CZ303144B6 - Zpusob výroby rekombinantního lidského choriogonadotropinu - Google Patents
Zpusob výroby rekombinantního lidského choriogonadotropinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303144B6 CZ303144B6 CZ20022855A CZ20022855A CZ303144B6 CZ 303144 B6 CZ303144 B6 CZ 303144B6 CZ 20022855 A CZ20022855 A CZ 20022855A CZ 20022855 A CZ20022855 A CZ 20022855A CZ 303144 B6 CZ303144 B6 CZ 303144B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chromatography
- eluate
- hcg
- previous step
- column
- Prior art date
Links
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 7
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 title abstract description 37
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 title abstract description 37
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 19
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 10
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 claims description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 11
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 abstract description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 abstract description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 11
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 10
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 10
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002684 recombinant hormone Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CBUWTGCATVNMJE-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethylheptanal Chemical compound CC(C)(C)CCCCC=O CBUWTGCATVNMJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010057021 Menotropins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- FYKBZUWKMAEAQP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OCC(N)(CO)CO FYKBZUWKMAEAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002659 Anovulatory cycle Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010011498 Cryptorchism Diseases 0.000 description 1
- 206010012205 Delayed puberty Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010059594 Secondary hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 201000000160 cryptorchidism Diseases 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- -1 sodium phosphate hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Zpusob cištení lidského choriogonadotropinu (hCG) ze vzorku, který spocívá v tom, že se vzorek podrobí chromatografii na sloupci s náplní oxidu kremicitého následované ionexovou chromatografií na dvou ruzných iontomenicích za ruzných podmínek, RP-HPLC a vylucovací chromatografií na Sephacrylu.
Description
Způsob výroby rekombinantního lidského choriogonadotropinu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu čištění lidského choriogonadotropinu hCG, zvláště čištění rekombinantního lidského choriového gonadotropinu ze surového vzorku této látky. Postup zahrnuje použití chromatografie na iontoměniči a vysokotlaké kapalinové chromatografie HPLC v reversní fázi.
io
Dosavadní stav techniky
Choriogonadotropin je hormon, produkovaný placentou a získávaný z moči těhotných žen.
Jde o heterodimemí hormon, který je tvořen podjednotkami alfa a beta, které jsou spolu vázány nekovalentní vazbou. Účinky tohoto hormonu odpovídají účinkům luteinizačního hormonu.
Choriogonadotropin (CHO) se podává ženám k vyvolání ovulace po stimulaci vývoje folikulu podáváním folikulostimulačního hormonu nebo pri léčení neplodnosti, doprovázené anovulačmmi cykly vzhledem k nízké koncentraci gonadotropinů nebo v případě, že tyto hormony zcela chybí. Podávají se jednotlivé dávky 5000 až 10 000 jednotek nitrosvalově k napodobení vrcholu koncentrace luteinizačního hormonu uprostřed cyklu, po němž obvykle dochází ke stimulaci ovulace. Choriogonadotropin se také podává ve spojení s menotrophinem a někdy také s clomiphen25 citrátem jako pomocný prostředek pri oplodnění in vitro a pri dalších postupech asistovaného otěhotnění včetně vyvolání superovulace a odběru vajíček. U mužů se tento hormon užívá pri léčení prepubertálního kryptorchismu. Způsob podávání se může měnit v širokém rozmezí, obvykle se však podává 500 až 4000 jednotek 3krát týdně nitrosvalově.
Uvedený hormon se také podává v případě mužské neplodnosti, spojené s hypogonadotrofhím hypogonadismem. I v tomto případě se mohou dávky pohybovat v širokém rozmezí, obvykle se podává 500 až 4000 jednotek 2krát až 3krát týdně. Často se přidává ještě látka s folikulostimulačním účinkem, například menotrophin k dosažení normální spermatogenese. V případě oligospermie se podávají dávky až 3000 jednotek choriogonadotropinu týdně spolu smeno35 trophinem nebo jinou folikulostimulační látkou. Při léčení opožděné puberty, spojené s hypogonadismem u mužů, se podává dávka 500 až 1500 jednotek 2krát týdně. Dávky by měly být podrobeny zkouškám proti koncentraci testosteronu v krevní plazmě.
K izolaci a čištění hCG z moči byly použity různé postupy, například podle publikací Birken a další, Endocrinology, 133(3), 1390-7, 1993, Sakakibara a další, Chem. Pharm. Bull., 35(5), 1414-6, 1990, Donini a další, Acta Endocrinol., 73(1), 133-45, 1973. V poslední době byl vyvinut odlišný postup, založený na afinitní chromatografii a označovaný jako afinitní chromatografie s membránovou filtrací, tento postup byl použit k čištění hCG z moči podle publikace Xu a další, Protein expresssion and purification, 16, 221-3, 1999. Pri uvedeném postupu se neužívá jako pevné fáze pro afinitní chromatografii Sepharosa, aktivovaná BrCN, takže postup znamená variaci obvyklých způsobů čištění hCG afinitní chromatografii z moči. Imunologická účinnost čištěného vzorku tímto postupem je 8554 IU/mg.
Rekombinantní hCG má tu výhodu, že je prostý jiných hormonů typu gonadotropinu a kontami50 nujících sloučenin lidského původu, zvláště takových, které jsou obvykle přítomny v moči. Surový vzorek rekombinantního hCG však obsahuje všechny další proteiny a kontaminující látky z buněk, použitých k produkci rekombinantního hormonu, a bylo by proto velmi žádoucí mít k dispozici způsob pro získání naprosto čistého hCG.
-1 CZ 303144 B6
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že surový vzorek hCG, odvozený od koncentrovaného vzorku v živném pro5 středí, získaném způsobem výroby rekombinantního hormonu nebo ze surového koncentrátu moči těhotných žen je možno čistit tak, že výsledný hCG je prakticky prostý proteinů a dalších kontaminujících látek, které byly obsaženy v surovém hCG.
Podle vynálezu je čištění založeno na použití chromatografie na iontoměniči a HPLC v reverzní io fázi. Dále je popřípadě ještě možno použít filtraci na materiálu, který odstraní látky s určitou molekulovou hmotností, tak aby došlo k odstranění jakýchkoliv zbytků kontaminujících látek.
Optimálních výsledků je možno dosáhnout v případě, že se použijí alespoň dva stupně chromatografie na iontoměniči.
Způsob podle vynálezu je možno použít pro čištění rekombinantního hCG ze surového materiálu v živném prostředí, v němž byl hormon rekombinantním způsobem získán. Tento r-hCG je možno získat s vysokým stupněm čistoty a s vysokou specifickou biologickou účinností 23 000 až 28 000 lU/mg, prakticky prostý fetálních proteinů séra skotu (FBS), v případě, že tyto látky byly přítomny v živném prostředí a také prakticky prostý nukleovýeh kyselin nebo jiných kontaminu2o jících látek, obsažených v hostitelských buňkách, použitých k produkci rekombinantního hormonu.
Způsob podle vynálezu je možno použít jak při čištění hCG z moči, kde se vychází ze surového koncentrátu moči těhotných žen, tak pro čištění CG zjiných savců, například skotu, koně, vepře, ovce a opice.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno čistit hCG z nečistého vzorku při použití chromatografie na iontoměniči a HPLC v reverzní fázi. Způsob obsahuje stupně, v nichž se vzorek podrobí chromatografii na iontoměniči a získaný eluát se podrobí HPLC v reverzní fázi. Dalším stupněm io může být podrobení eluátu filtraci na sloupci, který oddělí látky s určitou molekulovou hmotností.
Nejprve se s výhodou provádějí 2 chromatografie na iontoměniči za různých podmínek tak, aby bylo možno dosáhnout optimálního čištění. Ve výhodném provedení se způsob podle vynálezu provádí tak, že se:
a) vzorek podrobí chromatografii na sloupci oxidu křemičitého, načež se
b) eluát z předchozího kroku podrobí chromatografii na sloupci DEAE-Sepharózy jako iontoměniči,
c) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na sloupci CM-Sepharózy jako ionto40 měniči,
d) eluát z předchozího kroku se podrobí vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) v reverzní fázi s náplní oxidu křemičitého Silíca Cl8, a
e) eluát z předchozího kroku se podrobí vylučovací chromatografii na Sephacrylu.
V jednom z výhodných provedení způsobu podle vynálezu se k eluci ze sloupce DEAE-Sepharózy užije pufr na bázi hydrogen fosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu sodného o pH přibližně 7,5.
Eluce ze sloupce s náplní CM-Sepharózy se s výhodou provádí při použití pufru na bázi hydro50 gen fosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu sodného o pH přibližně 6.
Stupeň d), to znamená vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) v reverzní fázi se s výhodou provádí při použití směsi 2-propanolu a tris-fosfátového pufru jako mobilní fáze.
-2CZ 303144 B6
Hormonem, čištěným podle vynálezu je s výhodou lidský choriogonadotropin (hCG) a zvláště rekombinantní hCG, získaný ze živného prostředí buněk CHO jako hostitelských buněk pro výrobu rekombinantního hormonu.
Součást podstaty vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek, který jako účinnou složku obsahuje čištěný rekombinantní hCG, připravený svrchu uvedeným způsobem, spolu s příslušnými pomocnými látkami. Jako příklad vhodné pomocné látky je možno uvést sacharózu, která napomáhá stabilizaci lyofilizo váného produktu. Farmakologický prostředek s obsahem rekombinantního hCG je zvláště vhodný pro podkožní podání.
H)
Vynález tedy poskytuje nový způsob pro čištění hCG, zvláště pro čištění rekombinantního hCG ze surového materiálu, získaného ze živného prostředí po uskutečnění výroby rekombinantního hormonu. Rekombinantní hCG se získává s vysokým stupněm čistoty a s vysokou specifickou biologickou účinností, obvykle v rozmezí 23 000 až 28 000 IU/mg, prakticky prostý proteinů is fetálního séra skotu, které jsou přítomny v živném prostředí a prakticky prostý nukleových kyselin a dalších kontaminujících látek, obsažených v hostitelských buňkách, použitých při výrobě rekombinantního hormonu. Vynález je určen pro čištění biologických materiálů, zvláště surových směsí s obsahem hCG ajiných kontaminujících proteinů, tyto materiály jsou výchozími materiály pro způsob podle vynálezu. V příkladech, které budou dále uvedeny, se jako výchozí materiály používají vzorky s obsahem r-hCG, získané ze supematantu živného prostředí z biologických reaktorů. Je také možno použít vzorky koncentrované moči těhotných žen.
Vzorek se získá odebráním supematantu buněčné kultury v biologickém reaktoru v průběhu dvou dnů pěstování. Supematant se s výhodou vyčeří filtrací. V případě potřeby se surový roztok zahustí a podrobí se chromatografii na oxidu křemičitém C4 k odstranění kontaminujících složek, odvozených od buněčné kultury.
Takto částečně čištěný materiál se po ultrafiltraci podrobí chromatografii na iontoměniči, která se s výhodou provádí 2krát a s výhodou za odlišných podmínek a pak vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v reverzní fázi. První stupeň chromatografie na iontoměniči je možno uskutečnit při použití DEAE-Sepharózy, v průběhu tohoto stupně se odstraní větší část proteinů, odlišným od hCG a DNA. Druhý stupeň chromatografie na iontoměniči se obvykle provádí na sloupci s náplní CM-Sepharózy, v tomto sloupci se hCG váže a odstraňují se zbytky DNA a proteinů z hostitelských buněk jako kontaminující látky. Ve výhodném provedení se tento stupeň provádí při teplotě 5 °C a k eluci se použije sodný fosfátový pufr pri pH přibližně 6.
Chromatografie v reverzní fázi na sloupci oxidu křemičitého Silica 08 je účinná pro odstranění stop nukleových kyselin a kontaminujících látek, odvozených od buněčné kultury. K eluci sloupce se s výhodou jako mobilní fáze použije směs 2-propanolu a tris-fosforečnanového pufru.
Roztok materiálu, zadrženého v sloupci se pak s výhodou podrobí ultrafiltraci, při níž dochází k oddělení látek od molekulové hmotnosti 10000, eluát se koncentruje a materiál je možno izolovat úpravou pH na hodnotu 8 hydrogenuhličitanem amonným. Koncentrovaný produkt je pak možno dále zpracovávat chromatografii na materiálu Sephacryl S200 HR k odstranění dalších látek s určitou molekulovou hmotností. V tomto stupni se dosahuje oddělení od určité molekulo45 vé hmotnosti eluci hydrogenuhličitanem amonným o pH 8 k odstranění stále ještě případně přítomných stop materiálů z buněčné kultury, potenciálních shluků a volných podjednotek hCG. Eluát je pak možno podrobit dialýze ultrafiltraci na membránách, které oddělí látky od molekulové hmotnosti 10000, s výhodou při použití sodného fosfátového pufru o pH 7. Po filtraci se takto čištěný hCG s výhodou ukládá ve sterilních lahvích při nízkých teplotách.
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu,
-3 CZ 303144 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Reakční činidla:
amoniak, analyticky čistý hydrogenuhličitan amonný, analyticky čistý hydrogen fosforečnan sodný, analyticky čistý absolutní denaturovaný ethanol kyselina fosforečná, analyticky čistá
2-propanol, analyticky čistý chlorid sodný, analyticky čistý dihydrogenfosforečnan sodný, analyticky čistý hydroxid sodný ve formě pelet, analyticky čistý kyselina trifluoroctová, čistota pro použití při HPLC (TFA) tris-(hydroxymethyl)aminomethan, analyticky čistý
Schématické znázornění způsobu podle vynálezu
Materiál, získaný ze živného prostředí buněčné kultury se čistí a koncentruje v pěti chromatografických stupních. Následující diagram v tabulce 1 shrnuje výhodné provedení způsobu čištění r— hCG, uvádí pryskyřice, použité v chromatografických sloupcích a základní podmínky pro každý stupeň.
Tabulka 1.
| Stupeň I | Živné prostředí z biologického reaktoru chromatografie na oxidu křemičitém C4 (eluát obsahuje r-hCG) uitrafiitrace s oddělením látek s molekulovou hmotností 10000 (retentát obsahuje r-hCG) koncentrovaný surový r-hCG |
| Stupeň II | DEAE Sepharóza FF (nenavázaná frakce obsahuje r-hCG) |
| Stupeň III | CM Sepharóza FF (eluát obsahuje r-hCG) |
| Stupeň IV | RP-HPLC na oxidu křemičitém C18 (eluát obsahuje r-hCG} uitrafiitrace s oddělením látek s molekulovou hmotností 10000 |
| Stupeň V | Sephacryl S-200 HR (eluát obsahuje r-hCG) výsledný roztok Čistého r-hCG |
-4CZ 303144 B6
Jednotlivé stupně uvedeného postupu budou dále podrobněji popsány. Podmínky ve stupni l jsou podmínky, obvykle užívané v případě, že surový materiál je rekombinantního původu.
Stupeň I (zachycení požadovaného materiálu)
Ve stupni I se dosahuje předběžné koncentrace materiálu a podle potřeby se mění použitý pufr. Tento stupeň obvykle začíná při teplotě místnosti při použití oxidu křemičitého C4 jako náplně chromatografického sloupce a pak pokračuje pri teplotě +5 °C. Výhodné teplotní rozmezí je io 5 ± 3 °C. Tento stupeň se opakuje pro každé odebrání materiálu v průběhu produkčního cyklu biologického reaktoru.
i) Vyčeření materiálu
Čerstvě odebrané živné prostředí z biologického reaktoru se obvykle nejprve vyčeří filtrací.
ii) Chromatografie na oxidu křemičitém C4
Po vyčeření se materiál nanese na chromatografický sloupec s náplní oxidu křemičitého C4, pře20 dem uvedeného do rovnovážného stavu ve 25mM fosforečnanu sodném o pH 7. Výhodné rozmezí hodnoty pH je 6,6 až 7,7. Sloupec se promývá fosforečnanem sodným o koncentraci 25mM tak dlouho, až se signál na monitoru UV vrátí na základní hodnotu. Pak se produkt eluuje pri použití
34,2 hmotnostních procent propanolu ve 25mM fosforečnanu sodném.
iii) Zpracování amoniakem
K roztoku se přidá amoniak do konečné koncentrace IM a směs se inkubuje 6 hodin. Pak se roztok zředí dvojnásobným množstvím vody a pH se upraví na hodnotu 7,5 pri použití 85% kyseliny fosforečné. Výhodná hodnota pH je v rozmezí 7,5 ± 0,2.
iv) Koncentrace a dialýza
Membrány pro oddělení látek s molekulovou hmotností od 10000, uložené v 0,05M hydroxidu sodném, se opláchnou čištěnou vodou tak dlouho, až pH klesne na přibližně 8.
Produkt se zahustí a dialyzuje při použití těchto membrán k odstranění materiálu s molekulovou hmotností nižší než 10000 a k odstranění stop 2-propanotu a také k výměně roztoku amoniaku za 40mM fosforečnan sodný o pH 7,5. Výhodná hodnota pH je 7,5 ± 0,2.
Výsledný retentát se z membrán oddělí pri použití 40mM fosforečnanu sodného na výslednou koncentraci proteinu 3 až 15 mg/ml.
Získaný roztok se zfíltruje a výsledný koncentrát se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -15 °C.
Stupeň II
Filtrace a chromatografie na DEAE Sepharóze FF jako iontoměniěi
Tento chromatografický stupeň je průtokový stupeň, pri němž se odstraňuje převážná část proteinů, odlišných od r-hCG a nukleových kyselin. Na rozdíl od filtrace, která se provádí při teplotě místnosti se chromatografuje provádí ve chladném prostředí.
i) Roztátí a spojení koncentrovaných surových materiálů s obsahem r-hCG
-5CZ 303144 B6
Zmrazené koncentráty se nechají roztát a spojí se. Částečně čištěné vzorky r-hCG se získávají spojením různého počtu surových koncentrátů r-hCG, získaných z téhož druhu buněk. Kritéria pro počet surových koncentrátů jsou založena na maximální schopnosti vázat protein v následujícím chromatografickém stupni čištění (4 mg celkového proteinu/mg pryskyřice).
i i) Vyčeření filtrací
Roztok r-hCG se s výhodou nechá projít filtračním zařízením a filtry se promyjí 40mM fosforečnanem sodným o pH 7,5. Zfiltrovaný roztok a promývací kapalina se spojí.
iii) Chromatografie na DEAE Sepharóze FF jako iontoměniči
Sloupec s náplní slabě nabité an iontoměničové pryskyřice, diethylaminoethansepharózy (DEAE) Fast FIow se uvede do rovnovážného stavu ve 40mM fosforečnanu sodném o pH 7,5.
Na vrchol sloupce se nanese roztok r-hCG. Sloupec se pak promývá 40mM fosforečnanem sodným o pH 7,5. Postup chromatografie se sleduje pomocí spektrofotometru při vlnové délce 280 nm.
Počáteční eluát se odloží až do doby, kdy se počíná vymývat vrchol. Pak se shromáždí nenavázané frakce, které obsahují r-hCG.
Stupeň IH
Chromatografie na CM Sepharóze FF
V tomto chromatografickém stupni se odstraní převážná část kontaminujících látek z hostitelských buněk. Chromatografícký stupeň se provádí při teplotě +5 °C. Výhodná teplota je 5 ± 3 °C.
i) Zředění eluátu z DEAE Sepharózy FF
K eluátu se přidá voda pro injekční podání a hodnota pH se upraví na 6 při použití kyseliny fosforečné s koncentrací 85 %. Výhodná hodnota pH je 6 ± 0,1.
ii) Chromatografie na CM Sepharóze FF
Sloupec, který je naplněn kationtoměničovou pryskyřicí se slabým nábojem, karboxy methy 1sepharózou (CM) Fast Flow se uvede do rovnovážného stavu 20mM sodném fosfátovém pufru o pH 6. Výhodná hodnota pH je 6 ± 0,1.
Na vrchol sloupce se nanese roztok r-hCG.
Sloupec se promyje 20mM fosforečnanem sodným o pH 6. Chromatografícký postup se sleduje pomocí spektrofotometru při 280 nm.
K eluci produktu se užije 130mM sodný fosfátový pufr o pH 6. Počáteční eluát se odloží až do počátku eluce vrcholu.
Shromáždí se frakce, odpovídající celému vrcholu s obsahem r-hCG, Výsledný produkt je popří50 pádě možno v tomto stupni zfiltrovat k odstranění kontaminace viry.
Stupeň IV
Reverzní fáze vysokoúčinné kapalinové chromatografie (RP-HPLC) na oxidu křemičitém C18
-6CZ 303144 B6
Tento chromatograftcký stupen RP-HPLC slouží k účinnému odstranění stopových množství kontaminujících látek z buněčné kultury, k odstranění zbytků nukleových kyselin a endotoxinů. Tento stupeň je následován ultrafiltrací s oddělením látek od molekulové hmotnosti 10000 a popřípadě f ltrac í.
i) Příprava podílů pro zpracování
Podíly se upraví na pH 5 a přidá se 2-propanol do konečné koncentrace 15 % objemových.
i o ii) RP-HPLC chromatografie na oxidu křemičitém C18
Sloupec s náplní oxidu křemičitého 08 se nejprve uvede do rovnovážného stavu v tris-fosforečnanovém pufru s koncentrací 0,5M s obsahem 15 % objemových 2-propanolu.
První podíl se nanese na sloupec a chromatografie se sleduje UV spektrofotometrem.
Sloupec se promyje ekvilibračním pufřem.
Eluce r-hCG se provádí při použití lineárního gradientu 2-propanolu a 0,5M tris-fosforečnaného pufru jako mobilní fáze od 15 do 25 % objemových.
Výsledný r-hCG se odebírá v okamžiku, kdy se prokáže přítomnost odpovídajícího vrcholu pomocí spektrofotometru (A280). Frakce, jejichž absorbance je vyšší než 65 % maximální výšky vrcholu v jeho stoupající části a vyšší než 20 % maximální výšky vrcholu v jeho klesající části se spojí.
Čtyři spojené šarže s obsahem r—hCG se pak spojí a zředí na ekvivalentní objem vodou pro injekční podání WFI.
3o Produkt se zahustí a dialyzuje proti WFI ultrafiltrací s použitím membrány pro oddělení látek s molekulovou hmotností vyšší než 10000 k odstranění zbývajících nečistot a 2-propanolu.
Pak se produkt dialyzuje ultrafiltrací proti 0,lM pufru s hydrogenuhličitanem amonným o pH 8.
Výsledný meziprodukt se uloží při teplotě +5 °C nebo se v případě potřeby zmrazí. Výhodná teplota pro uložení je 5 ± 3 °C a v případě zmrazení -15 °C nebo nižší.
Stupeň V
Chromatografie na prostředku Sephacryl S-200 HR
Tento chromatografický stupeň s vyloučením látek od určité molekulové hmotnosti je účinný pro odstranění stopových množství materiálů z buněčné kultury, potenciálních shluků a/nebo volných podjednotek. Tento stupeň je následován ultrafiltrací, při níž dochází k oddělení látek s moleku45 lovou hmotností vyšší než 10 000. Oba stupně se provádějí při teplotě přibližně +5 °C, výhodná teplota je 5 ± 3 °C.
i) Chromatografie na prostředku Sephacryl S-200 HR so Sloupec s náplní pryskyřice Sephacryl S-200 HR se uvede do rovnovážného stavu v 0,5M hydrogenuhličitanu amonném o pH 8. Výhodná hodnota pH je 8 ± 0,2.
Roztok r-hCG se nanese na sloupec a eluce se zahájí při použití 0,5M hydrogenuhličitanu amonného o pH 8. Výhodná hodnota pH je 8 ± 0,2.
-7CZ 303144 B6
Frakce r-hCG se začnou shromažďovat od začátku průchodu vrcholu, frakce se odebírají tak dlouho, až se dosáhne 50 % maximální výšky vrcholu na jeho klesající části.
ti) Ultrafiltrace k odstranění látek s molekulovou hmotností vyšší než 10 000
Membrány pro odstranění látek s molekulovou hmotností látek vyšší než 10 000, uložené v 0,05 M hydroxidu sodném se opláchnou vodou pro injekční podání WFI až do poklesu pH na hodnotu přibližně 8.
io Produkt se zahustí a pak se dialyzuje ultrafíltrací proti WFI.
Pak se produkt dialyzuje ultrafíltrací proti O,1M pufru s fosforečnanem sodným o pH 7 a konečná koncentrace proteinu se upraví na požadovanou konečnou koncentraci 3,5 mg/ml,
Výsledný roztok čištěného r-hCG se s výhodou uloží ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -15 °C.
Chromatografické pryskyřice
Při způsobu čištění je možno použít následující chromatografické pryskyřice a také jejich ekvivalenty.
Stupeň I: Silica C4, 250 angstróm-50 gm (Matrex®, Milípore)
Stupeň II: DEAE Sepharose FF (Pharmacia)
Stupeň 111: CM Sepharose FF (Pharmacia)
Stupeň IV: Silica Cl8, 300 angstróm-15-20 gm (Vydac)
Stupeň V: Sephacryl S-200 HR (Pharmacia)
V současné době jsou hlavními výrobci těchto materiálů následující firmy:
Amersham Pharmacia Biotech, Millipore Corporation Bjorkgatan 30 17 Cherry Hill Drive
S-751 84, Uppsala Danvers, MA 01923
Sweden USA
Vydac, The Separations Group,
17434 Mojave St.
Hesperia, CA 92345 USA
Výsledky • Molekulová hmotnost a velikost molekul SDS-PAGE
Relativní molekulová hmotnost r-hCG, získaného způsobem podle vynálezu byla stanovena pomocí SDS-PAGE ve srovnání se standardními proteiny se známou molekulovou hmotností.
Barvení briliantovou modří Coomassie po neredukujícím průběhu SDS-PAGE poskytuje jediný široký pás pro heterodimer r-hCG přibližně při molekulové hmotnosti 70 000 (rozmezí 65000 až
75000). Totožnost pásu byla potvrzena metodou Western blot.
-8CZ 303144 B6 • Biologická účinnost
Biologická účinnost různých šarží r-hCG po čištění způsobem podle vynálezu je shrnuta v následující tabulce 2. Koncentrace proteinu byla stanovena spektrofotometricky při 276,5 nm, a=0,616.
Průměrná specifická účinnost takto připraveného r-hCG je zvláště vysoká a dosahuje až 25 000 IU/mg.
Tabulka 2.
| Šarže r-hCG | Specifická biologická účinnost |
| (IU/mg) | |
| BCEA 9901 | 244427 |
| BCEA 9902 | 26868 |
| BCEA 9903 | 25636 |
| BCEA 9904 | 27152 |
| BCEA 9905 | 23729 |
· Prostředky s obsahem hormonu
Byly připraveny kapalné i lyofilizované prostředky s obsahem vysoce čištěného rekombinantního hCG podle vynálezu.
Kapalné prostředky
Dva kapalné prostředky s účinností 10000 IU/ml byly připraveny v lékovkách DIN 2R při použití mannitolu nebo sacharózy jako pomocné látky, vzorky byly podrobeny testu na stálost při teplotě 50,40, 25 a 4 °C.
Složení jednotlivých prostředkuje uvedeno v následujících tabulkách 3 a 4.
Tabulka 3.
| Složka | Jednotka | Množství |
| r-hCG | IU/ml | 10000 |
| Sacharóza | mg/ml | 102,6 |
| Kyselina o-fosforečná | mg/ml | 0,98 |
| Hydroxid sodný | do pH 7,0 |
Objem plnění: 0,5 ml
-9CZ 303144 B6
Tabulka 4.
| Složka | Jednotka | Množství |
| r-hCG | IU/ml | 10000 |
| Mannitol | mg/ml | 54z 6 |
| Kyselina o-fosforečná | mg/ml | 0,98 |
| Hydroxid sodný | do pH 7,0 |
Objem plnění: 0,5 ml
Výsledky na stálost, prováděné se zkušebním balíčkem Bioassay nebo pomocí SE/HPLC a RPHPLC prokázaly, že prostředek s obsahem mannitolu byl stálejší, než prostředek obsahující sacharózu. Aby nedošlo ke tvorbě podjednotek a oxidace proteinu byla snížena na minimum, bylo nutno prostředky skladovat v chladničce.
Lyofilizovaný prostředek
Lyofilizovaný prostředek s účinností 5000 IU byl připraven v lékovkách DIN 2R a použit při testu na stálost při teplotě 50,40,25 a 4 °C při použití sacharózy jako pomocného prostředku. Výsledky uvedených zkoušek jsou shrnuty v následující tabulce 5.
Tabulka 5.
| Složka | Jednotka | Množství |
| r-hCG | IU | 5000 |
| Sacharóza | mg | 30 |
| Kyselina o-fosforečná | mg | 0,98 |
| Hydroxid sodný | do pH 7,0 |
Výsledky zkoušek na stálost, provedených při použití zkušebního balíčku Bioassay nebo pomocí SE/HPLC a RP-HPLC prokázaly, že lyofilizovaný prostředek je stálý při teplotě 40 a 50 °C po dobu alespoň 19 týdnů.
Zkoušky na stálost při teplotě 25 a 4 °C byly prováděny 6 měsíců, v průběhu této doby nebylo možno pozorovat žádnou degradaci účinné látky.
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY5 1. Způsob výroby rekombinantního hCG-lidského choriogonadotropinu se specifickou biologickou účinností v rozmezí 23 000 až28 000 ÍU/mg ze vzorku, vyznačující se tím, že se provádí v následujících stupních:a) vzorek se podrobí chromatografii na sloupci s náplní oxidu křemičitého,b) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na sloupci iontoměnice, kj c) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na druhém sloupci iontoměnice,d) eluát z předchozího kroku se podrobí vysokoúěinné kapalinové chromatografii v reverzní fázi ae) eluát z předchozího kroku se podrobí vylučovací chromatografii na Sephacrylu.15 2. Způsob výroby rekombinantního hCG podle nároku 1 ze vzorku, vyznačující se tím, že se provádí v následujících stupních:a) vzorek se podrobí chromatografii na sloupci s náplní oxidu křemičitého,b) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na sloupci iontoměnice DEAE-Sepharózy,
- 2o c) eluát z předchozího kroku se podrobí chromatografii na sloupci iontoměnice CM-Sepharózy,d) eluát z předchozího kroku se podrobí vysokoúěinné kapalinové chromatografii s náplní Silica C 18 v reverzní fázi ae) eluát z předchozího kroku se podrobí vylučovací chromatografii na Sephacrylu.25
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se eluce sloupce s náplní DEAESepharózy jako iontoměniče provádí pri použití sodného fosfátového pufru o pH 7,5.
- 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se eluce sloupce s náplní CM-Sepharózy jako iontoměniče provádí při použití sodného fosfátového pufru o pH 6.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků l až 4, vyznačující se tím, že se stupen d) provádí pri použití směsi 2-propanolu a tris-fosforečnanového pufru jako mobilní fáze.
- 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že se stupeň e)35 provádí při použití pufru s hydrogenuhličitanem amonným jako mobilní fází.
- 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažó, vyznačující se tím, že čištěným vzorkem je živné prostředí buněk CHO.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00103690 | 2000-02-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022855A3 CZ20022855A3 (cs) | 2002-11-13 |
| CZ303144B6 true CZ303144B6 (cs) | 2012-05-02 |
Family
ID=8167925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022855A CZ303144B6 (cs) | 2000-02-22 | 2001-01-22 | Zpusob výroby rekombinantního lidského choriogonadotropinu |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7297777B2 (cs) |
| EP (2) | EP1257564B1 (cs) |
| JP (1) | JP4588960B2 (cs) |
| KR (1) | KR100806911B1 (cs) |
| CN (1) | CN100482679C (cs) |
| AT (1) | ATE406378T1 (cs) |
| AU (2) | AU783320B2 (cs) |
| BG (1) | BG65807B1 (cs) |
| BR (1) | BRPI0108556B8 (cs) |
| CA (1) | CA2399020A1 (cs) |
| CY (1) | CY1108460T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ303144B6 (cs) |
| DE (1) | DE60135541D1 (cs) |
| DK (1) | DK1257564T3 (cs) |
| EA (1) | EA006605B1 (cs) |
| EE (1) | EE05644B1 (cs) |
| ES (1) | ES2307585T3 (cs) |
| HR (1) | HRP20020650B1 (cs) |
| HU (2) | HU228935B1 (cs) |
| IL (2) | IL151308A0 (cs) |
| ME (1) | ME00296B (cs) |
| MX (1) | MXPA02007871A (cs) |
| NO (1) | NO328694B1 (cs) |
| PL (1) | PL205149B1 (cs) |
| PT (1) | PT1257564E (cs) |
| RS (1) | RS50741B (cs) |
| SI (1) | SI1257564T1 (cs) |
| SK (1) | SK287146B6 (cs) |
| UA (2) | UA78488C2 (cs) |
| WO (1) | WO2001062773A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200206109B (cs) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4588960B2 (ja) * | 2000-02-22 | 2010-12-01 | メルク セローノ ソシエテ アノニム | ｈＣＧの精製方法及び本法により精製した組換えｈＣＧ |
| CA2582083A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Novetide, Ltd. | A counterion exchange process for peptides |
| CN1958603B (zh) * | 2005-11-04 | 2010-05-05 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法 |
| EA200802426A1 (ru) * | 2006-07-11 | 2009-04-28 | Коваль, Антон Александрович | Применение хорионического или лютеинизирующего гормона для профилактики или лечения возрастного гипогонадизма |
| CN101397339B (zh) * | 2008-09-24 | 2012-07-25 | 上海天伟生物制药有限公司 | 糖蛋白中去除/灭活病毒的方法 |
| TWI532495B (zh) * | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
| CN101792481B (zh) * | 2010-03-12 | 2012-05-30 | 丽珠医药集团股份有限公司 | 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法 |
| WO2012120535A2 (en) * | 2011-02-03 | 2012-09-13 | Sanzyme Limited | A composition comprising highly purified chorionic gonadotropin, it's formulation and uses of the same |
| WO2012131306A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Ferring B.V. | Pharmaceutical preparation |
| WO2013102921A2 (en) * | 2011-11-17 | 2013-07-11 | Sanzyme Limited | Hcg - newer treatment modality for type 2 diabetes mellitus (t2dm) |
| CN103288950A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-09-11 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法 |
| CN104101656A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-10-15 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种促性腺激素的纯度测定方法 |
| US20150065426A1 (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-05 | Professional Compounding Centers Of America | Testosterone Booster Transdermal Compositions |
| CN105968185A (zh) * | 2016-07-20 | 2016-09-28 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种绒促性素纯化方法 |
| CN111233999B (zh) * | 2020-03-21 | 2024-02-23 | 上海浦东明炎生物技术有限公司 | 一种从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法 |
| CN113398251B (zh) * | 2021-07-30 | 2022-08-05 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法 |
| CN116063452A (zh) * | 2023-01-03 | 2023-05-05 | 杭州浦泰生物科技有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺激素高效纯化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993011788A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Gonadotropin containing pharmaceutical compositions with sucrose stabilizer |
| EP1257564A1 (en) * | 2000-02-22 | 2002-11-20 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Process of purification of hcg and recombinant hcg purified by that method |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE148171T1 (de) * | 1989-02-21 | 1997-02-15 | Univ Washington | Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen |
| IT1254370B (it) * | 1992-05-22 | 1995-09-14 | Sorin Biomedica Spa | Procedimento per la purificazione di proteine da sistemi cellulari. |
| CN1082368C (zh) * | 1995-03-21 | 2002-04-10 | 应用研究系统Ars股份公司 | 人绒毛膜促性腺激素液体制剂 |
| ES2166841T3 (es) | 1995-03-21 | 2002-05-01 | Applied Research Systems | Formulaciones liquidas de hcg. |
| BR9707589A (pt) * | 1996-02-20 | 2000-01-04 | Applied Research Systems | Proteìna hìbrida, molécula de dna, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica e processos para produzir proteìna hìbrida e para induzir maturação folicular. |
| IT1287138B1 (it) * | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
| WO1998056806A1 (en) | 1997-06-12 | 1998-12-17 | The Regents Of The University Of California | A TRANSCRIPTION FACTOR COACTIVATOR PROTEIN, p/CIP |
| US6121428A (en) * | 1997-06-13 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Protein recovery |
| US6583109B1 (en) * | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
-
2001
- 2001-01-22 JP JP2001562554A patent/JP4588960B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 ES ES01901188T patent/ES2307585T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 HU HU0204231A patent/HU228935B1/hu unknown
- 2001-01-22 CA CA002399020A patent/CA2399020A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-22 MX MXPA02007871A patent/MXPA02007871A/es active IP Right Grant
- 2001-01-22 CZ CZ20022855A patent/CZ303144B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 CN CNB018053637A patent/CN100482679C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 IL IL15130801A patent/IL151308A0/xx unknown
- 2001-01-22 PT PT01901188T patent/PT1257564E/pt unknown
- 2001-01-22 EE EEP200200469A patent/EE05644B1/xx unknown
- 2001-01-22 EP EP01901188A patent/EP1257564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 UA UA2002086890A patent/UA78488C2/uk unknown
- 2001-01-22 AT AT01901188T patent/ATE406378T1/de active
- 2001-01-22 DE DE60135541T patent/DE60135541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 RS YUP-602/02A patent/RS50741B/sr unknown
- 2001-01-22 EP EP06024050A patent/EP1752466A3/en not_active Withdrawn
- 2001-01-22 WO PCT/EP2001/000665 patent/WO2001062773A1/en not_active Ceased
- 2001-01-22 ME MEP-2008-389A patent/ME00296B/me unknown
- 2001-01-22 US US10/204,630 patent/US7297777B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 KR KR1020027010625A patent/KR100806911B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 PL PL357508A patent/PL205149B1/pl unknown
- 2001-01-22 SI SI200130858T patent/SI1257564T1/sl unknown
- 2001-01-22 AU AU26804/01A patent/AU783320B2/en not_active Expired
- 2001-01-22 HR HR20020650A patent/HRP20020650B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 BR BRPI0108556A patent/BRPI0108556B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 HU HUP1300063 patent/HU1300063D0/hu unknown
- 2001-01-22 DK DK01901188T patent/DK1257564T3/da active
- 2001-01-22 UA UAA200511832A patent/UA86938C2/uk unknown
- 2001-01-22 SK SK1206-2002A patent/SK287146B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 EA EA200200892A patent/EA006605B1/ru not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-07-31 ZA ZA200206109A patent/ZA200206109B/en unknown
- 2002-08-14 BG BG107000A patent/BG65807B1/bg unknown
- 2002-08-18 IL IL151308A patent/IL151308A/en active IP Right Grant
- 2002-08-21 NO NO20023985A patent/NO328694B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-06 AU AU2006200059A patent/AU2006200059A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-08-28 US US11/846,118 patent/US20070299001A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-10-27 CY CY20081101218T patent/CY1108460T1/el unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993011788A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Gonadotropin containing pharmaceutical compositions with sucrose stabilizer |
| EP1257564A1 (en) * | 2000-02-22 | 2002-11-20 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Process of purification of hcg and recombinant hcg purified by that method |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chlenov a kol. (1993) J. Chromatogr. A 631, 261-267 * |
| Huth a kol. (1994) Endocrinology 135, 911-918 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070299001A1 (en) | PURIFIED hCG | |
| RS60202B1 (sr) | Jedinjenja cikličnog etra pirazol-4-il-heterociklil-karboksamida i postupci primene | |
| AU780377B2 (en) | Purified LH | |
| HK1052016B (en) | Process of purification of hcg |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210122 |