CZ306357B6 - Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci - Google Patents
Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ306357B6 CZ306357B6 CZ2002-2367A CZ20022367A CZ306357B6 CZ 306357 B6 CZ306357 B6 CZ 306357B6 CZ 20022367 A CZ20022367 A CZ 20022367A CZ 306357 B6 CZ306357 B6 CZ 306357B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- dna
- plant
- primer
- Prior art date
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 235
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 title abstract description 4
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 title description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 217
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 107
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 105
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 68
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 48
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 11
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 claims 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 93
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 31
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 31
- 239000000463 material Substances 0.000 description 31
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 29
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 23
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 23
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 19
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 14
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 10
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 8
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 5
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 5
- 101000708283 Oryza sativa subsp. indica Protein Rf1, mitochondrial Proteins 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N erucic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000007861 thermal asymmetric interlaced PCR Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N Brassidinsaeure Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O DPUOLQHDNGRHBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N Erucic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(O)=O URXZXNYJPAJJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 101100243082 Caenorhabditis elegans pde-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N docosan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000010499 rapseed oil Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 244000060924 Brassica campestris Species 0.000 description 1
- 235000005637 Brassica campestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 101100287651 Caenorhabditis elegans kbp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100094921 Caenorhabditis elegans rft-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- UAUDZVJPLUQNMU-UHFFFAOYSA-N Erucasaeureamid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCCCCCC(N)=O UAUDZVJPLUQNMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007152 anther development Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229960000735 docosanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- UAUDZVJPLUQNMU-KTKRTIGZSA-N erucamide Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCC(N)=O UAUDZVJPLUQNMU-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 125000004383 glucosinolate group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000010720 hydraulic oil Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009403 interspecific hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000005849 recognition of pollen Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000006032 tissue transformation Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Springs (AREA)
- Bending Of Plates, Rods, And Pipes (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Rostlina ozimé řepky olejky, semeno, buňka nebo pletivo rostliny, obsahující elitní událost RF-BN1 a/nebo MS-BN1. Dále je popsán způsob identifikace transgenní rostliny obsahující tuto elitní událost a souprava k provádění tohoto způsobu.
Description
Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci
Oblast techniky
Tento vynález se týká rostlin ozimé řepky olejky, konkrétně dvojice rostlin ozimé řepky olejky, která je obzvláště vhodná pro produkci hybridních semen. Konkrétněji, jedna rostlina je charakterizována tím, že je to rostlina se samčí sterilitou, díky přítomnosti genu samčí sterility v jejím genomu, zatímco druhá je charakterizována tím, že nese gen obnovující fertilitu, který je schopný zabránit aktivitě genu samčí sterility. Pár rostlin ozimé řepky olejky podle vynálezu spojuje schopnost vytvářet hybridní semena s optimálním celkovým agronomickým výkonem, genetickou stabilitou a adaptabilitou k různému genetickému pozadí.
Všechny dokumenty citované v tomto textu jsou formou odkazu součásti předkládaného popisu.
Dosavadní stav techniky
Fenotypová exprese transgenu v rostlině je určena jak strukturou genu samotného, tak jeho lokalizaci v rostlinném genomu. Současně přítomnost transgenu v odlišných místech genomu ovlivňuje celkový fenotyp rostliny odlišným způsobem. Agronomicky nebo průmyslově úspěšné vnesení komerčně zajímavých znaků do rostliny metodami genových manipulací může být značně zdlouhavý postup závislý na mnoha různých faktorech. Skutečná transformace a regenerace geneticky transformovaných rostlin jsou pouze prvními kroky v celé řadě selekčních kroků, která zahrnuje extenzivní genetickou charakterizaci, další šlechtění a vyhodnocení v polních pokusech.
Řepka olejka (Brassica napus, AACC, 2n=38) je přírodní hybrid vzniklý mezidruhovou hybridizací mezi brukví zelnou (Brassica oleracea, CC, 2n = 18) a brukví tuřínem (Brassica campestris, AA, 2n = 20). Ozimá řepka olejka se vysévá v průběhu posledních 10 dnů srpna a prvních deseti dnů září a sklízí se následující rok v červenci, neboť vyžaduje období s nízkou teplotou pro vernalizaci. Rychleji rostoucí jarní řepky se sejí na konci března až začátku dubna a sklizeň probíhá od poloviny srpna do září. Hlavní typy řepky olejky pěstované v současnosti jsou odrůdy s nízkým a vysokým obsahem erukové kyseliny. Tzv. dvojitě nízké (00) odrůdy obsahují nízkou (typicky méně než 1 %) hladinu erukových kyselin (které jsou pro člověka obtížně stravitelné) a nízké hladiny glukosinolátů (které činí vedlejší produkty nestravitelné pro zvířata). Běžné využití „00“ odrůd přestavuje olej pro lidskou spotřebu a krmivo pro zvířata s vysokým obsahem proteinů. K průmyslovému využití patří také základní suroviny pro léčiva a hydraulické oleje. Odrůdy řepky s vysokým obsahem erukové kyseliny (HEAR) jsou pěstované specificky pro jejich obsah erukové kyseliny - typicky 50 až 60 % oleje. Hlavním konečným použitím HEAR je výroba erukamidu, což je „kluzné činidlo“ používané při výrobě polyethanu. Malý podíl se využívá při výrobě behenylalkoholu, který se přidává k voskovitým surovým minerálním olejům pro zlepšení jejich tekutosti.
Rostliny řepky olejky jsou bisexuální a typicky ze 60 až 70 % samosprašné. Produkce hybridů a vnášení genetické variability jakožto základu pro selekci byly tradičně závislé na adaptaci v přírodě se vyskytujícího jevu jako je například self-inkompatibilita a cytoplazmatická samčí sterilita. Metody umělé kontroly opylení jako je například ruční sterilizace (emaskulace) nebo použití gametocidních látek nebyly ve šlechtění řepky více rozšířeny vzhledem k jejich omezené praktické použitelnosti a vysokým finančním nákladům.
Byly vyvinuty transgenní metody pro vytvoření samčí nebo samičí sterilní rostliny, které poskytují zajímavé alternativy k tradičním technikám.
- 1 CZ 306357 B6
EP 0 344 029 popisuje systém pro získání jaderné samčí sterility, přičemž rostliny jsou transformovány genem samčí sterility, který obsahuje například DNA kódující bamázu, který je řízen promotorem specifickým pro tapetum (specifické pletivo prašníků), PTA29, který po vnesení do rostliny zajišťuje selektivní destrukci buněk tapeta. Transformace rostlin tabáku a řepky olejky takovým chimérickým genem vedlo k rostlinám, u kterých bylo zcela zabráněno tvorbě pylu (Mariáni et al. 1990, Nature 347: 737-741).
Pro obnovu fertility v potomstvu rostlin se samčí sterilitou byl vytvořen systém, kdy je samčí sterilní rostlina křížena s transgenní rostlinou nesoucí gen obnovující fertilitu, který je po expresi schopen snížit nebo zcela zrušit aktivitu genu samčí sterility (viz US 5 689 041, US 5 792 929). Takový gen obnovující fertilitu je umístěn pod kontrolu promotoru řídicího expresi alespoň v buňkách toho typu, kde je gen samčí sterility exprimován. Mariani et al. (1992. Nature 384387) prokázali, že u řepky olejky sterilita kódovaná genem pTA29-barnáza může být obnovena chimérickým genem pTA29-barstar.
Cytochemická a histochemická analýza vývoje prašníků u rostlin Brassica napus obsahujících samotný chimérický gen pTA29:bamáza nebo pTA29:barstar je popsána v publikaci De Block a De Brouwer (1993, Planta 189:218-225).
Úspěšné transformace rostlin druhů Brassica bylo dosaženo řadou metod včetně infekce užitím Agrobacterium (jak bylo popsáno například v EP 0 116 718 a EP 0 270 882), ostřelováním mikročásticemi - biobalistickou metodou (jak bylo popsáno například Chen et al., 1994, Theor. Appl. Genet. 88:187-192) a pomoci přímého příjmu DNA (jak bylo popsáno například De Block et al. 1989, Plant Physiol. 914:694-701, Poulsen 1996, Plant Breeding 115:209225).
Avšak žádná z citovaných publikací nepopisovala ani nenavrhovala řešení popsané v předkládané přihlášce.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká rostliny ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny, obsahující elitní událost RF-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma příměry majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, přičemž rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletiva jsou připravitelná ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
Dále se předkládaný vynález týká shora uvedené rostliny, semene, rostlinné buňky nebo pletiva, které dále obsahují elitní událost MS-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma příměry majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejich buněk nebo pletiv, obsahujících elitní událost MS-BN1, který zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. C. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejich buněk nebo pletiv obsahujících elitní událost RF-BN1, který zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. C. 23 a SEKV. ID. Č.41.
-2CZ 306357 B6
Vynález se také týká soupravy pro identifikaci transgenní rostliny, jejich buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN1, přičemž tato souprava obsahuje PCR primery, z nichž jeden rozpoznává cizorodou sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 2 a další rozpoznává 5' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
Dále se vynález týká soupravy pro identifikaci elitní události MS-BN1 v biologických vzorcích, která obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS—BN1 v SEKV. ID. Č. 18.
Vynález se také týká soupravy pro identifikaci elitní události MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, tato souprava obsahuje alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvenci, která odpovídá (neboje komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 a 100 % se specifickým úsekem MS-BN1 a/nebo alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvenci, která odpovídá (nebo je komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % se specifickým úsekem RF-BN1. Výhodně sekvence sondy odpovídá specifickému úseku obsahujícímu část 5' nebo 3' sousedícího úseku MS-BN1 a/nebo RF-BN1. Nejvýhodněji specifická sonda má (neboje komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 a 100 % s rostlinnou DNA sekvenci v SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BN1 nebo s rostlinnou DNA sekvenci v SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BN1.
Výhodně souprava podle vynálezu obsahuje, kromě primeru, který specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BN1 a/nebo RF-BN1, druhý primer, kteiý specificky rozpoznává sekvenci z MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v cizorodé DNA, pro použití v PCR identifikačním protokolu. Výhodně, souprava podle vynálezu obsahuje dva (nebo více) specifické primery, jeden, který rozpoznává sekvenci ve 3' hraničním úseku MS-BN1 a/nebo RF-BN1, nejvýhodněji sekvenci v rostlinné DNA úseku SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BN1 nebo v rostlinné DNA sekvenci SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BN1 a další, který rozpoznává sekvenci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v cizorodé DNA, v daném pořadí. Obzvláště výhodně primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. C. 19. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 19 a primer rozpoznávající cizorodou DNA MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. C. 12, popsáno v tomto textu. Obzvláště výhodně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku RF-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 41. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. C. 41 a primer rozpoznávající cizorodou DNA z RF-BN1 obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 23, popsáno v tomto textu.
Způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro odlišné účely, jako jsou například, ale bez omezení, následující: k identifikaci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v rostlinách, rostlinném materiálu nebo v produktech, jako jsou například, ale bez omezení, potraviny nebo krmné produkty (čerstvé nebo zpracované) obsahující nebo pocházející z rostlinného materiálu, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k identifikaci transgenního rostlinného materiálu pro účely segregace mezi transgenním a netransgenním materiálem, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k určování kvality (tj. procento čistého materiálu) rostlinného materiálu obsahujícího MS-BN 1 a/nebo RF-BN1.
Je třeba mít na mysli, že konkrétní provedení vynálezu jsou popsána závislými patentovými nároky.
-3 CZ 306357 B6
Objasnění výkresů
Následující detailní popis vynálezu uváděný jako příklad, aniž by omezoval vynález na popsaná specifická provedení, může/mohou být lépe pochopen ve spojení s doprovázejícími obrázky, jejichž seznam je následující:
Obr. 1. Plazmidová mapa pVEl 13
Obr. 2. Restrikční mapa získaná po štěpení MS-BN1 genomové DNA
Sekvence analyzované metodou „Southern blot“: dráha 1, MS-BN1 DNA štěpená EcoRI, dráha 2, MS-BN1 DNA štěpená EcoRV, dráha 3, MS-BN1 DNA štěpená Hpal, dráha 4, MS-BN1 DNA štěpená AfUII, dráha 5, MS-BN1 DNA štěpená Ndel, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 7, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHW107 štěpená BamHI.
Obr. 3. Restrikční mapa získaná po štěpení RF-BN1 genomové DNA
Sekvence analyzované metodou „Southern blot“: dráha 1, RF-MS1 DNA štěpená BamHI, dráha 2, RF-BN1 DNA štěpená EcoRI, dráha 3, RF-BN1 DNA štěpená EcoRV, dráha 4, RF-BN1 DNA štěpená HindlII, dráha 5, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHWl 18 štěpená BamHI.
Obr. 4. PCR analýza odlišných linií s použitím MS-BN 1 PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující transgenní událost MS-BN1, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrola (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík“).
Obr. 5. PCR analýza odlišných linii s použitím RF-BN1 PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující transgenní událost RF-BN1, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky - rostliny obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrol (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík“).
Detailní popis
Termín „gen“, jak se v tomto textu používá, se týká kterékoliv DNA sekvence obsahující několik operativně spojených DNA fragmentů, jako je například promotor a 5' netranslatovaný úsek (5'UTR), které spolu tvoří úsek promotoru, kódující úsek (který může nebo nemusí kódovat protein) a netranslatovaný 3' úsek (3'UTR) obsahující polyadenylační místo. Typicky v rostlinných buňkách 5'UTR, kódující úsek a 3'UTR jsou transkribovány na RNA, která, v případě genu kódujícího protein, je translatována na protein. Gen může obsahovat další DNA fragmenty, jako jsou například introny. Jak se používá v tomto textu, genetický lokus je poloha daného genu v genomu rostliny.
Termín „chimérický“ při popisu genu nebo DNA sekvence je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence obsahuje alespoň dva funkčně relevantní DNA fragmenty (jako je například promotor, 5'UTR, kódující úsek, 3'UTR, intron), které nejsou přirozeně spojeny jeden s druhým a pocházejí například z odlišných zdrojů.
Termín „cizorodý“ při popisu genu nebo DNA sekvence vzhledem k rostlinným druhům je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence není přirozeně nalézána v těchto rostlinných druzích
-4 CZ 306357 B6 nebo není přirozeně nalézána v tomto genetickém lokusu v těchto rostlinných druzích. Termín „cizorodá DNA“ je použit v tomto textu při popisu DNA sekvence, která byla vnesena do genomu rostliny jako výsledek transformace.
Termín „transformující DNA“, jak se v tomto textu používá, se týká rekombinantní DNA molekuly použité pro transformace. Transformující DNA obvykle obsahuje alespoň jeden „požadovaný gen“ (např. chimérický gen), který je schopen poskytnout transformované rostlině jednu nebo více specifických vlastností.
Termín „rekombinantní DNA molekula“ je použit jako příklad a tedy může zahrnovat izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která může být DNA a která může být získána rekombinantními nebo i dalšími postupy.
Termín „transgen“, jak se používá v tomto textu, se týká požadovaného genu, který byl vnesen do genomu rostliny. Termín „transgenní rostlina“ se týká rostliny obsahující alespoň jeden transgen v genomu všech svých buněk.
Cizorodá DNA přítomná v rostlinách podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje dva požadované geny, konkrétněji, buďto gen samčí sterility a gen rezistence k herbicidu, nebo gen obnovující fertilitu a gen rezistence k herbicidu.
Termín „gen samčí sterility“, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který po expresi v rostlině činí rostlinu neschopnou produkce fertilního, životaschopného pylu. Příkladem genu samčí sterility je gen obsahující DNA sekvenci kódující bamázu pod kontrolou promotoru směrujícího expresi do buněk tapeta. Konkrétněji, gen samčí sterility podle předkládaného vynálezu je gen „PTA29-barnáza“ popsaný v tomto textu.
Termín „gen obnovující fertilitu“, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který svou expresí v rostlině obsahující gen samčí sterility, je schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility, čili obnovit fertilitu rostliny. Konkrétněji gen obnovující fertilitu obsahuje DNA kódující protein nebo polypeptid schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility pod kontrolou promotoru směřujícího expresi alespoň do buněk, ve kterých je gen samčí sterility exprimován. Konkrétněji, gen obnovující fertilitu podle předkládaného vynálezu je gen „TA29-barstar“, jak je popsán v tomto textu.
Inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu je typicky výsledkem transformace buňky nebo pletiva (nebo dalších genetických manipulací). Konkrétní místo inkorporace je buďto náhodné, neboje v předem určené lokalizaci (pokud je použit způsob cílené integrace).
Cizorodá DNA může být charakterizována lokalizací a konfigurací v místě inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu. Místo v rostlinném genomu, kde byla vložena rekombinantní DNA, se také označuje jako „inzerční místo“ nebo „cílové místo“. Inzerce (vložení) transgenu do rostlinného genomu může být spojena s delecí rostlinné DNA, označovanou jako „delece cílového místa“.
Termíny „sousedící úsek“ nebo „sousedící sekvence“ („flanking region“ a „flanking sequence“), jak se v tomto textu používají, se týkají sekvence alespoň délky 20 bp, výhodně alespoň 50 až 5000 bp rostlinného genomu, která je lokalizována buďto v protisměru a je bezprostředně přiléhající, nebo po směru a je bezprostředně přiléhající k cizorodé DNA. Transformační postupy vedoucí k náhodné integraci cizorodé DNA poskytují transformanty s odlišnými sousedícími úseky, které jsou charakteristické a unikátní pro každou transformantu. Když je transgen vnesen do rostliny metodou tradičního křížení, jeho inzerční místo v rostlinném genomu nebo jeho sousedící úseky se obecně nezmění. Termín „inzerční úsek“, jak se v tomto textu používá, se týká úseku odpovídajícímu alespoň 40 bp, výhodně alespoň 100 bp až více než 10 000 bp, obsaženému v protisměru a po směru sousedících úsecích transgenu (tj. obklopujících transgen) v rostlinném
-5CZ 306357 B6 genomu (netransformovaném) včetně inzerčního místa (a případné delece cílového místa). S ohledem na malé rozdíly v rámci biologického druhu způsobeného mutacemi, inzerční úsek si zachová alespoň 85%, výhodně 90%, výhodněji 95% a nejvýhodněji 100% sekvenční identitu se sekvencí obsahující úseky v protisměru a po směru sousedící s cizorodou DNA v rostlině tohoto druhu.
Exprese požadovaného genu se týká skutečnosti, že gen uděluje rostlině jeden nebo více fenotypových znaků (např. tolerance k herbicidu), které byly zamýšleny, že budou přeneseny tím, že se vnese rekombinantní DNA molekula - transformující DNA - použitá při transformaci (na základě struktury a funkce části nebo všech požadovaných genů).
Termín „událost“ je definován jako (umělý) genetický lokus, který v důsledku genetické manipulace nese cizorodou DNA obsahující alespoň jednu kopii požadovaného genu. Typické alelové stavy události jsou přítomnost nebo absence cizorodé DNA. Jak se v tomto textu specificky používá „MS“ událost a „RF“ událost se týkají události nesoucí gen „TA2 9-barnázy“ a gen „TA29-barstar“, v uvedeném pořadí. Událost je charakterizována fenotypově expresí jednoho nebo více transgenu. Na genetické úrovni, událost je část genetické výbavy rostlin. Na molekulární úrovni je událost charakterizována restrikční mapou (např. určenou metodou Southern blotting) a/nebo v protisměru a/nebo po směru sousedící sekvenci transgenu a/nebo molekulární konfigurací transgenu. Obvykle transformace rostlin transformující DNA obsahující alespoň jeden požadovaný gen vede k mnohočetným událostem, z nichž každá je jedinečná.
Termín „elitní událost“, jak se v tomto textu používá, je událost, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří události, získané transformací stejnou transformující DNA nebo zpětným křížením s rostlinou získanou takovou transformací, na základě exprese a stability transgenu a jeho kompatibility s optimálními agronomickými charakteristikami rostlin, které ho obsahují. Tedy kritéria pro výběr elitní události jsou jedno nebo více, výhodně dvě nebo více, nejvýhodněji všechna následující:
a) přítomnost transgenu neohrožuje další požadované vlastnosti rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickým výkonem nebo komerční hodnotou,
b) událost je charakterizována dobře definovanou molekulární konfiguraci, která je stabilně děděna a pro kterou lze vyvinout vhodný diagnostický nástroj ke kontrole identity,
c) požadovaný gen (nebo geny) v transgenu projevuje správnou, vhodnou a prostorově i časově trvalou expresi fenotypu, jak při heterozygotním (nebo hemizygotním), tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.
Je výhodné, když je cizorodá DNA asociována s polohou v rostlinném genomu, která dovoluje introgresi do požadovaného komerčního genetického pozadí.
Status události jako elitní události je potvrzen introgresi elitní události do odlišného relevantního genetického pozadí a pozorováním shody s jedním, dvěma nebo všemi z výše uvedených kritérií a), b) a c).
Navíc pro transgeny kódující samčí sterilitu a obnovu fertility popsané výše v tomto textu, výběr elitní události je také určen kompatibilitou mezi těmito událostmi, konkrétně tím, že potomstvo pocházející z křížení mezi rostlinou nesoucí událost samčí sterility a rostlinou nesoucí událost obnovitele fertility, ve kterém jsou obě události přítomny, má následující vlastnosti:
a) adekvátní fenotypovou expresi fenotypu obnovitele fertility, tj. samci fertility, a £ _
b) fenotypovou expresi v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.
Termín „elitní událost“ se tedy týká genetického lokusu obsahujícího transgen, který odpovídá výše popsaným kritériím. Rostliny, rostlinný materiál nebo potomstvo, jako je například semeno, mohou obsahovat jeden nebo více elitních událostí ve svém genomu.
„Diagnostický nástroj“ vyvinutý k identifikaci elitní události rostlin nebo rostlinného materiálu obsahujících elitní událost, je založen na specifických genomových charakteristikách elitní události, jako je například specifická restrikční mapa genomového úseku obsahujícího cizorodou DNA a/nebo sekvence úseků sousedících s transgenem.
Termín „restrikční mapa“, jak se v tomto textu používá, se týká souboru „Southern blot“ profilů získaných po štěpení rostlinné genomové DNA konkrétním restrikčním enzymem nebo souborem restrikčních enzymů a hybridizaci se sondou sdílející sekvenční podobnost s transgenem v podmínkách standardní stringence. Podmínky standardní stringence, jak se v tomto textu používá, označují podmínky pro hybridizaci popsané zde nebo jako podmínky obvyklé pro hybridizaci jak byly popsány v příručce Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), které například mohou zahrnovat následující kroky: 1) imobilizace fragmentů rostlinné genomové DNA na filtru, 2) prehybridizace filtru po dobu 1 až 2 hodin v podmínkách: 42 °C v 50% formamidu, 5X SSPE, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS nebo po dobu 1 až 2 hodin v 68 °C v 6X SSC, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS, 3) přidáni hybridizační sondy, která byla označena, 4) inkubace po dobu 16 až 24 hodin, 5) promýváni filtru po dobu 20 minut při teplotě místnosti v IX SSC, 0,1% SDS, 6) promýváni třikrát po dobu 20 minut, vždy v 68 °C v 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 7) expozice filtru po dobu 24 až 48 hodin na rentgenový film v -70 °C s intenzifikačním stínítkem.
Vzhledem k přítomnosti (endogenních) restrikčních míst v rostlinném genomu před inkorporací cizorodé DNA, inzerce cizorodé DNA změní specifickou restrikční mapu tohoto genomu. Tedy, konkrétní transformanta nebo z ní pocházející potomstvo mohou být identifikovány pomocí jednoho nebo více specifických restrikčních profilů. Podmínky pro stanovení restrikční mapy události jsou popsány v „protokolu pro identifikaci restrikční mapy“. Alternativně, jakmile jeden nebo oba úseky sousedící s transgenem byly sekvencovány, mohou být vyvinuty PCR sondy, které specificky rozpoznávají tyto sekvence podle „PCR identifikačního protokolu“. Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující elitní událost mohou být identifikovány testováním podle PCR identifikačního protokolu použitím těchto specifických primerů.
Jak se používá v tomto textu, „biologický vzorek“ je vzorek rostliny, rostlinný materiál nebo produkty obsahující rostlinný materiál. Termín „rostlina“ zahrnuje také rostlinné pletiva, v jakémkoliv stadiu dospělosti, ozimé řepky olejky (Brassica napus), a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z takových rostlin, včetně, avšak bez omezení, jakýchkoliv semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamet, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů. „Rostlinný materiál“, jak se v tomto textu používá, se týká materiálu, který je získán nebo pochází z rostlin. Produkty obsahující rostlinný materiál jsou potraviny, krmivá, a nebo další produkty, které jsou vyráběny s použitím rostlinného materiálu nebo mohou být kontaminovány rostlinným materiálem. Je třeba rozumět, že v kontextu předkládaného vynálezu, takové biologické vzorky jsou výhodně testovány na přítomnost nukleových kyselin specifických pro MS-BN1 a/nebo RF-BN1, ukazujících na přítomnost nukleových kyselin ve vzorcích. Tedy metody označované zde jako metody pro identifikaci elitní události MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, se výhodně týkají identifikace nukleových kyselin, které obsahují elitní událost, v biologických vzorcích.
Termín „souprava“, jak se v tomto textu používá, se týká souboru reagencií pro účely provádění způsobu podle vynálezu, konkrétněji, identifikace elitní události MS-BN1 a/nebo RF-BN1
- 7 CZ 306357 B6 v biologických vzorcích. Konkrétněji, výhodné provedení soupravy podle vynálezu obsahuje alespoň jeden nebo dva specifické oligonukleotidové primery, jak bylo popsáno výše. Volitelně, souprava může dále obsahovat jakékoliv další reagencie popsané v tomto textu v PCR identifikačním protokolu. Alternativně, podle dalšího provedení vynálezu, souprava může obsahovat specifické sondy, jak bylo popsáno výše, které specificky hybridizují s nukleovou kyselinou biologického vzorku k identifikaci přítomnosti MS-BN1 a/nebo RF-BN1 ve vzorku. Volitelně, souprava může ještě dále obsahovat jakékoliv další reagencie (jako je například, ale bez omezení, hybridizační pufr, značka) pro identifikaci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, s použitím specifických sond.
Souprava podle vynálezu může být použita a její složky mohou být specificky upraveny, pro účely kontroly kvality (např., čistota jednotlivých šarží semen), detekce elitní události v rostlinném materiálu nebo materiálu obsahujícím rostlinný materiál nebo pocházejícím z rostlinného materiálu, jako jsou například, ale bez omezení, potravinářské produkty nebo krmivá.
Předkládaný vynález se týká vývoje souboru elitních událostí u ozimé řepky olejky, MS-BNÍ a RF-BN1, rostlin, obsahujících tyto události, potomstva získaného křížením těchto rostlin a také rostlinných buněk nebo rostlinného materiálu získaného z těchto událostí. Rostliny obsahující elitní událost MS-BN1 byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHW107, jak bylo popsáno v příkladu 1. Rostliny obsahující elitní událost RF-BN1 byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHWl 18, jak je také popsáno v příkladu 1.
Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události MS-BN1 obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu bamázy pod kontrolou promotoru směrujícího expresi selektivně do buněk tapeta (nazvaná „TA29-bamáza“). TA29 promotor má „tapetum selektivní“ expresní profil u řepky olejky (De Block a Debrouwer, Planta 189:218-225, 1993). Exprese genu TA29-barnázy v rostlinách ozimé řepky olejky vede k destrukci tapeta, což činí rostliny sterilní - jde o rostliny se samčí sterilitou (Mariani et al, 1990, výše). Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události RF-BN1 obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu barstar pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (nazvaná „PTA29-barstar“). Exprese genu TA29barstar v rostlinách ozimé řepky olejky v přítomnosti genu „TA29-barnázy“ zabraňuje aktivitě bamázy v buňkách tapeta, a tím zabraňuje destrukci tapeta, a tudíž obnovuje fertilitu těchto rostlin (Mariani et al. 1992, výše).
Obě rekombinantní DNA, které se užívají pro vytvoření elitní událost MS-BN1 a RF-BN1, navíc obsahují DNA sekvence kódující enzym fosfinotricinacetyltransferázu a 35S promotor z viru mozaiky květáku (CMV), kde sekvence kódující fosfinotricinacetyltransferázu je pod kontrolou 35S promotoru (nazvaná „35S-bar“). 35S promotor má konstitutivní expresní profil u řepky olejky, což znamená významnou expresi ve většině buněčných typů v průběhu většiny životního cyklu rostliny. Exprese genu 35S-bar v rostlině řepky olejky poskytuje rostlině rezistenci k herbicidním sloučeninám fosfinotricinu, bialafosu nebo glufosinátu, nebo obecněji, inhibitorům glutaminsyntetázy nebo jejich solím nebo optickým izomerům.
Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující MS-BN1 může být identifikován podle protokol identifikace restrikční mapy popsaného pro MS-BN1 v příkladu 5 v tomto textu. Stměné, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem několika (výhodně dvou až pěti) z následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 3942 bp HindlII fragmentem plazmidu pTHW107 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym, který byl použit, se určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:
- EcoRI: jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden fragment více než 14 kbp,
-8CZ 306357 B6
- EcoRV: jeden fragment velikosti mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a jeden fragment více než 14 kbp,
- Hpal: jeden fragment velikosti mezi 1986 a 2140 bp, výhodně přibližně 1990 bp a jeden bp jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,
- AfUII: jeden fragment velikosti mezi 514 a 805 bp, výhodně přibližně 522 bp, jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden fragment velikosti mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,
- Ndel: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp.
Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda. Fragment delší než 14 kbp byl určen jako fragment délky mezi 14 a 40 kbp, když extrakce DNA byla provedena způsobem podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol. 3, p. 19-21).
Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, konkrétně s alespoň čtyřmi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikčními enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost MS-BN 1.
Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující MS-BN1 mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro MS-BN 1 v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplifikována PCR (polymerázovou řetězovou reakci) s použitím příměrů, které specificky rozpoznávají sousední sekvence MS-BN1, výhodně rozpoznávající 5' nebo 3' sousední sekvence MS-BN1 popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. C. 19 a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. C. 12. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytne fragment mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, rostliny ozimé řepky olejky byly identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost MS-BN 1.
Rostliny obsahující MS-BN1 jsou fenotypové charakterizovány tím, že za absence genu obnovitele fertility v jejich genomu projevují samčí sterilitu. Rostliny se samčí sterilitou jsou definovány jako rostliny, které nejsou schopné vytvářet fertilní, životaschopný pyl.
Rostliny obsahující MS-BN1 mohou být například získány ze semen obsahujících MS-BN1 uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny pak mohou být dále množeny pro přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.
Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující RF-BN1 mohou být identifikovány podle protokolu identifikace restrikční mapy popsaného pro RF-BN1 v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem (výhodně dvěma až čtyřmi) z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV a HindlII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHWl 18 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym se pak určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:
- BamHI: jeden fragment délky mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden fragment délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden fragment délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně přibližně 6500 bp,
-9CZ 306357 B6
- EcoRI: jeden fragment délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden fragment délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva fragmenty délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp ajeden přibližně 10 kbp,
- EcoRV: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14 057 bp, výhodně jeden přibližně 5,4 kbp a přibližně 8 kbp,
- HindlII: jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva fragmenty mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden přibližně 2565 bp ajeden přibližně 2635 bp,
Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda.
Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikčními enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost RF-BN 1.
Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující RF-BN1 mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro RF-BN1 v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplifikována PCR s použitím primerů, který specificky rozpoznává sousední sekvence RF-BN1, výhodně 5' nebo 3' hraniční sekvence RF-BN1 popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 41, a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 23. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytuje fragment mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, rostliny ozimé řepky olejky jsou identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost RF-BN1.
Rostliny obsahující RF-BN1 jsou charakterizovány tím, že gen barstar je exprimován v buňkách tapeta. Produkce genu v buňkách tapeta rostlin nemá ani prospěšný ani škodlivý účinek na tvorbu pylu, jak bylo ukázáno (Mariani et al. 1992, výše). Tedy za absence genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29-barstar nemá za následek pozorovatelný fenotyp. V přítomnosti genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29-barstar poskytuje rostlinu s obnovenou fertilitou, tedy fertilní fenotyp. Fenotyp rostliny s obnovenou fertilitou je definován jako rostlina, která, i přes přítomnost genu samčí sterility ve svém genomu, je schopna produkce fertilního, životaschopného pylu.
Rostliny obsahující RF-BN 1 mohou být například získány ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny mohou být dále množeny a/nebo použity v obvyklých šlechtitelských postupech k přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.
Rostliny obsahující MS-BN1 a/nebo RF-BN 1 jsou také charakterizovány jejich toleranci ke glufosinátu, což v kontextu předkládaného vynálezu zahrnuje rostliny, které jsou tolerantní k herbicidu Liberty™. Tolerance k herbicidu Liberty™ je definována kritériem, že postřik rostlin ve stadiu tří až čtyřech listů (3V až 4V) dávkou alespoň 200 gramů účinné složky/hektar (g.a.i./ha), výhodně 400 g.a.i./ha a případně až 1 600 g.a.i./ha, nezahubí rostliny. Rostliny obsahující MSBN1 a/nebo RF-BN 1 mohou být dále charakterizovány přítomností fosfinotricinacetyltransferázy v buňkách, která se stanoví PAT testem (De Block et al, 1987, supra).
Rostliny ozimé řepky olejky podle vynálezu mohou být pěstovány obvyklým způsobem. Přítomnost genu 35S-bar zajišťuje, že jsou tolerantní ke glufosinátu. Tudíž plevele na polích, kde jsou tyto rostliny ozimé řepky olejky pěstovány, mohou být plevely hubeny aplikací herbicidů obsahujících glufosinát jako účinnou složku (jako je například Liberty™).
-10CZ 306357 B6
Rostliny obsahující MS-BN 1 a/nebo RF-BN1 jsou také charakterizovány tím, že mají agronomické vlastnosti, které jsou srovnatelné s komerčně dostupnými odrůdami ozimé řepky olejky v USA. Relevantní agronomické vlastnosti jsou: výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdomost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.
Bylo pozorováno, že přítomnost cizorodé DNA v inzerčních úsecích v genomu rostlin ozimé řepky olejky (Brassica napus) popsaných v tomto textu, konkrétněji v inzerčních místech genomu rostlin ozimé řepky olejky, poskytují zvláště zajímavé fenotypové a molekulární vlastnosti rostlinám, které obsahují tyto události. Konkrétněji, přítomnost cizorodé DNA v těchto konkrétních úsecích genomu těchto rostlin vede k trvalé fenotypové expresi transgenu, aniž by se významně zhoršil kterýkoliv z aspektů požadované agronomické výkonnosti rostliny, což činí tyto rostliny zejména vhodné pro produkci hybridní ozimé řepky olejky. Tedy, inzerční úseky odpovídající sekvencím SEKV. ID. Č. 22 a SEKV. ID. Č. 34, a v nich konkrétně inzerční místo MS-BN1 a RF-BN1, jsou zejména vhodné pro vnesení požadovaných genů. Konkrétněji, inzerční úseky MS-BN1 (SEKV. ID. Č. 22) a RF-BN1 (SEKV. ID. Č. 34) nebo inzerční místa MSBN1 a RF-BN1, v daném pořadí, jsou zvláště vhodná pro vnesení plazmidů obsahujících gen samčí sterility a gen obnovující fertilitu, v daném pořadí, a zajišťují optimální expresi každého z těchto genů nebo obou genů v rostlině aniž by se zhoršila její agronomická výkonnost.
Rekombinantní DNA molekula může být specificky vložena do inzerčního úseku metodou cílené inzerce. Tyto metody jsou odborníkům dobře známy a patří k nim například homologní rekombinace s použitím rekombinázy, jako například, ale bez omezení, FLP rekombináza ze Saccharomyces cervisiae (Patent US 5 527 695), CRE rekombináza z fága Pl Escherichia coli (publikovaná PCT přihláška WO 91/09 957, rekombináza z pSRI Saccharomyces rouxii (Araki et al. 1985, J. Mol. Biol. 182:191-203) nebo rekombinační systém fága lambda jak byl popsán například v patentu US 4 673 640.
Termín „sekvenční identita“, ve vztahu k nukleotidové sekvenci (DNA nebo RNA), se týká hodnoty počtu poloh s identickým nukleotidem děleného počtem nukleotidů v kratší ze dvou srovnávaných sekvencí. Porovnání dvou nukleotidových sekvencí se provádí algoritmem podle Wilbura a Lipmanna (Wilbur a Lipmann, 1983) s použitím parametrů: velikost okna 20 nukleotidů, délka slova 4 nukleotidy a penalta za mezeru 4. Počítačově prováděná analýza a interpretace sekvenčních dat, včetně srovnání sekvencí jak bylo popsáno výše, může být např. výhodně prováděna pomocí programů Intelligenetics™ Suite (Intelligenetics lne., CA). Sekvence jsou „v podstatě podobné“ když tyto sekvence mají sekvenční identitu alespoň přibližně 75 %, zejména alespoň přibližně 80 %, konkrétněji alespoň přibližně 85 %, a zvláště přibližně 90 %, obzvláště přibližně 95 %, a obzvláště přibližně 100 %, a zejména obzvláště jde o sekvence zcela identické. Je jasné, že kdyžjsou RNA sekvence v podstatě podobné, nebo mají jistý stupeň sekvenční identity s DNA sekvencí, thymin (T) v DNA sekvenci se považuje za shodný s uracilem (U) v RNA sekvenci.
Jak se používá v tomto textu, termín „obsahující“ je třeba chápat jako specifikující přítomnost dané vlastnosti, hodnoty, kroku nebo složky, což přitom nevylučuje přítomnost nebo přidání jedné nebo více dalších vlastností, hodnot, kroků nebo složek nebo jejich skupin. Tedy např. nukleová kyselina nebo protein obsahující sekvenci nukleotidů nebo aminokyselin může obsahovat více nukleotidů nebo aminokyselin, než které jsou uvedeny, tj. může být např. vložena ve větší nukleové kyselině nebo proteinu. Chimérický gen obsahující DNA sekvenci, která je funkčně nebo strukturně definována, může obsahovat ještě další DNA sekvence, atd.
Následující příklady popisují vývoj a charakteristické vlastnosti rostlin ozimé řepky olejky obsahující elitní události MS-BN1 a RF-BN1.
Pokud není uvedeno jinak, všechny techniky rekombinantní DNA byly prováděny podle standardních protokolů popsaných v příručce Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Labora
-11 CZ 306357 B6 tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, a nebo v dílech 1 a 2 příručky Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardní materiály a metody pro rostlinnou molekulární genetiku byly popsány v příručce Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy, publikované v BIOS Scientific Publications Ltd (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.
V popisu a příkladech se odvolává na následující sekvence:
SEKV. ID. Č. 1: plazmid pTHW107
SEKV. ID. Č. 2: plazmid pTHWl 18
SEKV. ID. Č. 3: primer 248
SEKV. ID. Č. 4: primer 249
SEKV. ID. Č. 5: primer 247
SEKV. ID. Č. 6: primer 250
SEKV. ID. Č. 7: primer 251
SEKV. ID. Č. 8: primer 254
SEKV. ID. Č. 9: primer 258
SEKV. ID. Č. 10: primer SP6
SEKV. ID. Č. 11: primer T7
SEKV. ID. Č. 12: primer 201 (BNA01)
SEKV. ID. Č. 13: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN1
SEKV. ID. Č. 14: primer 611
SEKV. ID. Č. 15: primer 259
SEKV. ID. Č. 16: primer 260
SEKV. ID. Č. 17: primer 24
SEKV. ID. Č. 18: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1
SEKV. ID. Č. 19: primer 51 (BNA02)
SEKV. ID. Č. 20: primer 48
SEKV. ID. Č. 21: sekvence obsahující deleci cílového místa MS-BN 1
SEKV. ID. Č. 22: inzerční úsek MS-BN 1
SEKV. ID. Č. 23: primer 193 (BNA03)
SEKV. ID. Č. 24: sekvence obsahující 5' sousedící úsek 1ZP-BN1
SEKV. ID. Č. 25: primer 286
SEKV. ID. Č. 27: primer 315
SEKV. ID. Č. 28: primer 316
SEKV. ID. Č. 29: primer 288
SEKV. ID. Č. 30: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN1
SEKV. ID. Č. 31: primer 269
SEKV. ID. Č. 32: primer 283
SEKV. ID. Č. 33: primer 284
SEKV. ID. Č. 34: integrační úsek RF-BN 1
SEKV. ID. Č. 35: primer 57
SEKV. ID. Č. 36: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN 1 v rostlině řepky olejky
SEKV. ID. Č. 37: primer 68
SEKV. ID. Č. 38: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky
SEKV. ID. Č. 39: sekvence obsahující 5' sousedící úsek RF-BN 1 v rostlině ozimé řepky olejky
-12CZ 306357 B6
SEKV. ID. Č. 40: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky
SEKV. ID. Č. 41: primer 268 (BNA04)
SEKV. ID. Č. 42: primer BNA05
SEKV. ID. Č. 43: primer BNA06
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Transformace rostlin Brassica napus genem samčí sterility a genem obnovitele fertility
a) konstrukce chimérické DNA obsahující gen bamázy pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (pTHW107).
Plazmid pTHW107 (SEKV. ID. Č. 1) byl v podstatě získán z intermediátního vektoru pGSVl. PGSV1 je sám odvozen z pGSC 1700 (Cornelissen a Vandewielle, 1989), ale obsahuje umělý Túsek, který tvoří levá a pravá hraniční sekvence TL-DNA formy pTiB6S3 a multilinker klonovacích míst umožňující inzerci chimérického genu mezi T-DNA hraniční repetice. Vektor PGSVl je poskytnut s genem barstar v hlavním čtecím rámci plazmidu, s regulačními signály pro expresi v E. coli.
Úplný popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHW 107 je uveden v tabulce 1.
Tabulka 1: T-DNA plazmidu pTHW107
| nt polohy | Orientace | Popis a odkazy |
| 1-25 | Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). | |
| 26-97 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 309-98 | Proti směru | 3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846). |
| 310-330 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru |
- 13 CZ 306357 B6
| 882-331 | Proti směru | Kódující sekvence genu bar ze Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519- 2523) . Dva N-koncové kodony kódujícího úseku bar divokého typu byly substituovány kodony ATG a GAC, v daném pořadí. |
| 2608-883 | Proti směru | Promotor genu malé podjednotky ribulóza1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759). |
| 2609-2658 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 2919-2659 | Proti směru | 260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573). |
| 2920-3031 | 3'netranslatovaný úsek po směru (downstream) od kódující sekvence barnázy z B. Amyloliquefaciens | |
| 3367-3032 | Proti směru | Kódující úsek genu barnázy z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913915) . |
- 14CZ 306357 B6
| 4877-3368 | Proti směru | Promotorový úsek anther-specifického (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403). |
| 4878-4921 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 4922-4946 | Repetice levé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) EMBO Journal 3: 835-846). |
b) Konstrukce chimérické DNA obsahující gen barstar pod kontrolou konstitutivního promotoru (pTHWl 18)
Plazmid pTHW118 (SEKV. ID. Č. 2) byl také v podstatě odvozen z intermediátního vektoru pGSV 1 (popsán výše). Kompletní popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHWl 18 je uveden v tabulce 2.
Tabulka 2: T-DNA plazmidu pTHWl 18
| nt polohy | Orientace | Popis a odkazy |
| 1-25 | Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846). | |
| 26-53 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru |
- 15 CZ 306357 B6
| 54-90 | Reziduálni sekvence z TL-DNA v repetici pravé hranice. | |
| 91-97 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 309-98 | Proti směru | 3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846). |
| 310-330 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 883-331 | Proti směru | Kódujicí sekvence genu rezistence k bialafosu (bar) ze Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). Dva kodony N-konce kódujícího úseku bar divokého typu byly nahrazeny kodony ATG a GAC, v daném pořadí. |
| 2608-883 | Proti směru | Promotor genu malé podjednotky ribulóza1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759). |
| 2609-2658 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru |
- 16CZ 306357 B6
| 2919-2659 | Proti směru | 260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573) . |
| 2920-2940 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 2941-2980 | 3'netranslatovaný úsek po směru (downstream) od barstar kódující sekvence z Bacillus amyloliguefaciens | |
| 3253-2981 | Proti směru | Kódující úsek genu barstar z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913915) . |
| 4762-3254 | Proti směru | Promotorový úsek anther-specifického (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403). |
| 4763-4807 | Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru | |
| 4808-4832 | Repetice levé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) EMBO Journal 3: 835-846). |
c) Transformace rostlin Brassica napus
Pro transformaci rostlin Brassica napus byl užit vektorový systém, který byl popsán v Deblaere et al. (1985, 1987). Vektorový systém sestává z kmene Agrobacterium a dvou plazmidových složek: 1) non-onkogenní Ti-plazmid (pGV400) a 2) intermediátní klonovací vektor založený na
- 17CZ 306357 B6 plazmidu pGSV 1. Non-onkogenní Ti-plazmid z něhož byla odstraněna T-oblast nese geny vir nezbytné pro přenos umělé T-DNA klonované do druhého plazmidu do rostlinného genomu. Kmeny Agrobacteria vzniklé triparentální konjugací mezi uvedenými složkami pak mohou být použity pro transformaci rostlin.
Selekce byla prováděna na fosfinotricinu (PPT) ve všech stadiích, s výjimkou regenerace rostlinek, která probíhala bez přítomnosti PPT, aby se urychlil růst. Tak byl připraven soubor primárních transformant (rostliny generace To).
Příklad 2
Vývoj genetických událostí
2.1. Charakterizace transgenní události
2.1.1. Analýza MS události metodou Southern blot
Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportar, 1, vol,3, p, 19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi konstrukty s geny bamázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:
Sonda „bamáza“: 478 bp Pstl-EcoRI fragment plazmidu pVEl 13
Sonda „bar“: 546 bp Ncol-BglII fragment plazmidu pDEl 10
Plazmidy pVEl 13 a pDEl 10 jsou popsány na obrázku 1 a v dokumentu WO 92/09 696, v uvedeném pořadí. Hybridizace MS událostí se sondou „barnáza“ poskytla 12 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou „bar“ poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U obou událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce. To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho fokusu.
2.1.2. Analýza RF události metodou Southern blot
Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol. 3, p,19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi konstrukty s geny barnázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:
Sonda „bamáza“: 436 bp HindlII-Pstl fragment plazmidu pVEl 13
Sonda „bar“: 546 bp Ncol-BglII fragment plazmidu pDEl 10
Hybridizace MS událostí se sondou „bamáza“ poskytla 3 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou bar poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U několika událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce.
To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho lokusu.
-18CZ 306357 B6
2.1.3. Obecný fenotyp a agronomické výkonnost rostlin
Rostliny T] generace u obou událostí MS a RF byly vyhodnoceny na řadu fenotypových znaků, jako je např. výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdomost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.
Linie byly hodnoceny jako podobné (nebo zlepšené) v uvedených agronomických charakteristikách ve srovnání s netransformovanou odrůdou a také s řadou kultivarů řepky olejky. V některých případech rostliny segregovaly z důvodu somaklonální variace projeden nebo více z výše uvedených znaků. Pokud to nevedlo k vnesení komerčně zajímavého fenotypového znaku, takové rostliny byly odstraněny.
2.2. vývoj linií nesoucích znaky MS nebo RF
Různé hemizygotní rostlinky To generace („Ms/-„ nebo „Rf/“) byly přeneseny z pletivových kultur do půdy ve skleníku. Přítomnost transgenu a počet genových kopií byly kontrolovány Southern blot analýzou, jak bylo popsáno výše. Rostliny byly ponechány do květu, a pak byla vyhodnocena sterilita nebo fertilita květů. Rostliny TO generace byly kříženy s rostlinami divokého typu rostliny (-/-) pro vytvoření TI semen (MsTl a RfTl). TI semena byla vyseta a dále pěstována ve skleníku. Rostliny byly pak hodnoceny na toleranci ke glufosinátu amonnému. Ms-Tl rostliny byly také hodnoceny na segregaci sterility/fertility (u nepostříkaných rostlin), zatímco Rf-Tl rostliny byly kontrolovány na fertilitu květů.
Ms-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami homozygotními pro gen obnovující fertilitu (Rf/Rf), pro produkci MsRf-Fl semen. Tato semena (Ms/-, Rf/- a -/-, Rf/-) byla vyseta ve skleníku a ošetřena postřikem Liberty™. Zbylé F1 potomstvo bylo vyhodnoceno na segregaci fertility/sterility pro ověření toho, zda znak samčí sterility může být adekvátně obnoven u Brassica napus (fertilita blízká 100 %).
Nejlepší události byly vybrány pro další testování. Ms-Tl rostliny byly kříženy s homozygotním obnovitelem fertility a semena byla vyseta na poli. Rostliny pak byly hodnoceny na toleranci k herbicidu Liberty™ (800 gramů účinné složky na hektar (g.a.i./ha), přičemž doporučená dávka pro rolníky je 400 g.a.i./ha), segregaci fertility/sterility a na obecné fenotypové vlastnosti. Linie, u kterých došlo ke 100% obnovení fertility a u kterých nebyly pozorovány žádné negativní změny ve fenotypu nebo agronomické výkonnosti (podrobně viz (d)) ve srovnání s isogenní kontrolou divokého typu, byly selektovány.
Rf-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami obsahujícími gen samčí sterility (Ms/-) pro produkci F1 semen. Tato semena byla pěstována ve skleníku, postříkána herbicidem Liberty™ a pak byla vyhodnocena obnova fertility (blízko ke 100 %).
Mezitím byl Rf-Tl rostliny samosprášeny pro získání generace SI. SI rostliny byly pěstovány ve skleníku, ošetřeny postřikem herbicidu Liberty™ a opět samosprášeny pro vytvoření generace S2, z S2 pak byly vybrány homozygotní rostliny.
2.3. Kombinace událostí MS a RF.
Vybrané Ms-Tl rostliny byly kříženy s vybranými Rf-S2 událostmi ve skleníku pro otestování obnovy fertility. Semena byla vyseta ve skleníku, na rostliny byl aplikován postřik Liberty™ a byla kontrolována fertilita květů.
- 19CZ 306357 B6
2.4. Testování MS a RF události v odlišném genetickém základu a v odlišné lokalizaci
Vybrané události byly vneseny do dvou odlišných genetických základů, které jsou heteroticky odlišné, k prokázání toho, že MS a RF události jsou plně funkční a neměly žádné negativní účinky na výnos nebo kvalitu u žádného z testovaných základů.
Současně byly vybrané MS a RF události testovány ve čtyřech až pěti odlišných prostředích ke zjištění toho, zda není negativní interakce mezi prostředím a MS nebo RF událostí.
V dalším stadiu byla produkce hybridních semen s použitím vybraných MS a RF událostí testována extenzivněji v polních podmínkách. Vybraná MS událost ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech byly kříženy s vybranou RF událostí, také ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech. F1 hybridi byly hodnoceni na rezistenci k herbicidu Liberty™, fertilitu a také celkovou agronomickou výkonnost (výnos a kvalita).
2.5. Selekce elitní události
Výše popsaný postup selekce při vývoji transgenních MS linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly optimální expresi transgenu, tj. rezistenci ke glufosinátu amonnému, fenotyp samčí sterility a schopnost kompletní obnovy fertility s homozygotní obnovitelskou linií, konkrétně s vybranou RF elitní událostí.
Výše popsaný selekční postup při vývoji transgenních RF linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly optimální expresi transgenu, tj. rezistenci ke glufosinátu amonnému, a schopnost obnovy fertility Fl, když se kříží s rostlinou nesoucí gen samčí sterility, konkrétně s vybranou MS elitní událostí.
Příklad 3
Vnesení vybraných kandidátních elitních událostí do rostlin ozimé řepky olejky
Několik MS a RF elitních událostí, které byly vyvinuty u rostlin B. napus, jak bylo popsáno výše, bylo vneseno do kultivaru ozimé řepky olejky opakovaným zpětným křížením rostlin odrůdy Drakkar.
Rostliny byly vyšetřeny a bylo zjištěno následující:
a) Přítomnost cizorodé DNA nijak nepoškozuje další požadované charakteristiky rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickou výkonností nebo komerční hodnotou,
b) událost byla charakterizována dobře definovanou molekulární konfigurací, která byla trvale děděna,
c) požadované geny v cizorodé DNA vykazují správnou, vhodnou a trvalou prostorovou i časovou fenotypovou expresi, jak v heterozygotním (nebo hemizygotním) tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni a v rozsahu environmentálních podmínek, kterým rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vystaveny při jejich normálním agronomickém použití.
Dále, rostliny byly vyhodnoceny na jejich agronomicky významné vlastnosti a výkonnost ve srovnání s divokým typem ozimé řepky olejky.
-20CZ 306357 B6
Extenzivní testování v polních podmínkách ukázalo, že určité kandidátní elitní události u jarní řepky olejky, když byly přeneseny na ozimé řepky olejky, vedly ke vzniku rostlin, které vykazovaly adekvátní expresi požadovaných genů v cizorodé DNA ve spojení s optimální agronomickou výkonností. Tyto události byly vybrány jako MS a RF elitní události u ozimé řepky olejky a byly nazvány MS-BN1 a RF-BN1, v uvedeném pořadí.
Příklad 4
Charakterizace elitních událostí MS-BN1 a RF-BN1
Jakmile byly jednou události MS-BN1 a RF-BN1 identifikovány jako elitní události, kdy exprese požadovaných transgenů a také celková agronomické výkonnost byly optimální, lokusy transgenů byly analyzovány podrobněji na molekulární úrovni. To zahrnovalo detailní analýzu metodou Southern blot (s použitím vícečetné sady restrikčních enzymů) a sekvencování úseků sousedících s transgenem.
4.1. Southern blot analýza s použitím více restrikčních enzymů
Pletivo listů bylo odebráno z transgenních a kontrolních rostlin. Celková genomová DNA byla izolována z pletiva listů metodou podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, vol. 3, p, 19-21). DNA koncentrace každého preparátu pak byla určena měřením optické denzity na spektrofotometru při vlnové délce 260 nm.
pg genomové DNA bylo štěpeno restrikčním enzymem v reakci o celkovém objemu 40 a sice v podmínkách podle doporučení výrobce enzymu. Doba štěpení a/nebo množství restrikčního enzymu byly upraveny tak, aby bylo zajištěno úplné štěpení vzorků genomové DNA bez nespecifické degradace. Po štěpení bylo k naštěpené DNA přidáno 4 μΐ nanášecího barviva a vzorky byly naneseny na 1% agarózový gel.
Následující kontrolní DNA byly také naneseny na gel:
- negativní kontrola s genomovou DNA připravenou z netransgenní rostliny Brassica. Tato negativní kontrola je použita k potvrzení absence pozadí hybridizace.
- DNA pozitivní kontrola: s heterozygotní integrací jedné kopie transgenu do genomu Brassica napus, 10 pg genomové DNA má stejný počet molekul jako přibližně 19 pg DNA 1501 bp Pvul-HindlII fragmentu pTHW118 (velikost diploidního genomu Brassica napus: 0,8x109 bp). Množství představující jednu kopii plazmidu na celý genom bylo přidáno k 1 pg naštěpené DNA z netransgenní Brassica napus. Takto rekonstituovaný vzorek byl použit k ukázání toho, že hybridizace jsou prováděny v podmínkách umožňujících hybridizaci sondy s cílovou sekvencí.
DNA fága Lambda (kmen Clind 1 ts 857 Sam 7, Life Technologies) štěpený Pstl byl zahrnut jako velikostní standard.
Po elektroforéze byly DNA vzorky (štěpená genomová DNA Brassica, kontroly a DNA sloužící jako velikostní standard) přeneseny na nylonovou membránu pomoci kapilárního blottingu trvajícího 12 až 16 hodin.
DNA templáty použité pro přípravu sond pro MS-BN1 událost byly připraveny restrikčním štěpením PTW107 enzymem HindlIL Tak byl vyštěpen 3942 bp DNA fragment, který obsahoval relevantní část transformující DNA (část PSSUARA, 3' nos, bamáza, PTA29).
-21 CZ 306357 B6
DNA templáty použité pro přípravu sondy pro RF-BN1 události byly připraveny restrikčním štěpením PTW118 enzymem Hpal. Tak byl vyštěpen 2182 bp DNA fragment, který obsahoval relevantní části transformující DNA (část PSSUARA, 3'nos, barstar, PTA29).
Po purifikaci byly DNA fragmenty značeny standardním postupem a byly použity k hybridizaci na membráně.
Hybridizace byla prováděna v podmínkách standardní stringence: značená sonda byla denaturována zahříváním po dobu 5 až 10 minut ve vodní lázni na teplotu 95 až 100 °C a pak ochlazením na ledu po dobu 5 až 10 minut, a po té byla přidána k hybridizačnímu roztoku (6 X SSC (20 X SSC je 3,0 M NaCl, 0,3 M citrát sodný, pH 7,0), 5 X Denhardtovo činidlo (100 X Denhardt = 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% bovinní sérový albumin), 0,5% SDS a 20 pg/ml denaturované nosičové DNA (jednořetězcová DNA z rybího spermatu, s průměrnou délkou 120 až 3000 nukleotidů). Hybridizace byly prováděny přes noc v 65 °C. Bloty byly promývány třikrát po dobu 20 až 40 minut v 65 °C, promývacím roztokem (2 X SSC, 0,1 SDS).
Autoradiografy byly elektronicky skenovány.
4.1.1. MS-BN1
Restrikční profil získaný po štěpení MS-BN1 genomové DNA s různými restrikčními enzymy je uveden na obrázku 2 a přehledně shrnut v tabulce 3.
-22CZ 306357 B6
Tabulka 3: Restrikční mapa MS-BN1
| Číslo dráhy | Nanesená DNA | Migrace hybridizujících DNA fragmentů mezi pásy velikostního standardu | Určená délka hybridizujících DNA fragmentů | |
| Větší než | Menší než | |||
| 1 | MS-BN1 - EcoRI | 2140 14057 | 2450 | 2266 bp (*) >14 kbp |
| 2 | MS-BN1 - EcoRV | 1159 14057 | 1700 | 1,4 kbp (*) >14 kbp |
| 4 | MS-BN1 - Hpal | 1986 2140 | 2140 2450 | 1990 bp 2229 bp |
| 5 | MS-BN1 - AflIII | 2450 2140 514 | 2838 2450 805 | 2477 bp (*) 2250 bp 552 bp (*) |
| 6 | MS-BN1 - Ndel | 5077 5077 | 14057 14057 | 10 kbp 6510 bp |
| 7 | Netransgenní ozimé řepky olejky | — | — | |
| 8 | Kontrolní Dlazmidová DNA - BamHI | 1700 2450 | 1986 2838 | 1966 bp (*) 2607 bp (*) |
(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107
4.1.2. RF-BN 1 io Restrikční profil získaný po štěpení RF-BN 1 genomové DNA s různými restrikčními enzymy je uveden na obrázku 3 a přehledně shrnut v tabulce 4.
-23 CZ 306357 B6
Tabulka 4: Restrikční mapa RF-BN1
| Číslo dráhy | Nanesená DNA | Migrace hybridizujících DNA fragmentů mezi pásy velikostního standardu | Určená délka hybridizuj ících DNA fragmentů | |
| Větší než | Menší než | |||
| 1 | MS-BN1 - BamHI | 805 1700 2450 5077 | 1099 1986 2838 14057 | 814 bp 1849 bp (*) 2607 bp(*) 6580 bp |
| 2 | MS-BN1 - EcoRI | 805 1986 5077 5077 | 1159 2450 14057 14057 | 1094 bp 2149 bp 7000 bp 10 kbp |
| 3 | MS-BN1 - EcoRV | 5077 5077 | 14057 14057 | 5,4 kbp 8 kbp |
| 4 | MS-BN1 -HindlII | 1700 2450 2450 | 2140 2838 2838 | 1969 bp 2565 bp 2635 bp |
| 6 | Netransgenní ozimé řepky olej ky | — | ||
| 5 | Kontrolní plazmid DNA - BamHI | 1700 2450 5077 | 1986 2838 14057 | 1849 bp (*) 2607 bp (*) 8100 bp |
(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107
4.2. Identifikace sousedící úseky
Sousedící úseky elitní události MS-BN1 a RF-BN1 byly nejdříve identifikovány pro jarní řepky olejky, ve kterých události byly vyvinuty, a pak kontrolovány u ozimé řepky olejky.
4.2.1. Identifikace úseků sousedících s MS-BN1
4.2.1.1. Pravý (5') sousedící úsek
Pro stanovení sekvence sousedícího úseku MS-BN1 na pravé hranici byla užita ligaci-zprostředkovaná polymerázová řetězová reakce (Mueller et al. 1989, Science 780-786, Marine et al., 1994, PCR Methods and Applications, 71-75) s extenzním záchytem („extension capture“) (Tormanen et al., 1993, NAR 20:5487-5488).
-24CZ 306357 B6
Oligonukleotidy použité pro přípravu linkeru byly následující:
MDB248: (SEKV. ID. Č. 3)
5'CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT.AAC.TTT.AAC.CAC.TTT.
GCT.CCG.ACA.GTC.CCA.TTG
MDB249: (SEKV. ID. Č. 4)
5'CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.
CTG.GGT.CAG.GGC.ATG
Po přípravě linkeru následovala syntéza prvního řetězce z genomové MS-BN1 DNA štěpené Ncol, s použitím biotinylovaného genově specifického primerů:
| Sekvence (5' —>3') | Poloha v PTHW107 | |
| Biotinylovaný primer MDB247 | CCG.TCA.CCG.AGA.TCT. GAT.CTC.ACG.CG (SEKV. ID. Č. 5) | 322 <- 347 |
Linker pak byl ligován k prvnímu řetězci DNA, který pak byl kondenzován k magnetickým perličkám, ze kterých byl nebiotinylovaný řetězec eluován. Tato DNA byla použita pro PCR amplifikaci ve větším měřítku s použitím následujících primerů:
| Sekvence (5'->3') | Poloha v PTHW107 | |
| Linkerový primer MDB250 | GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEKV. ID. Č. 6) | |
| T-DNA primer MDB251 | GGA.TCC.CCC. GAT. GAG.CTA.AGC. TAG.C (SEKV. ID. Č. 7) | 293 <- 317 |
Tato PCR poskytla fragment přibližně 1150 bp. Tento fragment pravé hranice (RB) byl eluován z agarózového gelu a na 1 OOnásobně zředěné této DNA byla provedena sdružená („nested“) PCR s použitím následujících primerů:
| Sekvence (5'->3') | Poloha v PTHW107 | |
| „Nested linkerový primer MDB254 | CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEKV. ID. Č. 8) | |
| T-DNA primer MDB258 | CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9) | 224 <- 243 |
-25 CZ 306357 B6
Tato reakce poskytla fragment velikosti přibližně 1000 bp, který byl eluován z agarózového gelu, purifikován a ligován do vektoru pGem®-T. Rekombinantní plazmidová DNA byla podrobena screeningu s použitím standardní PCR reakce s následujícími primery:
| Sekvence (5'->3') | Poloha v PTHW107 | |
| SP6 primer | TAA. TAC. GAC. TCA. CTA. TAG. GGC. GA (SEKV. ID. Č. 10) | (SP6 promotor ve vektoru PGem®-T) |
| T7 primer | TTT.AGG.TGA.CAC. TAT.AGA.ATA.C (SEKV. ID. Č. 11) | (T7 promotor ve vektoru PGem®-T) |
| T-DNA primer MDB201 | gCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12) | 143 <- 163 |
Tak vznikly následující fragmenty:
SP6-T7: 1224 bp
SP6-MDB201: 1068 bp
T7-MDB201: 1044 bp
Fragment pravé hranice byl purifikován a sekvencován (SEKY. ID. Č. 13), což poskytlo výsledný 963 bp fragment, v němž polohy 1 až 867 odpovídají rostlinné DNA a úsek bp 868 až 953 odpovídá T-DNA z pTW 107.
4.2.1.2. Levý (3') sousedící úsek s MS-BN 1
Sekvence úseku levé hranice sousedícího s vloženým transgenem v MS-BN 1 události byly určeny s použitím metody TAIL-PCR („thermal asymmetric interlaced PCR“), který popsali Liu et al. (1995, Plant Journal 8(3): 457^463). Tento způsob užívá tři sdružené („nested“) specifické primery v následných reakcích společně s kratším arbitrámě degenerovaným (AD) primerem, takže relativní účinnosti amplifikace specifického a nespecifického produktu mohou být teplotně kontrolovány. Specifické primery byly vybrány pro nasednutí („annealing“) k hranici transgenu a na základě jejich podmínek pro nasednutí. Malé množství (5 μΐ) nepurifikovaných sekundárních a terciárních PCR produktů bylo analyzováno na 1% agarózovém gelu. Terciární PCR produkt byl použit pro preparativní amplifikaci, purifikován a sekvencován na automatickém sekvencovacím zařízení s použitím soupravy pro cyklovací sekvencování DyeDeoxy Terminátor.
Následující primery byly použity:
-26CZ 306357 B6
| Sekvence (5 * —>3’) | Poloha v PTHW107 | |
| Degenerovaný primer MDB611 | NgT.CgA.SWg.TNT.WCA.A (SEKV. ID. Č. 14) | |
| Primární TAIL MDB259 | gTg.Cag.ggA.AgC.ggT.TAA.CTg.g (SEKV. ID. Č. 15) | 7164 —> 4186 |
| Sekundární TAIL MDB260 | CCT.TTg.gAg.TAA.ATg.gTg.TT g.g (SEKV. ID. Č. 16) | 4346 -A 4366 |
| Terciární TAIL HCA24 | gCg.AAT.gTA. TAT.TAT.ATg.CA (SEKV. ID. Č. 17) | 4738 -» 4757 |
Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T
Fragment amplifikovaný s použitím HCA24-MDB611 byl přibližně dlouhý 540 bp, z nichž bylo 537 bp sekvencováno (3' sousedící: SEKV. ID. Č. 18). Sekvence mezi 1 a 180 bp obsahovala pTHW107 DNA, zatímco sekvence mezi 181a 537 bp odpovídala rostlinné DNA.
4.2.1.3. Identifikace delece cílového místa
Užitím primerů odpovídajících sekvencím v sousedících úsecích transgenu bylo na DNA divokého typu z rostliny Brassica napus var. Drakkar jako templátu identifikováno inzerční místo transgenu.
Následující primery byly použity:
| Sekvence (5’—>3’) | Poloha v 5' sousedícím úseku | Poloha v 3' sousedícím úseku | |
| (SEKV. ID. Č. 13) | (SEKV. ID. Č. 18) | ||
| VDS51 | TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g (SEKV. ID. Č. 19) | 733 -> 751 | |
| HCA48 | GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC (SEKV. ID. Č. 20) | 189 <- 208 |
Tím byl připraven 178 bp fragment (SEKV. ID. Č. 21), ve kterém úsek 132 až 150 bp odpovídá deleci cílového místa.
4.2.1.4. Identifikace MS-BN1 inzerěního úseku
Na základě identifikace sousedících úseků a delece cílového místa mohl být určen inzerční úsek MS-BN1 (SEKV. ID. Č. 22):
1-822: 5' sousedící úsek bp 46-867 ze SEKV. ID. Č. 13
-27CZ 306357 B6
823-841: delece cílového místa bp 132-150 SEKV. ID. Č. 21
842-1198: 3'sousedící úsek bp 181-537 SEKV. ID. Č. 18
4.2.2. Identifikace sousedících úseků RF-BN1
Hraniční sousedící úseky RF-BN1 byly určeny pomocí „Vectorette-PCR“ (použití „Vectorette“ a „Subvectorette PCR“ pro izolaci DNA sousedící s transgenem - viz Maxine J. Allen, Andrew Collick a Alec J. Jeffreys, PCR Methods and Applications - 1994 (4) pages 71-75) s RF-BN1 genomovou DNA štěpenou HindlII jako templátem. „Vectorette“ linker byl vytvořen s použitím primerů MDB248 (SEKV. ID. Č. 3) a MDB249 (SEKV. ID. Č. 4) popsanými výše.
4.2.2.1. Pravý (5') sousedící úsek BN-RF1
Následující primery byly použity:
| Sekvence (5'->3') | Poloha v PTHW118 | ||
| Vectorette primer MDB250 | GCA. CTG.AGG.GCC.AAA.GCT.TGG.CTC (SEKV. ID. Č. 6) | ||
| Vectorette primer MDB254 | CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG (SEKV. ID. Č. 8) | ||
| T-DNA primer MDB251 | GGA.TCC.CCC. GAT. GAG.CTA.AGC. TAG.C (SEKV. ID. Č. 7) | 293 <- | 317 |
| T-DNA primer MDB193 | CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC (SEKV. ID. Č. 23) | 226 <- | 243 |
| T-DNA primer MDB258 | CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9) | 224 <- | 243 |
| T-DNA primer MDB201 | GCT.TGG.ACT.ATA.ΑΤΑ.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12) | 143 <- | 163 |
Tím byl získán 1077 bp fragment (SEKV. ID. Č. 24), ve kterém úsek 1 až 881 bp odpovídá rostlinné DNA a úsek 882 až 1077 bp odpovídá T-DNA z pTW 118.
4.2.2.2. Levý (3') sousedící úsek BN-RF1
Pro identifikaci 3' sousedícího úseku elitní událost BN-RF1, TAIL-PCR byla provedena jak bylo popsáno výše s použitím arbitrámě degenerovaného primeru a primerů lokalizovaných v T-DNA v blízkosti levé hranice.
Byly použity následující primery:
Arbitrámě degenerovaný primer:
MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEKV. ID. Č. 25)
-28CZ 306357 B6
Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T
T-DNA primery:
MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)
MDB3IS ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g (SEKV. ID. Č. 27)
MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg (SEKV. ID. Č. 28)
Byl získán fragment velikosti přibližně 2000 bp. Tento fragment byl klonován do vektoru pGem©-T vektor a použit jako templát pro další PCR reakci s použitím následujících primerů:
Primer pro rostlinnou DNA:
MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg (SEKV. ID. Č. 29)
T-DNA primer:
MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)
Takto byl získán fragment velikosti přibližně 1500 bp (SEKV. ID. Č. 30), kde úsek 1 až 166 bp odpovídá T-DNA z plazmidu pTWl 18 a úsek 167 až 1441 bp odpovídá rostlinné DNA.
4.2.2.3. Molekulární analýza delece cílového místa
Usek obsahující deleci cílového místa byl klonován pomocí TAIL-PCR (popsána výše) s použitím genomové DNA divokého typu a primerů specifických pro rostlinnou DNA v protisměru (upstream) od T-DNA inzertu směrem k inzertu:
Arbitrámě degenerovaný primer:
MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEKV. ID. Č. 25) kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T
Primeiy pro rostlinnou DNA:
MDB269
MDB283
MDB284 ggTTTTCggAggTCCgAgACg
CTTggACCCCTAggTAAATgC gTACAAAACTTggACCCCTAgg (SEKV. ID. Č. 31) (SEKV. ID. Č. 32) (SEKV. ID. Č. 33)
Byl získán fragment velikosti 1068 bp (SEKV. ID. Č. 34), ve kterém je:
53-83: 5'sousedící úsek
84-133: delece cílového místa
134-1055: 3' sousedící úsek
Po inzerci T-DNA bylo cílové místo velikosti 51 bp deletováno. Srovnáním sekvence lokusu divokého typu s lokusem R13 odhalilo přítomnost „výplňového“ úseku DNA ve spojovacím místě pravé hranici. „Výplňová“ sekvence TCTCG sekvence v pravé hranici sousedí se sekvencí TCA na 5' konci a sekvencí CGA na 3' konci. Tyto triplety byly také nalezeny na předělu delece cílového místa a T-DNA. Vyhledávání ve vzdálenějších rostlinných sekvencích odhalilo možný původ této „výplňové“ DNA. Sekvence TCA.TCTCG.CGA je také lokalizována v rostlinné DNA
-29CZ 306357 B6 na 3' konci delece cílového místa. Je to Jádrová“ sekvence dvou identických repetic velikosti 13 bp lokalizovaná 209 bp po směru (downstream) od předělu delece cílového místa.
Inzerční úsek pro RF-BN1 může být definován jako úsek obsahující levý sousedící úsek, deleci cílového místa a pravý sousedící úsek, a sice následovně:
1-881: 5' sousedící úsek (bp 1-881 SEKV. ID. Č. 24)
882-932: delece cílového místa (bp 84-133 SEKV. ID. Č. 34)
933-2207: 3’ sousedící úsek (bp 167-1441 SEKV. ID. Č. 30)
3. Genetická analýza lokusu
Genetická stabilita inzertů pro dvě události byla ověřována molekulární a fenotypovou analýzou v potomstvu rostlin po několik generací.
Analýzy metodou Southern blot rostlin generací To, Ti a T2 byly srovnány pro obě události MSBN1 a RF-BN1. Bylo zjištěno, že získané profily byly identické pro každou z událostí v odlišných generacích. To dokazuje, že molekulární konfigurace transgenu v rostlinách obsahujících jak MS-BN1, tak i RF-BN1 je stabilní.
MS-BN1 a RF-BN1 události vykazují pro své odpovídající transgeny mendelovskou segregaci jako jediný genetický lokus v alespoň třech následných generacích, což ukazuje na to, že inzerty jsou stabilní.
Na základě výše popsaných výsledků byly MS-BN1 a MS-RF1 identifikovány jako elitní události.
4.4. Identifikace sousedících sekvencí událostí MS-BN1 a RF-BN1 u ozimé řepky olejky
Sousedící sekvence elitní události MS-BN1 a RF-BN1 u ozimé řepky olejky byly určeny s použitím primerů, které byly vyvinuty na základě sousedících sekvencí dané události u jarní řepky olejky.
Pravá (5') sousedící sekvence MS-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 12) a primerů lokalizovaného v MS-BN1 pravé hraniční rostlinné DNA:
VDS57: 5'-gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3' (SEKV. ID. Č. 35)
To poskytlo fragment velikosti 909 bp (SEKV. ID. C. 36) se sekvenci v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 13 (počínajíc nukleotidem 98).
Levá (3') sousedící sekvence MS-BN 1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA příměrů (SEKV. ID. Č. 17) a primer lokalizovaného v MS-BN 1 levé hraniční rostlinné DNA:
HCA68: 5'-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3' (SEKV. ID. Č. 37)
To poskytlo fragment 522 bp (SEKV. ID. Č. 38) se sekvenci v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 18.
Pravá (5') sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA příměrů (SEKV. ID. Č. 12) a primerů lokalizovaného v RF-BN 1 pravé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 31). Tak vznikl fragment 694 bp (SEKV. ID. Č. 39) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 24 (nukleotidy 293 až 980).
-30CZ 306357 B6
Levá sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 26) a primeru lokalizovaného v RF-BN1 levé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 29). Tak vznikl fragment 1450 bp, z něhož 1279 bp bylo sekvenováno (SEKV. ID. Č. 40). Bylo zjištěno, že tato sekvence je v podstatě podobná sekvenci SEKV. ID. Č. 30 (nukleotidy 141 až 1421).
Tedy tím bylo potvrzeno, že pravá a levá sousedící sekvence elitní události MS-BN1 a RF-BN1 jsou v podstatě shodné pro jarní a ozimou řepku olejku.
Příklad 5
Vývoj diagnostických nástrojů pro kontrolu identity
Následující protokoly byly vyvinuty s cílem identifikovat jakýkoliv rostlinný materiál ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BN1.
5.1. MS-BN1 a RF-BN 1 Elitní událost restrikční mapa identifikace protokol
Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BN1 mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu 4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétně s alespoň 4, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII 2) přenesena na nylonovou membránu a 3) hybridizována s 3 942 bp HindlII fragmentem z plazmidu pTHWl 07. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 3 v Příkladu 4.1.1., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost MS-BN 1.
Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost RF-BN1 mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu 4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV, HindlII 2) přenesena na nylonovou membránu a 3) hybridizována s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHWl 18. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 4 v příkladu 4.1.2., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost PF-BN1.
5.2. PCR identifikační protokol pro elitní události MS-BN1 a RF-BN1
Test protokolu, se všemi vhodnými kontrolami, musí být proveden ještě před screeningem neznámých vzorků. Předložený protokol by mohl vyžadovat optimalizaci složek, které se mohou obecně lišit mezi jednotlivými laboratořemi (příprava templátové DNA, Taq DNA polymeráza, kvalita primerů, dNTP, termocykler atd.).
Amplifíkace endogenní sekvence hraje v protokolu klíčovou roli. Je třeba dosáhnout takových podmínek PCR a cyklování teplot, aby se amplifikovaly v ekvimolámích množstvích endogenní a transgenní sekvence v templátu známé transgenní genomové DNA. Kdykoliv se cílový endogenní fragment neamplifikuje se stejnou intenzitou zjištěnou po elektroforéze na agarózovém gelu a obarvení ethidiumbromidem, optimalizace podmínek pro PCR je nezbytná.
5.2.1. Templátová DNA
Templátová DNA se připravuje z listových terčíků nebo jednoho semena postupem podle Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p.1349, 1991). Když se používá DNA připravená
-31 CZ 306357 B6 jinými metodami, měl by se nejdříve provést test protokolu s různými množstvími templátu. Obvykle 50 ng genomové DNA jako templát poskytuje nejlepší výsledky.
5.2.2. Přiděleni pozitivní a negativní kontroly
Následující pozitivní a negativní kontroly by měly být zařazeny v každém běhu PCR:
- „Master Mix“ kontrola (DNA negativní kontrola). To je PCR, ve které není přidána do reakce žádná DNA. Pokud nastane očekávaný výsledek, tj. žádné PCR produkty, znamená to, že připravená reakční směs (Master Mix) pro PCR není kontaminovaná cílovou DNA.
- DNA pozitivní kontrola (vzorek genomové DNA obsahující transgenní sekvence). Úspěšná amplifikace této pozitivní kontroly demonstruje, že PCR podmínky v daném běhu PCR byly takové, že umožnily amplifíkaci cílové sekvence.
- kontrola DNA divokého typu. Toto je PCR, ve které je jako templát genomová DNA připravená z netransgenní rostliny. Když nastane očekávaný výsledek, tedy žádná PCR amplifikace produktu z transgenu, avšak jen amplifikace endogenního PCR produktu, to znamená, že není detekovatelné pozadí transgenu při amplifíkaci samotné genomové DNA.
5.2.3. Primery
Následující primery, které specificky rozpoznávají transgen a sousedící sekvence MS-BN1 byly použity:
BNA01: 5'-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3' (SEKV. ID. Č. 12) (MDB201) (cíl: transgen)
BNA02: 5'-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3' (SEKV. ID. Č. 19) (VDS51) (cíl: rostlinná DNA)
Pro identifikaci rostlinného materiálu obsahujícího RF-BN1 byly užity následující primery, které specificky rozpoznávají transgen a sousedící sekvenci RF-BN1:
BNA03: 5'-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3' (SEKV. ID. Č. 23) (MDB193) (cíl: transgen)
BNA04: 5'-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3' (SEKV. ID. Č. 41) (MDB268) (cíl: rostlinná DNA)
Primery zacílené na endogenní sekvence jsou vždy přítomny v PCR koktejlu. Tyto primery slouží jako vnitřní kontrola u neznámých vzorků a v pozitivní kontrole. Pozitivní výsledek s dvojicí endogenních primerů demonstruje, že je v preparátu genomové DNA přítomen dostatek DNA v odpovídající kvalitě, aby mohl být generován PCR produkt. Endogenní primery byly:
BNA05: 5'-AAC.gAg.TgT.CAg.CTA.gAC.CAg.C-3' (SEKV. ID. Č. 42)
BNA06: 5'-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3' (SEKV. ID. Č. 43)
5.2.4 Amplifikované fragmenty
Očekávané amplifikované fragmenty v PCR reakci jsou:
-32CZ 306357 B6
Pro dvojici primerů BNA05-BNA06:
Pro dvojici primerů BNA01-BNA02:
Pro dvojici primerů BNA03-BNA04:
394 bp (endogenní kontrola)
280 bp (MS-BN1 elitní událost)
215 bp (RF-BN1 elitní událost)
5.2.5. Podmínky PCR
PCR reakční směs obsahuje v 50 μΐ reakci:
μΐ templátová DNA μΐ lOx Amplifikační pufr (dodávaný s Taq polymerázou) μΐ lOmMdNTP μΐ BNA01 (MS-BN1) nebo BNA03 (RF-BN 1) (10 pmol/μΐ) μΐ BNA02 (RF-BN 1) nebo BNA04 (RF-BN 1) (10 pmol/μΐ)
0,5 μΐ BNA05 (10 pmol/μΐ)
0,5 μΐ BNA06 (10 pmol/μΐ)
0,2 μΐ Taq DNA polymeráza (5 jednotek/μΐ) voda do 50 μΐ
Teplotní profil pro dosažení optimálních výsledků je následující:
minuty v 95 °C
Pak následuje:
minuta v 95 °C minuta v 57 °C minuty v 72 °C v 5 cyklech
Pak následuje:
sekund v 92 °C sekund v 57 °C minuta v 72 °C ve 22 až 25 cyklech
Pak následuje: 5 minut v 72 °C
5.2.6. Analýza na agarózovém gelu
Vzorky PCR o objemu 10 a 20 μΐ se nanášejí na 1,5% agarózový gel (Tris-borátový pufr) společně s vhodným standardem molekulární hmotnosti (např. 100 bp „žebřík“ PHARMACIA).
5.2.7. Validace výsledků
Data získaná pro vzorky DNA transgenní rostliny v jednom běhu PCR run a jednom PCR koktejlu nelze akceptovat, dokud 1) DNA pozitivní kontrola nevykazuje očekávané PCR produkty (transgenní a endogenní fragmenty), 2) DNA negativní kontrola je negativní pro PCR amplifikaci
-33 CZ 306357 B6 (žádné fragmenty) a 3) DNA kontrola divokého typu vykazuje očekávaný výsledek (amplifikován endogenní fragment).
Dráhy ukazující viditelná množství transgenního a endogenního PCR produktu očekávané veli5 kosti, jsou indikací toho, že odpovídající rostlina, ze které byla genomová templátová DNA připravena, zdědila MS-BN1 a/nebo RF-BN1 elitní událost. Dráhy bez viditelného množství obou transgenních PCR produktů avšak s viditelným množstvím endogenního PCR produktu indikují, že odpovídající rostliny, ze kterých byla genomová templátová DNA připravena, neobsahují elitní událost. Dráhy bez viditelného množství endogenního a transgenních PCR produktu jsou 10 výsledkem toho, že kvalita a/nebo kvantita genomové DNA nebyla dostatečná pro vznik PCR produktu. Tyto rostliny nemohou být vyhodnoceny. Genomová DNA by měla být znovu připravena a měl by být proveden nový běh PCR s příslušnými vhodnými kontrolami.
5.2.8. Použití protokolu diskriminační PCR k identifikaci MS-BN1 a RF-BN1
Rostlinný materiál z listů ozimé řepky olejky obsahující buďto MS-BN1, RF-BN1, nebo jinou transgenní událost, byl testován podle výše popsaného protokolu. Vzorky z ozimé řepky olejky divokého typu byly použity jako negativní kontroly. Výsledky PCR analýz jsou ilustrovány na obrázku 4 a 5.
Obrázek 4 ilustruje výsledek získaný pomocí identifikačního protokolu PCR pro elitní událost MS-BN1 na dvou vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2). Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 280 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje MS-BN 1.
Obrázek 5 ilustruje výsledek získaný pomocí PCR identifikačního protokolu pro elitní událost RF-BN1 na dvou vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2). Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 215 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje RF-BN1.
Příklad 6
Produkce hybridních semen s použitím MS-BN1 a RF-BN1 v rostlinách ozimé řepky olejky
Rostliny ozimé řepky olejky obsahující MS-BN1, které vykazovaly samčí sterilitu, byly kříženy 35 s rostlinami ozimé řepky olejky homozygotními v RF-BN1. Hybridní semena byla sebrána z MS-BN1 a uložena ve sbírce ATCC pod přístupovým číslem ATCC PTA-730.
Tato hybridní semena byla znovu vyseta na pole. Bylo zjištěno, že rostliny byly 100% fertilní a projevovaly současně optimální agronomické vlastnosti. Hybridní rostliny obsahovaly buďto 40 obě události MS-BN1 a RF-BN1, nebo jen RF-BN/1 samotnou.
Příklad 7
Vnesení MS-BN 1 a RF-BN1 do výhodného kultivaru ozimé řepky olejky
Elitní události MS-BN1 a RF-BN 1 byly opakovaným zpětným křížením rostlin obsahujících událost MS-BN 1 nebo RF-BN 1, v daném pořadí, přeneseny na řadu agronomicky významných kultivarů ozimé řepky olejky.
Bylo pozorováno, že introgrese elitní události do těchto kultivarů nijak významně neovlivnila žádné požadované fenotypové nebo agronomicky významné charakteristiky těchto kultivarů (žádná vazba), když exprese transgenu, která byla určována jako tolerance ke glufosinátu, dosáhla komerčně přijatelné úrovně. To potvrdilo status události MS-BN1 a RF-BN 1 jako elitních 55 událostí.
-34CZ 306357 B6
V připojených nárocích se užívá termín „rostlina“ tak, že zahrnuje i jakákoliv rostlinná pletiva, v jakémkoliv stadiu zralosti, a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z rostlin, včetně, aniž by však byl výčet omezující, semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamet, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů.
Semena obsahující elitní událost MS-BN1 a elitní událost RF-BN1 nebo elitní událost RF-BN 1 samotnou byla uložena v Americké sbírce mikroorganismů a tkáňových kultur ATCC pod přístupovým číslem: PTA-730.
SEZNAM SEKVENCÍ <160> 43 < 170> Patentln Ver. 2.0 < 210> 1 < 211> 4946 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: T-DNA plazmidu pTHW107 <220>
< 221> různé vlastnosti <222> (964)..(4906) < 223> Hind III fragment < 400> 1 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120
-35 CZ 306357 B6 atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt180 gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg240 tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt300 agctcatcgg gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg360 gggcggtacc ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg420 cttgaagccg gccgcccgca gcatgccgcg gggggcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg480 cacgctcggg tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc540 cagggacttc agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg600 ggagacgtac acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc660 cgcgtaggcg atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc720 ccgcagacgg acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt780 gaccgtgctt gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc840 ggtggcacgg cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtcc attgttcttc tttactcttt900 gtgtgactga ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag960 aacaagcttt ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct
1020 acaccgttgg attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080 aaggcctaag gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140 ggaagataat tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200 gtgcttgctc attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260 ttacttacta tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320 tatgattcat gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380 ggtgaaactg tggaatatat atttttttca tttaaaagca aaatttgcct tttactagaa 1440 ttataaatat agaaaaatat ataacattca aataaaaatg aaaataagaa ctttcaaaaa 1500 acagaactat gtttaatgtg taaagattag tcgcacatca agtcatctgt tacaatatgt 1560 tacaacaagt cataagccca acaaagttag cacgtctaaa taaactaaag agtccacgaa 1620 aatattacaa atcataagcc caacaaagtt attgatcaaa aaaaaaaaac gcccaacaaa 1680 gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740
-36CZ 306357 B6
| ctatacacaa aacaagtcag 1800 | ataaatctct | ttctgggcct | gtcttcccaa | cctcctacat |
| cacttcccta tcggattgaa 1860 | tgttttactt | gtaccttttc | cgttgcaatg | atattgatag |
| tatgtttgtg aaaactaata 1920 | gggttaacaa | tcgaagtcat | ggaatatgga | tttggtccaa |
| gattttccga gagctttcta 1980 | gtagaaagcc | catcaccaga | aatttactag | taaaataaat |
| caccaattag gtttcttatt 2040 | atgtgccaaa | ttcaatataa | ttatagagga | tatttcaaat |
| gaaaacgtat gaatgttatt 2100 | agtaaatggt | caggtaagac | attaaaaaaa | tcctacgtca |
| gatattcaac tttaaaaatt 2160 | cgatcagtgt | ggaattgtac | aaaaatttgg | gatctactat |
| atatatataa tgctttacaa 2220 | cacttggatt | tttttttgga | ggctggaatt | tttaatctac |
| atatttgttt tggccatgca 2280 | ccaactcatt | gtttagtgta | atactttgat | tttgtcaaat |
| atatgtgttc gtgtatattt 2340 | gtataagaat | ttctttgacc | atatacacac | acacatatat |
| atatatatat atatattata 2400 | tatcatgcac | ttttaattga | aaaaataata | tatatatata |
| tagtgcattt tttctaacaa 2460 | ccatatatgt | tgcgattgat | ctgcaaaaat | actgctagag |
| taatgaaaaa tataatctat 2520 | tgctgaaatt | atctcagatg | ttaagatttt | cttaaagtaa |
| attctttcaa attttagcta 2580 | aaagtcttgt | aataactaaa | gaataataca | caatctcgac |
| cacggaaaaa aaacacataa 2640 | taaatttgaa | tttcgaccgc | ggtacccgga | attcgagctc |
| ggtacccggg gatcttcccg 2700 | atctagtaac | atagatgaca | ccgcgcgcga | taatttatcc |
| tagtttgcgc gctatatttt 2760 | gttttctatc | gcgtattaaa | tgtataattg | cgggactcta |
| atcataaaaa cccatctcat 2820 | aaataacgtc | atgcattaca | tgttaattat | tacatgctta |
| acgtaattca acagaaatta 2880 | tatgataatc | atcgcaagac | cggcaacagg | attcaatctt |
| aagaaacttt attgccaaat 2940 | gtttgaacga | tctgcttcgg | atcctctaga | gccggaaagt |
| gaaattgacc gatcagagtt 3000 | tgaagaaaaa | tttattacac | actttatgta | aagctgaaaa |
| aaacggcctc cgcaggaagc 3060 | cgtttttttc | gttatctgat | ttttgtaaag | gtctgataat |
-37CZ 306357 B6
| ggtccgttgt 3120 | tttgtaaatc | agccagtcgc | ttgagtaaag | aatccggtct | gaatttctga |
| agcctgatgt 3180 | atagttaata | tccgcttcac | gccatgttcg | tccgcttttg | cccgggagtt |
| tgccttccct 3240 | gtttgagaag | atgtctccgc | cgatgctttt | ccccggagcg | acgtctgcaa |
| ggttcccttt 3300 | tgatgccacc | cagccgaggg | cttgtgcttc | tgattttgta | atgtaattat |
| caggtagctt 3360 | atgatatgtc | tgaagataat | ccgcaacccc | gtcaaacgtg | ttgataaccg |
| gtaccatggt 3420 | agctaatttc | tttaagtaaa | aactttgatt | tgagtgatga | tgttgtactg |
| ttacacttgc 3480 | accacaaggg | catatataga | gcacaagaca | tacacaacaa | cttgcaaaac |
| taacttttgt 3540 | tggagcattt | cgaggaaaat | ggggagtagc | aggctaatct | gagggtaaca |
| ttaaggtttc 3600 | atgtattaat | ttgttgcaaa | catggactta | gtgtgaggaa | aaagtaccaa |
| aattttgtct 3660 | caccctgatt | tcagttatgg | aaattacatt | atgaagctgt | gctagagaag |
| atgtttattc 3720 | tagtccagcc | acccacctta | tgcaagtctg | cttttagctt | gattcaaaaa |
| ctgatttaat 3780 | ttacattgct | aaatgtgcat | acttcgagcc | tatgtcgctt | taattcgagt |
| aggatgtata 3840 | tattagtaca | taaaaaatca | tgtttgaatc | atctttcata | aagtgacaag |
| tcaattgtcc 3900 | cttcttgttt | ggcactatat | tcaatctgtt | aatgcaaatt | atccagttat |
| acttagctag 3960 | atatccaatt | ttgaataaaa | atagctcttg | attagtaaac | cggatagtga |
| caaagtcaca 4020 | tatccatcaa | acttctggtg | ctcgtggcta | agttctgatc | gacatggggt |
| taaaatttaa 4080 | attgggacac | ataaatagcc | tatttgtgca | aatctcccca | tcgaaaatga |
| cagattgtta 4140 | catggaaaac | aaaaagtcct | ctgatagaag | tcgcaaagta | tcacaatttt |
| ctatcgagag 4200 | atagattgaa | agaagtgcag | ggaagcggtt | aactggaaca | taacacaatg |
| tctaaattaa 4260 | ttgcattcgc | taaccaaaaa | gtgtattact | ctctccggtc | cacaataagt |
| tattttttgg 4320 | cccttttttt | atggtccaaa | ataagtgagt | tttttagatt | tcaaaaatga |
| tttaattatt 4380 | tttttactac | agtgcccttg | gagtaaatgg | tgttggagta | tgtgttagaa |
-38CZ 306357 B6 atgtttatgt gaagaaatag taaaggttaa tatgatcaat ttcattgcta tttaatgtta 4440 aaatgtgaat ttcttaatct gtgtgaaaac aaccaaaaaa tcacttattg tggaccggag 4500 aaagtatata aatatatatt tggaagcgac taaaaataaa cttttctcat attatacgaa 4560 cctaaaaaca gcatatggta gtttctaggg aatctaaatc actaaaatta ataaaagaag 4620 caacaagtat caatacatat gatttacacc gtcaaacacg aaattcgtaa atatttaata 4680 .
taataaagaa ttaatccaaa tagcctccca ccctataact taaactaaaa ataaccagcg 4740 aatgtatatt atatgcataa tttatatatt aaatgtgtat aatcatgtat aatcaatgta 4800 taatctatgt atatggttag aaaaagtaaa caattaatat agccggctat ttgtgtaaaa 4860 atccctaata taatcgcgac ggatccccgg gaattccggg gaagcttaga tccatggagc 4920 catttacaat tgaatatatc ctgccg 4946 <210> 2 <211> 4832 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: T-DNA plazmidu pTHWl 18 io <220>
< 221> různé vlastnosti < 222> (1883)..(4065) <223> Hpal fragment <400>2 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120
-39CZ 306357 B6
| atatttattg | ataaaataac | aagtcaggta ttatagtcca | agcaaaaaca | taaatttatt | 180 |
| gatgcaagtt | taaattcaga | aatatttcaa taactgatta | tatcagctgg | tacattgccg | 240 |
| tagatgaaag | actgagtgcg | atattatgtg taatacataa | attgatgata | tagctagctt | 300 |
| agctcatcgg | gggatcctag | acgcgtgaga tcagatctcg | gtgacgggca | ggaccggacg | 360 |
| gggcggtacc | ggcaggctga | agtccagctg ccagaaaccc | acgtcatgcc | agttcccgtg | 420 |
| cttgaagccg | gccgcccgca | gcatgccgcg gggggcatat | ccgagcgcct | cgtgcatgcg | 480 |
| cacgctcggg | tcgttgggca | gcccgatgac agcgaccacg | ctcttgaagc | cctgtgcctc | 540 |
| cagggacttc | agcaggtggg | tgtagagcgt ggagcccagt | cccgtccgct | ggtggcgggg | 600 |
| ggagacgtac | acggtcgact | cggccgtcca gtcgtaggcg | ttgcgtgcct | tccaggggcc | 660 |
| cgcgtaggcg | atgccggcga | cctcgccgtc cacctcggcg | acgagccagg | gatagcgctc | 720 |
| ccgcagacgg | acgaggtcgt | ccgtccactc ctgcggttcc | tgcggctcgg | tacggaagtt | 780 |
| gaccgtgctt | gtctcgatgt | agtggttgac gatggtgcag | accgccggca | tgtccgcctc | 840 |
| ggtggcacgg | cggatgtcgg | ccgggcgtcg ttctgggtcc | attgttcttc | tttactcttt | 900 |
| gtgtgactga | ggtttggtct | agtgctttgg tcatctatat | ataatgataa | caacaatgag | 960 |
| aacaagcttt 1020 | ggagtgatcg | gagggtctag gatacatgag | attcaagtgg | actaggatct | |
| acaccgttgg 1080 | attttgagtg | tggatatgtg tgaggttaat | tttacttggt | aacggccaca | |
| aaggcctaag 1140 | gagaggtgtt | gagaccctta tcggcttgaa | ccgctggaat | aatgccacgt | |
| ggaagataat 1200 | tccatgaatc | ttatcgttat ctatgagtga | aattgtgtga | tggtggagtg | |
| gtgcttgctc 1260 | attttacttg | cctggtggac ttggcccttt | ccttatgggg | aatttatatt | |
| ttacttacta 1320 | tagagctttc | ataccttttt tttaccttgg | atttagttaa | tatataatgg | |
| tatgattcat 1380 | gaataaaaat | gggaaatttt tgaatttgta | ctgctaaatg | cataagatta | |
| ggtgaaactg 1440 | tggaatatat | atttttttca tttaaaagca | aaatttgcct | tttactagaa | |
| ttataaatat 1500 | agaaaaatat | ataacattca aataaaaatg | aaaataagaa | ctttcaaaaa | |
| acagaactat 1560 | gtttaatgtg | taaagattag tcgcacatca | agtcatctgt | tacaatatgt | |
| tacaacaagt 1620 | cataagccca | acaaagttag cacgtctaaa | taaactaaag | agtccacgaa | |
| aatattacaa 1680 | atcataagcc | caacaaagtt attgatcaaa | aaaaaaaaac | gcccaacaaa | |
| gctaaacaaa | gtccaaaaaa | aacttctcaa gtctccatct | tcctttatga | acattgaaaa |
-40CZ 306357 B6
1740
| ctatacacaa 1800 | aacaagtcag | ataaatctct | ttctgggcct | gtcttcccaa | cctcctacat |
| cacttcccta 1860 | tcggattgaa | tgttttactt | gtaccttttc | cgttgcaatg | atattgatag |
| tatgtttgtg 1920 | aaaactaata | gggttaacaa | tcgaagtcat | ggaatatgga | tttggtccaa |
| gattttccga 1980 | gagctttcta | gtagaaagcc | catcaccaga | aatttactag | taaaataaat |
| caccaattag 2040 | gtttcttatt | atgtgccaaa | ttcaatataa | ttatagagga | tatttcaaat |
| gaaaacgtat 2100 | gaatgttatt | agtaaatggt | caggtaagac | attaaaaaaa | tcctacgtca |
| gatattcaac 2160 | tttaaaaatt | cgatcagtgt | ggaattgtac | aaaaatttgg | gatctactat |
| atatatataa 2220 | tgctttacaa | cacttggatt | tttttttgga | ggctggaatt | tttaatctac |
| atatttgttt 2280 | tggccatgca | ccaactcatt | gtttagtgta | atactttgat | tttgtcaaat |
| atatgtgttc 2340 | gtgtatattt | gtataagaat | ttctttgacc | atatacacac | acacatatat |
| atatatatat 2400 | atatattata | tatcatgcac | ttttaattga | aaaaataata | tatatatata |
| tagtgcattt 2460 | tttctaacaa | ccatatatgt | tgcgattgat | ctgcaaaaat | actgctagag |
| taatgaaaaa 2520 | tataatctat | tgctgaaatt | atctcagatg | ttaagatttt | cttaaagtaa |
| attctttcaa 2580 | attttagcta | aaagtcttgt | aataactaaa | gaataataca | caatctcgac |
| cacggaaaaa 2640 | aaacacataa | taaatttgaa | tttcgaccgc | ggtacccgga | attcgagctc |
| ggtacccggg 2700 | gatcttcccg | atctagtaac | atagatgaca | ccgcgcgcga | taatttatcc |
| tagtttgcgc 2760 | gctatatttt | gttttctatc | gcgtattaaa | tgtataattg | cgggactcta |
| atcataaaaa 2820 | cccatctcat | aaataacgtc | atgcattaca | tgttaattat | tacatgctta |
| acgtaattca 2880 | acagaaatta | tatgataatc | atcgcaagac | cggcaacagg | attcaatctt |
| aagaaacttt 2940 | attgccaaat | gtttgaacga | tctgcttcgg | atcctctaga | ccaagcttgc |
| gggtttgtgt 3000 | ttccatattg | ttcatctccc | attgatcgta | ttaagaaagt | atgatggtga |
| tgtcgcagcc | ttccgctttc | gcttcacgga | aaacctgaag | cacactctcg | gcgccatttt |
-41 CZ 306357 B6
3060
| cagtcagctg 3120 | cttgctttgt | tcaaactgcc | tccattccaa | aacgagcggg | tactccaccc |
| atccggtcag 3180 | acaatcccat | aaagcgtcca | ggttttcacc | gtagtattcc | ggaagggcaa |
| gctccttttt 3240 | caatgtctgg | tggaggtcgc | tgatacttct | gatttgttcc | ccgttaatga |
| ctgctttttt 3300 | catcggtagc | taatttcttt | aagtaaaaac | tttgatttga | gtgatgatgt |
| tgtactgtta 3360 | cacttgcacc | acaagggcat | atatagagca | caagacatac | acaacaactt |
| gcaaaactaa 3420 | cttttgttgg | agcatttcga | ggaaaatggg | gagtagcagg | ctaatctgag |
| ggtaacatta 3480 | aggtttcatg | tattaatttg | ttgcaaacat | ggacttagtg | tgaggaaaaa |
| gtaccaaaat 3540 | tttgtctcac | cctgatttca | gttatggaaa | ttacattatg | aagctgtgct |
| agagaagatg 3600 | tttattctag | tccagccacc | caccttatgc | aagtctgctt | ttagcttgat |
| tcaaaaactg 3660 | atttaattta | cattgctaaa | tgtgcatact | tcgagcctat | gtcgctttaa |
| ttcgagtagg 3720 | atgtatatat | tagtacataa | aaaatcatgt | ttgaatcatc | tttcataaag |
| tgacaagtca 3780 | attgtccctt | cttgtttggc | actatattca | atctgttaat | gcaaattatc |
| cagttatact 3840 | tagctagata | tccaattttg | aataaaaata | gctcttgatt | agtaaaccgg |
| atagtgacaa 3900 | agtcacatat | ccatcaaact | tctggtgctc | gtggctaagt | tctgatcgac |
| atggggttaa 3960 | aatttaaatt | gggacacata | aatagcctat | ttgtgcaaat | ctccccatcg |
| aaaatgacag 4020 | attgttacat | ggaaaacaaa | aagtcctctg | atagaagtcg | caaagtatca |
| caattttcta 4080 | tcgagagata | gattgaaaga | agtgcaggga | agcggttaac | tggaacataa |
| cacaatgtct 4140 | aaattaattg | cattcgctaa | ccaaaaagtg | tattactctc | tccggtccac |
| aataagttat 4200 | tttttggccc | tttttttatg | gtccaaaata | agtgagtttt | ttagatttca |
| aaaatgattt 4260 | aattattttt | ttactacagt | gcccttggag | taaatggtgt | tggagtatgt |
| gttagaaatg 4320 | tttatgtgaa | gaaatagtaa | aggttaatat | gatcaatttc | attgctattt |
| aatgttaaaa | tgtgaatttc | ttaatctgtg | tgaaaacacc | aaaaaatcac | ttattgtgga |
- 4? CZ 306357 B6
4380
| ccggagaaag 4440 | tatataaata | tatatttgga | agcgactaaa | aataaacttt | tctcatatta |
| tacgaaccta 4500 | aaaacagcat | atggtagttt | ctagggaatc | taaatcacta | aaattaataa |
| aagaagcaac 4560 | aagtatcaat | acatatgatt | tacaccgtca | aacacgaaat | tegtaaatat |
| ttaatataat 4620 | aaagaattaa | tccaaatagc | ctcccaccct | atkaettaaa | ctaaaaataa |
| ccagcgaatg 4680 | tatattatat | gcataattta | tatattaaat | gtgtataatc | atgtataatc |
| aatgtataat 4740 | ctatgtatat | ggttagaaaa | agtaaacaat | taatatagee | ggctatttgt |
| gtaaaaatcc 4800 | ctaatataat | cgcgacggat | ccccgggaat | tccggggaag | cttagatcca |
| tggagccatt 4832 | tacaattgaa | tatatcctgc | eg |
<210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 248 <400> 3 catgccctga cccaggctaa gtattttaac tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60 <210>4 <211> 60 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 249 <400> 4 caatgggact gtcggaggac tgagggccaa agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60 <400> 5 <211> 26 <212>DNA <213> Umělá sekvence
-43 CZ 306357 B6 <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 247 <400> 5 ccgtcaccga gatctgatct cacgcg 26 <210> 6 <211> 24 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 250 <400> 6 gcactgaggg ccaaagcttg gctc 24 <210>7 <211> 25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 251 <400> 7 ggatcccccg atgagctaag ctagc 25 <210>8 <211> 21 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 254 <400> 8 cttagcctgg gtcagggcat g 21 <210>9 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 258
-44CZ 306357 B6 <400> 9 ctacggcaat gtaccagctg 20 <210> 10 <211> 23 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer SP6 < 400> 10 taatacgact cactataggg cga 23 <210> 11 <211>22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer T7 <400> 11 tttaggtgac actatagaat ac 22 <210> 12 <211> 21 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 201 <400> 12 gcttggacta taatacctga c 21 <210> 13 <211> 953 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN1 <220>
< 221> různé vlastnosti
-45 CZ 306357 B6 <222> (1)..(24) <223> pGEM®-T <400> 13 cccngccgcc atggccgcgg gattcttagc ctgggtcagg gcatgcatgg tgtgatccaa60 agactttctc ggcccaaata ctaatcatca caagtcatgc atgatctgct cgggatggcc120 aagaaaaatc gaacccatga caatattcac agttgtaagt tttttaccag tagacaaata180 ccacttggtt taacatattg taaacttaat atatagaaga tgttcctatt cagaaaataa240 tatatgtata tatataaaat tttattggcg actcgaggat gcacagaaat ataaaatgtt300 ggtcgcttag accatctcca atgtatttct ctatttttac ctctaaaata aaggagctct360 ataatagagg tgggttttgc tccaatgtat ttctttaaaa tagagatctc tacatataga420 gcaaaatata gaggaatgtt atttcttcct ctataaatag aggagaaaat agcaatctct480 attttagagg caaaaataga gatbsgttgg agtgattttg cctctaaatg ctattataga540 ggtagaaata gaggtgggtt ggagatgctc ttactatttt catagtaggt gaaaacttga600 aactagaaag ctttggagtg tacgagtgga aaacctctct ttgtagaaac atacacatgc660 catttagtta actagttgac atagattttt gagtcagata actttaagaa tatatatgtt720 tggatgagag tttgacactt tgagccactc gaaggacaaa ttttaaaaac ttgtgggatg780 ctgtggccat aaaccttgag gacvstttga tcatattcta ttaactacag tacgaatatg840 attcgacctt tgcaattttc tcttcaggta ctcggccgtc gaactcggcc gtcgagtaca900 tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg ttaattccca tcttgaaaga aat953 <210> 14 <211> 16 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 611 <400> 14 ngtcgaswgt ntwcaa <210> 15 <211> 22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 259
-46CZ 306357 B6 <400> 15 gtgcagggaa gcggttaact gg 22 < 210> 16 <211>22 <212>DNA < 213> Umělá sekvence < 220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer 260 ίο < 400> 16 cctttggagt aaatggtgtt gg 22 < 210> 17 <211>20 <212>DNA < 213> Umělá sekvence < 220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer 24 < 400> 17 gcgaatgtat attatatgca 2C < 210> 18 <2U>537 <212>DNA < 213> Umělá sekvence < 220>
< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1 <400> 18
| gcgaatgtat | attatatgca | taatttatat | attaaatgtg | tataatcatg | tataatcaat | 60 |
| gtataatcta | tgtatatggt | tagaaaaagt | aaacaattaa | tatagccggc | tatttgtgta | 120 |
| aaaatcccta | atataatcga | cggatccccg | ggaattccgg | gggaagctta | gatccatgga | 180 |
| tttgttatga | taaccaaaaa | caccctcctt | tttattataa | aggtagggat | agctaatctg | 240 |
| ttattcggtt | ttgattagag | atattaatcc | cgttttatca | agtacagttt | gatgtatttt | 300 |
| tttgttcgtt | ttcattacaa | tccaagacaa | gttaggttta | ttacatttta | ccaaaaaaaa | 360 |
| aggtttggtt | tattgtgaac | attgctgcgg | tttatttaaa | tttgattcta | ttcaaaggtc | 420 |
| aatccgtatt | taacaagtaa | actagtcttt | atataatctt | aaatctaacg | atctttgatt | 480 |
| tttaaattgc | atttanctat | gtcctctctg | gcgtatatgg | tctctttgaa | aacactc | 537 |
-47CZ 306357 B6 < 210> 19 < 211> 19 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 51 <400> 19 tgacactttg agccactcg 19 <210> 20 <211>20 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer 48 < 400> 20 ggagggtgtt tttggttatc 20 < 210> 21 <211>178 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující deleci inzerěního místa MS-BN1 <400>21 gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa60 ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc120 aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc178 <210> 22 <211> 1198 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: inzerční úsek MS-BN1
-48CZ 306357 B6 <400> 22 catggtgtga tccaaagact ttctcggccc aaatactaat catcacaagt catgcatgat60 ctgctcggga tggccaagaa aaatcgaacc catgacaata ttcacagttg taagtttttt120 accagtagac aaataccact tggtttaaca tattgtaaac ttaatatata gaagatgttc180 ctattcagaa aataatatat gtatatatat aaaattttat tggcgactcg aggatgcaca240 gaaatataaa atgttggtcg cttagaccat ctccaatgta tttctctatt tttacctcta300 aaataaagga gctctataat agaggtgggt tttgctccaa tgtatttctt taaaatagag360 atctctacat atagagcaaa atatagagga atgttatttc ttcctctata aatagaggag420 aaaatagcaa tctctatttt agaggcaaaa atagagatbs gttggagtga ttttgcctct480 aaatgctatt atagaggtag aaatagaggt gggttggaga tgctcttact attttcatag540 taggtgaaaa cttgaaacta gaaagctttg gagtgtacga gtggaaaacc tctctttgta600 gaaacataca catgccattt agttaactag ttgacataga tttttgagtc agataacttt660 aagaatatat atgtttggat gagagtttga cactttgagc cactcgaagg acaaatttta720 aaaacttgtg ggatgctgtg gccataaacc ttgaggacvs tttgatcata ttctattaac780 tacagtacga atatgattcg acctttgcaa ttttctcttc aggttttcta attcatatgg840 atttgttatg ataaccaaaa acaccctcct ttttattata aaggtaggga tagctaatct900 gttattcggt tttgattaga gatattaatc ccgttttatc aagtacagtt tgatgtattt960 ttttgttcgt tttcattaca atccaagaca agttaggttt attacatttt accaaaaaaa
1020 aaggtttggt ttattgtgaa cattgctgcg gtttatttaa atttgattct attcaaaggt 1080 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatctttgat 1140 ttttaaattg catttancta tgtcctctct ggcgtatatg gtctctttga aaacactc 1198 <210>23 <211>22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
io <223> Popis umělé sekvence: primer 193 <400> 23 tcatctacgg caatgtacca gc <210>24
-49CZ 306357 B6 <211>1077 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek RF-BN 1 <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1)..(45) <223> pGEM®-T <220>
<221 > různé vlastnosti <222> (1061).. (1077) <223> pGEM®-T <400> 24 gagctctccc atatggtcga cctgcaggcg gccgcactag tgattcttag cctgggtcag60 ggcatggcat gtctgatggt acatgctaaa tgctatattt cctgtttaaa gtgttaaaat120 cattttctga tggaactaaa tccagtttta agagtaactg acaagtacaa ttaagcacaa180 caatataata gtagtaattg gcatctttga ttgttaaata tcaaaacagt aaagttacaa240 aaaaaaatac caaaccaata atgaagactt ggcggagaca gtgccgtgcg aaggttttcg300 gaggtccgag acgagttcaa aaatacattt tacataatat atttttcata tatatatata360 tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct tcaccaaaat420 tttataaact aaatttttaa atcatgaaca aaaagtatga atttgtaata taaatacaaa480 gatacaaatt tttgattgaa atattggtag ctgtcaaaaa agtaaatctt agaatttaaa540 ttaactatag taaactatat attgaaaata ttataaattt ttatcaaatt ctcataaata600 tataaaataa atctaactca tagcatataa aaagaagact aatgtggatc aaaatattta660 cagtttttta gaagtagaat ctttatagtt ttatttaaaa tatagcaaaa atgatcacaa720 acctagttay ttaaggagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaat ctatctaaaa780 aaatatgtta actaccatgc aaaagtattt tttttgtaat tagaaaccct gaaatttgta840 caaaacttgg acccctaggt aaatgccttt ttcatctcgc gataagaaaa ggcaatttgt900 agatgttaat tcccatcttg aaagaaatat agtttaaata tttattgata aaataacaag960 tcaggtatta tagtccaagc aaaaacataa atttattgat gcaagtttaa attcagaaat
1020 atttcaataa ctgattatat cagctggtac atcgccgtag aatcccgcgc catggcg 1077
-50CZ 306357 B6 <210> 25 <211> 16 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 286 <400> 25 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 26 <211> 19 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 314 <400> 26 gtaggaggtt gggaagacc 19 <210> 27 <211>25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 315 <400> 27 gggctttcta ctagaaagct ctcgg 25 <210> 28 <211> 24 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 316 <400> 28 ccgataggga agtgatgtag gagg 24 <210> 29 <211> 21
-51 CZ 306357 Β6 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 288 <400> 29 atgcagcaag aagcttggag g <210> 30 <211> 1501 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN 1 <220>
<221> různé vlastnosti <222> (1)..(16) <223> pGEM®-T <220>
<221 > různé vlastnosti <222> (1458).. (1501) <223> pGEM®-T <400> 30
| ccatggccgc | gggattgtag | gaggttggga agacaggccc agaaagagat | ttatctgact | 60 | ||
| cgttttgtgt | atagttttca | atgttcataa | aggaagatgg | agacttgaga | agtttttttt | 120 |
| ggactttgtt | tagctttgtt | gggcgttttt | tttttttgat | caataacttt | gttgggctta | 180 |
| tggtcgataa | gcgtgcgcat | gtctgatggt | acatgctaaa | tgctatattt | ctgtttaaag | 240 |
| tgttaaaatc | attttctgat | ggaactaaat | ccagttttaa | gagtaactga | caagtacaat | 300 |
| taagcacaac | aataaaatag | tagtaattgg | catctttgat | tgttaaatat | caaaacaata | 360 |
| aagttacaaa | aaaaaatacc | aaaccaataa | tgaagacttg | gcggagacag | tgccgtgcga | 420 |
| aggttttcgg | aggtccgaga | cgagttcaaa | aatacatttt | acataatata | tttttcatat | 480 |
| atatatatat | atataacatt | caaaagtttg | aattattaca | taaacgtttt | ctaaattttc | 540 |
| ttcaccaaaa | ttttataaac | taaaattttt | maatcatgaa | caaaaagtat | gaatttgtaa | 600 |
| tataaatacm | aagatacaaa | tttttgattg | aaatattggt | agctgtcaaa | aaagtaaatc | 660 |
| ttagaattta | aattaactat | agtaaactat | atatggaaaa | tattataaat | ttttatcaaa | 720 |
ttctcataaa tatataaaat aaatctaact catagcatat aaaaagaaga ctaatgtgga 780 tcaaratatt tacagttttt tagaagtaga atctctatag ttttatttaa aatatagcaa 840 aaatgatcac aaacctagtt actttaacca gaagtccaat tcaaaatcaa ataaaaataa 900 aaatctatct aaaaaaatat gttaactacc atgcaaaagt attttttttt gtaattagaa 960 accctgaaat ttgtacaaaa cttggacccc taggtaaatt ccctagaaag tatcctatta 1020 gcgtcgacaa actgttgctc atatttttct ctccttactt tatatcatac actaatatan 1080 gnagatgatc taattaatta ttcatttcca tgctagctaa ttcaagaaaa agaaaaaaaa 1140 ctattatcta aacttatatt cgagcaacac ctcggagata acaggatata tgtcattaat 1200 gaatgcttga actcatctcg cgaactcatc tcgcatcgct tatagccaca aagatccaac 1260 ccctctcttc aatcatatat cagtagtaca atacaaatag atattgtgag cacatatgcc 1320 gtctagtact gatgtgtaca tgtagaggag ccgcaaatgt ttagtcactc caacaaatga 1380 gcatgaccac gcatcttctg atgatgtaca gccgtccctt ttgctctctc aaatatcctc 1440 caagcttctt gctgcataaa tcactagtgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag 1500
150 <210> 31 < 211> 21 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer 269 <400>31 ggttttcgga ggtccgagac g < 210> 32 < 211> 21 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer 283
-53 CZ 306357 B6 <400> 32 cttggacccc taggtaaatg c 21 <210> 33 <211>22 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 284 <400> 33 gtacaaaact tggaccccta gg 22 <210> 34 <211> 1068 <212> DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující deleci cílového místa RF-BN1 < 400> 34 cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac60 ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga120 gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt180 tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat240 ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca300 acacctcgga gataacagga tatatgttat taatgaatgc ttgaactcat ctcgcgaact360 catctcgcat cgcttatagc cacaaagatc caacccctct cttcaatcat atatcagtag420 tacaatacaa atagatattg tgagcacata tgccgtctag tactgatgtg tatatgtaga480 gganngcaaa tgtttagtca ctccaacaaa tgagcatgac nacgcatctt ctgatgatgt540 acagccgtcc cttttgctct ctcaaatatc ctccaagctt cttgctgcat ggaatcttct600 tcttggtgtc tttcatgata acaaaatcta acgagagaga aacccttagt caagaaaaaa660 caaataaaac tctaacgaga gtgtgtgaga aagtagagag tatgtgtgag tgacggagag720 aaagtgagac cataaagatg ttgtgcaaag agagcaagac ttaacctata tatactcaca780 tacacgtaca catcataccc attanagata ataaaaagga aaaaggaaca actaacaagg840 gaactgtatc ccatacttta tctcatcata catgatgcat aatatattct ttcgtatatc900
- 54CZ 306357 B6 aagaaaaatg agcctgatat ttttttattt ttagagatag tgccatgtca aatttctaag 1020 caaccccacg cgcattgtgt tcatttctct 1068 cgaaactaaa agagtgtcta tttctctctc 960 aagtagcaag atttacaaag gaatctaaag cgaccatccc gcggccat <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 57 <400> 35 gcatgatctg ctcgggatgg c 21 <210> 36 <211> 909 < 212> DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky < 400> 36 tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta60 agttttttac cagtagacaa ataccacttg gtttaacata ttgtaaactt aatatataga120 agatgttcct attcagaaaa taatatatgt atatatataa aattttattg gcgactcgag180 gatgcacaga aatataaaat gttggtcgct tagaccatct ccaatgtatt tctctatttt240 tacctctaaa ataaaggaac tctataatag aggtgggttt tactccaatg tatttcttta300 aaatagagat ctctacatat agagcaaaat atagaggaat gttatttctt cctctataaa360 tagaggagaa aatagcaatc tctattttag aggcaaaaat agagatgggt tggagtgatt420 ttgcctctaa atgctattat agaggtagaa atagaggtgg gttggagatg ctcttactat480 tttcatagta ggtgaaaact tgaaactaga aagctttgga gtgtacgagt ggaaaacctc540 tctttgtaga aacatacaca tgccatttag ttaactagtt gacatagatt tttgagtcag600 ataactttaa gaatatatat gtttggatga gagtttgaca ctttgagcca ctcgaaggac660 aaattttaaa aacttgtggg atgctgtggc ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat720 tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca gtactcggcc780 gtcgaactcg gccgtcgagt acatggtcga taagaaaagg caatttgtag atgttaattc840
-55CZ 306357 B6 ccatcttgaa agaaatatag tttaaatatt tattggataa aataacaagt caggtattat 900 agtccaagc 909 <210> 37 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 68 <400> 37 ccatatacgc cagagaggac 20 <210> 38 <211> 522 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 38 gcgaatgtat attatatgca taatttatat attaaatgtg tataatcatg tataatcaat60 gtataatcta tgtatatggt tagaaaaagt aaacaattaa tatagccggc tatttgtgta120 aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg gggaagctta gatccatgga180 tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tttattataa aggtagggat agctaatctg240 ttattcggtt ttgattagag atattaatcc cgttttatca agtacagttt gatgtatttt300 tttgttcgtt ttcattacaa tccaagacaa gttaggttta ttacatttta ccaaaaaaaa360 aggtttggtt tattgtgaac attgctgcgg ttttatttaa atttgattct attcaaaggt420 caatccgtat ttaacaagta aactagtctt tatataatct taaatctaac gatacttgga480 tttttaaatt gcatttagct atgtcctctc tggcgtatat gg522 <210> 39 <211> 694 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5' sousedící úsek RF-BN 1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 39 ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata60 tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct120 tcaccaaaat tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat180 ataaatacaa agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct240 tagaatttaa attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat300 tctcataaat atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat360 caaaatattt acagtttttt agaagtagaa tctttatagt tttatttaaa atatagcaaa420 aatgatcaca aacctagtta ctttaaccag aagtccaatt caaaatcaaa taaaaataaa480 aatctatcta aaaaaatatg ttaactacca tgcaaaagta tttttttttg taattagaaa540 ccctgaaatt tgtacaaaac ttggacccct aggtaaatgc ctttttcatc tcgcgataag600 aaaaggcaat ttgtagatgt taattcccat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt660 gataaaataa caagtcaggt attatagtcc aagc694 <210> 40 <211> 1279 <212>DNA <213> Umělá sekvence ίο <220>
<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3' sousedící úsek RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 40 gggggttttt ttttttgatc aataactttg ttgggcttat ggtcgataag cgtgcgcatg60 tctgatggta catgctaaat gctatatttc tgtttaaagt gttaaaatca ttttctgatg120 gaactaaatc cagttttaag agtaactgac aagtacaatt aagcacaaca ataaaatagt180 agtaattggc atctttgatt gttaaatatc aaacaataaa gttcaaaaaa aaataccaac240 ccaataatga agacttggcg gagacagtgc cgtgcgaagg ttttcggagg tccgagacga300 gttcaaaaat acattttaca taatatattt ttcatatata tatatatata taacattcaa360 aagtttgaat tattacataa acgttttcta aattttcttc accaaaattt tataaactaa420 aatttttaaa tcatgaacaa aaagtatgaa tttgtaatat aaatacaaag atacaaattt480 ttgattgaaa tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt540 aaactatata ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa600 tctaactcat agcatataaa aagaagacta atgtggatca aaatatttac agttttttag660
- 57 CZ 306357 B6 aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact720 ttaaccagaa gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tctatctaaa aaaatatgtt780 aactaccatg caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt840 ggacccctag gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata900 tttttctctc cttactttat atcatacact aatataaaaa gatgatctaa ttaattattc960 atttccatgc tagctaattc aagaaaaaga aaaaaaactt attatctaaa cttatattcg
1020 agcaacacct cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080 aactcatctc gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140 gtagtacaat acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200 tagaggagcc gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atcttctgat 1260 gatgtacagc cgtcccttt 1279 <210>41 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer 268 (BNA04) <400> 41 tggaccccta ggtaaatgcc 20 <210> 42 <211> 22 <212>DNA < 213> Umělá sekvence <220>
< 223> Popis umělé sekvence: primer BNA05 < 400> 42 aacgagtgtc agctagacca gc <210> 43 <211>22 <212>DNA
-58CZ 306357 B6 <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: primer BNA06 <400> 43 cgcagttctg tgaacatcga cc
Claims (32)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny, obsahující elitní událost RF-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, přiěemž rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletiva jsou připravitelná ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
- 2. Rostlina, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 215 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. C. 23 a SEKV. ID. C. 41.
- 3. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 1, dále obsahující elitní událost MS-BN 1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
- 4. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 3, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 280 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
- 5. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, které mohou být získány křížením rostliny s rostlinou ozimé řepky olejky získanou ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
- 6. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde se jedná o hybridní rostlinu, semena nebo hybridní rostlinné buňky nebo pletiva.
- 7. Rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, rostlinné buňky nebo pletivo, obsahující elitní událost MS-BN1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, přičemž rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletiva jsou připravitelná ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.
- 8. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 7, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 280 bp s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
- 9. Způsob identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv, obsahujících elitní událost MS-BN1, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp s použitím-59CZ 306357 B6 polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv může být použita k amplifikaci DNA fragmentu velikosti 280 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
- 11. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost MS-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR primery, z nichž jeden rozpoznává cizorodou sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 1, další rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 18, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
- 12. Souprava podle nároku 11, vyznačující se tím, že primer rozpoznávající cizorodou DNA sekvenci MS-BN1 rozpoznává cizorodou sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo v SEKV. ID.Č. 18.
- 13. Souprava podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje PCR primery obsahující nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.
- 14. Způsob identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv obsahujících elitní událost RF-BN 1, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID.Č. 41.
- 15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti 215 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
- 16. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN 1, vyznačující se tím, že souprava obsahuje PCR primery, z nichž jeden rozpoznává cizorodou sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 2 a další rozpoznává 5' sousedící sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, pro použití v PCR identifikačním protokolu.
- 17. Souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že primer rozpoznávající cizorodou DNA sekvenci RF—BN 1 rozpoznává cizorodou DNA sekvenci RF—BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo v sekvenci SEKV. ID. Č. 30.
- 18. Souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že PCR primery obsahují nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.
- 19. Souprava pro identifikaci elitní události MS-BN1 v biologických vzorcích, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v SEKV. ID.Č. 18.
- 20. Souprava podle nároku 19, vyznačující se tím, že PCR primer nebo sonda rozpoznávající 5' sousedící sekvenci MS-BN1 obsahuje sekvenci SEKV. ID. C. 19.-60CZ 306357 B6
- 21. Souprava podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává cizorodou DNA sekvenci MS-BN 1 v sekvenci SEKV. ID.Č. 1.
- 22. Souprava podle nároku 21, vyznačující se tím, že druhý PCR primer nebo sonda rozpoznává cizorodou DNA sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo v sekvenci SEKV. ID. Č. 18.
- 23. Souprava podle nároku 21, vyznačující se tím, že druhý PCR primer nebo sonda obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 12.
- 24. Způsob pro potvrzení čistoty osiva, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro MS-BN1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. C. 18, ve vzorcích semen.
- 25. Způsob screeningu osiva na přítomnost MS-BN1, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro MS-BN 1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící sekvenci MS-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 13 nebo 3' sousedící sekvenci MS-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 18, ve vzorcích šarže osiva.
- 26. Souprava pro identifikaci elitní události RF-BN1 v biologických vzorcích, vyznačující se t í m , že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává 5' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící sekvenci RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30.
- 27. Souprava podle nároku 26, vyznačující se tím, že PCR primer nebo sonda rozpoznávající sekvenci 5' sousedící sekvenci RF-BN 1 obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 41.
- 28. Souprava podle nároku 26 nebo 27, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává cizorodou DNA sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 2.
- 29. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že druhý primer nebo sonda rozpoznává cizorodou DNA sekvenci RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo v sekvenci SEKV. ID. Č. 30.
- 30. Souprava podle nároku 28, vyznačující se tím, že druhý PCR primer nebo sonda obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 23.
- 31. Způsob potvrzení čistoty osiva, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro RF-BN 1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící úsek RF-BN 1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící úsek RF-BN1 v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, ve vzorcích semen.
- 32. Způsob screeningu osiva na přítomnost RF-BN 1, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci DNA sekvence specifické pro RF-BN 1 pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' sousedící úsek RF-BN1 obsažený v sekvenci SEKV. ID. Č. 24 nebo 3' sousedící úsek RF-BN 1 obsažený v sekvenci SEKV. ID. Č. 30, ve vzorcích šarže osiva.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/457,037 US6506963B1 (en) | 1999-12-08 | 1999-12-08 | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022367A3 CZ20022367A3 (cs) | 2003-01-15 |
| CZ306357B6 true CZ306357B6 (cs) | 2016-12-21 |
Family
ID=23815191
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2002-2367A CZ306357B6 (cs) | 1999-12-08 | 2000-12-06 | Hybrid ozimé řepky olejky, způsob identifikace transgenní rostliny a souprava pro tuto identifikaci |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6506963B1 (cs) |
| EP (1) | EP1244348B1 (cs) |
| CN (2) | CN1690211B (cs) |
| AT (1) | ATE323404T1 (cs) |
| AU (1) | AU783406B2 (cs) |
| CZ (1) | CZ306357B6 (cs) |
| DE (1) | DE60027469T2 (cs) |
| DK (1) | DK1244348T3 (cs) |
| HU (1) | HU225433B1 (cs) |
| PL (1) | PL205071B1 (cs) |
| UA (1) | UA88861C2 (cs) |
| WO (1) | WO2001041558A1 (cs) |
Families Citing this family (378)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6506963B1 (en) * | 1999-12-08 | 2003-01-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
| CN100506987C (zh) * | 2003-05-16 | 2009-07-01 | 家庭食品株式会社 | 食物或食物原材料中特定属的植物的定量pcr检测方法 |
| US8293503B2 (en) * | 2003-10-03 | 2012-10-23 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
| WO2006108674A2 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Bayer Bioscience N.V. | Elite event a2704-12 and methods and kits for identifying such event in biological samples |
| BRPI0614693A2 (pt) | 2005-07-29 | 2011-04-12 | Monsanto Technology Llc | desenvolvimento de germoplasma usando segregados de cruzamentos transgênicos |
| WO2008073578A2 (en) | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Plant genes involved in nitrate uptake and metabolism |
| EP2016821A1 (en) * | 2007-06-13 | 2009-01-21 | Syngeta Participations AG | New hybrid system for Brassica napus |
| EP2554674B1 (en) | 2007-12-21 | 2014-11-05 | Keygene N.V. | Trichome specific promoters |
| EP2283034B1 (en) | 2008-05-08 | 2013-08-07 | Alellyx Applied Genomics | Genes and methods for increasing disease resistance in plants |
| BRPI1010843A2 (pt) | 2009-06-08 | 2015-09-08 | Nunhems Bv | plantas tolerantes à seca |
| NZ601341A (en) | 2010-01-22 | 2014-02-28 | Bayer Ip Gmbh | Acaricide and/or insecticide active substance combinations |
| EA030460B1 (ru) | 2010-05-28 | 2018-08-31 | Нунхемс Б.Ф. | Растения с увеличенным размером плода |
| MX347575B (es) | 2010-06-09 | 2017-05-03 | Bayer Cropscience N V * | Metodos y medios para modificar un genoma vegetal en una secuencia de nucleotidos usada comunmente en la ingenieria genetica de genomas vegetales. |
| AU2011264074B2 (en) | 2010-06-09 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| JP5860471B2 (ja) | 2010-11-15 | 2016-02-16 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | Ｎ−アリールピラゾール（チオ）カルボキサミド類 |
| SG190295A1 (en) | 2010-11-29 | 2013-06-28 | Bayer Ip Gmbh | Alpha,beta-unsaturated imines |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| JP6412311B2 (ja) | 2010-12-01 | 2018-10-24 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 作物において線虫類を防除するための、及び、収量を増加させるための、フルオピラムの使用 |
| JP2014513061A (ja) | 2011-03-10 | 2014-05-29 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 処理された種子の種子安全性を保護するためのリポキト−オリゴ糖化合物の使用 |
| EP2688413B1 (en) | 2011-03-23 | 2018-03-07 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations |
| WO2012136581A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| ES2561296T3 (es) | 2011-04-22 | 2016-02-25 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Combinaciones de un compuesto activo que comprenden un derivado de carboximida y un compuesto fungicida |
| EP2714901B1 (en) | 2011-05-31 | 2024-09-18 | Keygene N.V. | Pest resistant plants |
| WO2012171914A1 (en) | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent |
| CN103717076B (zh) | 2011-08-10 | 2016-04-13 | 拜耳知识产权股份有限公司 | 含有特定特特拉姆酸衍生物的活性化合物组合物 |
| BR112014003919A2 (pt) | 2011-08-22 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Ag | métodos e meios para modificar um genoma de planta |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| US9090600B2 (en) | 2011-09-12 | 2015-07-28 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal 4-substituted-3-{phenyl[(heterocyclylmethoxy)imino]methyl}-1,2,4-oxadizol-5(4H)-one derivatives |
| BR112014006217B1 (pt) | 2011-09-16 | 2019-01-15 | Bayer Intellectual Property Gmbh | utilização de acilsulfonamidas para melhorar o rendimento de plantas,método para induzir respostas de regulação de crescimento em plantas úteis ou plantas de cultura e composição. |
| CN103781352A (zh) | 2011-09-16 | 2014-05-07 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 苯基吡唑啉-3-甲酸酯类用于提高植物产量的用途 |
| CN107897194A (zh) | 2011-09-16 | 2018-04-13 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 5‑苯基‑或5‑苄基‑2‑异噁唑啉‑3‑甲酸酯用于改善植物产量的用途 |
| UA115132C2 (uk) | 2011-10-04 | 2017-09-25 | Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх | Спосіб боротьби з грибами та ооміцетами шляхом інгібування гена сахаропіндегідрогенази |
| CN104053770A (zh) | 2011-10-19 | 2014-09-17 | 凯金公司 | 用于产生肉桂酸内酯和/或补身二醇的方法 |
| RU2014125077A (ru) | 2011-11-21 | 2015-12-27 | Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх | Фунгицидные n-[(тризамещенный силил)этил]-карбоксамидные производные |
| AR089656A1 (es) | 2011-11-30 | 2014-09-10 | Bayer Ip Gmbh | Derivados de n-bicicloalquil- y n-tricicloalquil-(tio)-carboxamida fungicidas |
| CN104270946B (zh) | 2011-12-19 | 2017-05-10 | 拜耳农作物科学股份公司 | 邻氨基苯甲酸二酰胺衍生物用于防治转基因作物中的害虫的用途 |
| WO2013098146A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal 3-[(1,3-thiazol-4-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives |
| MX343871B (es) | 2011-12-29 | 2016-11-25 | Bayer Ip Gmbh | Derivados de 3-[(piridin-2-ilmetoxiimino)(fenil)metil]-2-sustituid o-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-ona fungicidas. |
| CN104507314B (zh) | 2012-01-25 | 2018-01-09 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 含有氟吡菌酰胺芽孢杆菌和生物防治剂的活性化合物结合物 |
| EP2806739A1 (en) | 2012-01-25 | 2014-12-03 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations containing fluopyram and biological control agent |
| AP2014007876A0 (en) | 2012-02-27 | 2014-08-31 | Bayer Ip Gmbh | Active compound combinations containing a thiazoylisoxazoline and a fungicide |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| CN104245687B (zh) | 2012-04-12 | 2016-12-14 | 拜尔农科股份公司 | 作为杀真菌剂的n-酰基-2-(环)烷基吡咯烷和哌啶 |
| JP2015516396A (ja) | 2012-04-20 | 2015-06-11 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（三置換シリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体 |
| KR102062517B1 (ko) | 2012-04-20 | 2020-01-06 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | Ｎ-시클로알킬-ｎ-［（헤테로시클릴페닐）메틸렌］-（티오）카르복사미드 유도체 |
| US9249104B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-02-02 | Bayer Cropscience Ag | Pyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| BR112014027644A2 (pt) | 2012-05-09 | 2017-06-27 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopirazol-indanil-carboxamidas |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| KR20150021503A (ko) | 2012-05-30 | 2015-03-02 | 바이엘 크롭사이언스 아게 | 생물학적 방제제 및 살진균제를 포함하는 조성물 |
| TR201816257T4 (tr) | 2012-05-30 | 2018-11-21 | Bayer Cropscience Ag | Bir biyolojik kontrol ajanı ve trifloksistrobin içeren bileşim. |
| NZ742941A (en) | 2012-05-30 | 2019-09-27 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the mitosis and cell division or compounds having a multi-site action |
| WO2013178655A1 (en) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the lipid membrane synthesis, the melanine biosynthesis, the nucleic acid synthesis or the signal transduction |
| BR112014029906A2 (pt) | 2012-05-30 | 2018-04-17 | Bayer Cropscience Ag | composições compreendendo um agente de controle biológico e um inseticida. |
| US9380787B2 (en) | 2012-05-30 | 2016-07-05 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of amino acid or protein biosynthesis, inhibitors of ATP production and inhibitors of the cell wall synthesis |
| JP2015519353A (ja) | 2012-05-30 | 2015-07-09 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | 生物的防除剤及び殺虫剤を含んでいる組成物 |
| BR112014029903A2 (pt) | 2012-05-30 | 2017-06-27 | Bayer Cropscience Ag | composições que compreendem um agente de controle biológico e um fungicida |
| EP3424322A1 (en) | 2012-07-31 | 2019-01-09 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Compositions comprising a pesticidal terpene mixture and an insecticide |
| UY35035A (es) | 2012-09-14 | 2014-04-30 | Bayer Cropscience Ag | ?molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una enzima hppd, vector, célula huésped, semilla, planta, polipéptido, producto primario, métodos y usos?. |
| EP2719280A1 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-16 | Bayer CropScience AG | Use of N-phenylethylpyrazole carboxamide derivatives or salts thereof for resistance management of phytopathogenic fungi |
| CA2888559C (en) | 2012-10-19 | 2021-03-02 | Bayer Cropscience Ag | Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| CA2888600C (en) | 2012-10-19 | 2021-08-10 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations comprising carboxamide derivatives |
| MX380476B (es) | 2012-10-19 | 2025-03-12 | Bayer Cropscience Ag | Método de promoción de crecimiento de planta usando derivados de carboxamida. |
| AU2013333847B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-04-20 | Bayer Cropscience Ag | Method for treating plants against fungi resistant to fungicides using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| WO2014083089A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Ternary fungicidal and pesticidal mixtures |
| UA116223C2 (uk) | 2012-11-30 | 2018-02-26 | Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт | Подвійна фунгіцидна суміш |
| BR122020019349B1 (pt) | 2012-11-30 | 2021-05-11 | Bayer Cropscience Ag | composição, seu processo de preparação, método para controlar um ou mais microrganismos nocivos, semente resistente a microorganismos nocivos e seu método de tratamento |
| UA117819C2 (uk) | 2012-11-30 | 2018-10-10 | Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт | Подвійні пестицидні і фунгіцидні суміші |
| BR112015012054A2 (pt) | 2012-11-30 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | mistura fungicida ou pesticida binária |
| WO2014086747A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| CN105025722A (zh) | 2012-12-03 | 2015-11-04 | 拜耳作物科学股份公司 | 包含生物防治剂和杀虫剂的组合物 |
| MX2015006631A (es) | 2012-12-03 | 2015-08-05 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un agente de control biologico y un insecticida. |
| WO2014086753A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising biological control agents |
| WO2014086748A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and a fungicide |
| MX2015006946A (es) | 2012-12-03 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende agentes de control biologico. |
| WO2014086758A2 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Composition comprising a biological control agent and an insecticide |
| PT3318129T (pt) | 2012-12-03 | 2020-02-18 | Bayer Cropscience Ag | Composição compreendendo uma combinação de paecilomyces lilacinus e fluopiram |
| WO2014090765A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Bayer Cropscience Ag | Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| US9428459B2 (en) | 2012-12-19 | 2016-08-30 | Bayer Cropscience Ag | Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides |
| CA2899490A1 (en) | 2013-02-11 | 2014-08-14 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising gougerotin and a fungicide |
| CA2898792A1 (en) | 2013-02-11 | 2014-08-14 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and another biological control agent |
| EP2953466A1 (en) | 2013-02-11 | 2015-12-16 | Bayer Cropscience LP | Compositions comprising gougerotin and an insecticide |
| CN105247054B (zh) | 2013-03-07 | 2019-06-18 | 阿则耐克斯公司 | 毒素基因及其使用方法 |
| AU2014255731B2 (en) | 2013-04-19 | 2018-07-26 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hybrid Brassica Plants and Methods for Producing Same |
| WO2014170345A2 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Bayer Cropscience Ag | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| CN105307492B (zh) | 2013-04-19 | 2018-03-30 | 拜耳作物科学股份公司 | 二元杀虫或除虫混合物 |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| US9770022B2 (en) | 2013-06-26 | 2017-09-26 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives |
| TW201609661A (zh) | 2013-12-05 | 2016-03-16 | 拜耳作物科學公司 | Ｎ－環烷基－ｎ－｛［２－（１－經取代環烷基）苯基］亞甲基｝－（硫代）甲醯胺衍生物 |
| EP3077377B1 (en) | 2013-12-05 | 2020-01-22 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| EP2885970A1 (en) | 2013-12-21 | 2015-06-24 | Bayer CropScience AG | Fungicide compositions comprising compound I, at least one succinate dehydrogenase (SDH) inhibitor and at least one triazole fungicide |
| CN106459986B (zh) | 2014-03-11 | 2020-06-30 | 拜耳作物科学有限合伙公司 | Hppd变体和使用方法 |
| WO2015160619A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide |
| WO2015160618A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent |
| WO2015160620A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Bayer Cropscience Lp | Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide |
| WO2016166077A1 (en) | 2015-04-13 | 2016-10-20 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives |
| EP3097782A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-11-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents |
| CA2996806A1 (en) | 2015-09-04 | 2017-03-09 | Keygene N.V. | Diplospory gene |
| WO2017042259A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Hppd variants and methods of use |
| WO2017049379A1 (en) | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Bayer Cropscience Inc. | Method for enhancing crop performance in brassica |
| AU2017230275B2 (en) | 2016-03-08 | 2021-02-18 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Herbicidal compositions comprising carfentrazone-ethyl and bromoxynil |
| EP3490379A1 (en) | 2016-07-29 | 2019-06-05 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants |
| BR112019010476A2 (pt) | 2016-11-23 | 2019-09-10 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, polipeptídeo recombinante, composição, método para controlar uma população de pragas, para matar pragas, para produzir um polipeptídeo, planta ou célula vegetal, método para proteger uma planta contra uma praga, para aumentar o rendimento em uma planta, uso e produto primário |
| EP3555056A1 (en) | 2016-12-19 | 2019-10-23 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| CN110431234B (zh) | 2017-01-18 | 2024-04-16 | 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 | Bp005毒素基因及其使用方法 |
| AR110756A1 (es) | 2017-01-18 | 2019-05-02 | Bayer Cropscience Lp | Uso de bp005 para el control de patógenos de planta |
| WO2018153730A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| US11708565B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seesi US LLC | HPPD variants and methods of use |
| WO2018184970A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2018188962A1 (en) | 2017-04-11 | 2018-10-18 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| MX2019012543A (es) | 2017-04-21 | 2019-12-02 | Bayer Cropscience Lp | Metodo para mejorar la seguridad de los cultivos. |
| WO2018202491A1 (en) | 2017-05-04 | 2018-11-08 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| CN110621669A (zh) | 2017-05-04 | 2019-12-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 防除植物病原性真菌的取代5-卤代烷基-5-羟基异噁唑类 |
| WO2018219797A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Basf Se | Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| EP3642187A1 (en) | 2017-06-19 | 2020-04-29 | Basf Se | 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi |
| AU2018308563B2 (en) | 2017-07-27 | 2024-01-04 | Basf Se | Use of herbicidal compositions based on L-glufosinate in tolerant field crops |
| WO2019025250A1 (en) | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| WO2019038042A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Basf Se | SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI |
| EP3684761A1 (en) | 2017-09-18 | 2020-07-29 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019068811A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Bayer Aktiengesellschaft | COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE |
| BR112020008092A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-09-15 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| BR112020008096A2 (pt) | 2017-10-24 | 2020-11-03 | Basf Se | método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica |
| WO2019101511A1 (en) | 2017-11-23 | 2019-05-31 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019121143A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Basf Se | Substituted cyclopropyl derivatives |
| WO2019137995A1 (en) | 2018-01-11 | 2019-07-18 | Basf Se | Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests |
| CN111669972A (zh) | 2018-01-29 | 2020-09-15 | 巴斯夫农业公司 | 新农业化学制剂 |
| MX2020008357A (es) | 2018-02-07 | 2020-09-25 | Basf Se | Piridincarboxamidas novedosas. |
| WO2019154665A1 (en) | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Basf Se | New pyridine carboxamides |
| CN111801014B (zh) | 2018-03-01 | 2022-05-27 | 巴斯夫农业公司 | 氯氟醚菌唑的杀真菌组合物 |
| WO2019219464A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Basf Se | Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi |
| WO2019224092A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Basf Se | Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides |
| CN112513033A (zh) | 2018-06-04 | 2021-03-16 | 拜耳公司 | 除草活性的双环苯甲酰基吡唑 |
| WO2020020895A1 (en) | 2018-07-26 | 2020-01-30 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of the succinate dehydrogenase inhibitor fluopyram for controlling root rot complex and/or seedling disease complex caused by rhizoctonia solani, fusarium species and pythium species in brassicaceae species |
| EP3613736A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-26 | Basf Se | Substituted glutarimide derivatives |
| EP3628158A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-01 | Basf Se | Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide |
| US12134616B2 (en) | 2018-10-23 | 2024-11-05 | Basf Se | Tricyclic pesticidal compounds |
| EP3643705A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-29 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| EP3670501A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-24 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| HUE062726T2 (hu) | 2019-01-11 | 2023-12-28 | Basf Se | 1-(1,2-dimetilpropil)-N-etil-5-metil-N-piridazin-4-il-pirazol-4-karboxamid kristályos formái |
| EP3696177A1 (en) | 2019-02-12 | 2020-08-19 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP3965575A1 (en) | 2019-05-10 | 2022-03-16 | Bayer CropScience LP | Active compound combinations |
| CN113874388B (zh) | 2019-05-29 | 2025-09-16 | 主基因有限公司 | 孤雌生殖基因 |
| EP3769623A1 (en) | 2019-07-22 | 2021-01-27 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| EP3975718A1 (en) | 2019-05-29 | 2022-04-06 | Basf Se | Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests |
| WO2020244970A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | New carbocyclic pyridine carboxamides |
| WO2020244969A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Pyridine derivatives and their use as fungicides |
| WO2020244968A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Basf Se | Fungicidal n-(pyrid-3-yl)carboxamides |
| EP3766879A1 (en) | 2019-07-19 | 2021-01-20 | Basf Se | Pesticidal pyrazole derivatives |
| KR20220035939A (ko) | 2019-07-22 | 2022-03-22 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살충제로서의 5-아미노-치환된 피라졸 및 트리아졸 |
| JP7691973B2 (ja) | 2019-07-23 | 2025-06-12 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 殺有害生物剤としての新規なヘテロアリール－トリアゾール化合物 |
| CA3148216A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| EP4007494B1 (en) | 2019-08-01 | 2026-03-18 | Bayer CropScience LLC | Method of improving cold stress tolerance and crop safety |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| EP4034656A1 (en) | 2019-09-26 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| WO2021063736A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | Bicyclic pyridine derivatives |
| WO2021063735A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Basf Se | New bicyclic pyridine derivatives |
| US20220361492A1 (en) | 2019-10-02 | 2022-11-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| CN117567338A (zh) | 2019-10-09 | 2024-02-20 | 拜耳公司 | 作为农药的新的杂芳基三唑化合物 |
| PH12022550862A1 (en) | 2019-10-09 | 2023-04-24 | Bayer Ag | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| MX2022004552A (es) | 2019-10-14 | 2022-10-10 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Nuevos genes de resistencia a insectos y métodos de uso. |
| BR112022007119A2 (pt) | 2019-10-14 | 2022-07-05 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Molécula de ácido nucleico, ácido nucleico, polipeptídeos, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, composição, métodos para controlar uma população de pragas, para matar uma praga, para produzir um polipeptídeo, para proteger uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta, planta, uso do ácido nucleico e produto básico |
| EP4055010A1 (de) | 2019-11-07 | 2022-09-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituierte sulfonylamide zur bekämpfung tierischer schädlinge |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| WO2021099271A1 (en) | 2019-11-18 | 2021-05-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| BR112022012417A2 (pt) | 2020-01-31 | 2022-08-30 | Pairwise Plants Services Inc | Supressão da resposta de evitação da sombra nas plantas |
| MX2022010059A (es) | 2020-02-18 | 2022-08-25 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de heteroaril-triazol como pesticidas. |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| EP4135512A1 (en) | 2020-04-16 | 2023-02-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| KR20230007398A (ko) | 2020-04-21 | 2023-01-12 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 해충 방제제로서 2-(헤트)아릴-치환된 축합 헤테로시클릭 유도체 |
| EP3903584A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv |
| EP3903583A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii |
| EP3903581A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i |
| EP3903582A1 (en) | 2020-04-28 | 2021-11-03 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii |
| EP4143167B1 (en) | 2020-04-28 | 2024-05-15 | Basf Se | Pesticidal compounds |
| TWI891782B (zh) | 2020-05-06 | 2025-08-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| JP7822960B2 (ja) | 2020-05-06 | 2026-03-03 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 殺真菌性化合物としてのピリジン（チオ）アミド |
| CN115605462B (zh) | 2020-05-12 | 2026-04-14 | 拜耳公司 | 作为杀真菌化合物的三嗪和嘧啶(硫代)酰胺 |
| EP3909950A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-17 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2021233861A1 (en) | 2020-05-19 | 2021-11-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds |
| BR112022024489A2 (pt) | 2020-06-02 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para o controle do tamanho do meristema para melhora da cultura agrícola |
| JP7840879B2 (ja) | 2020-06-04 | 2026-04-06 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 新規殺真菌剤としてのヘテロシクリルピリミジンおよびトリアジン |
| BR112022024413A2 (pt) | 2020-06-10 | 2023-02-07 | Bayer Ag | Heterociclos substituídos com azabiciclila como fungicidas inovadores |
| EP3945089A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v |
| WO2021249800A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Basf Se | Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides |
| MX2022015896A (es) | 2020-06-17 | 2023-02-22 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos. |
| CN116157017A (zh) | 2020-06-18 | 2023-05-23 | 拜耳公司 | 作为杀菌剂用于作物保护的3-(哒嗪-4-基)-5,6-二氢-4h-1,2,4-噁二嗪衍生物 |
| BR112022025344A2 (pt) | 2020-06-18 | 2023-01-03 | Bayer Ag | Composição para uso na agricultura |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| BR112022025710A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-03-07 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas |
| BR112022025692A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-02-28 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| BR112022026904A2 (pt) | 2020-07-02 | 2023-01-24 | Bayer Ag | Derivados de heterocicleno como agentes de controle de pragas |
| EP3960727A1 (en) | 2020-08-28 | 2022-03-02 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors vi |
| EP3939961A1 (en) | 2020-07-16 | 2022-01-19 | Basf Se | Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi |
| WO2022017836A1 (en) | 2020-07-20 | 2022-01-27 | BASF Agro B.V. | Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol |
| EP3970494A1 (en) | 2020-09-21 | 2022-03-23 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| IL301700A (en) | 2020-10-13 | 2023-05-01 | Keygene Nv | Modified promoter of a parthenogenesis gene |
| WO2022089969A1 (en) | 2020-10-27 | 2022-05-05 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| WO2022090069A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Compositions comprising mefenpyr-diethyl |
| WO2022090071A1 (en) | 2020-11-02 | 2022-05-05 | Basf Se | Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi |
| WO2022106304A1 (en) | 2020-11-23 | 2022-05-27 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| EP4259627B1 (en) | 2020-12-14 | 2025-08-20 | Basf Se | Sulfoximine pesticides |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| MX2023007290A (es) | 2020-12-18 | 2023-07-04 | Bayer Ag | Uso del inhibidor de dhodh para el control de hongos fitopatogenicos resistentes en cultivos. |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| US20240292798A1 (en) | 2020-12-21 | 2024-09-05 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP4043444A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-17 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| US20220259612A1 (en) | 2021-02-11 | 2022-08-18 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants |
| CA3211121A1 (en) | 2021-02-25 | 2022-09-01 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| BR112023019788A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-11-07 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| WO2022207494A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| IL308130A (en) | 2021-05-03 | 2023-12-01 | Basf Se | Additives to improve the effectiveness of pesticides of exterminating microorganisms |
| WO2022233777A1 (en) | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Bayer Aktiengesellschaft | Alkylamide substituted, annulated imidazoles and use thereof as insecticides |
| WO2022238391A1 (de) | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP4091451A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-23 | BASF Agro B.V. | Compositions comprising mefentrifluconazole |
| CN117355520A (zh) | 2021-05-18 | 2024-01-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 用作杀真菌剂的新型取代喹啉类 |
| EP4341258B1 (en) | 2021-05-18 | 2025-12-03 | Basf Se | New substituted pyridines as fungicides |
| JP2024519813A (ja) | 2021-05-18 | 2024-05-21 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 殺菌剤としての新規な置換ピリジン |
| CN117897050A (zh) | 2021-06-17 | 2024-04-16 | 成对植物服务股份有限公司 | 大豆中生长调节因子家族转录因子的修饰 |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| MX2023014883A (es) | 2021-07-01 | 2024-02-12 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos y composiciones para mejorar el desarrollo del sistema radicular. |
| EP4119547A1 (en) | 2021-07-12 | 2023-01-18 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| KR20240042636A (ko) | 2021-08-02 | 2024-04-02 | 바스프 에스이 | (3-피리딜)-퀴나졸린 |
| CN117794908A (zh) | 2021-08-02 | 2024-03-29 | 巴斯夫欧洲公司 | (3-喹啉基)-喹唑啉 |
| CA3229056A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-02-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| LT4384016T (lt) | 2021-08-13 | 2025-11-25 | Veikliųjų junginių deriniai ir juos apimančios fungicidinės kompozicijos | |
| PY2270221A (es) | 2021-08-17 | 2023-03-20 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plantas |
| EP4140986A1 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| MX2024002386A (es) | 2021-08-25 | 2024-03-14 | Bayer Ag | Nuevos compuestos de pirazinil-triazol como pesticidas. |
| EP4140995A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-01 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| CN118265446A (zh) | 2021-08-30 | 2024-06-28 | 成对植物服务股份有限公司 | 修饰植物中的泛素结合肽酶基因以改善产量性状 |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| EP4151631A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-22 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| AU2022352997A1 (en) | 2021-09-21 | 2024-04-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| CN118434850A (zh) | 2021-10-04 | 2024-08-02 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于改善小花能育性和种子产量的方法 |
| US20230116819A1 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| WO2023072671A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix |
| WO2023072670A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x |
| US20250064060A1 (en) | 2021-11-03 | 2025-02-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds |
| EP4441049A1 (en) | 2021-11-30 | 2024-10-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds |
| EP4194453A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-14 | Basf Se | Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests |
| UY40060A (es) | 2021-12-09 | 2023-07-14 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| EP4198033A1 (en) | 2021-12-14 | 2023-06-21 | Basf Se | Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4198023A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-21 | Basf Se | Pesticidally active thiosemicarbazone compounds |
| UY40132A (es) | 2022-01-31 | 2023-08-31 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| CA3243152A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING PESTS IN RAPESEED |
| WO2023148028A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Globachem Nv | Methods and compositions for controlling pests |
| CN118715211A (zh) | 2022-02-17 | 2024-09-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 杀有害生物活性氨硫脲化合物 |
| EP4486879A1 (en) | 2022-03-01 | 2025-01-08 | Wageningen Universiteit | Cas12a nickases |
| EP4238971A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-06 | Basf Se | Substituted isoxazoline derivatives |
| PY2314419A (es) | 2022-03-02 | 2023-09-25 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes del receptor de brasinoesteroides para mejorar rasgos de rendimiento |
| PE20250266A1 (es) | 2022-03-31 | 2025-01-29 | Pairwise Plants Services Inc | Plantas rosaceae de floracion temprana con caracteristicas mejoradas |
| AU2023251095A1 (en) | 2022-04-07 | 2024-10-17 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| CN119278208A (zh) | 2022-04-21 | 2025-01-07 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于改善产量性状的方法和组合物 |
| UY40250A (es) | 2022-05-02 | 2023-11-15 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar el rendimiento y la resistencia a enfermedades |
| IL316251A (en) | 2022-05-03 | 2024-12-01 | Bayer Ag | Use of (5S)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-6,5-dihydro-4H-4,2,1-oxadiazine for the control of undesirable microorganisms |
| IL316272A (en) | 2022-05-03 | 2024-12-01 | Bayer Ag | Crystalline forms of (5S)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-6,5-dihydro-4H-4,2,1-oxadiazine |
| UY40255A (es) | 2022-05-05 | 2023-11-15 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar la arquitectur radicular y/o mejorar los rangos de rendimient |
| UY40326A (es) | 2022-06-27 | 2023-12-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas |
| US20240002873A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| EP4547692A1 (en) | 2022-06-29 | 2025-05-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| AU2023317620A1 (en) | 2022-08-02 | 2025-02-13 | Basf Se | Pyrazolo pesticidal compounds |
| WO2024030984A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| UY40388A (es) | 2022-08-11 | 2024-03-15 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristema para la mejora de los cultivos |
| EP4584282A1 (en) | 2022-09-08 | 2025-07-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| EP4342885A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-27 | Basf Se | N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4361126A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-01 | Basf Se | Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv |
| EP4619399A1 (en) | 2022-11-16 | 2025-09-24 | Basf Se | New substituted tetrahydrobenzoxazepine |
| EP4619392A1 (en) | 2022-11-16 | 2025-09-24 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
| WO2024104818A1 (en) | 2022-11-16 | 2024-05-23 | Basf Se | Substituted benzodiazepines as fungicides |
| CN120202194A (zh) | 2022-11-16 | 2025-06-24 | 巴斯夫欧洲公司 | 作为杀真菌剂的取代的四氢苯并二氮杂䓬 |
| WO2024104643A1 (en) | 2022-11-17 | 2024-05-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Use of isotianil for controlling plasmodiophora brassica |
| CN117568502A (zh) * | 2022-12-12 | 2024-02-20 | 江西农业大学 | 一种筛选油菜铝毒敏感品种的引物对及其应用和方法 |
| EP4385326A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-19 | Kimitec Biogorup | Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants |
| AU2023408197A1 (en) | 2022-12-19 | 2025-06-26 | Basf Agricultural Solutions Us Llc | Insect toxin genes and methods for their use |
| EP4389210A1 (en) | 2022-12-21 | 2024-06-26 | Basf Se | Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2024165343A1 (en) | 2023-02-08 | 2024-08-15 | Basf Se | New substituted quinoline compounds for combatitng phytopathogenic fungi |
| US20240279673A1 (en) | 2023-02-16 | 2024-08-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| AR132019A1 (es) | 2023-03-02 | 2025-05-21 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar la evitación de la sombra en plantas |
| UY40664A (es) | 2023-03-09 | 2024-10-15 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de la vía de señalización de brasinoesteroide para mejorar rasgos de rendimien |
| JP2026509904A (ja) | 2023-03-17 | 2026-03-25 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | 植物病原真菌を駆除するための置換ピリジル／ピラジジルジヒドロベンゾチアゼピン化合物 |
| EP4455137A1 (en) | 2023-04-24 | 2024-10-30 | Basf Se | Pyrimidine compounds for the control of invertebrate pests |
| JP2026514960A (ja) | 2023-04-26 | 2026-05-13 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | Ｑｏ阻害剤ＸＶＩに対する耐性を付与するミトコンドリアシトクロムｂタンパク質におけるアミノ酸置換Ｆ１２９Ｌを含有する植物病原性真菌を駆除するためのストロビルリン型化合物の使用 |
| PY2439028A (es) | 2023-05-18 | 2025-06-18 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para mejorar las características de rendimiento de las plantas |
| EP4467535A1 (en) | 2023-05-25 | 2024-11-27 | Basf Se | Lactam pesticidal compounds |
| CN121464139A (zh) | 2023-07-05 | 2026-02-03 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于对抗植物病原性真菌的取代的喹啉基/喹喔啉基二氢吡咯并三嗪化合物 |
| CN121399131A (zh) | 2023-07-05 | 2026-01-23 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于对抗植物病原性真菌的取代的吡啶基/吡嗪基二氢吡咯并三嗪化合物 |
| WO2025008447A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| WO2025008446A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| EP4488269A1 (en) | 2023-07-06 | 2025-01-08 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4488270A1 (en) | 2023-07-06 | 2025-01-08 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| EP4488273A1 (en) | 2023-07-06 | 2025-01-08 | Basf Se | Triazole compounds for the control of invertebrate pests |
| UY40807A (es) | 2023-07-18 | 2025-02-28 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar la arquitectura radicular en plantas |
| UY40830A (es) | 2023-07-27 | 2025-02-28 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar rasgos de rendimiento de las plantas |
| WO2025026738A1 (en) | 2023-07-31 | 2025-02-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 6-[5-(ethylsulfonyl)-1-methyl-1h-imidazol-4-yl]-7-methyl-3-(pentafluoroethyl)-7h-imidazo[4,5-c]pyridazine derivatives as pesticides |
| EP4501112A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-05 | Globachem NV | Plant defense elicitors |
| WO2025026815A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-06 | Globachem Nv | Insecticidal mixtures |
| EP4758143A1 (en) | 2023-08-09 | 2026-06-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azaheterobiaryl-substituted 4,5-dihydro-1h-2,4,5-oxadiazines as novel fungicides |
| CN121693501A (zh) | 2023-08-09 | 2026-03-17 | 拜耳公司 | 作为新的杀菌剂的哒嗪-4-基噁二嗪 |
| WO2025031842A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Basf Se | New substituted benzoxazepine picolinonitrile compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| EP4758140A1 (en) | 2023-08-09 | 2026-06-17 | Basf Se | New substituted benzoxazine picolinonitrile compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| AU2024333800A1 (en) | 2023-08-31 | 2026-03-12 | Basf Agricultural Solutions Us Llc | Class 2 type v crispr-cas prime editing |
| PE20261029A1 (es) | 2023-09-21 | 2026-05-20 | Pairwise Plants Services Inc | Plantas de frambuesa negra de floracion temprana con caracteristicas mejoradas |
| PE20261030A1 (es) | 2023-09-29 | 2026-05-20 | Basf Se | Metodos para proteger plantas mediante el uso de mezclas que comprenden azufre y terpenos seleccionados |
| WO2025078183A1 (en) | 2023-10-09 | 2025-04-17 | Basf Se | Fungicidal mixture comprising substituted quinazolyl quinolines |
| CN121985880A (zh) | 2023-10-09 | 2026-05-05 | 巴斯夫欧洲公司 | 包含取代的吡啶的杀真菌混合物 |
| EP4791721A1 (en) | 2023-10-11 | 2026-08-19 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridazin-3-one-4-yloxadiazines as novel fungicides |
| US20250122522A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving crop yield traits |
| AU2024364447A1 (en) | 2023-10-19 | 2026-04-30 | Basf Agricultural Solutions Us Llc | Brassica napus plants having enhanced blackleg resistance |
| WO2025098875A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025098876A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025098874A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having fungicidal/insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025131902A1 (en) | 2023-12-21 | 2025-06-26 | Basf Se | Methods for protecting plants using mixtures comprising sulfur, selected terpenes and phosphites. |
| EP4574819A1 (en) | 2023-12-22 | 2025-06-25 | Basf Se | Diazinone compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2025168620A1 (en) | 2024-02-07 | 2025-08-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Heteroaryl-substituted 4,5-dihydro-1h-2,4,5-oxadiazines as novel fungicides |
| US20250270578A1 (en) | 2024-02-22 | 2025-08-28 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| WO2025180964A1 (en) | 2024-03-01 | 2025-09-04 | Basf Se | New substituted benzoxazepine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| WO2025186065A1 (en) | 2024-03-05 | 2025-09-12 | Bayer Aktiengesellschaft | Heteroaryl-substituted (aza)quinoxaline derivatives as pesticides |
| WO2025190927A1 (en) | 2024-03-14 | 2025-09-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025211272A1 (en) | 2024-04-04 | 2025-10-09 | Nihon Nohyaku Co., Ltd. | Pesticidal mixtures comprising an ethylsulfone compound |
| EP4640052A1 (en) | 2024-04-24 | 2025-10-29 | Basf Se | Mixtures of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors with at least one further pesticide i |
| WO2025223904A1 (en) | 2024-04-24 | 2025-10-30 | Basf Se | Mixtures of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors with at least one further pesticide i |
| EP4652843A1 (en) | 2024-05-21 | 2025-11-26 | Kimitec Biogroup S.L | Biopesticide composition, procedure of obtain thereof, and method for controlling and treating broad spectrum of pests in plants |
| EP4652842A1 (en) | 2024-05-21 | 2025-11-26 | Kimitec Biogroup S.L | Biopesticide composition, procedure of obtain thereof, and method for controlling and treating broad spectrum of pests, diseases and weeds in plants |
| WO2025257122A1 (en) | 2024-06-12 | 2025-12-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025257121A1 (en) | 2024-06-12 | 2025-12-18 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2026002763A1 (en) | 2024-06-26 | 2026-01-02 | Basf Se | Pesticidal mixtures and applications of beauveria bassiana and dimpropyridaz |
| WO2026012814A1 (en) | 2024-07-10 | 2026-01-15 | Basf Se | Compositions and methods to enhance crop yield and plant health |
| WO2026021910A1 (en) | 2024-07-23 | 2026-01-29 | Basf Se | New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| WO2026021911A1 (en) | 2024-07-23 | 2026-01-29 | Basf Se | New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| WO2026021912A1 (en) | 2024-07-23 | 2026-01-29 | Basf Se | New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| WO2026021909A1 (en) | 2024-07-23 | 2026-01-29 | Basf Se | New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi |
| WO2026027375A1 (de) | 2024-07-29 | 2026-02-05 | Bayer Aktiengesellschaft | Hydroxy-dihydropyridinon carboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2026037853A1 (en) | 2024-08-14 | 2026-02-19 | Basf Se | Benzoxazole derivatives as pesticidal compounds |
| WO2026041702A1 (en) | 2024-08-21 | 2026-02-26 | Basf Se | Benzoxazole derivatives as pesticidal compounds |
| EP4710766A1 (en) | 2024-09-11 | 2026-03-18 | Basf Se | Mixtures of ambruticin with at least one further pesticide |
| WO2026057375A1 (en) | 2024-09-11 | 2026-03-19 | Basf Se | Mixtures of ambruticin with at least one further pesticide |
| EP4721566A1 (en) | 2024-10-07 | 2026-04-08 | Kimitec Biogroup S.L | Microbial composition based on bacillus infantis strain for agricultural use |
| WO2026082481A1 (en) | 2024-10-17 | 2026-04-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2026082514A1 (en) | 2024-10-18 | 2026-04-23 | Basf Se | Pesticidal mixtures and applications of dimpropyridaz |
| WO2026093251A1 (en) | 2024-10-28 | 2026-05-07 | Basf Se | Pesticidal compounds and uses thereof |
| WO2026109530A1 (en) | 2024-11-21 | 2026-05-28 | Basf Se | Heterobicyclic compounds for the control of invertebrate pests |
| WO2026119600A1 (en) | 2024-12-04 | 2026-06-11 | Basf Se | Pesticidal mixtures |
| WO2026131328A1 (en) | 2024-12-19 | 2026-06-25 | Basf Se | Mixtures for protecting plants comprising limonene and fungicides |
| WO2026131327A1 (en) | 2024-12-19 | 2026-06-25 | Basf Se | Mixtures for protecting plants comprising limonene and fungicides |
| WO2026132258A1 (en) | 2024-12-20 | 2026-06-25 | Basf Se | Heterocyclic compounds for combating invertebrate pests |
| WO2026150086A1 (en) | 2025-01-10 | 2026-07-16 | Globachem N.V. | Method to improve a plant's growth, development and resistance to abiotic stress |
| LU509709B1 (en) | 2025-01-10 | 2026-07-13 | Inbiose Nv | Method to improve a plant's growth, development and resistance to abiotic stress |
| WO2026150087A1 (en) | 2025-01-10 | 2026-07-16 | Globachem N.V. | Method to improve a plant's resistance to biotic stress |
| LU509708B1 (en) | 2025-01-10 | 2026-07-10 | Inbiose Nv | Method to improve a plant's resistance to biotic stress |
| WO2026162563A1 (en) | 2025-01-30 | 2026-08-06 | Basf Agricultural Solutions Deutschland Gmbh | Diazinone derivatives for the control of invertebrate pests |
| WO2026162627A1 (en) | 2025-01-30 | 2026-08-06 | Basf Agricultural Solutions Deutschland Gmbh | Heterocyclic compounds for combating invertebrate pests |
| WO2026162559A1 (en) | 2025-01-30 | 2026-08-06 | Basf Agricultural Solutions Deutschland Gmbh | Diazinone derivatives for the control of invertebrate pests |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0344029A1 (en) * | 1988-04-28 | 1989-11-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants with modified stamen cells |
| EP0412911A1 (en) * | 1989-08-10 | 1991-02-13 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants with modified flowers |
| EP0757102A1 (en) * | 1995-08-04 | 1997-02-05 | Plant Genetic Systems N.V. | Genetic transformation using a PARP inhibitor |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0290799B9 (en) | 1983-01-13 | 2004-09-01 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Transgenic dicotyledonous plant cells and plants |
| WO1987007299A1 (en) | 1986-05-29 | 1987-12-03 | Calgene, Inc. | Transformation and foreign gene expression in brassica species |
| US5689041A (en) * | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| CA2213394C (en) | 1995-02-21 | 2010-05-04 | Plant Genetic Systems, N.V. | Method to obtain male sterile plants |
| US6506963B1 (en) * | 1999-12-08 | 2003-01-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same |
-
1999
- 1999-12-08 US US09/457,037 patent/US6506963B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-06 HU HU0203347A patent/HU225433B1/hu unknown
- 2000-12-06 AT AT00990782T patent/ATE323404T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-12-06 CN CN2005100719970A patent/CN1690211B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 UA UA2002075562A patent/UA88861C2/ru unknown
- 2000-12-06 PL PL356533A patent/PL205071B1/pl unknown
- 2000-12-06 DE DE60027469T patent/DE60027469T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CN CNB008168806A patent/CN1219065C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 AU AU30133/01A patent/AU783406B2/en not_active Expired
- 2000-12-06 DK DK00990782T patent/DK1244348T3/da active
- 2000-12-06 WO PCT/EP2000/012872 patent/WO2001041558A1/en not_active Ceased
- 2000-12-06 EP EP00990782A patent/EP1244348B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CZ CZ2002-2367A patent/CZ306357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-12-08 US US09/733,151 patent/US6563026B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-02-27 US US10/375,332 patent/US7659095B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-12-10 US US12/635,215 patent/US8026352B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-08-17 US US13/211,373 patent/US8309699B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0344029A1 (en) * | 1988-04-28 | 1989-11-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants with modified stamen cells |
| EP0412911A1 (en) * | 1989-08-10 | 1991-02-13 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants with modified flowers |
| EP0757102A1 (en) * | 1995-08-04 | 1997-02-05 | Plant Genetic Systems N.V. | Genetic transformation using a PARP inhibitor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3013301A (en) | 2001-06-18 |
| CN1409594A (zh) | 2003-04-09 |
| US20010029620A1 (en) | 2001-10-11 |
| HK1051295A1 (en) | 2003-08-01 |
| CZ20022367A3 (cs) | 2003-01-15 |
| EP1244348B1 (en) | 2006-04-19 |
| US8309699B2 (en) | 2012-11-13 |
| CN1690211B (zh) | 2010-05-12 |
| DE60027469D1 (de) | 2006-05-24 |
| US8026352B2 (en) | 2011-09-27 |
| PL356533A1 (en) | 2004-06-28 |
| HU225433B1 (en) | 2006-11-28 |
| US7659095B2 (en) | 2010-02-09 |
| CN1690211A (zh) | 2005-11-02 |
| EP1244348A1 (en) | 2002-10-02 |
| US20030188347A1 (en) | 2003-10-02 |
| AU783406B2 (en) | 2005-10-27 |
| US20100248232A1 (en) | 2010-09-30 |
| DE60027469T2 (de) | 2006-12-14 |
| HK1084415A1 (zh) | 2006-07-28 |
| HUP0203347A2 (hu) | 2003-01-28 |
| US6506963B1 (en) | 2003-01-14 |
| ATE323404T1 (de) | 2006-05-15 |
| DK1244348T3 (da) | 2006-08-21 |
| UA88861C2 (ru) | 2009-12-10 |
| PL205071B1 (pl) | 2010-03-31 |
| WO2001041558A1 (en) | 2001-06-14 |
| CN1219065C (zh) | 2005-09-14 |
| HUP0203347A3 (en) | 2004-10-28 |
| US6563026B2 (en) | 2003-05-13 |
| US20110294133A1 (en) | 2011-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6563026B2 (en) | Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same | |
| US6509516B1 (en) | Male-sterile brassica plants and methods for producing same | |
| CN103096712B (zh) | 转基因芸苔属植物事件mon 88302及其使用方法 | |
| US8313909B2 (en) | Herbicide tolerant rice plants and methods for identifying same | |
| JP5281392B2 (ja) | エリートイベントａ５５４７−１２７、ならびに生物サンプル中の該イベントを同定するための方法およびキット | |
| US11363768B2 (en) | Maize cytoplasmic male sterility (CMS) S-type restorer Rf3 gene, molecular markers and their use | |
| KR20120107476A (ko) | 우량 이벤트 ｅｅ－ｇｍ３, 그리고 생물학적 시료에서 이러한 이벤트를 동정하기 위한 방법 및 키트 | |
| DK2986727T3 (en) | HYBRID BRASSICA PLANTS AND METHODS OF PRODUCING THEREOF | |
| US20240057538A1 (en) | Methods for identifying and selecting maize plants with cytoplasmatic male sterility restorer gene | |
| CN120464785B (zh) | 转基因玉米事件lp1141-2及其检测方法 | |
| HK1084415B (en) | Hybrid spring oilseed rape and methods for producing same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20201206 |