CZ317094A3 - Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu - Google Patents

Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu Download PDF

Info

Publication number
CZ317094A3
CZ317094A3 CZ943170A CZ317094A CZ317094A3 CZ 317094 A3 CZ317094 A3 CZ 317094A3 CZ 943170 A CZ943170 A CZ 943170A CZ 317094 A CZ317094 A CZ 317094A CZ 317094 A3 CZ317094 A3 CZ 317094A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
nitrile hydratase
transformant
nitrile
hydratase
Prior art date
Application number
CZ943170A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ284017B6 (cs
Inventor
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Toru Nagasawa
Sueharu Horinouchi
Makoto Nishiyama
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Rayon Co., Ltd., Teruhiko Beppu, Hideaki Yamada filed Critical Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Publication of CZ317094A3 publication Critical patent/CZ317094A3/cs
Publication of CZ284017B6 publication Critical patent/CZ284017B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká DNA fragmentuodvozeného od Rhodococcus rhodochrous J-l a kódujícího polypeptid s nitriljhydra- J~i tasovou aktivitou, který hydrátu je nitrily na amidu·. Vynález
Ϊ (L) se také týká feaJcé. rekombinantní DRA, obsahující uvedený DNA fragment a transformantu transformovaného rekombinantní DNA. Vynález se dále týká způsobu přípravy nitril-hydratasy za použití tohoto transformantu a způsobu přípravy amidů pomocí nitril-hydratasy.
Dosavadní stav techniky
Nitril-hydratasa nebo nitrilasa je známa jako enzym, který hydratuje nitrily na amidy. Mezi mikroorganismy, které produkují nitril-hydratasu patří mikroorganismy rodu Bacillus, rodu Bacterium, rodu Micrococcus a rodu Brevibacterium /viz japonský patent 8-62-21517/1989, US patent č. 4001081/, rodu Corynebacterium a rodu Nocardia /viz japonský patent B-56-17918/1989, US patent č. 4248968/, rodu Pseudomonas /viz japonský patent 59-37951/1984, US patent č.
4637982/, rodu Rhodococcus, rodu Arthrobacter a rodu Microbacterium /viz japonský patent A-61-162193/1986, evropská patentová přihláška č. 0188316/ a rodu Rhodococcus rhodochrous /viz japonský patent 470/1990 a evropská patentová přihláška č. 0307926/.
Nitril-hydratasa se používá pro hydratování nitrilů na amidy. Podle tohoto vynálezu se upraví mikroorganismy tak, aby obsahovaly více kopií rekombinantní DNA, kódující nitril-hydratasu technologií rekombinantní DNA. Rekombinant produkuje pozoruhodně vysoké hladiny nitril-hydratasy ve srovnání s běžně používanými mikroorganismy.
-2Autoři vynálezu již dříve objevili fragment DNA odvozené od Rhodococcus sp.N-774 /FERM BP-1936/, který také kóduje polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou /japonský patent č. A-2-119778/1988/.
Na rozdíl od objevu uvedeného v předchozím odstavci využívají autoři tohoto vynálezu pro přípravu nitril-hydratasy fragmentu DNA odvozeného od Rhodococcus rhodochrous J-l.
Byl izolován gen, kódující nitril hydratasu, tento gen byl vložen do vhodného plasmidového vektoru a příslušný hostitel byl transformován tímto rekombinantním plasmidem. Byl tak úspěšně získán transformant, který produkuje nitril-hydratasu s vysokou aktivitou také k aromatickým nitrilům.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká;
Fragmentu DNA^L\ kódujícího polypeptid, který má nitril-hydratasovou aktivitu, kde tento peptid obsahuje (L)' o '^^p-Podjednotky následujících sekvencí aminokyselin:
a ^^-podjednotka:
10 15
MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrteuProArgSerAsn
0 z S 3 0
GluGlulleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlalleLeuVal
5 4 0 4 5
AspLysGlyleulleSerThrAspAlalleAspHisMetSerSer
0 5 5 6 0
ValTyrGluAsnGluValGIyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal
5 Ό 7 5
AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr
0 8 5 9 0
AspAlaThrSerAlaCysArgGIuMetGlyValGIyGIyMetGln
5 10 0 I 0 S
GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn
-3ιιο ι i s i z o
MetValValCysThrteuCysSerCysTyrProTrpProValLeu
I Z S 13 0 13 5
GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg
0 14 5 ISO
AlaValArgAspProArgGIyValleuAIaGluPheGlyTyrThr
I S5 16 0 | 6 s
ProAspProAspValGluIleArgl leTrpAspSerSerAlaGlu '70 I 7 S ISO
LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGIuAsn
IBS 190 | 9 S
PheThrGluGluGlnleuAlaAspLeuValThrArgAspSerleu
IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla p(L>
podjednotka;
10 |5
MetAspGIylleHisAspleuGlyGlyArgAlaGlyleuGlýPro
Z O Z 5 3 0 lleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
5 < O 4 S
ArgSerValleuThrMetPheProAlaMetAlaleuAlaGlyAIa
0 5 5 6 0
PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnlleProPro
5 7 0 7 5
HisAspTyrleuThrSerGInTyrTyrGluHisTrpMetHisAla
S O « S 9 0
Metl lellisHisGlyl leGluAlaGlyl lePheAspSerAspGlu
100 105
LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr
110 115 i 2 O
ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuVaiGluThrlleSerGIn
I Z 5 13 0 I 3 S
LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
4 0 1 4 5 1 5 0
AlaAlaPheAIaValGIyAspLysValIleValArgSerAspAla
5 5 1 6 0 1 6 5
SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg
7 0 1 7 5 |(o
ValGIyGluValValAlaThrIlisGlyAlaTyrValPheProAsp
IBS 190 195
ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr
ZOO Z o 5 Z , o
ValArgPheSerAIaThrGIuLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
Z I 5 ZZO 12 5
AsnValValAsnHisIieAspValPheGluProTyrLeuLeuPro A t a
-4Dále se předložený vynález týká fragmentu DNA výše, který obsahuje sekvence nukleotidů a S L jednotek, kde DNA sekvence '-podjednotky znamena uvedeného - podATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC
0 7 S 7 0
GAGGAGATCGCCGCACGCGTGA AGGCCA TGGAGGCCATCCTCGTC gacaagggcctgÁtctccaccgacgccatcgaccacatgtcctcg
ISO US ISO gtctacgagaacgaggtcggtcctcaactcggcgccaagatcgtc
5 ZI0 z Z 5
GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC
4 0 ZS5 Z 7 0
GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG
285 300 315
GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
ATGG TCG T A TG T A CC T TG TG C TCG TG CT A TCCG TG G CCG G T TC TC
375 370 4 0 S
GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC
I ZO 435 450
GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC
465 480 475
CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA
510 5ZS 540
CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC I TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC ___________________1 ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCA AGGCC a DNA sekvence -podjednotky znamená atggatggaatccacgACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG ATCAAGCCCGAATCCGATGaACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG
-5cacgactacctgacctcgcaatactacgÁgcactggatgcacgcg. atgatccaccacggcatcgaggcgggcatcttcgattccgacgaa CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA CTGATCACCCACCGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG
GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGA AATCCGCTACATCGTCATC
CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG
ACGAAGCTGGTGAGCCGGG ACTCGATG ATCGGTGTCAGTA ATGCG
CTCACACCGCAGGAAGTG ATCGTA
Dále se vynález týká rekombinantní DNA, obsahující ve vektoru DNA^L^ jak byla uvedena výše.
Ještě dále se vynález týká transformantu, který je transformován rekombinantní DNA , jak byla uvedena výše.
Ještě dále se vynález týká způsobu přípravy nitril-hydratasy kultivací transformantu uvedeného výše a izolací nitril-hydratasy z kultury.
Dále se vynález týká způsobu přípravy amidů, vyznačujícího se tím, že se nitrily hydratují nitril-hydratasou jak je uvedeno výše, za tvorby amidů.
Ještě dále se vynález týká způsobu přípravy amidů, který se vyznačuje tím, že se kultivuje výše uvedený trans— formant a nitrily se hydratují výslednou kulturou izolovaných bakteriálních buněk, materiálem z nich získaným nebo fixovaným,
-6Dále bude předložený vynález podrobněji popsán.
Postupuje se podle stupňů 1 až 8.
1. stupeň: Izolace a čištění nitril-hydratasy a částečné aminokyselinové sekvenování nitril-hydratasy
Z Rhodococcus rhodochrous J-l /FERM BP-1478/ se izolují a vyččistí dva typy nitril-hydratasy /označené jako typ
K a L/. Oba enzymy se rozdělí pomocí HPLC na pod jednotky θζ a 8. Určí se část aminokyselinové sekvence každé z podjednotek /obr.l/.
2. stupeň: Příprava DNA sondy na gen nitril-hydratasy
DNA sonda se připraví z JMlO5/pYUK121 /FERM BP-1937/ jak je popsáno v japonském patentu A-2-119778/1990 díky vysokénu stupni homologie aminokyselinové sekvence nitril-hydratasové β-podjednotky z Rhodococcus sp. N-774 /popsané v uvedeném oficiálním japonském patentovém časopise Japanese Patent Official Gazette/ a z Rhodococcus rhodochrous J-l. plasmid z PYUK121, obsahující gen nitril-hydratasy odvozený od Rhodococcus sp. N-774 se připraví z kultury JMlO5/pYUK121. pYUK121 DNA se rozštěpí působením Sphl a Sáli. SphI-SalI fragment obsahuje gen nitril-hydratasy odvozený od Rhodococcus sp. K-774 /obr.2/. Fragment DNA se radioaktivně označí.
3. stupeň: Detekce segmentu DNA, obsahujícího gen nitril-hydratasy z chromosomu Rhodococcus rhodochrous J-l
Chromosomová DNA se připraví z kultury Rhodococcus rhodochrous J_l. Chromosomová DNA se rozštěpí restrikčními enzymy a hybridizuje se sondou popsanou ve stupni 2 s použitím Southernovy hybridizační metody /Southern E.M. : J.Mol.
Biol. 98, 503 /1975//. Testují se dva DNA fragmenty různé délky
-Ί4. stupeň: Konstrukce rekombinantního plasmidu
Rekombinantní plasmid se zkonstruuje vložením chromosomového DNA fragmentu připraveného podle stupně 3 do plasmidového vektoru.
5. stupeň: Transformace a testování transformantu, obsahujícího rekombinantní plasmid
Z rekombinantního plasmidu popsaného ve stupni 4 se připraví transformanty. Transformant, obsahující rekombinantní plasmid se vybere pomocí sondy popsané ve stupni 2 způsobem hybridizace kolonií /Bruče Wallace R. a kol.,Nucl Acids Res. 9, 879/1981//. Přítomnost genu nitril-hydratasy v rekombinantním plasmidu se potvrdí Southernovou hybridizační metodou. Takto vybrané plasmidy se označí pNHJlOH a pNHJlOL.
6. stupeň: Izolace a čištění plasmidové DNA a konstrukce restrikční mapy
Plasmidové pNHJlOH a pNHJ20L, které byly připraveny podle stupně 5, se izolují a vyčistí. Pro určené oblasti, obsahující gen nitril-hydratasy se zkonstruuje restrikční mapa DNA /obr.3/.
7. stupeň: Sfekvenování DNA
Příslušným restrikčním enzymem se vyštěpí z plasmidu pNHJlOH a pNHJlOL segment vloženého fragmentu DNA. Tento vložený fragment DNA se pak použije pro sekvenování. Nukleo tidová sekvence fragmentu D /obr.4,5/ ukazuje, že fragment obsahuje sekvenci odvozenou od aminokyselinové sekvence popsané ve stupni 1.
-88.stupeň: Příprava nitril-hydratasy pomocí transformantu a konverse nitrilů na amidy
Kultivuje se transformant popsaný v bodě 8. Tyto bakteriální buňky se smíchají s nitrily. Připraví se tak substrát nitril-hydratasy a amidů.
Rhodococcus rhodochrous J-l byl uložen ve Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology a byl označen číslem FERM-BP-1478. Transformant TGl/pHHJlOH, obsahující pNHJlOH popsaný ve stupni 5 a transformant TGl/pNHJ20L, obsahující pHJJlOL popsaný ve
V Z v v z stupni 5 byl uložen v uvedený sbírce a označen číslem
FERM BP-2777 a FERM BP-2778.
Lze používat jakékoliv vektory včetně plasmidového vektoru /např. pATl53, pMPS, pHC624, pKC7 atd./, fágového vektoru /např. gtll /Toyobo/, Charon 44 /Amershara/ atd/.
Mezi enzymy, které se mohou používat, patří Sphl, Sáli, EcoRI, Bam Kl, Sací a podobné, komerčně dostupné od Takara Shuzo.
Pro transformaci lze použít různé hostitele včetně /ale bez omezení pouze na tyto/ E.coli JM105 a E.coli T01. Jako kultivační media pro transformanty se používají taková kul tivační media, která jsou obvykle v této oblástLpoužívána.
Kitrily se ma amidy převádějí pomocí nitril-hydratasy, surové nitril-hydratasy, kultury transformantu, izolovaných bakteriálních buněk nebo zpracovaných materiálů těchto buněk a pod., připravených z kultury transformantu.
Mezi vhodné nitrily podle vynálezu patří aromatické nitrily se čtyřmi až deseti atomy uhlíku v aromatické části a alifatické nitrily se dvěma až šesti atomy uhlíku, které jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 0307926. Typickými příklady jsou 4-,3- a 2-kyanopyridiny, 2-furonitril, kyanopyrazin, akrylonitril, methakrylonitril, krotonnitril, acetonitril a 3-hydroxypropionitril.
Tento vynález popisuje aminokyselinovou sekvenci a nukleotidovou sekvenci - a β-podjednotek typu nitril-hydratasy odvozené od Rhodococcus rhodochrous J-l. Fragment DNA, kódující nitril-hydratasu se vloží do expresního vektoru a rekombinantní vektor se použije pro transformaci. Transformant obsahuje více kopií genu a může produkovat mnohem vyšší hladiny nitril-hydratasy při srovnání s konvenčně používanými mikroorganismy.
Dále je uveden popis obrázků na připojených výkresech.
Obr.l - představuje N-koncové aminokyselinové sekvence©ýa β-podjednotek dvou typů nitril-hydratasy produkovaných Rhodococcus rhodochrous J-l.
Obr.2 - představuje sekvenci DMA genu nitril-hydratasy z
Rhodococcus sp.> N-774,,která se používá jako sonda DNA.
Obr.3 - představuje restrikční mapy rekombinantních plasmy dů pHHJlOH a pNHJ20L.
Obr.4- představuje Ε'Ά sekvenci fragmentu DNA v pNHJlOH odvozeném od Rhodococcus rhodochrous J-l a odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
Obr. 5 - představuje DNA sekvenci fragmentu v pNHJ20L odvozeném od Rhodococcus rhodochrous J-l a odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
Předložený vynález bude dále podrobněji ilustrován v následujících příkladech, které jej v žádném případě nikterak neomezují. V příkladech jsou použity tyto zkratky: TE znamená Tris-I-ICl /10 mM, pH 7,8/ a EDTA /1 mM, pH 8,0/, TNE Znamená Tris-HCl /50 mil, pH 8,0/, EDTA /1 mM, pH 8,0/ a NaCl /50 mM/, STE znamená Tris-HCl /50 mM, pH 8,0/, EDTA /5 mM, pH 8,0/ a sa charosa /35 mM/, 2x YT medium znamená 1,5 % Tryptonu, 1,0 % kvasničného extraktu a 0,5 % NaCl.
Příklady provedení vynálezu
-10Příklad 1
Izolace a čištění nitril-hydratasy a částečné sekvenování aminokyselin nitril-hydratasy
Rhodococcus rhodochrous J-l se kultivuje v mediu /3 g/1'kvasničného extraktu, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu horečnatého.4H2O, 0,01 g/1 chloridu kobaltnatého a 3 g/1 krotonamidu, pH 7,2/ 80 hodin při teplotě 28 °C.
Izolují se bakteriální buňky. 50 g bakteriálních buněk se rozruší a frakcionuje se síranem amonným. Vzorek se dialyzuje a dialyzát se odstřeluje. Supernatant se nanese na chromatografickou kolonu naplněnou nosičem DEAE-Cellulofine, Phenyl-Sepha rose, Sephadex G-150 a Octyl-Sepharose. Získají se dvě frakce s enzymovou aktivitou. Obě frakce se dialyzují. Dialyzáty se nanesou na kolonu s reverzní fází /Senshu Pak VP-304-125,
Senahu Kagaku/ a chromatografují se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Získají se dvě podjednotky / a 8/.
:, ( h ) _ ( h :
~· .1
N-Koncové aminokyselinové sekvence (L)- podjednotek byla stanovena na proteinovém sekvenátoru
Applied Biosystems model 470A. Sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obr. 1.
Příklůad 2
Příprava DNA sondy pro gen nitril-hydratasy
E.coli JM105 /FERM BP-1937/, obsahující pYUKl21 se kultivuje ve 100 ml media 2xYT, obsahujícího 50/ug/ml ampicilinu při 30 °C přes noc /12 hodin/. Bakteriální buňky se izolují.
K buňkám se přidá TNE. Suspenze buněk se pak odstřeluje. K peletě se přidá 8 mlSTe a 10 mg lysozymu. Směs se inkubuje 5 minut při teplotě 0 °C. Potom se přidají 4 ml 0,25M EDTA.
Ke směsi se za teploty místnosti přidají 2 ml 10% SDS a 5 ml chloridu sodného. Výsledná směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 0 až 4 °C. Potom se směs odstřeluje na ultraodstředivce. K supernatantu se přidá 1/2 objemu 30% PEG 5000. Směs se inkubuje přes noc /12 hodin/ při 0 °C až 4 °C a odstředí se.
-11K peletě se přidá tolik TNE, aby objem roztoku byl 7,5 ml. K suspenzi se přidá CaCl. Odstředěním směsi se odstraní proteiny. K supernatantu se pak přidá 300 až 500 mg/ml ethdiniumbromidu. Směs se přenese do ultracentrifugační zkumavky. Zkumavka se zataví a potom se odstřeluje v ultraodstředivce. cccDNAse vyextrahuje peristaltickou pumpou. K extraktu se přidá o něco více než je stejné množství isopropylalkoholu nasyceného vodou, pro odstranění ethidiniumbromidu. Vzorek se dialyzuje proti TE. Získají se tak asi 3 ml vyčištěného pYUK121.
pYUKl21 DNA se rozštěpí působením Sphl a Sáli. Získá se ta fragment DNA o 2070 nukleotidech, obsahující gen nitril-hydratasy odvozený od Rhodococcus sp. N-774, Označením fragmentu 32
P se získá sonda. Sekvence nukleotidů sondy je uvedena na obr. 2.
Příklad 3
Příprava fragmentu DNA, obsahujího gen nitril-hydratasový gen z chromosomu
Rhodococcus rhodochrous J-l se kultivuje ve 100 ml media /10 g/1 glukosy, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu hořečnatého. 7 H2O/, 1 g/1 kvasničného extraktu,
7,5 g/1 peptonu, 0,01 g/1 chloridu kobaltnatého, 7,5 g/1 močoviny, 1 % glycinu nebo 0,2 ^ug/ml ampicilinu, 1 litr vody, pH 7,2/. Bakteriální buňky se izolují a pelety se promyjí TNE. Pelety se suspendují v 10 ml TE. K suspenzi se přidají 4 ml 0,25M EDTA, 10 až 20 mg lysozymu, 10 až 20 mg acromoproteasy a 10 ml lOxSDS. Suspenze se inkubuje tři hodiny při 37 °C. K suspenzi se přidá 15 ml fenolu. Směs se inkubuje patnást minut při teplotě místnosti, odstředí, horní vrstva se odloží a k supernatantu se přidá 0,7 ml
2,5M octanu sodného a diethylether. Směs se odstřeňuje.
Horní vrstva se odstraní. Ke spodní vrstvě se přidají dva objemy ethanolu a DNA se odebere skleněnou tyčinkou. DNA se promývá pět minut směsí TE:ethanol 2:8,1:9 a 0:10 /objemové
-12díly:objemovým dílům/. Potom se DNA suspenduje ve dvou až čtyřech ml TE /37 °C/. K suspenzi se přidá 10 ^ul směsi RNA-sy A a T^. Směs se inkubuje při teplotě 37 °C. Ke směsi se přidá stejné množství fenolu a výsledná směs se odstředí. K supernatantu se přidá více než stejné množství etheru. Směs se opět odstřeluje. Horní vrstva se oddělí. Spodní se přes noc dialyzuje proti dvěma litrům TE, obsahujícího malé množství chloroformu, potom se dialyzuje tři až čtyři hodiny proti čerstvému TE. Získají se tak 4 ml surové chromosomové DNA.
K 15 /Ul surové chromosomové DNA se přidá 10 ^ul TE, ,ul reakčního pufru /10x/ a 2 ,ul Sací. Směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 37 C. Potom se elektrofořezuje na agarosovém gelu tři hodiny při 60 V. Southernova hybridizace chromosomové DNA se provádí sondou, která je popsána v příkladu 2. Silnou hybridizaci vykazovaly fragmenty s asi 6000 nukleotidy a 9400 nukleotidy.
Působením Sací se rozštěpí 15 ^ul chromosomové DNA. Směs se elektrofořezuje na agarosovém gelu jak bylo dříve popsáno.
Z gelu se vyříznou fragmenty DNA se 6000 a 9400 nukleotidy a přenesou se do třech objemů 8M chloristanu sodného. Po rozpuštění se každý roztok natečkuje na filtrační papír GF/C /Whatman//průměr 6 mm/. Na filtrační papír se pak přidá 10 kapek /přibližně 100 mikrolitrů/ TE, obsahujícího 6M chloristan sodný a 10 kapek /přibližně 100 mikrolitrů/ 95% ethanolu. Papír se suší tři minuty na vzduchu, přenese se do 0,5ml eppendorfovy zkumavky, přidá se 40 mikrolitrů TE a vše se inkubuje třicet minut při teplotě 47 °C. Zkumavka se pak odstřeáuje. Získá se asi 40 mikrolitrů supernatantu, který obsahuje fragmenty DNA o 6000 a 94000 nukleotidech, které obsahují nitrilhydratásový gen chromosomové DNA.
Dále je popsán způsob inzerce fragmentu DNA o 6000 nukleotidech do vektoru. Stejný způsob se použije také pro inzerci fragmentu DNA o 9400 nukleotidech do vektoru.
-13Příklad 4
Inzerce fragmentu chomosomové DNA do vektoru
K 10 /Ul pUCl9 se přidá 10 ,,ul TE, 3 ^ul reakčního pufru /10x/ a 2 ^ul Sací. Směs se inkubuje jednu hodinu při 30 °C. Pro zastavení reakce se ke směsi přidají 2 /Ul 0,2511 EDTA. Potom se ke směsi přidá 7 ^ul Iři Tris-HC1 /pH 9/ a 3 ,ul BAP /bakteriální alkalická fosfatása/.
Směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 55 C. Ke směsi se přidá tolik TE, aby konečný objem byl 100 mikrolitrů. Směs se extrahuje 3x stejným množstvím fenolu. K extraktu se přidá stejné množství etheru. Spodní vrstva se odebere a přidá se k ní 10 mikrolitrů 3? octanu sodného a 250 mikrolitrů ethanolu. Směs se inkubuje třicet minut pri teplote -80 C, odstreoi se, vysuší a resuspenduje v TE.
Pět mikrolitrů takto získané pUCl9 DNA se smísí se 40 jUl fragmentu DNA o 5000 nukleotidech, který byl popsán v příkladu 3. Ke směsi se přidá 6 ^ul ligačního pufru, /Ul ATP /5 mg/ml/ a 3 ^ul T4 DNA ligasy. Směs se inkubuje pes noc /12 hodin/ při 4 °C. Získá se tak rekombinantní plasmid, obsahující fragment DNA o 5000 nukleotidech, kódující žádaný enzym v místě Sací pUCl9.
Příklad 5
Transformace a testování transformantu
Do 10 ml media 2xYT se naočkuje E.coli Tgl /Amersham/ a inkubuje se dvanáct hodin při 37 °C. Po inkubaci se výsledná kultura přidá k čerstvému mediu 2xYT na koncentraci asi 1 % a směs se inkubuje 2 hodiny.při teplotě 37 °c. Kultusa se odstře dí a peleta se suspenduje v 5 ml chladného 50 mil chloridu vápenatého. Suspenze se vloží do ledu na 40 minut a pak se odstředí. K peletě se přidá 0,25 ml chladného 50 mM chloridu vápenatého a 60 mikrolitrů rekombinantní DNA, která je po-14psána v příkladu 4. Směs se inkubuje 40 minut při teplotě 0 °C, vystaví se dvouminutovému působení tepelného šoku /42 °C/, vloží se na pět minut do ledu a přidá se k 10 ml media 2xYT. Směs se inkubuje 90 minut při 37 °C za třepání. Potom se odstředí. Peleta se suspenduje v 1 ml media 2xYT. Na agarosovou plotnu, obsahující /2xYT/ 50 ^ug/ml ampicilinu se jednotlivě vysejí dva podíly /po 10 mikrolitrech/ suspenze. Pitná se inkubuje při teplotě 37 °C. Kolonie vyrostlé na plotně se vyberou způsobem hybridizace kolonií: kolonie se přenesou na nitrocelulosový filtr a rozštěpí. DNA zůstala fixována na filtru. Byla hybridizována sondou jak je to popsáno v příkladu 2. Filtr se autoradiografuje. Vybere se rekombinantní kolonie. Přítomnost genu nitril hydratasy v transformantu byla potvrzena také Southernovou hybridizační metodou.
Příklad 6
Izolace a —ěičfcění- rekombinantního plasmidu a konstrukce restrikční mapy vložených fragmentů DNA
Transformant, který se vybere jak je popsáno v příkladu 5, se nechá růst ve 100 ml media 2xYT, obsahujícího 50 /Ul/,1 ampicilinu přes noc /12 hodin/ při 37 °C. Izolují se bakteriální buňky. K buňkám se přidá TNE. Buňky se opět odstředí.
K buňkám se přidá 8 ml STE a 10 mg lysozymu. Směs se inkubuje pět minut při 0 °C. Ke směsi se přidají 4 ml 0,25N EDTA, ml 10% EDS /za teploty místnosti/ a 5 ml 514 chloridu sodného. Směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 0 až 4 °C a od střeňuje se na ultraodstředivce. K supernatantu se přidá 1/2 objemu 30% PEG. Směs se inkubuje přes noc /12 hodin/ při teplotě 0 až 4 °C a opět se odstřeluje. K peletě se přidá tolik TNE, aby konečný objem byl 7,5 ml. K suspenzi se přidá CsCl. Tím se suspenze zbaví proteinů. K supernatantu se potom přidá 300 až 500 mg/ml ethidiniumbromidu a směs se přenese do centrifugační zkumavky. Zkumavka se zataví a odstřeluje se na ultracentrifuze. Peristaltickou pumpou se odstraní
15cccDNA. K cccDNA se pro odstranění ethidiniumbromidu přidá o něco víc než stejné množství isopropylalkoholu nasyceného vodou. Vzorek DNA se dialyzuje proti TE. Získají se asi 3 ml vyčištěné rekombinantní DNA. Takto získaný rekombinantní plasmid, obsahující fragment DNA o 67000 nukleotidech se označí pNHJlOH a rekombinantní plasmid, obsahující fragment DNA o 9400 nukleotidech se označí pNHJ20L.
Tyto plasmidové DNA se rozštěpí působením EcoRI, Baml-II, Pstl, Sací, popř. Sáli. Zkonstruované mapy jsou uvedeny na obr. 3.
Příklad 7
Sekvenování DNA
Umístění genu nitril-hydratasy ve fragmentu DNA pNHJlOH bylo stanoveno podle zkonstruované restrikční mapy a podle Southernovy hybridizační metody. Přidaný segment v pNHJlOH byl štěpen působením Pstl a Sáli. Fragment DNA o 6000 nukleotidech poskytl fragment o 1970 nukleotidech. Podobně byl štěpen působením EcoRI a Sací přidaný fragment v pNHJ201.
Z fragmentu o 9400 nukleotidech byl získán fragment o 1730 nukleotidech.
Tyto fragmenty DNA byly sekvenovány způsobem podle Sangera /Sanger F.:Science 214, 1205 až 1210/1931// pomocí fágového M13 vektoru. Sekvence nukleotidů fragmentu DNA o 1970 nukleotidech /pNRJlOE/ a sekvence nukleotidů fragmentu DNA o 1730 nukleotidech /pNHJ20L/ jsou uvedeny na obr.4 a 5.
Bylo zjištěno, že sekvence aminokyselin odvozená od sekvence nukleotidů je plně identická se sekvencí aminokyselin, která byla stanovena v příkladu 1. Sekvenční analýza také odhalila, že fragment DNA obsahoval sekvenci, obsahující a β-podjednotky.
-16Příklad 8
Příprava nitril-hydratasy pomocí transformantu a konverze nitrilů na amidy pomocí nitril-hydratasy
Do 10 ml media 2xYT, které obsahuje 50 ^ug/ml ampicilinu se naočkuje TG-l/pNHJlOH a TG-l/pNHJ20L. Směs se inkubuje přes noc při teplotě 30 °C /12 hodin/. Jeden mililitr výsledné kultury se přidá ke 100 ml media 2xYT /50 /Ug/ml ampici-ý^ linu, 0,1 g CoC^.6H2O/1/. Směs se inkubuje čtyři hodiny při 30 C. Ke směsi se přidá IPTG na konečnou koncentraci 1 mil. Směs se inkubuje 10 hodin při 30 °C. Po izolování buněk se buňky suspendují v 5 ml 0,1M fosforečnanového pufru /pH 7,5/. Suspenze se rozbije ultrazvukem /pět minut/ a odstřeluje se 30 minut při 12000 g. Výsledné supernatanty se použijí pro enzymovou analýzu.
Enzymová analýza se provádí v reakční směsi /12 ml/, obsa hující 50 mil pufru fosforečnanu draselného /pH 7,5/, 6 ml benzonitrilu a příslušné množství enzymu. Reakce se nechá probíhat 30 minut při 20 °C. Reakce se zastaví přidáním 0,2 ml lil HCl. Množství vytvořeného benzamidu v reakční směsi bylo stanoveno HPLC. Jako kontrola se používá reakční směs získaná stejným postupem jak bylo výše popsáno z E.
coli TG-1. Hladiny nitril-hydratasy v bezbuněčných extraktech , , -3
E.coli, obsahujících pKHJlOH a pHJ20L byly 1,75.10 a 6,99.
_ o J jednotek na mg při kultivaci v mediu 2xYT za přítomnosti C0CI2 a IPTG. V reakční směsi s TG-l/pNKJlOH a pNHJ20L byl nalezen benzamid, zatímco v reakční směsi s TG-1 žádný benzamid nalezen nebyl.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKY
1 9 5 2 1 0 2 2 5
CACGACTACCTCACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG
240 255 270
ATG ATCCACCACGGC ATCG AGGCGGGCA TCTTCGA TTCCG A CG A A
285 300 3IS
CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG
-20ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAACTCATCGTGCGGTCGGACGCC TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG GCC
3. Rekombinaritní DNA, obsahující ve vektoru DNA^L^ podle nároků 1 a 2.
4. Transformant TGl/pNHJ20L/FERM BP-2778/ E.coli, který je transformován rekombinantní DNA podle nároku 3.
5. Způsob přípravy nitril-hydratasy,v yznačující se tím, že se kultivuje transformant podle nároku 4 a nitril-hydratasa se izoluje z kultury.
-21 6. Způsob přípravy amidů vybraných ze skupiny zahrnující 4-pyr idirftarb^íkot inamid, 2-pyr idinkarboxamid, benzamid,
2,6-difluorbenzamid, 2-thiofenkarboxamid, 2-furankarboxamid, pyrazinamid,, akrylamid, methakrylamid, krotonamid, acetamid a 3-hydroxypropionamid, vyznačující se tía, že se aromatické nitrily, mající 4 až 10 atomů uhlíku v aromatické skupině, a alifatické nitrily, mající nitri 1-hydratasou získanou nároku 4.
2 až 6 atomů uhlíku, hydratují z kultury transformantu podle
Způsob př í pravý am i dů
7.
4-pyridiriJ nikotinamid.
vybraných ze skupiny zahrnující
2-pyridinkarboxamid, benzamid,
1 5 3 0 4 5
ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG
60 75 90
ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGG AG
10 5 I z O 13 5
CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG
1. Fragment DNA L \ kódující polypeptid, který má nitril-hydratasovou aktivitu, kde uvedený polypeptid obsahu je ČX. -podjednotky následujících sekvencí aminokyselin:
O(/R- cpoc/ jed oo-V Lee :
(L)
5 10 15
NetThrAlaHisAsnProValGInGlyThrLeuProArgSerAsn
Z 0 2 5 3 0
GluGluI leAlaAlaArgValLysAIafletGluAlal leleuVal
3 S 4 0 4 5
AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlalleAspHisfletSerSer
5 0 5 5 6 0
ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAIalyslleVal
6 5 Jo 7 5
AlaArgAlaTrpValAspProGluPhelysGlnArgLeuLeuThr
B 0 8 5 4 0
AspAlaThrSerAlaCysArgGlufletGlyValGlyGlyMetGln
95 100 105
GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn IIO 115 I Z o
MetValValCysThrleuCysSerCysTyrProTrpProValleu
I Z S 13 0 13 5
GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg ován
-1814 0 HS ISO
AlaValArgAspProArgGlyValleuAlaGluPheGlyTyrThr
15 5 I 6 0 145
ProAspProAspValGluIleArgl leTrpAspSerSerAlaGlu
170 I 7 S 18 0
LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn i a s i o o i o 5
PheThrGluGtuGInleuAlaAspLeuValThrArgAspSerleu
IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla pod jednotka:
s 10 I s
HetAspGLylleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyteuGlyPro z 0 Z S 3 0 lleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu 3 5 <0 <5
ArgSerValleuThrfletPheProAlattetAlaleuAlaGlyAla
5 0 5 5 6 0
PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaNetGluGlnlleProPro
6 5 7 0 7 5
HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpřletHisAta
8 0 8 5 0 0
MetlleílisHisGlylleGluAlaGlylIePheAspSerAspGlu
95 10 0 1 O S
LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrHetAspHisProAspAspThr 110 IIS 1 Z O
ThrProThrArgG1nAspP r oGlnLeuVa1G1u T h rl1eSerG1n
I Z 5 13 0 13 5
LeulleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu | 4 0 1 4 5 1 5 0
AlaAlaPheAlaValGlyAspLysVallleValArgSerAspAla 155 160 165
SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg 1 7 0 17 5 1 8 0
ValGlyGluValValAlaThrllisGlyAlaTyrValPheProAsp
18 5 I Ό 10 5
ThrAsnAlaleuGlyAlaGIyGluSerProGluHisLeuTyrThr
200 Z O S Z 1 O
ValArgPheSerAlaThrGluleuTrpGlyGluProAlaAlaPro
ZIS 23« 22S
AsnValValAsnHislleAspValPheGluProTyrleuLeuPro
Ala
-192. Fragment DNA^L^ podlí sekvence nukleotidů -podjednotky znamená/ : nároku 1, obsahující a β^^-ροά jednotek, kde DNA sekvene
ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC
GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC
GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG
ISO I 6 S 180
GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC
19 5 110 Í I 5
GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC
240 ZSS 2 7 0
GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG
2 8 S 300 3 1 S
GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
330 34S 3 6 0
ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC
3 7 5 390 405
GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC
420 435 450
GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC
4 6 S 480 4 9 5
CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA
510 525 540
CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
SSS 570 585
TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC
ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC a DNA sekvence podjednotky znamená:
2,6-difluorbenzamid, 2-thiofenkarboxamid, 2-furankarboxamid, pyrazinamid,, akrylamid, methakrylamid, krotonamid, acetamid a 3-hydroxypropionamid, vyznačuj ící se tía, že se kultivuje transformant podle nároku 4 a aromatické nitrily, mající 4 až 10 atomů uhlíku v aromatické skupině, a alifatické nitrily, se hydratuji výslednou kulturou buněk, materiálem z nich mající 2 až 6 atomů uhlíku, izoloválných bakteriálních zpracovaným nebo f i xováným za vzn i ku odpov i da jících ami dů.
CZ943170A 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu CZ284017B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4807890 1990-02-28
US08/028,463 US5731176A (en) 1990-02-28 1993-03-09 DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ317094A3 true CZ317094A3 (cs) 1998-05-13
CZ284017B6 CZ284017B6 (cs) 1998-07-15

Family

ID=26388301

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ943170A CZ284017B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu
CS91531A CZ284048B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS91531A CZ284048B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5731176A (cs)
EP (1) EP0445646B1 (cs)
JP (1) JP3162091B2 (cs)
KR (1) KR950002004B1 (cs)
CN (1) CN1054639C (cs)
AT (1) ATE138101T1 (cs)
AU (1) AU627648B2 (cs)
CA (1) CA2037291C (cs)
CZ (2) CZ284017B6 (cs)
DE (1) DE69119454T2 (cs)
DK (1) DK0445646T3 (cs)
ES (1) ES2089044T3 (cs)
FI (1) FI102539B1 (cs)
MX (1) MX193790B (cs)
NO (1) NO306684B1 (cs)
PL (1) PL166201B1 (cs)
RU (1) RU2081173C1 (cs)
SK (1) SK280199B6 (cs)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2907479B2 (ja) * 1990-02-28 1999-06-21 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法
DE69231939T2 (de) * 1991-03-04 2002-04-04 Teruhiko Beppu Hybrid-Plasmid-Vektoren, die für Nitril-abbauende Enzyme kodierende Gene enthalten und Verfahren zur Herstellung von Amiden und Säuren
AU3692593A (en) * 1992-04-28 1993-11-04 Mitsubishi Kasei Corporation Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
JP3828590B2 (ja) * 1994-10-03 2006-10-04 昌 清水 ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
JP3154633B2 (ja) * 1994-12-28 2001-04-09 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子
JPH11513255A (ja) * 1995-10-06 1999-11-16 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 立体特異的ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ酵素をコードする核酸断片、ならびにキラルアミドおよび酸の生産に有用なそれら酵素を発現する組換え微生物
CN1240833C (zh) * 1996-02-14 2006-02-08 三井化学株式会社 新型腈水合酶
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.
FR2770214B1 (fr) * 1997-10-24 1999-12-31 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation d'un benzamide halogene
JP2000050866A (ja) * 1998-08-06 2000-02-22 Rikagaku Kenkyusho ニトリルヒドラターゼの生産方法
JP4185607B2 (ja) 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法
RU2310686C2 (ru) * 1999-06-25 2007-11-20 Басф Акциенгезелльшафт Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
RU2304616C2 (ru) * 1999-06-25 2007-08-20 Басф Акциенгезелльшафт Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации
RU2312145C2 (ru) * 1999-06-25 2007-12-10 Басф Акциенгезелльшафт Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
RU2306339C2 (ru) * 1999-06-25 2007-09-20 Басф Акциенгезелльшафт ГЕНЫ Corynebacterium glutamicum, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛКИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПУТЕЙ
RU2303635C2 (ru) * 1999-06-25 2007-07-27 Басф Акциенгезелльшафт Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам
RU2326170C2 (ru) * 1999-07-01 2008-06-10 Басф Акциенгезелльшафт Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки системы фосфоенолпируват-сахар-фосфотрансферазы
CN1340101A (zh) 1999-10-26 2002-03-13 昭和电工株式会社 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法
DE10010149A1 (de) * 2000-03-03 2001-09-06 Basf Ag Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
RU2288270C2 (ru) * 2000-12-20 2006-11-27 Диа-Нитрикс Ко., Лтд. Способ производства амидного соединения с применением микробного катализатора
CZ20031409A3 (cs) * 2001-01-09 2003-11-12 Lonza Ag Mikroorganismy a způsob výroby amidů
JP2002325587A (ja) * 2001-03-02 2002-11-12 Daicel Chem Ind Ltd ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法
JP2004194588A (ja) 2002-12-19 2004-07-15 Mitsui Chemicals Inc 新規なニトリルヒドラターゼ
WO2004067738A2 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Degussa Ag Nitrile hydratases from rhodococcus erythropolis and their application
AU2004295409B2 (en) 2003-12-02 2010-07-29 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Strain of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
EP1767624B1 (en) * 2004-05-26 2013-11-06 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Improved nitrile hydratase
JP2006187257A (ja) 2005-01-07 2006-07-20 Daiyanitorikkusu Kk アミド化合物の製造方法およびアクリルアミド系ポリマー
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
WO2008004473A1 (fr) * 2006-07-06 2008-01-10 University Of Tsukuba Nouveau complexe de protéines, procédé de maturation de nitrile hydratase à faible poids moléculaire de type au cobalt utilisant le complexe de protéines, nitrile hydratase correspondante et procédé l'utilisant
US8334132B2 (en) 2006-11-09 2012-12-18 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Process for production of a betaine such as carnitine
KR101734797B1 (ko) 2011-05-31 2017-05-24 미쯔비시 케미컬 주식회사 개량형 니트릴 히드라타제
US9193966B2 (en) 2011-06-07 2015-11-24 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Nitrile hydratase
FR3002542B1 (fr) * 2013-02-28 2016-01-22 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
CN112941060B (zh) 2014-06-06 2025-05-09 三菱化学株式会社 改良型腈水合酶
EP3535386A4 (en) 2016-11-04 2020-04-15 Georgia State University Research Foundation, Inc. ENDOTOXIN-FREE ASPARAGINASE
EP4279600A4 (en) 2021-02-10 2025-06-11 Mitsubishi Chemical Corporation Improved nitrile hydratase reactivity using aldehyde
CN114934006A (zh) * 2022-06-02 2022-08-23 无锡新晨宇生物工程有限公司 一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用
AU2024239889A1 (en) 2023-03-17 2025-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing amide compound
JPWO2024195653A1 (cs) 2023-03-17 2024-09-26

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX169933B (es) * 1987-09-18 1993-08-02 Hideaki Yamada Procedimiento para la produccion biologica de amidas
JP2840253B2 (ja) * 1988-07-06 1998-12-24 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
JPH04211379A (ja) 1992-08-03
NO910797L (no) 1991-08-29
NO910797D0 (no) 1991-02-27
EP0445646A3 (en) 1992-01-08
CA2037291C (en) 2001-07-24
PL166201B1 (pl) 1995-04-28
PL289239A1 (en) 1992-03-23
CA2037291A1 (en) 1991-08-29
ATE138101T1 (de) 1996-06-15
AU7129391A (en) 1991-09-12
ES2089044T3 (es) 1996-10-01
FI102539B (fi) 1998-12-31
CZ284017B6 (cs) 1998-07-15
NO306684B1 (no) 1999-12-06
KR950002004B1 (ko) 1995-03-08
CN1054616A (zh) 1991-09-18
DE69119454D1 (de) 1996-06-20
CZ284048B6 (cs) 1998-07-15
DE69119454T2 (de) 1996-09-26
SK280199B6 (sk) 1999-09-10
CN1054639C (zh) 2000-07-19
MX193790B (en) 1999-10-19
FI910960L (fi) 1991-08-29
EP0445646A2 (en) 1991-09-11
EP0445646B1 (en) 1996-05-15
CS9100531A2 (en) 1991-10-15
AU627648B2 (en) 1992-08-27
JP3162091B2 (ja) 2001-04-25
US5731176A (en) 1998-03-24
KR910021473A (ko) 1991-12-20
RU2081173C1 (ru) 1997-06-10
FI102539B1 (fi) 1998-12-31
DK0445646T3 (da) 1996-09-30
FI910960A0 (fi) 1991-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ317094A3 (cs) Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu
JP2840253B2 (ja) ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法
US5602014A (en) Regulatory system for expression of nitrilase gene
EP0444639B1 (en) A gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
JPH1189575A (ja) 微生物を用いたアミド化合物の製造方法
US5648256A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
EP1174499B1 (en) Novel amidase gene
US5683913A (en) Regulatory gene for the expression of nitrile hydratase gene
US5789211A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
ES2307746T3 (es) D-hidantoinasa de ochrobactrum anthropi&#39;.
US5753472A (en) DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
JP4139773B2 (ja) 新規なアミド加水分解酵素遺伝子
US5830693A (en) Gene encoding a regulatory factor involved in activating expression of the nitrilase gene promoter
RU2173708C2 (ru) Фрагмент днк, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, рекомбинантная плазмидная днк рnhj20l, кодирующая полипептид, штамм escherichia coli tg1/рnhj20l, способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы
JPH0568551A (ja) 新規なｇｌ−７ａｃａアシラーゼ
JPH0272878A (ja) 組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用いたグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20110228