CZ317898A3 - Způsob syntézy peptidu v reaktorovém systému obsahujícím reaktor s košem rotovatelným kolem osy a použití reaktového systému k syntéze peptidu na pevné fázi v reaktorovém koši v nezaplaveném stavu - Google Patents

Description

OBLAST TECHNIKY

Tento vynález se vztahuje k peptidové syntéze na pevné fázi, zvláště k reaktorovému systému, a způsobu použití nového reaktorového systému syntézy na pevné fázi, v kterém může být peptidová syntéza na pevné fázi prováděna ve velkém měřítku se vzrůstajícími objemy výroby a výtěžky oproti těm, které jsou v současnosti dostupné.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Širší použitelnost našeho systému a způsobu oproti jiným reakcím kapalina-pevná fáze zahrnujícím postupnou syntézu na pevných substrátech, takovou jakou je výroba oligonukleotidů, oligodeoxynukleotidů, oligoribonukleotidů, oligosacharidů, proteinů atd. bude jasná těm, kteří se daným stavem techniky zabývají.

Peptidová syntéza na pevné fázi (SPPS) byla vyvinuta Merrifieldem v roce 1963. Základní postup je velmi dobře znám. Způsob SPPS obvykle začíná na polymerním gelu, takovém, jakým je například částečně chlórovaný polystyren, který je prokřížen divinylbenzenem. C-konec chráněné aminokyseliny je na počátku navázán na polymer, například za vzniku benzyl esteru aminokyseliny. Mohou být samozřejmě použita i jiná vazebná činidla. Peptid je syntetizován postupně od C-konce přidávání dalších chráněných aminokyselin. Aminoskupiny a všechny reaktivní funkční skupiny bočních řetězců aminokyselin musí být chráněny stabilními substituenty, aby se předešlo nežádoucím bočním reakcím. Substituenty jsou vybírány tak, že aminoskupiny mohou být odblokovány bez narušení ochrany funkčních skupin bočního řetězce nebo vazby mezi C-koncem a polymerem. Aminoskupiny mohou být chráněny například pomocí boc (t-butoxykarbonyl) nebo fmoc (9-fluorenylmethoxykarbonyl).

Peptidová syntéza je obvykle prováděna následujícím způsobem: N-konec peptidu vázaného na polymer (chráněný pomocí boc) je například odblokován roztokem trifluoroctové kyseliny (TFA) v dichlormethanu (DCM). Aminokyselina, která podle sekvence následuje je napojena na peptid vázaný k polymeru za pomoci kondenzačního činidla, takového, jakým je například dicyklohexylkarbodiimid (DCC) v roztoku DCM a dimethylformamidu (DMF). Aktivační činidlo, jako je například 1-hydroxybenzotrazol (HOBt), může být použito k zlepšení rychlosti a selektivity kondenzační reakce a snížit racemaci. Nezreagovaná aminokyselina, reaktanty a ·· · · · ·· · · ·· ·· · · · · · · »· · • · · · · ···· • · · · · · · ···· · ··· ·· · · · ··· ·· ··· ···· ·♦ ·· vedlejší produkty reakce jsou odstraněny z polymeru omýváním a filtrací. Proces omývání a filtrace je pak opakován. N-konec peptidu je poté odblokován, další peptid je připojen k řetězci, systém je pak omyt a filtrován atd. Proces je opakován tak dlouho dokud všechny požadované aminokyseliny nebyly připojeny k peptidovému řetězci v požadovaném pořadí. Zbývající substituenty jsou pak odstraněny z peptidu, peptid je odštěpen od polymeru a shromážděn.

SPPS byla původně prováděna, a často ještě je, v třepaných nebo míchaných baňkách, v kterých je polymer rozptýlen. Pro udržení a míchání polymeru v kapalné fázi systém vyžaduje několikrát větší množství tekutiny, než kolik bude polymer sám absorbovat nebo vázat. Jestliže by tedy polymer zadržoval 10 ml kapaliny, pak by bylo třeba 50-100 ml kapaliny pro rozptýlení a udržení polymeru v kapalné fázi. Zvyšující se množství kapaliny vede k používání zředěných roztoků (obvykle 150 mmol aminokyseliny/litr roztoku) z důvodu minimalizace nákladů, protože aminokyseliny jsou drahé. Se zředěnými roztoky je obtížné získat vysokou koncentraci aminokyselin a z tohoto důvodu i rychlou chemickou reakci mezi aminokyselinami a rostoucím řetězcem. Kromě toho, když je polymer omýván a filtrován (v baňce) stylem vsádkového roztoku je fakticky nemožné, při omezeném počtu omytí vsádky, odstranit z polymeru všechny použité roztoky DCM a TFA. Výsledkem je, že čas styku peptidového řetězce s DCM a TFA nemůže být přesně kontrolován.

Počet navrhnutých typů v reaktorovém vývoji je pro peptidovou syntézu jedinečný. Polymer používaný jako pevná fáze je obvykle gelový polymer s nízkým stupněm prokřížení. Tyto polymery v některých rozpouštědlech bobtnají (v takových jako je DCM) a v jiných rozpouštědlech se smršťují (v takových jako je methanol). Objem polymeru také tíhne k zvětšování se s růstem délky peptidového řetězce. Kromě toho tyto polymery tíhnou k tom být ve své podstatě dosti měkké a tudíž jsou citlivé k fyzikálnímu opotřebování. Reaktor vyhovující těmto charakteristikám je očekáván. Délka expozičního času mezi polymerem svázaným peptidem a rozpouštědly a reaktanty užívanými při syntéze může být také velmi důležitá. Odblokování peptidu vázaného na polymer musí být úplné, aby byl získán nejvyšší výtěžek, ale tímto vzniklé karbokationty nesmí zůstat v kontaktu s peptidem, protože by se mohly vyskytnout nežádoucí boční reakce.

Bohužel čas požadovaný k odčerpání roztoku z polymerní polotekuté disperze se zvyšuje s tloušťkou polymerové vrstvy vzniklé během filtrace. Následkem toho expoziční čas peptidu vázaného na polymer s karbokationty se zvyšuje tak, jak se zvyšuje tloušťka vrstvy polymeru. Výsledkem je, že filtrační časy pro reakce v řádech kilogramů jsou daleko delší, než tyto časy porovnané s časy stolních reakcí, takže riziko zničení peptidů z důvodu reakcí s karbokationty se zvyšuje s velikostí vsádky. Reaktory větších rozměrů musí být proto navrhovány takovým • · « · » · · 1 • · · • ·» · · · · • · · · · · · * • · · β · · • · · · · · · · • · · · ♦ ······· ·· · · způsobem, aby se minimalizovala doba filtrace. Několik řešení tohoto problému může být vybráno podle typu reaktorové konstrukce a podle vlastností částic polymeru, které konstrukce reaktoru povoluje.

Aby chemická reakce probíhala, musí být reakční složky přítomny v reakčním místě uvnitř kuliček. Reakce jichž se týká vazebný krok, mohou být limitovány rychlostí, kterou reaktanty (DCC a intermediáty z objemové kapalné fáze reaktoru v němž dochází ke vzniku vazby) pronikají skrz povrch a póry polymeru do vnitřních reakčních míst. Jak je známo, polymer, což je obvykle polystyrénová pryskyřice, je účinně tvořen porézními kuličkami. První aminokyselina vytvářeného peptidového řetězce je vázána na vnitřní místa matrice polymeru. Peptidový řetězec pak začíná růst v těchto místech, podle toho jak reakční složky do těchto míst přicházejí.

Rychlost přestupu hmoty reaktantů z objemu kapalné fáze na místa uvnitř polymeru je úměrná koncentračnímu gradientu násobenému difusním koeficientem látky v rozpouštědle (Fickův zákon), ale je vhodné uvažovat o přestupu hmoty v termínech odporů. Odpor k přestupu hmoty v heterogenních procesech, kapalina-pevná látka, je zřejmý na dvou místech: (1) přes nehybnou kapalinovou vrstvu na povrchu částice polymeru a (2) uvnitř pórů polymerové částice. Zvýšení rychlosti tekutiny vzhledem k polymeru snižuje odpor vrstvy. Pro snížení odporu přestupu hmoty uvnitř polymeru jsou vhodnější malé polymerové kuličky, které jsou ve stavu gelu (to je 5-100 pm). Použití gelovatějších polymerů může umožnit kapacity, které převyšují 1 mmol aktivních míst (nebo peptidových řetězců)/g polymeru a blíží se k 2 až 4 mmol/g při vysokých výtěžcích a konverzi. Při použití malých částic polymeru se také očekává ulehčení lepšího, rychlejšího a úplnějšího omytí polymeru, protože bude jednodušší uskutečnit výměnu mezi matricí polymeru a promývacím rozpouštědlem. Kromě toho mají polymerové kuličky raději menší počet prokřížení kvůli zpřístupnění jejich pórů. Nicméně nějaké prokřížení je v polymeru nezbytné z důvodu udržení tvaru a dodání pevnosti polymerovým kuličkám. Kuličky polymeru se stupněm prokřížení mezi 0,2 % a 1 % by měly být dostačující.

U syntetizačních způsobů, kde jsou aminokyseliny aktivovány dicyklohexylkarbodiimidem (DCC), může být odpor k difusi do jádra polymeru značně zvýšen vznikem dicyklohexylurei (DCU), která je v podstatě nerozpustná v 50% DMF v DCM používaném během vazebné reakce. Na polymeru může vzniknout skořápka nerozpustné DCU. Tato vrstva DCU brání reaktantům a promývacím roztokům v přestupu mezi povrchem a jádrem polymerové kuličky. V extrémních případech může dojít ktomu, že difuse z objemu kapalné fáze k volným aminoskupinám je nemožná, a že pouze boc-aminokyselina vhodná pro vazebnou reakci je tou látkou, která je zpočátku přítomna uvnitř polymeru před přídavkem DCC.

• · • ·

Difuse reaktantů do polymeru může být také bržděna vznikem vlastních peptidových řetězců. Je obecně známo, že heterogenní reakce v porézních částicích typicky rostou paprskovitě dovnitř v závislosti na vnějším povrchu částice. Je proto rozumné použít toto pro syntézy na pevné fázi. Kulička tak vhodně zahrnuje rostoucí skořápku reagujícího peptidu a zmenšující se nezreagované jádro. Jestliže rychlost reakce mezi volnými aminoskupinami a aktivovaným intermediátem probíhá rychle vzhledem k rychlosti difuse přes póry polymeru, pak skořápka reagujícího peptidu, a eventuálně DCU, bude růst paprskovitě dovnitř od povrchu částice. Reakce bude probíhat nad povrchem zmenšujícího se jádra uvnitř kuličky polymeru. Reaktanty tedy proto musí difundovat přes stále se více zesilující vrstvu peptidu a DCU, aby dosáhly nezreagovaného jádra kuliček polymeru.

Jedním řešením srážení DCU je změna v chemismu reakčního systému. Odpor k diíusi přes póry blokované DCU může být snížen nebo odstraněn vytvořením symetrického anhydridu, o-acylisourei, a HOBt aktivního esteru v odděleném reaktoru (to jest preaktivované aminokyseliny) a filtrováním DCU z roztoku před zavedením do hlavního reaktoru, kde je prováděna syntéza. Podobného prospěchu může být dosaženo, jestliže jsou použita odlišná vazebná činidla (takové jako je DIC), která netvoří nerozpustné produkty během vazebné reakce. Kromě snížení blokování, které způsobuje vznik nerozpustných sloučen, jako je DCU, mohou být omezení difuse přes póry redukována použitím menších částic. Výsledkem klesajícího odporu přestupu hmoty je to, že budou požadovány nižší koncentrace reaktantů pro dosažení stejné reakční rychlosti. To může významně redukovat spotřebu aminokyselin, HOBt a DCC potřebných pro výrobu 1 gramu produktu.

Číselná analýza difuse do a přes částici je ukázána na obrázcích 3 a 4. Koncentrace reaktantů bude vyšší na povrchu částice a koncentrace reaktantů uvnitř částice se bude zvyšovat v čase, tak jak reaktanty difundují nebo přecházejí do polymerní částice. Obrázky 3 a 4 ukazují, že stupeň koncentrace vytvořený v čase (τ) závisí na koeficientu přestupu hmoty (H) přes vrstvu na povrchu polymerní částice a relativní vzdálenosti zeta = (r/R) skrz částici, ve které je koncentrace měřena, a kde R je celkový poloměr částice (rozměr částice) a r je bod odměřený od středu částice. Tedy r/R = 1 na povrchu částice a r/R = 0 ve středu částice. Každá ze čtyř křivek na obrázku 3 představuje koncentrační profil v daném čase τ, když na povrchu částice není odpor vrstvy (H = oo).

Na obrázku 4 jsou dvě křivky podobného tvaru, jako na obrázku 3, ale pouze tam, kde odpor k přestupu hmoty přes vrstvu na povrchu částice je vzrůstající (H se snižuje). V porovnání se dvěma křivkami na obrázku 4 (H = 1 a H = 3) může být pozorováno, že koncentrace uvnitř částice vzrůstá mnohem rychleji s nižším odporem vrstvy na povrchu částice (H je vyšší).

• · ·· · toto ·» ·· • · to · · to · to to to · · ··· · · ·«·· ·· toto · to · ···· · ··· ·· ··· ···· ·» ··· ···· ·· toto

Obrázky 3 a 4 ukazují, že při významném odporu (obou, odporu na povrchu i v pórech částice) se koncentrace uvnitř částice vytváří pomaleji. To naznačuje potřebu snížit oba, jak vnitřní odpor v pórech, tak vnější odpor povrchové vrstvy, a tak by mohlo dojít ke zvýšení přestupu hmoty reaktantů do a přes částici. Přenos hmoty reaktantů k volným amino skupinám vázaným na polymer může být zesílen zvýšením koncentrace reaktantů v kapalné fázi a snížením délky pórů (použitím polymerních částic s menším průměrem). Kromě toho odpor přestupu hmoty přes vrstvu může být snížen zvýšením rychlosti objemové tekutiny ve vztahu k polymerním částicím, protože koeficienty vrstvy pro kulovitá tělesa jsou funkcí rychlosti tekutiny. Konstrukce reaktoru, která by se zaměřovala na tyto difusní problémy zároveň není v současnosti k dispozici.

Od počátečního vývoje syntézy na pevné fázi (SPPS) Merrifieldem v roce 1963 byla uskutečněna řada inovací týkajících se konstrukce reaktoru pro peptidovou syntézu. Dřívější reaktory byly založeny na principu třepaných baněk, zatímco pozdější konstrukce reaktorů se skládaly z míchaných nádržových reaktorů, centrifugačních reaktorů a trubkových reaktorů. Všechny tyto typy reaktorů pracují s kuličkami polymeru drženými nebo potopenými v kapalné fázi. Míchané nádržové reaktory (STR’s) jsou obecně používány pro syntézu peptidů, ale trpí jistými omezeními. Protože kuličky jsou v disperzi, tak možnosti zvýšit rychlost kapaliny vzhledem k částicím v míchaném nádržovém reaktoru jsou krajně omezené. Je to proto, že setrvačné a viskosní síly působí prostřednictvím pohybující se kapaliny na dispergované částice tak, že částice tíhnou k tomu, být vlečeny spolu s kapalinou. Rychlostní pole kapaliny ve vztahu k částicím může být nicméně jednoduše zvyšováno v reaktorech obalených lůžkem, v kterých částice polymeru zůstávají uchyceny, ale kapalina je tlačena přes lůžko polymeru. Nicméně frita na dně obou, míchaných nádržových reaktorů a reaktorů obalených lůžkem vyžadujících filtrování kapalné fáze z polymeru, musí být schopna odolat rozdílným tlakům nezbytným pro filtraci. Jak se zvětšuje velikost reaktoru, frita musí být konstruována z postupně se zesilujících materiálů, aby se vyhnulo mechanickému selhání. Na druhé straně, pokud průměr reaktoru zůstává konstantní, pak se tloušťka vrstvy polymeru zvětšuje úměrně tomu, jak roste velikost vsádky. Zvětšená tloušťka vrstvy polymeru způsobuje postupné prodlužování odvodňovacích a filtračních časů a také expozičních časů mezi peptidem navázaným na polymeru a reaktanty, reaktivními intermediáty a rozpouštědly. Z těchto důvodů ani míchaný nádržový reaktor se zabudovaným filtrem ani reaktor obalený lůžkem nepředstavují nejvýkonnější typu reaktoru pro velkoobjemový (v řádech kilogramů) SPPS proces.

Ačkoliv změny ve velikosti částic v průběhu reakce vedly k některým konstrukčním obtížím, trubkové reaktory, takové jako reaktory obalené lůžkem, stále nabízejí některé výhody oproti • · «· · · · «· · · • · · * · » · · · « · · f · · · · · · · · · u ··«· · ··«···* • « · ·· · · · ···· ·» ··· ···· ·· ·· jiným reaktorům. Reaktory obalené lůžkem umožňují přistupovat k promývání jako k nahrazovací operaci, spíše než jako k zřeďovací operaci, jak je tomu u STR, za předpokladu, že velikost „mrtvého objemu“ mezi vstupem do reaktoru a kuličkami polymeru je minimalizována. Reynoldsovou číslo (Re) může být u trubkových reaktorů velmi vysoké, jestliže je vysoká rychlost kapaliny vůči kuličkám polymeru. Ale vysoké průtokové rychlosti vytváří vysoké tlaky uvnitř reaktoru a vysoké tlaky mohou mít škodlivý vliv na polymer. Nicméně, protože koeficienty přestupu hmoty se zvyšují se vzrůstajícími Reynoldsovými čísly, tak trubkové reaktory mohou mít nižší odpor vrstvy k přestupu hmoty než míchané nádržové disperzní reaktory.

Ale použití reaktorů obalených lůžkem má také vlastní řadu problémů. Polymer může zvětšit svou původní velikost třikrát, když je omýván DCM a může se zmenšit na jednu třetinu původní velikosti, když je omýván methanolem. To může způsobit celkově devětkrát změnu v celém objemu polymerního lůžka. Odstranění nebo minimalizaci mrtvého objemu je proto velmi obtížené provést. Reaktor obalený lůžkem, který má výšku mnohem větší než průměr, má významnou velikost plochy povrchu stěny, která brání expanzi a smršťování polymerního lůžka. Když polymerní lůžko expanduje, působí to proti stěnám nádoby a redukuje prázdný prostor mezi částicemi polymeru. Je tak potřeba vysoký tlak na protlačení omývacího roztoku přes lůžko za požadovaný časový interval. Tento vysoký tlak může poničit kuličky polymeru, vytvořit jemné částice, které mohou zablokovat filtr a případně poničit nebo zlomit filtrovací fritu. Jestliže není použit vysoký tlak, pak průtok přes lůžko bude moc pomalý, což umožní peptidům reagovat delší čas a může dojít k vedlejším reakcím. Některé vazebné kroky aminokyselin nebo peptidů jsou velmi citlivé na reakční dobu. Například arginin může sám zreagovat za vzniku cyklické struktury místo navázání se na peptidový řetězec. Expoziční čas se proto může stát velmi důležitým faktorem.

Bylo provedeno několik pokusů zkonstruovat trubkový reaktor, který by překonal omezení kladená polymerem. Tyto dřívější pokusy zahrnují:

(1) Ignorování problémů s se zvětšováním polymeru. Verlunder, et al., U.S. Patent No. 4,192,798 odhaluje přístupy, ve kterých pokles tlaku v reaktoru je nejméně 200 psi a více než 10 000 psi nebo více. Nárokují kvantitativní výsledky a ty reakce, které trvají hodiny, zatímco v jiných reaktorech byly dokončeny za minuty. Obtíže s tímto typem reaktoru zahrnují degradaci polymeru, blokaci frity na výstupu, udržování stejného osového průtoku v celé koloně na zvýšené hodnotě, neúčinnosti při omývání jako výsledek vlivu mrtvého objemu a cena kolony a vysokotlaké pumpy. Tento typ reaktoru je základně průmyslově označován HPLC.

9

9 99 99 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · ·* ···«·· ' 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 9999 99 99 (2) Povolení osové expanze v koloně. Baru, et al., WO 88/909010.6, SU 4117080 vyvinul reaktor s nulovým mrtvým objemem, v kterém jeden konec reaktoru směl splývat s polymerem. Malá zátěž byla položena na vrchní píst reaktoru, aby se zajistila konstantní síla působící na splývavou hlavu reaktoru. Výsledkem bylo, že kolona byla provozována za nižšího poklesu tlaku, aby se vyhnulo přetékání rozpouštědla ven kolem horní hlavy reaktoru, což dělalo systém citlivý k blokací frity na výstupu. Akumulace DCU v lůžku nebo uvnitř frity může zvýšit pokles tlaku a mohla by mít následky pro bezpečnost a okolní prostředí. Kromě toho nucené udržování nízkého poklesu tlaku vyžaduje nízkou rychlost kapaliny, což se projevuje malými hodnotami Reynoldsových čísel a špatnou distribucí průtoku kapaliny. Nízké rychlosti průtoku kapaliny způsobují také delší expoziční časy reaktantů a omývacích roztoků.

(3) Použití rigidního polymeru na podporu gelu. Atherton, et al., JCS Chemical Communications, p. 1151 [1981], vyvinul rigidní polymer, ve kterém by mohl být v makropórech obsažen gelový polymer. Gelový polymer by se mohl zvětšovat a zmenšovat, ale objem rigidních polymerních kuliček by zůstal konstantní. Jako výsledek by mohly být získány vysoké průtokové rychlosti kapaliny, nízké poklesy tlaku a konstantní objem polymeru. Nicméně je více pravděpodobné, že dojde ke snížení přestupu hmoty v takto podporovaných typech polymerů, protože by se prodloužila difusní cesta reaktantů po připojení vrstvy filmu a difuse přes póry rigidního polymeru. Navíc jsou tyto typy polymerů drahé.

(4) Ohled na mrtvý objem. Lapluye a Poisson, PCT publication no. WO 92/115867 vyvinuli pístový typ reaktoru s fritami na obou koncích. V tomto typu reaktoru je polymer umístěn v dutém pístu, který se pohybuje nahoru a dolu uvnitř velkého válce, který je plný rozpouštědla a reaktantů. Tento typ reaktoru je v základu podobný míchanému reaktoru nebo reaktoru s tekutým lůžkem a míchací pohyb pístového reaktoru by měl vyrovnat odlišnosti v hustotě polymeru a rozpouštědel. Jeví se, že účinnost omývání by měla být stejná nebo trochu lepší než v případě menších objemů kapalné fáze u STR. Nicméně objem rozpouštědla použitého vzhledem k hmotě polymeru je pravděpodobně značně větší než vyžaduje typický trubkový reaktor. Reynoldsova čísla jsou pravděpodobně docela nízká a může být obtížné zvětšit mechanismus. Kromě toho může docházet k vývoji tepla, jako výsledku vlivů „viskózního rozptýlení“ způsobených pohybem pístu v kapalině, což vyžaduje některé přídavné chladicí prostředky.

Z tohoto pohledu neexistuje trubkový reaktor, který by neměl nějaká vážná omezení v ceně, bezpečnosti nebo účinnosti.

Reaktory založené na principu rotující mísy byly také vyvinuty. Rotující mísy nebo centrifugační reaktory mohou brát v úvahu zvyšující rychlost kapaliny vzhledem k částicím polymeru. Birr, German Patent No. 2,017,351, ukazuje „pračkový“ reaktor, v kterém je porézní koš na počátku • · »

• fr • · · · frfr fr · · · * • · frfrfr • · «frfrfr fr • fr frfr naplněn polymerem, a poté vířen mírnou rychlostí zatímco je zaplavován kapalinou. Odstředivé síly způsobují, že částice polymeru vytváří lůžko na vnitřních stěnách koše a také jejich vlivem vzniká mírní stupeň recirkulace kapaliny přes lůžko polymeru. Mísa je zaplavena (to jest naplněná tekutinou), tak jako je zaplaveno polymerní lůžko. Brzda vložená na koš kapalinovou lázní vkládá velkou kroutivou sílu na pohonnou jednotku a bude také způsobovat vznik tepla. Z těchto důvodů bude rotační rychlost Birrova reaktoru relativně nízká a vzájemná rychlost kapaliny vůči pevné fázi bude omezena. Omezení kladená na rotační rychlost budou téměř jistě vést ke vzniku nejednotného polymerního lůžka, který bude na vrcholu mělký a hluboký v blízkosti dna. Recirkulující kapalina bude mít sklon jít cestou nejmenšího odporu a tak vznikne „zkrat“ přes mělčí část polymerního lůžka. Výsledkem je, že kontakt mezi kapalinou bohatou na reaktanty a polymerem nebude shodný v celém reaktoru. Kromě toho nižší rychlost kapaliny s ohledem na polymer bude způsobovat nižší přenos hmoty přes povrch vrstvy, která obklopuje částice. Nakonec objem rozpouštědla nezbytného k zaplavení rotujícího koše bude velký v porovnání s objemem potřebným k nasáknutí polymerní náplně. To tedy bude také vyžadovat významný objem reaktantů vzhledem k hmotě polymeru. Větší objem bude mít za následek použití méně koncentrovaného roztoku, který se následně projeví nižší reakční rychlostí a delším reakčním časem. To proto může vyžadovat větší množství aminokyseliny, aby byla udržena koncentrace aminokyseliny na takové úrovni, která zajistí přijatelné reakční rychlosti.

Jiný typ centrifugačního reaktoru založeného na principu zaplaveného „dutého rotoru“ byl vyvinut Andersonem a Andersonem, U.S. Patent No. 5,186,824. Cesta, kterou kapalina protéká reaktorem (Anderson et al.) je spíše osová než paprskovitá a geometrie je pro kapalinová průtoková pole nepravidelná. To, která kapalina je uvedena závisí na hustotě kapaliny ve vztahu k hustotě nejnověji přidané kapaliny. Pro expanzi polymeru je také zajištěn malý prostor. Výsledkem expanze a smršťování je, že expozice polymeru v kapalné fázi je pravděpodobně nejednotná. Kompletní a jednotný kontakt a odstranění kapaliny z rotoru by možná bylo velmi obtížné provést.

PODSTATA VYNÁLEZU

Jedním cílem předkládaného vynálezu je zajistit způsob provádění SPPS, který bude produkovat vyšší výstupy a vyšší výtěžky než je v současnosti možné.

Jiným cílem je zajistit takový způsob, při kterém by čas kontaktu peptidového řetězce s různými činidly mohl být přesně kontrolován.

Dalším cílem je zajistit takový způsob, při kterém se reakční rychlost zvyšuje.

• · · · ♦ · · * • · · · • · · · <

• fe « • · fefe

Dalším cílem je zajistit takový způsob, který bude dovolovat použití vyšších koncentrací aminokyseliny než je v současnosti možné bez zvyšování množství použité aminokyseliny (a eventuálně použití vyšších koncentrací s menším množstvím aminokyselin).

Dalším cílem je zajistit reaktor pro takový způsob.

Dalším cílem je zajistit takový reaktor, v kterém se přenos hmoty kapaliny přes pevnou fázi zvyšuje.

Dalším cílem je zajistit takový reaktor, který nebude bránit bobtnání a smšťování polymeru, a který nebude způsobovat opotřebovávání polymeru.

Dalším cílem je zajistit takový reaktor, v kterém je polymerní lůžko skutečně rovnoměrné v tloušťce tak, že průtok kapaliny přes polymer je rovnoměrný.

Dalším cílem je zajistit takový reaktorový systém, který může redukovat plýtvání rozpouštědlem. Dalším cílem je zajistit takový reaktor, který má schopnost „vymačkat“ rozpouštědlo z polymeru pomocí odstředivé síly, čehož výsledkem je eliminování kroku chemického smšťování polymerních částic alkoholem, protože chemického smšťování polymeru může způsobit shluknutí narůstajícího řetězce a může poškodit polymer.

Dalším cílem je umožnit širší výběr polymerů mající odlišnou velikost částic a vlastnosti prokřížení, které jsou výhodné pro utváření peptidů.

Tyto a další cíle budou zřejmé těm, kteří se daným stavem techniky zabývají ve světle následujících návrhů a doprovázejících odhalení.

Ve shodě s vynálezem, obecně uvedeným, jsme zajistili reaktorový systém a způsob ovládání systému, který dosahuje výše uvedených cílů. Reaktorový systém zahrnuje reaktor mající vnitřní prostor a rotovatelný koš namontovaný uvnitř tohoto vnitřního prostoru. Koš má perforovanou, porézní nebo dírkovanou boční stěnu, na které se tvoří vrstva polymeru během syntetizačníno procesu. Filtrační tkanina nebo stěna je umístěna na vnitřním povrchu stěny koše a vrstva polymeru se vytváří na filtrační tkanině. Systém také obsahuje zásobní nádrž na roztok nebo přechovávači nádrž, která přijímá roztoky později zaváděné do reaktoru. Zásobní nádrž na roztok obsahuje vstupní otvor a výstupní otvor. Zásobní nádrž na roztok a reaktor jsou propojeny tak, aby se vytvořila smyčka nebo obvod, přes který je roztok cirkulován. Reaktorový systém funguje tak, že reaktorový koš není ponořen v roztoku. Tudíž reaktor není nikdy zaplaven roztokem a všechen roztok prochází přes vrstvu polymeru.

Systém obsahuje čistící systém mající lapač odpadu a ventily, které jsou v potrubích propojujících reaktor a zásobní nádrž. Ventily odstraňují se systému první roztok a posílají ho přímo do odpadu dříve než je zaveden do systému druhý roztok. Čistící systém se skládá z prvního ventilu, který je v potrubí spojujícím výstup zásobní nádrže se vstupním otvorem ·· «· · ·· ·· ·· * · · ♦ · · ♦ · ♦ · · · • ·· · · · « · · • · · · · φ · · · · · · ··· ·· · · · ···· ·· ··« ·♦·· ·· 99 reaktoru a druhý ventil, který je v potrubí spojujícím výstup z reaktor se vstupním otvorem do zásobní nádrže. První ventil posílá první roztok do odpadu potom co je dokončen cyklus prvního roztoku a před tím než je zaveden druhý roztok do zásobní nádrže. Druhý ventil posílá cirkulující roztok do odpadu na krátký čas na začátku cirkulace druhého roztoku, aby se zabránilo zbytkům prvního roztoku, který mohl zůstat v polymerním lůžku, ve vstupu do zásobní nádrže, která nyní obsahuje druhý roztok.

Výhodněji obsahuje reaktorový systém také přípravnou nádrž, v které jsou roztoky připravovány (to znamená, že aminokyseliny jsou zde preaktivovány, polymer je zde připravován, atd.). Tato přípravná nádrž je propojena potrubím s reaktorem a se zásobní nádrží na roztok. Ventil je schopen selektivně poslat obsah přípravné nádrže do zásobní nádrže na roztok a do reaktoru. Ventil z přípravné nádrže posílá připravený polymer přímo do reaktoru a roztoky aminokyselin, omývacích roztoků atd. do zásobní nádrže. Mezi přípravnou nádrží a zásobní nádrží je umístěn filtr, přes který prochází roztoky preaktivovaných aminokyselin. Filtr zajišťuje odfiltrování nerozpustných vedlejší produktů aktivační reakce (takových jako je DCU). Tato filtrační cesta je zajištěna tak, že omývací roztoky, deblokační činidla atd. nemohou projít přes filtr.

Způsob řízení systému zahrnuje (a) otáčení koše při požadované rotační rychlosti a dodávání aktivovaného polymeru do reaktorového koše tak, aby se vytvořila vrstva skutečně jednotné tloušťky (například přibližně od 2 cm do 5 cm silná) na perforované stěně koše. Polymer výhodněji obsahuje první aminokyselinu vázanou na polymer nebo je jinak odvozen. Jestliže první aminokyselina není navázána na polymer, pak je navázána na polymer nyní. (b) Dodání deblokačního roztoku do rotujícího koše, aby byl odblokován N-konec peptidu vázaného na polymer, (c) Dodání omývacího roztoku do rotujícího koše, aby byl vymyt deblokační roztok z vrstvy polymeru, (d) A dodání roztoku následující aminokyseliny, aby byla připojena kpeptidovému řetězci, a vazebného roztoku do rotujícího koše, aby přispěl k připojení následující aminokyseliny k peptidovému řetězci. Kroky (b) - (d) jsou opakovány dokud není peptidový řetězec dokončen.

Roztoky (to znamená deblokační roztok, omývací roztok, roztok aminokyseliny a roztok vazebného činidla) jsou zaváděny do rotujícího koše takovou rychlostí, že dodávaný roztok nebude bržděn v prostoru reaktoru v místě nad patrem koše, takže všechen roztok nebude zabržděn v prostoru reaktoru okolo koše. Tudíž koš je v nezaplaveném stavu během každého stupně peptidové syntézy. Použitý polymer je vhodněji tvořen polystyrénovými kuličkami, které mají průměr menší než 100 pm a jsou výhodněji prokříženy z 0,2 % až 1,5 %. Malá velikost kuličky a nízké procento prokřížení uvnitř kuličky usnadní přenos hmoty přes kuličky a tím toto toto ► · <

• ·· • · • · to · ·>

•· ·* toto toto to to · to • · to · · to · · · · · · • « · · •to·· ·» to· umožní, aby rychlost reakce byla tak vysoká jak jen je možné. Větší kuličky polymeru mohou také být použity v tomto systému, ale bude pak zaveden větší odpor k přestupu hmoty.

Aby koš mohl fungovat v nezaplaveném stavu, většina roztoku je udržována ve vnější sběrné nádrži a roztok je pak pumpován do reaktoru tak, aby prošel vrstvou a pak se vrátil do sběrné nádrže. Roztok je poté recyklován přes reaktorové polymerní lůžko předurčeným časovým intervalem. To zajišťuje kontakt na tak dlouho, jak je potřeba.

Mezi každým krokem (to znamená před zavedením dalšího nebo druhého roztoku) je předešlý nebo první roztok odčerpán a vyčištěn ze systému, aby se zabránilo prvnímu roztoku v kontaktu s polymerem v delším časové intervalu než je požadováno. Odvodňovací krok je po recyklování roztoku zastaven, pokračuje otáčení koše, aby se zajistilo, že téměř všechen volný odvodňovaný roztok je vytlačen ven z vrstvy působením odstředivých sil a navrácen do zásobní nádrže. Čistící krok se týká činnosti prvního ventilu, který posílá roztok do sběrné nádrže k obnově nebo do odpadu.

Malé množství prvního roztoku může zůstat v polymeru na počátku druhého cyklu. Když je druhý roztok zaveden do systému, tak je druhý ventil otevřen do odpadu na krátký časový úsek na počátku cyklu druhého roztoku. Zbytek prvního roztoku, který nebyl vytlačen pryč z vrstvy, bude vytlačen nebo vymyt ven z vrstvy druhým roztokem. Otevření druhého ventilu do odpadu za účelem čištění odstraní ze systému zbytek prvního roztoku.

Vhodněji jsou aminokyseliny preaktivovány a nerozpustné vedlejší produkty z aktivačního kroku jsou filtrovány z roztoku aminokyseliny dříve, než je aminokyselinový roztok zaváděn do systému.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Na obrázku 1 je nákres vybavení systému používaného v předkládaném vynálezu;

Na obrázku 2 je zvětšený nákres reaktoru používaného v předkládaném vynálezu;

Na obrázku 3 je graf ukazující koncentraci boc-aminokyseliny jako funkci vzdálenosti od středu částice (udávána „zetou“) v čtyřech bodech v čase pro případ možného přenosu hmoty přes vrstvu kapaliny;

Obrázek 4 se skládá ze dvou grafu ukazujících koncentraci boc-aminokyseliny jako funkci vzdálenosti od středu polymerní kuličky v čtyřech bodech v čase pro vysoký a nízký odpor vrstvy k přenosu hmoty;

Na obrázku 5 je graf zobrazující vypočítaný průtok přes polymer proti poklesu tlaku v polymerním lůžku.

• 9 ♦ 9 ·· • 9 9 • ··

9 9 •999 99 ·· 99 99 • 99 9 9 99 9 • 9 9999

9 · 9999 9

9 9 9 9

9999999 «9 ··

PRŮMYSLOVÁ VYUŽITELNOST

Znázornění vybavení systému předkládaného vynálezu je schématicky ukázáno na obrázku 1. Systém 1 zahrnuje přípravnou nádrž 3 zajišťující společně s agitátorem rozpouštění aminokyseliny. Je výhodnější použít mechanický agitátor, ale další typy agitátorů mohly být také použity. Rozpouštědla a činidla použitá během syntetických operací mohou by plněna postupně do přípravné nádrže, míchána a optimálně upravena na požadovanou pracovní teplotu s pomocí buď vnitřních spirál (ukázáno) nebo vnějšího vyhřívacího a chladicího pláště. Výhodněji je také přípravná nádrž 3 použita pro preaktivaci aminokyseliny. Pumpa PÍ umístěná v potrubí 4 přenáší reaktanty z přípravné nádrže 3 do třícestného ventilu VI, kterým je polymer, roztok aminokyseliny nebo rozpouštědel dopraven do přechovávači nádrže 5 potrubím 6 nebo do reaktoru 7 potrubím 8. Jestliže jsou preaktivované aminokyseliny přenášeny do přechovávači nádrže 5, tak jsou tyto aminokyseliny propouštěny přes filtr Fl, který dostatečně jemně odstraňuje nerozpustné vedlejší produkty, takové jako je DCU, z roztoků preaktivované aminokyseliny. Filtrované preaktivované aminokyseliny jsou poté přenášeny do přechovávači nádrže 5 potrubím 9. Jak je zmíněno výše, DCU je vedlejším produktem aktivace následující aminokyseliny přidávané k řetězci a může ucpat kuličky polymeru právě tak jako systémové vybavení, takové, jakým jsou rozstřikovací trysky a pumpy. Propouštění roztoku preaktivované aminokyseliny přes filtr Fl za účelem odstranění DCU, které předchází zavedení roztoku aminokyseliny do reaktoru 7, je tudíž upřednostňováno.

Potrubí 11 vede od výstupu z přechovávači nádrže 5 ke vstupu do reaktoru 7. Vhodněji je potrubí 11 opatřeno filtrem F2, měřící pumpou P2 a tepelným výměníkem Hl. Obě strany pumpy P2 jsou opatřeny dvěma ventily V2 a V3, které umožňují činidlům být poslána do „odpadu“ nebo na „obnovu“. Výhodněji je ventil V2 umístěn proti proudu filtru F2.

Na závěr, výstup z reaktoru 7 je spojen se vstupem do přechovávači nádrže potrubím 13. Čtvrtý ventil V4 je umístěn v potrubí 13, aby posílal činidla z reaktoru 5 do „odpadu“ nebo na „obnovu“.

Jak může být shledáno, přechovávači nádrž 5 a reaktor 7 jsou částí smyčky vymezené nebo dokončené potrubími 11 a 13. Přechovávači nádrž 5 tedy může být použita k tomu, přijmout vyprázdněný obsahu reaktoru 7 a udržovat zásobu omývacích rozpouštědel nebo roztoků aminokyselin pro recyklování zpět přes reaktor. Jak bude diskutováno níže, toto umožňuje reaktoru být skutečně bez povrchových kapalin.

Reaktor 5 je ukázán ve větším detailu na obrázku 2. Skládá se z vnitřního prostoru 15, v kterém je rotovatelný koš 17 namontován k otáčení. Vnitřní prostor 15 je vhodněji oddělen od okolní • fr frfr · frfr ·· frfr frfrfr· frfr frfr frfrfrfr • frfr · · fr · frfr • fr frfr · fr · frfrfrfr · • frfr frfr frfrfr • frfrfr frfr frfrfr frfrfrfr frfr frfr atmosféry, aby se předešlo vypařování reaktantů a omývacích roztoků. Prostor 18 je určen mezi košem 17 a vnitřním prostorem 15. Koš 17 je namontován na hřídeli 19. Hřídel 19 je funkčně spojena s motorem M takového přijatelného výkonu, který je schopen roztočit koš 17 tak, aby bylo vyvinuto zrychlení o velikosti nejméně 10 jednotek gravitačního zrychlení (g) na povrchu koše. Vhodnější je zrychlení větší než 15 g a ještě vhodnější je, když je zrychlení na povrchu koše 50 g nebo více. Aby bylo dosaženo zrychlení 50 g na obvodu koše, který má poloměr 15 cm, musí být koš otáčen rychlostí 546 ot./min.. Zrychlení, kterého může být dosaženo, je limitováno mechanickými vlastnostmi reaktoru a stlačitelností polymeru.

Koš 17 má pevné dno 21, perforovanou válcovitou stěnu 23 a okraj 22 prodloužený dovnitř od vrcholu stěny 23. Dírkování boční stěny je vhodnější v rozmezí 2 až 5 mm. Filtrační tkanina nebo síťovino vá vložka je umístěna na vnitřním povrchu stěny (23) koše a má takový rozměr, aby se zabránilo pronikání polymeru R přes stěnu 23. Síťovinová vložka 25 má vhodněji velikost ok přibližně od jedné desetiny (0,10) do jedné třetiny (0,33) průměru částic polymeru, takže nepropustí kuličky z koše ven, nicméně tekutinu nechá projít skrz. Trubice 24, přivádějící tekutý polymer, je napojena na třícestný ventil VI skrz potrubí 8, aby mohl být tekutý polymer zaveden na pevnou fázi. Trubice 24 má na konci vhodněji koleno 26, aby byl tekutý polymer zaváděn na stěnu 23 koše 17. Odstředivé síly vznikající otáčením koše jsou obecně dostatečně silné na vytvoření hladké vrstvy polymeru na stěně koše. Nicméně trubice 24 může zahrnovat mechanické prostředky pro rozvrstvení tekutého polymeru tak, aby byla zajištěna jednotně silná vrstva polymeru na stěně 23. Mechanické rozvrstvovací prostředky mohou například zahrnovat osově nebo vertikálně prodlužovatelnou čepel, která je v koši radiálně pohyblivá tak, aby byla nastavena požadovaná vzdálenost od stěny (23) koše. Trubka 27, která dodává reaktanty a je napojená na potrubí 11, je prodloužena do koše 17 a zahrnuje mnoho rozstřikovacích trysek 29, které rozstřikují roztok aminokyseliny nebo omývacího rozpouštědla rovnoměrně na otáčející se lůžko pevné fáze. Výstupní potrubí 13 dovoluje reaktantům nebo omývacím roztokům, které prošly přes koš 17, rychle opustit reaktor 7 a vrátit se do přechovávači nádrže 5. Takto nebude reaktor 5 obsahovat žádné množství tekutiny, která by kontaktovala nebo zaplavovala koš. Úroveň kapaliny v reaktoru nebude stoupat ve vnitřním prostoru 15 ke dnu 21 koše 17. Protože reaktorový obal nebude zatopen, nebude zde kapalina, která by brzdila koš, což by vyžadovalo větší výkon motoru M.

Vybavení zařízeni může být uzpůsobeno na automatické plnění požadovaných množství kapalin do přípravné nádrže 3, kontrolování zásoby kapaliny v přechovávači nádrži a kontrolování průtokové rychlosti kapaliny tekoucí do reaktoru 7. Kromě toho může být přidán nepovinný vsádkový sekvenátor S, aby byla více automatizována celá operace. Vybavení zařízení (takové ·· fe· · fefe fefe fefe fefefefe fefe fefe fefefefe • fefe · · fefe fefe • fe fefe · · · fefefefe fe • fefe fefe fefefe • fefefe fefe fefefe fefefefe fefe fefe jako je IR detektor) může také zajišťovat sledování vývoje deblokace a omývání, takže syntéza může být sledována v daném čase. Kromě toho IR detektor může sloužit jako integrální část automatizovaného procesu a testování nezreagovaných volných aminů může být provedeno hned jakmile IR detektor udá, že reakce ustala.

Konstrukce používající nekovové nebo vysoce protikorozně pokryté povrchy se mohly ukázat nezbytné pro některé produkty. V takových případech mohou být součásti reaktorového systému 1 vyrobeny nebo spojeny s nereaktivními materiály. Takové materiály zahrnují například slitiny s vysokým obsahem niklu, takové jako je Hastelloy dostupný u Haynes Inťl lne. of Kokomo, Ind., Teflon® pokrytý polytetrafluoroethylenem a dostupný u E.I.du Pont deNemours nebo 316 stainless ocel.

Syntéza může být prováděna následujícím způsobem. Polymer a rozpouštědlo polymeru jsou naplněny do přípravné nádrže 3 a je zapnut agitátor. Kuličky použité pro tekutý polymer jsou malé kuličky, výhodněji menší než 100 pm v průměru, které jsou prokříženy z 0,2 % až 1,5 %. Polymer se například může skládat z boc-Pro-RCM (Merrifíeldův polymer, který má navíc navázaný boc-Prolin a je dostupný u Sigma Chemical) a rozpouštědlem může být dichlormethan (DCM). Teplota může být upravena na předurčenou teplotu (takovou jako je 30 °C) prostřednictvím teplotního regulátoru TIC v nádrži 3. Zatímco je tekutý polymer míchán, koš 17 začíná být roztáčen a upravován na požadovanou rotační rychlost (takovou jako je 1000 otáček za minutu), aby se vyvinulo zrychlení nejméně 10 g, vhodnější je větší než 15 g a nej vhodnější je 50 g nebo větší. Tekutý polymer je plněn přímo do reaktoru prostřednictvím potrubí 8 a trubky 24. V koši 17 není žádná kapalina v okamžiku, když je tekutý polymer zaváděn do koše. Odstředivé síly působící na polymer způsobí, že polymer vytvoří relativně rovnoměrnou vrstvu R (Obr. 2) na vnitřním povrchu koše. Vrstva R je vhodněji vybudována s počáteční tloušťkou mezi 2 až 6 cm. Jiné tloušťky by samozřejmě mohly být použity také. Další rozpouštědlo polymeru nebo recyklovaný filtrát může být zaveden do přípravné nádrže 3, aby byl spláchnut zbylý polymer do reaktoru 7. Měřící pumpa P2 je aktivována, aby bylo recyklováno rozpouštědlo polymeru přes reaktor a byla tak jistota, že se vytvořila jednotná vrstva v reaktoru. Jakmile vrstva R dosahuje požadované tloušťky je zbývající rozpouštědlo polymeru převedeno do odpadu odkloněním třícestného ventilu V3 do odpadu a působením pumpy P2, dokud není přechovávači nádrž 5 prázdná.

Čepel nebo nůž, diskutované výše, mohou ulehčit rozprostření polymeru na boční stěnu, aby bylo jisté, že vzniká lůžko rovnoměrné tloušťky. Jak je polymer aplikován na stěnu 23, a jestliže dojde k tomu, že vzniká vrstva větší tloušťky než je požadováno, pak čepel otře přebytečný

44 44

4 4 4 4 4

4 4 44

4 4444 4

4 4 4

4444 44 44 • ·

44 * 4 4 • 44

4

4

4444 44 polymer, jak může být oceněno. Nicméně jak je poznamenáno, takové mechanické rozvrstvovací prostředky nejsou obecně vyžadovány k tomu, aby vzniklo hladké polymerní lůžko.

Roztok, který odblokovává N-konec peptidu vázaného na polymer je připravován v přípravné nádrži 3. Příklady deblokačních roztoků zahrnují čistou kyselinu trifluoroctovou (TFA) nebo roztoky TFA a DCM (dichlormethan). Deblokační roztok je převáděn do přechovávači nádrže 5 potrubím 6. Pumpa P2 je aktivována a deblokační roztok je prováděn přes reaktorovou smyčku. Roztok je pumpován do reaktoru z přechovávači nádrže 5 přes potrubí 11 a trubku 27. Deblokační roztok je zaváděn na lůžko s pomocí trysek 29 a přechází přes lůžko do prostoru 18, který je mezi košem 17 a vnitřním prostorem 15. Roztok opouští reaktor 7 a vrací se do přechovávači nádrže 5 přes potrubí 13. Nějaké zbytky rozpouštědla polymeru v potrubích a v polymerním lůžku mohou být odstraněny odkloněním prvního množství odstředěného roztoku opouštějícího reaktor 7 do odpadu nebo na obnovu přes ventil V4 v potrubí 13. To ochrání rozpouštědlo polymeru od smíchání s deblokačním roztokem v přechovávači nádrži 5. Následuje odstranění rozpouštědla polymeru. Zbývající odstředěný roztok opouštějící reaktor 7 je odkloněn do přechovávači nádrže 5 pro recyklování v reaktoru 7. Recyklování pokračuje po předem stanovenou dobu (nejvhodněji okolo 3 minut). Následuje deblokace, kdy je roztok odkloněn do odpadu nebo na obnovu přes ventil V3, jak je popsáno výše vzhledem k rozpouštědlu polymeru.

Jestliže to je požadováno, může být proveden druhý deblokační krok, aby byla jistota, že došlo ke kompletní deblokaci N-konce peptidu vázaného na polymer.

Polymer může být omyt (například DCM), aby se odstranil deblokační roztok. Omytí je provedeno naplněním požadovaného množství roztoku do přípravné nádrže, poté převedením roztoku do přechovávači nádrže 5 pumpou PÍ a aktivací pumpy P2. Omývací roztok je převáděn přes reaktor 7 a přechovávači nádrž 5 po určenou dobu, to je po dobu 3 minut. Tak jako předtím je ventil V4 počátečně nastaven na odpad, aby se odstranil zbylý deblokační roztok ze systému. Ventil V4 je poté nastaven na průtok cyklem a omývací roztok protéká přes systém. Potom co je omývání hotové, je omývací roztok odstraněn ze systému přes ventil V3.

Dodatečný omývací roztok (například s isopropanolem) může být zaveden do zmenšeného polymeru.

Peptid je poté deprotonován omýváním polymeru zásaditým roztokem, takovým jako je diisopropylethylamin (DIEA), po dobu 20 minut.

Dodatečný omývací roztok DCM může být zaveden, aby došlo k odstranění zásaditého DIEA. Polymer může být zmenšen omýváním methanolem (MeOH) nebo dimethylformamidem (DMF).

·· ·♦ ♦ ·· ·« 99 • 9 9 * · · 9 · · · 9 9

99 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 9999 99 99

Polymer může být zvětšen omýváním DCM.

Následující aminokyselina (například boc-arginin), která má být připojena k peptidovému řetězci je naplněna do přípravné nádrže 3. Aminokyselina je vhodněji preaktivovaná a přípravná nádrž 3 je také naplněna vhodným rozpouštědlem nebo rozpouštědly, takovými jako jsou DCM a DMF. Nádrž 3 je naplněna rozpouštědly ve stejné době jako aminokyselinou. Vazebné činidlo, takové jakým je DCC nebo DIC je pak přidáno k roztoku aminokyseliny v přípravné nádrži 3. Následuje období preaktivace, kdy vzniká většina nerozpustných vedlejších produktů. Ventil VI pracuje, aby zavedl aktivovanou aminokyselinu do přechovávači nádrže 5 přes filtr Fl, na němž dochází k odstranění nerozpustných vedlejších produktů aktivačního procesu. Filtr Fl má takovou velikost, která umožní odstranit skutečně všechny nerozpustné vedlejší produkty aktivační reakce. Zfiltrovaný roztok aminokyseliny je pak recirkulován přes reaktor, jak je popsáno výše, dokud není vazebná reakce hotová.

Protože ani vnitřní prostor ani koš nejsou zaplaveny během reakce, je potřeba méně tekutiny, než by bylo potřeba u míchaného nádržového reaktoru, třepaného baňkového reaktoru nebo dokonce u reaktoru se zaplaveným rotovaným košem. Tato schopnost použít méně kapaliny dovoluje použití vyšších koncentrací aminokyselin bez užití většího množství aminokyselin a tím tedy bez zvyšujících se nákladů na operaci. Takto může být koncentrace aminokyseliny zvýšena například na 300 mmol/1 roztoku bez zvýšení množství použité surové aminokyseliny. Jak je známo, reakční rychlost je funkcí koncentrace reaktantů. Tedy schopnost použít méně tekutiny zvyšuje reakční rychlost vazebného kroku. Teplota aktivované aminokyseliny může být kontrolována a přizpůsobena v přípravné nádrži 3 a při recirkulaci v tepelném výměníku Hl. Zakončení vazebné reakce může být potvrzeno testovacími vzorky polymeru odebranými z reaktoru.

Polymer může být omyt rozpouštědlem, takovým jako je DMF.

Nerozpustné vedlejší produkty mohou být odstraněny z polymeru omytím methanolem (MeOH). Methanol může být odstraněn z polymeru omytím rozpouštědlem, takovým jako je DCM.

Proces se opakuje pro další aminokyselinu, která je v sekvenci na řadě. Je potěšitelné, že filtrační tkanina a perforovaná boční stěna koše nahrazují filtrační fritu, která je používána buď v míchaných nádržových nebo v trubkových SPPS reaktorových systémech. Odstranění geometrických nátlaků malé a oddělené filtrační frity z vyprazdňovací cesty osvobozuje reaktorový systém od tlakových nátlaků uvalených na něj fritou (to znamená, že se konstruktér nemusí starat o poškození frity). Maximální tlak, kterém může být systém vystaven, je tak spojen se velikostí polymerních kuliček a tloušťkou polymerního lůžka (tlak nemůže být tak velký pokud jde o zničení nebo velké stlačení polymerních kuliček) a sílou koše 17.

·· Φ· · »φ φ* φφ • φ · φ · · φ · · φ φ φ • 9· · ··«·· • Φ Φ Φ · · Φ Φφ Φ φ Φ

Φ Φ Φ φ Φ ··· ···· ΦΦ ·ΦΦ ΦΦΦΦ Φ· φφ

Mezi každým krokem (to znamená zatímco je přechovávači nádrž naplňována následujícím roztokem) je koš 17 udržován v otáčkách. To zajišťuje, že většina předchozího roztoku bude rychle odstraněna z vrstvy R odstředivými silami před tím, než je následující roztok zaveden do reaktoru 7. Dále, jak je poznamenáno, je ventil V4 otevřen do „odpadu“ na krátký čas na začátku každého cyklu. Toto bude dále zbavovat systém zbytků předchozího roztoku, který možná nebyl odstraněn z vrstvy R pokračujícím otáčením koše, a který byl odstraněn nynějším roztokem. To zajistí, že ne více než minimální množství předchozího roztoku zbude v systému a usnadní kontrolu expozice peptidového řetězce reaktanty nebo omývacími roztoky.

Jak bylo poznamenáno, koš a polymerní lůžko nejsou zaplaveny. Tedy všechny reaktanty a kapaliny, které jsou zavedeny do koše prochází přes vrstvu R dobrou rychlostí. To znamená, že průchod roztoku přes vrstvu R nebude zdržován tekutinou v prostoru 18 mezi košem a vnitřním prostorem reaktoru. Tudíž doba kontaktu peptidu s reaktantem nebo omývacím roztokem může být pozorně a přesně kontrolována pomocí nepřetržitě otáčeného koše a měření délky činnosti pumpy P2.

Relativní rychlost tekuté částice je tak konstrukčně proměnlivá, že může mít vliv na výkon systému, výtěžek produktu a jeho kvalitu. Když je reaktant nebo omývací roztok zaváděn do koše 17, tak kapalina prochází přes polymer a filtrační tkaninu, jak bylo zmíněno výše, do vnitřního prostoru 15, aby byla recirkulována zpět do přechovávači nádrže. Pokud rychlost, při které kapalina reaktor opouští je v podstatě rovna nebo převyšuje rychlost, kterou je kapalina do reaktoru zaváděna, pak reaktor nebude zaplaven. V závislosti na prostoru mezi dnem reaktorového koše a dnem vnitřního prostoru může být rychlost dodávané kapaliny menší než rychlost kapaliny, která reaktor opouští, pokud je cyklus ukončen před tím, než kapalina dosáhne úrovně dna koše. Rychlost, při které roztok může procházet přes polymer a filtrační tkaninu, je funkcí odporu (K_p) polymeru k průchodu kapaliny polymer a odporu (B) filtrační tkaniny k průchodu kapaliny přes tkaninu. Kp a B jsou vypočítány podle následujících rovnic:

- /JGcC_s ~ /dRm

Kp = - a B =-, kde 1

A² ΔΡ ΑΔΡ μ = viskozita kapaliny;

C_s = koncentrace pevných částic v kapalině;

A = plocha filtrace, která se rovná ploše filtrační tkaniny použité v koši;

ΔΡ = pokles tlaku přes polymerní lůžko;

α = specifickú odpor vrstvy (polymeru) k průchodu roztoku přes polymer (v m/kg), který je funkcí poréznosti;

R_m= odpor filtrační tkaniny k průtoku roztoku přes tkaninu.

Síly působící na těleso v centrifuze mohou být popsány následujícími rovnicemi. Zrychlení a předmětu v centrifuze o poloměru R, která se otáčí úhlovou rychlostí ω rad/s, může být získáno z následující rovnice:

a = Roj² 2 ·· toto • · · * to • · · ··· •to·· ·· • toto toto ·· • toto · · to· · • · · · ·· • to « ···· · • to · · · •toto ···· ·· ··

Horní rovnice může být vyjádřena v jednotkách gravitačního zrychlení vydělením zrychlení zrychlením jako výsledku tíhy (980 cm/s²).

Pokles tlaku přes lůžko polymeru může být získán následujícím způsobem. Statický tlak působící na tekutinu je vyjádřený rovnicí:

dP =pgdz kde P je tlak, g gravitační síla a z je výška tekutiny. Výsledkem substituce rovnice 2 pro gravitační zrychlení v rovnici 3 je :

dP = po?RdR 4

Výsledkem integrace mezi vnitřním a vnějším poloměrem tloušťky polymerního lůžka je následující vyjádření:

Λ-Ρο = pco²(R²-R₍ ²)

Horní rovnice mohou být vyjádřeny vhodnějšími výrazy (otáčky za minutu), než v radiánech za sekundu, následujícím převodem:

ŽTtVp-w / min] (ů[rad / sec] = - 6

60[sec / min]

Pokles tlaku přes porézní prostředky může být vyjádřen následující rovnicí:

(m_ca R_m

-,—+ A A

49 » 9 9 I » 9 44

4 » «

4 9 «9 44 *»

9 9 9 • 9* • 9 9

9 4

9999 ·* kde qje objemová průtoková rychlost kapaliny, μ viskozita kapaliny, m_cje hmotnost vrstvy, a je specificky odpor vrstvy vůči průtoku, R_m je odpor filtračního prostředku vůči průtoku a A je filtrační plocha. Odpor vrstvy ? může být funkcí tlaku, jestliže se vrstva stlačuje. Konstanty pro odpory vrstvy a filtračních prostředků mohou být získány provedením vsádkového filtračního experimentu za konstantního tlaku a rozdělením času, který uplyne, a jehož dělení je provedeno podle objemu jednotlivých podílů celkového objemu filtrátu. Sklon výsledné křivky je úměrný odporu vrstvy a průsečík je úměrný odporu filtračních prostředků.

Koš 17 má vnitřní poloměr IR (Obr. 2) rovný vzdálenosti od středu koše k vnitřnímu konci okraje 22 a vnější poloměr OR rovný vzdálenosti od středu koše k perforované stěně 23 koše. U použitého koše byl vnější poloměr (OR) okolo 15 cm a okraj měl šířku okolo 7,5 cm. Vnitřní poloměr použitého koše tak byl okolo 7,5 cm. Koše jiných rozměrů mohly také být použity. Jakmile je reaktant nebo omývací roztok zaveden do koše 17, budou kapičky roztoku splývat, aby vytvořily kapalinovou stěnu na vnitřním povrchu polymerní vrstvy působením odstředivých sil. Jak se proud roztoku do koše zvyšuje, tak se bude zvyšovat i tloušťka kapalinové stěny. Když je kapalinová stěna dostatečně silná tak, že vzdálenost vnitřního povrchu této kapaliny od středu koše (R [vnitřní] v Tabulce I dole) je menší než vnitřní poloměr koše (7,5 cm), pak roztok přeteče přes okraj 22 koše. Za těchto podmínek je koš účinně zaplaven. Jak může být vidět z Tabulky I dole, pro rotační rychlost 500 ot./min. se koš začíná zaplavovat při vstupní průtokové rychlosti mezi 102,8 ml/s a 115,7 ml/s pro tloušťku polymerního lůžka 5,5 cm. Pro polymerní lůžko tloušťky 2,5 cm se koš začíná zaplavovat, když je průtoková rychlost mezi 217,8 ml/s a 244,9 ml/s. Při rotační rychlosti 1000 ot./min. se koš nezaplavuje dokud průtoková rychlost není mnohem vyšší. Pro polymerní lůžko tloušťky 5,5 cm se koš nezačne zaplavovat dokud průtoková rychlost není mezi 449,8 ml/s a 514,1 ml/s a pro polymerní lůžko tloušťky 2,5 cm se koš nezačne zaplavovat dokud průtoková rychlost není mezi 952,5 ml/s a 1088,6 ml/s.

Hodnoty ve spodní Tabulce I byly získány ze série filtračních výpočtů použitím experimentálně získaných hodnot K_p a B, které byly použity pro centrifugu, která měla plochu stěny 63,62 cm². Hodnoty Kp a B byly získány za konstantního tlakového rozdílu PÍ o 11 stupních rtuťového sloupce v prostoru 18 mezi košem a vnitřním prostorem. Filtrační parametry takto získané byly použity pro centrifugu, která měla poloměr 15 cm a stěnu koše o ploše 1413 cm², k vypočítání průtokových rychlostí kapalin, aby byl zjištěn pokles tlaku (v tloušťce kapaliny) pro různé rotační rychlosti. Změny tlaku PÍ a filtrační plochy budou mít vliv na filtrační koeficienty Kp a B.

φ* φφ φ φ « φ φ φ φφ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ

ΦΦ φ · • φφφφ • Φ φ φ φφ • φ φ φ φ φφ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ

Tabulka I: Vypočítané hodnoty poklesu tlaku při průtoku přes polymerní lůžko

	Arei fílter elotfri	63.62	cm A2		A2/A 1	22.21
	Arei Buket	1413	ίΠ,Λ2		PÍ fin. Hel	11
	Le	0.00038	t/cm A6
	B	0.0051	j/cm A3		Vol. basket	8884.00
	Vol. fílter	400	m 1		Cake til.	u	(tmi
Precsure (cm. DCM)	P2 fin. Hel	Flow (m 1/sl	Flow (m l/t)	P2ZP1	Ko	B	R finnerl cm
	Bcd Dcpth (cm'	5.50	2.50				1000 RPM	500 RPM
10.17	1	12.83	77,21	o.o?I	8.4738E-06	2.53E-03	14.84	14.36
20.35	2	25.70	54.43	0.1 82	4.2369E-06	1.26E-03	14.68	13.69
30.32	3	38.56	81.64	0.273	2.8246E-O6	8.42E-04	14.52	12.98
40.69	4	51.41	108.86	0.364	2.1 I85E-06	6.3! E-04	14.36	12.24
50.86	5	64.26	136.07	0.455	1.6948E-06	5.05E-04	14.19	1.45
61.04	6	77.11	163.29	0.545	I.4123E-06	4.21 E-04	14.03	10.59
71.2 1	7	89.97	190.50	0.636	1.2105E-06	3.61E-04	13.86	9.66
81.38	8	102.82	217.72	0.727	1.O592E-O6	3.16E-04	13.69	8.64
91.36	9	1 15.67	244.93	0.818	9.4I54E-07	2.81E-04	13.52	7.47
101.73	10	128.52	272.15	0.909	8.4738E-07	2.53E-04	13.34	6.08
1 11.90	1 1	141.37	299.36	1.000	7.7035E-07	2.30E-04	13.16	4.27
122.08	12	1 54.23	326.58	1.091	7.0615E-07	2.10E-04	12.98
132.23	13	167.08	353.79	1.182	6.5183E-07	1.94E-04	12.80
142.42	14	179.93	381.01	1.273	6.0527E-07	1.80E-04	12.62
152.39	15	192.78	408.22	1.364	5.6492E-07	1.68E-04	12.43
162.77	16	205.64	435.44	1.455	5.2961E-07	1.58E-04	12.24
172.94	17	218.49	462.65	1.545	4.9846E-07	1.49E-04	12.05
l «3.11	18	231.34	489.87	1.636	4.7077E-07	1.40E-04	11.85
193.29	19	244.19	517.08	1.727	4.4599E-07	1.33E-04	11.65
203.46	20	257.05	544.30	1.818	4.2369E-07	1.26E-04	11.44
213.63	21	269.90	571.51	1.909	4.0352E-07	1.20E-04	11.24
223.80	22	. 282.75	598.73	2.000	3.8517E-07	I.15E-04	11.03
233.98	23	295.60	625.94	2.091	3.6843E-O7	1.10E-04	10.81
244.15	24	308.45	653.16	2.182	3.5308E-07	I.O5E-O4	10.59
254.32	25	321.31	680.37	2.273	3.3895E-07	1.01 E-04	10.37
264.50	26	334.16	707.58	2.364	3.2592E-07	9.71E-05	10.14
274.67	27	347.01	734.80	2.455	3.1385E-07	9.36E-05	9.90
284.84	28	359.86	762.01	2.545	3.0264E-07	9.02E-05	9.66
295.02	29	372.72	789.23	2.636	2.922E-07	8.71E-05	9.42
305.19	30	383.57	816.44	2.727	2.8246E-07	8.47E-05	9.16
356.05	35	449.83	952.52	3.182	2.4211E-07	7.22E-05	7.78
406.92	40	514.09	1088.59	3.636	2.1 185E-07	6.31E-05	6.08

Na obrázku 5 je graf, který ukazuje průtokovou rychlost proti poklesu tlaku v polymerním lůžku v koši 17.

S potěšením je konstatováno, že maximální průtoková rychlost před počátkem zaplavení je funkcí tloušťky polymerního lůžka a poloměru radiální šířky okraje 22 koše. Tedy zvýšením šířky okraje 22 nebo snížením tloušťky polymerního lůžka může být zvýšena maximální možná průtoková rychlost. Činnosti reaktoru nebude bráněno žádnou kapalinou na povrchu polymerního lůžka (za podmínky, že podstatné množství kapaliny nepřetéká přes okraj 22 cestou okolo lůžka). Důležité je, že koš není ponořen (to znamená, že není žádná kapalina vyplňující prostor 18 mezi stěnou koše a vnitřním prostorem). Tato povrchová kapalina mohla sloužit ke zvýšení rychlosti průtoku přes polymerní lůžko za cenu nepatrně většího objemu kapaliny uvnitř rotujícího koše. Schopnost měnit rotační rychlost podle přání a s neomezeným uspořádáním (protože koš není ponořen v kapalině) dovoluje, aby byly získány vyšší rychlosti kapaliny, než když je ponořený válec r.otuje v zatopené nádrži nebo skořápce.

• · • frfr· • · fr fr 4

Rovnoměrný kontakt kapaliny a pevné fáze je nezbytný pro dobrou činnost reaktoru. Uspokojivý kontakt polymeru s kapalinami může být dosáhnut s rovnoměrně rozprášenou kapalinou na polymer, který má jednotnou tloušťku lůžka a pozorným výběrem průtokové rychlosti kapaliny a rotační rychlosti koše. Průtoková rychlost kapaliny přes lůžko pevné fáze je často přímo úměrná poklesu tlaku v kuličce a nepřímo úměrná tloušťce lůžka. Nicméně polymer je trochu želatinovitý. Vysoké odstředivé síly mohou způsobit stlačení polymerního lůžka a takto zvýšení odporu k průtoku přes polymerní lůžko. Jestliže je lůžko stlačeno při dostatečně vysokém tlaku, průtok kapaliny přes lůžko se může snížit s rostoucím poklesem tlaku. Může tedy zde být konečná rotační rychlost, která maximalizuje průtok kapaliny.

Tabulka I nahoře ukazuje rotační rychlosti 500 a 1000 ot./min. v koši s poloměrem 15 cm, které odpovídají odstředivým zrychlením 41,123 cm/s² (41,9 g) a 164,494 cm/s² (167,8 g) na vnitřním povrchu stěny koše. Nicméně může být možné vystavit kuličky polymeru mnohem vyšším zrychlením před tím, než stlačení kuliček odstředivými silami začne bránit průtoku kapaliny přes polymerní lůžko. Stlačení kuliček polymeru je funkcí tuhosti kuličky, která je následně vztažena ke stupni prokřížení polymeru.

PŘÍKLADY PROVEDENI VYNALEZU

Centrifuga IEC vybavená motorem s proměnlivou rychlostí a košem ze stainless oceli a peristaltická pumpa Cole-Palmer Masterflex Model 7518-12 fungovaly jako reaktor. Koš měl vnitřní průměr 13 cm a výšku 5 cm. Kapalina byla do centrifugy dodávána prostřednictvím hadice Masterflex Phar-Med, typ 6485-24, která posílala proud kapaliny na vrchol středu koše, kde byl proud rozbíjen na řadu kapiček. Tato konstrukce nedovolila úplné nebo plné pokrytí povrchu polymeru jednotným rozstřikem. Přibližný průtok kapaliny byl 200 ml/min.. Aminokyseliny a HOBt byly preaktivovány pomocí DCC. Nerozpustná DCU byla odstraněna z roztoku aktivované aminokyseliny vakuovou filtrací před přidáním do reaktoru. Alkoholové (methanol) omývací roztoky nebyly potřeba, protože preaktivační krok odstranil velkou většinu DCU. Způsob byl jinak stejný jako ten, který je popsaný v tabulce II dole. Rotace koše byla přibližně 500 ot./min., což odpovídalo zrychlení okolo 18,2 g. Pokles tlaku (při zaplaveném stavu) v 1 cm kapaliny se specifickou tíží 1,0 za výše popsaných podmínek byl 1645 N/m² (0,24 psi). Filtrační plocha centrifugy pro reaktor je 204 cm² a minimální povrchová rychlost kapaliny v prázdném koši (při průtokové rychlosti 200 ml/min.) je 0,98 cm/min.. Skutečná průtoková rychlost přes kuličky polymeru je nepřímo úměrná poréznosti vrstvy a měla by být deseti až stonásobkem této odhadnuté průtokové rychlosti.

4 44 4 44 44 44

44 4 444 4 4 44 4

44 4 4 fc> 4 44

44444 44 44444

444 44 444

4444 44 444 4444 44 44

Byly provedeny experimenty při dvou nastaveních. První nastavení bylo prováděno tak, aby bylo určeno chování polymeru když neprobíhají chemické reakce. Polymer byl dispergován v DCM nebo DMF a naplněn do centrifugy, která byla vyplněna polypropylenovou filtrační tkaninou o velikosti 1 až 3 mikrony. Polymer vytvořil na tkanině jednotné lůžko, které se zvětšovalo a zmenšovalo, podle toho jak bylo vystavováno účinkům DCM, DMF a MeOH. Vrstva neodpadávala během krátkých okamžiků po zastavení centrifugy. Nicméně vrstva neměla tendenci odpadnout, ani když byla nechána uschnout přes noc. Ačkoliv vrstva když uschla praskla, praskliny byly docela úzké. Prázdná místa příležitostně vznikala, ale rychle mizela použití následujícího omývacího rozpouštědla. Jak bylo řečeno, zavedení kapaliny na povrch kuliček polymeru povrch uhladí. Tyto nepatrné zlomy a prázdné formace tedy nemají vliv na průtok kapaliny přes vrstvu a průtok kapaliny přes vrstvu byl považován za homogenní. Polymer byl také nalezen v efluentu na počátku omývání, ale efluent byl rychle vyčištěn recyklováním. Recyklace kapaliny fungovala neobyčejně dobře, protože se nepřihodila žádná akumulace rozpouštědla uvnitř centrifugy a to umožnilo, aby byl prováděn rychlejší průtokový kontakt pokud to je požadováno. Ztráty části pevné fáze z centrifugy na počátku vsádkového a omývacího kroku jsou normální a byly při tomto pokusu očekávány, protože nebyly použity žádné záchytné kroužky, aby držely tkaninu na stěně koše. Výsledky prvního pokusu byly vysoce příznivé a posílily mechanickou proveditelnost reaktorového systému.

V rámci druhého experimentu byl syntetizován dipeptid boc-Arg-Gly na methylbenzhydrylaminovém (MBHA) polymeru, aby byla ukázána vhodnost reakčního zařízení pro syntézu malých peptidů. Nakonec byly reakčně navázány poslední tři aminokyseliny peptidu Leuprolidu, za účelem dotvořit Leuprolid (pGlu-His-Trp), aby byla demonstrována vhodnost reakčního zařízení pro syntézu středně dlouhých peptidů. Použitý způsob je popsán dole v tabulce II.

• · k I • · · ·

I · · » · · · ·

Tabulka II: Způsob syntézy na pevné fázi

Step	Operation	Approx. Time
1	1 x DCM wash (First amino acid only)	3 min.
2	1 x 50% TFA/DCM wash containing 0.5% DTE and 1.0% 2-methyiindole after introducing Cys	3 min’
3	1 x 50% TFA/DCM wash containing 0.5% DTE and 1.0% 2-methylindole after introducing Cys	20 min
4	2 x DCM wash	3 min* i
5	'2 x 5% DIEA/DCM neutralization	4 min each’
6	1 x DCM wash	3 min’
7	2 x MeOH wash (only doně for first amino acid)	3 min each
8	2 x DMF wash	3 min each'
9	React with preactivated boc-Amino Acid	30 min. minimum
10	Ninhydrin Test
11	Ninhydrin Test (if necessary)
12	2 x DMF wash	3 min each' j
13	2 x DCM wash	3 min each'

*Čas omývání pro Leuprolid zvýšený na 5 minut

V první syntéze (to znamená boc-Arg-Gly) bylo 20 g MBHA polymeru s inkorporačním poměrem 1 meq proteinu/g polymeru použito jako výchozí materiál. 60 mmol (3 eq) boc-Gly, HOBt a DCC bylo použito pro 'první vazebnou reakci. Aminokyselina byla preaktivována po dobu 15 minut a DCU odstraněna filtrací. Po první hodině reakční doby byla centrifuga zastavena, byly odebrány vzorky a volné aminové skupiny testovány ninhydrinovým testem. Vzorek prošel ninhydrinovým testem. Vsádka byla deblokována pomocí DCM a TFA a ponechána stát přes noc.

···· ·· * · · · · · • · « ···· · • · · · ······· ·· ·»

Následující vazebná reakce byla prováděna s 60 mmol boc-Arg(TOS) stejným postupem, který byl popsán výše pro boc-Gly. Vzorky odebrané po 1 hodině a 2 hodinách vazebné reakce neuspěly v ninhydrinovém testu. Vsádka byla podrobena nové vazebné reakci s 1,5 eq bocArg(TOS), HOBt a DCC preaktivovaným 3minuty (aby se minimalizoval vznik laktámového cyklu). Ninhydrinový test byl poté úspěšný.

Druhá část experimentu zahrnovala připojení posledních tří aminokyselin (Glu-His-Trp) k Leuprolídu. Byl získán pre-Leuprolid (post-Ser). V tomto momentě obsahoval peptid-polymer okolo 0,5 meq peptidu/g polymeru. Použitý způsob byl stejný se způsobem popsaným v tabulce II výše, kromě toho, že byla přidána recirkulační nádoba, která byla tvořena baňkou s kulatým dnem a uzavřenou povrchovou skleněnou hlavou s ponořenou hadicí. Otvor na vrcholu centrifugy byl uzavřen plastikovou kádinkou s vříznutým otvorem pro napouštěcí hadici. Tyto změny byly udělány, aby se redukovaly ztráty rozpouštědla vypařováním.

První vazebná reakce v novém uspořádání byla s boc-TRP. Vzorek odebraný po první hodině uspěl v ninhyrinovém testu. Druhá vazebná reakce byla s boc-His(BOM). Rychlost pumpy byla zvýšena a reakce ve vsádce probíhala další hodinu. Po uplynutí reakční doby byly odebrány tři vzorky polymeru, každý z vrcholu, středu a dna vrstvy a individuálně testovány na volné amino skupiny. Ninhydrinový test byl velmi silně pozitivní pro každý vzorek.Vsádka byla podrobena nové vazebné reakci s 1,5 eq boc-His(BOM) a po jedné hodině byla úspěšně podrobena ninhydrinovému testu. Poslední vazebnou reakcí byla reakce s p-Glu. Vsádka byla podrobena vazebné reakci po dobu jedné hodiny a vzorek uspěl v ninhydrinovém testu. Konečná hmotnost peptid-polymeru byla 32 gramů. 2,0 gramy peptid polymeru byly štěpeny s ethylaminem, což vykázalo 802 mg chráněného peptidu. Surový peptid byl testován na HPLC s reversní fází a vykázal typický pás pro surový Leuprolid.

Výsledky první řady experimentů naznačují, že polymer vytváří jednotné lůžko na stěně centrifugy a má malou tendenci zhroutit se nebo se provalit. Kromě toho polymerní lůžko vykazuje minimální trhliny. Prázdná místa a trhliny se ztrácejí při omývání a průniky v polymeru jsou obvykle docela malé. Čisté průlomy polymeru do filtrátu během vazebných experimentů téměř neexistovaly, kromě posledního vazebného kroku. Lepší metody utěsňování filtračních prostředků jsou k dispozici a očekává se řešení tohoto problému.

S potěšením je konstatováno, že reaktorový systém nastavený podle toho jak bylo popsáno výše a způsob provozu tohoto systému zabraňuje zaplavování systému rozpouštědly a reaktanty a dovoluje velké průtokové rychlosti přes polymer. Výhod tohoto systému je mnoho a zahrnují:

• to • to · ·· ·· ··· to · «· · • · ···· • · · ·· · · · • · · · · • · · · · · to to· toto

- Mnohem přesnější kontrolu teploty během aktivace, vazebné reakce a deblokace. To je možné, protože není ponořen v zaplaveném vnitřním prostoru. Tudíž vše co je potřeba kontrolovat je teplota kapaliny v potrubí 11 a ve vstupní trubce 26.

- Zmenšené množství nezbytného rozpouštědla, protože nebude potřeba naplnit rozpouštědlem vnitřní prostor 15 ani dispergovat polymer, jako je to v případě STR.

- Zmenšené množství použité aminokyseliny nebo zvýšené reakční rychlosti. Reakční rychlosti jsou úměrné koncentraci reaktantů. Protože objem rozpouštědla může být zmenšený, nároky na množství aminokyseliny jsou také menší, aby byla dosažena stejná koncentrace. Jestliže množství aminokyseliny není zmenšeno, koncentrace budou vyšší a reakční rychlost se úměrně tomu zvýší.

- Vyloučení velmi hořlavých rozpouštědel. Protože aminokyseliny jsou preaktivovány a filtrovány, tak množství DCU v polymeru by mělo být velmi malé. Výsledkem tedy je, že omývací roztoky, jako jsou methanol nebo isopropanol, nejsou nezbytné. Vyloučením alkoholových omývacích roztoků se odstraní „mačkání“ polymeru, které by mohlo poškodit kuličky polymeru. To také samozřejmě zmenší celkový čas potřebný pro vazebnou reakci každé aminokyseliny na peptid. Další výhodou je, že z procesu mohou být vyloučena nukleofilní rozpouštědla, což odstraňuje nebezpečí vnesení možné smíšené kontaminace nebo nedostatečného odstranění těchto „reaktivních“ látek.

- Vyloučení poničení polymeru způsobeného střižnými ději agitátoru při dispergování kuliček v míchané nádobě. Polymer není zatěžován mícháním jako v případě STR. Je tedy méně střihového lámání kuliček polymeru od konců čepelí vysoko rychlostního agitátoru.

- Schopnost odvést teplo vznikající při deblokační reakci. Recirkulovaná kapalina může být chlazena ve vnějším tepelném výměníku a polymer proto bude souvisle vystavován chladnému roztoku DCM/TFA.

- Schopnost zlepšit kvalitu a výtěžky peptidu rychlím odstraněním karbokationtů, které vznikají při prvním plnění TFA během deblokační reakce. To může být provedeno, protože omývací roztoky mohou být chlazeny a recyklovány nebo vyřazeny po jednom projití přes reaktor.

- Schopnost zmenšit velikost částic polymeru a ještě udržovat vysokou relativní rychlost toku do částice, která je ve stabilním lůžku, s poklesem tlaku, který je ovlivnitelný volně rotujícím neponořeným košem.

- Zlepšené rychlosti přenosu reaktantů mezi kapalinou a aktivními místy uvnitř polymeru, protože preaktivace polymeru zahrnuje odstranění DCU filiací.

·«· · · · · · ·

4 4 9 · * · 94 9 9 ·

9 9 9 4 9 9 9

9994 99 999 9999 94 49

- Kratší a více kontrolované doby kontaktu kapaliny s neponořeným košem a rychlejší filtrační doby, jejichž výsledkem je kratší doba cyklu a více kontrolovaná doba expozice TFApeptidpolymeru.

- Odstranění frit, které se mohou zlomit nebo být blokovány fragmenty polymeru nebo nerozpustnými vedlejšími produkty. Jak bylo popsáno výše, frita byla nahrazena perforovanou stěnou 23 koše 17.

- Mnohem lépe fungující omývání, protože polymer může být točen relativně suchý mezi jednotlivými omýváními a první část následujícího roztoku může být vyřazena spíše než recyklována. To má vliv na rychlé očištění polymeru od předešlého roztoku.

- Přizpůsobení zmenšování a zvětšování polymerního lůžka jednotné vrstvě koše. Na rozdíl od trubkových reaktorů je poměr objemu polymerního lůžka k filtrační ploše (to znamená stěně koše) malý.

Tento popis je uveden pouze pro ilustrativní účely a není úmyslně omezen. Změny v rámci připojených nároků mohou být jasné těm, kteří se daným stavem techniky zbývají. Například DIC může být nahrazen DCC jako aktivačním činidlem. Použitím DIC nevznikají nerozpustné vedlejší produkty (takové jako DCU), které by zahltily polymer. Použití DIC jako aktivačního činidla tedy odstraňuje potřebu methanolových omývacích prostředků a preaktivaci, což sníží celkovou dobu nezbytnou pro syntézu peptidu. Přípravná nádrž 3 může být odstraněna ze systému a všechny roztoky mohou být připravovány v přechovávači nádrži 5. To by vyžadovalo, aby kontrolní zařízení spojená s přípravnou nádrží byly spojeny s přechovávači nádrží, a aby filtr FI byl umístěn v potrubí 11 nebo ve filtrační smyčce na potrubí 11. Ačkoliv koš rotuje horizontálně na vertikální ose, mohl by být rotován na horizontální ose, tak že koš je na této straně, nebo by mohl být rotován dokonce na skloněné ose (to znamená pod úhlem méně něž 90° od vertikální osy). Tyto příklady jsou pouze ilustrační.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob vyznačující se tím, že je prováděna syntéza peptidu na pevné fázi v reaktorovém systému 1, reaktorový systém 1 obsahující reaktor 7 pro syntézu, který má vnitřní prostor 15, koš 17 umístěný ve vnitřním prostoru a mající porézní stěnu 23, koš rotovatelný kolem osy, koš mající menší průměr, než vnitřní prostor, koš a vnitřní prostor vymezující prostor 18 mezi vnějším povrchem koše a vnitřním povrchem vnitřního prostoru; způsob vyznačující se tím, že zahrnuje koš rotovatelný požadovanou rotační rychlostí, dodávající tekutý polymer do rotovaného reaktorového koše, aby došlo k vytvoření vrstvy R skutečně jednotně silné na stěně koše, dodávající deblokační roztok do rotovaného koše, aby došlo k odblokování N-konce peptidu vázaného na polymer, dodávající jeden nebo více omývací roztoky do rotovaného koše, aby došlo k omytí deblokačního roztoku z vrstvy, dodávající roztok následující aminokyseliny, která má být připojena k peptidovému řetězci, a vazebné činidlo do rotovaného koše, aby došlo k připojení následující aminokyseliny k peptidovému řetězci, opakování kroků (c) - (d) dokud není peptidový řetězec kompletní; způsob vyznačují se tím, že deblokační roztok, omývací roztok, roztok aminokyseliny a roztok vazebného činidla jsou zaváděny do rotovaného koše takovou rychlostí, že dodávané roztoky se nebudou hromadit ve vnitřním prostoru reaktoru a zaplavovat koš, koš je v nezaplaveném stavu během každého kroku syntézy peptidu.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje krok vázání první aminokyseliny požadované sekvence peptidu na aktivní místo polymeru, aby vznikla vazba peptid-polymer.
3. 3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že polymer je tvořen styrenovými kuličkami.
4. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že tyto kuličky mají průměr menší než 100 pm a jsou prokřížené z 0,2 % až 1,5 %.
5. 5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok rotování koše zahrnuje rotování koše rychlostí dostatečně velkou k vytvoření dostatečně velkých odstředivých sil, které udrží vrstvu polymeru proti stěně koše.
6. 6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že koš je rotován rychlostí dostatečnou pro získání odstředivé síly na vnitřním povrchu koše nejméně 10 g.
7. 7. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že reaktorový systém zahrnuje přechovávači nádrž 5, reaktor 7 mající výstup z vnitřního prostoru pro dopravu kapaliny prvním potrubím 13 ke vstupu do přechovávači nádrže, přechovávači nádrž mající výstup pro dopravu kapaliny druhým potrubím 11 ke vstupu 27 do reaktoru, reaktor a první a druhé potrubí vymezující okruh, kroky dodávající roztoky do reaktoru zahrnující krok dodávky roztoku do přechovávači nádrže 5

   9 4

   4 · ♦ * · 44 44 • 44 4 444 4 4 · 4 4

   444 4 · 4444 a pak transportující roztok do reaktoru, roztok, který je tlačen přes vrstvu do reaktorového prostoru 18, roztok vracející se do přechovávači nádrže 5 prvním potrubí 13.
8. 8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že krok dodávající roztok do rotujícího koše zahrnuje cirkulaci roztoku okruhem po určenou dobu.
9. 9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje krok podstatného vyčištění prvního roztoku z reaktorového systému před zavedením druhého roztoku do reaktoru.
10. 10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že přechovávači nádrž 5 může být propojena se sběrníkem, čistící krok zahrnuje krok transportu nějakého roztoku z reaktoru 7 do přechovávači nádrže 5, přechovávači nádrž 5 propojená se sběrníkem a odvádí obsah přechovávači nádrže 5 do sběrníku, transportní krok zahrnující rotování koše předurčenou rychlostí po určenou dobu cirkulace proběhl před tím než zavedení druhého roztoku začalo.
11. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že první potrubí 13 může být propojeno se sběrníkem, krok čištění prvního roztoku z reaktorového systému dále zahrnuje krok propojení prvního potrubí se sběrníkem po předem určenou dobu během kroku dodávání druhého roztoku do reaktoru.
12. 12. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje krok kontrolování teploty roztoků.
13. 13. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok budování vrstvy zahrnuje budování vrstvy tloušťky mezi 2 cm a 6 cm.
14. 14. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje krok preaktivování aminokyseliny před dodáním aminokyseliny do reaktoru.
15. 15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že zahrnuje krok filtrování roztoku preaktivované aminokyseliny, aby byly z roztoku odstraněny nerozpustné vedlejší produkty před jeho dodáním do reaktoru.
16. 16. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že reaktorový systém zahrnuje filtr umístěný mezi reaktor 7 a přechovávači nádrž 5, způsob zahrnuje krok filtrování roztoku během jeho transportu okruhem.
17. 17. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že kroky dodávání roztoků do reaktoru zahrnují rozprašování roztoků tryskou na vrstvu polymeru.
18. 18. Použití reaktorového systému vyznačující se tím, že je prováděna syntéza peptidu na pevné fázi, reaktorový systém zahrnující reaktor 7, který má vnitřní prostor 15 se vstupem a výstupem a rotovatelný koš 17 obsažený uvnitř vnitřního prostoru, koš mající porézní boční stěnu 23, na které je vytvářena vrstva polymeru, přechovávači nádrž 5, do které jsou zaváděny roztoky pro syntézu peptidu, přechovávači nádrž se vstupem a výstupem, výstup z reaktoru, který je propojen se vstupem do přechovávači nádrže prostřednictvím prvního potrubí 13 a výstup z přechovávači « · • · * v ·» ♦ · · • *· · · · · · · ·· · on · ·♦ *····· zy » · · « « *#····· • · · ·« » · 9

    9 9 9 9 99 999 9999 «· «» nádrže, který je propojen se vstupem do reaktoru prostřednictvím druhého potrubí 11, reaktorový systém je schopný udržovat reaktorový koš 17 v nezaplaveném stavu takovém, že roztok reaktorový koš nezaplavuje.
19. 19. Použití reaktorového systému podle nároku 18 vyznačující se tím, že zahrnuje prostředky pro skutečné očištění reaktorového systému od prvního roztoku použitého při syntéze peptidů před druhým roztokem přidávaným do systému.
20. 20. Použití reaktorového systému podle nároku 19 vyznačující se tím, že zahrnuje sběrník a první ventil V2 v potrubí 11, první ventil V2 je selektivně přepínatelný mezi první polohou, při které roztok opouštějící přechovávači nádrž vstupuje do reaktoru a druhou polohu, při které roztok opouštějící přechovávači nádrž přechází do sběrníku, čistící prostředky zahrnují reaktor, přechovávači nádrž a ventil, reaktorový koš je rotován po té co je cyklus roztoku hotový tak, že roztok zbylý v koši přechází do přechovávači nádrže a obsah přechovávači nádrže je pak odveden do sběrníku přes první ventil.
21. 21. Použití reaktorového systému podle nároku 20 vyznačující se tím, že čistící prostředky dále zahrnují druhý ventil V4 v prvním potrubí 13, druhý ventil je selektivně přepínatelný mezi první polohou, při které je výstup z reaktoru propojen s přechovávači nádrží a druhou polohou, při které je výstup z reaktoru propojen se sběrníkem, systém je provozován tak, že druhý ventil je přepnut do druhé polohy na předem určenou dobu během dodávání druhého roztoku do reaktoru.
22. 22. Použití reaktorového systému podle nároku 18 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravnou nádrž 3 propojenou s reaktorem a přechovávači nádrž a ventil VI schopný selektivně vést obsah přípravné nádrže jedné přechovávači nádrže a reaktoru.
23. 23. Použití reaktorového systému podle nároku 22 vyznačující se tím, že tekutý polymer je připravován v přípravné nádrži, ventil VI schopný dopravit tekutý polymer do reaktoru, reaktor obsahující vstupní trubku pro tekutý polymer.
24. 24. Použití reaktorového systému podle nároku 23 vyznačující se tím, že vstupní trubka pro tekutý polymer zavádí tekutý polymer na stěnu reaktorového koše.
25. 25. Použití reaktorového systému podle nároku 24 vyznačující se tím, že zahrnuje rozprašovač, který usnadňuje formování polymerního lůžka na stěně reaktoru, které je skutečně jednotné tloušťky a hladkosti.
26. 26. Použití reaktorového systému podle nároku 22 vyznačující se tím, že roztoky aminokyselin jsou preaktivovány v přípravné nádrži, aminokyseliny jsou dopravovány do přechovávači nádrže ventilem.