CZ305442B6 - Aminoderiváty biotinu a jejich konjugáty s makrocyklickými chelatačními činidly - Google Patents

Abstract

Sloučeniny obecného vzorce I, způsob jejich přípravy a jejich použití k přípravě konjugátů s radioligandy pro použití v humánní a veterinární terapii a diagnostice, a zvláště k diagnostice a terapii takových patologických stavů, jako jsou nádory.

Description

Oblast techniky

Zde popisovaný vynález se týká modifikovaného biotinu vhodného pro přípravu konjugátů s radionuklidy pro použití v humánní a veterinární diagnostice a terapii, a to zvláště v diagnostice a léčbě takových patologických stavů, jako jsou nádory.

Zde popisovaný vynález spadá do technické oblasti přípravy léčiv.

Zde popisovaný vynález poskytuje sloučeniny, metody jejich přípravy, metody pro jejich použití a přípravky, které je obsahují, a které jsou vhodné pro průmyslové aplikace v oblasti farmacie.

Zde popisovaný vynález poskytuje sloučeniny, přípravky a metody vhodné pro to, aby se tyto látky dopravily a patřičnou látku vhodnou k diagnostické a terapeutické medicíně k léčbě patologických poruch uvolnily v orgánech a tkáních.

Zde popisovaný vynález se týká zejména, i když ne výlučně, oblasti protirakovinových radiofarmak, a to jak látek, které jsou vhodné k diagnostickým účelům, tak látek, které jsou vhodné k prevenci a terapii rakoviny.

Dosavadní stav techniky

Terapie nádorů se většinou provádí využíváním látek cílených na destrukci rakovinových buněk. Toho lze dosáhnout cytotoxickými látkami, které musejí penetrovat do nádorových buněk, aby se dosáhlo jejich plného účinku, nebo se na buňky musí působit zářením o dostatečné energii, aby se tyto buňky zneškodnily. V obou případech nastává problém co nej selektivnějšího přivedení této látky do cílové buňky takovým způsobem, aby se zamezilo případnému poškození okolních zdravých buněk. V případě radiofarmak, tj. látek nesoucích radioaktivní součást, je nutno vidět jako zvláště důležitý problém selektivní přivedení účinné součásti do cílového nádoru, a co největší zamezení difúze radionuklidu do těla nebo jeho interakce se zdravými buňkami obklopujícími nádor.

Pro diskusi o všech publikacích a dosud známých řešeních je čtenář odkazován na US patenty 5 283 342; 5 608 060 a 5 955 605 náležející společnosti Neorex, které vycházejí z patentové přihlášky z 9. června 1992. Tyto patenty jsou formou odkazu zahrnuty v tomto textu.

V těchto dokumentech je diskutován mimo jiné i problém odolnosti látky nesoucí radionuklid k metabolickému napadení. Případem, kterému je věnována největší pozornost, je molekula biotinu, která je jednou z prvních voleb pro přivádění radionuklidu do nádorových buněk díky jeho dobře známé interakci s avidiny. Jak je z praxe známo, biotin se váže na chelátovou Část radionuklidu, například na molekulu DOTA, kovalentně. Patenty společnosti Neorex postavily problém odolnosti komplexu obsahujícího ve své molekule biotin jako spojení radionuklidu kovalentní vazbou s bionidázami - enzymy, které štěpí peptidovou vazbu, která je v komplexu. Tato vazba spojuje chelatační činidlo a biotin.

Mezi vyžadované vlastnosti patří i to, že se molekula musí z těla rychle a účinně vylučovat a musí být dostatečně malá (m. hm < 1000), aby byla umožněna snadná distribuce do mimobuněčné tekutiny, kde by se vázala s nádorem. Musí navíc vykazovat stabilitu in vivo pouze s minerální absorpcí nenádorovými buňkami a rychlé vylučování (přes ledviny) a nesmí být metabolizována.

K těmto charakteristikám se musí ještě přidat nutnost určité stability mezi biotinovou částí a chelatační částí molekuly.

Chelatační část se nesmí uvolnit in vivo a uvolnit ty části molekuly, které jsou potenciálně nebezpečné pro tělo. Odborníci z oboru jsou seznámeni s problémem uvolňování radionuklidu chelatační součástí obsahující ionty kovu, které jsou tělu zcela cizí a které mohou být vybaveny radioaktivitou různých typů a i vysokocnergetickou radiací, kteráje tudíž vysoce škodlivá.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že sloučenina obecného vzorce I tak, jak je zde dále uvedena, nejen že splňuje požadavky na takovou sloučeninu k terapii a diagnostice nádoru nebo jiných onemocnění, které mohou být detekovány a léčeny sloučeninami tohoto typu, ale má též výhodu v tom, že neprochází metabolickými reakcemi schopnými uvolňovat komplexní část molekuly. Takto je molekula zcela tělem vyloučena v nezměněné formě, a tím se předchází problému možného uvolňování chelatační součásti obsahující ionty kovů v ní vázané.

Jedním z předmětů zde popisovaného vynálezu je tedy sloučenina obecného vzorce 1

HN NH

I I

R H kde

Q je skupina -(CIT),,-, ve které n je celé číslo od 4 do 12,

R je vodík,

R je -Λ, kde -Λ je makrocyklus vzorce II

(Π), kde X je vodík, Y je -(CH₂)_m-COOH, kde m je celé číslo od 1 do 3;

p je celé číslo 2.

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce I s radioizotopy pro diagnostické a/nebo terapeutické využití. Příklady těchto izotopů jsou: Fe-52, Mn-52m, Co;_ιι< um P—32. Sc—47. Cu—67. Y—90,

Pd-109, Ag-111, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Bi-212, Bi-213, Rh-105, Sm-153, Lu177 a Au-198.

První skupinou komplexů podle vynálezu, kterým se dává přednost, jsou ty, kde se sloučenině s obecného vzorce 1, kde Rje vodík, Q je -(CH₂)_n-, kde n je celé číslo od 4 do 8, nejlépe 6, R je

-Λ, Y je vždy -CH₂COOH; X je vodík a p je 2 a radioizotopem je Y-90.

Dále je popsán postup přípravy sloučenin obecného vzorce 1 ajejich komplexů s radiofarmaky.

ío Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu jsou farmaceutické a/nebo diagnostické kompozice obsahující sloučeniny obecného vzorce I ajejich komplexy tak, jak jsou uváděny výše.

Dále se tento vynález týká použití sloučenin obecného vzorce 1 ajejich komplexů s radioizotopy jako léčiv nebo diagnostických nástrojů, zvláště k přípravě léčiv, která jsou vhodná v nádorové ls terapii nebo diagnostice.

Tyto a další předměty zde popisovaného vynálezu budou podrobně popsány v části, která bude následovat a též pomocí experimentálních příkladů.

Podrobný popis vynálezu

Sloučeniny podle zde popisovaného vynálezu se připravují podle následujícího schématu, který se skládá z těchto stupňů:

a) vytvoření amidové vazby mezi karboxylovou skupinou biotinu a primární aminovou skupinou H₂N-Q-NH₂ diaminu, kde je další primární aminoskupina vhodně chráněna, pokud to je nutné, například skupinou Boc.

b) odstranění ochrany primární aminoskupiny;

c) redukce amidové skupiny na aminoskupinu;

d) konjugace s požadovaným chelatačním činidlem -A obecného vzorce II.

Biotin je komerční produkt. H₂N-Q-NH₂ diaminy jsou v obchodní síti dostupné a mohou být každopádně připraveny pomocí známých postupů.

Ochrany primární aminoskupiny se snadno docílí použitím známých chránících skupin, jako například Boc, které lze v každém případě nalézt v katalozích a v obecné literatuře.

Alternativně mohou být sloučeniny obecného vzorce I podle předloženého vynálezu připraveny podle následujícího schématu, pokud Rje vodík a R je makrocyklické chelatační činidlo -A:

a) vytvořením amidové vazby mezi karboxylovou skupinou biotinu a primární aminoskupinou

H₂N-Q-NH₂ diaminu, kde je další primární aminoskupina vhodně chráněna, pokud to je nutné, například skupinou Boc;

b) odstraněním primární aminoskupiny, pokud je chránící skupina alkylurethanového typu citlivá na působení BH₃.THF, jako například skupina Boc;

c) selektivní ochranou jmenované primární aminoskupiny chránící skupinou vybranou z uváděné literatury tak, aby byla odolná vůči následné redukci a odštěpitelná bez poškození biotinového kruhu (Greene, T. W, Wuts, P. G. M., „Protective groups in organic synthesis“, 3. vyd., J. Wiley & Sons, lne., New York, 1999; Handbook od Reagents for Organic Synthesis, „Oxidizing and

Reducing Agents“, edited by Burke, S. D. a Danheiser, R. L., J. Wiley & Sons, lne., New York, 1999);

d) redukcí amidové skupiny pomocí BH₃.THF na aminoskupinu;

e) chráněním sekundární aminoskupiny jinou než již použitou chránicí skupinou;

f) odstraněním skupiny chránící primární aminoskupinu;

g) konjugací s požadovaným chelatačním činidlem tak, jak je definováno výše;

h) odstraněním skupiny chránící sekundární aminoskupinu;

i) nebo, pokud je R makrocyklické chelatační činidlo -Λ a R” je vodík, následuje po stupni d):

j) konjugace s požadovaným chelatačním činidlem -A;

k) odstranění skupiny chránící primární aminoskupinu.

Skupina pro chránění primární aminoskupiny ve stupni a) již byla uvedena výše. Co se týká chránicí skupiny aminoskupiny ve stupni c) a skupiny chránící sekundární aminoskupiny, je běžně vzdělaný odborník schopen na základě svých znalostí oboru vybrat odpovídající chránicí skupinu.

Pokud R je -(CH₂)_r-A a R je -Λ, může být sloučenina obecného vzorce I připravena podle následujícího schématu:

a) aktivace -COOH skupiny biotinu známými postupy pro syntézu peptidů (Lloyd-Williams, P., Albericio, F., Giralt, E.: „Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins“, CRC Press, Boča Raton, New York, 1997);

b) konjugace biotinu aktivovaného aminem obecného vzorce BocNH(CH₂)_nNH(CH₂)_qNHBoc, kde n a q se mohou nezávisle na sobě pohybovat v rozmezí od 4 do 12;

c) odštěpení ochranné skupiny Boc;

d) pokud to je nutné, redukce amidu, kterou lze provést stejně, jak je popsáno výše;

e) konjugace s požadovaným chelatačním činidlem -Λ.

Mnoho sekundárních aminů, uvedených ve stupni b) lze v obchodní síti získat; další mohou být připraveny vhodně upravenými běžnými způsoby (například viz Hansen, J. B„ Nielsen, M. C„ Ehrbar, U., Buchardt, O., Synthesis, 404, 1982).

Konjugace sloučeniny podle vynálezu s radioizotopem k vytvoření komplexů zmiňovaných v kontextu s tímto vynálezem se provádí tradičními způsoby, které jsou v této oblasti známé, například jak je popsáno v publikaci Paganelli, Chinol, et al., European Journal of Nuclear Medicine, 26, (4), 348-357, duben 1999.

Popis výhodného provedení vynálezu

Nyní bude následovat podrobný popis přípravy výhodné sloučeniny obecného vzorce (I), tj. sloučeniny, kde Rje vodík, Q je -(CH₂)_n- kde n je nejlépe 6, R''je -Λ, Y je vždy -CH₂-COOH; X ie vodík a o ie 2.

Tento postup se skládá z:

a) vytvoření amidové vazby mezi karboxylovou skupinou biotinu a primární aminoskupinou hexamethylendiaminu, vhodně chráněnou - pokud to je nutné - například skupinou Boc;

b) odštěpení skupiny chránící aminoskupinu hexamethylendiaminu;

c) redukce amidové skupiny na aminoskupinu;

d) konjugace s požadovaným chelatačním činidlem.

Stupeň a) zde popsaného postupu spočívá ve vytvoření amidové vazby mezi karboxylovou skupinou biotinu a primární aminoskupinou hexamethylendiamin-Boc. Na biotin se působilo HATU za vzniku extrémně aktivního esteru in šitu, který reaguje s aminoskupinou hexamethylendiaminBoc za vzniku odpovídajícího amidu. Tento aktivační mechanismus, který se používá především k syntéze peptidů v pevné fázi, vyžaduje bazické médium. Aby se zabránilo reakci báze s aktivním esterem, používají se terciární báze, jako je například diisopropylethylamin (DIPEA), nebo N-methylmorfolin (NMM). Ochránění jedné ze dvou aminoskupin hexamethylendiaminu Boc skupinou (terc-butyloxykarbonylem) je nutná k zabránění tomu, aby se biotin vázal na oba konce diaminového řetězce. Výsledný produkt se z reakčního média izoluje po odpaření rozpouštědla (DMF) a vysrážení vodou. Produkt, rekrystalizovaný z propanolu, byl charakterizován pomocí ’Η-NMR, elementární analýzy a ESI-MS. Výtěžek reakce je okolo 88 %.

Ve stupni b) se biotinyl-hexamethylendiamin-Boc rozpustí v přibližně 3M směsi AcOEt/HCl za účelem odštěpení skupiny Boc. Po odstranění směsi rozpouštědel byl produkt lyofilizován za účelem úplného odstranění HC1. Vzorek byl přečištěn rekrystalizací z vodného roztoku v alkalické oblasti pH a charakterizován pomocí 'H-NMR a TLC.

Ve stupni c) byla redukce amidové skupiny provedena pomocí BH3.THF. Jelikož je redukční činidlo velice reaktivní, musí být postup prováděn v bezvodém prostředí. Výchozí produkt byl před reakcí uchováván pod vakuem a potom rozpuštěn v bezvodém THF (destilovaném se sodíkem a benzofenonem). Reakční směs byla refluxována v dusíkové atmosféře až do úplné redukce amidové skupiny (sledováno pomocí 'H-NMR spekter). Po odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku bylo na směs působeno vodným roztokem HC1. Po lyofilizaci kyselého roztoku byl produkt přečištěn rekrystalizací z vodného roztoku v alkalické oblasti pH a potom chromatografován na koloně s reverzní fází. Analýza produktu byla provedena analytickou TLC, která prokázala jeho čistotu. Výtěžek reakce je přibližně 55 %.

Stupeň d) spočívá v konjugační reakci redukovaného biotinyl-hexamethylendiaminu s DOTA, provedenou s použitím specifických reagencí za účelem vytvoření amidových vazeb ve vodném prostředí: l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochlorid (EDC) a sulfoNHS.DOTA byly rozpuštěny ve vodě a pH bylo nastaveno na hodnotu mezi pK_a3 a pK_a4, aby se aktivovala převážně jedna ze čtyř karboxylových skupin. Tímto způsobem lze snížit pravděpodobnost vzniku vedlejších produktů. K bazickému roztoku byl přidán sulfo-NHS a nakonec EDC. Po vytvoření aktivního esteru in sítu byl přidán redukovaný biotinyl-hexamethylendiamin, přičemž bylo kontrolováno, aby pH roztoku zůstalo na hodnotě kolem 8,6. Přečištění surového produktu bylo provedeno semipreparativní HPLC (C₎₈; CH₃CN/H₂O/0,l % TFA; od 5 do 25 % CH₃CN během 20 minut).

Předměty zde popisovaného vynálezu jsou farmaceutické nebo diagnostické kompozice obsahující jako účinnou složku alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I, též ve formě komplexu s radioizotopem, nebo v případě uvedené sloučeniny obecného vzorce I ve spojení s dalšími aktivními složkami vhodnými k léčbě onemocnění uvedených v tomto textu, např. s dalšími produkty majícími protirakovinové účinky; též v oddělených dávkových formách nebo ve formě vhodné pro kombinovanou terapii.

Aktivní složka podle vynálezu bude ve formě směsi s vhodnými vehikuly a/nebo excipienty běžně používanými ve farmaceutické technologii, jako například s látkami popisovanými v posledním vydání publikace „Remingtonů Pharmaceuticals Sciences Handbook“. Kompozice podle vynálezu musí obsahovat terapeuticky účinné množství aktivní složky. Dávky budou stanoveny odborníkem z této oblasti, např. klinickým nebo praktickým lékařem, podle typu onemocnění, které má být léčeno a podle pacientova stavu, nebo souběžně podávaných dalších aktivních složek.

Mezi příklady farmaceutických přípravků patří ty, které umožní parenterální nebo lokoregionální podávání. Farmaceutickými přípravky vhodnými pro takovýto účel jsou roztoky, suspenze nebo lyofilizované formy, které lze rekonstituovat v době jejich použití.

Formy vhodné pro průmyslové využití tohoto vynálezu jsou soupravy pro rakovinovou radioterapii, jaké jsou například popsány v evropském patentu 0 496 074, v článku Paganelli, Chinol, et al., publikovaném v European Journal of Nuclear Medicine, 26. (4), 348 - 357, duben 1999; v US patentu 5 968 405 a odpovídající literatuře.

Dalším předmětem zde popisovaného vynálezu je souprava pro terapii nebo diagnostiku nádorů pomocí radioaktivity charakteristická tím, že alespoň jedna složka uvedené soupravy obsahuje sloučeninu obecného vzorce 1 nebo jeden z jejích komplexů s vhodným radioizotopem.

Sloučeniny podle vynálezu jsou vhodné k přípravě terapeutických a/nebo diagnostických činidel pro léčbu a diagnostiku nádorů.

Uvedené sloučeniny mohou být použity například při metodách léčby nádorů využívajících protirakovinová radiofarmaka, jako například při metodách popisovaných v evropském patentu 0 496 074, v článku Paganelli, Chinol, et al., publikovaném v European Journal of Nuclear Medicine, 26, (4), 348 - 357, duben 1999; v US patentu 5,968,405 a v odpovídající literatuře.

Vynález dále objasňují následující příklady.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

NMR spektra byla zaznamenána v roztoku DMSO-dó.

K roztoku biotinu (1 g; 4,1 mmol) a NMM (0,451 ml; 1 ekv.) v bezvodém DMF byl přidán roztok N-Boc-hexamethylendiamin-HCl (1,03 g; 1 ekv.) a NMM (0,541 ml; 1 ekv.) v bezvodém DMF. Po několika minutách byl přidán roztok HATU (1,56 ; 1 ekv.) v DMF. Reakční směs byla míchána přes noc za laboratorní teploty a potom za sníženého tlaku odpařena. Takto získaná olejovitá látka byla ponechána krystalizovat po přídavku vody a byla překrystalizována z n-propanolu, čímž bylo získáno 1,6 g (3,6 mmol; výtěžek 88 %) sloučeniny 1.

Kontrolní TLC bylo zjištěno, že jde o čistou látku (eluent: DCM/MeOH = 5:1; detekce fluoreskaminem nebo Cl₂/o-tolidinem).

B.t.: 174 až 176 °C;

CZ 305442 Β6 'H-NMR, 8_h: 1,1 - 1,65 (14H, CH(CH₂)₃ a NHCH₂(CH₂)₄); 1,34 (s, 9H, tBu); 2,05 (t, 2H, CH₂CO); 2,54 (d, 1H, HCHS); 2,74 - 3,15 (6H, 2 x CH₂N, HCHS a CHS); 4,12 m, 1H, CHCHNH); 4,28 (m, 1H, CH₂CHNH); 6,36 a 6,42 (dva s, 2 x biotin NH); 6,74 (t, 1H, Boc NH); 7,74 (t, IH, amidNH);

ESI-MS: m/e vypočteno [M + H]⁺ 443,1; nalezeno 443,1.

Elementární analýza: vypočteno: pro C₂iH₃₈N₄O₄S.0,5 H₂O: C = 55,85; H = 8,7; N = 12,4. Nalezeno: C = 56,2; H = 8,8; N = 12,4.

K suspenzi biotinyl-hexamethylendiamin-Boc (1) (1,6 g) v AcOEt byl přidáván 37% vodný roztok HC1 až do rozpuštění a získání přibližně 3M roztoku v HC1. Roztok byl po dobu 30 minut míchán magnetickým míchadlem a potom za sníženého tlaku odpařen. Olejovitý produkt byl lyofilizován pomocí vody, pH bylo nastaveno 2M NaOH na hodnotu 12, roztok byl zchlazen ledem, načež byl roztok ještě jednou lyofilizován. K získané tuhé látce (sloučenině 2) byl několikrát přidán MeOH za účelem odstranění přítomných solí a potom byla přečištěna srážením methanolového roztoku přídavkem ethylétheru, čímž bylo získáno 1,1 g (výtěžek 90 %) sloučeniny 2. Sloučenina byla podle TLC analýzy na silikagelu (eluent: n-propanol/AcOH/H₂O =1:1:1) při kontrole pomocí fluoreskaminu v acetonu při 366 nm a Cl₂/o—tolidinu čistá.

Bod tání: 179 až 182 °C; 'H-NMR v souladu se sloučeninou 1 pouze bez signálu tBu.

K 8,8 ml 1M roztoku BH₃ v THF pod dusíkovou atmosférou při teplotě 0 °C byl přidán jemně práškový amin 2 (1,5 g; 4,3 mmol) a směs byla suspendována v 15 ml bezvodého THF. Směs byla míchána magnetickým míchadlem při 0 °C po dobu přibližně 30 minut a potom refluxována až do ukončení reakce (postup reakce byl kontrolován 'H-NMR alikvotních podílů reakční směsi, ke které byla přidána horká 3M HC1 s následným odpařením při sníženém tlaku). Na konci reakce byla přidána 3M HC1; reakční směs byla refluxována po dobu 3 hodin a odpařena za sníženého tlaku. Surový reakční produkt (sloučenina 3) byl vysrážen vodou při pH přibližně 12 a přečištěn pomocí RP-CC (LiChroprep RP-8, 40 - 63 μιη; eluent: H₂O/CH₃CN/TFA = 92 : 8 : 0,1), čímž bylo získáno 1,3 g (2,3 mmol; výtěžek 55 %) sloučeniny 3, která byla podle TLC analýzy Čistá (stejný postup jako byl použit pro sloučeninu 2).

'H-NMR, δ_Η: 1,30 - 1,58 (16H, CH(CH₂)₄ a NHCH₂(CH₂)₄); 2,53 (d, 1H, HCHS); 2,82 (7H, HCHS a 3 x CH₂N); 3,05 (m, 1H, CHS); 4,12 (m, 1H, CHCHNH); 4,28 (m, 1H, CH₂CHNH); 6,38 (br, 2 x biotin NH); 8,03 (br, NH⁺3); 8,9 (br, NH⁺2).

ESI-MS: m/e vypočteno [M + H]⁺ 328,23; nalezeno 328,2.

K roztoku DOTA.3H₂O (100 mg; 0,2 mmol) ve vodě o pH nastaveném na hodnotu 9,2 byl přidán roztok sulfo-NHS (86,8 mg; 0,4 mmol) v 1 ml vody. Po několika minutých byl po kapkách a za chlazení ledem přidáván roztok EDC (76,7 mg; 0,4 mmol) v 0,5 ml. Reakční směs byla míchána po dobu přibližně 20 minut a potom byl přikapán roztok aminu 3(111 mg; 0,2 mmol) rozpuštěného v 1 ml vody při pH 8,6. Přibližně po 3 hodinách byl reakční roztok lyofilizován a surový produkt 4 přečištěn HPLC s reverzní fází (C,₈, A: 0,1 % TFA v CH₃NH; B: 0,1 % TFA ve vodě; 10 až 15 % B během 20 minut; Rt: 12,6 min.), čímž bylo získáno 53 mg (20 %) produktu, který byl podle TLC čistý (stejný postup byl použit u sloučeniny 2). Zkouška s fluoreskaminem v acetonu k potvrzení přítomnosti primární aminoskupiny vedla k negativním výsledkům.

'H-NMR, δ_Η: 1,3 - 1,6 (16H, CH(CH₂)₄ a NHCH₂(CH₂)₄; 2,60 (d, 1H, HCHS); 2,8 - 2,9 (7H, HCHS a 3 x CH₂N); 3,04 (br s, 16H, 8 x DOTA-kruh CH?), 3,11 (m, 1H, CHS); 3,61 (br s, 8H, 4 x DOTA CH₂CO); 4,15 (m, 1H, CHCHNH); 4,33 (m, 1H, CH₂CHNH); 6,40 a 6,44 (dvě s, 2 x biotin NH); 8,27 (br, amid NH); 8,54 (br, NH%).

CZ 305442 [36

ESI-MS [M + Hf: nalezeno 715,4.

Elementární analýza: vypočteno: pro C₁₂H_5SN8O_sS.4TFA.fLO: C = 40,41; I I = 5,43; N = 9,42. Nalezeno: C = 40,48; H = 5,45; N = 9,09.

Zkoušky značení (izotopem), zkoušky vázání avidinu a zkoušky stability séra byla provedeny se sloučeninami podle následujícího příkladu.

Zkoušky vazby

Avidin byl ponechán reagovat s ⁹⁰Y-DOTA-biotinem se stoupajícím množstvím značeného biotinu. Přítomnost dalších radioaktivních píku vedle píků náležejících avidin-biotinovému komplexu byla kontrolována pomocí FPLC za isokratických podmínek popsaných výše. Radioaktivní pík odpovídající ⁹⁰Y-DOTA-biotin/avidinovému komplexu vykazoval retenční čas 9 minut, zatímco pík nevázaného ⁹⁰Y-DOTA-biotinu byl eluován v 15. minutě.

Výsledky afinitních studií mezi avidinem a ⁹⁰Y označeným derivátem biotinu z příkladu 1 v přirozeném molárním poměru 1 : 4 a při molámím nadbytku avidinu (1 : 2) jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1. Molámí poměry avidin/biotin-DOTA

molární poměr avidin/biotin	1 : 2	1 : 4
90Y-DOTA-biotin (pg)	1	2
avidin (pg)	51	51
vazba (%)	99,8	99,7

Pokud se začínalo s molámím nadbytkem avidinu, byl na radiochromatogramu pozorován pouze jeden pík odpovídající avidin-biotinovému komplexu. Stejný profil FPLC byl získán se dvojnásobně zvýšeným množstvím ⁹⁰Y-DOTA-biotinu, což ukazuje, že byla zachována přirozená afinita systému.

Studie afinity

Byl studován přenos ⁹⁰Y-DOTA-biotinu z avidinu působením přirozeného biotinu (vitamin H), přičemž se vycházelo z molámího poměru avidinu ku biotinu 1 : 4. Úplnost vazby při molámím poměru avidinu ku biotinu v poměru 1 : 4 byla zpočátku kontrolována pomocí gelové FPLC za výše uvedených podmínek. K alikvotním podílům z tohoto roztoku bylo přidáváno stoupající molární množství vitaminu H a po 15 minutách inkubace za laboratorní teploty byl každý roztok analyzován pomocí FPLC. Míra přenosu byla vypočtena podle snižování avidin-biotinového radiopíku v porovnání se rostoucím radiopíkem ⁹⁰Y-DOTA-biotinu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2. Afinitní studie s biotinem

molární poměr avidin:vitamin H	1 : 2	1 : 4	1 : 8	1 : 16	1 : 32
9uY-DOTA-biotin (ng)	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
vázaný avidin	6,4	6,4	6,4	6,4	6,4
přidaný biotin (ng)	0,047	0,094	0,188	0,376	0,752
přenos (%)	0,2	0,0	0,8	0,0	0,0

Výsledky < 1 % byly považovány za výsledky v rámci experimentální chyby.

Je patrné, že i velký molámí nadbytek vitaminu H nemůže přenášet ⁹⁰Y-DOTA-biotin, který se již navázal na avidin.

Studie stability μΐ označovací směsi odpovídající 1,85 MBq ⁹⁰Y bylo 20násobně zředěno fyziologickým roztokem nebo sérem a inkubováno při 37 °C. Roztok byl analyzován v různých časových bodech až do 144. hodiny po označení. Za účelem provedení analýzy byl přidán alikvotní podíl inkubační směsi k molámímu nadbytku avidinu. Výše popsanou FPLC byl stanoven poměr komplexu ⁹⁰YDOTA-biotin/avidin proti k volnému ⁹⁰Y.

Studie stability ukázaly, že ve fyziologickém roztoku bylo radioaktivní značení stále zcela asociováno s avidin-biotinovým komplex až 144 hodin.

V séru byl nejprve detekován pouze jeden radiopík v chromatogramu inkubovaných vzorků po dobu až 48 hodin, avšak potom byla pozorována rovnoměrná disociace ⁹⁰Y Z DOTA-biotinu, která dosáhla maxima 55 % ve 144. hodině.

Pokud se vycházelo ze vzorku inkubovaného 72 hodin, byl v radiochromatogramu pozorován druhý pík s nižším retenčním časem (8,2 min.), což bylo známkou toho, že aktivita ⁹⁰Y byla asociována s vysokomolekulámími látkami, pravděpodobně se sérovým transferinem.

Claims (8)

1. CZ 305442 136

   PATENTOVÉ NÁROKY

   5 1. Aminoderivát biotinu vzorce I (1), kde

   Q je skupina -(CH₂)_n-, ve které n je celé číslo od 4 do 12,

   R je vodík,

   15 R je -Λ, kde -Aje makrocyklus vzorce II

   -co—(CH₂)m_v /^CH4^P .Y (Π), kde X je vodík, Y je -(CH₂)_m-COOH, kde m je celé číslo od 1 do 3;

   p je celé číslo 2.
2. 2. Komplex sloučeniny vzorce 1 podle nároku 1 s radioizotopem pro použití pro terapeutické a/nebo diagnostické účely.
3. 3. Komplex podle nároku 2, ve kterém je radioizotop vybraný ze skupiny zahrnující Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-1 11, 1-123, 1-125, 1-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Bi-212, Bi-213, Rh-105, Sm-153, Lu-177 a Au-198.
4. 4. Komplex podle nároků 2 a 3, kde ve sloučenině vzorce I Q je -(CFTjn- kde n je celé číslo od 4 do 8, výhodně 6, Y je -CH₂-COOH a radioizotop je Y-90.
5. 5. Farmaceutická a/nebo diagnostická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje 35 sloučeninu vzorce I podle nároku 1 ve směsi s vhodnými vehikuly a/nebo excipienty.

   ... I o rsrr» IaXKh narinrů
6. 7. Farmaceutická a/nebo diagnostická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje komplex podle jednoho z nároků 2, 3 nebo 4 ve směsi s vhodnými vehikuly a/nebo excipienty.

   5
7. 8. Komplex podle jednoho z nároků 2, 3 nebo 4 pro použití jako protirakovinové radiofarmakum.
8. 9. Souprava pro radioterapii nebo diagnózu nádorů, vyznačující se tím, že alespoň jedna složka této soupravy obsahuje sloučeninu vzorce I podle nároku 1 nebo 2.