RS60202B1 - Jedinjenja cikličnog etra pirazol-4-il-heterociklil-karboksamida i postupci primene - Google Patents

Description

PROCES PREČIŠĆAVANJA HCG I REKOMBINANTNOG HCG PREČIŠĆENOG

TOM METODOM

POLJE IZUMA

Ovaj pronalazak odnosi se na proces prečišćavanja horionskog gonadotropina. Pre svega na proces prečišćavanja rekombinantnog humanog horionskog gonadotropina (hCG) iz uzorka sirovog rekombinantnog hCG. Ova metoda obuhvata upotrebu hromatografije jonske izmene i HPLC reverzne faze.

Horionski gonadotropin je hormon koji se proizvodi od strane placente i tradicionalno se dobija iz urina trudnih žena.

Ovaj hormon je jedan heterodimer i sastoji se od ne-kovalentno vezanih a i p

podjedinica. Njegova dejstva su predominantno dejstva gonadotropinskog luteinizirajuzćeg hormona.

Horionski gonadotropin se daje ženama da se izazove ovulacija postoje razvoj folikula stimulisan hormonom za stimulaciju folikula (FSH) ili humanim menopauzalnim gonadotropinima za lečenje anovulatorne neplodnosti zbog niskih koncentracija gonadotropina ili njegovog potpunog odsustva. Pojedinačna doza od 5000 do 10000 jedinica daje se intramuskularnom injekcijom da se podražava rast luteinizirajućeg hormona sredinom ciklusa što normalno stimuliše ovulaciju. Horionski gonadotropin se daje i u vezi sa menotropinom i ponekad klomifen citratom kao dodatak kod in vitro procesa fertilizacije i drugih tehnika asistiranog začeća koje uključuju superovulaciju i ubiranje oocita. Kod muškaraca se koristi za lečenje prepubertalnog kriptorhidizma. Režimi davanja se znatno razlikuju, ali se doze uglavnom kreću u rasponu od 500 do 4000 jedinica tri puta nedeljno intramuskularnom injekcijom.

Daje se i za lečenje muške neplodnosti praćene hipogonadotrofičnim hipogonadizmom. I opet, postoje znatne varijacije u režimu doziranja, a doze se kreću u rasponu od 500 do 4000 jedinica dva do tri puta nedeljno. Agens sa aktivnošću stimulacije folikula kao što je menotropin često se dodaje da omogući normalnu spermatogenezu. Za oligospermiju, mogu da se koriste doze od maksimalno 3000 jedinica horionskog gonadotropina nedeljno sa menotropinom ili drugim preparatom za stimulaciju folikula. Za lečenje zakasnelog puberteta praćenog hipogonadizmom kod muškaraca, doze od 500 do 1500 jedinica daju se dva puta nedeljno. Ova doza treba da bude titrirana prema koncentraciji

testosterona u plazmi.

Različite metode su korišćene da se izoluje i prečisti hCG iz sirovih uzoraka urina (Birken i sar. Endocrinologv, 133(3): 1390-7, 1993; Sakakibara i sar. Chem. Pharm. Buli. 35(5): 1414-6, 1990;Donini i sar. Acta Endocrinol. 73(1): 133-34, 1973). Nedavno su razvijene različite metode afinitetne hromatografije, terminske afinitetne hromatografije s membranskom filtracijom, i primenjene su da se prečisti hCG iz urina (Xu i sar. Ekspresija i prečišćavanje proteina, 16: 221-3, 1999). Ova metoda izbegava korišćenje Sefaroze aktivirane BrCN kao solidne faze za kolonu afinitetne hromatografije, i predstavlja varijaciju uobičajene metode za prečišćavanje hCG afinitentnom hromatografijom iz uzorka urina. Imunoaktivnost prečišćenog hCGu skladu sa ovom metodom iznosi 8554 IJ/mg.

Rekombinantni hCG ima tu prednost da nema druge gonadotropinske hormone i kontaminante humanog porekla i specifičnije one koji su prisutni u humanom urinu. Sirovi preparat rekombinantnog hCH sadrži, međutim, sve druge proteine i kontaminante ćelija koje se koriste u rekombinatnoj proizvodnji, pa je veoma poželjna metoda za postizanje apsolutne čistoće rekombinantnog horionskog gonadotropina.

KRATKI OPIS PRONALASKA

Mi smo sada utvrdili da sirovi preparat hCH, koji se dobija iz koncentrovanog uzorka kulture u medijumu dobijene po procesu rekombinacije ili iz sirovog koncentrata urina trudnih žena može da se prečisti tako da rezultantni hCG bude praktično potpuno bez proteina ili drugih zagađivača koji se nalaze u sirovom hCG preparatu.

Proces purifikacije se zasniva na upotrebi hromatograifje jonske razmene i HPLC reverzne faze. Moguća dalja upotreba kolone za isključivanje po veličini omogućuje uklanjanje svih rezidualnih tragova zagađivača. Optimalni rezultati se postižu kada se obave bar dva koraka hromatografije jonskom razmenom.

Proces opisan u ovom pronalasku može da se koristi za prečišćavanje rekombinantnog hCG iz sirovog preparata medijuma kulture dobijenog rekombinantnim procesom. Rekombinanti (r) hCG dobija se s visokim stepenom čistoće i visokom specifičnom bioaktivnošću (u rasponu od 23.000 - 28.000 U/mg), praktično bez belančevina FBS (fetalnog goveđeg seruma), ako ih ima u medijumu kulture, i nukleinskih kiselina ili drugih zagađivača koji se nalaze u ćeliji domaćinu koja se koristi u procesu rekombinacije.

Proces ovog pronalaska može da se koristi i za prečišćavanje urinarnog hCG, od sirovog koncentrata urina trudnih žena, i za purifikaciju CG drugih vrsta sisara uključujući na primer goveda, konje, svinje, ovce i majmuna.

Predmet ovog pronalaska je da se obezbedi proces za prečišćavanje hCG iz uzorka koji obuhvata upotrebu hromatografije jonske razmene i HPLC reverzne faze. Ovaj proces obuhvata faze podvrgavanja uzorka hromatografiji jonske razmene, a onda podvrgavanje eluata HPLC reverzne faze. Dodatni korak je da se eluat podvrgne koloni za isključivanje po veličini takođe može da se uvede i sprovede.

Dve faze hromatografije jonske razmene po mogućstvu se obavljaju pod različitim uslovima, da bi se dobili optimalni rezultati iz procesa prečišćavanja. Preporučeni oblik procesa pronalaska obuhvata sledeće korake:

(a) eluciju uzorka kroz silicijumsku kolonu za hromatografiju,

(b) eluciju kroz hromatografsku kolonu za jonsku razmenu od DEAE Sepharose,

(c) eluciju kroz hromatografsku kolonu za jonsku razmenu od CM Sepharose,

(d) eluciju kroz kolonu HPLC za reverznu fazu Silica Cl 8, i

(e) eluciju kroz kolonu za hromatografiju za isključivanje po veličini Sephacril.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, elucija kroz hromatografsku kolonu za jonsku razmenu od DEAE Sepharose obavlja se u natrijum fosfatnom puferu na oko pH 7,5. Elucija kroz hromatografsku kolonu za jonsku razmenu od CM Sepharose se, po mogućstvu, obavlja u natrijum fosfatnom puferu na oko pH 6.

Korak (d), elucija kroz kolonu HPLC za reverznu fazu po mogućstvu se obavlja sa 2-propanol/Tris-fosfatnim puferom kao mobilnom fazom.

CG iz ovog pronalaska je po mogućstvu humani CG, a najbolje rekombinantni hCG dobijen iz medijuma kulture CHO ćelija koje se koriste u procesu rekombinacije.

Dalje, cilj ovog pronalaska je da se obezbedi farmaceutski sastav koji obuhvata terapijski efikasnu količinu rekombinantog hCG kako se priprema procesom rekombinacije opisanim gore, zajedno s odgovarajućim ekscipijentima. Saharoza je jedan primer odgovarajućeg ekscipijenta, što pomaže stabilizaciji liofilizovanog proizvoda.

Farmaceutski sastav rekombinantnog hCG je posebno pogodan za supkutanu primenu.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za prečišavanje hCG, pre svega za purifikaciju rekombinantnog hCG iz sirovog preparata medijuma kulture rekombinantnog procesa.

Ovaj r-hCH šedobija s velikim stepenom čistoće i visokom specifičnom bioaktivnošću (u rasponu od 23.000 - 28.000 IJ/mg), praktično bez sadržaja proteina fetalnog goveđeg seruma (FBS), nukleinskih kiselina ili drugih zagađivača koji su sadržani u onim ćelijama domaćina koje se koriste u procesu rekombinacije.

Ovaj pronalazak je namenjen za korišćenje sa biološkim materijalima, posebno sirovim mešavinama sa sadržajem hCG i drugim kontaminirajućim belančevinama koje se ovde nazivaju uzorcima početnog materijala. Primeri koji su detaljno dole opisani koriste kao uzorke početnog materijala posebno sirove mešavine sa sadržajem r-hCG dobijenog iz supernatanta medijuma kulture iz bioreaktora. Alternativno se može koristiti sirovi koncentrat urina trudnih žena.

Ovaj uzorak se sastoji od sveže prikupljenih ćelija supernatanta kulture medijuma koji se perfunduju kroz bioreaktor tokom dva dana.

Supernatant se, po mogućstvu, klarifikuje filtracijom. Ako je neophodno, sirovi rastvor se koncentruje i podvrgava hromatografiji C4 silika da se uklone zagađivači koji se dobijaju iz kulture ćelija.

Polu-pročišćene ubrane ćelije, po ultrafiltraciji, se tada podvrgavaju hromatografiji jonske razmene, koja se po mogućstvu obavlja dva puta, i po mogućstvu u različitim uslovima, i HPLC reverzne faze. Prvi korak jonske razmene DEAE Sepharose može da se obavi, uglavnom delujući kao korak «protoka» hCG gde veliki deo ne-hCG proteina i DNK bude eliminisan. Drugi korak jonske razmene, po mogućstvu kroz kolonu CM-Sepharose, deluje kao korak za vezivanje hCG i uklanja rezidualni DNK i ćeliju

domaćina ili proteinske zagađivače medijuma. U preporučenom obliku ovaj korak se obavlja na oko 5°C gde se obavlja elucija natrijum fosfatnim puferom na oko pH 6.

Hromatografija reverzne faze na koloni Silica Cl 8 efikasno uklanja nukleinske kiseline koje su u tragovima i zagađivače izvedene ćelijske kulture. Ova kolona se eluira po mogućstvu sa 2-propanol/Tris-fosfatnim puferom kao mobilnom fazom. Zaostali rastvor se onda po mogućstvu podvrgava ultrafiltraciji sa presekom na 10 kD, koncentraciji i može da se oporavi amonijum hidrogen karbonatom pH 8. Ovaj koncentrovani proizvod onda može da se nanese na hromatografsku kolonu za isključivanje po veličini na Sephacrvl S200HR. U ovom koraku, separacija zasnovana na molekulskoj veličini postiže se elucijom s amonijum hidrogen karbonatom pH 8 da se uklone zaostali elementi zagađivača u tragovima izvedenih iz ćelijske kulture, potencijalni agregati i slobodne podjedinice hCG. Ovaj eluat onda može da se podvrgava dijalizi ultrafiltracijom na membranama sa presekom na 10 kD, po mogućstvu u natrijum fosfatnom puferu, pH 7. Posle filtracije, prečišćena količina hCG se čuva u sterilnim bočicama na niskoj temperaturi.

PRIMER 1

Reagensi

Amonijak, analitička čistoća

Amonijum hidrogen karbonat, analitička čistoća (B.P.)

Di-natrijum hidrogen fosfat, analitička čistoća

Apsolutno denaturisani etanol

Fosforna kiselina, analitička čistoća (Ph. Eur.)

2-propanol, analitička čistoća (Ph. Helv.)

Natrijum hlorid, analitička čistoća (Ph. Eur.)

Natrijum di-hidrogen fosfat, analitička čistoća

Pelete natrijum hidroksida, analitička čistoća (Ph. Eun)

Trifluorosirćetna kiselina (TFA), FIPLC čistoća

Tris-(hidroksimetil) aminometan, analitička čistoća

Rezime procesa prečišćavanja, dijagram protoka

Obrani materijal dobijen iz procesa ćelijske kulture se prečišćava i koncentruje serijom od pet hromatografskih koraka.

Sledeći dijagram (Tabela 1) rezimira preporučeni oblik r-hCG procesa prečišćavanja, gde se iznose smole hromatografske kolone i principi rada za svaki od međukoraka.

Dole je dat dijagram protoka i opis procesa. Uslovi za korak ubiranja (prvi korak) su oni koji se normalno primenjuju kada je sirovi materijal rekombinantnog porekla.

Prvi korak (korak ubiranja)

U ovom koraku (Prvi korak), preliminarna koncentracija se postiže, a pufer se menja da bude kontrolisanog sastava. Ovaj korak se započinje na sobnoj temperaturi (Silica C4 hromatografija) a onda se nastavlja na oko +5°C. Preporučeni raspon temperatura je 5 ± 3. Ponavlja se individualno za svako ubiranje tokom ciklusa produkcije bioreaktora. (i) Klarifikacija ubranog materijala Sveže ubrani medijum kulture iz bioreaktora se obično prvo klarifikuje filtracijom.

(ii) Hromatografija C4

Po klarifikaciji, ubrani materijal se puni u hromatografsku kolonu C4 silica, koja je prethodno uravnotežena natrijum fosfatom 25 mM, pH 7. Preporučeni raspon pH je 6,6 do 7,7. Ova kolona se pere natrijum fosfatom 25 mM sve dok se signal UV monitora ne spusti na bazalnu liniju."Proizvod se onda eluira sa 34,2 % (tež./tež.) 2-propanol u natrijum fosfatu 25 mM.

(iii) Tretman amonijakom

Zatim se dodaje amonijak u rastvor da se dođe do finalne koncentracije od 1 M. Ova mešavina se inkubira 6 sati. Onda se rastvor dvostruko razblažuje vodom, a pH se podešava na 7,5 korišćenjem fosforne kiseline 85%. Preporučeni raspon pH je 7,5 ±0,2.

(iv) Koncentracija i dijaliza

Membrane za razdvajanje na 10 kD koje se čuvaju u 0,05 M natrijum hidroksidu između serija ispiraju se prečišćenom vodom sve dok pH ne siđe na oko 8.

Ovaj proizvod se onda koncentruje i dijalizira (ultrafiltracjom 10 kD membrana) da se ukloni materijal molekulske težine manje od 10 kD i da se eliminišu tragovi 2-propanola i da se rastvor amonijaka promeni za natrijum fosfat 40 mM pH 7,5. Preporučeni raspon pH je 7,5 ± 0,2.

Finalno zadržani materijal se dobija sa membrane natrijum fosfatom 40 mM da bi se postigla ciljna koncentracija od 3 do 15 mg/ml.

Ovaj rastvor se onda filtrira i dobijena koncentracija se čuva zamrznuta na -15°C.

Drugi korak (filtracija i jonska izmena na DEAE Sepharose FF hromatografiji) Ovaj hromatografski korak predstavlja korak «protoka» r-hCG gde se eliminiše veliki deo belančevina koje ne pripadaju r-hCG i nukleinskih kiselina. Dok se obavlja filtracija na sobnoj temperaturi, hromatografski stadijum gde proizvod prolazi kroz kolonu obavlja se u hladnoj prostoriji.

(i) Topljenje i mešanje koncentrovanih sirovih ubranih r-hCG

Zamrznuti koncentrati se otope i pomeŠaju. Serija prečišćenog r-hCG se obrađuje iz mešavine promenljivog broja sirovih koncentrata r-hCG se proizvode iz iste radne banke ćelija. Kriterijumi za broj pomešanih sirovih koncentrata r-hCG zasniva se na maksimalnom kapacitetu za vezivanje proteina sledećeg hromatografskog koraka u procesu prečišćavanja (4 mg ukupne težine proteina/mg smole). (ii) Klarifikacija filtracijom Rastvor r-hCG se po mogućstvu propušta kroz filterski aparat, a filteri se ispiraju 40 mM natrijum fosfata pH 7,5.

Filterski rastvor i ispirci se pomešaju.

(iii) Hromatografija jonske izmene na DEAE Sepharose FF

Ova kolona, ispunjena slabo naelektrisanom smolom za anjonsku izmenu, dietil amino etan (DEAE) Sepharose Fast Flow, uravnoteži se sa 40 mM natrijum fosfatom (pH7,5).

Rastvor r-hCG se puni u kolonu.

Kolona se puni sa 40 mM natrijum fosfatom pH 7,5. Hromatografski proces se prati spektrofotometrijski na 280 nm.

Vodeći efiuent se odbacuje dok pik ne počne da se eluira. Tada se ubira nevezana frakcija sa sadržajem r-hCH.

Treći korak (CM Sepharose FF Hromatografija)

U ovom hromatografskom koraku uklanja se veliki deo zagađivača ćelija domaćina. Hromatografski korak se odvija na oko +5°C. Preporučeni raspon temperatura je 5 ± 3.

(i) Dilucija eluata DEAE Sepharose

Voda za injekcije se dodaje u eluat DEAE Sepharose FF, a pH se podešava na 6 korišćenjem fosforne kiseline 85%. Preporučeni raspon pHje 6 ± 0,1.

(ii) Hromatograifja jonske izmene na CM Sepharose FF

Ova kolona ispunjena slabo naelektrisanom smolom za katjonsku izmenu, karboksimetil (CM) Sepharose fast Flow, uravnoteži se sa 20 mM natrijum fosfatnim puferom (pH 6). Preporučeni raspon pHje 6 ± 0,1.

Rastvor r-hCH se puni u kolonu.

Kolona se ispire sa 20 mM natrijum fosfatnim puferom pH 6. Hromatografski proces se prati spektrofotometrijski na 280 nm: Ovaj proizvod se eluira 130 mM natrijum fosfatnim puferom pH 6. Vodeći eluent se odbacuje dok pik ne počne da se eluira.

Ubire se celokupni pik sa sadržajem r-hCG. Proizvod može da se opciono filtrira u ovom stadij umu da se uklone virusne komponente.

Četvrti korak (RP-HPLC na Silica C18)

Ovaj korak RP-HPLC hromatografije je efikasan za uklanjanje tragova količine zagađivača kulture ćelija, nukelinskih kiselina i endotoksina. Posle njega sledi ultrafilstracija sa razdvajanjem na 10 kD i opciona filtracija.

(i) Priprema alikvota

PH alikvota se podešava na 4, pa se dodaje 2-propanol do finalne koncentracije od 15% (V/V).

(ii) RP-HPLC hromatografija na Silica Cl 8.

Ova kolona, ispunjena smolom Silica C18 prvo se uravnoteži u 15% (v/v) 2-propanola u Tris-fosfatnom 0,5M puferu.

Prvi alikvot se puni u kolonu, a hromatografija se prati UV spektrofotometrijom. Kolona se pere istim ekvilibrisanirft puferom.

Elucija r-hCG se potom obavlja lineranim gradijentom 2-propanol/Tris-fosfatne 0,5 M puferske mobilne faze od 15% do 25% (v/v).

r-hCH se frakcioniše kada se spektorfotometrijski otkrije odgovarajući pik (A28o)-Frakcije čija apsorbanca je veća od 65% maksimalne visine pika na uzlaznom delu i veća od 20% of maksimalne visine pika u silaznom delu se spajaju.

Četiri mešavine r-hCG se onda opet spajaju i razblažuju u ekvivalentoj zapremini vode za injekcije (WFI).

Ovaj proizvod se koncentruje i dijalizira (ultrafiltracijom na membrani od 10 kD) sa-vodom za injekcije da bi se uklonio materijal molekulske težine ispod 10 kD i da se eliminiše 2-propanol.

Ovaj proizvod se onda dijalizira ultrafiltracijom sa amonijum vodonik karbonatnim puferom 0,1 M, pH 8.

Dobijeni srednji proizvod se onda čuva na oko +5 ili zamrznut, po potrebi. Preporučena temperatura skladištenja je 5 ± 3 °C, odnosno na ispod - 15 °C.

Peti korak (hromatografija isključivanjem po veličini na Sephacrvl S-200 HR)

Ovaj hromatografski korak sa isključivanjem po veličini je efikasan za uklanjanje tragova količine zagađivača iz ćelijske kulture, potencijalnih agregata i/ili slobodnih podjedinica. Ovo je praćeno ultrafiltracijom sa isključivanjem na 10 kD. Koraci Sephacrvl S-200 HR i ultrafiltracije sa isključivanjem na 10 kD obavljaju se na oko +5°C. Preporučeni raspon temperature je 5 ± 3 °C.

(i) Isključivanje po veličini na Sephacrvl S-200 HR

Kolona punjena smolom Sephacrvl S-200 HR se uravnoteži sa amonijak vodonik karbonatom 0,5 M (pH 8). Preporučeni raspon pH je 8 ± 0,2.

Rastvor r-hCG se puni u kolonu a elucija se započinje korišćenjem sa amonijak vodonik karbonata 0,5 M (pH 8). Preporučeni raspon pH je 8 ± 0,2.

Sakupljanje frakcije r-hCG se započinje od početka pika i traje dok se ne dođe do oznake 50% maksimalne visine pika na silaznom delu pika.

(ii) Ultrafiltracija sa isključivanjem na 10 kD

Membrane za isključivanje na 10 kD se čuvaju, između serija, u 0,05 natrijum hidroksidu i ispiraju vodom za injekcije dok pH ne siđe na oko 8.

Ovaj proizvod se koncentruje i dijalizira (ultrafiltracijom) prema vodi za injekcije. Proizvod se onda dijalizira (ultrafiltracjom) prema natrijum fosfatnom puferu 0,01 M pH 7, a finalna koncentracija proteina se podešava da dostigne cilju finalnu koncentraciju od 3,5 mg/ml.

Rezultujući finalni zbirni rastvor r-hCG se po mogućstvu zamrzava na oko -15°C.

Hromatografske smole

Sledeće hromatografske smole mogu da se koriste u procesu prečišćavanja:

Mogu se koristiti i ekvivalentne smole.

Prvikorak Silica C4, 250 Angstrom - 50 um (Matrex® Millipore)

Drugi korak DEAE Sepharose FF (Pharmacia)

Treći korak CM Sepharose FF (Pharmacia)

Četvrti korak Silica Cl 8, 300 Angstrom - 15 - 20 um (Vydac)

Peti korak Sephacrvl S-200 HR (Pharmacia)

Tekući snabdevači su:

Amersham Pharmacia Biotech Millipore Corporation

Bjorkgatan30 17 Chery Hill Drive

S-751 84 Upsala Danvers, MA 01923

Švedska SAD

Vydac, The Separaticns Group

17434 Mojave St.

HesperiaCA 92345

SAD

REZULTATI

Molekulska veličina i težina

SDS-PAGE

Relativna molekulska težina r-hCG dobijena praćenjem metode prečišćavanja ovog pronalaska određena je uz pomoć SDS-PAGE prema standardnim proteinima poznate molekulske težine.

Commassie brilijant plavo prebojavanje po ne-redukujućem SDS-PAGE otkrilo je jednu široku traku heterodimera -hCG približne molekulske težine 70 kD (raspon 65

- 775 kD). Identitet ove trake potvrđen je Western blot metodom.

Biološka aktivnost

Biološka aktivnost različitih serija r-hCG po purifikaciji metodom prikazanom u ovom pronalasku prikazana je na Tabeli 2. Koncentracija proteina određena je sprektofotometrijski na 276,5 nm, a = 0,616.

Prosečna specifična aktivnost preparata r-hCGje posebno visoka, i iznosi oko 25,000 U/mg.

Formulacije

I tečne i suvo zamrznute formulacije su razvijene s visoko prečišćenim rekombinantim r-nCG u ovom pronalasku,

Tečna formulacija

Dve tečne formulacija na 10,000 IJ/ml pripremljene su u vajlama DIN 2R korišćenjem manitola ili saharoze kao ekscipijenta i podvrgnute su testovima stabilnosti na 50, 40, 25 i 4°C.

Sadržaj je zabeležen na Tabelama 3 i 4.

Zapremina punjenja: 0,5 ml

Zapremina punjenja: 0,5 ml

Rezultati testa stabilnosti koji su rađeni uz pomoć Bioassav, SE/HPLC i RP-HPLC pokazali su daje manitolska formulacija stabilnija u poređenju sa formulacijom sa sadržajem saharoze. Preporučeno je skladištenje u frižideru da bi se na najmanju meru svela oksidacija proteina i stvaranje slobodnih podjedinica.

Formulacija sušena zamrzavanjem

Formulacija sušena zamrzavanjem jačine 5,000 JJ pripremljena je u vajlama DIN 2R za testove stabilnosti na 50, 40, 25 i 4°C korišćenjem saharoze kao ekscipijenta.

Sastav je izložen na Tabeli 5.

Zapremina punjenja: 0,5 ml

Rezultati testa stabilnosti koji su obavljeni uz pomoć Bioassav, SE/HPLC i RP-HPLC pokazali su daje ova formulacija sušena zamrzavanjem stabilna na 40 i 50°Ci da traje najmanje 19 nedelja.

Testovi stabilnosti na 25 i 4°C obavljeni su posle 6 meseci pokazujući da ne dolazi do degradacije aktivne supstance.

Claims (15)

1. Proces prečišćavanja hCG, naznačen time, iz uzorka koji uključuje upotrebu hromatografije jonske izmene i HPLC reverzne faze.

2. Proces u skladu sa zahtevom 1,naznačen time, koji obuhvata sledeće korake: (a) podvrgavanje uzorka hromatografiji jonske izmene da se proizvede prvi eluat, (b) podvrgavanje prvog eluata HPLC reverzne faze da se proizvede drugi eluat, (c) podvrgavanje drugog eluata hromatografiju isključivanja po veličini.

3. Proces u skladu sa zahtevima 1 i 2 , naznačen time, gde korak (a) obuhvata dva različita prolaza hromatografije jonske izmene.

4. Proces u skladu sa zahtevom 3, naznačen t i m e, gde se prolazi hromatograifje jonske izmene obavljaju pod različitim uslovima.

5. Proces u skladu sa zahtevima od 1 do 4, naznačen t i m e, koji obuhvata sledeće korake: (a) eluacija uzorka kroz kolonu za silica hromatografiju; (b) eluacija uzorka kroz kolonu DEA Sepharoze hromatografiju za jonsku izmenu; (c) eluacija uzorka kroz kolonu za Silica Cl 8 za HPLC jonsku izmenu; i (d) primena eluata za Sephacrvl hromatografiju uz isključivanje po veličini.

6. Proces u skladu sa zahtevom 5, n a z n a č e n t i m e, da se elucija kroz DEAE Sepharoze smolu za jonsku izmenu obavlja u natrijum fosfatnom puferu na pH 7,5.

7. Proces u skladu sa zahtevima 5 ili 6, n a z n a č e n time, da se elucija kroz CM-Sepharose smolu za jonsku izmenu obavlja u natrijum fosfatnom puferu na pH 6.

8. Proces u skladu sa zahtevom 5, 6 ili 7, n a z n a č e n time, da se korak (c) obavlja sa 2-propanol/tris - fosfatnim puferom kao mobilnom fazom.

9. Proces u skladu sa ma kojim zahtevom od 5 do 8, n a z n a č e n time, da se korak (d) obavlja amonijam hidrogen karbonatnim puferom kao mobilnom fazom.

10. Proces u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 9, naznačen time, daje hCG rekombinantni hCG

11. Proces u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 10, n a z n a č e n time, daje uzorak medijum kulture ćelija CHO.

12. Farmaceutska formulacija, naznačena time, što uključuje terapijski efikasne količine rekombinantnog hCG pripremljenog procesima opisanim u zahtevima 10 ili 11, kao i odgovarajućim ekscipijentom.

13. Farmaceutska formulacija u skladu sa zahtevom 12, naznačena time da je taj ekscipijent saharoza.

14. Farmaceutska formulacija u skladu sa zahtevom 12,naznačena time, da je taj ekscipijent manitol.

15. Farmaceutska formulacija u skladu sa zahtevom 12, 13 ili 14, naznačena time, što je za supkutanu primenu.