CZ20022367A3

CZ20022367A3 - Hybrid ozimé řepky olejky a způsob jeho přípravy

Info

Publication number: CZ20022367A3
Application number: CZ20022367A
Authority: CZ
Inventors: Both Greta De; Beuckeleer Marc De
Original assignee: Aventis Cropscience N. V.
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2003-01-15
Also published as: DE60027469D1; ATE323404T1; HK1051295A1; US7659095B2; DE60027469T2; EP1244348A1; AU783406B2; HUP0203347A2; CN1409594A; WO2001041558A1; US20100248232A1; DK1244348T3; HK1084415A1; US6563026B2; US20110294133A1; CN1690211A; EP1244348B1; HU225433B1; AU3013301A; US20010029620A1

Description

Tento vynález se týká rostlin ozimé řepky olejky, konkrétně dvojice rostlin ozimé řepky olejky, která je obzvláště vhodná pro produkci hybridních semen. Konkrétněji, jedna rostlina je charakterizována tím, že je to rostlina se samčí sterilitou, díky přítomnosti genu samčí sterility v jejím genomu, zatímco druhá je charakterizována tím, že nese gen obnovující fertilitu, který je schopný zabránit aktivitě genu samčí sterility. Pár rostlin ozimé řepky olejky podle vynálezu spojuje schopnost vytvářet hybridní semena s optimálním celkovým agronomickým výkonem, genetickou stabilitou a adaptabilitou k různému genetickému pozadí.

Všechny dokumenty citované v tomto textu jsou formou odkazu součástí předkládaného popisu.

Dosavadní stav techniky

Fenotypová exprese transgenu v rostlině je určena jak strukturou genu samotného tak jeho lokalizací v rostlinném genomu. Současně přítomnost transgenu v odlišných místech genomu ovlivňuje celkový fenotyp rostliny odlišným způsobem. Agronomicky nebo průmyslově úspěšné vnesení komerčně zajímavých znaků do rostliny metodami genových manipulací může být značně zdlouhavý postup závislý na mnoha různých faktorech. Skutečná transformace a regenerace geneticky transformovaných rostlin jsou pouze prvními kroky v celé řadě selekčních kroků, která zahrnuje extenzívní genetickou charakterizaci, další šlechtění a vyhodnocení v polních pokusech.

Řepka olejka (Brassica napus, AACC, 2n=38) je přírodní hybrid vzniklý mezidruhovou hybridizací mezi brukví zelnou (Brassica oleracea, CC, 2n = 18) a brukví tuřínem (Brassica campestris, AA, 2n = 20). Ozimá řepka olejka se vysévá v průběhu posledních 10 dnů srpna a prvních deseti dnů září a sklízí se následující rok v červenci, neboť vyžaduje období s nízkou teplotou pro vernalizaci. Rychleji rostoucí jarní řepky se sejí na konci března až začátku dubna a sklizeň probíhá od poloviny srpna do září. Hlavní typy řepky olejky pěstované v současnosti jsou odrůdy s nízkým a vysokým obsahem erukové kyseliny. Tzv. Dvojitě nízké (00) odrůdy obsahují nízkou (typicky méně než 1 %) hladinu erukových kyselin (které jsou pro člověka obtížně stravitelné) a nízké hladiny glukosinolátů (které činí vedlejší produkty nestravitelné pro zvířata). Běžné využiti 00 odrůd přestavuje olej pro lidskou spotřebu a krmivo pro zvířata s vysokým obsahem proteinů. K průmyslovému využití patří také základní suroviny pro léčiva a hydraulické oleje. Odrůdy řepky s vysokým obsahem erukové kyseliny (HEAR) jsou pěstované specificky pro jejich obsah erukové kyseliny - typicky 50 až 60 % oleje. Hlavním konečným použitím HEAR je výroba erukamidu, což je kluzné činidlo používané pří výrobě polyethanu. Malý podíl se využívá při výrobě behenylalkoholu, který se přidává k voskovitým surovým minerálním olejům pro zlepšení jejich tekutosti.

Rostliny řepky olejky jsou bisexuální a typicky ze 60 až 70 % samosprašné. Produkce hybridů a vnášení genetické variability jakožto základu pro selekci byly tradičně závislé na adaptaci v přírodě se vyskytujícího jevu jako je například self-inkompatibilita a cytoplazmatická samčí sterility. Metody umělé kontroly opylení jako je například ruční sterilizace

(emaskulace) nebo použití gametocidních látek nebyly ve šlechtění řepky více rozšířeny vzhledem k jejích omezené praktické použitelnosti a vysokým finančním nákladům.

Byly vyvinuty transgenní metody pro vytvoření samčí nebo samičí sterilní rostliny, které poskytují zajímavé alternativy k tradičním technikám.

EP 0,344,029 popisuje systém pro získání jaderné samčí sterility, přičemž rostliny jsou transformovány genem samčí sterility, který obsahuje například DNA kódující barnázu, který je řízen promotorem specifickým pro tapetum (specifické pletivo prašníků), PTA29, který po vnesení do rostliny zajišťuje selektivní destrukci buněk tapeta. Transformace rostlin tabáku a řepky olejky takovým chimérickým genem vedlo k rostlinám, u kterých bylo zcela zabráněno tvorbě pylu (Mariani et al. 1990, Nátuře 347: 737-741).

Pro obnovu fertility v potomstvu rostlin se samčí sterilitou byl vytvořen systém, kdy je samčí sterilní rostlina křížena s transgenní rostlinou nesoucí gen obnovující fertilitu, který je po expresi schopen snížit nebo zcela zrušit aktivitu genu samčí sterility (viz US 5,689,041, US 5,792,929). Takový gen obnovující fertilitu je umístěn pod kontrolu promotoru řídícího expresi alespoň v buňkách toho typu, kde je gen samčí sterility exprimován. Mariani et al. (1992. Nátuře 357:3$4-387) prokázali, že u řepky olejky sterilita kódovaná genem pTA29-barnáza může být obnovena chimérickým genem pTA29-barstar.

Cytochemická a histochemická analýza vývoje prašníků u rostlin Brassica napus obsahujících samotný chimérický gen pTA29:barnáza nebo pTA29:barstar je popsána v publikaci De Block a De Brouwer (1993, Planta 189:218-225).

Úspěšné transformace rostlin druhů Brassica bylo dosaženo

·.

řadou metody včetně infekce užitím Agrobacterium (jak bylo popsáno například v EP 0,116,718 a EP 0,270,882), ostřelováním mikročásticemi - biobalistickou metodou (jak bylo popsáno například Chen et al., 1994, Theor. Appl. Genet. 88:187-192) a pomocí přímého příjmu DNA (jak bylo popsáno například De Block et al. 1989, Plant Physiol. 914:694-701, Poulsen 1996, Plant Breeding 115:209225).

Avšak žádná z citovaných publikací nepopisovala ani nenavrhovala řešení popsané v předkládané přihlášce.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká dvojice rostlin ozimé řepky olejky obzvláště vhodných pro produkci hybridních semen. Konkrétněji se předkládaný vynález týká první transgenní rostliny ozimé řepky olejky nebo jejích semen, buněk nebo tkání, obsahujících, integrovanou do svého genomu, expresní kazetu, která obsahuje gen samčí sterility, a druhé transgenní rostliny ozimé řepky olejky nebo jejích semen, buněk nebo tkání, obsahujících, integrovanou do svého genomu, expresní kazetu, která obsahuje gen obnovující fertilitu, a hybridní semena získaná křížením první a druhé rostliny, která obsahují gen samčí sterility a/nebo gen obnovující fertilitu integrované do svého genomu.

V jednom provedení vynálezu první rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva, obsahuje expresní kazetu pTHW107. Ve výhodném provedení vynálezu první rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva obsahují událost MS-BNl. V dalším provedení vynálezu druhá rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva, obsahuje expresní kazetu pTHW1118. Ve výhodném • ·· ·· »· • ♦ ♦ » · · ♦ • » · « · • · · · · · ··· *· ♦» ···· provedení vynálezu rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, buňky nebo pletiva obsahují událost RF-BN1. V obzvláště výhodném provedení vynálezu první rostlina ozimé řepky olejky obsahuje událost MS-BN1 a druhá rostlina ozimé řepky olejky obsahuje událost RF-BN1 a hybridní semena od nich získaná obsahují dokonce MS-BN1 a RF-BN1 nebo samotnou RF-BN1.

Vynález se týká transgenních semen ozimé řepky olejky nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:

a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji alespoň čtyři, nejvýhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

i) jeden soubor dvou EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden délky více než 14 kbp, ii) jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a druhý má délku více než 14 kbp, iii) jeden soubor dvou Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp, iv) jeden soubor tří AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,

v) Jeden soubor dvou Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp,

kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHWlO7 enzymem HindlII, jak je popsáno v tomto textu, a/nebo

b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

i) jeden soubor tří BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně 6500 bp, ii) jeden soubor čtyř EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 214 9 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, iii) jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden má délku přibližně

5,4 kbp a druhý má délku přibližně 8 kbp, iv) Jeden soubor tří HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden má délku přibližně 2565 bp a jeden má délku přibližně 2635 bp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal, jak je popsáno v tomto textu.

· *

Předkládaný vynález se týká semen rostlin ozimé řepky olejky nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována nebo jejích buněk nebo tkání, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:

a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, například alespoň čtyři, výhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané v bodě

a) výše obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě a) i), ii), iii) , iv) a v) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i) , ii) , iii), iv) a v) popsaných v bodě a) výše, a/nebo

b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, nejvýhodněji čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané v bodě b) výše obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě b)

i) , ii) , iii) a iv) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i) , ii) , iii) a iv) popsaných v bodě

b) výše.

Vynález se dále týká semen ozimé řepky olejky nebo rostlin pěstovaných z těchto semen, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:

c) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, v daném pořadí, a/nebo

d) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, v daném pořadí.

• 4 ·· 4 4 4« • ♦ 4 « > » «

4 4 4 4 ·

4 4 4 4 4 4 • · · · 4 · •44 44 44 4444

Vynález se dále týká semen ozimé řepky olejky nebo rostlin pěstovaných z těchto semen, jejichž genomová DNA je charakterizována vlastnostmi popsanými v bodě a) a c) výše a/nebo vlastnostmi popsanými v bodě b) a d) výše.

Předkládaný vynález se týká semen rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:

i) Jeden soubor dvou EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden délky více než 14 kbp, ii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a druhý má délku více než 14 kbp, iii) Jeden soubor dvou Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezí 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp, iv) Jeden soubor tří AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,

v) Jeden soubor dvou Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti

3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy přepravitelnou štěpením HindlII plazmidu pTHWlO7, jak je popsáno v tomto textu, a/nebo,

c) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, v daném pořadí.

Předkládaný vynález se týká semen rostliny ozimé řepky olejky, výhodně rostliny se samčí sterilitou nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována nebo jejích buněk nebo tkání, jejichž genomová DNA je charakterizována tím, že je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané výše obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě i), ii), iii), iv) a v) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i), ii) , iii), iv) a v) popsaných výše.

Předkládaný vynález se dále týká semen rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny pěstované z těchto semen, jejichž genomová DNA je charakterizována jednou nebo oběma následujícími vlastnostmi:

b) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji čtyři restrikční fragmenty nebo soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

i) Jeden soubor tří BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden mé délku mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně

Μ · · · · • 00 0 0 0 0

0 0 «0 ·

0 · « · « ♦ 000 00 ·0 0 · 0 ·

6500 bp, ii) Jeden soubor čtyř EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a

1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, iii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde oba máji délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden má délku přibližně

5,4 kbp a druhý má délku přibližně 8 kbp, iv) Jeden soubor tři HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva máji délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden má délku přibližně 2565 bp a jeden má délku přibližně 2635 bp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením Hpal plazmidu pTHWH8, popsáno v tomto textu,

A/nebo

d) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, v daném pořadí.

Předkládaný vynález se týká semen rostliny ozimé řepky olejky, výhodně rostliny obnovující fertilitu nebo rostliny, která může být z těchto semen pěstována nebo jejích buněk nebo tkání, jejichž genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, nejvýhodněji čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny popsané výše, obsahující soubory restrikčních fragmentů popsané v bodě b) i) , ii), iii) a iv) výše, přičemž selekce může zahrnovat kteroukoliv kombinaci i), ii), iii) a iv) popsaných výše.

Předkládaný vynález se týká transgenních rostlin ozimé řepky olejky, buněk, tkání nebo semen, které jsou výhodně charakterizovány oběma vlastnostmi popsanými v bodě b) a/nebo

d) výše, v daném pořadí.

Vynález se dále týká transgenních, výhodně hybridních rostlin ozimé řepky olejky s obnovenou fertilitou, buněk, tkání nebo semen získaných křížením rostliny se samčí sterilitou s rostlinou obnovující fertilitu podle vynálezu, charakterizovanou příslušnými vlastnostmi popsanými výše, přičemž rostliny s obnovenou fertilitou, buňky, pletiva nebo semena jsou charakterizována molekulárními vlastnostmi jak rostliny se samčí sterilitou, tak vlastnostmi rostliny ozimé řepky olejky obnovující fertilitu popsanými výše. Vynález se dále týká transgenních, výhodně hybridních rostlin ozimé řepky olejky, buněk, tkání nebo semen získaných křížením rostliny se samčí sterilitou s rostlinou obnovující fertilitu podle vynálezu charakterizovanou molekulárními vlastnostmi popsanými výše, přičemž hybridní rostliny, buňky, pletiva nebo semena jsou charakterizována molekulárními vlastnostmi rostliny ozimé řepky olejky obnovující fertilitu popsanými výše.

Vynález se také týká semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730, rostliny, která je vypěstována z těchto semen a buněk nebo tkání z rostliny vypěstované z těchto semen. Vynález se dále týká rostliny získatelné množením a/nebo křížením s rostlinou ozimé řepky olejky pěstovanou ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.

Vynález se dále týká způsobu produkce hybridních semen ozimé řepky olejky, který zahrnuje křížení rostliny ozimé řepky olejky se samčí sterilitou podle předkládaného vynálezu s rostlinou ozimé řepky olejky obnovující fertilitu podle • 0«

0··· vynálezu.

Vynález se dále týká rostliny ozimé řepky olejky, rostlinné buňky, rostlinné pletiva nebo semen, které obsahují rekombinantní DNA obsahující alespoň jeden transgen, integrovaný do části chromozómové DNA charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 22 a/nebo rekombinantní DNA obsahující alespoň jeden transgen, integrovaný do části chromozómové DNA charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 34.

Vynález dále poskytuje způsob produkce transgenní buňky rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny z ní získané, který obsahuje vnesení rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 22 a, volitelně, regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.

Vynález dále poskytuje způsob produkce transgenní buňky rostliny ozimé řepky olejky nebo rostliny z ní získané, který obsahuje vnesení rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky charakterizované sekvencí SEKV. ID. Č. 34 a, volitelně, regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.

Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání, obsahujících elitní událost MS-BNl podle vynálezu, přičemž tento způsob zahrnuje zjištění jedné nebo obou následujících charakteristických vlastností genomové DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání:

a) Genomová DNA je schopna poskytnout alespoň dva, výhodně alespoň tři, výhodněji alespoň čtyři, nej výhodněji pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří

i) Jeden soubor dvou EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 ·· ··· · a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden délky více než 14 kbp, ii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a druhý má délku více než 14 kbp, iii) Jeden soubor dvou Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp, iv) Jeden soubor tří AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,

v) Jeden soubor dvou Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením HindlII plazmidu pTHW107, jak popsáno v tomto textu, a/nebo

c) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, podle PCR identifikačního protokolu, popsaného v tomto textu, s dvěma primery identifikujícími elitní událost majícími nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, v daném pořadí.

Vynález se dále týká způsobu identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání, obsahující elitní událost RF-BN1 podle vynálezu, tento způsob zahrnuje zjištění jedné nebo obou následujících charakteristických vlastností genomové DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo tkání:

Β 99

9 « • · · • · · ··· ··· ·· ·» « · · • Β <

Β Β « ·· ·β«Β

i) Jeden soubor tří BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně 6500 bp, ii) Jeden soubor čtyř EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, iii) Jeden soubor dvou EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden má délku přibližně

5,4 kbp a druhý má délku přibližně 8 kbp, iv) Jeden soubor tří HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden má délku přibližně 2565 bp a jeden má délku přibližně 2635 bp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvencí PTA29-barstar přípravítelnou štěpením Hpal plazmidu pTHWll8, jak popsáno v tomto textu a/nebo

d) Genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikostí mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, s použitím PCR identifikačního protokolu, popsaného v tomto textu, s dvěma primery identifikujícími elitní událost • .ί * *« *» ·· • ® * · · · 4 « « _# , * * ··»»·♦ • · ···#· ·♦· ·«« 449 et ·« ··»· majícími nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41, v daném pořadí.

Vynález se také týká soupravy pro identifikaci rostliny obsahující elitní událost MS-BNl podle předkládaného vynálezu, souprava obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

Vynález se dále týká soupravy pro identifikaci rostliny obsahující elitní událost RF-BNl podle předkládaného vynálezu, souprava obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

Vynález se také týká soupravy pro identifikaci elitní události MS-BNl a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, tato souprava obsahuje alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvencí, která odpovídá (nebo je komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % se specifickým úsekem MS-BNl a/nebo alespoň jeden specifický primer nebo sondu mající sekvenci, která odpovídá (nebo je komplementární k) sekvenci mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % se specifickým úsekem RF-BN1. Výhodně sekvence sondy odpovídá specifickému úseku obsahujícímu část 5' nebo 3' sousedícího úseku MS-BNl a/nebo RF-BNl. Nej výhodněji specifická sonda má (nebo je komplementární k) sekvencí mající identitu sekvence mezi 80 % a 100 % s rostlinnou DNA sekvencí v SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BNl nebo s rostlinnou DNA sekvencí v SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BNl.

Výhodně souprava podle vynálezu obsahuje, kromě primeru, který specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BNl a/nebo RF-BNl, druhý primer, který specificky rozpoznává sekvenci z MS-BNl a/nebo RF-BNl v cizorodé DNA, pro použití v PCR identifikačním protokolu. Výhodně, souprava podle vynálezu obsahuje dva (nebo . více) specifické primery, jeden, který rozpoznává sekvenci ve 3' hraničním úseku MS-BN1 a/nebo RF-BN1, nej výhodněji sekvenci v rostlinné DNA úseku SEKV. ID. Č. 36 nebo SEKV. ID. Č. 38 pro MS-BNl nebo v rostlinné DNA sekvenci SEKV. ID. Č. 39 nebo SEKV. ID. Č. 40 pro RF-BN1 a další, který rozpoznává sekvenci MS-BN1 a/nebo RF-BN1 v cizorodé DNA, v daném pořadí. Obzvláště výhodně primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 19. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úsek MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 19 a primer rozpoznávající cizorodou DNA MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 12, popsáno v tomto textu. Obzvláště výhodně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku RF-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 41. Konkrétně, primer rozpoznávající rostlinnou DNA sekvenci v 5' hraničním úseku MS-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 41 a primer rozpoznávajíc! cizorodou DNA z RF-BNl obsahuje nukleotidovou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 23, popsáno v tomto textu.

Způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro odlišné účely, jako jsou například, ale bez omezení, následující: k identifikaci MS-BNl a/nebo RF-BNl v rostlinách, rostlinném materiálu nebo v produktech, jako jsou například, ale bez omezení, potraviny nebo krmné produkty (čerstvé nebo zpracované) obsahující nebo pocházející z rostlinného materiálu, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k identifikaci transgenního rostlinného materiálu pro účely segregace mezi transgenním a netransgenním materiálem, dodatečně nebo alternativně mohou být použity způsoby a soupravy podle předkládaného vynálezu k určování kvality (t j.

procento čistého materiálu) rostlinného materiálu obsahujícího MS-BNl a/nebo RF-BNl.

Je třeba mít na mysli, že konkrétní provedení vynálezu jsou popsána závislými patentovými nároky.

Popis obrázků

Následující detailní popis vynálezu uváděný jako příklad, aniž by omezoval vynález na popsaná specifická provedení, může/mohou být lépe pochopen ve spojení s doprovázejícími obrázky, jejichž seznam je následující:

Obr. 1. Plazmidová mapa pVE113

Obr. 2. Restrikční mapa získaná po štěpení MS-BN1 genomové DNA

Sekvence analyzované metodou „Southern blot: dráha 1, MS-BN1 DNA štěpená EcoRI, dráha 2, MS-BNl DNA štěpená EcoRV, dráha 3, MS-BN1 DNA štěpená Hpal, dráha 4, MS-BNl DNA štěpená AflIII, dráha 5, MS-BNl DNA štěpená Ndel, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 7, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHWlO7 štěpená BamHI.

Obr. 3. Restrikční mapa získaná po štěpení RF-BNl genomové DNA

Sekvence analyzované metodou „Southern blot: dráha 1, RF-MS1 DNA štěpená BamHI, dráha 2, RF-BNl DNA štěpená EcoRI, dráha 3, RF-BNl DNA štěpená EcoRV, dráha 4, RF-BNl DNA štěpená Hindlll, dráha 5, netransgenní ozimé řepky olejky DNA štěpená BamHI, dráha 6, netransgenní ozimé řepky olejky štěpená BamHI + DNA kontrolního plazmidu pTHW118 štěpená BamHI.

í

Obr. 4. PCR analýza odlišných linií s použitím MS-BN1 PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky rostliny obsahující transgenní událost MS-BN1, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky rostliny obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrola (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík).

Obr. 5. PCR analýza odlišných linií s použitím RF-BNl PCR identifikačního protokolu. Nanesení sekvencí na gel: dráha 1, vzorek DNA z řepky olejky rostlin obsahující transgenní událost RF-BNl, dráha 2, vzorek DNA z řepky olejky rostlin obsahující další transgenní událost, dráha 3, DNA z divokého typu řepky olejky, dráha 4, negativní kontrol (voda), dráha 5, standard molekulární hmotnosti (100 bp „žebřík).

Detailní popis

Termín gen, jak se v tomto textu používá, se týká kterékoliv DNA sekvence obsahující několik operativně spojených DNA fragmentů, jako je například promotor a 5' netranslatovaný úsek (5'UTR), které spolu tvoří úsek promotoru, kódující úsek (který může nebo nemusí kódovat protein) a netranslatovaný 3' úsek (3'UTR) obsahující' polyadenylační místo. Typicky v rostlinných buňkách 5'UTR, kódující úsek a 3'UTR jsou transkribovány na RNA, která, v případě genu kódujícího protein, je translatována na protein. Gen může obsahovat další DNA fragmenty, jako jsou například introny. Jak se používá v tomto textu, genetický lokus je poloha daného genu v genomu rostliny.

• · ·

Termín chimérický při popisu genu nebo DNA sekvence je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence obsahuje alespoň dva funkčně relevantní DNA fragmenty (jako je například promotor, 5'UTR, kódující úsek, 3'UTR, intron), které nejsou přirozeně spojeny jeden s druhým a pocházejí například z odlišných zdrojů.

Termín cizorodý při popisu genu nebo DNA sekvence vzhledem k rostlinným druhům je použit k označení toho, že gen nebo DNA sekvence není přirozeně nalézána v těchto rostlinných druzích nebo není přirozeně nalézána v tomto genetickém lokusu v těchto rostlinných druzích. Termín cizorodá DNA je použit v tomto textu při popisu DNA sekvence, která byla vnesena do genomu rostliny jako výsledek transformace.

Termín transformující DNA, jak se v tomto textu používá, se týká rekombinantní DNA molekuly použité pro transformace. Transformující DNA obvykle obsahuje alespoň jeden požadovaný gen (např. chimérický gen), který je schopen poskytnout transformované rostlině jednu nebo více specifických vlastností.

Termín rekombinantní DNA molekula je použit jako příklad a tedy může zahrnovat izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která může být DNA a která může být získána rekombinantními nebo i dalšími postupy.

Termín transgen, jak se používá v tomto textu, se týká termín požadovaného genu, který byl vnesen do genomu rostliny. Termín transgenní rostlina se týká rostliny obsahující alespoň jeden transgen v genomu všech svých buněk.

Cizorodá DNA přítomná v rostlinách podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje dva požadované geny, konkrétněji, buďto gen samčí sterility a gen rezistence k herbicidu, nebo gen obnovující fertilitu a gen rezistence k herbicidu.

• 0

0	0	0 · 0	04 »0
•	*	• 0	#0· ·
•	• 0	0 0	0 0 0 0 0
•	•	• 0	0 »00
• · ·	0 0 0	• 0 0 >0	0 0 0 0 0 0

Termín gen samčí sterility, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který po expresi v rostlině činí rostlinu neschopnou produkce fertilního, životaschopného pylu. Příkladem genu samčí sterility je gen obsahující DNA sekvenci kódující barnázu pod kontrolou promotoru směrujícího expresi do buněk tapeta. Konkrétněji, gen samčí sterility podle předkládaného vynálezu je gen PTA29-barnáza popsaný v tomto textu.

Termín gen obnovující fertilitu, jak se v tomto textu používá, se týká genu, který svou expresí v rostlině obsahující gen samčí sterility, je schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility, čili obnovit fertilitu rostliny. Konkrétněji gen obnovující fertilitu obsahuje DNA kódující protein nebo polypeptid schopný zabránit fenotypové expresi genu samčí sterility pod kontrolou promotoru směřujícího expresi alespoň do buněk, ve kterých je gen samčí sterility exprimován. Konkrétněji, gen obnovující fertilitu podle předkládaný vynálezu je gen TA29-barstar, jak je popsán v tomto textu.

Inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu je typicky výsledkem transformace buňky nebo pletiva (nebo dalších genetických manipulací). Konkrétní místo inkorporace je buďto náhodné nebo je v předem určené lokalizaci (pokud je použit způsob cílené integrace).

Cizorodá DNA může být charakterizována lokalizací a konfigurací v místě inkorporace rekombinantní DNA molekuly v rostlinném genomu. Místo v rostlinném genomu, kde byla vložena rekombinantní DNA, se také označuje jako inzerční místo nebo cílové místo. Inzerce (vložení) transgenu do rostlinného genomu může být spojena s delecí rostlinné DNA, označovanou jako delece cílového místa.

Termíny souse.dící úsek nebo sekvence sousedící » · » ·* .··..·· ,, ., ·**:::*.

• · · · · · !

• ·· ······.· • · ······ ··· ··· ··♦ «· ·· ···· („flanking region a „flanking sequence), jak se v tomto textu používají, se týkají sekvence alespoň délky 20 bp, výhodně alespoň 50 bp až 5000 bp rostlinného genomu, která je lokalizována buďto v protisměru a je bezprostředně přiléhající, nebo po směru a je bezprostředně přiléhající k cizorodé DNA. Transformační postupy vedoucí k náhodné integraci cizorodé DNA poskytují transformanty s odlišnými sousedícími úseky, které jsou charakteristické a unikátní pro každou transformantu. Když je transgen vnesen do rostliny metodou tradičního křížení, jeho inzerční místo v rostlinném genomu nebo jeho sousedící úseky se obecně nezmění. Termín inzerční úsek, jak se v tomto textu používá, se týká úseku odpovídajícímu alespoň 40 bp, výhodně alespoň 100 bp až více než 10000 bp, obsaženému v protisměru a po směru sousedících úsecích transgenu (tj . obklopujících transgen) v rostlinném genomu (netransformovaném) včetně inzerčního místa (a případné delece cílového místa). S ohledem na malé rozdíly v rámci biologického druhu způsobeného mutacemi, inzerční úsek si zachová alespoň 85%, výhodně 90%, výhodněji 95% a nejvýhodněji 100% sekvenční identitu se sekvencí obsahující úseky v protisměru a po směru sousedící s cizorodou DNA v rostlině tohoto druhu.

Exprese požadovaného genu se týká skutečnosti, že gen uděluje rostlině jeden nebo více fenotypových znaků (např. tolerance k herbicidu), které byly zamýšleny, že budou přeneseny tím, že se vnesen rekombinantní DNA molekula transformující DNA - použitá při transformaci (na základě struktury a funkce části nebo všech požadovaných genů ) .

Termín událost je definován jako (umělý) genetický lokus, který v důsledku genetické manipulace nese cizorodou DNA obsahující alespoň jednu kopii požadovaného genu. Typické alelové stavy události jsou přítomnost nebo absence cizorodé

• 4 44 • · · ·

DNA. Jak se v tomto textu specificky používá MS událost a RF událost se týkají události nesoucí gen TA29-barnázy a gen TA29-barstar, v uvedeném pořadí. Událost je charakterizována fenotypově expresí jednoho nebo více transgenů. Na genetické úrovni, událost je část genetické výbavy rostlin. Na molekulární úrovni je událost charakterizována restrikční mapou (např. určenou metodou Southern blotting) a/nebo v protisměru a/nebo po směru sousedící sekvencí transgenů a/nebo molekulární konfigurací transgenů. Obvykle transformace rostlin transformující DNA obsahující alespoň jeden požadovaný gen vede k mnohočetným událostem, z nichž každá je jedinečná.

Termín elitní událost, jak se v tomto textu používá, je událost, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří události, získané transformací stejnou transformující DNA nebo zpětným křížením s rostlinou získanou takovou transformací, na základě exprese a stability transgenů a jeho kompatibility s optimálními agronomickými charakteristikami rostlin, které ho obsahují. Tedy kritéria pro výběr elitní události jsou jedno nebo více, výhodně dvě nebo více, nejvýhodněji všechna následuj ící:

a) přítomnost transgenů neohrožuje další požadované vlastnosti rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickým výkonem nebo komerční hodnotou,

b) událost je charakterizována dobře definovanou molekulární konfigurací, která je stabilně děděna a pro kterou lze vyvinout vhodný diagnostický nástroj ke kontrole identity,

c) požadovaný gen (nebo geny) v transgenů projevuje správnou, vhodnou a prostorově i časově trvalou expresi fenotypu, jak při heterozygotním (nebo hemizygotním) tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních - podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí

·< 00 • 0 0 • · * • 0 · • · ·

0000 událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.

Je výhodné, když je cizorodá DNA asociována s polohou v rostlinném genomu, která dovoluje introgresi do požadovaného komerčního genetického pozadí.

Status události jako elitní události je potvrzen introgresi elitní události do odlišného relevantního genetického pozadí a pozorováním shody s jedním, dvěma nebo všemi z výše uvedených kritérií a), b) a c) .

Navíc pro transgeny kódující samčí sterilitu a obnovu fertility popsané výše v tomto textu, výběr elitní události je také určen kompatibilitou mezi těmito událostmi, konkrétně tím, že potomstvo pocházející z křížení mezi rostlinou nesoucí událost samčí sterility a rostlinou nesoucí událost obnovitele fertility, ve kterém jsou obě události přítomny, má následující vlastnosti:

a) adekvátní fenotypovou expresi fenotypů obnovitele fertility, tj. samčí fertility, a

b) fenotypovou expresi v komerčně přijatelném stupni v rozmezí environmentálních podmínek, ve kterých se rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vyskytovat při jejich normálním agronomickém použití.

Termín elitní událost se tedy týká genetického lokusu obsahujícího transgen, který odpovídá výše popsaným kritériím. Rostliny, rostlinný materiál nebo potomstvo, jako je například semeno, mohou obsahovat jeden nebo více elitních událostí ve svém genomu.

Diagnostický nástroj vyvinutý k identifikaci elitní události rostlin nebo rostlinného materiálu obsahujících elitní událost, je založen na specifických genomových charakteristikách elitní události, jako je například

··· ·♦ ·♦ • · · • · · • · · • · · •0 ·♦·· specifická restrikční mapa genomového úseku obsahujícího cizorodou DNA a/nebo sekvence úseků sousedících s transgenem.

Termín restrikční mapa, jak se v tomto textu používá, se týká souboru „Southern blot profilů získaných po štěpení rostlinné genomové DNA konkrétním restrikčním enzymem nebo souborem restrikčních enzymů a hybridizaci se sondou sdílející sekvenční podobnost s transgenem v podmínkách standardní stringence. Podmínky standardní stringence, jak se v tomto textu používá, označují podmínky pro hybridizaci popsané zde nebo jako podmínky obvyklé pro hybridizaci jak byly popsány v příručce Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), které například mohou zahrnovat následující kroky: 1) imobilizace fragmentů rostlinné genomové DNA na filtru, 2) prehybridizace filtru po dobu 1 až 2 hodin v podmínkách: 42 °C v 50% formamidu, 5X SSPE, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS nebo po dobu 1 až 2 hodin v 68 °C v 6X SSC, 2X Denhardtova reagencie a 0,1% SDS, 3) přidání hybridizační sondy, která byla označena, 4) inkubace po dobu 16 až 24 hodin, 5) promývání filtru po dobu 20 minut při teplotě místnosti v IX SSC, 0,1 %SDS, 6) promývání filtru třikrát po dobu 20 minut, vždy v 68 °C v 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 7) expozice filtru po dobu 24 až 48 hodin na rentgenový film v -70 °C s intenzifikačním stínítkem.

Vzhledem k přítomnosti (endogenních) restrikčních míst v rostlinném genomu před inkorporací cizorodé DNA, inzerce cizorodé DNA změní specifickou restrikční mapu tohoto genomu. Tedy, konkrétní transformanta nebo z ní pocházející potomstvo mohou být identifikovány pomocí jednoho nebo více specifických restrikční profilů. Podmínky pro stanovení restrikční mapy události jsou popsány v protokolu pro identifikaci restrikční mapy. Alternativně, jakmile jeden nebo oba úseky sousedící s · · ·· ·» ·♦ ·· ·· ······· • · ····· · » ·· ·»···· · • · ··«··· «·· ·«· ··· ·· ·♦ ··*· transgenem byly sekvencovány, mohou být vyvinuty PCR sondy, které specificky rozpoznávají tyto sekvence podle PCR identifikačního protokolu. Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující elitní událost mohou být identifikovány testováním podle PCR identifikačního protokolu použitím těchto specifických primerů.

Jak se používá v tomto textu, biologický vzorek je vzorek rostliny, rostlinný materiál nebo produkty obsahující rostlinný materiál. Termín rostlina zahrnuje také rostlinné pletiva, v jakémkoliv stádiu dospělosti, ozimé řepky olejky (Brassica napus), a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z takových rostlin, včetně, avšak bez omezení, jakýchkoliv semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamete, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů. Rostlinný materiál, jak se v tomto textu používá, se týká materiálu, který je získán nebo pochází z rostlin. Produkty obsahující rostlinný materiál jsou potraviny, krmivá, a nebo další produkty, které jsou vyráběny s použitím rostlinného materiálu nebo mohou být kontaminovány rostlinným materiálem. Je třeba rozumět, že v kontextu předkládaného vynálezu, takové biologické vzorky jsou výhodně testovány na přítomnost nukleových kyselin specifických pro MS-BNl a/nebo RF-BN1, ukazujících na přítomnost nukleových kyselin ve vzorcích. Tedy metody označované zde jako metody pro identifikaci elitní události MS-BNl a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích, se výhodně týkají identifikace nukleových kyselin, které obsahují elitní událost, v biologických vzorcích.

Termín souprava, jak se v tomto textu používá, se týká souboru reagencií pro účely provádění způsobu podle vynálezu, konkrétněji, identifikace elitní událost MS-BNl a/nebo RF-BN1 v biologických vzorcích. Konkrétněji, výhodné provedení »* ·* • * ···*· « » · 4 9 4 4 9 4 9 4

9 9 9 9 9 4 9

999 999 949 49 94 9944

Volitelně, reagencie protokolu.

soupravy podle vynálezu obsahuje alespoň jeden nebo dva specifické oligonukleotidové primery, jak bylo popsáno výše.

souprava může dále obsahovat jakékoliv další popsané v tomto textu v PCR identifikačním Alternativně, podle dalšího provedení vynálezu, souprava může obsahovat specifické sondy, jak bylo popsáno výše, které specificky hybridizují s nukleovou kyselinou biologického vzorku k identifikaci přítomnost MS-BN1 a/nebo RF-BNl ve vzorku. Volitelně, souprava může ještě dále obsahovat jakékoliv další reagencie (jako je například, ale bez omezení, hybridizační pufr, značka) pro MS-BN1 a/nebo RF-BNl v biologických vzorcích, specifických sond.

identifikaci s použitím

Souprava podle vynálezu může být použita a její složky mohou být specificky upraveny, pro účely kontroly kvality (např., čistota jednotlivých šarží semen), detekce elitní události v rostlinném materiálu nebo materiálu obsahujícím rostlinný materiál nebo pocházejícím z rostlinného materiálu, jako jsou například, ale bez omezení, potravinářké produkty nebo krmivá.

Předkládaný vynález se týká vývoje souboru elitních událostí u ozimé řepky olejky, MS-BN1 a RF-BNl, rostlin, obsahujících tyto události, potomstva získaného křížením těchto rostlin a také rostlinných buněk nebo rostlinného materiálu získaného z těchto událostí. Rostliny obsahující elitní událost MS-BN1 byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHW107, jak bylo popsáno v příkladu 1. Rostliny obsahující elitní událost RF-BNl byly získány prostřednictvím transformace plazmidem pTHW118, jak je také popsáno v příkladu 1.

Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události MS-BN1 obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu • 4 * 4 4 · ·

4 4 «

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

444 «4 4· 4444 barnázy pod kontrolou promotoru směrujícího expresi selektivně do buněk tapeta (nazvaná TA29-barnáza). TA29 promotor má tapetum selektivní expresní profil u řepky olejky (De Block a Debrouwer, Planta 189:218-225, 1993). Exprese genu TA29barnázy v rostlinách ozimé řepky olejky vede k destrukci tapeta, což činí rostliny sterilní - jde o rostliny se samčí sterilitou (Mariani et al, 1990, výše). Rekombinantní DNA molekula použitá pro vytvoření elitní události RF-BNl obsahuje DNA sekvenci kódující molekulu barstar pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (nazvaná PTA29-barstar) . Exprese genu TA29-barstar v rostlinách ozimé řepky olejky v přítomnosti genu TA29-barnázy zabraňuje aktivitě barnázy v buňkách tapeta, a tím zabraňuje destrukci tapeta, a tudíž obnovuje fertilitu těchto rostlin (Mariani et al. 1992, výše).

Obě rekombinantní DNA, které se užívají pro vytvoření elitní událost MS-BNl a RF-BNl, navíc obsahují DNA sekvence kódující enzym fosfinotricinacetyltransferázu a 35S promotor z viru mozaiky květáku (CMV), kde sekvence kódující fosfinotricinacetyltransferázu je pod kontrolou 35S promotoru (nazvaná 35S-bar). 35S promotor má konstitutivní expresní profil u řepky olejky, což znamená významnou expresi ve většině buněčných typů v průběhu většiny životního cyklu rostliny. Exprese genu 35S-bar v rostlině řepky olejky poskytuje rostlině rezistenci k herbicidním sloučeninám fosfinotricinu, bialafosu nebo glufosinatu, nebo obecněji, inhibitorům glutaminsyntetázy nebo jejich solím nebo optickým izomerům.

Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující MS-BNl může být identifikován podle protokol identifikace restrikční mapy popsaného pro MS-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem několika (výhodně dvou až pěti) z

• · · • · · · · · následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 3942 bp HindlII fragmentem plazmidu pTHWlO7 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym, který byl použit, se určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:

- EcoRI: jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp a jeden fragment více než 14 kbp,

- EcoRV: jeden fragment velikosti mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp a jeden fragment více než 14 kbp,

- Hpal: jeden fragment velikosti mezi 1986 a 2140 bp, výhodně přibližně 1990 bp a jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,

- AflIII: jeden fragment velikosti mezi 514 a 805 bp, výhodně přibližně 522 bp, jeden fragment velikosti mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp a jeden fragment velikosti mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,

- Ndel: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp.

Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda. Fragment delší než 14 kbp byl určen jako fragment délky mezi 14 kbp a 40 kbp, když extrakce DNA byla provedena způsobem podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol. 3, p. 19-21).

Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, konkrétně s alespoň čtyřmi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikční enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí • · · · · · • * · · · • · · · • a · · · ·

elitní událost MS-BNl.

Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující MS-BNl mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro MS-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplifikována PCR (polymerázovou řetězovou reakcí) s použitím primerů, které specificky rozpoznávají sousední sekvence MS-BNl, výhodně rozpoznávající 5' nebo 3' sousední sekvence MS-BNl popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 19 a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 12. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytne fragment mezi 260 a 300 bp, výhodně přibližně 280 bp, rostliny ozimé řepky olejky byly identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost MS-BNl.

Rostliny obsahující MS-BNl jsou fenotypově charakterizovány tím, že za absence genu obnovitele fertility v jejich genomu projevují samčí sterilitu. Rostliny se samčí sterilitou jsou definovány jako rostliny, které nejsou schopné vytvářet fertilní, životaschopný pyl.

Rostliny obsahující MS-BNl mohou být například získány ze semen obsahujících MS-BNl uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny pak mohou být dále množeny pro přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.

Rostliny ozimé řepky olejky nebo rostlinný materiál obsahující RF-BNl mohou být identifikovány podle protokolu identifikace restrikční mapy popsaného pro RF-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je štěpena výběrem (výhodně dvěma až čtyřmi) z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV a HindlII, pak je přenesena na nylonovou membránu a hybridizována s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHW118 (nebo T-DNA v něm obsaženou). Pro každý restrikční enzym se pak určí, zda mohou být identifikovány následující fragmenty:

- BamHI: jeden fragment délky mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1849 bp, jeden fragment délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2607 bp a jeden fragment délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně přibližně 6500 bp,

- EcoRI: jeden fragment délky mezi 805 a 1159 bp, výhodně přibližně 1094 bp, jeden fragment délky mezi 1986 a 2450 bp, výhodně přibližně 2149 bp a dva fragmenty délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 7000 bp a jeden přibližně 10 kbp,

- EcoRV: dva fragmenty délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden přibližně 5,4 kbp a přibližně 8 kbp,

- HindlII: jeden fragment délky mezi 1700 a 1986 bp, výhodně přibližně 1969 bp a dva fragmenty mezi 2450 a 2838 bp, výhodně jeden přibližně 2565 bp a jeden přibližně 2635 bp,

Délky DNA fragmentů jsou určeny srovnáním se souborem DNA fragmentů známé délky, konkrétně Pstl fragmenty DNA fága lambda.

Jestliže rostlinný materiál po štěpení s alespoň dvěma, výhodně alespoň třemi, a zejména pak se všemi uvedenými restrikční enzymy, poskytuje DNA fragmenty se stejnou délkou, jak byly popsány výše, rostlina ozimé řepky olejky je identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost RF-BN1.

Rostliny nebo rostlinný materiál obsahující RF-BN1 mohou také být identifikovány podle PCR identifikačního protokolu popsaného pro RF-BNl v příkladu 5 v tomto textu. Stručně, genomová DNA ozimé řepky olejky je amplífíkována PCR s použitím primeru, který specificky rozpoznává sousední • ·

sekvence RF-BNl, výhodně 5' nebo 3' hraniční sekvence RF-BNl popsané v tomto textu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 41, a primer, který rozpoznává sekvence v transgenu, konkrétně primer mající sekvenci SEKV. ID. Č. 23. Endogenní primery ozimé řepky olejky jsou použity jako kontroly. Jestliže rostlinný materiál poskytuje fragment mezi 195 a 235 bp, výhodně přibližně 215 bp, rostliny ozimé řepky olejky jsou identifikovány jako rostliny nesoucí elitní událost RF-BNl.

Rostliny obsahující RF-BNl jsou charakterizovány tím, že gen barstar je exprimován v buňkách tapeta. Produkce genu v buňkách tapeta rostlin nemá ani prospěšný ani škodlivý účinek na tvorbu pylu, jak bylo ukázáno (Mariani et al. 1992, výše). Tedy za absence genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29-barstar nemá za následek pozorovatelný fenotyp. V přítomnosti genu samčí sterility v genomu rostliny, gen TA29barstar poskytuje rostlinu s obnovenou fertilitou, tedy fertilní fenotyp. Fenotyp rostliny s obnovenou fertilitou je definován jako rostlina, která, i přes přítomnost genu samčí sterility ve svém genomu, je schopna produkce fertilního, životaschopného pylu.

Rostliny obsahující RF-BNl mohou být například získány ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730. Takové rostliny mohou být dále množeny a/nebo použity v obvyklých šlechtitelských postupech k přenesení elitní události podle vynálezu na další kultivary stejného rostlinného druhu.

Rostliny obsahující MS-BN1 a/nebo RF-BNl jsou také charakterizovány jejich tolerancí ke glufosinátu, což v kontextu předkládaného vynálezu zahrnuje rostliny, které jsou tolerantní k herbicidu Liberty™. Tolerance k herbicidu Liberty™ je definována kritériem, že postřik rostlin ve stádiu tří až čtyřech listů (3V až 4V) dávkou alespoň 200 gramů účinné složky/hektar (g.a.i./ha), výhodně 400 g.a.i./ha a • 1 případně až 1600 g.a.i./ha, obsahující MS-BNl a/nebo charakterizovány přítomností v buňkách, která se stanoví PAT supra).

• · ·· • · · • · · • · · · · · nezahubí rostliny. Rostliny RF-BNl mohou být dále fosfinotricinacetyltransferázy testem (De Block et al, 1987,

Rostliny ozimé řepky olejky podle vynálezu mohou být pěstovány obvyklým způsobem. Přítomnost genu 35S-bar zajišťuje, že jsou tolerantní ke glufosinátu. Tudíž plevele na polích, kde jsou tyto rostliny ozimé řepky olejky pěstovány, mohou být plevely hubeny aplikací herbicidů obsahujících glufosinát jako účinnou složku (jako je například Liberty™) .

Rostliny obsahující MS-BNl a/nebo RF-BNl jsou také charakterizovány tím, že mají agronomické vlastnosti, které jsou srovnatelné s komerčně dostupnými odrůdami ozimé řepky olejky v USA. Relevantní agronomické vlastnosti jsou: výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdornost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.

Bylo pozorováno, že přítomnost cizorodé DNA v inzerčních úsecích v genomu rostlin ozimé řepky olejky (Brassica napus) popsaných v tomto textu, konkrétněji v inzerčních místech genomu rostlin ozimé řepky olejky, poskytují zvláště zajímavé fenotypové a molekulární vlastnosti rostlinám, které obsahují tyto události. Konkrétněji, přítomnost cizorodé DNA v těchto konkrétních úsecích genomu těchto rostlin vede k trvalé fenotypové expresi transgenů, aniž by se významně zhoršil kterýkoliv z aspektů požadované agronomické výkonnosti rostliny, což činí tyto rostliny zejména vhodné pro produkci hybridní ozimé řepky olejky. Tedy, inzerční úseky odpovídající sekvencím SEKV. ID. Č. 22 a SEKV. ID. Č. 34, a v nich konkrétně inzerční místo MS-BNl a RF-BNl, jsou zejména vhodné • · · · « ··· ·· 44 44 pro vnesení požadovaných genů. Konkrétněji, inzerční úseky MS-BNl (SEKV. ID. Č. 22) a RF-BN1 (SEKV. ID. Č. 34) nebo inzerční místa MS-BN1 a RF-BN1, v daném pořadí, jsou zvláště vhodná pro vnesení plazmidů obsahujících gen samčí sterility a gen obnovující fertilitu, v daném pořadí, a zajišťují optimální expresi každého z těchto genů nebo obou genů v rostlině aniž by se zhoršila její agronomická výkonnost.

Rekombinantní DNA molekula může být specificky vložena do inzerčního úseku metodou cílené inzerce. Tyto metody jsou odborníkům dobře známy a patří k nim například homologní rekombinace s použitím rekombinázy, jako například, ale bez omezení, FLP rekombináza ze Saccharomyces cervisiae (US Patent 5,527,695), CRE rekombináza z fága Pl Escherichia coli (publikovaná PCT přihláška WO 9109957, rekombináza z pSRI Saccharomyces rouxii (Araki et al. 1985, J. Mol. Biol. 182:191-203) nebo rekombinační systém fága lambda jak byl popsán například v US Patentu 4,673,640.

Termín sekvenční identita, ve vztahu k nukleotidové sekvenci (DNA nebo RNA), se týká hodnoty počtu poloh s identickým nukleotidem děleného počtem nukleotidů v kratší ze dvou srovnávaných sekvencích. Porovnání dvou nukleotidových sekvencí se provádí algoritmem podle Wilbura a Lipmanna (Wilbur a Lipmann, 1983) s použitím parametrů: velikost okna 20 nukleotidů, délka slova 4 nukleotidy a penalta za mezeru 4. Počítačově prováděná analýza a interpretace sekvenčních dat, včetně srovnání sekvencí jak bylo popsáno výše, může být např. výhodně prováděna pomocí programů Intelligenetics™ Suitě (Intelligenetics lne., CA). Sekvence jsou v podstatě podobné když tyto sekvence mají sekvenční identitu alespoň přibližně 75 %, zejména alespoň přibližně 80 %, konkrétněji alespoň přibližně 85 %, a zvláště přibližně 90 %, obzvláště přibližně 95 %, a obzvláště přibližně 100%, a zejména *· ♦» 99

9 9 · 9

9 9 9 9 • 9 9 9 9 • ·· ·* ···<

obzvláště jde o sekvence zcela identické. Je jasné, že když jsou RNA sekvence v podstatě podobné, nebo mají jistý stupeň sekvenční identity s DNA sekvencí, thymin (T) v DNA sekvenci se považuje za shodný s uracilem (U) v RNA sekvenci.

Jak se používá v tomto textu, termín obsahující je třeba chápat jako specifikující přítomnost dané vlastnosti, hodnoty, kroku nebo složky, což přitom nevylučuje přítomnost nebo přidání jedné nebo více dalších vlastností, hodnot, kroků nebo složek nebo jejich skupin. Tedy např. nukleová kyselina nebo protein obsahující sekvenci nukleotidů nebo aminokyselin může obsahovat více nukleotidů nebo aminokyselin, než které jsou uvedeny, t j. může být např. vložena ve větší nukleové kyselině nebo proteinu. Chimérický gen obsahující DNA sekvenci, která je funkčně nebo strukturně definována, může obsahovat ještě další DNA sekvence, atd.

Následující příklady popisují vývoj a charakteristické vlastnosti rostlin ozimé řepky olejky obsahující elitní události MS-BN1 a RF-BN1.

Pokud není uvedenou jinak, všechny techniky rekombinantní DNA byly prováděny podle standardních protokolů popsaných

Molecular Cloning: A Cold Spring Harbour v příručce Sambrook Laboratory Manual, et al. (1989)

Second Edition,

Laboratory Press, NY, a nebo v dílech 1 a 2 příručky Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardní materiály a metody pro rostlinnou molekulární genetiku byly popsány v příručce Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy, publikované v BIOS Scientific Publications Ltd (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.

	V • ·	* ·· ·· · · • · ·	··	·· • •
• •	• •
	•	• · «	•	•	•
		··· ··	• ·		····

V popisu

SEKV. ID.

i příkladech se odvolává na následující sekvence:

Č. 1: plazmid pTHW107

Č. 2: plazmid pTHW118

Č. 3: primer 248

Č. 4: primer 249

Č. 5: primer 247

Č. 6: primer 250

Č. 7: primer 251

Č. 8: primer 254

Č. 9: primer 258

Č. 10: primer SP6

Č. 11: primer T7

Č. 12: primer 201 (BNA01)

Č. 13: sekvence obsahující 5' sousedící úsek

MS-BN1

Č. 14: primer 611

Č. 15: primer 259

Č. 16: primer 260

Č. 17 : primer 24

Č. 18: sekvence obsahující 3’ sousedící úsek

MS-BN1

Č. 19: primer 51 (BNA02)

Č. 20: primer 48

Č. 21: sekvence obsahující deleci cílového místa MS-BN1

Č. 22: inzerční úsek MS-BN1

Č. 23: primer 193 (BNA03)

Č. 24: sekvence obsahující 5' sousedící úsek

1ZP-BN1

Č. 25: primer 286

Č. 27: primer 315

Č. 28: primer 316

Č. 29: primer 288

Č. 30: sekvence obsahující 3' sousedící ««· «· ····

				úsek RF-BN1
SEKV.	ID.	Č.	31:	primer 269
SEKV.	ID.	Č.	32:	primer 283
SEKV.	ID.	Č.	33:	primer 284
SEKV.	ID.	Č.	34 :	integrační úsek RF-BN1
SEKV.	ID.	Č.	35:	primer 57
SEKV.	ID.	Č.	36:	sekvence obsahující 5' sousedící úsek
				MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky
SEKV.	ID.	Č.	37:	primer 68
SEKV.	ID.	Č.	38:	sekvence obsahující 3' sousedící úsek
				MS-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky
SEKV.	ID.	Č.	39:	sekvence obsahující 5' sousedící úsek
				RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky
SEKV.	ID.	Č.	40:	sekvence obsahující 3' sousedící úsek
				RF-BNl v ozimé řepky olejky
SEKV.	ID.	Č.	41:	primer 268 (BNA04)
SEKV.	ID.	Č.	42:	primer BNA05
SEKV.	ID.	Č.	43:	primer BNA06

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Transformace rostlin Brassica napus genem samčí sterility a genem obnovitele fertility

a) konstrukce chimérické DNA obsahující gen barnázy pod kontrolou promotoru specifického pro tapetum (pTHW107).

Plazmid pTHW107 (SEKV. ID. Č. 1) byl v podstatě získán z intermediátního vektoru pGSVl. PGSVl je sám odvozen z pGSC • · ······ ··· ··· ··· ·· ·· ····

1700 (Cornelissen a Vandewielle, 1989), ale obsahuje umělý T-úsek, který tvoří levá a pravá hraniční sekvence TL-DNA formy pTiB6S3 a multilinker klonovacích míst umožňující inzerci chimérického genu mezi T-DNA hraniční repetice. Vektor PGSV1 je poskytnut s genem barstar v hlavním čtecím rámci plazmidu, s regulačními signály pro expresi v E. coli.

Úplný popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHW107 je uveden v tabulce 1.

Tabulka 1: T-DNA plazmidu pTHW107

nt polohy	Orientace	Popis a odkazy
1-25		Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).
26-97		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
309-98	Proti směru	3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).
310-330		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru

882-331	Proti směru	Kódující sekvence genu bar ze Streptomyces hygroscopícus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519- 2523). Dva N-koncové kodony kódujícího úseku bar divokého typu byly substituovány kodony ATG a GAC, v daném pořadí.
2608-883	Proti směru	Promotor genu malé podjednotky ribulóza- 1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759).
2609-2658		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
2919-2659	Proti směru	260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573) .
2920-3031		3¹netranslatovaný úsek po směru (downstream) od kódující sekvence barnázy z B. Amyloliquefaciens
3367-3032	Proti směru	Kódující úsek genu barnázy z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913- 915) .

··· ··· ··· ·· ·♦ ····

4877-3368	Proti	Promotorový úsek	anther-speciíického
	směru	(prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403) .
4878-4921		Sekvence odvozená polylinkeru	ze syntetického
4922-4946		Repetice levé hranice (Gielen et al (1984 835-846).	z TL-DNA Z pTiB6S3 ) EMBO Journal 3:

b) Konstrukce chimérické DNA obsahující gen barstar pod kontrolou konstitutivního promotoru (pTHW118)

Plazmid pTHW118 (SEKV. ID. Č. 2) byl také v podstatě odvozen z intermediátního vektoru pGSV 1 (popsán výše). Kompletní popis DNA obsažené mezi hraničními repeticemi v pTHW118 je uveden v tabulce 2.

Tabulka 2: T-DNA plazmidu pTHW118

nt polohy	Orientace	Popis a odkazy
1-25		Repetice pravé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).
26-53		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru

• · · · · ·

54-90		Reziduální sekvence z TL-DNA v repetici pravé hranice.
91-97		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
309-98	Proti směru	3' netranslatovaný konec z TL-DNA genu 7 (3'g7)z pTiB6S3 (Velten a Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998, Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).
310-330		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
883-331	Proti směru	Kódující sekvence genu rezistence k bialafosu (bar) ze Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). Dva kodony N-konce kódujícího úseku baz divokého typu byly nahrazeny kodony ATG a GAC, v daném pořadí.
2608-883	Proti směru	Promotor genu malé podjednotky ribulóza- 1,5-bifosfátkarboxylázy atSIA z Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759).
2609-2658		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru

2919-2659	Proti směru	260 bp Taql fragment z 3' netranslatovaného konce genu nopalinsyntázy (3'nos) z T-DNA pTiT37 a obsahující rostlinný polyadenylační signál (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573).
2920-2940		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
2941-2980		3'netranslatovaný úsek po směru (downstream) od barstar kódující sekvence z Bacillus amyloliguefaciens
3253-2981	Proti směru	Kódující úsek genu barstar z Bacillus amyloliguefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202:913- 915) .
4762-3254	Proti směru	Promotorovy úsek anther-specifického (prašníkově specifického) genu TA29 z Nicotiana tabacum. Promotor obsahuje 1,5 kb sekvenci v protisměru (upstream) od ATG iniciačního kodonu (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403) .
4763-4807		Sekvence odvozená ze syntetického polylinkeru
4808-4832		Repetice levé hranice z TL-DNA z pTiB6S3 (Gielen et al (1984) EMBO Journal 3: 835-846).

c) Transformace rostlin Brassica napus

Pro transformaci rostlin Brassica napus byl užit vektorový systém, který byl popsán v Deblaere et al. (1985, 1987).

Vektorový systém sestává z kmene Agrobacterium a dvou plazmidových složek: 1) non-onkogenní Ti-plazmid (pGV400) a

2) intermediátní klonovací vektor založený na plazmidu pGSV 1. Non-onkogenní Ti-plazmid z něhož byla odstraněna T-oblast nese geny vir nezbytné pro přenos umělé T-DNA klonované do druhého plazmidu do rostlinného genomu. Kmeny Agrobacteria vzniklé triparentální konjugací mezi uvedenými složkami pak mohou být použity pro transformaci rostlin.

Selekce byla prováděna na fosfinotricinu (PPT) ve všech stádiích, s výjimkou regenerace rostlinek, která probíhala bez přítomnosti PPT, aby se urychlil růst. Tak byl připraven soubor primárních transformant (rostliny generace T_o) .

Příklad 2

Vývoj genetických událostí

2.1. Charakterizace transgenní události

2.1.1. Analýza MS události metodou Southern blot

Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol,3, p,19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi • · · konstrukty s geny barnázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:

Sonda barnáza: 478 bp Pstl-EcoRI fragment plazmidu pVEH3 Sonda bar: 546 bp NcoI-BglII fragment plazmidu pDEHO

Plazmidy pVE113 a pDEHO jsou popsány na obrázku 1 a v dokumentu WO 92/09696, v uvedeném pořadí. Hybridizace MS událostí se sondou „barnáza poskytla 12 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou „bar poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U obou událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce. To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho lokusu.

2.1.2. Analýza RF události metodou Southern blot

Přítomnost transgenu a počet genových inzercí byly kontrolovány standardní metodou analýzy Southern blot. Celková genomová DNA byla izolována z 1 g pletiva nadzemních částí rostlin podle Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reportér, 1, vol,3, p,19-21 nebo Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19:11) a štěpena restrikčním enzymem Sací. Sací má unikátní restrikční místo v T-DNA fragmentu, ležící mezi konstrukty s geny barnázy a bar. Southern analýza byla prováděna s následujícími dvěma sondami:

Sonda barnáza: 436 bp HindlII-Pstl fragment plazmidu pVE113 Sonda bar: 546 bp NcoI-BglII fragment plazmidu pDEHO

Hybridizace MS událostí se sondou „barnáza poskytla 3 Kb pás, zatímco hybridizace se sondou bar poskytla 14 Kb fragment. Relativní intenzita pásů poskytla indikaci toho, zda rostliny byly homozygotní nebo hemizygotní pro transgenní lokus. U několika událostí byla zjištěna jednoduchá inzerce.

·· ·· ·«

To bylo potvrzeno skutečností, že segregační profil transgenu mohl být vysvětlen na principu mendelovské dědičnosti jednoho lokusu.

2.1.3. Obecný fenotyp a agronomická výkonnost rostlin

Rostliny T_x generace u obou událostí MS a RF byly vyhodnoceny na řadu fenotypových znaků, jako je např. výška rostliny, síla/pevnost stonku, tendence k poléhání, zimuvzdornost, odolnost k rozpraskávání, tolerance k suchu, a rezistence k nemocem (černá hniloba, skvrnitost listů, Sclerotinia), produkce semen a výnos.

Linie byly hodnoceny jako podobné (nebo zlepšené) v uvedených agronomických charakteristikách ve srovnání s netransformovanou odrůdou a také s řadou kultivarů řepky olejky. V některých případech rostliny segregovaly z důvodu somaklonální variace pro jeden nebo více z výše uvedených znaků. Pokud to nevedlo k vnesení komerčně zajímavého fenotypového znaku, takové rostliny byly odstraněny.

2.2. vývoj linií nesoucích znaky MS nebo RF

Různé hemizygotní rostlinky T_o generace (Ms/- nebo Rf/) byly přeneseny z pletivoových kultur do půdy ve skleníku. Přítomnost transgenu a počet genových kopií byly kontrolovány Southern blot analýzou, jak bylo popsáno výše. Rostliny byly ponechány do kvetu, a pak byla vyhodnocena

Rostliny TO generace byly typu rostliny (-/-) pro Tl semena byla vyseta a dále sterilita nebo fertilita kvetu kříženy s rostlinami divokého vytvoření Tl semen (MsTl a RfTl) pěstována ve skleníku. Rostliny byly pak hodnoceny na toleranci ke glufosinátu amonnému. Ms-Tl rostliny byly také hodnoceny na segregaci sterility/fertility (u nepostříkaných

9 9

99

9 9 9 9 9

999 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 99 9999 rostlin)_r zatímco Rf-Tl rostliny byly kontrolovány na fertilitu květů.

Ms-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami homozygotními pro gen obnovující fertilitu (Rf/Rf), pro produkci MsRf-Fl semen. Tato semena (Ms/-, Rf/- a Rf/-) byla vyseta ve skleníku a ošetřena postřikem Liberty™. Zbylé F1 potomstvo bylo vyhodnoceno na segregaci fertility/sterility pro ověření toho, zda znak samčí sterility může být adekvátně obnoven u Brassica napus (fertilita blízká 100 %).

. Nej lepší události byly vybrány pro další testování. Ms-Tl rostliny byly kříženy s homozygotním obnovitelem fertility a semena byla vyseta na poli. Rostliny pak byly hodnoceny na toleranci k herbicidu Liberty™ (800 gramů účinné složky na hektar (g.a.i./ha), přičemž doporučená dávka pro rolníky je 400 g.a.i./ha), segregaci fertility/sterility a na obecné fenotypové vlastnosti. Linie, u kterých došlo ke 100% obnovení fertility a u kterých nebyly pozorovány žádné negativní změny ve fenotypu nebo agronomické výkonnosti (podrobně viz (d) ) ve srovnání s isogenní kontrolou divokého typu, byly selektovány.

Rf-Tl rostliny obsahující transgen byly kříženy s testovacími rostlinami obsahujícími gen samčí sterility (Ms/-) pro produkci F1 semen. Tato semena byla pěstována ve skleníku, postříkána herbicidem Liberty™ a pak byla vyhodnocena obnova fertility (blízko ke 100 %).

Mezitím byl Rf-Tl rostliny samosprášeny pro získání generace Sl. Sl rostliny byly pěstovány ve skleníku, ošetřeny postřikem herbicidu Liberty™ a opět samosprášeny pro vytvoření generace S₂, z S₂ pak byly vybrány homozygotní rostliny.

·· ···· • ·. · · · · · · ·

9 9 9 9 9

4 4 9 9 9 9 9 • · 4 4 4 4

444 444 944 44

2.3. Kombinace událostí MS a RF.

Vybrané Ms-Tl rostliny byly kříženy s vybranými Rf-S2 událostmi ve skleníku pro otestování obnovy fertility. Semena byla vyseta ve skleníku, na rostliny byl aplikován postřik Liberty™ a byla kontrolována fertilita květů.

2.4. Testování MS a RF události v odlišném genetickém základu a v odlišný lokalizaci

Vybrané události byly vneseny do dvou odlišných genetických základů, které jsou heteroticky odlišné, k prokázání toho, že MS a RF události jsou plně funkční a neměly žádné negativní účinky na výnos nebo kvalitu u žádného z testovaných základů.

Současně byly vybrané MS a RF události testovány ve čtyřech až pěti odlišných prostředích ke zjištění toho, zda není negativní interakce mezi prostředím a MS nebo RF událostí.

V dalším stádiu byla produkce hybridních semen s použitím vybraných MS a RF událostí testována extenzivněji v polních podmínkách. Vybraná MS událost ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech byly kříženy s vybranou RF událostí, také ve svém původním genetickém základu a ve dvou odlišných a heteroticky odlišných základech. Fl hybridi byly hodnoceni na rezistenci k herbicidu Liberty™, fertilitu a také celkovou agronomickou výkonnost (výnos a kvalita).

2.5. Selekce elitní události

Výše popsaný postup selekce při vývoji transgenních MS linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly

4	•	»	··		·«		··
·· ·	• ·	• · ·	•	•		•	•
•	•	• ·	•	•		*	•
•	• • · ·	• · • · ·	• • ·	•	··	•	• • »··

optimální expresi transgenu, tj. rezistenci ke glufosinátu amonnému, fenotyp samčí sterility a schopnost kompletní obnovy fertility s homozygotní obnovitelskou linií, konkrétně s vybranou RF elitní událostí.

Výše popsaný selekční postup při vývoji transgenních RF linií poskytl několik elitních událostí, které vykazovaly

optimální	expresi	transgenu,	tj. rezistenci ke	glufosinátu
amonnému,	a schopnost obnovy	fertility Fl, když	se kříží s
rostlinou	nesoucí	gen samčí	sterility, konkrétně	s vybranou
MS elitní	událostí.
Příklad 3
Vnesení vybraných	kandidátních elitních událostí	do rostlin

ozimé řepky olejky

Několik MS a RF elitních událostí, které byly vyvinuty u rostlin B. napus, jak bylo popsáno výše, bylo vneseno do kultivaru ozimé řepky olejky opakovaným zpětným křížením rostlin odrůdy Drakkar.

Rostliny byly vyšetřeny a bylo zjištěno následující:

a) Přítomnost cizorodé DNA nijak nepoškozuje další požadované charakteristiky rostlin, jako jsou například vlastnosti související s agronomickou výkonností nebo komerční hodnotou,

b) událost byla charakterizována dobře definovanou molekulární konfigurací, která byla trvale děděna,

c) požadované geny v cizorodé DNA vykazují správnou, vhodnou a trvalou prostorovou i časovou fenotypovou expresi, jak v heterozygotním (nebo hemizygotním) tak i homozygotním výskytu události, v komerčně přijatelném stupni a v rozsahu »9 ·« ·· * · ·

9 ·»··*· • · · ··»··« · • » ······ ·«· ··· ··· et »· ·»«· environmentálních podmínek, kterým rostliny nesoucí událost budou pravděpodobně vystaveny při jejich normálním agronomickém použití.

Dále, rostliny byly vyhodnoceny na jejich agronomicky významné vlastnosti a výkonnost ve srovnání s divokým typem ozimé řepky olejky.

Extenzivní testování v polních podmínkách ukázalo, že určité kandidátní elitní události u jarní řepky olejky, když byly přeneseny na ozimé řepky olejky, vedly ke vzniku rostlin, které vykazovaly adekvátní expresi požadovaných genů v cizorodé DNA ve spojení s optimální agrónomickou výkonností. Tyto události byly vybrány jako MS a RF elitní události u ozimé řepky olejky a byly nazvány MS-BN1 a RF-BN1, v uvedeném pořadí.

Příklad 4

Charakterizace elitních událostí MS-BN1 a RF-BN1

Jakmile byly jednou události MS-BNl a RF-BN1 identifikovány jako elitní události, kdy exprese požadovaných transgenů a také celková agronomická výkonnost byly optimální, lokusy transgenů byly analyzovány podrobněji na molekulární úrovni. To zahrnovalo detailní analýzu metodou Southern blot (s použitím vícečetné sady restrikčních enzymů) a sekvencování úseků sousedících s transgenem.

4.1. Southern blot analýza s použitím více restrikčních enzymů

Pletivo listů bylo odebráno z transgenních a kontrolních rostlin. Celková genomová DNA byla izolována z pletiva listů metodou podle Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology • « · · · · · * • ·· ······ · t · ······ ··· ··· ··· ·· ·· ····

Reportér, 1, vol. 3, p,19-21). DNA koncentrace každého preparátu pak byla určena měřením optické denzity na spektrofotometru při vlnové délce 260 nm.

μρ genomové DNA bylo štěpeno restrikčním enzymem v reakci o celkovém objemu 40 μΐ, a sice v podmínkách podle doporučení výrobce enzymu. Doba štěpení a/nebo množství restrikčního enzymy byly upraveny tak, aby bylo zajištěno úplné štěpení vzorků genomové DNA bez nespecifické degradace. Po štěpení bylo k naštěpené DNA přidáno 4 μΐ nanášecího barviva a vzorky byly naneseny na 1% agarózový gel.

Následující kontrolní DNA byly také naneseny na gel:

- negativní kontrola s genomovou DNA připravenou z netransgenní rostlin Brassica. Tato negativní kontrola je použita k potvrzení absence pozadí hybridizace.

- DNA pozitivní kontrola: s heterozygotní integrací jedné kopie transgenů do genomu Brassica napus, 10 μς genomové DNA má stejný počet molekul jako přibližně 19 pg DNA 1501 bp Pvul-HindlII fragmentu pTHWH8 (velikost diploidního genomu Brassica napus: 0,8x109 bp) . Množství představující jednu kopii plazmidu na celý genom bylo přidáno k 1 μς naštěpené DNA z netransgenní Brassica napus. Takto rekonstituovaný vzorek byl použit k ukázání toho, že hybridizace jsou prováděny v podmínkách umožňujících hybridizaci sondy s cílovou sekvencí.

DNA fága Lambda (kmen Clind 1 ts 857 Sam 7, Life

Technologies) štěpený Pstl byl zahrnut jako velikostní standard.

Po elektroforéze byly DNA vzorky (štěpená genomová DNA

Brassica, kontroly a DNA sloužící jako velikostní standard) byly přeneseny na nylonovou membránu pomocí kapilárního • · * * · 0 0 • 0 · · 0 · · • · 0 · · ·

0 · 0 0 0 • 00 · · ·· 0··· blottingu trvajícího 12 až 16 hodin.

DNA templáty použité pro přípravu sond pro MS-BNl událost byly připraveny restrikčním štěpením PTW107 enzymem HindlII. Tak byl vyštěpen 3942 bp DNA fragment, relevantní část transformující DNA (část který obsahoval PSSUARA, 3'nos, barnáza, PTA29).

DNA templáty použité pro přípravu sondy pro RF-BNl události byly připraveny restrikčním štěpením PTW118 enzymem Hpal. Tak byl vyštěpen 2182 bp DNA fragment, který obsahoval relevantní části transformující DNA (část PSSUARA, 3'nos, barstar, PTA29).

Po purifikaci byly DNA fragmenty značeny standardním postupem a byly použity k hybridizací na membráně.

Hybridizace byla prováděna v podmínkách standardní stringence: značená sonda byla denaturována zahříváním po dobu 5 až 10 minut ve vodní lázni na teplotu 95 °C až 100 °C a pak ochlazením na ledu po dobu 5 až 10 minut, a po té byla přidána k hybridizačnímu roztoku (6 X SSC (20 X SSC je 3,0 M NaCl, 0,3 M citrát sodný, pH 7,0), 5 X Denhardtovo činidlo (100 X Denhardt = 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrolidon, 2% bovinní sérový albumin), 0,5% SDS a 20 pg/ml denaturované nosičové DNA (jednořetězcová DNA z rybího spermatu, s průměrnou délkou 120 až 3000 nukleotidů). Hybridizace byly prováděny přes noc v 65 °C. Bloty byly promývány třikrát po dobu 20 až 40 minut v 65 °C, promývacím roztokem (2 X SSC, 0,1 SDS).

Autoradiografy byly elektronicky skenovány.

4.1.1. MS-BNl

Restrikční profil získaný po štěpení MS-BNl genomové DNA s různými restrikční enzymy je uveden na obrázku 2 a přehledně • · shrnut v tabulce 3.

Tabulka 3: Restrikční mapa MS-BN1

Číslo dráhy	Nanesená DNA	Migrace hybridizujících DNA fragmentů mezi pásy velikostního standardu	Určená délka hybridizuj ících DNA fragmentů
Větší než	Menší než
1	MS-BN1 - EcoRI	2140 14057	2450	2266 bp (*) >14 kbp
2	MS-BN1 - EcoRV	1159 14057	1700	1,4 kbp (*) >14 kbp
4	MS-BN1 - Hpal	1986 2140	2140 2450	1990 bp 2229 bp
5	MS-BN1 - AflIII	2450 2140 514	2838 2450 805	2477 bp () 2250 bp 552 bp ()
6	MS-BN1 - Ndel	5077 5077	14057 14057	10 kbp 6510 bp
7	Netransgenní ozimé řepky olej ky
8	Kontrolní plazmidová DNA - BamHI	1700 2450	1986 2838	1966 bp () 2607 bp ()

(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107

4.1.2. RF-BNl

Restrikční profil získaný po štěpení RF-BNl genomové DNA « · • · 4 ♦* ·· » · · · · · 0 4 · • 4 »4404 ·

04 44444 4 *

4 4 4 4 4 4 0

444 444 444 44 ** 4 4 4«· s různými restrikční enzymy je uveden na obrázku 3 a přehledně shrnut v tabulce 4.

Tabulka 4: Restrikční mapa RF-BNl

Číslo	Nanesená DNA	Migrace	Určená	délka
dráhy		hybridizujících DNA	hybridizuj ících
		fragmentů	mezi pásy	DNA fragmentů
		velikostního
		standardu
		Větší než	Menší než
1	MS-BNl - BamHI	805	1099	814 bp
		1700	1986	1849 bp	(*)
		2450	2838	2607 bp	*)
		5077	14057	6580 bp
2	MS-BNl - EcoRI	805	1159	1094 bp
		1986	2450	2149 bp
		5077	14057	7000 bp
		5077	14057	10 kbp
3	MS-BN1 - EcoRV	5077	14057	5,4 kbp
		5077	14057	8 kbp
4	MS-BNl -HindlII	1700	2140	1969 bp
		2450	2838	2565 bp
		2450	2838	2635 bp
6	Netransgenní ozimé řepky olej ky
5	Kontrolní	1700	1986	1849 bp	(*)
	plazmid DNA	2450	2838	2607 bp	(*)
	- BamHI	5077	14057	8100 bp

(*) délky těchto fragmentů byly predikovány na základě restrikční mapy plazmidu pTHW107 ♦ · *

4.2. Identifikace sousedící úseky

Sousedící úseky elitní události MS-BNl a RF-BNl byly nejdříve identifikovány pro jarní řepky olejky, ve kterých události byly vyvinuty, a pak kontrolovány u ozimé řepky olej ky.

4.2.1. Identifikace úseků sousedících s MS-BNl

4.2.1.1. Pravý (5') sousedící úsek

Pro stanovení sekvence sousedícího úseku MS-BNl na pravé hranici byla užita ligací-zprostředkovaná polymerázová řetězová reakce (Mueller et al. 1989, Science 780-786, Marině t al., 1994, PCR Methods and Applications, 71-75) s extenzním záchytem („extension capture) (Tormanen et al., 1993, NAR 20:5487-5488).

Oligonukleotidy použité pro přípravu linkeru byly následuj ící:

MDB248: (SEKV. ID. Č. 3)

5'CAT.GCC.CTG.ACC.CAG.GCT.AAG.TAT.TTT.AAC.TTT.AAC.CAC.TTT.

GCT.CCG.ACA.GTC.CCA.TTG

MDB249: (SEKV. ID. Č. 4)

5'CAA.TGG.GAC.TGT.CGG.AGG.ACT.GAG.GGC.CAA.AGC.TTG.GCT.CTT.AGC.

CTG.GGT.CAG.GGC.ATG

Po přípravě linkeru následovala syntéza prvního řetězce z genomové MS-BNl DNA štěpené Ncol, s použitím biotinylovaného genově specifického primeru:

#·· ··· ··· ♦· »* ····

	Sekvence (5 ' -»3 ')	Poloha v PTHW107
Biotinylovaný primer MDB247	CCG.TCA.CCG.AGA.TCT.GAT.CTC.ACG.CG (SEKV. ID. Č. 5)	322 <- 347

Linker pak byl ligován k prvnímu řetězci DNA, který pak byl kondenzován k magnetickým perličkám, ze kterých byl nebiotinylovaný řetězec eluován. Tato DNA byla použita pro PCR amplifikaci ve větším měřítku s použitím následujících primerů:

	Sekvence (5 ' -»3 ')	Poloha v PTHW107
Linkerový primer MDB250	GCACTGAGGGCCAAAGCTTGGCTC (SEKV. ID. Č. 6)
T-DNA primer MDB251	GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (SEKV. ID. Č. 7)	293 <r- 317

Tato PCR poskytla fragment přibližně 1150 bp. Tento fragment pravé hranice (RB) byl eluován z agarózového gelu a na lOOnásobně zředěné této DNA byla provedena sdružená („nested) PCR s použitím následujících primerů:

	Sekvence (5 '->3 ')	Poloha v PTHW107
„Nested linkerový primer MDB254	CTTAGCCTGGGTCAGGGCATG (SEKV. ID. Č. 8)
T-DNA primer MDB258	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9)	224 243

Tato reakce poskytla fragment velikosti přibližně 1000 bp,

4 44# ·· « 4 44 4 4 4 » » ·

4 4 · · 4 4 ·· 4*4444

4 444444

444 444 444 44 *· 4444 který byl eluován z agarózového gelu, purifikován a ligován do vektoru pGem®-T. Rekombinantní plazmidová DNA byla podrobena screeningu s použitím standardní PCR reakce s následujícími primery:

	Sekvence (5 ' ->3 ' )	Poloha v PTHW107
SP6 primer	TAA.TAC.GAC.TCA.CTA.TAG.GGC.GA (SEKV. ID. Č. 10)	(SP6 promotor ve vektoru PGem®-T)
T7 primer	TTT.AGG.TGA.CAC.TAT.AGA.ATA.C (SEKV. ID. Č. 11)	(T7 promotor ve vektoru PGem®-T)
T-DNA primer MDB201	gCT.TGG.ACT.ATA.ATA.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12)	143 163

Tak vznikly následující fragmenty:

SP6-T7: 1224 bp

SP6-MDB201: 1068 bp

T7-MDB201: 1044 bp

Fragment pravé hranice byl (SEKV. ID. Č. v němž polohy

13) , což poskytlo 1 až 867 odpovídají purifikován a sekvencován výsledný 963 bp fragment, rostlinné DNA a úsek bp 868 až 953 odpovídá T-DNA z pTW 107.

4.2.1.2. Levý (3') sousedící úsek s MS-BNl

Sekvence úseku levé hranice sousedícího s vloženým transgenem v MS-BNl události byly určeny s použitím metody TAIL-PCR („thermal asymmetric interlaced PCR), který popsali Liu et al. (1995, Plant Journal 8(3): 457-463). Tento způsob užívá tři sdružené („nested) specifické primery v následných

• · ·«·♦·» ··* ··· ··· «· ·· ···· reakcích společně s kratším arbitrárně degenerovaným (AD) primerem, takže relativní účinnosti amplifikace specifického a nespecifického produktu mohou být teplotně kontrolovány. Specifické primery byly vybrány pro nasednutí („annealing) k hranici transgenu a na základě jejich podmínek pro nasednutí. Malé množství (5 μΐ) nepurifikovaných sekundárních a terciárních PCR produktů bylo analyzováno na 1% agarózovém gelu. Terciární PCR produkt byl použit pro preparativní amplifikaci, purifikován a sekvencován na automatickém sekvencovacím zařízení s použitím soupravy pro cyklovací sekvencování DyeDeoxy Terminátor.

Následující primery byly použity:

	Sekvence (5'—>3')	Poloha v PTHW107
Degenerovaný primer MDB611	NgT.CgA.SWg.TNT.WCA.A (SEKV. ID. Č. 14)
Primární TAIL MDB259	gTg.Cag.ggA.AgC.ggT.TAA.CTg.g (SEKV. ID. Č. 15)	7164 -> 4186
Sekundární TAIL MDB260	CCT.TTg.gAg.TAA.ATg.gTg.TTg.g (SEKV. ID. Č. 16)	4346 4366
Terciární TAIL HCA24	gCg.AAT.gTA.TAT.TAT.ATg.CA (SEKV. ID. Č. 17)	4738 4757

Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T

Fragment amplifikovaný s	použitím	HCA24-MDB611	byl
přibližně	dlouhý 540 bp,	z nichž	bylo 537	bp sekvencováno	(3'
sousedící:	SEKV. ID. Č	. 18) .	Sekvence	mezi 1 a 180	bo
obsahovala	PTHW107 DNA,	zatímco	sekvence	mezi 181 a 537	bp

odpovídala rostlinné DNA.

'4 · 4 4 >4 4 · • 4 444444 • 44 444 444 99 94 44·«

4.2.1.3. Identifikace delece cílového místa

Užitím primerů odpovídajících sekvencím v sousedících úsecích transgenu bylo na DNA divokého typu z rostliny Brassica napus var. Drakkar jako templátu identifikováno inzerční místo transgenu.

Následující primery byly použity:

	Sekvence (5 ' —»3 ')	Poloha v 5’ sousedícím úseku	Poloha v 3' sousedícím úseku
		(SEKV. ID. Č. 13)	(SEKV. ID. Č. 18)
VDS51	TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g (SEKV. ID. Č. 19)	733 -» 751
HCA48	GgA.ggg.TgT.TTT.Tgg.TTA.TC (SEKV. ID. Č. 20)		189 <- 208

Tím byl připraven 178 bp fragment (SEKV. ID. Č. 21), ve kterém úsek 132 až 150 bp odpovídá deleci cílového místa.

4.2.1.4.

Identifikace MS-BNl inzerčního úseku

Na základě identifikace sousedících úseků cílového místa mohl být určen inzerční úsek MS-BNl Č. 22) :

a delece (SEKV. ID.

1- 822:

823- 841

842-1198

5' sousedící úsek delece cílového místa

3' sousedící úsek bp 46-867 ze SEKV. ID. Č. 13 bp 132-150 SEKV. ID. Č. 21 bp 181-537 SEKV. ID. Č. 18 • 0 0 • ♦ 0 · · ·

4.2.2. Identifikace sousedících úseků RF-BN1

Hraniční sousedící úseky RF-BN1 byly určeny pomocí „Vectorette-PCR (použití „Vectorette a „Subvectorette PCR pro izolaci DNA sousedící s transgenem - viz Maxine J. Allen, Andrew Collick a Alec J. Jeffreys, PCR Methods and Applications - 1994 (4) pages 71-75) s RF-BN1 genomovou DNA štěpenou HindlII jako templátem. „Vectorette linker byl vytvořen s použitím primerů MDB248 (SEKV. ID. Č. 3) a MDB249 (SEKV. ID. Č. 4) popsanými výše.

4.2.2.1. Pravý (5') sousedící úsek BN-RFl

Následující primery byly použity:

	Sekvence (5'—>3')	Poloha v PTHW118
Vectorette primer MDB250	GCA. CTG. AGG. GCC. AAA. GCT . TGG. CTC (SEKV. ID. Č. 6)
Vectorette primer MDB254	CTT.AGC.CTG.GGT.CAG.GGC.ATG (SEKV. ID. Č. 8)
T-DNA primer MDB251	GGA.TCC.CCC.GAT.GAG.CTA.AGC.TAG.C (SEKV. ID. Č. 7)	293 <- 317
T-DNA primer MDB193	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC (SEKV. ID. Č. 23)	226 <- 243
T-DNA primer MDB258	CTA.CGG.CAA.TGT.ACC.AGC.TG (SEKV. ID. Č. 9)	224 <7 243
T-DNA primer MDB201	GCT.TGG.ACT.ΑΤΑ.ATA.CCT.GAC (SEKV. ID. Č. 12)	143 <- 163

Tím byl získán 1077 bp fragment (SEKV. ID. Č. 24), ve kterém úsek 1-881 bp odpovídá rostlinné DNA a úsek 882-1077 bp • · ♦♦···· ··· ·♦· ··· ♦· ·· ···· odpovídá T-DNA z pTW 118.

4.2.2.2. Levý (3') sousedící úsek BN-RF1

Pro identifikaci 3' sousedícího úseku elitní událost BNRF1, TAIL-PCR byla provedena jak bylo popsáno výše s použitím arbitrárně degenerovaného primeru a primerů lokalizovaných v T-DNA v blízkosti levé hranice.

Byly použity následující primery:

Arbitrárně degenerovaný primer:

MDB286 NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEKV. ID. Č. 25)

Kde: N=A,C,T nebo g, S=C nebo g, W=A nebo T

T-DNA primery:

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)

MDB31S ggg.CTT.TCT.ACT.AgA.AAg.CTC.TCg.g (SEKV. ID. Č. 27)

MDB316 CCg.ATA.ggg.AAg.TgA.TgT.Agg.Agg (SEKV. ID. Č. 28)

Byl získán fragment velikostí přibližně 2000 bp. Tento fragment byl klonován do vektoru pGem©-T vektor a použit jako templát pro další PCR reakci s použitím následující primerů:

Primer pro rostlinnou DNA:

MDB288 ATg.CAg.CAA.gAA.gCT.Tgg.Agg (SEKV. ID. Č. 29)

T-DNA primer:

MDB314 gTA.ggA.ggT.Tgg.gAA.gAC.C (SEKV. ID. Č. 26)

Takto byl získán fragment velikosti přibližně 1500 bp (SEKV. ID. Č. 30), kde úsek 1-166 bp odpovídá T-DNA z plazmidu pTW118 a úsek 167-1441 bp odpovídá rostlinné DNA.

• · • · ·♦·»♦· ··· ··· ··· ·· ·* ····

4.2.2.3. Molekulární analýza delece cílového místa

Úsek obsahující deleci cílového místa byl klonován pomocí TAIL-PCR (popsána výše) s použitím genomové DNA divokého typu a primerů specifických pro rostlinou DNA v protisměru (upstream) od T-DNA inzertu směrem k inzertu:

Arbitrárně degenerovaný primer:

MDB286	NTg.CgA.SWg.ANA.WgA.A	(SEKV	. ID.	Č. 25)
kde	: N=A,C,T nebo g, S=C nebo	g, W=	A nebo T
Primery	pro rostlinou DNA:
MDB269	ggTTTTCggAggTCCgAgACg	(SEKV,	. ID.	Č. 31)
MDB283	CTTggACCCCTAggTAAATgC	(SEKV,	. ID.	Č. 32)
MDB284	gTACAAAACTTggACCCCTAgg	(SEKV.	. ID.	Č. 33)
Byl	získán fragment velikosti	1068	bp	(SEKV. ID

ve kterém je:

53-83: 5'sousedící úsek

84-133: delece cílového místa

134-1055: 3'sousedící úsek

Po inzerci T-DNA bylo cílové místo velikosti 51 bp deletováno. Srovnáním sekvence lokusu divokého typu s lokusem Rf3 odhalilo přítomnost „výplňového úseku DNA ve spojovacím místě pravé hranici. „výplňová sekvence TCTCG sekvence v pravé hranici sousedí se sekevncí TCA na 5' konci a sekvencí CGA na 3' konci. Tyto triplety byly také nalezeny na předělu delece cílového místa a T-DNA. Vyhledávání ve vzdálenějších rostlinných sekvencích odhalilo možný původ této „výplňové DNA. Sekvence TCA.TCTCG.CGA je také lokalizována v rostlinné DNA na 3'konci delece cílového místa. Je to „jádrová sekvence dvou identických repetic velikosti 13 bp lokalizovaná 209 bp po směru (downstream) od předělu delece cílového místa.

Inzerční úsek pro RF-BNl může být definován jako úsek obsahující levý sousedící úsek, deleci cílového místa a pravý sousedící úsek, a sice následovně:

1-881: 5' sousedící úsek (bp 1-881 SEKV. ID. Č. 24)

882-932: delece cílového místa (bp 84-133 SEKV. ID. Č. 34)

933-2207: 3' sousedící úsek (bp 167-1441 SEKV. ID. Č. 30)

3. Genetická analýza lokusu

Genetická stabilita inzertů pro dvě události byla ověřována molekulární a fenotypovou analýzou v potomstvu rostlin po několik generací.

Analýzy metodou Southern blot rostlin generací T_o, Ti a T₂byly srovnány pro obě události MS-BN1 a RF-BNl. Bylo zjištěno, že získané profily byly identické pro každou z událostí v odlišných generacích. To dokazuje, že molekulární konfigurace transgenu v rostlinách obsahujících jak MS-BN1 tak i RF-BNl je stabilní.

MS-BN1 a RF-BNl události vykazují pro své odpovídající transgeny mendelovskou segregaci jako jediný genetický lokus v alespoň třech následných generacích, což ukazuje na to, že inzerty jsou stabilní.

Na základě výše popsaných výsledků byly MS-BN1 a MS-RF1 identifikovány jako elitní události.

4.4. Identifikace sousedících sekvencí událostí MS-BNl a RF-BNl u ozimé řepky olejky

Sousedící sekvence elitní události MS-BNl a RF-BNl u ozimé řepky olejky byly určeny s použitím primerů, které byly vyvinuty na základě sousedících sekvencí dané události u jarní • 9

9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 99 9 řepky olejky.

Pravá (5') sousedící sekvence MS-BNl ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 12) a primeru lokalizovaného v MS-BNl pravé hraniční rostlinné DNA: VDS57: 5'-gCA.TgA.TCT.gCT.Cgg.gAT.ggC-3' (SEKV. ID. Č. 35)

To poskytlo fragment velikosti 909 bp (SEKV. ID. Č. 36) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 13 (počínajíc nukleotidem 98).

Levá (3') sousedící sekvence MS-BNl ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 17) a primer lokalizovaného v MS-BNl levé hraniční rostlinné DNA: HCA68: 5'-CCA.TAT.Acg.CCA.gAg.Agg.AC-3' (SEKV. ID. Č. 37)

To poskytlo fragment 522 bp (SEKV. ID. Č. 38) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci SEKV. ID. Č. 18.

Pravá (5') sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určena s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 12) a primeru lokalizovaného v RF-BN1 pravé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 31). Tak vznikl fragment 694 bp (SEKV. ID. Č. 39) se sekvencí v podstatě podobnou sekvenci ze SEKV. ID. Č. 24 (nukleotidy 293 až 980).

Levá sousedící sekvence RF-BN1 ozimé řepky olejky byla určen s použitím T-DNA primeru (SEKV. ID. Č. 26) a primeru lokalizovaného v RF-BN1 levé hraniční rostlinné DNA (SEKV. ID. Č. 29). Tak vznikl fragment 1450 bp, z něhož 1279 bp bylo

sekvencováno (	SEKV. ID.	Č. 40)	Bylo	zj ištěno,	, že tato
sekvence je v	podstatě	podobná	sekvenci	SEKV.	ID. Č. 30
(nukleotidy 141	až 1421).
Tedy tím	bylo potvrzeno,	že pravá	a levá	sousedící

sekvence elitní události MS-BNl a RF-BN1 jsou v podstatě shodné pro jarní a ozimou řepku olej ku.

• ··

Příklad 5

Vývoj diagnostických nástrojů pro kontrolu identity

Následující protokoly byly vyvinuty s cílem identifikovat jakýkoliv rostlinný materiál ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BNl.

5.1. MS-BNl a RF-BNl Elitní událost restrikční mapa identifikace protokol

Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost MS-BNl mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu

4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétně s alespoň 4, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: EcoRI, EcoRV, Ndel, Hpal, AflIII 2) přenesena na nylonovou membrány a 3) hybridizována s 3942 bp Hindlll fragmentem z plazmidu pTHW107. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 3 v Příkladu 4.1.1., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost MS-BNl.

Rostliny ozimé řepky olejky obsahující elitní událost RF-BNl mohou být identifikovány metodou Southern blotting s použitím v podstatě stejného postupu jak byl popsán v příkladu

4.1. Tedy genomová DNA ozimé řepky olejky je 1) štěpena s alespoň dvěma, výhodně alespoň 3, konkrétněji se všemi z následujících restrikčních enzymů: BamHI, EcoRI, EcoRV,

Hindlll 2) přenesena na nylonovou membránu a 3) hybridizována ·· ·· • · · s 2182 bp Hpal fragmentem plazmidu pTHWH8. Jestliže alespoň pro dva použité restrikční enzymy jsou identifikovány DNA fragmenty stejné délky jako fragmenty uvedené v tabulce 4 v příkladu 4.1.2., pak je rostlina ozimé řepky olejky identifikována jako rostlina nesoucí elitní událost RF-BNl.

5.2. PCR identifikační protokol pro elitní události MS-BNl a RF-BNl

Test protokolu, se všemi vhodnými kontrolami, musí být proveden ještě před screeningem neznámých vzorků. Předložený protokol by mohl vyžadovat optimalizaci složek, které se mohou obecně lišit mezi jednotlivými laboratořemi (příprava templátové DNA, Taq DNA polymeráza, kvalita primerů, dNTP, termocykler atd.).

Amplifikace endogenní sekvence hraje v protokolu klíčovou roli. Je třeba dosáhnout takových podmínek PCR a cyklování teplot, aby se amplifikovaly v ekvimolárních množstvích endogenní a transgenní sekvence v templátu známé transgenní genomové DNA. Kdykoliv se cílový endogenní fragment neamplifikuje se stejnou intenzitou zjištěnou po elektroforéze na agarózovém gelu a obarvení ethidiumbromidem, optimalizace podmínek pro PCR je nezbytná.

5.2.1. Templátová DNA

Templátová DNA se připravuje z listových terčíků nebo jednoho semena postupem podle Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p.1349, 1991). Když se používá DNA připravená jinými metodami, měl by se nejdříve provést test protokolu s různými množstvími templátu. Obvykle 50 ng genomové DNA jako templát poskytuje nej lepší výsledky.

·· ·· · ·

5.2.2. Přidělení pozitivní a negativní kontroly

Následující pozitivní a negativní kontroly by měly být zařazeny v každém běhu PCR:

- „Master Mix kontrola (DNA negativní kontrola). To je PCR, ve které není přidána do reakce žádná DNA. Pokud nastane očekávaný výsledek, tj. žádné PCR produkty, znamená to, že připravená reakční směs (Master Mix) pro PCR není kontaminovaná cílovou DNA.

- DNA pozitivní kontrola (vzorek genomové DNA obsahující transgenní sekvence). Úspěšná amplifikace této pozitivní kontroly demonstruje, že PCR podmínky v daném běhu PCR byly takové, že umožnily amplifkaci cílové sekvence.

- kontrola DNA divokého typu. Toto je PCR, ve které je jako templát genomová DNA připravená z netransgenní rostliny. Když nastane očekávaný výsledek, tedy žádná PCR amplifikace produktu z transgenu, avšak jen amplifikace endogenního PCR produktu, to znamená, že není detekovatelné pozadí transgenu při amplifikaci samotné genomové DNA.

5.2.3. Primery

Následující primery, které specificky rozpoznávají transgen a sousedící sekvence MS-BNl byly použity:

BNA01:5'-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CCT.gAC-3' (SEKV. ID. Č. 12) (MDB201) (cíl: transgen)

BNA02: 5'-TgA.CAC.TTT.gAg.CCA.CTC.g-3' (SEKV. ID. Č. 19) (VDS51) (cíl: rostlinná DNA)

Pro identifikaci rostlinného materiálu obsahujícího RF-BNl byly užity následující primery, které specificky rozpoznávají

« «1	0 ··
»0	• 0	0 0 0	0	•	0	•
•	•	• 0	0	%	0	4
						0
•	0	0 0	0	0	*	0
	« 00	00«	• 0	f 0		0*00

transgen a sousedící sekvenci RF-BNl:

BNA03: 5'-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3' (SEKV. ID. Č. 23) (MDB193) (cíl: transgen)

BNA04: 5¹-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3' (SEKV. ID. Č. 41) (MDB268) (cíl: rostlinná DNA)

Primery zacílené na endogenní sekvence jsou vždy přítomny v PCR koktejlu. Tyto primery slouží jako vnitřní kontrola u neznámých vzorků a v pozitivní kontrole. Pozitivní výsledek s dvojicí endogenních primerů demonstruje, že je v preparátu genomové DNA přítomen dostatek DNA v odpovídající kvalitě, aby mohl být generován PCR produkt. Endogenní primery byly:

BNA05: 5'-AAC.gAg.TgT.CAg.CTA.gAC.CAg.C-3' (SEKV. ID. Č. 42) BNA06: 5'-CgC.AgT.TCT.gTg.AAC.ATC.gAC.C-3' (SEKV. ID. Č. 43)

5.2.4. Amplifikované fragmenty

Očekávané amplifikované fragmenty v PCR reakci jsou:

Pro dvojici primerů BNA05-BNA06: 394 bp (endogenní kontrola)

Pro dvojici primerů ΒΝΆ01-ΒΝΑ02: 280 bp (MS-BN1 elitní událost)

Pro dvojici primerů BNA03-BNA04: 215 bp (RF-BNl elitní událost)

5.2.5. Podmínky PCR

PCR reakční směs obsahuje v 50 μΐ reakci :

μΐ templátová DNA μΐ lOx Amplifikační pufr (dodávaný s Taq polymerázou) μΐ 10 mM dNTP μΐ BNA01 (MS-BN1) nebo BNA03 (RF-BNl) (10 pmol/μΐ) μΐ BNA02 (RF-BNl) nebo BNA04 (RF-BNl) (10 pmol/μΐ)

0,5 μΐ ΒΝΑ05 (10 pmol/μΐ)

0,5 μΐ ΒΝΑ06 (10 pmol/μΐ)

0,2 μΐ Taq DNA polymeráza (5 jednotek/μΐ) voda do 50 μΐ

Teplotní profil pro dosažení optimálních výsledků je následuj ící:

minuty v 95 °C

Pak následuje:

1	minuta	v	95	°C
1	minuta	v	57	°C
2	minuty	v	72	°C
		v	5	cyklech

Pak následuje:

sekund v 92 °C 30 sekund v 57 °C 1 minuta v 72 °C ve 22 až 25 cyklech Pak následuje: 5 minut v 72 °C

5.2.6. Analýza na agarózovém gelu

Vzorky PCR o objemu 10 a 20 μΐ se nanášejí na 1,5% agarózový gel (Tris-borátový pufr) společně s vhodným standardem molekulární hmotnosti (např. 100 bp „žebřík PHARMACIA).

5.2.7. Validace výsledků

Data získaná pro vzorky DNA transgenní rostliny v jednom běhu PCR run a jednom PCR koktejlu nelze akceptovat, dokud 1) DNA pozitivní kontrol nevykazuje očekávané PCR produkty • · • · · · · · (transgenní a endogenní fragmenty), 2) DNA negativní kontrola je negativní pro PCR amplifikaci (žádné fragmenty) a 3) DNA kontrola divokého typu vykazuje očekávaný výsledek (amplifikován endogenní fragment).

Dráhy ukazující viditelná množství transgenního a endogenního PCR produktu očekávané velikosti, jsou indikací toho, že odpovídající rostlina, ze které byla genomová templátová DNA připravena, zdědila MS-BN1 a/nebo RF-BNl elitní událost. Dráhy bez viditelného množství obou transgenních PCR produktů avšak s viditelným množstvím endogenního PCR produktu indikují, že odpovídající rostliny, ze kterých byla genomová templátová DNA připravena, neobsahují elitní událost. Dráhy bez viditelného množství endogenního a transgenních PCR produktu jsou výsledkem toho, že kvalita a/nebo kvantita genomové DNA nebyla dostatečná pro vznik PCR produktu. Tyto rostliny nemohou být vyhodnoceny. Genomová DNA by měla být znovu připravena a měl by být proveden nový běh PCR s příslušnými vhodnými kontrolami.

5.2.8. Použití protokolu diskriminační PCR k identifikaci MS-BNl a RF-BNl

Rostlinný materiál z listů ozimé řepky olejky obsahující buďto MS-BNl, RF-BNl nebo jinou transgenní událost, byl testován podle výše popsaného protokolu. Vzorky z ozimé řepky olejky divokého typu byly použity jako negativní kontroly. Výsledky PCR analýz jsou ilustrovány na obrázku 4 a 5.

Obrázek 4 ilustruje výsledek získaný pomocí identifikačního protokolu PCR pro elitní událost MS-BN1 na dva vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2). Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 280 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje MS-BNl.

« ·

Obrázek 5 ilustruje výsledek získaný pomocí PCR identifikačního protokolu pro elitní událost RF-BNl na dvou vzorcích ozimé řepky olejky (dráha 1 a 2) . Dráha 1 obsahuje elitní událost detekovanou jako 215 bp pás, zatímco vzorek v dráze 2 neobsahuje RF-BNl.

Příklad 6

Produkce hybridních semen s použitím MS-BN1 a RF-BNl v rostlinách ozimé řepky olejky

Rostliny ozimé řepky olejky obsahující MS-BNl, které vykazovaly samčí sterilitu, byly kříženy s rostlinami ozimé řepky olejky homozygotními v RF-BNl. Hybridní semena byla sebrána z MS-BN1 a uložena ve sbírce ATCC pod přístupovým číslem ATCC PTA-730.

Tato hybridní semena byla znovu vyseta na pole. Bylo zjištěno, že rostliny byly 100% fertilní a projevovaly současně optimální agronomické vlastnosti. Hybridní rostliny obsahovaly buďto obě události MS-BNl a RF-BNl nebo jen RF-BN-1 samotnou.

Příklad 7

Vnesení MS-BNl a RF-BNl do výhodného kultivaru ozimé řepky olej ky

Elitní události MS-BNl a RF-BNl byly opakovaným zpětným křížením rostlin obsahujících událost MS-BNl nebo RF-BNl, v daném pořadí, přeneseny na řadu agronomicky významných kultivarů ozimé řepky olejky.

Bylo pozorováno, že introgrese elitní události do těchto kultivarů nijak významně neovlivnila žádné požadované fenotypové nebo agronomicky významné charakteristiky těchto kultivarů (žádná vazba), když exprese transgenu, která byla určována jako tolerance ke glufosinátu, dosáhla komerčně přijatelné úrovně. To potvrdilo status událostí MS-BNl a RF-BNl jako elitních událostí.

V připojených nárocích se užívá termín rostlina tak, že zahrnuje i jakákoliv rostlinná pletiva, v jakémkoliv stádiu zralosti, a také jakékoliv buňky, pletiva nebo orgány odebrané nebo pocházející z rostlin, včetně, aniž by však byl výčet omezující, semen, listů, stonků, květů, kořenů, jednotlivých buněk, gamet, buněčných kultur, tkáňových kultur nebo protoplastů.

Semena obsahující elitní událost MS-BNl a elitní událost RF-BNl nebo elitní událost RF-BNl samotnou byla uložena v Americké sbírce mikroorganismů a tkáňových kultur ATCC pod přístupovým číslem: PTA-730.

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 43 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4946 <212> DNA <2l3> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: T-DNA plazmidu pTHW107 <220>

<221> různé vlastnosti <222> (964)..(4906) <223> Hind III fragment <400> 1 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120 • 4 4 · 4 • 4 · · · ·

atatttattg	ataaaataac	aagtcaggta	^2. ttatagtcca	• 4 4 4 4 44« 444 4 agcaaaaaca	4 · 4 · 4 · 4 4 4 4 4 44 «4 4· taaatttatt	• • • 44 4 •180
gatgcaagtt	taaattcaga	aatatttcaa	taactgatta	tatcagctgg	tacattgccg	240
tagatgaaag	actgagtgcg	atattatgtg	taatacataa	attgatgata	tagctagctt	300
agctcatcgg	gggatcctag	acgcgtgaga	tcagatctcg	gtgacgggca	ggaccggacg	360
gggcggtacc	ggcaggctga	agtccagctg	ccagaaaccc	acgtcatgcc	agttcccgtg	420
cttgaagccg	gccgcccgca	gcatgccgcg	gggggcatat	ccgagcgcct	cgtgcatgcg	480
cacgctcggg	tcgttgggca	gcccgatgac	agcgaccacg	ctcttgaagc	cctgtgcctc	540
cagggacttc	agcaggtggg	tgtagagcgt	ggagcccagt	cccgtccgct	ggtggcgggg	600
ggagacgtac	acggtcgact	cggccgtcca	gtcgtaggcg	ttgcgtgcct	tccaggggcc	660
cgcgtaggcg	atgccggcga	cctcgccgtc	cacctcggcg	acgagccagg	gatagcgctc	720
ccgcagacgg	acgaggtcgt	ccgtccactc	ctgcggttcc	tgcggctcgg	tacggaagtt	780
gaccgtgctt	gtctcgatgt	agtggttgac	gatggtgcag	accgccggca	tgtccgcctc	840
ggtggcacgg	cggatgtcgg	ccgggcgtcg	ttctgggtcc	attgttcttc	tttactcttt	900
gtgtgactga	ggtttggtct	agtgctttgg	tcatctatat	ataatgataa	caacaatgag	960
aacaagcttt 1020	ggagtgatcg	gagggtctag	gatacatgag	attcaagtgg	actaggatct
acaccgttgg 1080	attttgagtg	tggatatgtg	tgaggttaat	tttacttggt	aacggccaca
aaggcctaag 1140	gagaggtgtt	gagaccctta	tcggcttgaa	ccgctggaat	aatgccacgt
ggaagataat 1200	tccatgaatc	ttatcgttat	ctatgagtga	aattgtgtga	tggtggagtg
gtgcttgctc 1260	attttacttg	cctggtggac	ttggcccttt	ccttatgggg	aatttatatt
ttacttacta 1320	tagagctttc	ataccttttt	tttaccttgg	atttagttaa	tatataatgg
tatgattcat 1380	gaataaaaat	gggaaatttt	tgaatttgta	ctgctaaatg	cataagatta
ggtgaaactg 1440	tggaatatat	atttttttca	tttaaaagca	aaatttgcct	tttactagaa
ttataaatat 1500	agaaaaatat	ataacattca	aataaaaatg	aaaataagaa	ctttcaaaaa
acagaactat 1560	gtttaatgtg	taaagattag	tcgcacatca	agtcatctgt	tacaatatgt
tacaacaagt 1620	cataagccca	acaaagttag	cacgtctaaa	taaactaaag	agtccacgaa
aatattacaa 1680	atcataagcc	caacaaagtt	attgatcaaa	aaaaaaaaac	gcccaacaaa

gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa 1740

4

4 1

I h

ctatacacaa	aacaagtcag	ataaatctct	ttctgggcct	gtcttcccaa	cctcctacat
cacttcccta 1860	tcggattgaa	tgttttactt	gUěáWtte oattccasta atattgaw
tatgtttgtg 1920	aaaactaata	gggttaacaa	tcgaagtcat	ggaatatgga	tttggtccaa
gattttccga 1980	gagctttcta	gtagaaagcc	catcaccaga	aatttactag	taaaataaat
caccaattag 2040	gtttcttatt	atgtgccaaa	ttcaatataa	ttatagagga	tatttcaaat
gaaaacgtat 2100	gaatgttatt	agtaaatggt	caggtaagac	attaaaaaaa	tcctacgtca
gatattcaac 2160	tttaaaaatt	cgatcagtgt	ggaattgtac	aaaaatttgg	gatctactat
atatatataa 2220	tgctttacaa	cacttggatt	tttttttgga	ggctggaatt	tttaatctac
atatttgttt 2280	tggccatgca	ccaactcatt	gtttagtgta	atactttgat	tttgtcaaat
atatgtgttc 2340	gtgtatattt	gtataagaat	ttctttgacc	atatacacac	acacatatat
atatatatat 2400	atatattata	tatcatgcac	ttttaattga	aaaaataata	tatatatata
tagtgcattt 2460	tttctaacaa	ccatatatgt	tgcgattgat	ctgcaaaaat	actgctagag
taatgaaaaa 2520	tataatctat	tgctgaaatt	atctcagatg	ttaagatttt	cttaaagtaa
attctttcaa 2580	attttagcta	aaagtcttgt	aataactaaa	gaataataca	caatctcgac
cacggaaaaa 2640	aaacacataa	taaatttgaa	tttcgaccgc	ggtacccgga	attcgagctc
ggtacccggg 2700	gatcttcccg	atctagtaac	atagatgaca	ccgcgcgcga	taatttatcc
tagtttgcgc 2760	gctatatttt	gttttctatc	gcgtattaaa	tgtataattg	cgggactcta
atcataaaaa 2820	cccatctcat	aaataacgtc	atgcattaca	tgttaattat	tacatgctta
acgtaattca 2880	acagaaatta	tatgataatc	atcgcaagac	cggcaacagg	attcaatctt
aagaaacttt 2940	attgccaaat	gtttgaacga	tctgcttcgg	atcctctaga	gccggaaagt
gaaattgacc 3000	gatcagagtt	tgaagaaaaa	tttattacac	actttatgta	aagctgaaaa

aaacggcctc cgcaggaagc cgtttttttc gttatctgat ttttgtaaag gtctgataat 3060

4* Μ 44 • · ♦ ·

ggtccgttgt tttgtaaatc agccagtcgc ttgagtaaag aatccggtct gaatttctga 3120
agcctgatgt 3180	atagttaata	tccgcttcac	gccatgttcg	tccgcttttg	cccgggagtt
tgccttccct 3240	gtttgagaag	atgtctccgc	cgatgctttt	ccccggagcg	acgtctgcaa
ggttcccttt 3300	tgatgccacc	cagccgaggg	cttgtgcttc	tgattttgta	atgtaattat
caggtagctt 3360	atgatatgtc	tgaagataat	ccgcaacccc	gtcaaacgtg	ttgataaccg
gtaccatggt 3420	agctaatttc	tttaagtaaa	aactttgatt	tgagtgatga	tgttgtactg
ttacacttgc 3480	accacaaggg	catatataga	gcacaagaca	tacacaacaa	cttgcaaaac
taacttttgt 3540	tggagcattt	cgaggaaaat	ggggagtagc	aggctaatct	gagggtaaca
ttaaggtttc 3600	atgtattaat	ttgttgcaaa	catggactta	gtgtgaggaa	aaagtaccaa
aattttgtct 3660	caccctgatt	tcagttatgg	aaattacatt	atgaagctgt	gctagagaag
atgtttattc 3720	tagtccagcc	acccacctta	tgcaagtctg	cttttagctt	gattcaaaaa
ctgatttaat 3780	ttacattgct	aaatgtgcat	acttcgagcc	tatgtcgctt	taattcgagt
aggatgtata 3840	tattagtaca	taaaaaatca	tgtttgaatc	atctttcata	aagtgacaag
tcaattgtcc 3900	cttcttgttt	ggcactatat	tcaatctgtt	aatgcaaatt	atccagttat
acttagctag 3960	atatccaatt	ttgaataaaa	atagctcttg	attagtaaac	cggatagtga
caaagtcaca 4020	tatccatcaa	acttctggtg	ctcgtggcta	agttctgatc	gacatggggt
taaaatttaa 4080	attgggacac	ataaatagcc	tatttgtgca	aatctcccca	tcgaaaatga
cagattgtta 4140	catggaaaac	aaaaagtcct	ctgatagaag	tcgcaaagta	tcacaatttt
ctatcgagag 4200	atagattgaa	agaagtgcag	ggaagcggtt	aactggaaca	taacacaatg
tctaaattaa 4260	ttgcattcgc	taaccaaaaa	gtgtattact	ctctccggtc	cacaataagt
tattttttgg 4320	cccttttttt	atggtccaaa	ataagtgagt	tttttagatt	tcaaaaatga

tttaattatt tttttactac agtgcccttg gagtaaatgg tgttggagta tgtgttagaa 4380 • · · ·« 44 • · • 4

4

4 4

4444

atgtttatgt 4440	gaagaaatag	taaaggttaa	tatgatcaat	ttcattgcta	tttaatgtta
aaatgtgaat 4500	ttcttaatct	gtgtgaaaac	aaccaaaaaa	tcacttattg	tggaccggag
aaagtatata 4560	aatatatatt	tggaagcgac	taaaaataaa	cttttctcat	attatacgaa
cctaaaaaca 4620	gcatatggta	gtttctaggg	aatctaaatc	actaaaatta	ataaaagaag
caacaagtat 4680	caatacatat	gatttacacc	gtcaaacacg	aaattcgtaa	atatttaata
taataaagaa 4740	ttaatccaaa	tagcctccca	ccctataact	taaactaaaa	ataaccagcg
aatgtatatt 4800	atatgcataa	tttatatatt	aaatgtgtat	aatcatgtat	aatcaatgta
taatctatgt 4860	atatggttag	aaaaagtaaa	caattaatat	agccggctat	ttgtgtaaaa
atccctaata 4920 catttacaat 4946	taatcgcgac tgaatatatc	ggatccccgg ctgccg	gaattccggg	gaagcttaga	tccatggagc

<210>	2
<211>	4832
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence: T
<220>
<221>	různé	vlastnosti
<222>	(1883)	. . (4065)
<223>	Hpal	fragment
<400>	2

aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60 gtcgataaga aaaggcaatt_ tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120

99 9

9 9 9 99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

499 999 499 99 99 9999

atatttattg ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180
gatgcaagtt	taaattcaga	aatatttcaa	taactgatta	tatcagctgg	tacattgccg	240
tagatgaaag	actgagtgcg	atattatgtg	taatacataa	attgatgata	tagctagctt	300
agctcatcgg	gggatcctag	acgcgtgaga	tcagatctcg	gtgacgggca	ggaccggacg	360
gggcggtacc	ggcaggctga	agtccagctg	ccagaaaccc	acgtcatgcc	agttcccgtg	420
cttgaagccg	gccgcccgca	gcatgccgcg	gggggcatat	ccgagcgcct	cgtgcatgcg	480
cacgctcggg	tcgttgggca	gcccgatgac	agcgaccacg	ctcttgaagc	cctgtgcctc	540
cagggacttc	agcaggtggg	tgtagagcgt	ggagcccagt	cccgtccgct	ggtggcgggg	600
ggagacgtac	acggtcgact	cggccgtcca	gtcgtaggcg	ttgcgtgcct	tccaggggcc	660
cgcgtaggcg	atgccggcga	cctcgccgtc	cacctcggcg	acgagccagg	gatagcgctc	720
ccgcagacgg	acgaggtcgt	ccgtccactc	ctgcggttcc	tgcggctcgg	tacggaagtt	780
gaccgtgctt	gtctcgatgt	agtggttgac	gatggtgcag	accgccggca	tgtccgcctc	840
ggtggcacgg	cggatgtcgg	ccgggcgtcg	ttctgggtcc	attgttcttc	tttactcttt	900
gtgtgactga	ggtttggtct	agtgctttgg	tcatctatat	ataatgataa	caacaatgag	960
aacaagcttt 1020	ggagtgatcg	gagggtctag	gatacatgag	attcaagtgg	actaggatct
acaccgttgg 1080	attttgagtg	tggatatgtg	tgaggttaat	tttacttggt	aacggccaca
aaggcctaag 1140	gagaggtgtt	gagaccctta	tcggcttgaa	ccgctggaat	aatgccacgt
ggaagataat 1200	tccatgaatc	ttatcgttat	ctatgagtga	aattgtgtga	tggtggagtg
gtgcttgctc 1260	attttacttg	cctggtggac	ttggcccttt	ccttatgggg	aatttatatt
ttacttacta 1320	tagagctttc	ataccttttt	tttaccttgg	atttagttaa	tatataatgg
tatgattcat 1380	gaataaaaat	gggaaatttt	tgaatttgta	ctgctaaatg	cataagatta
ggtgaaactg 1440	tggaatatat	atttttttca	tttaaaagca	aaatttgcct	tttactagaa
ttataaatat 1500	agaaaaatat	ataacattca	aataaaaatg	aaaataagaa	ctttcaaaaa
acagaactat 1560	gtttaatgtg	taaagattag	tcgcacatca	agtcatctgt	tacaatatgt
tacaacaagt 1620	cataagccca	acaaagttag	cacgtctaaa	taaactaaag	agtccacgaa
aatattacaa 1680	atcataagcc	caacaaagtt	attgatcaaa	aaaaaaaaac	gcccaacaaa

gctaaacaaa gtccaaaaaa aacttctcaa gtctccatct tcctttatga acattgaaaa « » ·· ·· ·· ·· 0 0 0 0 · 0 0 • 0 0 · 0 0 0

00 000 0 0 • 0 0 0 0 0 0 • 00 000 00 00 0··0

1740

ctatacacaa aacaagtcag ataaatctct ttctgggcct gtcttcccaa cctcctacat 1800
cacttcccta 1860	tcggattgaa	tgttttactt	gtaccttttc	cgttgcaatg	atattgatag
tatgtttgtg 1920	aaaactaata	gggttaacaa	tcgaagtcat	ggaatatgga	tttggtccaa
gattttccga 1980	gagctttcta	gtagaaagcc	catcaccaga	aatttactag	taaaataaat
caccaattag 2040	gtttcttatt	atgtgccaaa	ttcaatataa	ttatagagga	tatttcaaat
gaaaacgtat 2100	gaatgttatt	agtaaatggt	caggtaagac	attaaaaaaa	tcctacgtca
gatattcaac 2160	tttaaaaatt	cgatcagtgt	ggaattgtac	aaaaatttgg	gatctactat
atatatataa 2220	tgctttacaa	cacttggatt	tttttttgga	ggctggaatt	tttaatctac
atatttgttt 2280	tggccatgca	ccaactcatt	gtttagtgta	atactttgat	tttgtcaaat
atatgtgttc 2340	gtgtatattt	gtataagaat	ttctttgacc	atatacacac	acacatatat
atatatatat 2400	atatattata	tatcatgcac	ttttaattga	aaaaataata	tatatatata
tagtgcattt 2460	tttctaacaa	ccatatatgt	tgcgattgat	ctgcaaaaat	actgctagag
taatgaaaaa 2520	tataatctat	tgctgaaatt	atctcagatg	ttaagatttt	cttaaagtaa
attctttcaa 2580	attttagcta	aaagtcttgt	aataactaaa	gaataataca	caatctcgac
cacggaaaaa 2640	aaacacataa	taaatttgaa	tttcgaccgc	ggtacccgga	attcgagctc
ggtacccggg 2700	gatcttcccg	atctagtaac	atagatgaca	ccgcgcgcga	taatttatcc
tagtttgcgc 2760	gctatatttt	gttttctatc	gcgtattaaa	tgtataattg	cgggactcta
atcataaaaa 2820	cccatctcat	aaataacgtc	atgcattaca	tgttaattat	tacatgctta
acgtaattca 2880	acagaaatta	tatgataatc	atcgcaagac	cggcaacagg	attcaatctt
aagaaacttt 2940	attgccaaat	gtttgaacga	tctgcttcgg	atcctctaga	ccaagcttgc
gggtttgtgt 3000	ttccatattg	ttcatctccc	attgatcgta	ttaagaaagt	atgatggtga

tgtcgcagcc ttccgctttc gcttcacgga aaacctgaag cacactctcg gcgccatttt

*4 4« » 4 · • tt «

4 4 • 4 »

4· 4*44

3060

cagtcagctg cttgctttgt tcaaactgcc tccattccaa aacgagcggg tactccaccc 3120
atccggtcag 3180	acaatcccat	aaagcgtcca	ggttttcacc	gtagtattcc	ggaagggcaa
gctccttttt 3240	caatgtctgg	tggaggtcgc	tgatacttct	gatttgttcc	ccgttaatga
ctgctttttt 3300	catcggtagc	taatttcttt	aagtaaaaac	tttgatttga	gtgatgatgt
tgtactgtta 3360	cacttgcacc	acaagggcat	atatagagca	caagacatac	acaacaactt
gcaaaactaa 3420	cttttgttgg	agcatttcga	ggaaaatggg	gagtagcagg	ctaatctgag
ggtaacatta 3480	aggtttcatg	tattaatttg	ttgcaaacat	ggacttagtg	tgaggaaaaa
gtaccaaaat 3540	tttgtctcac	cctgatttca	gttatggaaa	ttacattatg	aagctgtgct
agagaagatg 3600	tttattctag	tccagccacc	caccttatgc	aagtctgctt	ttagcttgat
tcaaaaactg 3660	atttaattta	cattgctaaa	tgtgcatact	tcgagcctat	gtcgctttaa
ttcgagtagg 3720	atgtatatat	tagtacataa	aaaatcatgt	ttgaatcatc	tttcataaag
tgacaagtca 3780	attgtccctt	cttgtttggc	actatattca	atctgttaat	gcaaattatc
cagttatact 3840	tagctagata	tccaattttg	aataaaaata	gctcttgatt	agtaaaccgg
atagtgacaa 3900	agtcacatat	ccatcaaact	tctggtgctc	gtggctaagt	tctgatcgac
atggggttaa 3960	aatttaaatt	gggacacata	aatagcctat	ttgtgcaaat	ctccccatcg
aaaatgacag 4020	attgttacat	ggaaaacaaa	aagtcctctg	atagaagtcg	caaagtatca
caattttcta 4080	tcgagagata	gattgaaaga	agtgcaggga	agcggttaac	tggaacataa
cacaatgtct 4140	aaattaattg	cattcgctaa	ccaaaaagtg	tattactctc	tccggtccac
aataagttat 4200	tttttggccc	tttttttatg	gtccaaaata	agtgagtttt	ttagatttca
aaaatgattt 4260	aattattttt	ttactacagt	gcccttggag	taaatggtgt	tggagtatgt
gttagaaatg 4320	tttatgtgaa	gaaatagtaa	aggttaatat	gatcaatttc	attgctattt

aatgttaaaa tgtgaatttc ttaatctgtg tgaaaacacc aaaaaatcac ttattgtgga • » 99 • 4 · ·

4 4 *

4380

ccggagaaag 4440	tatataaata	tatatttgga	agcgactaaa	aataaacttt	tctcatatta
tacgaaccta 4500	aaaacagcat	atggtagttt	ctagggaatc	taaatcacta	aaattaataa
aagaagcaac 4560	aagtatcaat	acatatgatt	tacaccgtca	aacacgaaat	tcgtaaatat
ttaatataat 4620	aaagaattaa	tccaaatagc	ctcccaccct	atkacttaaa	ctaaaaataa
ccagcgaatg 4680	tatattatat	gcataattta	tatattaaat	gtgtataatc	atgtataatc
aatgtataat 4740	ctatgtatat	ggttagaaaa	agtaaacaat	taatatagcc	ggctatttgt
gtaaaaatcc 4800	ctaatataat	cgcgacggat	ccccgggaat	tccggggaag	cttagatcca
tggagccatt	tacaattgaa	tatatcctgc	cg

4832 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 248 <400> 3 catgccctga cccaggctaa gtattttaac tttaaccact ttgctccgac agtcccattg 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 249 $0 f · ·

I · · • · ···« <400> 4 caatgggact gtcggaggac tgagggccaa agcttggctc ttagcctggg tcagggcatg 60 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 247 <400> 5 ccgtcaccga gatctgatct cacgcg 26 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 250 <400> 6 gcactgaggg ccaaagcttg gctc 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 251 <400> 7 »· · ' · • * • · • · β · · ggatcccccg atgagctaag ctagc <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 254 <400> 8 cttagcctgg gtcagggcat g <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 258 <400> 9 ctacggcaat gtaccagctg <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer SP6 « · · • · ··» · <400> 10 taatacgact cactataggg ega 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer T7 <400> 11 tttaggtgac actatagaat ac 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 201 <400> 12 gcttggacta taatacctga c 21 <210> 13 <211> 953 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek MS-BNl • « • * · • · ···· <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1)..(24) <223> pGEM®-T <400> 13

cccngccgcc	atggccgcgg	gattcttagc	ctgggtcagg	gcatgcatgg	tgtgatccaa	60
agactttctc	ggcccaaata	ctaatcatca	caagtcatgc	atgatctgct	cgggatggcc	120
aagaaaaatc	gaacccatga	caatattcac	agttgtaagt	tttttaccag	tagacaaata	180
ccacttggtt	taacatattg	taaacttaat	atatagaaga	tgttcctatt	cagaaaataa	240
tatatgtata	tatataaaat	tttattggcg	actcgaggat	gcacagaaat	ataaaatgtt	300
ggtcgcttag	accatctcca	atgtatttct	ctatttttac	ctctaaaata	aaggagctct	360
ataatagagg	tgggttttgc	tccaatgtat	ttctttaaaa	tagagatctc	tacatataga	420
gcaaaatata	gaggaatgtt	atttcttcct	ctataaatag	aggagaaaat	agcaatctct	480
attttagagg	caaaaataga	gatbsgttgg	agtgattttg	cctctaaatg	ctattataga	540
ggtagaaata	gaggtgggtt	ggagatgctc	ttactatttt	catagtaggt	gaaaacttga	600
aactagaaag	ctttggagtg	tacgagtgga	aaacctctct	ttgtagaaac	atacacatgc	660
catttagtta	actagttgac	atagattttt	gagtcagata	actttaagaa	tatatatgtt	720
tggatgagag	tttgacactt	tgagccactc	gaaggacaaa	ttttaaaaac	ttgtgggatg	780
ctgtggccat	aaaccttgag	gacvstttga	tcatattcta	ttaactacag	tacgaatatg	840
attcgacctt	tgcaattttc	tcttcaggta	ctcggccgtc	gaactcggcc	gtcgagtaca	900
tggtcgataa	gaaaaggcaa	tttgtagatg	ttaattccca	tcttgaaaga	aat	953

<210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 611 <400> 14 • 4 4

ngtcgaswgt ntwcaa

<210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 259 <400> 15 gtgcagggaa gcggttaact gg <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 260 <400> 16 cctttggagt aaatggtgtt gg <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 24 <400> 17 gcgaatgtat attatatgca <210> 18 <211> 537 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek MS-BN1 <400> 18

gcgaatgtat	attatatgca	taatttatat	attaaatgtg	tataatcatg	tataatcaat	60
gtataatcta	tgtatatggt	tagaaaaagt	aaacaattaa	tatagccggc	tatttgtgta	120
aaaatcccta	atataatcga	cggatccccg	ggaattccgg	gggaagctta	gatccatgga	180
tttgttatga	taaccaaaaa	caccctcctt	tttattataa	aggtagggat	agctaatctg	240
ttattcggtt	ttgattagag	atattaatcc	cgttttatca	agtacagttt	gatgtatttt	300
tttgttcgtt	ttcattacaa	tccaagacaa	gttaggttta	ttacatttta	ccaaaaaaaa	360
aggtttggtt	tattgtgaac	attgctgcgg	tttatttaaa	tttgattcta	ttcaaaggtc	420
aatccgtatt	taacaagtaa	actagtcttt	atataatctt	aaatctaacg	atctttgatt	480
tttaaattgc	atttanctat	gtcctctctg	gcgtatatgg	tctctttgaa	aacactc	537

<210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 51 <400> 19 tgacactttg agccactcg

4 4 4» 4» «·

4 4 444 · 4 · »

4 4 4 4 4 · se • 4 444444

444 »44 444 *4 «« «444 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 48 <400> 20 ggagggtgtt tttggttatc 20 <210> 21 <211> 178 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující deleci inzerčního místa MS-BNl <400> 21 gacactttga gccactcgaa ggacaaattt taaaaacttg tgggatgctg tggccataaa 60 ccttgaggac gctttgatca tattctatta actacagtac gaatatgatt cgacctttgc 120 aattttctct tgttttctaa ttcatatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcc 178 <210> 22 <211> 1198 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: inzerční úsek MS-BNl t 9 9· *« «fc • · 0· · · · 9 · *· ·' » 99 9 9 · ·

0 · 9··*9 9 9 • 9 99·«··

99« 999 999 «· ·· 9999 <400> 22

catggtgtga	tccaaagact	ttctcggccc	aaatactaat	catcacaagt	catgcatgat	60
ctgctcggga	tggccaagaa	aaatcgaacc	catgacaata	ttcacagttg	taagtttttt	120
accagtagac	aaataccact	tggtttaaca	tattgtaaac	ttaatatata	gaagatgttc	180
ctattcagaa	aataatatat	gtatatatat	aaaattttat	tggcgactcg	aggatgcaca	240
gaaatataaa	atgttggtcg	cttagaccat	ctccaatgta	tttctctatt	tttacctcta	300
aaataaagga	gctctataat	agaggtgggt	tttgctccaa	tgtatttctt	taaaatagag	360
atctctacat	atagagcaaa	atatagagga	atgttatttc	ttcctctata	aatagaggag	420
aaaatagcaa	tctctatttt	agaggcaaaa	atagagatbs	gttggagtga	ttttgcctct	480
aaatgctatt	atagaggtag	aaatagaggt	gggttggaga	tgctcttact	attttcatag	540
taggtgaaaa	cttgaaacta	gaaagctttg	gagtgtacga	gtggaaaacc	tctctttgta	600
gaaacataca	catgccattt	agttaactag	ttgacataga	tttttgagtc	agataacttt	660
aagaatatat	atgtttggat	gagagtttga	cactttgagc	cactcgaagg	acaaatttta	720
aaaacttgtg	ggatgctgtg	gccataaacc	ttgaggacvs	tttgatcata	ttctattaac	780
tacagtacga	atatgattcg	acctttgcaa	ttttctcttc	aggttttcta	attcatatgg	840
atttgttatg	ataaccaaaa	acaccctcct	ttttattata	aaggtaggga	tagctaatct	900
gttattcggt	tttgattaga	gatattaatc	ccgttttatc	aagtacagtt	tgatgtattt	960
ttttgttcgt 1020	tttcattaca	atccaagaca	agttaggttt	attacatttt	accaaaaaaa
aaggtttggt 1080	ttattgtgaa	cattgctgcg	gtttatttaa	atttgattct	attcaaaggt
caatccgtat 1140	ttaacaagta	aactagtctt	tatataatct	taaatctaac	gatctttgat
ttttaaattg	catttancta	tgtcctctct	ggcgtatatg	gtctctttga	aaacactc

1198 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 193 • »· ·· «» • · » · 0 » 4 • * · 0 · * »·«*·< « ··· · · · ·· ·· ·· ··»· <400> 23 tcatctacgg caatgtacca gc 22 <210> 24 <211> 1077 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek RF-BNl <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1)..(45) <223> pGEM®-T <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1061)..(1077) <223> pGEM®-T <400> 24

gagctctccc	atatggtcga	cctgcaggcg	gccgcactag	tgattcttag	cctgggtcag	60
ggcatggcat	gtctgatggt	acatgctaaa	tgctatattt	cctgtttaaa	gtgttaaaat	120
cattttctga	tggaactaaa	tccagtttta	agagtaactg	acaagtacaa	ttaagcacaa	180
caatataata	gtagtaattg	gcatctttga	ttgttaaata	tcaaaacagt	aaagttacaa	240
aaaaaaatac	caaaccaata	atgaagactt	ggcggagaca	gtgccgtgcg	aaggttttcg	300
gaggtccgag	acgagttcaa	aaatacattt	tacataatat	atttttcata	tatatatata	360
tataacattc	aaaagtttga	attattacat	aaacgttttc	taaattttct	tcaccaaaat	420
tttataaact	aaatttttaa	atcatgaaca	aaaagtatga	atttgtaata	taaatacaaa	480
gatacaaatt	tttgattgaa	atattggtag	ctgtcaaaaa	agtaaatctt	agaatttaaa	540
ttaactatag	taaactatat	attgaaaata	ttataaattt	ttatcaaatt	ctcataaata	600

• · · · · · * · a · * · · ··« · · * • · · ···»·♦ · • · ·····<

··· ··· ··· Β· ·· ····

tataaaataa	atctaactca	tagcatataa	aaagaagact	aatgtggatc	aaaatattta	-660
cagtttttta	gaagtagaat	ctttatagtt	ttatttaaaa	tatagcaaaa	atgatcacaa	720
acctagttay	ttaaggagaa	gtccaattca	aaatcaaata	aaaataaaat	ctatctaaaa	780
aaatatgtta	actaccatgc	aaaagtattt	tttttgtaat	tagaaaccct	gaaatttgta	840
caaaacttgg	acccctaggt	aaatgccttt	ttcatctcgc	gataagaaaa	ggcaatttgt	900
agatgttaat	tcccatcttg	aaagaaatat	agtttaaata	tttattgata	aaataacaag	960
tcaggtatta 1020	tagtccaagc	aaaaacataa	atttattgat	gcaagtttaa	attcagaaat
atttcaataa 1077	ctgattatat	cagctggtac	atcgccgtag	aatcccgcgc	catggcg

<210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 286 <400> 25 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 314 <400> 26 gtaggaggtt gggaagacc 19 <210> 27 fc fc • fcfc • « fcfcfcfc <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 315 <400> 27 gggctttcta ctagaaagct ctcgg <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 316 <400> 28 ccgataggga agtgatgtag gagg <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 288 <400> 29 atgcagcaag aagcttggag g <210> 30 «

• · · <211> 1501 • ·· ·* ·· •· · · · » 4

4 ♦ « « 9 • 9 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 9

494 44 99 4444 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek RF-BNl <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1)..(16) <223> pGEM®-T <220>

<221> různé vlastnosti <222> (1458)..(1501) <223> pGEM®-T <400> 30

ccatggccgc gggattgtag gaggttggga agacaggccc agaaagagat ttatctgact 60
cgttttgtgt	atagttttca	atgttcataa	aggaagatgg	agacttgaga	agtttttttt	120
ggactttgtt	tagctttgtt	gggcgttttt	tttttttgat	caataacttt	gttgggctta	180
tggtcgataa	gcgtgcgcat	gtctgatggt	acatgctaaa	tgctatattt	ctgtttaaag	240
tgttaaaatc	attttctgat	ggaactaaat	ccagttttaa	gagtaactga	caagtacaat	300
taagcacaac	aataaaatag	tagtaattgg	catctttgat	tgttaaatat	caaaacaata	360
aagttacaaa	aaaaaatacc	aaaccaataa	tgaagacttg	gcggagacag	tgccgtgcga	420
aggttttcgg	aggtccgaga	cgagttcaaa	aatacatttt	acataatata	tttttcatat	480
atatatatat	atataacatt	caaaagtttg	aattattaca	taaacgtttt	ctaaattttc	540
ttcaccaaaa	ttttataaac	taaaattttt	maatcatgaa	caaaaagtat	gaatttgtaa	600
tataaatacm	aagatacaaa	tttttgattg	aaatattggt	agctgtcaaa	aaagtaaatc	660
ttagaattta	aattaactat	agtaaactat	atatggaaaa	tattataaat	ttttatcaaa	720
ttctcataaa	tatataaaat	aaatctaact	catagcatat	aaaaagaaga	ctaatgtgga	780
tcaaratatt	tacagttttt	tagaagtaga	atctctatag	ttttatttaa	aatatagcaa	840

aaatgatcac	aaacctagtt	actttaacca	<32. * 9 gaagtccaat	9 · ♦9 99 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 tcaaaatcaa	99 99 99 * 9 9 9 9
• 9 9 9 • 9 9 0 9 < 9 9 9 9 99 99 *9 ataaaaataa	9 9 9 9 -900
aaatctatct	aaaaaaatat	gttaactacc	atgcaaaagt	attttttttt	gtaattagaa	960
accctgaaat 1020	ttgtacaaaa	cttggacccc	taggtaaatt	ccctagaaag	tatcctatta
gcgtcgacaa 1080	actgttgctc	atatttttct	ctccttactt	tatatcatac	actaatatan
gnagatgatc 1140	taattaatta	ttcatttcca	tgctagctaa	ttcaagaaaa	agaaaaaaaa
ctattatcta 1200	aacttatatt	cgagcaacac	ctcggagata	acaggatata	tgtcattaat
gaatgcttga 1260	actcatctcg	cgaactcatc	tcgcatcgct	tatagccaca	aagatccaac
ccctctcttc 1320	aatcatatat	cagtagtaca	atacaaatag	atattgtgag	cacatatgcc
gtctagtact 1380	gatgtgtaca	tgtagaggag	ccgcaaatgt	ttagtcactc	caacaaatga
gcatgaccac 1440	gcatcttctg	atgatgtaca	gccgtccctt	ttgctctctc	aaatatcctc
caagcttctt	gctgcataaa	tcactagtgc	ggccgcctgc	aggtcgacca	tatgggagag

1500 c 150 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 269 <400> 31 ggttttcgga ggtccgagac g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA

4 4 4 • · 4 4 ♦ · • 4

4444 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 283 <400> 32 cttggacccc taggtaaatg c

<210>	33
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence:
<400>	33
gtacaaaact tggaccccta gg
<210>	34
<211>	1068
<212>	DNA
<213>	Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence
	místa	RF-BNl
<400>	34

primer 284 cgcgttggga gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcactagtg attcttggac 60 ccctaggtaa atgccttttt caaaagcctc taagcacggt tctgggcggg gagtcagcga 120 gaaaaaaaga tatttcccta gaaagtatcc tattagcgtc gacaaactgt tgctcatatt 180 tttctctcct tactttatat catacactaa tataaaaaga tgatctaatt aattattcat 240 ttccatgcta gctaattcaa gaaaaagaaa aaaactatta tctaaactta tattcgagca 300 • 1 ·· ♦ ♦ • ·

acacctcgga	gataacagga	tatatgttat	taatgaatgc	ttgaactcat	ctcgcgaact	.360
catctcgcat	cgcttatagc	cacaaagatc	caacccctct	cttcaatcat	atatcagtag	420
tacaatacaa	atagatattg	tgagcacata	tgccgtctag	tactgatgtg	tatatgtaga	480
gganngcaaa	tgtttagtca	ctccaacaaa	tgagcatgac	nacgcatctt	ctgatgatgt	540
acagccgtcc	cttttgctct	ctcaaatatc	ctccaagctt	cttgctgcat	ggaatcttct	600
tcttggtgtc	tttcatgata	acaaaatcta	acgagagaga	aacccttagt	caagaaaaaa	660
caaataaaac	tctaacgaga	gtgtgtgaga	aagtagagag	tatgtgtgag	tgacggagag	720
aaagtgagac	cataaagatg	ttgtgcaaag	agagcaagac	ttaacctata	tatactcaca	780
tacacgtaca	catcataccc	attanagata	ataaaaagga	aaaaggaaca	actaacaagg	840
gaactgtatc	ccatacttta	tctcatcata	catgatgcat	aatatattct	ttcgtatatc	900
aagaaaaatg	agcctgatat	ttttttattt	cgaaactaaa	agagtgtcta	tttctctctc	960
ttagagatag 1020	tgccatgtca	aatttctaag	aagtagcaag	atttacaaag	gaatctaaag
caaccccacg 1068	cgcattgtgt	tcatttctct	cgaccatccc	gcggccat

<210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 57 <400> 35 gcatgatctg ctcgggatgg c 21 <210> 36 <211> 909 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek MS-BNl v rostlině ozimé řepky olejky

0 0 0 · 0 0 ·

<400> 36

tgcatgatct gctcgggatg gccaagaaaa atcgaaccca tgacaatatt cacagttgta 60
agttttttac	cagtagacaa	ataccacttg	gtttaacata	ttgtaaactt	aatatataga	120
agatgttcct	attcagaaaa	taatatatgt	atatatataa	aattttattg	gcgactcgag	180
gatgcacaga	aatataaaat	gttggtcgct	tagaccatct	ccaatgtatt	tctctatttt	240
tacctctaaa	ataaaggaac	tctataatag	aggtgggttt	tactccaatg	tatttcttta	300
aaatagagat	ctctacatat	agagcaaaat	atagaggaat	gttatttctt	cctctataaa	360
tagaggagaa	aatagcaatc	tctattttag	aggcaaaaat	agagatgggt	tggagtgatt	420
ttgcctctaa	atgctattat	agaggtagaa	atagaggtgg	gttggagatg	ctcttactat	480
tttcatagta	ggtgaaaact	tgaaactaga	aagctttgga	gtgtacgagt	ggaaaacctc	540
tctttgtaga	aacatacaca	tgccatttag	ttaactagtt	gacatagatt	tttgagtcag	600
ataactttaa	gaatatatat	gtttggatga	gagtttgaca	ctttgagcca	ctcgaaggac	660
aaattttaaa	aacttgtggg	atgctgtggc	ccataaacct	tgaggacgct	ttgatcatat	720
tctattaact	acagtacgaa	tatgattcga	cctttgcaat	tttctcttca	gtactcggcc	780
gtcgaactcg	gccgtcgagt	acatggtcga	taagaaaagg	caatttgtag	atgttaattc	840
ccatcttgaa	agaaatatag	tttaaatatt	tattggataa	aataacaagt	caggtattat	900
agtccaagc						909

<210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 68 <400> 37 ccatatacgc cagagaggac 20 <210> 38 •4 44 44

4 4 · 4 · 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 • 44 44 4444 <211> 522 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek MS-BNl v rostlině ozimé řepky olejky <400> 38

gcgaatgtat	attatatgca	taatttatat	attaaatgtg	tataatcatg	tataatcaat	60
gtataatcta	tgtatatggt	tagaaaaagt	aaacaattaa	tatagccggc	tatttgtgta	120
aaaatcccta	atataatcga	cggatccccg	ggaattccgg	gggaagctta	gatccatgga	180
tttgttatga	taaccaaaaa	caccctcctt	tttattataa	aggtagggat	agctaatctg	240
ttattcggtt	ttgattagag	atattaatcc	cgttttatca	agtacagttt	gatgtatttt	300
tttgttcgtt	ttcattacaa	tccaagacaa	gttaggttta	ttacatttta	ccaaaaaaaa	360
aggtttggtt	tattgtgaac	attgctgcgg	ttttatttaa	atttgattct	attcaaaggt	420
caatccgtat	ttaacaagta	aactagtctt	tatataatct	taaatctaac	gatacttgga	480
tttttaaatt	gcatttagct	atgtcctctc	tggcgtatat	gg		522

<210> 39 <211> 694 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 5'sousedící úsek RF-BNl v rostlině ozimé řepky olejky <400> 39 ggttttcgga ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttcatata 60 tatatatata tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120 • 0 0 *:

• 0 000 000

• 0 0» • 0

0 0 «

0

000 0

tcaccaaaat	tttataaact	aaaattttta	aatcatgaac	aaaaagtatg	aatttgtaat	.180
ataaatacaa	agatacaaat	ttttgattga	aatattggta	gctgtcaaaa	aagtaaatct	240
tagaatttaa	attaactata	gtaaactata	tattgaaaat	attataaatt	tttatcaaat	300
tctcataaat	atataaaata	aatctaactc	atagcatata	aaaagaagac	taatgtggat	360
caaaatattt	acagtttttt	agaagtagaa	tctttatagt	tttatttaaa	atatagcaaa	420
aatgatcaca	aacctagtta	ctttaaccag	aagtccaatt	caaaatcaaa	taaaaataaa	480
aatctatcta	aaaaaatatg	ttaactacca	tgcaaaagta	tttttttttg	taattagaaa	540
ccctgaaatt	tgtacaaaac	ttggacccct	aggtaaatgc	ctttttcatc	tcgcgataag	600
aaaaggcaat	ttgtagatgt	taattcccat	cttgaaagaa	atatagttta	aatatttatt	660
gataaaataa	caagtcaggt	attatagtcc	aagc			694

<210> 40 <211> 1279 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sekvence obsahující 3'sousedící úsek RF-BN1 v rostlině ozimé řepky olejky <400> 40

gggggttttt	ttttttgatc	aataactttg	ttgggcttat	ggtcgataag	cgtgcgcatg	60
tctgatggta	catgctaaat	gctatatttc	tgtttaaagt	gttaaaatca	ttttctgatg	120
gaactaaatc	cagttttaag	agtaactgac	aagtacaatt	aagcacaaca	ataaaatagt	180
agtaattggc	atctttgatt	gttaaatatc	aaacaataaa	gttcaaaaaa	aaataccaac	240
ccaataatga	agacttggcg	gagacagtgc	cgtgcgaagg	ttttcggagg	tccgagacga	300
gttcaaaaat	acattttaca	taatatattt	ttcatatata	tatatatata	taacattcaa	360
aagtttgaat	tattacataa	acgttttcta	aattttcttc	accaaaattt	tataaactaa	420
aatttttaaa	tcatgaacaa	aaagtatgaa	tttgtaatat	aaatacaaag	atacaaattt	480
ttgattgaaa	tattggtagc	tgtcaaaaaa	gtaaatctta	gaatttaaat	taactatagt	540
aaactatata	ttgaaaatat	tataaatttt	tatcaaattc	tcataaatat	ataaaataaa	600
tctaactcat	agcatataaa	aagaagacta	atgtggatca	aaatatttac	agttttttag	660

3$ ·

· 4 • ·· • 4 4 • 4

114

4

4 •4 4444

aagtagaatc tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact.720
ttaaccagaa	gtccaattca	aaatcaaata	aaaataaaaa	tctatctaaa	aaaatatgtt	780
aactaccatg	caaaagtatt	tttttttgta	attagaaacc	ctgaaatttg	tacaaaactt	840
ggacccctag	gtaaattccc	tagaaagtat	cctattagcg	tcgacaaact	gttgctcata	900
tttttctctc	cttactttat	atcatacact	aatataaaaa	gatgatctaa	ttaattattc	960
atttccatgc 1020	tagctaattc	aagaaaaaga	aaaaaaactt	attatctaaa	cttatattcg
agcaacacct 1080	cggagataac	aggatatatg	tcattaatga	atgcttgaac	tcatctcgcg
aactcatctc 1140	gcatcgctta	tagccacaaa	gatccaaccc	ctctcttcaa	tcatatatca
gtagtacaat 1200	acaaatagat	attgtgagca	catatgccgt	ctagtactga	tgtgtatatg
tagaggagcc	gcaaatgttt	agtcactcca	acaaatgagc	atgaccacgc	atcttctgat

1260 gatgtacagc cgtcccttt 1279 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer 268 (BNA04) <400> 41 tggaccccta ggtaaatgcc 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer BNA05 ’· » *

• · ··»·»» ·«· >1« ·»· · .« ·»*· <400> 42 aacgagtgtc agctagacca gc 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer BNA06 <400> 43 cgcagttctg tgaacatcga cc

100

Claims

1. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 1, kde genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

I) jeden soubor BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi 805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, jeden má délku mezi 2450 a 2838 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp,

II) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a 1159 bp, jeden délky mezi 1986 a 2450 bp a dva délky mezi 5077 a 14057 bp,

III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp,

IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal.

2. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

1, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo pletiv je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

3. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

2, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo

101 pletiv je schopna poskytnout čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

4. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

2, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo pletiv je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

5. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 1, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

6. Rostlina ozimé řepky olejky, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 5, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti přibližně 215 s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

7. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 1, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybrané ze skupiny, kterou tvoří:

I) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2266 bp, a jeden délky více než 14 kbp,

II) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde jeden má délku mezi 1159 a 1700 bp, výhodně přibližně 1,4 kbp, a druhý má délku více než 14 kbp,

III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a

102

2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,

IV) jeden soubor AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a 805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp, a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně 2477 bp,

V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, kde každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHW107 enzymem HindlII.

8. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

7, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

9. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

8, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

10. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

9, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

11. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

7, kde dále genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím

103 polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

12. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

1, které mohou být získány křížením rostliny s rostlinou ozimé řepky olejky získanou ze semen uložených v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.

13. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde se jedná o hybridní rostlinu, semena nebo hybridní rostlinné buňky nebo pletiva.

14. Semena uložená v ATCC pod přístupovým číslem PTA-730.

15. Rostlina ozimé řepky olejky nebo její semena, rostlinné buňky nebo pletiva, kde: a) genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

II) jeden soubor EcoRI fragmentů, jeden délky mezi 805 a

1159 bp, jeden délky mezi 1986 a mezi 5077 a 14057 bp, 2450 bp a dva délky III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde 5077 a 14057 bp, oba maj i délku mezi IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde j eden má délku

mezi 1700 a 2140 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen

9 ·

104 hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal, a/nebo

b) kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

16. Rostlina, semena, buňky nebo pletiva rostliny podle nároku 15, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti přibližně 215 s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence ze SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

17. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 15, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

18. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 17, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

19. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 18, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

20. Rostlina, buňky, pletivo nebo semena podle nároku 13, kde dále genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních ··· ···

105 fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,

V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHWlO7 enzymem HindlII, a/nebo

b) kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukieotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

21. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku 20, kde genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukieotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

106

22. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

20, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň tři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

23. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

22, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout alespoň čtyři soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

24. Rostlina, semena, rostlinné buňky nebo pletivo podle nároku

23, kde genomová DNA rostliny, semen, rostlinných buněk nebo tkání je schopna poskytnout všech pět souborů restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny.

25. Způsob produkce hybridních semen vyznačující se tím, že zahrnuje

a) křížení transgenní rostliny ozimé řepky olejky se samčí sterilitou, která má jednu z uvedených charakteristik nebo obě:

1) genomová DNA rostliny, buňky, pletiva nebo semen je schopna poskytnout alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

107

V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, přičemž každý z restrikčnich fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barnázy připravitelnou štěpením plazmidu pTHW107 enzymem HindlII, a/nebo

1) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce s dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19, s rostlinou ozimé řepky olejky obnovující fertilitu, obsahující, a to trvale integrován do svého genomu, gen obnovující fertilitu obsahující:

DNA kódující inhibitor ribonukleázy konstitutivní promotor, kde DNA je v stejné transkripční jednotce a pod kontrolou konstitutivního promotoru,

b)sklizení hybridních semen z rostlin ozimé řepky olejky se samčí sterilitou.

26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že rostlina obnovující fertilitu je charakterizována jednou z následujících vlastností nebo oběma:

1) genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčnich fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

I) jeden soubor BamHI fragmentů, kde jeden má délku mezi

108

805 a 1099 bp, výhodně přibližně 814 bp, jeden má délku mezi 1700 a 1986 bp, jeden má délku mezi 2450 a

2838 bp a jeden má délku mezi 5077 a 14057 bp,

III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde oba máji délku mezi 5077 a 14057 bp,

IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp a dva máji délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s fragmentem o velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci PTA29-barstar připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 enzymem Hpal, a/nebo

2) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotídové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

27. Hybridní semena rostlin ozimé řepky získatelná způsobem podle nároku 25 nebo 26.

28. Způsob přípravy buněk nebo rostlin transgenní ozimé řepky olejky vyznačující se tím, že zahrnuje inzerci rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky, kterážto molekula je v podstatě podobná sekvenci SEKV. ID. Č. 22, a regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.

29. Způsob podle nároku 28, kde rekombinantní DNA molekul je gen samčí sterility a regenerovaná rostlina je rostlina se • · · ·

109 samčí sterilitou.

30. Způsob přípravy buněk nebo rostlin transgenní ozimé řepky olejky vyznačující se tím, že zahrnuje inzerci rekombinantní DNA molekuly do části chromozómové DNA buňky ozimé řepky olejky, kterážto molekula je v podstatě podobná sekvenci SEKV. ID. Č. 34, a regeneraci rostliny ozimé řepky olejky z transformované buňky ozimé řepky olejky.

31. Způsob podle nároku 21, kde rekombinantní DNA molekul je gen obnovy fertility a regenerovaná rostlina je obnovitel fertility schopný po křížení s rostlinou se samčí sterilitou poskytnout potomstvo se samčí fertilitou.

32. Transgenní buňka nebo rostlina ozimé řepky získatelná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 28 až 31.

33. Způsob identifikace transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv, obsahující elitní událost MS-BNl, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA rostliny, buněk nebo pletiv má jednu z následujících vlastností nebo obě:

III) jeden soubor Hpal fragmentů, jeden délky mezi 1986 a 2140 bp, výhodně délky přibližně 1990 bp a jeden délky

110 mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2229 bp,

IV) jeden soubor AflIII fragmentů, jeden délky mezi 514 a

805 bp, výhodně délky přibližně 522 bp, a jeden délky mezi 2140 a 2450 bp, výhodně přibližně 2250 bp, a jeden délky mezi 2450 a 2838 bp, výhodně přibližně

2477 bp,

V) jeden soubor Ndel fragmentů, oba délky mezi 5077 a 14057 bp, výhodně jeden délky přibližně 6500 bp a jeden délky přibližně 10 kbp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s velikosti 3942 bp obsahujícím sekvenci připravitelnou štěpením plazmidu pTHW107 fragmentem o PTA29-barnázy enzymem HindlII, a/nebo

2) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o polymerázové velikosti mezi řetězové reakce

260 a 300 bp, s použitím s dvěma primery majícími nukleotídové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny, jejích pletiv nebo buněk může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 260 a 300 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

35. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost MS-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy, z nichž jedna rozpoznává sekvence v transgenu, další rozpoznává rostlinou DNA sekvenci ve 3' sousedícím úseku SEKV. ID. Č. 13 nebo 5' sousedící sekvenci SEKV. ID. Č. 18 události • 9

111

MS-BNl, pro použití v PCR identifikačním protokolu.

36. Souprava podle nároku 35 pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost MS-BNl, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 12 a SEKV. ID. Č. 19.

37. Způsob identifikaci transgenní rostliny nebo jejích buněk událost RF-BNl, nebo pletiv obsahujících elitní vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení jedené nebo obou z následujících charakteristik genomové DNA transgenní rostliny nebo jejích buněk nebo pletiv:

1) genomová DNA rostlin ozimé řepky olejky nebo semen, buněk nebo pletiv rostliny poskytnou alespoň dva soubory restrikčních fragmentů vybraných ze skupiny, kterou tvoří:

III) jeden soubor EcoRV fragmentů, kde oba mají délku mezi 5077 a 14057 bp,

IV) jeden soubor HindlII fragmentů, kde jeden má délku mezi 1700 a 2140 bp a dva mají délku mezi 2450 a 2838 bp, přičemž každý z restrikčních fragmentů je schopen hybridizace v podmínkách standardní stringence, s velikosti 2182 bp obsahujícím sekvenci připravitelnou štěpením plazmidu pTHW118 fragmentem o PTA29-barstar enzymem Hpal, a/nebo ♦* ·♦

112

2) genomová DNA může být použita k amplifikaci DNA

fragmentu o velikosti mezi 195 3 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery maj ícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41. Způsob podle nároku 37 v y z n a č u j ící se tím, že

zahrnuje stanovení toho, zda genomová DNA transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiv může být použita k amplifikaci DNA fragmentu o velikosti mezi 195 a 235 bp, s použitím polymerázové řetězové reakce se dvěma primery majícími nukleotidové sekvence SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

39. Souprava pro identifikaci transgenní rostliny, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy, z nichž jedna rozpoznává sekvence v transgenu, a další rozpoznává rostlinou DNA sekvenci v 3' sousedícím úseku SEKV. ID. Č. 24 nebo 5' sousedící SEKV. ID. Č. 30 události RF-BN1, pro použití v PCR identifikačním protokolu.

40. Souprava podle nároku 39, pro identifikaci transgenní rostlin, jejích buněk nebo pletiva obsahujících elitní událost RF-BN1, vyznačující se tím, že obsahuje PCR sondy mající nukleotidovou sekvenci SEKV. ID. Č. 23 a SEKV. ID. Č. 41.

41. Souprava pro identifikaci elitní události MS-BNl v biologických vzorcích vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvence v 3' nebo 5' sousedícím úseku události MS-BNl.

113

42. Souprava podle nároku 41 vyznačující se tím, že alespoň jeden PCR primer rozpoznává sekvence v rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 13.

43. Souprava podle nároku 42 vyznačující se tím, že primer rozpoznávající sekvence v rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 13 obsahuje sekvencí SEKV. ID. Č. 19.

nároků 41 az

44. Souprava podle kteréhokoliv z vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvence v cizorodé DNA MS-BN2.

45. Souprava podle nároku 44 vyznačující se tím, že primer rozpoznávájící sekvenci v cizorodé DNA MS-BNl obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 12.

46. Primer pro použití v MS-BNl PCR identifikačním protokolu, který má sekvenci, která za optimalizovaných PCR podmínek specificky rozpoznává sekvenci v 5' nebo 3' sousedícím úseku MS-BNl.

47. Primer podle nároku 46, který má alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí rostlinné DNA SEKV. ID. Č. 13 nebo SEKV. ID. Č. 18 nebo komplementární sekvencí.

48. Primer podle nároku 47 obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 19.

49. Primer obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 12.

50. Způsob pro potvrzení čistoty osiva vyznačující se tím, že zahrnuje detekci MS-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primerů nebo sondy, která specificky

• • · • • • · 9 • 9 9 9 0 0 0« 9 9 ·· 9 0 9 0 00 9 0 0 • 9 4 0 9 • • • 0 · • · 9 0 9 0 • 0 • 9 9 · · ·

114 rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BNl, ve vzorcích semen.

51. Způsob screeningu osiva na přítomnost MS-BNl vyznačující se tím, že zahrnuje detekci MS-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek MS-BNl, ve vzorcích šarže osiva.

52. Souprava pro identifikaci elitní události RF-BNl v biologických vzorcích vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvence v 3' nebo 5' sousedícím úseku události RF-BNl.

53. Souprava podle nároku 52 vyznačující se tím, že alespoň jeden PCR primer rozpoznává sekvenci rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 24.

54. Souprava podle nároku 53 vyznačující se tím, že primer rozpoznávající sekvenci v rostlinné DNA v SEKV. ID. Č. 24 obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 41.

55. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 52 až 54 vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň druhý PCR primer nebo sondu, která rozpoznává sekvenci v cizorodé DNA MS-BN2.

56. Souprava podle nároku 55 vyznačující se tím, že primer rozpoznávající sekvenci v cizorodé DNA RF-BNl obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 23.

57. Primer pro použití v RF-BNl PCR identifikačním protokolu

115 který má sekvenci, která za optimalizovaných PCR podmínek specificky rozpoznává sekvenci v 5' nebo 3' sousedícím úseku MS-BNl.

58. Primer podle nároku 57, který má alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí rostlinné DNA SEKV. ID. Č. 24 nebo SEKV. ID. Č. 30 nebo komplementární sekvencí.

59. Primer podle nároku 58 obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 41.

60. Primer obsahující sekvenci SEKV. ID. Č. 23.

61. Způsob potvrzení čistoty osiva vyznačující se tím, že zahrnuje detekci RF-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek události RF-BNl, ve vzorcích semen.

62. Způsob screeningu osiva na přítomnost RF-BNl vyznačující se tím, že zahrnuje detekci RF-BNl specifické DNA sekvence pomocí specifického primeru nebo sondy, která specificky rozpoznává 5' nebo 3' sousedící úsek RF-BNl, ve vzorcích šarže osiva.