CZ304833B6 - Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií - Google Patents
Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304833B6 CZ304833B6 CZ2013-473A CZ2013473A CZ304833B6 CZ 304833 B6 CZ304833 B6 CZ 304833B6 CZ 2013473 A CZ2013473 A CZ 2013473A CZ 304833 B6 CZ304833 B6 CZ 304833B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- beta
- lactamases
- mass spectrometry
- gram
- proteins
- Prior art date
Links
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000003781 beta lactamase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940126813 beta-lactamase inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229940126085 β‑Lactamase Inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 6
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 4
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 claims description 3
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N meropenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](C(=O)N(C)C)C1 DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002260 meropenem Drugs 0.000 claims description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 2
- HVFLCNVBZFFHBT-ZKDACBOMSA-N cefepime Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1C[N+]1(C)CCCC1 HVFLCNVBZFFHBT-ZKDACBOMSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002100 cefepime Drugs 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 2
- 108010068543 beta-lactamase CMY-2 Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108010068385 carbapenemase Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000001090 spherocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9446—Antibacterials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení poskytuje způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií pomocí hmotnostní spektrometrie. Z bakterií se nejprve vyextrahují proteiny vnější membrány buněčné stěny a periplasmového prostoru. V této směsi se beta-laktamázy stabilizují inhibitorem a/nebo substrátem beta-laktamáz. Proteiny se následně vysrážejí, rozpustí, nanesou na destičku pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii, překryjí roztokem matrice a změří metodou MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie, načež se výsledná spektra srovnají s referenčními peaky beta-laktamáz. Detekce může být používána k rychlému vyhodnocení rezistence bakterií vůči beta-laktamovým antibiotikům, s minimem falešně pozitivních výsledků.
Description
Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií, konkrétněji pak způsobu identifikace beta-laktamáz a zjištění rezistence gramnegativních bakterií k beta-laktamovým antibiotikům.
Dosavadní stav techniky
Beta-laktamázy jsou enzymy produkované některými bakteriemi. Způsobují rezistenci k betalaktamovým antibiotikům (např. peniciliny, cefalosporiny, karbapenemy). Detekce beta-laktamáz je jedním z vhodných postupů zjištění rezistence bakterií. Je důležitá pro nasazení účinné antibiotické léčby a nastavení vhodných preventivních opatření pro zamezení jejich šíření.
Identifikace beta-laktamáz je prováděna fenotypovými metodami na základě senzitivity k různým inhibitorům. Precizní identifikace probíhá PCR amplifikaci jejich genů s následnou sekvencí amplifikačních produktů. Několik laboratoří ve světě pracuje na vývoji metod identifikace betalaktamáz pomocí hmotnostní spektrometrie (např. Schaumann R, Knoop N, Genzel GH, Losensky K, Rosenkranz C, Stingu CS, Schellenberger W., Rodloff AC, Eschrich K. 2012. A step towards the discrimination of beta-lactamase-producing clinical isolates of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by MALDI-TOF mass spectrometry. Med. Sci. Monit. 18: MT71MT77).
Metoda detekce proteinů (beta-laktamáz) pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie může poskytovat výsledky srovnatelné s molekulámě-genetickými testy (PCR, mikročipy), avšak umožní celý proces významně zrychlit a zlevnit. Dosud však nebyla publikována úspěšná metodika detekce těchto enzymů pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Jedinou publikovanou prací, kdy byla zobrazena beta-laktamáza pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie, je práce z roku 2007 (Camara JE, Hays FA. 2007. Discrimination between wild-type and ampicillin-resistant Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 389: 1633-1638). Výsledky publikované těmito autory se však nepodařilo zopakovat. Zároveň nejsou k dispozici publikace, které by závěry výše citované práce potvrdily.
Známa je detekce karbapenemáz a cefalosporináz pomocí hmotnostní spektrometrie, kde jsou ovšem nejprve proteiny štěpeny na krátké peptidy a podle typického spektra těchto peptidů je potom stanovován typ karbapenemáz a cefalosporináz (WO 2012/14 535, WO 2012/143 534). Dále je známa detekce rezistence u bakterií, kde jsou hmotnostní spektrometrií sledovány produkty působení enzymů způsobujících rezistenci, tedy kovalentně modifikovaná antibiotika nebo kovalentně modifikované modelové sloučeniny (US 2012/196309). Obdobně je známo stanovení přítomnosti beta-laktamáz, založené na detekci produktů působení beta-laktamáz, tedy na detekci produktů hydrolytického štěpení amidové vazby beta-laktamového kruhu beta-laktamových antibiotik (WO 2011/154 517).
Všechny dosud známé metody detekce enzymů bakteriální rezistence vyžadují buď degradaci enzymů na peptidy, nebo provedení enzymatické reakce a detekci produktů této reakce. Tím se do analyzované směsi zanášejí další složky a také se zvyšuje riziko falešně pozitivních výsledků.
- 1 CZ 304833 B6
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií pomocí hmotnostní spektrometrie, jehož podstata spočívá v tom, že se z bakterií vyextrahují proteiny vnější membrány buněčné stěny a periplasmového prostoru a proteiny, které mají být detekovány, se stabilizují inhibitorem a/nebo substrátem daného proteinu, stabilizované proteiny se následně rozpustí, nanesenou se na destičku pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii, překryjí roztokem matrice a změří metodou MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight, ionizace laserem za přítomnosti matrice v kombinaci s detektorem doby letu) hmotnostní spektrometrie. Výsledná spektra se pak srovnají s referenčními peaky (vrcholy) pro danou beta-laktamázu. Referenční peaky beta-laktamáz se získají měřením standardů proteinů, jejichž identita je známa nebo ověřena známými metodami.
Extrakce se s výhodou provádí tak, že bakterie pomnožené v médiu určeném pro kultivaci gramnegativních bakterií, např. vybraném z bujónu Mueller-Hintonové (MH bujónu) nebo média BHI (brain-heart infusion, infuze mozkové a srdeční tkáně), se ochladí na 0 až 6 °C a následně centrifugují pro sedimentaci bakterií. Supematant se odstraní, peleta se resuspenduje ve vodném roztoku sacharózy o koncentraci alespoň 20 % (w/w), s výhodou 20 až 40% (w/w) vodném roztoku sacharózy, výhodněji ve 40% (w/w) roztoku sacharózy, a inkubuje minimálně 1 h při 2 až 8 °C. Ke směsi se následně přidá pufr vhodný pro aktivitu lysozymu (například Tris-HCl pufr) a lysozym, směs se inkubuje při 35 až 37 °C po dobu nutnou pro rozrušení vnější membrány buněčné stěny a uvolnění proteinů periplasmového prostoru (obvykle minimálně 1 h). Kvalitu extrakce/rozrušení vnější membrány buněčné stěny lze ověřit mikroskopicky - dojde ke změně tyčkovitého tvaru bakterií na sférické útvary (sferocyty).
Ve výhodném provedení je inhibitorem či substrátem použitým pro stabilizaci například betalaktamové antibiotikum nebo beta-laktamový inhibitor, např. meropenem, ampicilin, kyselina klavulanová, cefepim, kyselina fenylboritá.
S výhodou se vysrážení provede C1-C4 alkoholem, výhodněji ethanolem, nebo acetonem, do kterých lze s výhodou přidat kyselinu trifluoroctovou, výhodněji 0,1 % obj. kyseliny trifluoroctové.
S výhodou se rozpuštění vysrážených stabilizovaných proteinů provede směsí acetonitrilu a vody s přídavkem kyseliny trifluoroctové, výhodněji se jedná o směs s 50 % obj. acetonitrilu a 2,5 % obj. kyseliny trifluoroctové.
Referenční peaky beta-laktamáz se získají měřením standardů beta-laktamáz, jejichž identita je známa nebo ověřena známými metodami.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je kit pro detekci beta-laktamáz gramnegativních bakterií pomocí hmotnostní spektrometrie, obsahující Tris-HCl pufr (pH 8,0), lysozym, inhibitor či substrát beta-laktamáz, C1-C4 alkohol nebo aceton, směs acetonitrilu a vody s přídavkem kyseliny trifluoroctové, matrici, rozpouštědlo pro matrici.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje příklady detekce beta-laktamáz typu CMY. Peaky odpovídající beta-laktamáze jsou vyznačeny šipkou. A - spektrum purifikované beta-laktamázy CMY-2, B - spektrum vzorku Próteus mirabilis produkující beta-laktamázu CMY-15, C - spektrum vzorku Escherichia coli produkující beta-laktamázu CMY-2.
-2CZ 304833 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kultivace bakterií a extrakce β-laktamáz:
Izolát bakterií z čeledi Enterobacteriaceae (testovány byly Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Próteus mirabilis, Citrobacter freundií) byl naočkován do 50 ml bujónu Mueller-Hintonové (MH bujón) nebo BHI (brain-heart infusion), s přídavkem 50 mg/1 ampicilinu; kultivace byla prováděna po dobu 12 až 18 h při 35 až 37 °C.
Médium s narostlou kulturou bylo následně ochlazeno na cca 4 °C (inkubace na ledu cca 10 minut), centrifugace 20 minut. Supematant byl odstraněn. Peleta byla resuspendována v 90 μΐ vodného roztoku 40% (w/w) sacharózy a inkubována 1 h při 4 °C.
Ke směsi bylo následně přidáno 10 μΐ 1M Tris-HCl pufru (pH 8,0), 1 μΐ lysozymu (koncentrace 10 mg/ml); inkubace byla prováděna 90 minut při 35 až 37 °C. Kvalitu extrakce lze ověřit mikroskopicky - dojde ke změně tyčkovitého tvaru bakterií na sférické útvary (sferocyty).
Následovala centrifugace při 14 000 g po dobu 5 minut. Supematant obsahující extrahované βlaktamázy byl použit dále.
Příprava a stabilizace β-laktamáz ve směsi:
100 μΐ připraveného extraktu bylo smíseno s 25 μΐ lOOmM meropenemu (byly testovány i kyselina klavulanová, kyselina fenylboritá, s obdobnými výsledky) a inkubováno 10 minut při pokojové teplotě. Ke směsi byl přidán 1 ml ledově vychlazeného ethanolu s0,l %obj. trifluoroctové kyseliny, vortexováno 30 sekund, následně centrifiigováno 20 minut při 14 000 g při 4 °C. Poté byl opatrně odstraněn supematant, peleta usušena 10 minut při 35 až 37 °C. Peleta pak byla rozpuštěna v 50μ1 roztoku acetonitrilu (500 μΐ acetonitrilu, 475 μΐ deionizované vody, 25 μΐ trifluoroctové kyseliny); vortexováno 1 minutu.
Vlastní měření:
μΐ roztoku byl nanesen na destičku pro MALDI-TOF MS (mass spectrometry, hmotnostní spektrometrie) měření, ponechán při pokojové teplotě uschnout. Vzorek byl převrstven 1 μΐ matrice (vodný 50% (obj.) roztok ethanolu nasycený kyselinou sinapovou) a ponechán zaschnout. Následně bylo provedeno MALDI-TOF MS měření.
Obr. 1 ukazuje, že postupem podle vynálezu lze získat spektra s oddělenými a dobře integrovatelnými peaky, a s výborným poměrem signál-šum.
Claims (6)
1. Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií pomocí hmotnostní spektrometrie, vyznačený tím, že se z bakterií vyextrahují proteiny vnější membrány buněčné stěny a periplasmového prostoru, v této směsi se beta-laktamázy stabilizují inhibitorem a/nebo substrátem beta-laktamáz, proteiny se následně vysrážejí, vysrážené proteiny se následně rozpustí, nanesou se na destičku pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii, překryjí roztokem matrice určené pro ionizaci proteinů s relativní molekulovou hmotností >10 000 a změří metodou MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie, načež se výsledná spektra srovnají s referenčními peaky beta-laktamáz.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že extrakce se provede tak, že bakterie v médiu určeném pro kultivaci gramnegativních bakterií se ochladí na 0 až 6 °C a následně centrifugují alespoň 20 minut, peleta se resuspenduje ve vodném roztoku sacharózy o koncentraci alespoň 20 % (w/w) a inkubuje se po dobu alespoň 1 hodiny při 2 až 8 °C, ke směsi se následně přidá roztok lysozymu v pufru a směs se inkubuje při 35 až 37 °C po dobu alespoň 1 hodiny.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že inhibitorem či substrátem je beta-laktamové antibiotikum nebo beta-laktamový inhibitor, s výhodou je inhibitor či substrát vybrán ze skupiny zahrnující meropenem, ampicilin, kyselinu klavulanovou, cefepim, kyselinu fenylboritou.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se vysrážení provede C1-C4 alkoholem nebo acetonem, s výhodou s přídavkem kyseliny trifluoroctové.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se rozpuštění vysrážených stabilizovaných proteinů provede směsí acetonitrilu a vody s přídavkem kyseliny trifluoroctové.
6. Kit pro detekci beta-laktamáz gramnegativních bakterií pomocí hmotnostní spektrometrie, vyznačený tím, že obsahuje Tris-HCl pufr o pH 8,0, lysozym, inhibitor či substrát betalaktamáz, C1-C4 alkohol nebo aceton, případně s přídavkem kyseliny trifluoroctové, směs acetonitrilu a vody s přídavkem kyseliny trifluoroctové, matrici, rozpouštědlo pro matrici.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-473A CZ2013473A3 (cs) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií |
| US14/398,705 US9803229B2 (en) | 2013-06-20 | 2014-06-20 | Method of detection of gram-negative bacteria periplasmic space and cell wall outer membrane proteins by mass spectrometry |
| EP14173225.5A EP2816357B1 (en) | 2013-06-20 | 2014-06-20 | Method of detection of Gram-negative bacteria periplasmic space and cell wall outer membrane proteins by mass spectrometry |
| PCT/CZ2014/000069 WO2014202034A1 (en) | 2013-06-20 | 2014-06-20 | Method of detection of gram-negative bacteria periplasmic space and cell wall outer membrane proteins by mass spectrometry |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-473A CZ2013473A3 (cs) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ304833B6 true CZ304833B6 (cs) | 2014-11-26 |
| CZ2013473A3 CZ2013473A3 (cs) | 2014-11-26 |
Family
ID=51032943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-473A CZ2013473A3 (cs) | 2013-06-20 | 2013-06-20 | Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9803229B2 (cs) |
| EP (1) | EP2816357B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2013473A3 (cs) |
| WO (1) | WO2014202034A1 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR112775A1 (es) * | 2017-08-17 | 2019-12-11 | Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecn Conicet | Detección directa de mecanismos de resistencia por espectrometría de masa maldi-tof |
| JP2019143975A (ja) * | 2018-02-15 | 2019-08-29 | 株式会社島津製作所 | 分析方法およびβ−ラクタム系抗菌薬耐性評価方法 |
| KR101999574B1 (ko) * | 2018-08-03 | 2019-09-27 | 다이아텍코리아 주식회사 | 질량분석법을 이용한 베타락탐 항생제 가수분해 효소의 활성형 직접 검출법 |
| KR102729119B1 (ko) * | 2019-08-02 | 2024-11-13 | (재)씨젠의료재단 | 베타-락탐 항생제에 대한 내성을 가지는 병원성 균주의 직접 검출 방법 |
| JP2026013695A (ja) * | 2024-07-17 | 2026-01-29 | 株式会社島津製作所 | 微生物の薬剤耐性評価方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006021493B4 (de) * | 2006-05-09 | 2010-04-01 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Messung mikrobieller Resistenzen |
| DE102010023452B4 (de) | 2010-06-11 | 2012-11-08 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Messung von β-Lactamase-Resistenzen |
| US20120196309A1 (en) | 2011-01-28 | 2012-08-02 | Yale University | Methods and Kits for Detection of Antibiotic Resistance |
| DE102011012060A1 (de) * | 2011-02-23 | 2012-08-23 | Bruker Daltonik Gmbh | Massenspektrometrische Bestimmung der inhibitorischen Wirkung von Substanzen gegenüber beta-Lactamasen |
| CN103765216B (zh) | 2011-04-21 | 2017-08-11 | 生物梅里埃公司 | 使用质谱检测至少一种碳青霉烯抗性机制的方法 |
| WO2012143534A2 (fr) | 2011-04-21 | 2012-10-26 | Biomerieux Inc. | Procede de detection d'au moins un mecanisme de resistance aux cephalosporines par spectrometrie de masse |
-
2013
- 2013-06-20 CZ CZ2013-473A patent/CZ2013473A3/cs unknown
-
2014
- 2014-06-20 WO PCT/CZ2014/000069 patent/WO2014202034A1/en not_active Ceased
- 2014-06-20 US US14/398,705 patent/US9803229B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2014-06-20 EP EP14173225.5A patent/EP2816357B1/en not_active Not-in-force
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Al-Haroni M et al. Proteomic analysis of ampicillin-resistant oral Fusobacterium nucleatum. Oral Microbiol. Immunol., 2008, 23, 36-42. * |
| Bethel CR et al. Exploring the inhibition of CTX-M-9 by beta-lactamase inhibitors and carbapenems. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, 55(7), 3465-3475. * |
| Camara JE, Hays FA. Discrimination between wild-type and ampicillin-resistant Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem., 2007, 389, 1633-1638. * |
| Hrabák J et al. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to routine diagnosis. Clin. Microbiol. Rev., 2013, 26(1), 103-114. * |
| Schaumann R et al. A step towards the discrimination of beta-lactamase producing clinical isolates of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by MALDI-TOF mass spectrometry. Med. Sci. Monit., 2012, 18(9), MT71-77. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2013473A3 (cs) | 2014-11-26 |
| US20160138068A1 (en) | 2016-05-19 |
| EP2816357A1 (en) | 2014-12-24 |
| WO2014202034A1 (en) | 2014-12-24 |
| US9803229B2 (en) | 2017-10-31 |
| EP2816357B1 (en) | 2019-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2622127T3 (es) | Metodos de determinación de resistencia a antibioticos en microorganismos | |
| CZ304833B6 (cs) | Způsob detekce beta-laktamáz gramnegativních bakterií hmotnostní spektrometrií | |
| JP6087341B2 (ja) | セファロスポリンに対する耐性の少なくとも１つの機構を質量分析により検出する方法 | |
| Kok et al. | Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory | |
| Chenau et al. | Detection of yersinia pestis in environmental and food samples by intact cell immunocapture and liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| US20250075247A1 (en) | Method for determining the methicillin resistance of staphylococcus aureus strains | |
| Ma et al. | Legionella effectors SidC/SdcA ubiquitinate multiple small GTPases and SNARE proteins to promote phagosomal maturation | |
| JP6232115B2 (ja) | 微生物が潜在的に抗菌剤化合物に対して耐性を有するか否かを決定するための方法 | |
| McGee et al. | Direct detection of intact Klebsiella pneumoniae carbapenemase variants from cell lysates: Identification, characterization and clinical implications | |
| KR102318190B1 (ko) | 펩티도글리칸의 생물학적 분석법 | |
| Shah et al. | Determination of antimicrobial resistance using tandem mass spectrometry | |
| Fan et al. | Rapid determination of bacterial aminoglycoside resistance in environmental samples using membrane electrospray ionization mass spectrometry | |
| JP6378153B2 (ja) | 微生物における抗生物質耐性の特徴付けの方法 | |
| Spinler et al. | Discerning strain-specific β-lactam drug resistance by clonal isolates of multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa using selected reaction monitoring | |
| RU2518249C1 (ru) | Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат | |
| Rojo-Martín | Detecting bacterial resistance, biomarkers, and virulence factors by MALDI-TOF mass spectrometry | |
| US9376705B2 (en) | Method for detecting susceptibility of microorganisms to chemical agents | |
| US20240085414A1 (en) | A method for isolating gram-negative bacteria-derived intact proteins | |
| RU2776822C2 (ru) | Выявление продуцирующих карбапенемазу видов enterobacteriales, pseudomonas и acinetobacter с применением хромогена | |
| Stone | Cell-Selective Chemoproteomics for Biological Discovery | |
| Gaulton | Characterisation of novel and complex mechanisms of antobiotic resistance using a proteomics approach | |
| Wei Yang et al. | Differentiation of Secreted Proteins from a Virulent and an Avirulent Strain of Streptococcus suis Serotype 2 |