znajdujące się w rejonie E1 są niezbędne do rozprzestrzeniania się wirusów. Region E4 ma również znaczenie w regulacji replikacji genomu adenowirusowego. Główne geny późne znajdują się w rejonach do L1 do L5. Dokonano sekwencjonowania genomu wirusa Ad5; sekwencja ta jest dostępna w bazie danych (zobacz Genbank M73260). Dokonano również sekwencjonowania części, a nawet całości innych genomów adenowirusowych, ludzkich i/lub zwierzęcych (Ad2, Ad7, Ad12, CAV-2 itd.).

Ponadto, jak to wspomniano uprzednio, adenowirusy wykorzystywano już do przenoszenia genów in vivo. W tym celu wytworzono różne wektory pochodzące od adenowirusów, zawierające różne geny (β-gal, OTC, α-IAT, cytokiny, enzymy, czynniki wzrostu itd.). W każdej z tych konstrukcji genom adenowirusa zmodyfikowano w ten sposób, aby stał się on niezdolny do autonomicznej replikacji i/lub rozprzestrzeniania się po przeniesieniu genowym. I tak, konstrukcje znane ze stanu techniki są adenowirusami pozbawionymi jednego lub kilku regionów dobranych z grupy, do której należy region E1, E2, E3, E4, pIX, Iva2, itd. Te szczególne konstrukcje są pozbawione na przykład: regionu E1, regionów E1 i E3, regionów E1 i E4, regionów E1, E3 i E4 lub też wszystkich regionów kodujących adenowirusa (wektory „gutless”). Wektory te zawierają zwykle heterologiczny kwas nukleinowy, który chce się przenieść do komórek lub badać. Ten kwas nukleinowy można wprowadzać w różne miejsca w rekombinacyjnym genomie, zastępując regiony, które uległy delecji lub umieszczać go w innych miejscach. Przykłady wektorów adenowirusowych opisano w publikacjach, zwłaszcza Levrero i wsp., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury i wsp., Gene 50 (1986) 161, WO 94/12649, WO 94/28152,

PL 210 590 B1

WO 94/28938, WO 95/34671, WO 96/10088, WO 95/02697, WO 95/27071, itd., które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie.

Rekombinacyjne adenowirusy wytwarza się przez transfekcję DNA wirusa rekombinacyjnego w kompetentnej linii komórkowej enkapsydacji. Może to być transfekcja prosta, kiedy dysponuje się konstrukcją zawierającą całość genomu wirusa rekombinacyjnego lub, częściej, transfekcja kilku fragmentów DNA wnoszących różne części rekombinacyjnego genomu wirusowego. W tym przypadku sposób obejmuje jeden lub kilka etapów rekombinacji homologicznej między różnymi konstrukcjami w linii komórkowej enkapsydacji, w celu wytworzenia DNA wirusa rekombinacyjnego. Dla zastosowania jednego lub drugiego z tych sposobów konieczne jest zatem dysponowanie odpowiednimi konstrukcjami, zawierającymi całość lub część genomu rekombinacyjnego adenowirusa, który chce się wytworzyć.

Ze stanu techniki znanych jest kilka sposobów wytwarzania tych konstrukcji in vitro. Najczęściej stosowana technika polega na izolowaniu DNA wirusowego i zmodyfikowaniu go in vitro klasycznymi metodami biologii molekularnej (trawienie, ligacja itd.). Wytworzone konstrukcje można następnie oczyszczać i stosować do transfekowania linii enkapsydacji. Metoda ta obejmuje jednak wytwarzanie zapasów wirusa i oczyszczanie DNA wirusowego dla każdej konstrukcji lub dla każdej manipulacji DNA wirusa rekombinacyjnego, nie jest zatem dostosowana do wytwarzania partii różnych wirusów, czy wytwarzania banków. Dla pokonania tych niedogodności proponowano zastosowanie plazmidów prokariotycznych do wytwarzania DNA wirusowego, nadającego się do transfekcji. W szczególności, Bett i wsp. (PNAS 91 (1994) 8802) opisuje wytwarzanie plazmidu replikacyjnego w E. coli, zawierającego zmodyfikowany genom adenowirusowy (plazmid pBHG10). Bardziej szczegółowo, plazmid ten zawiera genom adenowirusowy pozbawiony regionów E1, E3 i Psi, któremu nadano kształt kolisty przez połączenie sekwencji ITR, i który zawiera część plazmidu pBR322, wprowadzoną na poziomie regionu 188-1339 genomu adenowirusa. Plazmid ten można replikować w E. coli poddanej obróbce w celu wprowadzenia danych genów, jest to jednak zawsze niedogodne.

Wykorzystanie tego sposobu do wytwarzania wirusów wymaga zwłaszcza linearyzacji łączących ITR i rekombinacji, co biorąc pod uwagę konstrukcję, prowadzi do włączenia do rekombinacyjnego genomu adenowirusowego regionów pochodzących z plazmidu prokariotycznego. Inne plazmidy tego typu, wykazujące takie same niedogodności, opisał na przykład Graham (EMBOJ. 3 (12) (1984) 2917). Ostatnio opisano nowe sposoby, oparte w szczególności na homologicznej rekombinacji dwóch plazmidów, z zastosowaniem sztucznych chromosomów drożdży (YACs, Ketner i wsp. 1994) lub bakterii (Chartier i wsp. 1996, Crouzet i wsp. 1997, He i wsp. 1998). Sposoby te, chociaż bardziej wydajne niż poprzednie, są też bardziej złożone. System YAC wymaga hodowli i manipulacji hodowlami drożdży (Ketner i wsp. 1994). W układach E. coli konieczne jest przeprowadzenie kilku etapów (z których niektóre są krytyczne, na przykład elektrotransformacja, selekcja na sacharozie). Należy w szczególności zauważyć, że we wszystkich tych przypadkach konieczne jest dokonanie selekcji wśród klonów, by wybrać końcowy klonowy wektor rekombinacyjny, zawierający zakaźny genom adenowirusa. Sposoby te, pozwalające skutecznie wytworzyć w sposób klonalny pewną ilość adenowirusa zawierającego dany gen terapeutyczny, nie nadają się jednak w dostatecznym stopniu do zastosowania w wytwarzaniu rekombinacyjnych adenowirusów na dużą skalę, a zwłaszcza do jednoczesnego wytwarzania wielu adenowirusów rekombinacyjnych, zawierających różne kwasy nukleinowe.

Zastosowanie wektora adenowirusowego jako systemu przenoszenia lub analizy reszt genowych jest zatem hamowane przez złożoność i liczbę etapów koniecznych do wytworzenia tych wirusów. Z dotychczasowego stanu techniki wynika zatem w sposób jasny konieczność opracowania sposobu wytwarzania odpowiednich plazmidów, łatwych do manipulacji i wytwarzania in vitro, do wytwarzania rekombinacyjnych genomów adenowirusowych. Ważne jest również, by tak wytworzone genomy były praktycznie pozbawione regionów pochodzących z plazmidów, które mogłyby (i) prowokować reakcję immunologiczną, (ii) kodować białka oporności i (iii) ograniczać zdolność wykorzystania wirusa jako wektora. Istnieje również konieczność opracowania sposobów umożliwiających wytwarzanie w sposób ułatwiony adenowirusów rekombinacyjnych w sposób klonalny, szybki i w dużej ilości.

Celem niniejszego wynalazku jest pokonanie tych niedogodności. W niniejszym wynalazku opisano także nowe kompozycje oraz sposób według wynalazku do wytwarzania adenowirusów rekombinacyjnych, spełniających te kryteria. Kompozycje te, a także sposób według niniejszego wynalazku umożliwiają wytwarzanie klonalne, szybkie i w dużych ilościach, adenowirusów rekombinacyjnych nadających się do wykorzystania terapeutycznego lub do badań celów farmaceutycznych.

PL 210 590 B1

Niniejszy wynalazek opiera się w szczególności na zastosowaniu dwóch plazmidów (zwłaszcza Procaryota), zdolnych do wytwarzania w jednym etapie homologicznej rekombinacji w komórce gospodarza (w szczególności w komórce prokariotycznej), plazmidu zawierającego pełny genom adenowirusowy, łatwy do wycięcia celem wytworzenia adenowirusów rekombinacyjnych.

Ogólnie, sposób według niniejszego wynalazku obejmuje: w pierwszym etapie wytworzenie pierwszego plazmidu (zwanego „wahadłowym” - ang. „shuttle vector”), korzystnie prokariotycznego, zawierającego pierwszy rekombinacyjny genom adenowirusowy, okrojony, zawierający przynajmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy (etap klonowania). Korzystnie, pierwszy skrócony genom zawiera ITR, heterologiczny kwas nukleinowy, region homologii adenowirusowej i ewentualnie sekwencję enkapsydacji.

W drugim etapie ten pierwszy plazmid styka się z drugim plazmidem (zwanym „rodzicielskim”), zawierającym drugi skrócony rekombinacyjny genom adenowirusowy komplementarny do pierwszego, umożliwiając przez homologiczną rekombinację wytworzenie ostatecznego plazmidu, zawierającego pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy (etap rekombinacji). Korzystnie, drugi skrócony genom adenowirusowy zawiera co najmniej jedną ITR, region homologii adenowirusowej identyczny jak w pierwszym i sekwencję enkapsydacji (jeż eli nie znajduje się ona w pierwszym). Ten drugi skrócony genom adenowirusowy może ponadto zawierać również inny korzystny kwas nukleinowy.

W trzecim etapie peł ny rekombinacyjny genom adenowirusowy wycina się z ostatecznego plazmidu i wprowadza do linii enkapsydacji, w celu wytworzenia adenowirusów rekombinacyjnych, zawierających pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy (etap wytwarzania adenowirusa).

W czwartym etapie, fakultatywnym, rekombinacyjne adenowirusy stosuje się do zakaż ania:

- materiału biologicznego zawierającego komórki, w celu analizy właściwości kwasu nukleinowego (etap analizy funkcjonalnej),

- hodowli komórkowej in vitro lub ex vivo, w celu wytwarzania białka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez heterologiczny kwas nukleinowy,

- komórki, tkanki lub narzą dy, w celu wytwarzania in vivo biał ka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez heterologiczny kwas nukleinowy.

Niniejszy wynalazek umożliwia również wytwarzanie w jednym etapie (rekombinacja homologiczna) prokariotycznego plazmidu, zawierającego czynnościowy genom adenowirusowy (pełny), który można wyciąć jednym lub kilkom odpowiednimi enzymami. Ten ostateczny plazmid powstaje zatem z wprowadzenia pierwszego plazmidu („wahadłowego”), zawierającego sekwencje adenowirusowe (co najmniej jedną sekwencję ITR i enkapsydacji) i wyposażonego w dany heterologiczny kwas nukleinowy, do drugiego plazmidu („rodzicielskiego”) zawierającego komplementarne sekwencje adenowirusowe (co najmniej drugą sekwencję ITR) poprzez rekombinację homologiczną, za pośrednictwem sekwencji wspólnej dla dwóch plazmidów (sekwencja homologii adenowirusowej). Zjawisko to, homologicznej rekombinacji, powoduje powstanie, poprzez ten koagregat, funkcjonalnego genomu adenowirusowego.

Jedną z korzystnych cech sposobu według niniejszego wynalazku jest jego prostota umożliwiająca równoległe wytwarzanie wielu plazmidów „wahadłowych”. Tak więc, pierwszy etap sposobu obejmuje korzystnie klonowanie banku kwasów nukleinowych w plazmidach „wahadłowych”, powodując w ten sposób powstanie końcowych banków plazmidów, zawierających funkcjonalny genom adenowirusowy, o strukturze identycznej, z wyjątkiem zawartych w nich insertów. Ten etap klonowania przeprowadza się, korzystnie, poprzez zachowanie każdego poszczególnego klonu, na przykład w zagłębieniu płytki do mikromiareczkowania. Ponadto, etap ten można przeprowadzać w sposób automatyczny. Bank plazmidów „wahadłowych” wykorzystuje się następnie w etapie rekombinacji, przy czym każdy plazmid „wahadłowy” z banku styka się z plazmidem „rodzicielskim”. Sposób ten prowadzi w ten sposób do wytwarzania równolegle i jednocześnie wielu adenowirusów rekombinacyjnych, zawierających heterologiczny kwas nukleinowy (to znaczy adenowirusowego banku ekspresji). Bank ten można następnie badać na materiale biologicznym (etap czwarty) w celu zidentyfikowania klonów wykazujących poszukiwaną aktywność biologiczną.

Wynalazek można wykorzystać we wszystkich typach adenowirusów komórek prokariotycznych i w róż nych bankach kwasów nukleinowych, co zostanie zilustrowane szczegół owo w dalszej części tekstu.

Definicje

Adenowirus rekombinacyjny: termin „adenowirus rekombinacyjny”, w rozumieniu niniejszego wynalazku, oznacza każdy adenowirus, którego genom zmodyfikowano poprzez delecję i/lub insercję,

PL 210 590 B1 i/lub substytucję zasad. Termin ten oznacza zatem, bardziej szczegółowo, cząstkę adenowirusową, zwykle zakaźną, zawierającą rekombinacyjny genom adenowirusowy. Według jednej lub wielu modyfikacji wprowadzonych do genomu, wirus rekombinacyjny może być defektywny w odniesieniu do replikacji, to znaczy niezdolny do autonomicznej replikacji i/lub rozprzestrzeniania się w komórce. Adenowirus rekombinacyjny można wytwarzać z każdego serotypu adenowirusa, zwłaszcza z adenowirusów ludzkich (na przykład typu C jak Ad5, Ad2, Ad7, Ad12, itd.) lub zwierzęcych (takich jak adenowirusy psie, np. CAV-2).

Genom adenowirusowy: termin „genom adenowirusowy” oznacza cząsteczkę DNA obecną w adenowirusie lub jej sekwencję, kopię lub replikę. Rekombinacyjny genom adenowirusowy jest kwasem nukleinowym, którego sekwencja odpowiada sekwencji genomu adenowirusa i zawiera jedną lub więcej modyfikacji. Modyfikacje zawierają np. delecję (np. całości lub części regionów E1, E2, E3, E4, itd.), insercję (jak na przykład jeden lub kilka heterologicznych kwasów nukleinowych) lub zmianę zastosowania kodonów.

Rekombinacyjny genom adenowirusowy wytworzony dzięki zastosowaniu kompozycji i sposobu według niniejszego wynalazku jest, korzystnie, genomem „pełnym”, czyli „funkcjonalnym”, to znaczy nie wymaga dodania innych regionów przez rekombinację, ani przez ligację, do wytwarzania większych ilości wirusa w wybranych liniach enkapsydacji. Taki „pełny” genom zawiera zatem, korzystnie, co najmniej jedną sekwencję enkapsydacji i jeden heterologiczny kwas nukleinowy, otoczone sekwencjami ITR z każdej strony. Inna korzystna cecha plazmidów według niniejszego wynalazku pochodzi w istocie z tego, ż e peł ny rekombinacyjny genom adenowirusowy nie jest przerwany regionami plazmidów prokariotycznych. Dlatego też, wytworzone genomy nie zawierają w zasadzie regionów plazmidu, których niekorzystne cechy zostały wymienione uprzednio. Na przykład, w plazmidach według niniejszego wynalazku ITR genomu adenowirusowego nie stykają się, co pozwala wytworzyć pełne liniowe, rekombinacyjne genomy wirusowe, nadające się bezpośrednio do wykorzystania do wytwarzania wirusów rekombinacyjnych.

Korzystnie, rekombinacyjny genom adenowirusowy zawiera co najmniej sekwencję ITR i sekwencję pozwalającą na enkapsydację. Powtórzone sekwencje odwrócone (ITR) stanowią początek replikacji adenowirusa. Są one umiejscowione na obu końcach genomu wirusowego, z których można je łatwo wyizolować klasycznymi technikami biologii molekularnej, znanymi specjaliście. Sekwencję nukleotydową z sekwencji ITR adenowirusów ludzkich (zwłaszcza serotypów Ad2 i Ad5) opisano w piśmiennictwie, podobnie jak sekwencję adenowirusów psich (zwłaszcza CAV1 i CAV2). Jeżeli chodzi na przykład o adenowirus Ad5, sekwencja lewa ITR odpowiada regionowi zawierającemu nukleotydy 1-103 genomu.

Sekwencja enkapsydacji (zwana również sekwencją Psi) jest niezbędna do enkapsydacji genomu wirusowego. Znajduje się ona w genomie wirusów dzikich, pomiędzy lewym ITR a regionem E1. Można ją izolować lub syntetyzować sztucznie klasycznymi technikami biologii molekularnej. Sekwencję nukleotydową sekwencji enkapsydacji adenowirusów ludzkich (zwłaszcza serotypów Ad2 i Ad5) opisano w piśmiennictwie, podobnie jak adenowirusów psich (zwłaszcza CAV1 i CAV2). Jeżeli chodzi na przykład o adenowirus Ad5, sekwencja enkapsydacji funkcjonalnej znajduje się pomiędzy nukleotydami 194 a 358 genomu.

W korzystnym sposobie wykonania wedł ug niniejszego wynalazku genom adenowirusa pozbawiony jest całości lub części regionu E1. Region E1 ma w istocie zasadnicze znaczenie dla replikacji wirusa i jego inaktywacji prowadzonej przy tworzeniu wirusów defektywnych w odniesieniu do replikacji, to znaczy niezdolnych do autonomicznej replikacji po przeniesieniu genowym in vivo. Region E1 i każ dy inny rozpatrywany region wirusowy moż na pozbawić funkcjonalnoś ci wszystkimi sposobami znanymi specjaliście, zwłaszcza poprzez całkowite zniesienie, substytucję, częściową delecję lub addycję jednej lub kilku zasad w rozważanym genie lub genach. Takich modyfikacji można łatwo dokonać bezpośrednio na plazmidach według niniejszego wynalazku, na przykład sposobami inżynierii genetycznej. Korzystnie, wytworzony genom adenowirusa pozbawiony jest części regionu E1, zawartej pomiędzy nukleotydami 454 a 3328 (fragment PvuII-BglII) lub 382-3446 (fragment HinfII-Sau3A).

Skrócony rekombinacyjny genom adenowirusowy oznacza DNA odpowiadające sekwencji części końcowej genomu adenowirusowego, to znaczy od jednego końca (ITR). Dwa okrojone genomy rekombinacyjne nazywa się komplementarnymi, ponieważ każdy z nich zawiera część komplementarną genomu adenowirusowego i ponieważ mogą one odtworzyć, poprzez rekombinację homologiczną, pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy.

PL 210 590 B1

Heterologiczny kwas nukleinowy: termin „heterologiczny kwas nukleinowy” oznacza każdy kwas nukleinowy włączony do rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, którego przeniesienie, ekspresja lub badanie czynnościowe są celem przeprowadzania danej procedury. Chodzi tu zwłaszcza o kwas nukleinowy o pochodzeniu innym niż z adenowirusa („heterologicznym”), na przykład o kwas pochodzący z komórek ludzkich, zwierzęcych, roślinnych, wirusowych (innych niż adenowirus stosowany jako wektor), prokariotycznych, eukariotycznych niższych lub pochodzenia syntetycznego, lub półsyntetycznego. Wielkość heterologicznego kwasu nukleinowego może być różna, o tyle, o ile rekombinacyjny genom adenowirusowy, zawierający ten kwas, nie przekracza wielkości maksymalnej, umożliwiającej jego enkapsydację do cząstki adenowirusowej (w sumie mniej niż 40 kb). Tak więc, może to być kwas nukleinowy o długości powyżej 30 kb, ponieważ delecji uległo wystarczająco dużo regionów adenowirusa. Kwas nukleinowy może wówczas zawierać region kodujący dane białko, polipeptyd lub peptyd, na przykład cDNA, gDNA lub DNA syntetyczne. Może także być to kwas nukleinowy o nieznanej strukturze, pochodzący na przykład z klonu banku kwasów nukleinowych. Ponadto, rekombinacyjny genom adenowirusowy może zawierać kilka heterologicznych kwasów nukleinowych, wprowadzonych w różnych miejscach genomu.

Opis plazmidów

Jak to wspomniano powyżej, przedmiotem niniejszego wynalazku są dwa plazmidy (prokariotyczne), plazmid „wahadłowy” i plazmid „rodzicielski”, z których każdy zawiera komplementarny fragment rekombinacyjnego genomu adenowirusa. Co najmniej jeden z tych plazmidów zawiera heterologiczny kwas nukleinowy (lub miejsce wprowadzenia takiego kwasu nukleinowego), korzystne z punktu widzenia terapii genowej, wytwarzania białka rekombinacyjnego lub genomiki funkcjonalnej. Korzystnie, końce (sekwencje ITR) każdego ze skróconych genomów znajdujących się w plazmidach sąsiadują (na końcu 5' w przypadku lewego ITR i na końcu 3' w przypadku prawego ITR) z miejscem nieobecnym w tym genomie, aby umożliwić wycięcie całego genomu po rekombinacji. Plazmidy te zawierają skrócony genom adenowirusa i nie mogą pojedynczo wytwarzać zakaźnego genomu adenowirusowego. Każdy z tych dwóch plazmidów zawiera część komplementarną do drugiego tak, aby wytwarzać przez kointegrację plazmid końcowy, posiadający zatem całość genomu adenowirusa, otoczoną przez dwa ITR i sąsiadującą z co najmniej jednym miejscem restrykcyjnym znajdującym się w tym genomie. Fragment genomu adenowirusa rekombinacyjnego, znajdujący się w tych plazmidach, jest genomem niepełnym, który sam nie może okazać się potem zakaźny. Jest to szczególnie korzystne, ponieważ jeden tylko kointegrat z dwóch plazmidów może wytwarzać funkcjonalny genom.

Plazmidy takie przedstawiono na przykład na fig. 1 i opisano je bardziej szczegółowo w poniższym tekście. Plazmidy te są, korzystnie, plazmidami prokariotycznymi i zawierają na ogół region plazmidowy i region adenowirusowy. Region plazmidowy umożliwia replikację i/lub selekcję plazmidów w komórce gospodarzu, w szczególnoś ci w prokariotycznej komórce gospodarzu. Region adenowirusowy (genom skrócony) dostarcza części rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, która po rekombinacji z regionem adenowirusowym komplementarnego plazmidu („rodzicielskiego” lub „wahadłowego”) umożliwia odtworzenie pełnego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego.

Region umożliwiający replikację w komórkach prokariotycznych, stosowany w plazmidach według niniejszego wynalazku, może być jedynym początkiem replikacji funkcjonalnej w wybranych komórkach. Może to być początek replikacji pochodzący z plazmidów grupy niezgodności P (przykład = pRK290), który umożliwia replikację w szczepach E. coli pol A. Bardziej ogólnie, może to być każdy początek replikacji pochodzący z plazmidu replikującego się w komórkach prokariotycznych. Ten plazmid może być pochodną pBR322 (Bolivar i wsp., 1977), pochodną puc (Viera i Messing, 1982) lub innych plazmidów pochodzących z tej samej grupy niezgodności, to znaczy na przykład z ColE1 lub z pMB1. Plazmidy te można dobierać zresztą z innych grup niezgodności replikujących się w Escherichia coli. Mogą to być plazmidy pochodzące z plazmidów należących do grup niezgodności, na przykład: A, B, FI, FII, FIII, FIV, H1, H11, I1, I2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z lub 9. Można również stosować inne plazmidy, w tym plazmidy nie replikujące się w E. coli, ale w innych gospodarzach, takich jak: B. subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium lub Clostridium. Korzystnie, stosuje się początek replikacji pochodzący z plazmidów replikujących się w E. coli.

Region umożliwiający selekcję komórek prokariotycznych, zawierających plazmidy według niniejszego wynalazku może być utworzony szczególnie przez każdy gen nadający oporność na produkt, szczególnie na antybiotyk. Można więc zacytować na przykład geny nadające oporność na kanamycynę (Kan^r), na ampicylinę (Amp^r), na tetracyklinę (tet^r) lub na spektynomycynę, które po8

PL 210 590 B1 wszechnie stosuje się w biologii molekularnej (Maniatis i wsp., 1989). Selekcji plazmidów można dokonywać przez inne geny, takie jak geny kodujące markery oporności na antybiotyk. Ogólnie, chodzi o geny nadają ce bakterii funkcję , której ona już nie posiada (moż e to odpowiadać genowi, który uległ delecji na chromosomie lub stał się nieczynny), przy czym geny na plazmidzie przywracają tę funkcję. Na przykład może być to gen RNA transferu, który odtwarza brakującą funkcję chromosomalną (Somoes i wsp., 1991).

Korzystnie, plazmid „wahadłowy” i plazmid „rodzicielski” zawierają początek replikacji i/lub różne markery, aby umożliwić selekcję każdego elementu.

Region adenowirusowy zawarty w każdym z tych plazmidów odpowiada w zasadzie sekwencji okrojonego genomu adenowirusowego. Te okrojone genomy znajdujące się w każdym plazmidzie są komplementarne, to znaczy zdolne do wytwarzania pełnego rekombinacyjnego genomu adenowirusa (liniowego), po homologicznej rekombinacji. Poza tym, okrojone genomy, znajdujące się w każdym z plazmidów, są otoczone, korzystnie przez jedno lub wiele miejsc restrykcyjnych, które nie są obecne w genomie adenowirusowym tak, ż e peł ny adenowirusowy genom rekombinacyjny, wytworzony przez rekombinację, jest otoczony przez takie miejsca.

Skrócony genom obecny w plazmidzie „wahadłowym”

Plazmid „wahadłowy”, jak to wspomniano uprzednio, przeznaczony jest do przyjmowania danego kwasu nukleinowego w celu jego włączenia w rekombinacyjny genom adenowirusowy.

Region adenowirusowy plazmidu „wahadłowego” odpowiada części lewej lub części prawej genomu adenowirusowego od jego końca (sekwencji ITR) aż do wybranego regionu homologii adenowirusowej, który umożliwi rekombinację homologiczną między dwoma plazmidami. Poza tym, ten genom adenowirusowy zawiera jedną lub więcej modyfikacji genetycznych.

Według pierwszego sposobu wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie „wahadłowym” odpowiada części lewej ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład jedną sekwencję od lewego ITR aż do regionu kodującego białko pIX (i/lub Iva2), przy czym heterologiczny kwas nukleinowy jest włączony zamiast całości lub części regionu E1. W tym szczególnym sposobie wykonania region homologii adenowirusowej jest utworzony przez region kodujący białka pIX (i/lub Iva2).

W innym sposobie wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie „wahadłowym” odpowiada części prawej końcowego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład sekwencję od prawego ITR aż do regionu kodującego białko pIX (i/lub Iva2), przy czym heterologiczny kwas nukleinowy jest włączony zamiast całości lub części, na przykład regionu E4 lub E3. W tym szczególnym sposobie wykonania region homologii adenowirusowowej składa się również z regionu kodującego białko pIX (i/lub Iva2).

Ponadto, w szczególnie korzystnym sposobie wykonania region homologii utworzony jest przez zmodyfikowaną sekwencję adenowirusową. Tak więc, region homologii może być utworzony na przykład przez zmodyfikowany region adenowirusa, poprzez zmianę zastosowania kodonu, przy zastosowaniu degeneracji kodu genetycznego. Takie modyfikacje opisano w zgłoszeniu patentowym WO 99/25861, które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. W szczególnym sposobie wykonania region homologii adenowirusowej utworzony jest przez zdegenerowany region kodujący białko pIX (i/lub Iva2).

Należy rozumieć, że w zależności od wybranej struktury ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego (który tworzy się po rekombinacji) region homologii adenowirusowej może odpowiadać różnym regionom genomu. I tak, region adenowirusowy plazmidu „rodzicielskiego” może rozciągać się od lewego ITR aż do regionu E3, a zatem to właśnie ten region stanowi strefę homologii adenowirusowej. Bardziej ogólnie, region homologii adenowirusowej jest sekwencją dopowiadającą każdemu regionowi genomu adenowirusowego dzikiego lub zmodyfikowanego, która umożliwia rekombinację pomiędzy plazmidem „wahadłowym” a plazmidem „rodzicielskim”, w taki sposób, aby wytworzyć ostateczny rekombinacyjny genom adenowirusowy. Ten region homologii jest zatem w zasadzie identyczny w plazmidzie „wahadłowym” i w plazmidzie „rodzicielskim”. Może on odpowiadać różnym częściom genomu adenowirusa, w zależności od zastosowanego typu konstrukcji.

W szczególnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku plazmid „wahadłowy” zawiera skrócony genom, zawierający lewy region ITR, sekwencję enkapsydacji, heterologiczny kwas nukleinowy i region homologii adenowirusowej, utworzony przez region kodujący białka pIX (i/lub Iva2), dziki lub zdegenerowany (por. na przykład plazmidy pJJ1 i pIG5).

PL 210 590 B1

Ponadto, w korzystnym sposobie wykonania skrócony genom adenowirusowy jest otoczony, oprócz ITR, miejscem, które nie znajduje się w genomie adenowirusowym, na przykład PacI.

Skrócony genom obecny w plazmidzie „rodzicielskim”

Plazmid „rodzicielski”, jak to wspomniano powyżej, zawiera skrócony genom adenowirusowy, zdolny do uzupełnienia przez rekombinację okrojonego genomu obecnego w plazmidzie „wahadłowym”. Struktura jego zależy więc od struktury plazmidu „wahadłowego”. Ponadto, plazmid „rodzicielski” może zawierać także kwas nukleinowy, różny od kwasu znajdującego się w plazmidzie „wahadłowym”.

I tak, ponieważ region adenowirusowy plazmidu „wahadłowego” odpowiada lewej części genomu adenowirusowego, skrócony genom obecny w plazmidzie „rodzicielskim” odpowiada jego części prawej, rozciągającej się od ITR aż do regionu homologii adenowirusowej. I odwrotnie, ponieważ region adenowirusowy plazmidu „wahadłowego” odpowiada prawej części genomu adenowirusowego, skrócony genom obecny w plazmidzie „rodzicielskim” odpowiada jego części lewej, rozciągającej się od ITR aż do regionu homologii adenowirusowej.

W pierwszym sposobie wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie „rodzicielskim” odpowiada części prawej ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład sekwencję od prawego ITR aż do regionu kodującego białko pIX (i/lub Iva2). Ponadto, genom może zawierać modyfikacje genetyczne, takie jak na przykład delecję całości lub części regionów E4 lub E3.

W innym sposobie wykonania skrócony genom obecny w plazmidzie „rodzicielskim” odpowiada lewej części ostatecznego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego. W tym sposobie wykonania zawiera on na przykład sekwencję od lewego ITR aż do sekwencji bliskiej regionu E4. Ponadto, genom może zawierać modyfikacje genetyczne, takie jak na przykład delecję całości lub części regionu E1.

Korzystnie, plazmid „rodzicielski” zawiera skrócony genom odpowiadający prawej części genomu adenowirusowowego i zawiera niefunkcjonalny region E3. Bardziej korzystnie, zawiera on niefunkcjonalny region E4. Jeszcze korzystniej, zawiera on delecję całości lub części faz ORF3 i/lub ORF6 regionu E4. W innym korzystnym sposobie wykonania, plazmid „rodzicielski” zawiera skrócony genom, odpowiadający części prawej genomu adenowirusowego oraz zawiera funkcjonalne regiony E3 i E4.

Konkretnymi przykładami takich plazmidów są pOSE1, pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE17-00 i pOSE37-00 (por. fig. 1 i fig. 4).

W tym sposobie wykonania plazmid „wahadłowy” zawiera skrócony genom odpowiadający lewej części genomu adenowirusowego i delecję całości lub części regionu E1.

Dwoma szczególnie korzystnymi plazmidami według niniejszego wynalazku są plazmid pO-SE17-00 i plazmid pIG5. POSE17-00 (plazmid „rodzicielski”) zawiera początek replikacji plazmidu RK2, gen oporności na tetracyklinę i fragment genomu adenowirusowego, rozpoczynający się od zasady 3520 Ad5 i ciągnący się do prawego ITR, sąsiadującego z miejscem PacI. Ten fragment genomu posiada niefunkcjonalny region E3 i sekwencję zmodyfikowaną w pIX i Iva2, jak to opisano w zgłoszeniu WO 99/25861. Plazmid pIG5 (plazmid „wahadłowy”) zawiera początek replikacji RK6 i nie może się replikować w szczepach E. coli pir-. Gen pIG5 zawiera region ITR i region enkapsydacji, poprzedzone miejscem PacI, korzystną kasetę ekspresji i region homologiczny do pOSE17-00 (sekwencja zmodyfikowana pIX i Iva2, jak to opisano w zgłoszeniu WO 99/25861). Korzystny genom ulega zatem rekonstrukcji przez homologiczną rekombinację dzięki obecności regionu homologicznego pomiędzy dwoma plazmidami (to znaczy zmodyfikowanej sekwencji pIX i Iva2, jak to opisano w zgłoszeniu WO 99/25861).

Sposób według niniejszego wynalazku pozwala również na wytwarzanie pełnego genomu rekombinacyjnego (zakaźnego) z dwóch plazmidów zawierających po części genomu (plazmid zawierający lewą sekwencję ITR, poprzedzoną miejscem PacI i zespół sekwencji wirusowych i nie wirusowych oraz plazmid poprzedzony sekwencjami wirusowymi lub nie wirusowymi, zawierający prawe ITR, po którym następuje miejsce PacI, przy czym wybór sekwencji wirusowych lub nie wirusowych zależy od doboru planowanej konstrukcji, a rekombinacyjny wektor adenowirusowy poddano delecji całości lub części genów wirusowych); oba plazmidy zawierają przy tym sekwencje wspólne, wystarczające do dokonania homologicznej rekombinacji i zawierają zachodzące na siebie fragmenty sekwencji, co umożliwia pojawienie się homologicznej rekombinacji. W szczególności, sposób ten umożliwia, w schemacie porównywalnym ze schematem przedstawionym dla wprowadzania sekwencji egzogennych do regionu E1, wprowadzanie sekwencji egzogennych do regionu E4 za pomocą odpowiednich plazmidów. W tym przypadku rekombinacja zachodzi między plazmidem „rodzicielskim” (zawierającym prawy region ITR i region enkapsydacji, poprzedzony miejscem restrykcji dla enzymu PacI i skróco10

PL 210 590 B1 nym genomem adenowirusowym w pobliżu regionu E4) a plazmidem „wahadłowym” (zawierającym sekwencję bliską regionu E4, identyczną z wektorem „rodzicielskim”, która będzie brała udział w rekombinacji i następnie kasetę ekspresji danej sekwencji oraz prawy region ITR i unikalne miejsce PacI).

Według szczególnie korzystnego sposobu wykonania, wytworzony genom adenowirusa jest również pozbawiony całości lub części regionu E3 i/lub E4, i/lub Iva2. Te dodatkowe delecje umożliwiają zwiększenie bezpieczeństwa wektora i podniesienie jego wydajności. Korzystnie, genom adenowirusowy jest pozbawiony części regionu E4, zawierającej co najmniej fazy ORF3 i ORF6. Genom adenowirusowy może również być zmodyfikowany, jak to opisano w zgłoszeniu FR 9 413 355, które włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie, w taki sposób, aby uniknąć ryzyka zanieczyszczenia cząstek replikacji. W szczególnym sposobie wykonania wytworzony pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy jest genomem określanym jako „gutless”, to znaczy, jest pozbawiony wszystkich regionów kodujących adenowirusa. W tym sposobie wykonania skrócony genom plazmidów zawiera z jednej strony ITR region enkapsydacji, a z drugiej strony ITR, region homologiczny, który moż e składać się z samego heterologicznego kwasu nukleinowego lub ze sztucznej sekwencji, włączonej do każdego plazmidu.

Dlatego też, region homologii obecny w każdym plazmidzie może być, ogólnie, sekwencją nie wirusową, sztuczną lub nie, umożliwiającą rekombinację homologiczną.

Genom rekombinacyjny może również zawierać kasety nadające się do wycięcia in vivo (WO 97/47757) i zmodyfikowane sekwencje genetyczne (geny włókna lub pentonu), umożliwiające modyfikację tropizmu wirusa. Poza tym, organizacja genomowa wirusa może również ulec modyfikacji, w celu poprawy bezpieczeństwa wytworzonych wirusów (WO 96/13596),

Jak to wspomniano powyżej, rekombinacyjny genom adenowirusa jest, korzystnie, otoczony jednym lub kilkoma miejscami restrykcji, nieobecnymi w tym genomie. To miejsce lub miejsca umożliwiają proste i skuteczne wycięcie rekombinacyjnego genomu adenowirusowego plazmidu. Sekwencja genomowa adenowirusa jest znana i dostępna; specjalista może wybrać na drodze rutynowych doświadczeń miejsce restrykcyjne, nieobecne w tym genomie. Przykładowo, można wspomnieć o miejscach PacI, NspV i Swal (dla Ad5) lub SnabI (w Ad2). Można również nadać pewnym miejscom unikalność, zmieniając sekwencję genomu adenowirusowego. Tak więc, można stosować inne enzymy, jeżeli odpowiednie miejsca restrykcyjne ulegają zahamowaniu, modyfikacji lub delecji, w wytworzonej sekwencji adenowirusowej w E. coli. Miejsca mogą być umieszczane obok końców genomu adenowirusowego lub rozdzielone kilkoma parami zasad.

Plazmidy według niniejszego wynalazku można wytwarzać stosując adenowirusy różnego pochodzenia. W istocie scharakteryzowano kilka serotypów adenowirusów, których struktura i właściwości trochę się różnią. Spośród tych serotypów korzystne jest stosowanie, według niniejszego wynalazku, adenowirusów ludzkich typu 2 lub 5 (Ad2 lub Ad5), lub adenowirusów pochodzenia zwierzęcego (patrz zgłoszenie WO 94/26914). Spośród adenowirusów pochodzenia zwierzęcego, które można zastosować według niniejszego wynalazku, można zacytować adenowirusy pochodzenia psiego, bydlęcego, mysiego (na przykład: Mavl, Beard i wsp. Virology 75 (1990) 81), owczego, świńskiego, ptasiego lub małpiego (na przykład: SAV). Korzystnie, adenowirusem pochodzenia zwierzęcego jest adenowirus psi, korzystniej adenowirus CAV2 [na przykład szczep manhattanski lub A26/61 (ATCC VR-800)]. Według szczególnego sposobu wykonania niniejszego wynalazku stosowanym adenowirusem jest adenowirus pochodzenia ludzkiego. Według korzystnego sposobu wykonania, adenowirusem jest adenowirus pochodzenia zwierzęcego.

Rekombinacja homologiczna i wytwarzanie wirusa

Etap rekombinacji homologicznej (umożliwiający odtworzenie pełnego genomu) można wykonać technikami znanymi specjaliście, przez transfekcję (lub kotransfekcję) plazmidów w odpowiedniej komórce, korzystnie, komórce prokariotycznej. W korzystnym sposobie wykonania homologicznej rekombinacji dokonuje się w E. coli, stosując szczep polA w celu selekcji zdarzeń rekombinacji homologicznej. Oczywiste jest, że konstrukcje te można również wytwarzać przy braku systemów umożliwiających selekcję wydarzeń rekombinacji. W istocie takie zdarzenia rekombinacji można poddawać badaniu przesiewowemu celem minipreparacji, utraty lub nabycia znacznika, lub też badaniu przesiewowemu za pomocą sond radioaktywnych swoistych dla uzyskanych lub utraconych połączeń. Ponadto, istnieją inne techniki umożliwiające selekcję zdarzeń rekombinacji homologicznej w E. coli. Wśród nich wspomnijmy o zastosowaniu plazmidów termowrażliwych do ich replikacji (Hamilton i wsp. 1989), zastosowaniu cząsteczek kolistych nie replikujących się (opisane np. przez Slater i Maurer, 1993), zastosowaniu szczepów, w których zastosowany wektor się nie replikuje (Miller i Mekalanos 1988,

PL 210 590 B1

Zeef i wsp. 1984), itd. Wszystkie te systemy można stosować zamiast szczepów polA i transformacji plazmidem pochodnym pBR322 lub jego licznych pochodnych, lub innych plazmidów, do replikacji zależnej od polA, lub też plazmidów nie replikujących się w E. coli.

Innym celem niniejszego wynalazku jest każda komórka prokariotyczna zawierająca plazmid taki, jak to określono powyżej. Może to być w szczególności każda bakteria, dla której istnieje system wektora, do którego można wprowadzić rekombinacyjne DNA. Wymieńmy na przykład Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti lub bakterie z rodzaju Streptomyces. Komórki te wytwarza się, korzystnie, poprzez transformację technikami znanymi specjaliście. Transformacja może w szczególności być wykonana techniką transformacji z zastosowaniem CaCl2 (Dagert i Ehrlich, 1979) lub techniki opracowanej przez Hanahan i wsp. (1983), lub każdą techniką pochodną (Maniatis i wsp. 1989), jak również poprzez elektrotransformację (Wirth i wsp. 1989). Zobacz również techniki ogólne biologii molekularnej opisane poniżej.

Innym celem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania rekonstrukcyjnych genomów adenowirusowych. Według tego sposobu komórki prokariotyczne, takie jak opisano poniżej, hoduje się i następnie w drugim etapie odzyskuje się z nich plazmidy. Korzystnie, hodowlę prowadzi się przez czas dostatecznie długi do wytworzenia odpowiedniej ilości plazmidów. Plazmid można odzyskać ogólną techniką znaną specjaliście służącą wytworzeniu DNA plazmidowego. I tak, plazmid można odzyskać poprzez preparację przezroczystego lizatu i następnie odwirowanie w gradiencie chlorku cezu (Maniatis i wsp., 1989). Można stosować inne sposoby odwołujące się do innych sposobów lizy z zastosowaniem np. triton x-100 (Ausubel i wsp., 1987) lub kolumny anionowymiennej po etapie lizy i oddzielenia DNA plazmidowego od większości DNA chromosomowego białek. Tak wytworzone plazmidy mogą następnie być oczyszczane i traktowane w obecności enzymu restrykcyjnego odpowiadającego miejscom okalającym genom wirusowy. Pozwala to w jednym etapie na wytworzenie genomu liniowego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, nadającego się bezpośrednio do wykorzystania do klonalnego wytwarzania rekombinacyjnych wirusów.

Tak więc, pierwszy sposób wytwarzania rekombinacyjnych wirusów polega na transfekowaniu genomu wirusowego wytworzonego z plazmidu według niniejszego wynalazku, w kompetentnej linii komórkowej enkapsydacji, tzn. w komórkach wykazujących wszystkie funkcje niezbędne do uzupełnienia defektywnego wirusa. Funkcje te, korzystnie, są zintegrowane z genomem komórki, co ogranicza ryzyko rekombinacji i nadaje większą stabilność linii komórkowej.

Drugi sposób polega na kotransfekcji w odpowiedniej linii komórkowej wytworzonego genomu rekombinacyjnego i DNA jednego lub kilku wirusów lub plazmidu pomocniczego („helper”). Według tego sposobu nie trzeba dysponować kompetentną linią komórkową zdolną do uzupełnienia wszystkich funkcji defektywnych adenowirusa rekombinacyjnego. Część tych funkcji jest w istocie uzupełniana przez wirus lub wirusy pomocnicze. Ten (lub te) wirusy pomocnicze same w sobie są defektywne.

Spośród nadających się do wykorzystania linii komórkowych można wymienić zwłaszcza linie komórek zarodkowych nerki ludzkiej 293 (Graham i wsp., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Linia ta zawiera w szczególności zintegrowaną w genom lewą część genomu adenowirusa ludzkiego Ad5 (12%). Transfekcji można dokonać, korzystnie, bezpośrednio z produktem trawienia plazmidu uzyskanym według sposobu opisanego uprzednio bez etapu oczyszczania genomu adenowirusowego. Innymi liniami są na przykład linie wytworzone z komórek zarodkowych siatkówki (HER), komórek wątroby itd. Mogą to być linie uzupełniające funkcje E1 (293, komórki PERC-6), E1 i E6 (IGRP2), E1 i E2, itd. Linie takie opisano w stanie techniki, są one znane ze stanu techniki i mogą być wykorzystane przez specjalistę.

Tak wytworzone adenowirusy można izolować lub oczyszczać technikami znanymi specjaliście (chlorek cezu, chromatografia, itd). Można je stosować w różnych zastosowaniach, takich jak wytwarzanie produktów terapeutycznych lub profilaktycznych in vitro, ex vivo lub in vivo, jak również do analizy funkcjonalnej genomu (i do tworzenia banków).

Korzyści z zastosowania nowego sposobu są następujące: uproszczenie i większa szybkość wytwarzania wirusa rekombinacyjnego i brak konieczności etapu przesiewania związanego z systemami wielokrotnej selekcji uczestniczącymi w procesie i ze strukturą niefunkcjonalnego wektora „rodzicielskiego”.

Przeciwnie do sposobów znanych ze stanu techniki, siła sposobu opiera się na jednoczesnym przeprowadzaniu selekcji, co prowadzi w jednym etapie do wybrania jednego końcowego plazmidu zawierającego funkcjonalny genom adenowirusowy. Wytworzenie nowego wektora rekombinacyjnego

PL 210 590 B1 tylko w jednym etapie znacznie ogranicza konieczny czas pracy w porównaniu ze znanymi sposobami. Nie są potrzebne etapy przesiewania, tak więc ilość niezbędnej pracy jest znacznie mniejsza w porównaniu ze znanymi sposobami. Ponadto, brak konieczności przesiewania otwiera drogę do jednoczesnego wytwarzania wielu rekombinacyjnych wektorów adenowirusowych przez jedną osobę.

Inną, korzystną cechą procesu według niniejszego wynalazku jest to, że oba plazmidy stosowane do wytwarzania plazmidu ostatecznego posiadającego genom funkcjonalny, nie są żywotne. Żaden z tych dwóch plazmidów począ tkowych nie posiada oddzielnie cał o ś ci funkcji, które pozwolił yby na wytworzenie funkcjonalnego genomu adenowirusowego. Tak więc, w skrajnym przypadku ucieczki do narzuconych środków selekcjonujących (antybiotyki), jeżeli oba typy konstrukcji (konstrukcja pożądana i plazmidy początkowe) musiałyby współistnieć po rekombinacji w szczepie bakteryjnym, wynik ten nie miałby wpływu na wytwarzanie pożądanego wektora rekombinacyjnego po transfekowaniu tej mieszaniny do wytwarzającej komórki eukariotycznej. Istotnie, tylko pożądana konstrukcja, powstała po rekombinacji homologicznej, wykazuje żywotność i namnaża się w wytwarzającej komórce eukariotycznej, natomiast plazmidy początkowe nie są żywotne (brak co najmniej jednego regionu ITR dla każdego plazmidu).

Wyżej wspomniane cechy sposobu według niniejszego wynalazku przyczyniają się do uproszczenia wytwarzania wektorów adenowirusowych i odbierają możliwość wytwarzania wektorów rekombinacyjnych z dużą wydajnością. Można zatem wytwarzać jednocześnie rekombinacyjne wektory adenowirusowe zawierające znane sekwencje, dla których chcemy potwierdzić funkcje lub zespoły wektorów rekombinacyjnych zawierających sekwencje o nieznanej naturze, których funkcje chce się poznać. W tym ostatnim przypadku mówi się o adenowirusowych bankach ekspresji.

Zastosowanie w terapii genowej

Adenowirusy mogą być wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych. W tym celu heterologiczny kwas nukleinowy może zawierać jeden lub kilka genów terapeutycznych i jeden lub kilka genów kodujących peptydy antygenowe.

Geny terapeutyczne, które można w ten sposób przenosić, są to wszystkie geny, których transkrypcja i ewentualnie translacja w komórce docelowej powoduje powstanie produktów wykazujących działanie terapeutyczne.

Mogą to być produkty homologiczne w stosunku do komórki docelowej (tzn. produkty, które normalnie są wydzielane przez komórkę docelową, kiedy nie ulega ona żadnemu procesowi patologicznemu). W tym przypadku ekspresja umożliwia na przykład złagodzenie skutków niedostatecznego wydzielania w komórce lub ekspresji białka nieczynnego lub słabo czynnego wskutek modyfikacji, lub też umożliwia zwiększenie wydzielania tego białka. Gen terapeutyczny może również kodować mutant białka komórkowego o zwiększonej stabilności, zmodyfikowanej aktywności, itd. Produkt może być również heterologiczny w stosunku do komórki docelowej. W tym przypadku wydzielane białko może na przykład uzupełniać lub nadawać brakującą funkcję komórki pozwalając jej zwalczać proces patologiczny.

Spośród produktów terapeutycznych można wspomnieć szczególnie o enzymach, produktach krwiopochodnych, hormonach, limfokinach: interleukinach, interferonach, TNF, itd. (WO 93/19191), czynnikach wzrostu, neuroprzekaźnikach lub ich prekursorach, lub enzymach, syntetycznych czynnikach wzrostu: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bBGF, NT3, NT5, itd.; apolipoproteinach: ApoAI, ApoAIV, ApoE, itd. (WO 94/25073), dystrofinie lub minidystrofinie (FR 9 111 947), genach supresorowych guzów: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, itd. (WO 94/24297), genach kodujących czynniki krzepnięcia: czynnik VII, VII, IX, genach samobójczych (TK, itd.), itd.

Gen terapeutyczny może również być genem lub sekwencją antysensowną, której sekwencja w komórce docelowej umoż liwia kontrolę sekwencji genów lub transkrypcji mRNA komórkowego. Sekwencje takie mogą na przykład ulegać transkrypcji w komórce docelowej do RNA komplementarnego do mRNA komórkowego i blokować w ten sposób ich translację do białek sposobem opisanym w patencie EP nr 140 308.

Jak to wspomniano uprzednio, dany kwas nukleinowy może również zawierać jeden lub wiele genów kodujących peptyd antygenowy, zgodny do wywoływania u człowieka reakcji odpornościowej. W tym korzystnym sposobie wykonania wynalazek umoż liwia zatem wytwarzanie szczepionek umoż liwiających uodpornianie człowieka, szczególnie przeciwko drobnoustrojom lub wirusom. Może to szczególnie dotyczyć peptydów antygenowych swoistych dla wirusa Epstein-Barr, wirusa HIV, wirusa zapalenia wątroby typu B (EP nr 185 573), wirusa pseudowścieklizny lub peptydów swoistych dla nowotworów (EP nr 259 212).

PL 210 590 B1

Ogólnie, korzystny kwas nukleinowy zawiera również sekwencje umożliwiające ekspresję genu terapeutycznego i/lub genu kodującego peptyd antygenowy do zakażonej komórki. Mogą to być sekwencje, które są odpowiedzialne za sekwencje danego genu, ponieważ sekwencje te są podatne na funkcjonowanie w komórce zakażonej. Mogą to również być sekwencje innego pochodzenia (odpowiedzialne za syntezę innych białek lub nawet syntetyczne). Mogą to być zwłaszcza sekwencje promotorowe genów eukariotycznych lub wirusowych. Mogą to być na przykład sekwencje promotorowe pochodzące z genomu komórki, którą chce się zakazić. Mogą to być również sekwencje promotorowe pochodzące z genomu wirusa, w tym z genomu stosowanego adenowirusa. W tym kontekście można wymienić na przykład promotory genów ElA, MLP (Major Late Promoter), CMV (cytomegalowirus), RSV (wirus mięsaka Rousa), itd. Ponadto, te sekwencje ekspresji mogą być zmodyfikowane przez dodanie sekwencji aktywacji, regulacji itd. Korzystnie można stosować promotory ulegające regulacji przez tetracyklinę typu Tet on/off lub off/on, lub pobudzeniu przez ektyzon, lub deksametazon. Ponadto, ponieważ gen wprowadzony nie zawiera sekwencji ekspresji, może być wprowadzony do genomu wirusa defektywnego w kierunku końca 5' takich sekwencji. I wreszcie, dany kwas nukleinowy może również zawierać, zwłaszcza w kierunku 5' genu terapeutycznego, sekwencję sygnałową, kierującą zsyntetyzowany produkt terapeutyczny do dróg wydzielania komórki docelowej. Ta sekwencja sygnałowa może być naturalną sekwencją sygnałową produktu terapeutycznego, ale może również być każdą inną funkcjonalną sekwencją sygnałową lub sztuczną sekwencją sygnałową.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające jeden lub więcej rekombinacyjnych adenowirusów wytworzonych według tego sposobu. Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można wytwarzać z przeznaczeniem do podawania miejscowego, doustnego, pozajelitowego, donosowego, dożylnego, domięśniowego, podskórnego, do worka spojówkowego, przezskórnego, itd.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki do preparatu do wstrzyknięć. Zaróbki te mogą być w szczególności roztworami soli fizjologicznej (fosforan jednosodowy, dwusodowy, chlorek sodowy, potasowy, wapniowy lub magnezowy itp., lub mieszaniny takich soli), jałowymi, izotonicznymi, lub kompozycjami suchymi, zwłaszcza liofilizowanymi, które po dodaniu, w zależności od danego przypadku, jałowej wody, lub soli fizjologicznej, pozwalają na ponowne rozpuszczenie substancji rozpuszczonej, do wstrzyknięć.

Dawki wirusów stosowane do wstrzyknięć można dostosowywać w zależności od różnych parametrów, zwłaszcza w zależności od stosowanego sposobu podawania danej jednostki chorobowej, genu ulegającego ekspresji, jak również przewidywanego czasu leczenia. Ogólnie, rekombinacyjne adenowirusy według niniejszego wynalazku zawiera się w preparacie i podaje w postaci dawek zawartych między 104 a 1014 pfu, korzystnie 106 a 1010 pfu. Pojęcie pfu („plaque forming unit”), odpowiada sile zakaźnej roztworu wirusa i określane jest przez zakażenie odpowiedniej hodowli komórkowej i pomiar, zwykle po piętnastu dniach, liczby „łysinek” zakażonych komórek. Sposoby oznaczania miana pfu roztworu wirusowego są dobrze opisane w piśmiennictwie.

W zależności od wprowadzonej heterologicznej sekwencji DNA adenowirusy według wynalazku można stosować w leczeniu lub zapobieganiu licznych chorób, takich jak choroby genetyczne (dystrofia, mukowiscydoza itd.), choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego (choroba Alzheimera, Parkinsona, SLA, itd.), nowotwory, choroby związane z zaburzeniami krzepnięcia lub z dyslipoproteinemią, choroby związane z zakażeniami wirusowymi (zapalenie wątroby, AIDS itd.), itd.

Zastosowanie do wytwarzania białek rekombinacyjnych

Sposób według niniejszego wynalazku pozwala na wytwarzanie wektorów adenowirusowych, które mogą pozwolić na wytwarzanie białek rekombinacyjnych, zwłaszcza w komórkach ludzkich w hodowli. Mogą to być białka takie, jak ludzka albumina surowicy, interferony ludzkie, przeciwciała ludzkie, insulina ludzka, czynniki hematopoetyczne, czynniki, takie jak czynnik IX lub VII, czynniki trombolityczne, takie jak tkankowy aktywator plazminogenu, różne czynniki wzrostu, czynniki troficzne, cytokiny, peptydy ośrodkowego układu nerwowego, opioidy, enzymy, antygeny wirusowe, jak również białka innych organizmów, na przykład roślin.

Zastosowanie w genomice funkcjonalnej

Za pomocą tych samych sposobów wytwarzania, które opisano powyżej, sposób ten wykorzystuje się do walidacji lub odkrywania nowych celów w takim sensie, jak to jest rozumiane w przemyśle farmaceutycznym.

Niniejszy wynalazek dotyczy również dowolnego wykorzystania kompozycji z zastosowaniem opisanego sposobu, w szczególności wytwarzania umożliwiającego uzyskanie i integrację jakiegokol14

PL 210 590 B1 wiek kwasu nukleinowego do pierwszego plazmidu „wahadłowego” (według definicji z niniejszego wynalazku), jak również zastosowania tych plazmidów do wytwarzania jednego lub wielu adenowirusów rekombinacyjnych różnymi sposobami automatyzacji. Te rekombinacyjne adenowirusy można też stosować w różnych modelach in vitro i in vivo do oceny funkcjonalności sekwencji, które zawierają. Funkcjonalność sekwencji znajdujących się w wytworzonych adenowirusach rekombinacyjnych można ocenić jednym z wielu testów funkcjonalnych znanych specjaliście.

Celem niniejszego wynalazku jest zatem również sposób wytwarzania adenowirusowych banków ekspresji obejmujący następujące etapy:

- stworzenie banku pierwotnego w wektorze „wahadłowym”, takim jak to opisano powyż ej;

- przekształ cenie hodowli bakteryjnej z uż yciem tego banku pierwotnego w obecnoś ci plazmidu „rodzicielskiego” według wynalazku;

- wprowadzenie stworzonych plazmidów lub pełnych genomów adenowirusowych po wycięciu przez trawienie enzymatyczne do komórki wytwarzającej adenowirus;

- ewentualnie zakażenie materiału biologicznego komórki celem analizy klonów banku.

Sposób ten obejmuje zatem pierwszy etap wytwarzania banku pierwotnego kwasów nukleinowych w plazmidzie „wahadłowym” według niniejszego wynalazku przed zastosowaniem wynalazku i wykorzystanie banku adenowirusowego w modelu doś wiadczalnym. Wytworzenia takiego banku pierwotnego w plazmidzie według niniejszego wynalazku (plazmidzie „wahadłowym”) można dokonać technikami biologii molekularnej znanymi specjaliście. W szczególności, bank pierwotny można wytworzyć poprzez kolejne przeprowadzenie następujących etapów:

a) uzyskanie mRNA (lub całego RNA) z populacji komórkowej;

b) wytworzenie DNA komplementarnego do izolowanego mRNA populacji;

c) ewentualnie wytworzenie banku kwasów nukleinowych, w którym cDNA umieszczane są pod kontrolą silnego promotora, lub szczególnie pod kontrolą promotora ulegającego regulacji;

d) włączenie cDNA (lub kaset ekspresji) do plazmidu „wahadłowego” według niniejszego wynalazku.

Celem niniejszego wynalazku jest również bank klonowanych kwasów nukleinowych w wektorze lub plazmidzie „wahadłowym”, takim, jak to opisano poprzednio.

W drugim etapie kotransformacja banku pierwotnego plazmidów „wahadł owych” z plazmidem „rodzicielskim” według niniejszego wynalazku umożliwia wytworzenie banku plazmidów zawierających funkcjonalne genomy adenowirusowe. Etap ten można przeprowadzić przez jednoczesną kotransformację plazmidów w bakteriach lub przez kolejne transfekcje. Tak więc, plazmid „rodzicielski” może być na początku wprowadzony do bakterii i następnie, w drugim etapie, plazmidy „wahadłowe” poddawane są transfekcji.

W trzecim etapie plazmidy (lub wycięte funkcjonalne genomy rekombinacyjne) są transfekowane do komórki transkomplementarnej, co pozwala na wytworzenie banku adenowirusów rekombinacyjnych. Korzystnie, wytworzone plazmidy są izolowane i/lub oczyszczane, a genomy rekombinacyjne są wycinane przez traktowanie odpowiednim enzymem (lub enzymami), które nie tną genomu adenowirusowego.

W czwartym etapie zakaż enie wybranej populacji komórkowej (lub materiału biologicznego) bankiem adenowirusów rekombinacyjnych umożliwia analizę właściwości biologicznych lub funkcjonalnych klonów banku. W tym celu, dobraną i zakażoną populację komórkową można umieszczać w warunkach umożliwiających ekspresję kwasu nukleinowego i w ten sposób identyfikację poszukiwanego genotypu poprzez badanie populacji komórkowej. Następnie, można ponownie wejść do wektora indukującego i w ten sposób dokonać charakterystyki DNA nadającego poszukiwany genotyp.

Korzystnie, dla umożliwienia bardziej intensywnych badań funkcjonalności, klony traktuje się oddzielnie i nie w puli. Klony banku pierwotnego w plazmidzie „wahadłowym” są więc transformowane pojedynczo na mikropłytkach w bakteriach zawierających już „rodzicielski” skrócony plazmid adenowirusowy. Przez wzrost na mikropłytkach w obecności czynnika selekcjonującego (antybiotyki) wytworzone DNA ulega oczyszczeniu i transfekcji do wytwarzającej komórki eukariotycznej po wycięciu genomu wybranym enzymem (np. PacI). Taki proces przedstawiono schematycznie na fig. 2.

Według korzystnego sposobu wykonania metody wytwarzania banków adenowirusowych ekspresji według niniejszego wynalazku można stosować technologię klonowania Gateway^®, opracowaną przez Life Technologies, Inc. (LTI, Rockville, MA, Stany Zjednoczone), umożliwiającą jednoczesne wytwarzanie zespołu adenowirusów zawierających inserty pochodzące na przykład z banku DNA

PL 210 590 B1 komplementarnego, lub z grupy sekwencji charakterystycznych i dobranych przez różne metody znane specjalistom.

Technologia klonowania Gateway^®, którą opisano między innymi w patencie Stanów Zjednoczonych nr 5 888 732, umożliwia wprowadzanie insertów między np. dwa wektory plazmidowe w czasie reakcji in vitro, dzięki reakcjom rekombinacji na poziomie miejsc swoistych attL, attR, attB i attP, bakteriofaga lambda (λ) Escherichia coli. Insercja genów nie wymaga już obecności odpowiednich miejsc restrykcyjnych w wektorze, a jedynie obecności krótkich sekwencji rekombinacyjnych zwanych sekwencjami att.

System klonowania Gateway^® polega z jednej strony na przeprowadzaniu reakcji zwanej LR, w czasie której klon wejścia zawierający dany insert otoczony miejscami attL ulega rekombinacji z klonem miejsca przeznaczenia zawierającym miejsca attL w celu wytworzenia klonu ekspresji. Dany insert, znajdujący się w klonie wyjścia, ulega potem przeniesieniu w wektorze ekspresji pochodzącym z klonu miejsca przeznaczenia zawierającego miejsca attB. System Gateway^® umożliwia z drugiej strony przeprowadzenie reakcji odwrotnej, zwanej reakcją BP, w czasie której klon ekspresji, zawierający dany insert, otoczony miejscami rekombinacji attB, ulega rekombinacji z wektorem dawcy, zawierający miejsca attP, dając klon miejsca wejścia, zawierający miejsca attL.

Bardziej szczegółowo, można modyfikować według pierwszej strategii plazmid „wahadłowy”, na przykład pJJ1, jak to opisano uprzednio, w celu wytworzenia plazmidu zgodnego z systemem Gateway^®, posiadającego odpowiednie miejsca att. Według tego pierwszego sposobu miejsca att, korzystnie, wprowadza się między promotor (CMV) a miejsce poliadenylacji SV40 kasety ekspresji plazmidu „wahadłowego”. Tak wytworzony plazmid zwany jest plazmidem przeznaczenia w terminologii technologii Gateway^® i może on później wchodzić w reakcję z klonami wejścia technologii Gateway^®. W wyniku tego, każdy insert pochodzący z banku DNA lub grupy wybranych sekwencji, klonowany w wektorze lub klonie wejścia, może być przenoszony do plazmidu „wahadłowego” według niniejszego wynalazku, nadając plazmidowi „wahadłowemu” ekspresję nadającą się do wykorzystania według wynalazku do wytworzenia odpowiedniego wektora adenowirusowego.

Według drugiej strategii pełny plazmid adenowirusowy ulega modyfikacji tak, aby był zgodny z technologią Gateway^®. Dochodzi zatem do wprowadzenia odpowiednich miejsc att w plazmidzie zawierającym genom adenowirusowy w celu umożliwienia realizacji reakcji opisanych w systemie klonowania Gateway^®. Korzystnie, zamiast i w miejscu regionu E1 genomu adenowirusowego między promotorem a sekwencją poliadylenacji wprowadzane są miejsca att. Strategia ta umożliwia wytworzenie w ten sposób plazmidu zawierającego genomy adenowirusowe zawierające różne inserty, pierwotnie obecne w klonach wejścia. Mogą to być inserty pochodzące z wytwarzania banków komplementarnego DNA, inserty odpowiadające genomom z tej samej rodziny, lub dowolnego pochodzenia. Wytwarza się plazmid zawierający genom adenowirusowy zmodyfikowany i zawierający sekwencje att, który jest klonem przeznaczenia w rozumieniu technologii Gateway^® i oznaczony jest literami pAdDEST (przykład 6, fig. 10). W ten sposób uzyskany klon przeznaczenia, pAdDEST, może reagować z każdym klonem wejścia celem wytworzenia plazmidu ekspresji, w którym znajduje się genom adenowirusowy pAdExp, jak to opisano dalej w przykładzie 6 i na fig. 11.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc również nowy sposób walidacji lub identyfikacji sekwencji związanych z efektem fizjologicznym lub genetycznym, powodującym powstanie charakterystycznego fenotypu. Może to być w szczególności gen powodujący wadę genetyczną lub gen, który może wskazywać lub charakteryzować anomalię genetyczną.

W zastosowaniu do walidacji lub ustalania funkcji jednej lub kilku sekwencji w ramach genomiki funkcjonalnej, sekwencje mogą być wszelkiego rodzaju, zwłaszcza mogą to być sekwencje cytowane powyżej, mogą one jednak również pochodzić z populacji wszystkich sekwencji nieznanej lub wielorakiej natury. Sekwencje te mogą być przeciwstawione w różnych kasetach i na koniec wprowadzone do danego genomu adenowirusowego.

Sekwencje te mogą pochodzić ze wszystkich typów komórek żywych lub wytworzonych sztucznie rozmaitymi sposobami, takimi, jak synteza de novo, mutageneza, kombinacja sekwencji, itd.

Jako źródło sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku można wykorzystywać wielką liczbę banków, w tym jednak bez ograniczenia, banki DNA genomowego (zwłaszcza regionów chromosomów znajdujących się na przykład w YAC lub BAC), banki cDNA, banki DNA syntetycznego, niezależnie od tego, czy banki te są znormalizowane, czy nie, i czy są wytworzone z różnych tkanek żywych w ekspresji sensownej lub antysensownej, sekwencje wytworzone losowo, wykazujące zdol16

PL 210 590 B1 ność do wytwarzania różnych peptydów, sekwencje zdegenerowane pochodzące ze znanej sekwencji, sekwencja mozaikowa sekwencji znanych, itd.

W szczególności, badane sekwencje pierwotne mogą wytwarzać sekwencje antysensowne lub elementy supresji genetycznej. Są to sekwencje, które ulegając ekspresji mogą inaktywować dany gen w badanym układzie biologicznym. Może to być rybozym.

Sekwencje wykorzystywane do tworzenia banków mogą pochodzić z różnych reakcji syntezy. W szczególności, symulacja kierowanej ewolucji molekularnej, która wykorzystuje rekombinację, umożliwia wytworzenie różnych genów, przy użyciu znanych mechanizmów ewolucji (Curr. Op. In Biotech, 1997, 8: 724-733).

Sekwencje stosowane do wytworzenia banków mogą również pochodzić z analizy bioinformatycznej banków danych, które analizują dane genomu ludzkiego. Mogą one być wybrane z zastosowaniem analizy ekspresji genetycznej uzyskanej innymi metodami (EST. Microarrays, DNA chips, differential display) TIBtech 1996; 14: str. 294-298; Nature Biotechnology 1998, 16, str. 27-31.

W szczególności, sposób umożliwia wytworzenie banku adenowirusowego ekspresji sekwencji losowo dobranych peptydów. Umożliwia on zatem ułatwienie selekcji identyfikacji sekwencji białek dobranych losowo zdolnych do łączenia się z danym białkiem. Bank oligonukleotydów o sekwencji losowej wprowadza się do miejsca (polilinkera) odpowiadającego giętkiej pętli białka naturalnego lub syntetycznego, tak, aby peptydy były obecne na powierzchni białka. Może to być prezentacja peptydów w sposób wewnątrzkomórkowy (Colas i wsp., 1996, Nature 380, 548-550 lub na powierzchni komórki (Tramonto i wsp, 1994, J. Mol. Recognit. 7; 9-24). I wreszcie, peptydy mogą być prezentowane na zewnątrz komórki, wprowadzając sygnał sekrecji do kasety ekspresji (Rice i wsp., 1992, PNAS 89, 5467-5471).

Do wektora może zostać zintegrowana jedna lub wiele korzystnych sekwencji.

Można dokonywać na koniec oceny połączenia sekwencji (kasety ekspresji) lub koekspresji danej sekwencji z innym korzystnym genem, na przykład genem markerowym. Można zatem decydować się na zastosowanie sekwencji policistronowych lub na umieszczenie jednej lub wielu sekwencji, które mają ulec ekspresji w innym miejscu niż dana sekwencja, w obrębie genomu adenowirusowego. Można stosować różne sekwencje policistronowe. Elementy IRES umożliwiają translację dwóch lub więcej otwartych ramek odczytu z jednego mRNA. Bardziej szczegółowo, jedna faza odczytuje dane białko (pochodzące z banku cDNA), natomiast druga faza odczytu buduje marker, na przykład GFP.

Sposób umożliwia wykorzystanie układów wycinania (integracji) związanych z aktywnością enzymatyczną. Może to być układ CRE-Lox (Baubonis i wsp., Nucl. Acids Res. 21: 2025-2029), systemu ELP rekombinaza-FRT (Dang i wsp., Dev. Gent. 13; 367-375), systemu Piv z Moraxella lacunata (Lenie i wsp., 1994, J. Bacterid. 176-4160) lub układ integrazy lambda (Kwon i wsp., 1997 Science 276, 126); bardziej szczegółowo, sekwencja lub kaseta ekspresji cDNA połączona z replikującym się wektorem episomalnym ulega wycięciu przez system CRE-Lox z genomu adenowirusowego i przekazaniu do komórek zakażonych, które się podzielą (WO 97/47757).

Sposób ten umożliwia udowodnienie istnienia interakcji DNA-białka. Białko odpowiada zatem populacji sekwencji zdolnych do wiązania się z DNA. Są to polipeptydy pochodzące z białek w naturalny sposób zdolnych do przytwierdzania się do DNA lub do sztucznych polipeptydów. Poszukuje się sekwencji najbardziej swoistej dla danej sekwencji DNA.

Sposób umożliwia udowodnienie interakcji między białkami. Wykorzystuje się zdolność koinfekcji wektora adenowirusowego. Korzystnie, stosuje się test komplementacji LacZ (PNAS 1997, 94, 8405-8410). System komórkowy jest współzakazany pierwszą konstrukcją i bankami c-DNA.

Istnieje wiele różnych testów funkcjonalności, które można wykorzystać do analizy adenowirusowego banku ekspresji według niniejszego wynalazku.

Można stosować na przykład test komplementacji polegający na identyfikacji sekwencji nukleotydowej pochodzącej z banku, którego ekspresja prowadzi do uzyskania danego fenotypu komórkowego. Bardziej szczegółowo, adenowirusowy bank ekspresji umożliwia zakażenie komórki ludzkiej, której brak jest pewnej cechy fenotypowiej. Analiza zakażonych komórek umożliwia wychwycenie komórek, które wykazują poszukiwaną cechę fenotypową. Następnie prowadzi się analizę cDNA wirusa odpowiedzialnego za pojawienie się cechy fenotypowej. Można również zmierzyć znikanie cechy fizjologicznie po zakażeniu powodującym aktywność antysensowną, czyli funkcjonalny „knock-out”.

Sposób umożliwia badanie sposobu działania cząsteczki chemicznej w układzie biologicznym. Adenowirusowy bank ekspresji służy do zakażania komórek układu biologicznego odpowiadających na działanie leku. Po zakażeniu wpływ leku może pozostać niezmieniony, zwiększyć się lub ulec zaPL 210 590 B1 hamowaniu. W tych dwóch ostatnich przypadkach, analiza cDNA genomów wirusowych umożliwia odkrycie dróg wewnątrzkomórkowych i/lub pozakomórkowych, biorących udział w tym działaniu związku chemicznego.

Sposób niniejszego wynalazku można również wykorzystać do:

- poszukiwania kwasów nukleinowych (celów) umoż liwiających ominięcie działania p53 w procesie zahamowania wzrostu i apoptozy,

- identyfikacji cytokin,

- identyfikacji peptydów syntetycznych, które wpływają na procesy komórkowe,

- poszukiwania czą steczek zdolnych do prezentacji pozakomórkowej peptydów,

- identyfikacji celów dla komórek nowotworowych, które nie posiadają specyficznych supresorów nowotworów, identyfikacji genów zaangażowanych w proces powstawania przerzutów.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zestaw zawierający:

- plazmid „wahadł owy”, zawierają cy pierwszy, skrócony genom adenowirusa i

- plazmid „rodzicielski”, zawierają cy drugi skrócony genom adenowirusa, przy czym te dwa plazmidy mogą wytwarzać przez homologiczną rekombinację między dwoma skróconymi genomami adenowirusów, końcowy plazmid, zawierający pełny, liniowy, rekombinacyjny genom adenowirusa, sąsiadujący z jednym lub kilkoma miejscami restrykcji nieobecnymi w tym genomie.

Niniejszy wynalazek zostanie bardziej szczegółowo opisany za pomocą poniższych przykładów, które należy uważać jedynie za ilustrację, a nie ograniczenie tego wynalazku.

Opis rysunków

Figura 1. Opisowy schemat zasady wynalazku. Plazmid „wahadłowy” pJJ1 i plazmid „rodzicielski” pOSE1, z których każdy zawiera fragment komplementarny, tworzą koagregat przez rekombinację homologiczną w E. coli, tworząc pełny genom adenowirusa rekombinacyjnego z sekwencją egzogenną. KmR: gen oporności na kanamycynę. Tet R: gen oporności na tetracyklinę. RK2 Ori: początek replikacji plazmidu RK2. RK6 Ori: początek replikacji plazmidu RK6.

Figura 2. Jednoczesne wytwarzanie dziewięćdziesięciu sześciu adenowirusów rekombinacyjnych zawierających cDNA pochodzące z banku cDNA wytworzonego w plazmidzie „wahadłowym”. Zastosowanie właściwości technologii OSEDRAG.

Figura 3. Wytwarzanie plazmidu „rodzicielskiego” według wynalazku, zawierającego sekwencję genomu adenowirusowego, niepełną, a zatem niefunkcjonalną w technologii EDRAG (Crouzet i wsp.). Mapa plazmidów pJJ301, pXL3215 i plazmidu POSE17-00.

Figura 4. Mapy różnych wersji plazmidów „rodzicielskich”, nadających się do wykorzystania według wynalazku, do wytwarzania różnych wersji rekombinacyjnych wektorów adenowirusowych, zwłaszcza wektorów po delecji E1 i E3 (pOSE10-00) wektorów po delecji E1 i E3 i zaopatrzonych w region pIX pod jego postacią syngen # 2 (WO 99/25861)-(pOSE17-00), wektorów po delecji E1, E3 i E4 (pOSE30-00) i wektorów po delecji E1, E3 i E4, wyposaż onych w region pIX pod jego postacią syngen # 2 (pOSE37-00).

Figura 5. Wytwarzanie sposobem według niniejszego wynalazku rekombinacyjnego genomu adenowirusowego, zawierającego kasetę ekspresji genu LacZ. Mapa plazmidu „wahadłowego” pIG5 i plazmidu „rodzicielskiego” pOSE17-00 i plazmidu koń cowego pAd17-01. Mapa plazmidów pIG5, pOSE17-00 i pAd17-01.

Figura 6. Wytwarzanie sposobem niniejszego wynalazku genomów adenowirusowych za pomocą trzech różnych plazmidów „wahadłowych” (pIG5, zawierający kasetę ekspresji LacZ; plazmid pIG18; zawierający kasetę ekspresji genu lucyferazy i pIG7: bez kasety ekspresji). Trawienie enzymatyczne klonów powstałych po transformacji plazmidu „wahadłowego” i plazmidu „rodzicielskiego”.

Figura 7. Wytwarzanie sposobem według niniejszego wynalazku wektorów adenowirusowych po transfekcji różnych klonów plazmidu pAD17-01 w komórce wytwarzającej 293. Trawienie enzymatyczne DNA wirusowych oczyszczonych z wirusów namnożonych w komórce 293.

Figura 8. Wytwarzanie sposobem według niniejszego wynalazku banku genomów adenowirusowych wytworzonych przez bank pierwotny cDNA w plazmidzie „wahadłowym” pTA00. Bank genomów adenowirusowych wytwarza się z zastosowaniem plazmidu „rodzicielskiego” pOSE37-10, który jest plazmidem pochodnym pOSE37-00. Mapa plazmidów pTA00, pOSE37-10 i pAd37-10.

_®

Figura 9. Wytwarzanie plazmidu ekspresji pAdGWExpLacZm, zgodnego z systemem Gateway^® (LTI, Rockville, MA, Stany Zjednoczone), przez rekombinację homologiczną plazmidów PSHExpLacZ i Px12689.

PL 210 590 B1

Figura 10. Wytwarzanie reakcją zwaną BP plazmidu przeznaczenia pAdDEST, zawierającego pełny genom adenowirusowy, gen ccdB, letalny dla E. coli, otoczonego miejscami rekombinacyjnymi AttR1 i attR2.

Figura 11. Wytwarzanie plazmidu adenowirusowego zawierającego korzystny insert pAdExp dla reakcji zwanej LR.

Ogólne sposoby klonowania, biologii molekularnej i biologii komórkowej

Klasyczne metody biologii molekularnej, takie jak odwirowanie DNA plazmidowego w gradiencie chlorku cezu-bromku etydowego, trawienie enzymami restrykcyjnymi, elektroforeza na żelu, transformacja w E. coli, strącenie kwasów nukleinowych itd., opisano w piśmiennictwie (Maniatis i wsp., 1989).

Enzymy pochodzą z firmy New-England Biolabs (Beverly, MA, Stany Zjednoczone). Do ligacji fragmenty DNA rozdzielono według wielkości na żelu agarozowym od 0,8 do 1,5%, oczyszczono na GeneClean (BIO101, LaJolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki) i inkubowano przez noc w temperaturze 14°C w buforze Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, w obecności ligazy DNA faga T4.

Poddane ligacji DNA wykorzystuje się do przekształcenia szczepu, któremu nadano kompetencje E. coli TGl ^(lac pro A, B), supE, thi, hsdD5/F' traD36, pro A+, B+, lacl^q, ^ΖΔΜ15] (Maniatis i wsp., 1982), szczepu E. coli Top10 (TOP10 One Shot Kit, Invitrogen, Holandia) lub szczepu E. coli polA SF800 (Heffron i wsp., 1977).

Powielenia metodą PCR (polimerazowa reakcja łańcuchowa) również dokonano sposobem Maniatis i wsp., 1989, w następujących warunkach: temperatura denaturacji 95°C, temperatura hybrydyzacji 55°C, temperatura wydłużania łańcucha 72°C. Cykl ten powtórzono 25 razy w urządzeniu PTC-200 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Massachusetts, Stany Zjednoczone Ameryki).

Oligonukleotydy syntetyzowała firma GENSET (Evry, Francja). Sekwencjonowania dokonała firma ESGS (Evry, Francja).

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie plazmidów „rodzicielskich”

W przykładzie tym opisano wytwarzanie genomu adenowirusowego, okrojonego w swej części 5', po delecji regionów E1 i E3, adenowirusa ludzkiego typu 5, okolonego unikalnym miejscem restrykcyjnym, w swej części 3' w plazmidzie grupy niezgodności P replikującym się w E. coli.

Plazmidy według niniejszego wynalazku można wytwarzać na inne sposoby. W korzystnym sposobie wytwarza się plazmid pOSE17-00 sposobem EDRAG (FR 2 730 504), przy użyciu plazmidów pXL3215 i pJJ301. Plazmid PXL3215 zawiera całość genomu AD (minus dwie delecje w regionach E1 i E3) i zawiera kasetę ekspresji genu LacZ kierowaną przez promotor RSV w regionie E1. Plazmid PXL 3215 jest pochodną plazmidu PXL2689 i zawiera początek replikacji plazmidu RK2, gen oporności na tetracyklinę (J. Crouzet PNAS, 1997).

Plazmid pJJ301 zawiera początek replikacji RK6 i nie może się replikować w szczepach E. coli pir-. Plazmid pJJ301 zawiera gen oporności na kanamycynę. Plazmid pJJ301 zawiera region homologiczny na początku genomu adenowirusowego znajdujący się w pOSE17-00. Jest to szczególna wersja regionu pIX, zwana syngen # 2, którą opisano w publikacji WO 99/25861. W kierunku końca 5' tej sekwencji wprowadza się sekwencję homologiczną do pełnego genomu adenowirusowego w plazmidzie pXL3215. W wyniku podwójnej rekombinacji plazmidów pXL3215 i pJJ301 powstaje pOSE17-00. Ten plazmid pOSE17-00 odpowiada plazmidowi „rodzicielskiemu” według niniejszego wynalazku, przedstawiono go schematycznie na fig. 3.

Inne plazmidy „rodzicielskie” (pOSE 10-00, pOSE30-00, pOSE37-00) wytworzono według tego samego schematu, umożliwiającego wytwarzanie genomów adenowirusowych z delecją w regionach E1 i E3 (w wersji z dzikim regionem pIX lub w wersji ze zdegenerowanym regionem pIX (WO 99/25861)) lub genomów adenowirusowych z delecją w regionach E1, E3 i E4 (w wersji z dzikim regionem pIX lub w wersji ze zdegenerowanym regionem pIX (fig. 4)).

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie plazmidów „wahadłowych”

W przykładzie tym opisano wytwarzanie plazmidu „wahadłowego” zawierającego region 5' genomu adenowirusowego (region ITR i region enkapsydacji), adenowirusa ludzkiego typu 5, poprzedzony miejscem restrykcyjnym PacI.

Plazmid ten zawiera początek replikacji RK6 i jest niezdolny do replikacji w E. coli, która nie może dokonać transkomplementacji dla białka pir. Ten plazmid pIG5 zawiera kasetę ekspresji LacZ, poprzedzającą sekwencję homologiczną do sekwencji obecnej w pOSE17-00 (sekwencja odpowiadaPL 210 590 B1 jąca części regionu pIX Iva2). Plazmid ten zwany jest plazmidem „wahadłowym” według niniejszego wynalazku; zawiera on gen oporności na kanamycynę (fig. 5).

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie funkcjonalnego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego

W przykł adzie tym opisano wytwarzanie funkcjonalnego genomu adenowirusowego po delecji regionów E1 i E3, adenowirusa ludzkiego typu 5, którego końce sąsiadują z miejscem restrykcyjnym PacI w plazmidzie z grupy niezgodności P, replikującym się w E. coli i zawierającym kasetę ekspresji genu LacZ.

Sposobem integracji jest homologiczna rekombinacja w szczepie E. coli, między pOSE17-00 a pIG5. Plazmid pOSE17-00 wprowadzono do komórek szczepu E. coli JM83 Rec+ LacZ-. Ze swej strony, komórki pochodzące z klonu tetracyklinoopornego nabyły kompetencje, zostały transformowane przez plazmid pIG5 i następnie posiane na pożywkę LB, w obecności tetracykliny i kanamycyny. Biorąc pod uwagę, ze plazmid pIG5 nie replikuje się w szczepie JM83, nabycie oporności na tetracyklinę i na kanamycynę może dokonać się jedynie dzięki rekombinacji homologicznej między dwoma plazmidami. Istotnie, mają one wspólny region pIX genomu Ad5. Powstały plazmid posiada pełny genom rekombinacyjnego wektora adenowirusowego, sąsiadujący z miejscem PacI. Trawienie enzymami PacI i Hindlll, EcoRI lub PacI i Dral umożliwia kontrolę wytwarzania oczekiwanej struktury plazmidowej. Ten końcowy plazmid, zawierający funkcjonalny genom adenowirusowy, nazwano pAd17-01 (fig. 5).

W ten sam sposób z plazmidu pIG5 i plazmidu pOSE37-00 powstaje plazmid zawierający pełny genom adenowirusowy po delecji E1, E3, E4, zaopatrzony w region pIX w postaci syngen # 2 (WO 99/25861).

Ponadto, tym samym sposobem można wytwarzać inne rekombinacyjne genomy z tej samej rodziny, zwierające kasetę ekspresji lub nie. Stosuje się pIG7 i pIG18, pochodzące z pIG5: pIG7 nie zawiera kasety ekspresji, pIG18 zawiera kasetę ekspresji genu lucyferazy. O ile kaseta ekspresji nie wykazuje homologii sekwencji z sekwencją genomową chromosomu bakteryjnego, oczekuje się, że 100% klonów będzie dodatnich. Jak to zilustrowano na fig. 6, 100% analizowanych klonów, pochodzących z tego doświadczenia, okazało się zawierać oczekiwane struktury nukleotydowe (fig. 6).

PAd17-01 strawiono PacI uwalniając genom rekombinacyjnego adenowirusa. Produkt tego trawienia można stosować w stanie niezmienionym do transfekcji transkomplementarnych komórek ssaków (komórki 293) dla funkcji E1 adenowirusa.

P r z y k ł a d 4. Produkcja rekombinacyjnych adenowirusów

Można wytwarzać klony adenowirusów rekombinacyjnych w Escherichia coli poprzez (i) wprowadzanie fragmentów zawierających jeden lub więcej genów, z odpowiednimi sygnałami regulacji, celem ekspresji tych genów w badanych komórkach ssaków lub (ii) przez delecję pewnych fragmentów genów adenowirusa lub też przez połączenie tych dwóch zjawisk i następnie po transfekcji komórek wytwarzających można uzyskać pewien zapas takiego adenowirusa rekombinacyjnego.

Plazmid pAd17-01 oczyszcza się z hodowli komórek E. coli DH5, kompetentnych i poddanych transformacji. Genom adenowirusa uwalnia się przez trawienie w obecności enzymu PacI. Produkt trawienia stosuje się bezpośrednio do wytwarzania rekombinacyjnych adenowirusów. W tym celu komórki linii 293 są transfekowane przez produkt trawienia pAd17-01 w obecności Effectene (Qiagen, Niemcy). Adenowirus rekombinacyjny namnaża się w linii komórkowej 293, co prowadzi do powstania nadsączu hodowli, zawierającego rekombinacyjny adenowirus, nie oczyszczony, o mianie 10¹⁰ pfu/ml.

Jednorodność DNA wirusowego sprawdza się poprzez trawienie enzymatyczne po oczyszczeniu DNA powstałego z namnożonych wirusów (fig. 7).

Cząstki wirusowe oczyszcza się następnie przez odwirowanie na gradiencie chlorku cezu znanymi sposobami (zob. zwłaszcza Graham i wsp., Virology 52 (1973) 456) lub przez chromatografię. Adenowirus można przechowywać w temperaturze -80°C w 20% glicerolu.

P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie adenowirusowych banków ekspresji

Stosuje się plazmid „wahadłowy”, zaopatrzony w początek replikacji RK6, w celu wytworzenia pierwotnego banku plazmidów „wahadłowych”, który posłuży poprzez homologiczną rekombinację do wytworzenia banku rekombinacyjnych genomów adenowirusa w plazmidzie zawierającym początek replikacji RK2. Ten bank plazmidów rekombinacyjnych genomów adenowirusowych będzie transfekowany w transkomplementarnej komórce wytwarzającej, w celu wytworzenia banku rekombinacyjnych adenowirusów.

Wszystkie etapy są przedstawione schematycznie na fig. 2, natomiast struktury plazmidowe umożliwiające tworzenie adenowirusowego banku ekspresji są przedstawione na fig. 8.

PL 210 590 B1

P r z y k ł a d 5.1. Wytwarzanie banku cDNA w wektorze „wahadłowym”

W celu wytworzenia banku w wektorze „wahadłowym” (pochodna pIG5 lub gen LacZ wycięto i zastąpiono wieloma miejscami klonowania, zwłaszcza miejscami XhoI i EcoRI), 10-20 μg wektora oczyszczonego przez gradient cezu strawiono 5 U^g enzymu Xhol i EcoRI przez 90 minut w temperaturze 37°C. Produkt trawienia umieszczono na żelu agarozowym (1% Seakem GTG) i linearyzowany wektor rozdzielono przez elektroforezę w buforze TAE. Prążek odpowiadający wektorowi odcięto po wizualizacji na stole UV. Wektor eluowano z agarozy (Qiaquick DNA Cleanup System, Qiagen, Niemcy) i oczyszczono przez ekstrakcję fenol/chloroform i następnie strącono etanolem. Wektor ten umożliwia wytworzenie, po ligacji, insertu strawionego EcorI i XhoI, około 5 milionów klonów^g, przy tle mniejszym od 10%.

Wytwarzanie cDNA: cDNA wytwarza się z populacji RNA wzbogaconej mRNA. Syntezy pierwszej nici dokonuje się według klasycznych protokołów z zastosowaniem transkryptazy Superscript II (Stratagene), za pomocą primera oligo dT, zawierającego sekwencję miejsca XhoI na końcu 5'. Syntezy drugiej nici dokonuje się z zastosowaniem enzymu DNA polimerazy I DNA E. coli w obecności RNAzy H i ligazy DNA E. coli. Końce wytworzone przez drugą nić są wypełniane dzięki działaniu polimerazy DNA T4.

cDNA frakcjonuje się, w zależności od wielkości, przez chromatografię filtracyjną, na żelu, za pomocą Biogel A50M, jak to opisano uprzednio (Soares i wsp. PNAS, 91: 9228-9232). cDNA frakcjonowane ze względu na wielkość, poddaje się ligacji do dostępnych w handlu adaptatorów EcoRI (Stratagene) i następnie trawi się EcoRI dla wytworzenia fragmentów cDNA zaopatrzonych w końce EcoRI (5') i HoI (3'). Adaptatory, które nie uległy ligacji, eliminuje się przez chromatografię na kolumnie Sepharose CL4B (Pharmacia). cDNA, zawierający adaptatory, poddaje się fosforylacji stosując kinzę polinukleotydów T4 i poddaje się ligacji stosując ligazę DNA T4, w miejscach EcoRI i XhoI wektora „wahadłowego”, jak to opisano uprzednio w temperaturze 16°C przez okres od 48 godzin (600 ng wektora + 300 ng insertu, w objętości 10-20 μ(). Bank namnaża się przez eletroporację w szczepie pir.116+, umożliwiając replikację plazmidów zaopatrzonych w początek replikacji RK6 i następnie posiewa się do 100 pudełek o średnicy 150 mm, w pożywce Agar-LB, z dodatkiem kanamycyny. Uzyskuje się bank 5 milionów klonów. Pierwotny bank cDNA w plazmidzie „wahadłowym” poddaje się następnie normalizacji, zgodnie z protokołem opisanym przez Soaresa i wsp. w 1994 roku. Etap selekcji podzespołu klonów można przeprowadzić opierając się na technikach umożliwiających oznaczenie profilu ekspresji klonów, jak na przykład za pomocą metody „puces” DNA (Amersham, Molecular Dynamics, Affymetrix).

Wyselekcjonowane klony pochodzące ze znormalizowanego banku cDNA w plazmidzie „wahadłowym” są uporządkowane na mikropłytkach po 96 głębokich zagłębień, w ilości jednego klonu/zagłębienie. Klony te namnaża się w pożywce płynnej (LB) w obecności odpowiedniego antybiotyku (kanamycyny). Wytwarzanie DNA każdego klonu wykonuje się jednocześnie dla 96 próbek hodowlanych, stosując robota Quiagen (Quiagen Biorobot 9600) i stosując zestaw Quiaprep 96 Turbo Biorobot (Quiagen, Niemcy). DNA jest ponownie umieszczany w 50 μl Tex1. Na płytce zwanej pierwotną umieszcza się w porządku 96 próbek DNA plazmidowego.

P r z y k ł a d 5.2. Wytwarzanie banku plazmidowego funkcjonalnych genomów adenowirusowych zawierających cDNA

Rodzicielski genom adenowirusowy znajdujący się w plazmidzie RK2 (pOSE37-00) wprowadza się przez klasyczną transformację do szczepu JM83. Hodowli tego szczepu, zaopatrzonego w plazmid (JM83xpOSE37-00), nadaje się kompetencje standardowymi sposobami, przez kolejne płukania w 100 mM CaCl2. W mikropłytce o 96 głębokich zagłębieniach umieszcza się komórki kompetentne (JM83xpOSE37-00), w ilości 40 μl na zagłębienie.

DNA każdego plazmidu „wahadłowego” przekształca się w tym szczepie tak, aby spowodować homologiczną rekombinację, w wyniku której powstaje funkcjonalny genom adenowirusowy. Następnie, do 40 μl komórek kompetentnych dodaje się, zachowując uporządkowanie, 5 μl DNA pochodzącego z płytki zwanej pierwotną. Płytkę ogrzewa się do temperatury 40°C przez jedną minutę i następnie ponownie umieszcza na lodzie przez 2 minuty. Dodaje się po 1 ml pożywki (LB), zawierającej dwa odpowiednie antybiotyki (kanamycynę i tetracyklinę) na zagłębienie. Po pierwszym sześciogodzinnym kursie, 50 μl z tego kursu służy do posiania na nową płytkę, o 96 głębokich zagłębieniach, w których znajduje się po 1 ml pożywki (LB), zawierającej dwa odpowiednie antybiotyki (kanamycynę i tetracyklinę). Hodowlę prowadzi się przez 14 godzin.

PL 210 590 B1

DNA plazmidowe powstałe w wyniku przeprowadzenia tego kursu oczyszcza się, stosując robota Quiagen (Quiagen Biorobot 9600) i stosując zestaw R.E.A.L Prep 96 Biorobot, po czym stosuje się jeszcze etap rozdzielania Quiawell, z zastosowaniem zestawu Quiawell 96 Ultra Biorobot Kit, przed strąceniem w izopropanolu (Quiagen, Niemcy). DNA ponownie umieszcza się w 50 μΐ Tex1.

Następnie, przenosi się 20 μl każdego DNA (około 0,4 μg) na nową mikropłytkę o 96 zagłębieniach, zachowując uporządkowanie. To DNA trawi się enzymem PacI, w celu wycięcia genomu wirusowego. Do zagłębień dodaje się 10 μΐ mieszaniny reakcyjnej (3 μΐ bufora Nel, 6 μΐ H₂O, 1 μΐ (2,5 j) PacI) do 20 μΐ DNA. Reakcję prowadzi się w temperaturze 37°C przez 1,5 godziny. Płytkę odwirowuje się i zamraża do temperatury -20°C, aż do następnego etapu.

Wirusowy DNA powinien zostać strawiony przez PacI w ce^ wycięcia genomu adenowirusowego i następnie transfekowany w transkomplementarnych komórkach eukariotycznych, w ce^ wytworzenia banku wirusowego.

P r z y k ł a d 5.3. Wytwarzanie adenowirusowego banku ekspresji

Płytkę o 96 zagłębieniach, zawierającą DNA strawione przez PacI, doprowadza się do temperatury otoczenia. Do 30 μΐ DNA strawionego przez PacI z każdego zagłębienia dodaje się 2 μΐ wzmacniacza i 15 μΐ effectenu (Effectene Tranfection Reagent, Quiagen, Niemcy). Następnie, mieszaninę transfekującą rozprowadza się w zagłębieniach płytki 96- ^b 48-zagłębieniowej, do których posiano komórki IGRP2 (WO 96/22378) w Mości 105 komórek/cm².

dni po transfekcji pobiera się 50-75 μΐ/zagłębienie nadsączu hodowN, który służy do zakażania nowej płytki ze świeżo posianymi komórkami komplementarnymi. Ten etap namnażania powtarza się 3 do 5 razy, dte zapewnienia jednorodności miana wirusa uzyskanego w każdym z zagłębień. Miano uzyskane w każdym z zagłębień zawiera się pomiędzy 5 x 10⁸ i 5 x 10⁹ cząstek na mi. Płytkę odwirowuje się i zamraża do temperatury -20°C.

Wirusy te można stosować bezpośrednio w odpowiednim układzie biotogicznym. Po infekcji mode^ komórkowego przez bank, ustata się i wprowadza anaNzę funkcjona^ą. AnaNzę prowadzi się szczególnie w kierunku aktywności proapoptotycznej, antyangiogennnej ^b antyapoptotycznej, w zateżności od zastosowanego mode^ komórkowego. Uporządkowanie Wonów, a następnie wirusów, w czasie tworzenia banku, umożNwia łatwe odtwarzanie sekwencji nukteotydowej związanej z aktywnością funkcjona^ą i w ten sposób umożNwia zdefiniowanie nowego ce^.

P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie ptazmidu zawierającego genom adenowirusowy zgodny z systemem bonowania Gateway® firmy Life Technotogies (LTI, RockviNe, MA, Stany Zjednoczone)

Wytwarza się ptezmid pSHExptacZ; zawiera on promotor CMV, miejsce attB1, gen LacZ, miejsce attB2 oraz miejsce poNadenylacji SV40 w wektorze „wahadłowym” typu pIG5 (fig. 2). W ce^ wytworzenia tego ptazmidu, cDNA genu LacZ pochodzącego z ptazmidu pSV404acZ (Promega) trawi się Hindm i Dral i wprowadza do miejsc Xmd i EcoRV pENTR-1A, opisanych przez Life Technotogies w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 888 732, w wyniku czego powstaje ptazmid pENTR-LacZ. Reakcja typu LR (technika bonowania Gateway® pomiędzy pENTR-LacZ i pDest12.2 powoduje powstanie pExpLacZ (nazwa według techniki Gateway^®).

Dwa etapy podktonowania ułatwiły ostateczne wytworzenie pSHExptacZ: fragment Ncol/Asel pExpLacZ wprowadza się do Asel i NcoI pCA350 (pochodna pIG5), wytwarzając ptazmid pSExpLacZ. I wreszcie, fragment Pad/SaN pSExpLacZ wprowadza się do Pad/SaN ptazmidu pIG7 (pochodna pIG5). Na końcu sekwencji znajdują się: promotor CMV, miejsce attB1, gen LacZ, miejsce attB2 i miejsce poNadenylacji SV40 zamiast kasety CMV-LacZ ptezmidu „wahadłowego” pIG5 (przykład 2). Tak wytworzony ptazmid oznacza się jako pSHExpLacZ; przedstawia go fig. 9. Następnie, wytwarza się ptazmid oznaczony jako pAdGWExpLacZ zgodny z systemem Gateway®, technika EDRAG (patent FR nr 2 730 504) z wykorzystaniem ptezmidów pSHExpLacZ i pXL2689.

Ptazmid pXL2689, opisany przez Crouzet i wsp. (PNAS 1997), zawiera początek ptazmidu RK2, gen oporności na tetracykNnę i zakaźny genom adenowirusowy z detecjami w E1 i E3. W wyniku rekombinacji ptazmidów pXL2689 i pSHExpLacZ powstaje ptazmid pAdGWExpLacZ, zawierający genom adenowirusowy i insert zawierający promotor CMV, miejsce attB1, gen LacZ, miejsce attB2 i miejsce poNadenylacji SV40 (fig. 9).

Tak wytworzony ptazmid pAdGWExpLacZ zawiera korzystny gen, przedstawiony przez LacZ, między dwoma miejscami rekombinacji attB faga tambda E. coli i reaguje z wektorem, zwanym donorem, układu Gateway^® (pDONR201) zawierającym miejsca attP, gen oporności na kanamycynę (KnR) i gen ccdB, który jest teta^y d^ E. coli. Ptazmid powstały w wyniku tej reakcji, zwanej BP, według

PL 210 590 B1 nazewnictwa techniki klonowania Gateway^®, oznacza się jako pAdDEST (plazmid przeznaczenie); przedstawiono genom na fig. 10.

I wreszcie, plazmid pAdDEST reaguje dzięki miejscom attR1 i attR2 z klonem, zwanym klonem wejścia układu Gateway^®, zawierającym korzystny insert, otoczony miejscami rekombinacji attL1 i attL2, przez reakcję zwaną LR. Tak wytworzony plazmid oznacza się jako pAdExp i zawiera on pełny genom adenowirusowy, jak również korzystny insert (fig. 11).

Piśmiennictwo

Ausubel i wsp., 1987: Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.

Bolivar i wsp., 1977. Gene 2: 95.

Crouzet i wsp., 1997. PNAS 94, 1414-1419

Dagert i wsp., 1979 . Gene, 6, 23-28.

Ditta i wsp., 1980. Plasmid, 13, 149-154.

Ghosh-Choudhurry i wsp. 1986. Gene, 50,161-171.

Hamilton i wsp., 1989. J. Bacterid. 171: 4617-4622.

Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol. 166: 557.

Heffron i wsp., 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 702-706.

Maniatis T. i wsp., 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Miller i wsp., 1988. J. Bacteriol. 170:2575-2583.

Simoes, i wsp., 1991. New York Acad. Sci. 646: 254-258.

Sinha N. D. i wsp., 1984. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557.

Slater i wsp., 1993. J. Bacteriol. 175: 4260-4262.

Viera i wsp., 1982. Gene, 19, 259-268.

Wirth, i wsp., 1989. Mol. Gen. Genet., 216, 175-177.

Zeef i wsp., 1994. EMBO J. 13: 5113-5120.

Claims (4)

1. Sposób wytwarzania rekombinacyjnego adenowirusa, znamienny tym, że obejmuje:

a) wytwarzanie pierwszego plazmidu (zwanego „wahadłowym”), zawierającego region 5' genomu adenowirusa ludzkiego typu 5 i zawierającego co najmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy, przy czym plazmid ten nie podlega linearyzacji przed etapem rekombinacji i korzystnie jest plazmidem prokariotycznym,

b) doprowadzanie do zetknięcia tego pierwszego plazmidu, z drugim plazmidem (zwanym „rodzicielskim”), skróconym w regionie 5' genomu adenowirusa ludzkiego typu 5 o regiony E1 i E2, zawierający co najmniej jeden heterologiczny kwas nukleinowy, komplementarny do pierwszego genomu, przy czym oba plazmidy są plazmidami o postaci kolistej co umożliwia za pomocą homologicznej rekombinacji wytworzenie końcowego plazmidu, zawierającego pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy, przy czym rekombinację homologiczną prowadzi się w żywej komórce E. coli,

c) wycięcie pełnego, liniowego rekombinacyjnego genomu adenowirusowego z plazmidu końcowego i wprowadzenie go do komórkowej linii enkapsydacji, w celu wytworzenia adenowirusów rekombinacyjnych obejmujących pełny rekombinacyjny genom adenowirusowy, przy czym wspomniany plazmid „wahadłowy” i wspomniany plazmid „rodzicielski” oba zawierają identyczny adenowirusowy region homologiczny, oba zawierają miejsce origin replikacji i dwa różne markery selekcji do selekcji każdego elementu i oba zawierają sekwencję odwróconego powtórzenia końcowego (ITR) otoczone miejscami restrykcyjnymi nie obecnymi w genomie adenowirusowym i jeden lub drugi zawiera sekwencję enkapsydacji.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto zastosowanie wytworzonych adenowirusów rekombinacyjnych do zakażania:

- materiału biologicznego zawierającego komórki oprócz człowieka, dla analizy właściwości kwasu nukleinowego,

- hodowli komórkowej in vitro lub ex vivo, dla wytwarzania białka, polipeptydu lub peptydu kodowanego przez ten heterologiczny kwas nukleinowy, przy czym wszystkie etapy zastosowania przeprowadza się poza organizmem człowieka lub zwierzęcia.

PL 210 590 B1

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, do wytwarzania adenowirusowych bibliotek ekspresji.

4. Zestaw, znamienny tym, że zawiera:

- plazmid „wahadł owy” jak zdefiniowano w zastrz. 1; i - plazmid „rodzicielski” jak zdefiniowano w zastrz. 1, za pomocą obu plazmidów mog ą cy wytworzyć poprzez homologiczną rekombinację między dwoma skróconymi genomami adenowirusa plazmid końcowy, który zawiera pełny liniowy rekombinacyjny genom adenowirusa, otoczony przez jedno lub kilka miejsc restrykcyjnych, które są nieobecne w tym genomie, przy czym wspomniany plazmid „wahadłowy” i wspomniany plazmid „rodzicielski” oba zawierają identyczny adenowirusowy region homologi rozciągający się od lewego ITR do regionu E3, oba zawierają miejsce origin replikacji i dwa różne markery selekcyjne dla selekcji każdego elementu i oba zawierają sekwencję odwróconego powtórzenia końcowego (ITR) otoczoną miejscami restrykcyjnymi nie obecnymi w genomie adenowirusowym i jeden lub drugi zawiera sekwencję enkapsydacji.