CZ339097A3 - Genetické sekvence a proteiny týkající se Alzheimerovi choroby a jejich použití - Google Patents

Genetické sekvence a proteiny týkající se Alzheimerovi choroby a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ339097A3
CZ339097A3 CZ973390A CZ339097A CZ339097A3 CZ 339097 A3 CZ339097 A3 CZ 339097A3 CZ 973390 A CZ973390 A CZ 973390A CZ 339097 A CZ339097 A CZ 339097A CZ 339097 A3 CZ339097 A3 CZ 339097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
presenilin
protein
seq
sequence
group
Prior art date
Application number
CZ973390A
Other languages
English (en)
Inventor
George-Hyslop Peter H. St.
Paul E. Fraser
Johanna M. Rommens
Original Assignee
Hsc Research And Development Limited Partnership
The Governing Council Of The Iniversity Of Toronto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/431,048 external-priority patent/US6531586B1/en
Priority claimed from US08/496,841 external-priority patent/US6210919B1/en
Application filed by Hsc Research And Development Limited Partnership, The Governing Council Of The Iniversity Of Toronto filed Critical Hsc Research And Development Limited Partnership
Publication of CZ339097A3 publication Critical patent/CZ339097A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/60—New or modified breeds of invertebrates
    • A01K67/61—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic or polyploid
    • A01K67/63—Genetically modified worms
    • A01K67/64—Genetically modified nematodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/60—New or modified breeds of invertebrates
    • A01K67/61—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic or polyploid
    • A01K67/65—Genetically modified arthropods
    • A01K67/68—Genetically modified insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/703—Worms, e.g. Caenorhabdities elegans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)

Description

Genetické sekvence a proteiny týkající se Alzheimerovi choroby a jejich použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká oblasti neurologických a fyziologických dysfunkcí asociovaných s Alzheimerovou chorobou. Přesněji, vynález se týká identifikace, izolace a klonování genů, které jsou asociovány s Alzheimerovou chorobou, stejně jako jejich transkriptů, genových produktů, asociovaných informací o sekvenci, a příbuzných genů. Předkládaný vynález se také týká metod pro detekci a diagnostiku nosičů normálních a mutovaných alel těchto genů, metod pro detekci a diagnostiku Alzheimerovy choroby, metod pro identifikaci genů a proteinů týkajících se nebo interagujících s Alzheimerovými geny a proteiny, metod pro vyšetřování potenciálních léčiv pro léčbu Alzheimerovy choroby a buněčných linií a zvířecích modelů použitelných pro hodnocení potenciálně použitelných terapií Alzheimerovy choroby.
Dosavadní stav techniky
Pro usnadnění odkazů na různé časopisové články je seznam článků uveden na konci této přihlášky.
Alzheimerova choroba (AD) je degenerativní onemocnění lidského centrálního nervového systému charakterizované progresivním narušením paměti a snížením kognitivních a intelektuálních funkcí ve středním až pozdním věku (Katzman, 1986). Choroba je doprovázena souborem neuropatologických charakteristik, kde hlavními jsou přítomnost extracelulárního • · · • · · • · · · • · ··· · · · ·· * amyloidu nebo senilních plaků a neurofibrilární degenerace neuronů. Etiologie onemocnění je komplexní, ačkoliv u některých rodin se zdá být dědičná autosomálně dominantním způsobem. Nicméně, i mezi těmito dědičnými formamy AD existují alespoň tři různé geny, které udělují dědičnou náchylnost k tomuto onemocnění (St. George-Hyslop et al., 1990). e4 (C112R) alelový polymorfismus genu pro Apolipoprotein E (ApoE) byl asociován s AD v signifikantním počtu případů s nástupem v pozdním věku (Saunders et al., 1993; Strittmatter et al., 1993). Podobně, velmi malá část familiárních případů s nástupem před 65 rokem věku byla asociována s mutacemi genu pro β-amyloid prekursorový protein (APP) (Chartier-Harlin et al., 1991; Goate et al., 1991; Murrell et al., 1991; Karlínsky et al., 1992; Mullan et al., 1992). Třetí lokus (AD) asociovaný s velkou částí případů s časným nástupem AD byl nedávno mapován na chromosomu 14q24.3 (Schellenberg et al., 1992; St. George-Hyslop et al., 1992; Van Broeckhoven et al., 1992).
Ačkoliv 14q region chromosomu nese několik genů, které mohou být považovány za kandidáty genů pro umístění mutací asociovaných s AD3 (např. cFOS, alfa-l-chymotrypsin akathepsin G), většina z těchto kandidátů genů byla vyloučena na základě jejich fyzického umístění mimo AD3 region a/nebo absence mutací v jejich příslušných otevřených čtecích rámečcích (Schellenberg et al., 1992; Van Broeckhoven et al., 1992; Rogaev et al., 1993; Wong et al., 1993).
Existuje několik směrů vývoje a komerčních zaměření nebo strategií s ohledem na léčbu Alzheimerovy choroby a její diagnostiky. Publikovaná PCT přihláška WO94 23049 popisuje transfekci DNA o vysoké molekulové hmotnosti do specifických • · · · · · myších buněk. Tato metoda může být použita pro analýzu velkých genových komplexů. Například, transgení myš může mít zvýšenou dávku APP genu, což napodobuje trisomický stav, který převládá u Downova syndromu, a umožňuje generování zvířecích modelů s β-amyloidosou podobnou té, která převažuje u jedinců s Alzheimerovou chorobou. Publikovaná mezinárodní přihláška WO 94 00569 popisuje transgení non-lidská zvířata nesoucí velké transgeny jako je transgen obsahující lidský APP gen. Takové zvířecí modely mohou poskytnout užitečné modely lidských genetických onemocnění, jako je Alzheimerova choroba.
Kanadská patentová přihláška č. 2096911 popisuje nukleovou kyselinu kódující APP-štěpící proteasu, která je asociována s Alzheimerovou chorobou a Downovým syndromem. Genetická informace, která byla izolována z chromosomu 19, může být použita pro diagnosu Alzheimerovy choroby. Kanadská patentová přihláška č. 2071105 popisuje detekci a léčbu dědičné nebo získané Alzheimerovy choroby za použití YAC nukleotidových sekvencí. YAC jsou identifikovány čísly 23CB10, 28CA12 a 26FF3.
U.S. patent 5297562 popisuje detekci Alzheimerovy choroby asociované s trisomií chromosomu 21. Léčba zahrnuje metody pro redukci proliferace trisomie chromosomu 21. Kanadská patentová přihláška č. 2054302 popisuje monoklonální protilátky, které rozpoznávají jaderný protein lidských mozkových buněk kódovaný na chromosomu 21 a které jsou použity pro detekci změn exprese během Alzheimerovy choroby nebo Downova syndromu. Monoklonální protilátka je specifická pro protein kódovaný lidských chromosomem 21 a je nacházena ve velkých pyramidálních buňkách lidské mozkové tkáně.
Oblast vynálezu
Předkládaný vynález je částečně založen na identifikaci, izolaci, klonování a sekvencování dvou savčích genů, které byly označeny presenilin-1 (PSI) a presenilin-2 (PS-2). Tyto dva geny, a jejich korespondující proteinové produkty, jsou členy vysoce konzervované rodiny genů, presenilinů, s homology nebo orthology u jiných savčích druhů (např. myší, krys) stejně jako orthology u bezobratlých (např., C. elegans, D. melanogaster). Mutace v těchto genech jsou spojeny u lidí s vývojem forem familiární Alzheimerovy choroby a mohou být příčinnou i jiných onemocnění (např. jiných kognitivních, intelektuálních, neurologických nebo psychologických onemocnění jako je mozkové krvácení, schizofrenie, deprese, mentální retardace a epilepsie). Předkládaný vynález poskytuje genomovou a cDNA nukleotidovou sekvenci pro lidský PSI (hPSl) a lidský PS2 (hPS2) gen, myší PSI homolog (mPSl) a příbuzné geny od C. elegans )sel-12, Spe-4) a D. melanogaster (DmPS). Vynález také poskytuje předpokládané aminokyselinové sekvence presenilin proteinů kódovaných těmito geny a strukturální charakterizaci presenilinů, včetně putativních funkčních domén a antigeních determinant. Množství mutací presenilinů, které jsou příčinou Alzheimerovy choroby (AD) u lidí je také popsáno a uvedeno do vztahu k funkčním doménám proteinu.
Tak v jedné sérii provedení předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny včetně sekvencí nukleotidů obsahující nebo odvozené od genu pro presenilin a/nebo kódující polypeptidy obsahující nebo odvozené od presenilin proteinů. Presenilin sekvence podle předkládaného vynálezu obsahují specificky popsané sekvence, sestřižené varianty těchto sekvencí, alelické varianty těchto sekvencí, synonymní sekvence a homologní nebo orthologní varianty těchto sekvencí. Tak například vynález poskytuje genomové a cDNA sekvence hPSl genu, hPS2 genu, mPSl genu a DmPS genu. Předkládaný vynález také poskytuje alelické varianty a homologní nebo orthologní sekvence poskytnutím metod, kterými mohou být takové varianty rutině získány. Předkládaný vynález také specificky poskytuje mutantní nebo onemocnění způsobující varianty presenilinů popsáním mnoha specifických mutantních sekvencí a poskytnutím metod, kterými mohou být takové varianty rutině získány. Protože nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro různé diagnostické, terapeutické a rekombinantní aplikace, jsou také poskytnuty různé podsady sekvencí pro preseniliny a kombinace sekvencí pro preseniliny s heterologními sekvencemi. Například, pro použití alelicky specifickém hybridizačním vyšetření nebo technikách PCR amplifikace, podsada podsady sekvencí pro preseniliny, včetně sense a antisense sekvencí a včetně normálních a mutovaných sekvencí, stejně jako intronových, exonových a netranslatovaných sekvencí, jsou také poskytnuty. Takové sekvence mohou obsahovat malý počet sousedních nukleotidů ze sekvencí, které jsou popsány nebo jinak zde podány, ale preferovaně obsahují alespoň 8-10, lépe 9-25 sousedících nukleotidů ze sekvence pro presenilin. Jiné preferované podsady sekvencí pro presenilin zahrnují ty, které kódují jednu nebo více funkčních domén nebo antigeních determinant presenilinovych proteinů, zejména mohou obsahovat bud' normální (divokého typu) nebo mutantní sekvence. Vynález také poskytuje různé konstrukty nukleových kyselin ve kterých jsou sekvence pro presenilin, buď kompletní nebo podsady, operativně připojeny na exogení sekvence za tvorby klonovacích vektorů, fúsních vektorů, transgeních konstruktů, a podobně. Tak, podle jiného aspektu vynález je • · ··· · poskytnut rekombinantní vektor pro transformaci buněk tkáně savců nebo bezobratlých pro expresi normální nebo mutované sekvence pro presenilin.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález hostitelské buňky, které byly transfektovány nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu. Buňky mohou být transformovány prostě za účelem propagace konstruktů nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu, nebo mohou být transformovány tak, aby exprivovaly sekvence pro presenilin. Transformované buňky podle předkládaného vynálezu mohou být použity v testech pro identifikaci proteinů a/nebo jiných sloučenin, které ovlivňují normální nebo mutantni expresi presenilinu, které interagují s normálními nebo mutantními presenilinovými proteiny a/nebo které modulují funkci nebo účinek normálních nebo mutantních proteinů, nebo pro produkci presenilinových proteinů, fúsních proteinů, funkčních domén, antigeních determinant a/nebo protilátek podle předkládaného vynálezu. Transformované buňky mohou také být implantovány do hostitele, včetně člověka, pro terapeutické nebo jiné účely. Preferované hostitelské buňky zahrnují savčí buňky z neuronálních, fibroblastových, splenických, organotypických, smíšených kultur, nebo z kultur kostní dřeně, stejně jako bakteriální, kvasinkové, nematodní, hmyzí a jiné buňky bezobratlých. Pro použití popsané dále preferované buňky také zahrnují ebryonální kmenové buňky, zygoty, gamety, a buňky zárodečné linie.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález modely transgeních zvířat pro AD a j iné choroby nebo onemocnění asociované s mutacemi v genech pro presenilin. Zvířata mohou *Ί ······· / ············ • · · · · · • · · ·· ··· ··· · · · být savci, včetně krys, myší, křečků, morčat, králíků, psů, koček, ovcí, prasat, a non-lidských primátů. Kromě toho, modely bezobratlých, včetně hlístů a hmyzu, mohou být použity pro určité aplikace. Zvířecí modely jsou produkovány standartními transgeními metodami včetně mikroinjekce, transfekce, nebo jiných forem transformace embryonálních kmenových buněk, zygot, gamet a buněk zárodečné linie vektory obsahujícími genomové nebo cDNA fragmenty, minigeny, homologní rekombinantní vektory, virové inserční vektory a podobně. Vhodné vektory zahrnují virus vakcinie, adenovirus, adeno asociovaný virus, retrovirus, liposomový transport, neuraltropní virus a Herpes simplex virus. Zvířecí modely mohou obsahovat transgení sekvence obsahující nebo odvozené od presenilinů, včetně normálních a mutantních sekvencí, intronových, exonových a netranslatovaných sekvencí, a sekvencí kódujících podsady presenilinů jako jsou funkční domény. Hlavní typy poskytovaných zvířecích modelů j sou:
1) Zvířata, u kterých byl normální gen pro lidský presenilin rekombinantně zaveden do genomu zvířete jako další gen, pod regulací buď exogeního, nebo endogeního promotorového elementu a a buď jako minigen, nebo jako velký genomový fragment; kde normální gen pro lidský presenilin byl rekombinantně substituován za jednu nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin homologní rekombinací nebo zaměřením genu; a/nebo kde jedna nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin byly rekombinantně humanizovány částečnou substitucí sekvencí kódujících lidský homolog homologní rekombinací nebo zaměřením genu.
2) Zvířata, u kterých byl mutantní gen pro lidský presenilin • · · ·· · rekombinantně zaveden do genomu zvířete jako další gen, pod regulací buď exogeního, nebo endogeního promotorového elementu a buď jako minigen, nebo jako velký genomový fragment; kde mutantní gen pro lidský presenilin byl rekombinantně substituován za jednu nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin homologní rekombinací nebo zaměřením genu; a/nebo kde jedna nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin byly rekombinantně humanizovány částečnou substitucí sekvencí kódujících lidský homolog homologní rekombinací nebo zaměřením genu.
3) Zvířata, u kterých byla mutantní verse jedno ze zvířecích genů pro presenilin rekombinantně zavedena do genomu zvířete jako další gen, pod regulací buď exogeního, nebo endogeního promotorového elementu a buď jako minigen, nebo jako velký genomový fragment; a/nebo kde byla mutantní verse jedno ze zvířecích genů pro presenilin rekombinantně substituována za jednu nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin homologní rekombinací nebo zaměřením genu;
4) Knock-out zvířata, u kterých byla jedna nebo obě kopie genu pro zvířecí presenilin parciálně nebo kompletně deletována homologní rekombinací nebo zaměřením genu, nebo byla inaktivována insercí nebo substitucí exogení sekvence homologní rekombinací nebo zaměřením genu. V preferovaných provedeních má transgení myší model pro JUD transgen kódující normální lidský PSI nebo PS2 protein, mutantní lidský nebo myší PSI nebo PS2 protein, nebo humanizovaný normální nebo mutantní myší PSI nebo PS2 protein.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález v podstatě čisté proteinové přípravky včetně polypeptidů obsahujících nebo odvozených od presenilinových proteinů. Proteinové sekvence presenilinu podle předkládaného vynálezu zahrnují specificky popsané sekvence, varianty teěchto sekvencí vzešlé z alternativního sestřihu mRNA, alelické varianty těchto sekvencí a homologní nebo orthologní varianty těchto sekvencí. Tak například, předkládaný vynález poskytuje aminokyselinové sekvence hPSl proteinu, mPSl proteinu a DmPS proteinu. Předkládaný vynález také poskytuje alelické varianty a homologních nebo orthologních proteinů poskytnutím metod, kterými mohou být takové varianty rutině získány. Předkládaný vynález také specificky poskytuje mutantní nebo onemocnění způsobující varianty presenilinů popsáním mnoha specifických mutantních sekvencí a poskytnutím metod, kterými mohou být takové varianty rutině získány. Protože proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro různé diagnostické, terapeutické a rekombinantní aplikace, jsou také poskytnuty různé podsady proteinových sekvencí pro preseniliny a kombinace proteinových sekvencí pro preseniliny s heterologními sekvencemi. Například, pro použití jako imunogen nebo v testech vazby, podsady proteinových sekvencí pro preseniliny, včetně včetně normálních a mutovaných sekvencí jsou také poskytnuty. Takové proteinové sekvence mohou obsahovat malý počet sousedních aminokyselinových zbytků ze sekvencí, které jsou popsány nebo jinak zde podány, ale preferovaně obsahují alespoň 4-8, lépe 9-15 sousedících aminokyselinových zbytků z presenilinové sekvence. Jiné preferované podsady proteinových sekvencí pro presenilin zahrnují ty, které kódují jednu nebo více funkčních domén nebo antigeních determinant presenilinových proteinů a zejména mohou obsahovat normální (divokého typu) nebo mutantní sekvence.
Vynález také poskytuje různé proteinové konstrukty, buď kompletní nebo podsady, připojené na exogení sekvence za tvorby fúsních proteinů a podobně. Tak, podle tohoto aspektu vynálezu je také poskytnuta metoda pro produkci všech výše popsaných proteinů, které obsahují, nebo jsou odvozeny od presenilinů.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález produkci a použití polyklonálních a monoklonálních protilátek, včetně fragmentů protilátek, včetně Fab fragmentů, F(ab')2 a jednořetězcových fragmentů protilátek, které se selektivně vážou na preseniliny, nebo na specifické antigení determinanty presenilinů. Protilátky mohou být získány od myší, králíků, koz nebo jiných vhodných zvířat, nebo mohou být produkovány rekombinantně v kultivovaných buňkách jako jsou hybridomní buněčné linie. Preferovaně jsou protilátky namířeny proti sekvencím pro presenilin obsahujícím alespoň 4-8, lépe 9-15 sousedních aminokyselinových zbytků ze sekvence pro presenilin. Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity v různých diagnostických, terapeutických a technických aplikacích, které jsou zde popsány.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody pro vyšetřování a identifikaci proteinů, malých molekul nebo jiných sloučenin, které jsou schopné indukce nebo inhibice exprese genů pro presenilin a jejich proteinů (např. PSI nebo PS2). Testy mohou být provedeny in vitro za použití netransformovaných buněk, imortalizovaných buněčných linií nebo rekombinantních buněčných linií, nebo in vivo za použití transgeních zvířecích modelů zde popsaných. Jednotlivě, testy mohou detekovat přítomnost zvýšené nebo snížené exprese PSI, PS2 nebo jiných genů ve vztahu k presenilinů, zvýšené nebo ·· ···· snížené hladiny proteinových produktů ve vztahu k presenilinu nebo zvýšené nebo znížené hladiny exprese markerových genů (např. β-galaktosidasy, zeleného fluorescentního proteinu, alkalické fosfatasy nebo luciferasy) operativně vázaných na presenilinový 5' regulační region v rekombinantním konstruktu. Buňky, o kterých je známo, že exprivují určitý presenilin, nebo transformované tak, aby exprivovaly určitý presenilin, jsou inkubovány a jedna nebo více testovaných sloučenin je přidána do media. Po dostatečné časové periodě (např. 0-72 hodin) umožňující indukci nebo inhibici exprese presenilinu sloučeninou, je jakákoliv změna v hladině exprese vzhledem k stanovené základní expresi detekována za použití jakékoliv techniky popsané výše. V zejména preferovaných provedeních jsou buňky z imortalizovaných buněčných linií jako je lidská neurobíastomová, glioblastomová nebo hybridomní buněčná linie, nebo to jsou transformované buňky podle předkládaného vynálezu.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody pro identifikaci proteinů a jiných sloučenin, které se váží na, nebo jinak přímo interagují s preseniliny. Proteiny a sloučeniny budou zahrnovat endogenní buněčné složky, které interagují s preseniliny in vivo a které proto poskytují nové cíle pro famaceutické a terapeutické intervence, stejně jako rekombinantní, syntetické a jiné exogení sloučeniny, které mohou mít vazebnou kapacitu pro presenilin a proto mohou být kandidáty pro farmaceutická agens. Tak, v jedné sérii provedení, buněčné lysáty nebo homogenizáty tkáně (např.homogenizáty mozkové tkáně, lymfocytární lysáty) mohou být vyšetřovány na proteiny a jiné sloučeniny, které se váží na normální nebo mutované preseniliny. Alternativně, mnoho různých exogeních sloučenin, jak přirozeně se vyskytujících, tak • · ······ ·· ·· · · · • · · · ♦ • · · · · · · • · · · ··· ··· ·· · * ·
• · · syntetických (např. knihovny malých molekul nebo peptidů) mohou být vyšetřovány na vazebnou kapacitu pro presenilin. V každém z těchto provedení je test proveden na detekování vazby mezi presenilínovou složkou a nějakou jinou skupinou.
presenilinová složka v těchto testech může být jakýkoliv polypeptid obsahující nebo odvozený od normálního nebo mutovaného presenilinového proteinu, včetně funkčních domén nebo antigeních determinant presenilinů, nebo presenilinových fúsních proteinů. Vazba může být detekována nespecifickými měřeními (např. změnou intracelulárního Ca2*, poměru GTP/GDP) nebo specifickými měřeními (např. změnami v Αβ produkci peptidů nebo změnou exprese jiných downstream genů, která může být detekována různými testy, 2D elektroforesou, různou hybridizací nebo SAGE metodou). Preferované metody obsahují variace následujících technik:
1) přímé extrakce afinitní chromatografii;
2) ko-izolace složek presenilinů a navázaných proteinů nebo jiných sloučenin imunoprecipitací;
3) Biomolecular Interaction Assay (BIAcore); a
4) kvasinkových dvou-hybridních systémů.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody pro identifikaci proteinů, malých molekul a jiných sloučenin, které jsou schopny modulace aktivity normálních nebo mutovaných presenilinů. Za použití normálních buněk nebo zvířat, transformovaných buněk a modelů transgeních zvířat podle předkládaného vynálezu, nebo buněk získaných od subjektů nesoucích normální nebo mutované geny pro presenilin poskytuje předkládaný vynález metody pro identifikaci takových sloučenin na základě jejich schopnosti ovlivňovat expresi presenilinů, intracelulární lokalizaci presenilinů, intracelulární hladiny
Ca2*, Na*, K* nebo jiných iontů nebo jejich metabolismus, výskyt nebo stupeň apoptosy nebo buněčné smrti, hladiny nebo stav AE produkce peptidů, přítomnost nebo hladiny fosforylace s mikrotubuly asociovaných proteinů nebo fyziologické markéry, které odlišují buňky nesoucí normální a mutované sekvence pro presenilin. Za použití transgeních zvířat podle předkládaného vynálezuje metoda pro identifikaci takových sloučenin poskytnuta na základě schopnosti sloučeniny ovlivňovat behaviorální, fyziologické nebo histologické fenotypy asociované s mutacemi presenilinů.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody pro vyšetření nosičů presenilinových alel asociovaných s AD. Pro diagnosu obětí AD, a pro vyšetření a diagnosu příbuzných presenilních a senilních demencí, psychiatrických onemocnění jako je schizofrenie a deprese a neurologických onemocnění jako je iktus a mozkové krvácení, které jsou asociovány s mutacemi v PSI nebo PS2 genech. Vyšetření a/nebo diagnosa může být provedena metodami založenými na nukleových kyselinách (včetně genomové a mRNA/cDNA sekvencích), proteinech, a/nebo protilátkách zde popsaných a daných, včetně funkčních testů pro detekování selhání nebo zesílení normální aktivity presenilinů a/nebo přítomnosti specifických nových aktivit způsobených mutantními preseniliny. Tak jsou poskytnuta vyšetření a diagnostika založené na presenilinových proteinech, které detekují rozdíly mezi mutantními a normálními preseniliny v elektroforetické mobilitě, vzorcích proteolytického štěpení, molárních poměrech různých aminokyselinových zbytků, ve schopnosti vázat se na specifickou protilátku. Kromě toho jsou poskytnuta vyšetření a diagnostika založená na nukleových kyselinách (gDNA, cDNA nebo mRNA), která detekují rozdíly v • · · · · ·
— „ · · · · ··· • · • · · · · sekvenci nukleotidů přímým sekvencováním nukleotidů, hybridizací za použití alelově specifických nukleotidů, trávení restrikčními enzymy a mapování (např. RFLP, REF-SSCP), elektroforetické mobility (např. SSCP, DGGE), PCR mapování, RNAsové ochraně, chemickým chybným štěpením, ligasou zprostředkovanou detekcí a různými jinými metodami. Jsou poskytnuty také jiné metody, které detekují abnormální zpracování PSI, PS2, APP nebo proteinů reagujících s PSI, PS2 nebo APP (např. abnormální fosforylace, glykosylace, amidace nebo proteolytické štěpení), alterace v presenilinové transkripci, translaci a posttranslační modifikaci; alterace v intracelulárním nebo extracelulárnímpřepravě presenilinového genového produktu; nebo abnormální intracelulární lokalizaci presenilinů. V souladu s těmito provedeními jsou také poskytnuty diagnostické kity, které budou obsahovat reagens nezbytná pro výše popsaná diagnostická vyšetření.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody a farmaceutické přípravky pro použití v léčbě s preseniliny asociovaných onemocnění jako je AD. Tyto metody a farmaceutické přípravky jsou založeny na:
1) podání normálních PSI nebo PS2 proteinů,
2) genové terapii normálními PSI nebo PS2 geny pro kompenzaci nebo náhradu za mutantní geny,
3) genové terapii založené na antisense sekvencích k mutantním PSI nebo PS2 genů, které vyřadí mutantní geny,
4) genové terapii založené na genech, které kódují protein, který blokuje nebo koriguje poškozující účinek PSI nebo PS2 mutantů,
5) imunoterapii založené na protilátkách k normálním a/nebo mutantním PSI nebo PS2 proteinům, nebo • · · · · · : .
. · · · · · ... ·· ··· ··· ·· ·
6) malých molekulách (léčivech), které pozměňují expresi Psi nebo PS2, blokují abnormální interakce mezi mutantními formami PSI nebo PS2 a jinými proteiny nebo ligandy, nebo které jinak blokují aberantní funkce mutantních PSI nebo PS2 proteinů změnou struktury mutantních proteinů, zvýšením jejich metabolické clearence nebo inhibicí jejich funkce.
V souladu s jiným aspektem předkládaného vynálezu mohou být proteiny podle předkládaného vynálezu použity jako počáteční bod pro racionální vývoj léčiv pro poskytnutí ligandů, terapeutických léčiv, nebo jiných typů malých chemických molekul. Alternativně, malé molekuly nebo jiné sloučeniny identifikované výše popsanými vyšetřovacími testy mohou sloužit jako vedoucí sloučeniny v racionálním vývoji léčiv.
Jednotlivé popsané nukleotidové a aminokyselinové sekvence podle předkládaného vynálezu jsou označeny SEQ ID NO: 1 - 25. Kromě toho, ve smyslu Budapešťské smlouvy, biologické deposita jednotlivých sekvencí nukleových kyselin zde popsaných mohou být označena ATCC (Rockville, MD). Tato deposita zahrnují přírůstkové číslo 97124 (uloženo 28.5.1995), přírůstkové číslo 97214 (uloženo 28.6.1995), a přírůstkové číslo 97428 (uloženo 26.1.1996).
Popis obrázků na přiložených výkresech
Obrázek 1: Tento obrázek je representací strukturální organizace hPSl genomové DNA. Nekódující exony jsou znázorněny vytečkovanými rámečky. Kódující exony jsou znázorněny prázdnými rámečky nebo šrafovánými rámečky pro alternativně připojené • · · · · · : . :
• · · · ··· ·· ··· ··· sekvence. Restrikční místa jsou: B = BamHI; E = EcoRi; H = HindlII; N = Notl; P = Pstl; V = PvuII; X = Xbal. Přerušení v horizontální linii mezi restrikčními místy representují nedefinované gnomové sekvence. Klonované genomové fragmenty obsahuj ící každý exon j sou znázorněny oboustranými horizontálními šipkami. Velikost genomových subklonů a přírůstková čísla pro každou genomovou sekvenci jsou také dány.
Obrázek 2: Tento obrázek representuje hydropatický graf putativního PSI proteinu. Graf byl kalkulován podle metody Kyte a Doolittle (1982).
Obrázek 3: Tento obrázek presentuje seřazení sekvence proteinových sekvencí hPSl a mPSl proteinu. Vertikální čárky ukazují identické aminokyseliny.
Obrázek 4: Tento obrázek presentuje seřazení sekvence proteinových sekvencí hPSl a hPS2 proteinu. Vertikální čárky ukazují identické aminokyseliny.
Obrázek 5: Tento obrázek je schematické znázornění předpokládané struktury PSI proteinu. Římské číslice ukazují transmembránové domény. Putativní glykosylační místa jsou ukázána hvězdičkou a většina fosforylačních míst je umístěna na stejné straně membrány jako dvě acidické hydrofilní smyčky. MAP kinasa místo je přítomno na zbytku 115 a PKC místo je na zbytku 114. FAD mutační místa jsou ukázána horizontálními šipkami.
Obrázek 6: Tento obrázek je schematické znázornění předpokládané struktury PS2 proteinu. Římské číslice ukazují transmembránové domény. Putativní glykosylační místa jsou ukázána hvězdičkou a většina fosforylačních míst je umístěna na stejné straně membrány jako dvě acidické hydrofilní smyčky. FAD mutační místa jsou ukázána horizontálními šipkami.
I. Definice
Pro usandnění přezkoumání různých provedení předkládaného vynálezu a pro pochopení různých elementů a složek použitých ve tvorbě a použití vynálezu jsou poskytnuty následující definice pro jednotlivé termíny použité v popisu a připojených nárocích.
Presenilin: Jak je zde použito bez další modifikace, znamená termín presenilin nebo preseniliny presenilin-1 (PSI) a/nebo presenilin-2 (PS2) geny/proteiny. Jednotlivě, nemodifikovaný termín presenilin nebo preseniliny označuje savčí PSI a/nebo PS2 geny/proteiny a preferovaně lidské PSI a/nebo PS2 geny/proteiny.
Presenilin-1 gen: Jak je zde použito, znamená termín presenilin-1 gen nebo PSI gen savčí gen prvně objevený a popsaný v U.S. přihlášce sériové č. 08/431048 podané 28.5.1995 a později popsaný Sherringtonem et al (1995), včetně alelických variant a heterospecifických savčích homologů. Jedna lidská presenilin-1 (hPSl) cDNA sekvence je zde popsaná jako SEQ ID NO: 1. Jiná lidská cDNA sekvence, vzešlá z alternativního sestřižení hPSl mRNA transkriptu, je zde popsána jako SEQ ID NO: 3. Kromě lidských sestřižených variant, jak je popsáno níže, bylo také nalezeno, ve kterém regionu kódujícím třicet tři zbytků může být sestřižena v nějakém transkriptu. cDNA myšího homologů (mPSl) je popsána jako SEQ ID • · · · · ·
NO: 16. Termín presenilin-1 gen nebo PSI gen se primárně týká kódující sekvence, ale může také zahrnovat některé nebo všechny sousední regulační regiony a/nebo introny. Termín PSI gen specificky zahrnuje arteficiální nebo rekombinantní geny vytvořené z cDNA nebo genomové DNA, včetně rekombinantních genů založených na sestřižených variantách. Presenilin - 1 gen byl také označován jako S182 gen (např. Sherrington et al., 1995) nebo jako Alzheimer Related Membrane Protein (ARMP) gen (např. U.S. přihláška sériové č. 08/431048 podaná 28.5.1995.
Presenilin-1 protein: Jak je zde použito, znamená termín presenilin-1 protein nebo PSI protein protein kódovaný PSI genem, včetně alelických variant a heterospecifických savčích homologů. Jedna lidská presenilin-1 (hPSl) proteinová sekvence je zde popsaná jako SEQ ID NO: 2. Jiná lidská proteinová sekvence, vzešlá z alternativního sestřižení hPSl mRNA transkriptu, je zde popsána jako SEQ ID NO: 4. Kromě lidských sestřižených variant, jak je popsáno níže, bylo také nalezeno, který region obsahující třicet tři zbytků může být sestřižen v nějakém transkriptu. Tyto varianty také spadají do termínu presenilin - 1 protein jak je zde použit. Proteinová sekvence myšího homologů (mPSl) je popsána jako SEQ ID NO: 17. Protein může být produkován rekombinantními buňkami nebo organismy, může být podstatně purifikován z přirozených tkání nebo buněčných linií nebo může být syntetizován chemicky nebo enzymaticky. Proto termín presenilin - 1 protein nebo PSI protein zahrnuje protein v glykosylované, částečně glykosylované nebo neglykosylované formě, stejně jako fosforylovanou, částečně fosforylovanou, nefosforylovanou, sulfatovanou, částečně sulfatovanou nebo nesulfatovanou formu. Termín také zahrnuje alelické varianty a jiné funkční ekvivalenty • · · · · ·
PSI aminokyselinové sekvence, včetně biologicky aktivních nebo jiných fragmentů. Tento protein byl také označován jako S182 protein (např. Sherrington et al., 1995) nebo jako Alzheimer
Related Membrane Protein (ARMP) (např. U.S. přihláška pořadové č.
08/431048 podaná 28.5.1995.
hPSl gen a/nebo protein. Jak je zde použito, znamená zkratka hPSl lidské homologní nebo alelické varianty PSI genu a/nebo proteinu. Dvě cDNA sekvence lidského PSi genu jsou zde uvedeny jako SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3. Korespondující hPSl proteinové sekvence jsou zde popsány jako SEQ ID NO: 2a SEQ ID NO: 4. Mnoho alelických variant, včetně poškozujících mutantů, je popsáno a dáno v popisu, který následuje.
mPSl gen a/nebo protein. Jak je zde použito, znamená zkratka mPSl myší homologní a myší alelické varianty PSI genu a/nebo proteinu. cDNA sekvence jednoho myšího PSI genu je zde uvedena jako SEQ ID NO: 16. Korespondující mPSl proteinová sekvence je zde popsána jako SEQ ID NO: 17 Alelické varianty, včetně poškozujících mutantů, jsou popsány a dány v popisu, který následuje.
Presenilin-2 gen: Jak je zde použito, znamená termín presenilin-2 gen nebo PS2 gen savčí gen prvně objevený a popsaný v U.S. přihlášce sériové č. 08/496841 podané 28.6.1995 a později popsaný Rogaevem et al (1995) a Levy-Lahadem et al. (1995), včetně alelických variant a heterospecifických savčích homologů. Jedna lidská presenilin-2 (hPS2) cDNA sekvence je zde popsaná jako SEQ ID NO: 18. U dalších lidských sestřižených variant, jak jsou popsány níže, bylo také nalezeno, ve kterém jednom kodonu nebo ·· ···· regionu kódujícím třicet tři zbytků může být sestřižena v nějakém transkriptu. Termín presenilin-2 gen nebo PS2 gen se primárně týká kódující sekvence, ale může také zahrnovat některé nebo všechny sousední regulační regiony a/nebo introny. Termín PS2 gen specificky zahrnuje arteficiální nebo rekombinantní geny vytvořené z cDNA nebo genomové DNA, včetně rekombinantních genů založených na sestřižených variantách. Presenilin - 2 gen byl také označován jako E5-1 gen (např. Rogaev et al., (1995); U.S. přihláška sériové č. 08/496841 podaná 28.6.1995) nebo STM2 gen (např. Levy-Lahad et al., (1995)).
Presenilin-2 protein: Jak je zde použito, znamená termín presenilin-2 protein nebo PS2 protein protein kódovaný PS2 genem, včetně alelických variant a heterospecifických savčích homologů. Jedna lidská presenilin-2 (hPS2) proteinová sekvence je zde popsaná jako SEQ ID NO: 19. U dalších lidských sestřižených variant, jak jsou popsány níže, bylo také nalezeno, ve kterém jednom zbytku nebo regionu obshujícím třicet tři zbytků může být sestřižena v nějakém transkriptu. Protein může být produkován rekombinantními buňkami nebo organismy, může být podstatně purifikován z přirozených tkání nebo buněčných linií nebo může být syntetizován chemicky nebo enzymaticky. Proto termín presenilin - 2 protein nebo PS2 protein zahrnuje protein v glykosylováné, částečně glykosylováné nebo neglykosylované formě, stejně jako fosforylovanou, částečně fosfory1ovanou, nefosforylovanou, sulfatovanou, částečně sulfatovanou nebo nesulfatovanou formu. Termín také zahrnuje alelické varianty a jiné funkční ekvivalenty PSI aminokyselinové sekvence, včetně biologicky aktivních nebo jiných fragmentů. Tento protein byl také označován jako E5-1 protein (např. Sherrington et al., 1995; U.S. přihláška pořadové
č. 08/496841 podaná 28.6.1995) nebo STM2 protein (např.
Levy-Lahad et al., (1995)).
hPS2 gen a/nebo protein. Jak je zde použito, znamená zkratka mPSl lidské homologní a lidské alelické varianty PS2 genu a/nebo proteinu. cDNA sekvence jednoho lidského PS2 genu je zde uvedena jako SEQ ID NO: 18. Korespondující hPS2 proteinová sekvence je zde popsána jako SEQ ID NO: 19. Mnoho alelických variant, včetně poškozujících mutantů, je popsáno a dáno v popisu, který následuje.
DmPS gen a/nebo protein. Jak je zde použito, znamená zkratka mPSl Drosophila homologní a alelické varianty PSI a PS2 genu a/nebo proteinu. Tato definice je chápána tak, že zahrnuje polymorfismus sekvencí nukleových kyselin a aminokyselin, kde substituce, inserce nebo delece genu nebo proteiné sekvence neovlivňují základní funkce genového produktu. Nukleotidová sekvence nebo jedna cDNA sekvence DmPS genu je zde uvedena jako SEQ ID NO: 20 a korespondující aminokyselinová sekvence je zde popsána jako SEQ ID NO: 21. Termín DmPS gen se primárně týká kódující sekvence, ale může také zahrnovat některé nebo všechny sousední regulační regiony a/nebo introny.
Normální: Jak je zde použito s ohledem na geny znamená termín normální gen, který kóduje normální protein. Jak je zde použito s ohledem na proteiny znamená termín normální protein, který provádí svou běžnou nebo normální fyziologickou roli a který není asociován s, nebo není příčinou patogeních stavů. Proto, jak je zde použito, termín normální je v podstatě synonymní s obvyklým významem fráze divokého typu.
·· ··<·
Pro jakýkoliv daný gen nebo korespondující protein může existovat mnoho normálních alelických variant, kde žádná z nich není asociována s vývojem patogeních stavů, takové normální alelické varianty zahrnují, ale nejsou omezeny na, varianty, ve kterých jedna nebo více substitucí nukleotidů nevede ke změně kódované sekvence aminokyselin.
Mutantní: Jak je zde použito s ohledem na geny znamená termín mutantní gen, který kóduje mutantní protein. Jak je zde použito s ohledem na proteiny znamená termín mutantní protein, který neprovádí svou běžnou nebo normální fyziologickou roli a který je asociován s, nebo je příčinou patogeních stavů. Proto, jak je zde použito, termín mutantní je v podstatě synonymní s termíny dysfunkční, patogení, onemocnění způsobující, a poškozující. S ohledem na presenilinové geny a proteiny podle předkládaného vynálezu označuje termín mutantní presenilinové geny/proteiny nesoucí jednu nebo více nukleotidových/aminokyselinových substitucí, insercí a/nebo delecí, které typicky vedou k rozvoji příznaků Alzheimerovy choroby a/nebo jiných příbuzných dědičných fenotypů (např. mozkové hemorhagie, mentální retardace, schizofrenie, psychosy a deprese), pokud jsou exprivovány u lidí. Tato definice je chápána tak, že zahrnuje různé mutace, které se přirozeně vyskytují, stejně jako syntetické nebo rekombinantní mutace vyvolané lidským zásahem. Termín mutantní jak je aplikován na presenilinové geny, není míněn tak, aby zahrnoval varianty sekvence které, díky degeneraci genetického kódu, kódují proteiny identické k normálním sekvencím zde popsaným nebo jinak uvedeným; ani není míněn tak, aby zahrnoval varianty sekvence které, ačkoliv kódují různé proteiny, kódují proteiny, které jsou funkčně ekvivalent! k normálním presenilinovým proteinů.
Funkční ekvivalent: Jak je zde použito při popisování genových sekvencí a aminokyselinových sekvencí znamená termín funkčně ekvivalentní to, že uvedená sekvence nemusí být identická s jednotlivou popsanou sekvencí seznamu sekvencí, ale poskytuje pouze sekvenci, která účinkuje biologicky a/nebo chemicky jako ekvivalent popsané sekvence.
V podstatě čistý: Jak je zde použito s ohledem na proteiny (včetně protilátek) nebo jiné přípravky znamená termín v podstatě čistý přípravek, který je alespoň ze 60% hmotnosti (suché hmotnosti) složen z požadované sloučeniny. Preferovaně je přípravek alespoň ze 75%, lépe alespoň ze 90% a nejlépe alespoň z 99% hmotnosti složen z požadované sloučeniny. Čistota může být měřena jakoukoliv vhodnou metodou, např. chromatografií na koloně, gelovou elektroforesou nebo HPLC analýsou.
S ohledem na proteiny, včetně protilátek, pokud přípravek obsahuje dvě nebo více požadovaných sloučenin (např. dvě nebo více různých protilátek, imunogenů, funkčních domén nebo jiných peptidů podle předkládaného vynálezu) znamená v podstatě čistý přípravek, ve kterém je celková hmotnost (suchá hmotnost) všech požadovaných sloučenin alespoň 60% celkové suché hmotnosti. Obdobně, pro takové přípravky obsahující dvě nebo více požadovaných sloučenin je preferováno, aby celková hmotnost požadovaných sloučenin byla alespoň 75%, lépe alespoň 90% a nejlépe alespoň 99% hmotnosti celkové suché hmotnosti přípravku.
·· ···· : . : :
• · · · ··· ·· ··· ···
Izolovaná nukleová kyselina: Jak je zde použito, izolovaná nukleová kyselina je ribonukleová kyselina, deoxyribonukleová kyselina nebo analog nukleové kyseliny obsahující polynukleotidovou sekvenci, která byla izolována nebo separována ze sekvencí, které jsou bezprostředně sousedící (jedné na 5' konci a jedné na 3' konci) v přirozeně se vyskytujícím genomu organismu, ze kterého je odvozena. Termín proto zahrnuje, například, rekombinantní nukleovou kyselinu, která je inkorporována do vektoru, do autonomně se replikujícího plasmidu nebo viru nebo do genomové DNA prokaryotického nebo eukaryotuického organismu; nebo která existuje jako separátní molekula (např. cDNA nebo genomový DNA fragment produkovaný PCR nebo ošetřením restrikční endonukleasou) nezávislý na jiných sekvencích. Také zahrnuje rekombinantní DNA, která je částí hybridního genu kódujícího další peptidové sekvence a/nebo obsahujícího exogení regulační elementy.
V podstatě identické sekvence: Jak je zde použito je v podstatě identická aminokyselinová sekvence aminokyselinová sekvence, která se liší pouze konzervativními substitucemi aminokyselin, například, substitucemi aminokyselin jedné za druhou stejné třídy (např. valin za prolin, arginin za lysin, atd.) nebo jednou nebo více nekonservativními substitucemi, delecemi nebo insercemi umístěnými v takových pozicích aminokyselinové sekvence, kde neničí funkci proteinu (testované, např. jak je zde popsáno). Preferovaně, taková sekvence je alespoň z 85%, lépe z 90% a nejlépe z 95% identická na úrovni aminokyselin se sekvencí proteinu nebo peptidu, se kterým je srovnávána. Pro nukleové kyseliny, délka srovnání sekvencí bue alespoň 50 nukleotidů, lépe alespoň 60 nukleotidů, • · · · · · ještě lépe alespoň 75 nukleotidů a nejlépe alespoň 110 nukleotidů. V podstatě identická sekvence nukleových kyselin kóduje v podstatě identickou aminokyselinovou sekvenci jak byla definována výše.
Transformované buňky. Jak je zde použito, transformovaná buňka je buňka, do které (nebo do jejíhož předka) byla zavedena, prostředky rekombinantní DNA techniky, požadovaná molekula nukleové kyseliny. Požadovaná nukleová kyselina bude typicky kodovat peptid nebo protein, transformovaná buňka může exprivovat požadovanou sekvenci nebo může být použita pro propagaci sekvence. Termín transformovaná může zde být použit pro obsažení jakékoliv metody pro zavedení exogení nukleové kyseliny včetně, ale nejenom, transformace, transfekce, elektroporace, mikroinjekce, virem zprostředkované transfekce a podobně.
Operativně spojené. Jak je zde použito, o kódujících sekvencích a regulačních regionech je řečeno, že jsou operativně spojené, pokud jsou kovalentně vázané takovým způsobem, že umísťují expresi nebo transkripci kódující sekvence pod vliv nebo kontrolu regulačního regionu. Pokud je požadováno, aby kódující sekvence byly translatovány do funkčního proteinu, pak o dvou sekvencích je řečeno, že jsou operativně spojené, pokud indukce funkce promotoru vede ke transkripci kódující sekvence a pokud charakter vazby mezi dvěma DNA sekvencemi 1) nevede k mutaci posunu rámečku, 2) neinterferuje se schopností regulačního regionu řídit transkripci kódujících sekvencí, nebo 3) neinterferuje se schopností korespondujícího RNA transkriptu být translatován na protein, tak, regulační region může být operativně spojen s
9t · · · ♦ kódující sekvencí, pokud je regulační region schopen způsobit transkripci této DNA sekvence, tak že vzniklý transkript může být translatován do požadovaného proteinu nebo polypeptidu.
Přísné hybridizační podmínky. Přísné hybridizační podmínky je termín v oboru používaný a odborníků známý. Pro jakoukoliv danou sekvenci nukleových kyselin jsou přísné hybridizační podmínky podmínky teploty, chaotrofní kyseliny, pufrů, a iontové síly, které umožní hybridizaci této sekvence nukleových kyselin na její komplementární sekvenci a nikoliv na podstatně odlišnou sekvenci. Přesné podmínky, které tvoří přísné podmínky, závisejí na charakteru sekvence nukleových kyselin, délce sekvence, a frekvenci výskytu podsad této sekvence v jiných neidentických sekvencích. Odlišností hybridizačních podmínek od hladině přísnosti, ve které se vyskytuje nespecifická hybridizace do hladiny, při které je pozorována pouze specifická hybridizace může odborník v oboru určit bez zbytečného experimentování podmínky, které umožní hybridizaci dané sekvence pouze s komplementární sekvencí. Vhodné rozsahy takových podmínek přísnosti jsou popsány v Krause and Aaronson (1991). Hybridizační podmínky, v závislosti na délce a běžnosti sekvence, mohou zahrnovat teploty od 20 °C - 65 °C a iontovou sílu od 5x do 0,lx SSC. Vysoce přísné podmínky hybridizace mohou zahrnovat teploty nižší než 40 °C - 42 °C (pokud jsou obsaženy denaturanty jako je formamid) až vyšší než 60 - 65 °C v iontové síle nižší než 0,1 x SSC. Tyto rozsahy jsou, nicméně, pouze ilustrativní a v závislosti na charakteru cílové sekvence, a možného budoucího vývoje techniky, mohou být přísnější, než je nezbytné. Méně než přísné podmínky jsou využity pro izolaci sekvence nukleových kyselin, které jsou v podstatě shodné, alelické nebo homologní k jakékoliv dané sekvenci .
Selektivně se váže. Jak je zde použito s ohledem na protilátky, o protilátce je řečeno, že se selektivně váže na cíl, pokud protilátka rozpoznává a váže se na požadovaný cíl, ale v podstatě nerozpoznává ani se neváže na jiné molekuly ve vzorku, např. biologickém vzorku, který obsahuje požadovaný cíl.
II. Preseniliny
Předkládaný vynález je částečně založen na objevu rodiny savčích genů, které, pokud jsou mutovány, jsou asociovány s vývojem Alzheimerovy choroby. Objev těchto genů, označených presenilin-1 a presenilin-2, stejně jako charakterizace těchto genů, jejich proteinových produktů, mutantů a možných účinků, je popsán níže. Homology presenilinů u bezobratlých jsou zde také uvedeny, protože mohou vnést světlo do účinků presenilinů a dále mohou být užitečné v různých provedeních, která jsou popsána níže.
1. Izolace lidského genu presenilinu-1
A. Genetické mapování AD3 regionu
Počáteční izolace a charakterizace PSi genu, potom popisovaného jako AD3 gen nebo S182 gen, byla popsána v Sherrington et al. (1995). Po počátečním regionálním mapování
AD3 genového lokusu na 14q24.3 poblíž anonymních mikrosatelitních markérů D14S43 a D14S53 (Schellenberg et al., 1992; St. George-Hyslop et al., 1992; Van Breckoven et al.,
1992) bylo dvacet jedna rodokmenů použito pro segregaci AD jako putativního autosomálně dominantního rysu (St. George-Hyslop et al., 1992) a pro zkoumání segregace 18 dalších genetických markérů z 14q24.3 regionu, které byly organizovány do vysokodensitní mapu genetických vazeb (Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Dříve publikované párová maxima pravděpodobnostní analýzy potvrdily základní kumulativní důkaz pro vazbu mezi familiární Alzheimerovou chorobou (FAD) a všemi těmito markéry. Nicméně, mnoho genetických dat podporujících vazbu na tyto markéry bylo odvozeno od šesti rozsáhlých rodokmenů s časným nástupem, FAD1 (Nee et al., 1983), FAD2 (Frommelt et al., 1991), FAD3 (Goudsmith et al., 1981; Polenn,
1993) , Fad4 (Foncin et al., 1985), TOR1.1 (Bergamini, 1991) a 603 (pericak-vance et al., 1988), kde každý z nich poskytuje alespoň jeden anonymní genetický markér z 14q24.3 (St. George-Hyslop et al., 1992).
Pro přesnější definování umístění AD3 genu ve vztahu k známým umístěním genetických markérů z 14q24.3 byly rekombinační orientační body vyhledávány přímou inspekcí z dat ze surových haplotypů z těch genotypovaných postižených členů šesti rodokmenů, kteří vykazovali definitivní vazbu na chromosom 14. Tato selektivní strategie v tomto určitém případě nezbytně ruší data z rekonstruovaných genotypů zesnulých postižených členů stejně jako od starých asymptomatických členů velkých rodokmenů a nebere v úvahu malé rodokmeny nejistého stavu vazby. Nicméně, tato strategie je velmi důkladná, protože vylučuje získání potenciálně zavádějících dat genotypů získaných bud' díky chybám v rekonstruovaných genotypech zesnulých postižených členů vzniklých z nepaternity nebo chyb vzorků, nebo z použití nevázaných rodokmenů.
Po prohlídce dat haplotypů od postižených subjektů byly u členů šesti velkých rodokmenů, jejichž genotypy byly přímo určeny, zjištěny obligátní rekombinace v D14S48 a D14S53, a v D14S258 a D14S63. Jedna rekombinace v D14S253, která znázorňuje telomerickou vazbu na FAD region, se vyskytla u stejného AD postiženého jedince FAD1 rodokmenu, který byl dříve popsán jako rekombinantní v několika jiných markérech umístěných telomericky do D14S53, včetně D14S48 (St. George-Hyslop et al., 1992). Oproti tomu, jedna rekombinace v D14S258, která značí centromerickou vazbu FAD regionu, se vyskytla u postiženého člena FAD3 rodokmenu, který byl také rekombinantní v několika jiných markérech centromerických k D14S258 včetně D14S63. Oba rekombinantní subjekty měly nesporný důkaz Alzheimerovi choroby potvrzený standartními klinickými testy pro onemocnění u jiných postižených členů jejich rodin a genotyp obou rekombinantních subjektů byl informativní a kosegregující v mnoha lokusech v intervalu centromerickém k D14S53 a telomerickém k D14S258.
Pokud byly analýzy haplotypů rozšířeny tak, aby zahrnovaly rekonstruované genotypy zesnulých postižených členů šesti velkých rodokmenů stejně jako data ze zbývajících patnácti rodokmenů s pravděpodobností vazby menší než 0,95, pak bylo detekováno několik dalších rekombinantů v jednom nebo více markerových lokusech v intervalu mezi D14S53 a D14S258. Tak jeden další rekombinant byl detekován rekonstruováním genotypů zesnulých postižených členů každého ze tří velkých FAD rodokmenů (FAD1, FAD2 a jiných příbuzných rodin) a osm dalších rekombinantů bylo detekováno u postižených členů pěti menších FAD rodokmenů. Nicméně, protože někteří z těchto rekombinantů mohou mít správně umístěný AD3 gen v lépe definovaném cílovém ·· ···· regionu, bylo nezbytné považovat tyto potenciálně těsnější vnitřní rekombinanty za nedůvěryhodné nejen z důvodů uvedených výše, ale také proto, že poskytují vzájemně neslučitelné umístění pro AD3 gen v D14S53 - D14S258 intervalu.
B. Konstrukce fyzikálního sousedícího (contig) překlenuj ícího AD3 regionu.
Jako počáteční krok pro klonování AD3 genu byl konstruován spoj přesahujících genomových DNA fragmentů klonovaných do kvasinkových arteficiálních chromosomových vektorů, fágových arteficiálních chromosomových vektorů a kosmidových vektorů. Studie FISS mapování za použití kosmidů odvozených od YAC klonů 932c7 a 964f5 naznačily, že interval nejpravděpodobněji nesoucí AD3 gen byl velikosti nejméně pět megabasí. Protože velká velikost tohoto minimálního kosegregačního regionu činí poziční klonovací strategie neřešitelnou, byly hledány jiné genetické vyhledávače, které byly zaměřeny na umístění AD3 regionu do jednoho nebo více podregionů v intervalu vymezeném D14S53 a D14S258. Haplotypové analýzy markérů mezi D14S53 a D14S258 selhaly při detekci statisticky signifikantního důkazu pro nerovnováhu vazby a/nebo alelickou asociaci mezi FAD rysem a alelami v jakýchkoliv z těchto markérů, nezávisle na tom, zda analýza byla restrihována na rodokmeny s formami častého nástupu FAD, nebo generalizována na všechny rodokmeny. Tento výsledek nebyl neočekávaně daný různými etnickými původy našich rodokmenů. Nicméně, pokud byly rodokmeny podobného etnického původu porovnány, pak přímá inspekce haplotypů pozorovaných na chorobu nesoucím chromosomu segregujícím v různých rodokmenech stejného etnického původu odhalila dvě seskupení markerových lokusů. První z těchto seskupení umístěné centromericky k D14S77 (D14S786, ·· · · · ·
D14S277 a D14S268) a překlenující 0,95 Mb fyzikální interval obsažený v YAC 78842. Druhé z těchto seskupení bylo umístěno telomericky k D14S77 (D14S43, D14S273 a D14S76) a překlenovalo asi 1 Mb fyzikální interval obsažený v přesahujících YAC klonech 964c2, 74163, 797dll a části 854f5. Identické alely byly pozorovány v alespoň dvou rodokmenech stejného etnického původu. Jako část této strategie byly usouzeno, že přítomnost účastnících se alel v jedné z těchto skupin fyzikálně seskupených markerových lokusů může odrážet ko-dědičnost malých fyzikálních regionů obklopujících PSI gen na jedinečně nalezeném chromosomu v každé etnické populaci. Signifikantně, každý z těchto účastnících se rozšířených haplotypů byl vzácný v normální Kavkazské populaci a tyto alely nebyly pozorovány v jiných skupinách markérů překlenujících stejné genetické intervaly kdekoliv na chromosomu 14q24.3.
C. Transkripčni mapování a analýza kandidátů pro geny
Pro izolování exprivovaných sekvencí kódovaných mezi oběma kritickými intervaly byla použita přímá selekční strategie vyžadující imobilizovanou, klonovanou, lidskou genomovou DNA jako hybridizační cíl pro znovu získání transkribovaných sekvencí z primárních komplementárních poolů DNA odvozených od lidské mozkové mRNA (Rommens et al., 1993). Přibližně 900 putativních DNA fragmentů velikosti 100 až 600 párů baží bylo získáno z těchto regionů. Tyto fragmenty byly hybridizovány na Souther bloty obsahující genomové DNA od lidí a od jiných savců. Tato identifikovaná podsada 151 klonů, které vykazovaly důkazy pro evoluční konzervaci a/nebo pro komplexní strukturu, což naznačovalo, že byly odvozené od sestřižené DNA. Klony v této podsadě byly tříděny na základě fyzického mapového • · · · · · umístění, zkřížené hybridizace a sekvence nukleotidů a byly použity pro vyšetření konvenčních lidských mozkových cDNA knihoven na delší cDNA. Bylo izolováno alespoň 19 nezávislých cDNA klonů o délce větší než 1 kb a byly potom seřazeny do částečné transkripční mapy AD3 regionu. Pouze tři z těchto transkriptů korespondovaly se známými charakterizovanými geny (cFOS, dihydrolipoamid sukcinyl transferasa a vazebný protein 2 pro latentní transformující růstový faktor).
D. Získaní kandidátů pro geny
Každá z částí otevřeného čtecího rámečku kandidátových genů byla získána RT-PCR z mRNA izolované z mrtvé mozkové tkáně od normálních kontrolních subjektů a od bud' mrtvé mozkové tkáně nebo kultivovaných fibroblastových linií postižených členů šesti rodokmenů definitivně vázaných na chromosom 14. RT-PCR produkty byly potom vyšetřovány na rozdíly v sekvenci za použití chemického štěpení a metodou vyhledávání restrikčními endonukleasami konformačního polymorfismu jednořetězcové sekvence (Saleeba and Cotton, 1993; Liu and Sommer, 1995) a přímého sekvencování nukleotidů. S jednou výjimkou, všechny z vyšetřovaných genů, i když ne požadovaných, neobsahovaly aterace v sekvencích, které byly jedinečné u postižených subjektů nebo kosegregovaly s onemocněním. Jednou výjimkou byl kandidátovy gen representovaný klonem S182, který obsahoval sérii nukleotidových změn, která nebyla pozorována u normálních subjektů a o kterých bylo předpokládáno, že alterují aminokyselinovou sekvenci u postižených subjektů. Gen korespondující tomuto klonu byl nyní označen jako presenilin-l (PSI). Dvě PSI sekvence, representujíc alternativní sestřižené varianty popsané níže, jsou zde popsány jako SEQ ID NO: 1 a SEQ • · · ·· ·
ID NO: 3. Korespondující předpokládané aminokyselinové sekvence jsou popsány jako SEQ ID NO: 2a SEQ ID NO: 4. Bluescript plsamidy nesoucí klony těchto cDNA byly deponovány v ATCC, Rockville, Md., pod ATCC přírůstkovými čísly 97124 a 97508 28.5.1995. Sekvence korespondující SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 byly také deponovány v GenBank databasy a mohou zde být získány pod přírůstkovým číslem 42110.
2. Izolace genu pro myší presenilin-1
Myší homolog (mPSl) lidského PSI genu byl získán vyšetřením myší cDNA knihovny značenou lidskou cDNA probou z hPSl genu. Tímto způsobem byl získán 2 kb částečný transkript (reúresentující 3' konec genu) a několik RT-PCR produktů representujících 5' konec. Sekvencování konsensuálního cDNA transkriptu myšího homologu odhalilo významnou aminokyselinovou identitu s hPSl. Významné je, jak je popsáno níže, že všechny aminokyseliny, které byly mutovány ve FAD rodokmenech byly konservovány mezi myším homologem a normální lidskou variantou. Tato konservace PSI genu ukazuje, že orthologní gen existuje u myší (mPSl) a že je nyní možné klonovat jiné savčí homology nebo orthology vyšetřováním genomových nebo cDNA knihoven za použiti lidských PSI prob. Tak, podobný přístup umožní identifikaci a charakterizaci PSI genu u jiných druhů. Sekvence nukleové kyseliny mPSl je zde popsána jako SEQ ID NO: 16 a korespondující aminokyselinová sekvence je zde popsána jako SEQ ID NO: 17. Obě sekvence byly deponovány v GenBank databasy a mohou zde být získány pod přírůstkovým číslem 42177.
3. Izolace genu pro lidský presenilin-2.
*· ····
• · · ·· •· • ···
Druhý lidský gen, nyní označený presenilin-2 (PS2) byl izolován a bylo ukázáno, že má významnou nukleotidovou a aminokyselinovou homologii s PSI genem. První izolace tohoto genu je detailně popsána v Rogaev et al., (1995). Izolace lidského PS2 genu (také označovaného jako STM2) téměř stejnou metodou je také popsána v Levy-Lahad et al (1995). Stručně, PS2 gen byl identifikován za použití nukleotidové sekvence cDNA pro PSI pro prohlížření databasí za použití BLASTN vzoru podle Altschul et al. (1990). Byla lokalizována tři vybraná místa exprivované sekvence, identifikovaná přírůstkovým číslem T03769, R14600 a R05907, která měla významnou homologii (p < 1,0 e~io°, více než 97% identita v alespoň 100 sousedních párech baží).
Z těchto sekvencí byly produkovány oligonukleotidové primery a byly použity pro generování PCR produktů reversní transkriptasovou PCR (RT-PCR). Tyto krátké RT-PCR produkty byly částečně sekvencovány pro potvrzení jejich identity se sekvencemi v databasy a potom byly použity jako hybridizační proby pro vyšetření kompletních cDNA knihoven. Několik různých cDNA v rozsahu od 1 kb do 2,3 kb bylo získáno z cDNA knihovny nádorové buňky (Caco2) a z lidské mozkové cDNA knihovny (E5-1, Gl-1, cc54, cc32). Nukleotidové sekvence těchto klonů potvrdila, že byly všechny generovány ze stejného transkriptu.
Gen kódující transkript, PS2 gen, byl mapován na lidský chromosom 1 za použití hybridních mapovacích panelů ke dvěma seskupením CEPH Mega YAC klonů, které byly umístěny podle fyzikální sousedící (contig) mapy (YAC klony 750g7, 921dl2 mapovaný lq41; a YAC klon 787gl2 mapovaný na Ip36.1-p35). Sekvence nukleových kyselin hPS2 klonu je zde popsána jako SEQ ID NO: 18 a korespondující aminokyselinová sekvence je zde popsána jako SEQ • · · · · ·
ID NO: 19. Obě sekvence byly deponovány v GenBank databasi a mohou zde být získány pod přírůstkovým číslem L44577. DNA sekvence hPS2 klonu byla také vložena do vektoru a deponována v
ATCC, Rockville, MD po přírůstkovým číslem 97214 28.6.1995.
4. Identifikace homologů u C. elegans a D. melanogaster
A. SPE-4 C. elegans
Srovnání sekvence nukleových kyselin a předpokládané aminokyselinové sekvence PSI s dostupnou databasi za použití BLAST typu seřazení ukázalo střední podobnost s C. elegans spermatickým integrálním membránovým proteinem SPE-4 (P = 1,5 e-25, 24 - 37% identita ve třech skupinách alespoň padesáti zbytků) a slabší podobnost s částmi jiných membránu překlenujících proteinů včetně savčího chromograninu A a alfa podjednotky savčího napěťově závislého kalciového kanálu (Altschul et al., 1990). Podobnosti aminokyselinové sekvence v putativních transmembránových doménách mohou příležitostně dávat sestavení, které jednoduše vzniká z omezeného počtu hydrofobních aminokyselin, ale existuje zde také rozšířené sestavení aminokyselin mezi PSI a SPE-4 v několika hydrofilních doménách. Oba putativní PSI protein a SPE-4 jsou předpokládané srovnatelné velikosti (467 a 465 zbytků, v příslušném pořadí) a, jak je podrobněji popsáno níže, obsahují alespoň sedm transmembránových domén s velkou acidickou doménou předcházející konečné transmembránové doméně. PSI protein nemá velký předpokládaný hydrofilní region na N konci.
Analýza BLASTP sestavení také detekovala signifikantní homologii mezi PS2 a C. elegans SPE-4 proteinem (P = 3,5 e-26 20 - 63% identita v pěti doménách alespoň 22 zbytků), a slabší ·· ···· · ··· · · • · · · ··· ·· ··· ··· homologie k mozkovým sodíkovým kanálům (alfa III podjednotka) a alfa podjednotce napěťově dependentních kalciových kanálů z rzných druhů (P = 0.02, 20 - 28% identita ve dvou nebo více doménách každé o alespoň 35 zbytcích) (Altschul, 1990). Tyto sestavení jsou stejná jako jsou ta, která byla výše popsána pro PSI gen.
B. Sel-12 C. elegans
U 461 zbytků Sel-12 proteinu od C. elegans a S182 (SEQ ID NO: 2) bylo shledáno, že mají 48% identitu sekvence v 460 aminokyselinách (Levitan and Greenwald, 1995). 0 Sel-12 proteinu se také soudí, že má mnoho transmembránových domén. Sel-12 gen (přírůstkové číslo U35660) byl identifikován vyšetřením na supresory lin-12 gain of function (nabytí funkce) mutace a byl klonován transformační záchranou (Levitan and Greenwald, 1995).
C. DmPS D. melanogaster.
Redundantní oligonukleotidy kódující vysoce konzervované regiony presenilin/sel 12 proteinů byly připraveny a použity pro identifikaci relevantních mRNA z dospělých a embryonálních D. melanogaster. Tyto mRNA byly sekvencovány a ukázalo se, že obsahují otevřený čtecí rámeček s putativní aminokyselinovou sekvencí vysoce homologní k sekvenci lidských presenilinů. DmPS cDNA je identifikována jako SEQ ID NO: 20.
Tato sekvence kóduje polypeptid o 541 aminokyselinách (SEQ ID NO: 21) s asi 52% identitou k lidským presenilinům.
Struktura D.melanogaster homologu je podobná struktuře ·· ···* • · ··· ·· lidských presenilinů s alespoň sedmi putativními transmembránovými doménami (Kyte-Doolittle analýzy hydrofobicity za použití okna 15 a hranice 1,5). Důkaz alespoň jedné alternativně sestřižené formy byl detekován v klonu pdsl3 obsahujícím ORF o 541 aminokyselinách, zatímco klony pds7, pdsl4 a pdsl postrádaly uzavírající nukleotidy 1300 - 1341. Toto alternativní sestřižení povede k alteraci Gly na Ala ve zbytku 384 v putativní TM6->7 smyčce a k fúsi v rámečku k Glu zbytku v kodonů 399 delšího ORF. Zásadní rozdíly v aminokyselinové sekvenci D. melanogaster a lidských genech byly v N terminální acidické hydrofilní doméně a v acidické hydrofilní části TM6->7 smyčky. Zbytky obklopující TM6->7 smyčku jsou zejména konzervována (zbytky 220 - 313 a 451 - 524), což naznačuje, že tyto jsou funkčně důležité domény. Šestnách ze dvaceti zbytků identifikovaných jako mutované v lidském PSI a PS2 a způsobujících lidský FAD je konzervováno v D. melanogaster homologu.
DNA sekvence DmPS genu jak byla klonována byla vložena do Bluescript plasmidů. Tento stabilní vektor byl deponován v ATCC, Rockville, MD, pod ATCC přírůstkovým číslem 97428 26.1.1996.
5. Charakterizace lidských genů pro preseniliny
A. hPSl transkripty a genová struktura
Hybridizace PSI (S182) klonu na norther bloty identifikovala transkript hojně exprivovaný v mnoha oblastech mozku a periferní tkáně jako hlavní asi 2,8 kb transkript a vedlejší transkript asi o 7,5 kb (viz např. obrázek 2 v Sherrington et al., 1995) . PSI je exprivován téměř uniformně ve většině regionů mozku a ve většině •r ···· periferních tkání s výjimkou jater, kde je transkripce nízká. Ačkoliv identita 7,5 kb transkriptu je nejasná, dvě pozorování naznačují, že asi 2,8 kb transkript representuje aktivní produkt genu. Hybridizace PSI klonu na northern bloty obsahující mRNA 'z mnoha myších tkání, včetně mozku, identifikovala pouze jeden transkript identické velikosti k asi 2,8 kb lidskému transkriptu. Všechny delší cDNA klony doposud získané (2,6 - 2,8 kb), které obsahovaly jak 5', tak 3' UTR a které patřily k 2,8 kb prožku v northern blotu, byly mapovány výlučně na stejný fyzikální region chromosomu 14.
Z těchto pokusů může asi 7,5 kb transkript buď vzácně alternativně sestřiženou, nebo polyadenylovanou izoformu asi 2,8 kb transkriptu, nebo může representovat jiný gen s homologií k PSI. cDNA knihovna Caco2 buněčné linie, která exprivuje vysoké hladiny jak PSI, tak PS2, byla vyšetřována na dlouhé transkripty. Byly získány dva různé klony, GL40 a B53. Sekvencování ukázalo, že oba klony obsahují podobné 5' UTR a ORF, který byl identický k Orf kratšího 2,8 kb transkriptu v mozku.
Oba klony obsahovaly neobvykle dlouhý 3' UTR. Tento dlouhý 3'UTR representuje použití alternativního polyadenylačního místa o asi 3 kb dále downstream. tento dlouhý 39UTR obsahoval množství motivů nukleotidové sekvence, které vedly k palindromům nebo kmenovým-smyčkovým strukturám. Tyto struktury jsou asociovány s mRNA stabilitou a také s translační účinností. Užitečnost tohoto pozorování je v tom, že může být možné vytvořit rekombinantní expresní konstrukty a/nebo transgeny, ve kterých je odstraněno upstream polyadenylační místo, což posiluje použití downstream polyadenylačního místa a delšího 3' UTR. V určitých případech, toto může navodit stabilitu vybraných mRNA druhů, s preferenční
• ·» ·· 9··· ♦ · · ··· * • · ·♦ · translací, která může být využita pro změnu rovnováhy mutantních versus přirozených transkriptů v cílových buněčných liniích, nebo i in vivo v mozku, buď terapií zárodečných linií nebo použitím virových vektorů jako jsou modifikované herpes simplex virus vektory jako forma genové terapie.
hPSl gen se rozkládá v genomovém intervalu alespoň 60 kb v 200 kb PAC1 klonu RPCI-1 54D12 z Roswell Park PAC knihovny a třech překrývajících se kosmidových klonů 57-H10, 1-G9, a 24-D5 z Los Alamos Chromosome 14 kosmidové knihovny. Transkripty PSI genu obsahují RNA ze 13 exonů, které byly identifikovány opakovanou hybridizací oligonukelotidových a částečných cDNA prob na subklonované restrikční fragmenty PAC a kosmidových klonů a přímým sekvencováním nukleotidů těchto subklonů. 5' UTR je obsažen v exonech 1-4, s tím, že exony 1 a 2 representují alternativní 5' konce transkriptů. ORF je obsažen v exonech 4 až 13, s alternativním spojením, které vede k absenci části exonu 4 nebo celého exonu 9. Exon 13 také obsahuj e 3' UTR.
Pokud není jinak uvedeno, v zájmu ujasnění a stručnosti, všechny odkazy na umístění nukleotidů v hPSl odvozených nukleotidových sekvencí budou využívat číslování basí podle SEQ ID NO: 1 (L42110), hPSl cDNA sekvence začínající exonem 1. V této cDNA je exon 1 připojen přímo na exon 3, který je připojen na exony 4 - 13. V SEQ ID NO: 1 se exon 1 rozkládá v nukleotidové pozici 1 - 113, exon 3 se rozkládá v pozici 114 - 195, exon 4 se rozkládá v pozici 196 až 335, exon 5 se rozkládá v pozici 336 až 586, exon 6 se rozkládá v pozici 587 až 728, exon 7 se rozkládá v pozici 729 až 796, exon 8 se rozkládá v pozici 797 až 1017, exon 9 se rozkládá v pozici 1018 až 1116, exon 10 se rozkládá v pozici 1117 až 1203, exon 11 se rozkládá v pozici 1204 až 1377, exon 12 »· ···· se rozkládá v pozici 1378 až 1496, exon 13 se rozkládá v pozici
1497 až 2765. Podobně, pokud není jinak uvedeno, všechny odkazy na umístění aminokyselin v hPSl odvozených proteinových sekvencích budou využívat číslování zbytků podle SEQ ID NO: 2, translačního produktu SEQ ID NO: 1.
Obklopující genomové sekvence byly získány pro exony 1 - 12 a jsou presentovány v SEQ ID NO: 5 - 14 (přírůstková čísla L76518 L76527). Genomova sekvence 5' z exonu 13 byla také určena a je presentována v SEQ ID NO: 15 (přírůstková číslo L76528). SEQ ID NO: 5 - 14 také obsahují kompletní exonové sekvence. SEQ ID NO: 15, nicméně, neobsahuje 3' konec exonu 13. Genomové sekvence korespondující exonům 1 a 2 jsou umístěny přibližně 240 bp od 2,6 kb BamHI-HindlII fragmentu, SEQ ID NO: 5. Exony 3 a 4 (které obsahují ATG start kodon) jsou umístěny na separátním 3 kb BamHI fragmentu. Kompletní sekvence intronu 2 mezi BamHI místem 850 bp downstream od exonu 2 a BamHI místem 600 bp upstream od exonu 3 nebyla ještě identifikována a nebyla ihned získána rozšířeným PCR za použití primerů ze sousedících BamHI míst, což naznačuje, že intron 2 může být větší.
Analýzy nukleotidové sekvence sousedící s exony 1 a 2 (SEQ ID NO: 5) odhalila CpG dinukleotidy obsahující Notl restrikční místo v intronu 1. Konsensuální sekvence pro několik putativních transkripčních regulačních proteinů obsahujících mnohá seskupení aktivátor proteinu - 2 (AP-2), signálních transducerů a aktivátorů transkripce (STAT3) (Schindler and Darnell, 1995), gamma aktivátorových sekvencí (Gas nebo STATI), mnohotný start místo element downstream (MED) (Ince and Scotto, 1995) a GC elementy byly přítomny jak v intronu 1, tak v sekvenci 5' od exonu 1 (viz SEQ ID NO: 5). Dva putativní TATA boxy jsou přítomny ·· ···· upstream od exonu 1, v bp 925 - 933 a 978 - 987 SEQ ID NO: 5, a jsou následovány dvěma putativními transkripčními iniciačními (CAP nebo Chambon-Trifonov) konsensuálními sekvencemi v 1002 1007 bp a 1038 - 1043 bp 484 SEQ ID NO: 5. Oproti tomu, sekvence ihned upstream od exonu 2 postrádá TATA boxy nebo CAP místa, ale je obohacena v seskupení CpG ostrůvků.
Schematická mapa strukturální organizace hPSl genu je presentována na obrázku 1. Nekódující exony jsou znázorněny jako vytečkované rámečky. Kódující exony jsou znázorněny jako prázdné rámečky nebo šrafované rámečky pro alternativně sestřižené sekvence. Restrikční místa jsou: B = BamHI; E = EcoRI; H = HindlII; N = Notl; P = Pstl; V = PvuII; X = Xbal. Přerušení v horizontální linii mezi restrikčními místy representují nedefinované genomové sekvence. Klonované genomové fragmenty obsahující každý exon jsou znázorněny oboustranými horizontálními šipkami. Velikost genomových subklonů a přírůstková čísla pro každou genomovou sekvenci jsou také dány.
Předpoklady DNA sekundární struktury založené na sekvenci nukleotidů v 290 bp upstream exonu 1 a v intronu 1 odhalily několik palindromů se stabilitou vyšší než 16 kcal/mol. Tyto analýzy sekundární struktury také předpověděly přítomnost tří stabilních motivů kmenových smyček (v bp 1119 - 1129/1214 - 1224; v bp 1387 - 1394/1462 - 1469; a v bp 1422 - 1429/1508 - 1515; vše v SEQ ID NO: 5) s velikostí smyčky dostatečnou pro obkroužení nukleosomu (asi 76 bp). Takové kmenové smyčkové struktury jsou běžnou vlastností genů obsahujících TATA (Kollmar and Farnham, 1993) .
Souhrn vlastností těchto 5' regionů je presentován v tabulce ·· ····
1. Všechny odkazy na umístění basí jsou ve vztahu k SEQ ID NO: 5.
Nejdelší předpokládaný otevřený čtecí rámeček v SEQ ID NO: 1 kóduje protein o 467 aminokyselinách, SEQ ID NO: 2. Start kodon pro tento otevřený čtecí rámeček e první ve-fázy ATG umístěný downstream od TGA stop kodonu. Nejsou zde klasické konsensuální Kozák sekvence okolo prvních dvou ve ve fázy ATG kodonů (Sherrington et al., 1995). Jako jiné geny postrádající klasické silné start kodony, putativní 5' UTR lidských transkriptů je bohaté na GC.
B. Alternativní transkripce a sestřih hPSl 5' UTR
Ačkoliv první tři exony a část čtvrtého exonu obsahují netranslatované sekvence, analýza mnoha kompletních cDNA klonů izolovaných z cDNA knihovny lidského hippocampu (Stratagene, La Jolla CA) a z buněčné linie adenokarcinomu střeva (Caco2 od J. Rommens) ukázala, že u většiny klonů byly iniciální sekvence odvozeny od exonu 1 a byly přímo připojeny na exon 3 (přírůstkové číslo L42110, SEQ ID NO: 1). Méně často (1 z 9 klonů) byly prvně transkribované sekvence odvozeny od exonu 2 a byly připojeny na exon 3 (přírůstkové číslo L76517, SEQ ID NO: 3). Přímé sekvencování nukleotidů alespoň 40 nezávislých RT-PCR transkriptů izolovaných za použití primeru v exonu 1 selhalo při identifikaci klonů obsahujících jak exon 1, tak exon 2. Konečně, inspekce genomové sekvence upstream od exonu 2 neodhalila 3' sestřihávací místo sekvence. Tato pozorování argumentuje pro to, že exon 2 je skutečným iniciálním exonem spíše než alternativní sestřiženou formou transkriptů začínajících v exonu 1 nebo artefaktem cDNA klonování. Kromě toho, protože klon (cc44) obsahující exon 2 byl získán ze stejné monoklonální Caco2 buněčné linie, je pravděpodobné, že oba exon 1 obsahující transkripty a exon 2
obsahující transkripty existují ve stejné buňce.
Pro testování předpokladů o transkripčních iniciačních místech založených na sekvenci nukleotidů 5' upstream regionu v blízkosti exonu 1 jsme vyšetřovali 5' sekvenci tří nezávislých kompletních cDNA klonů obsahujících exon 1 (cc33, cc58 a cc48) a tří sekvencí získaných extensí primery za použití antisense priméru umístěného v exonu 3. Další 5' extense byla pozorována v cDNA G40L, která mapovala nejproximálnější transkripční start místo na pozici 1214 bp v genomové sekvenci obsahující exon 1 SEQ ID NO: 5 (L76518), a která proto koresponduje pozici -10 SEQ ID NO: 1. Dva další klony (cDNA cc48 a 5' RACE produkt č. 5) nesly společné start místo v pozici 1259 bp v genomové sekvenci, SEQ ID NO: 5, což koresponduje pozici 34 v SEQ ID NO: 1. Dvě zbývající cDNA, stejně jako zbývající 5' RACE klony, začínaly ve více distálních pozicích v exonu 1. 5' RACE klon č. 8 začínal v pozici 1224 bp, shodné s pozicí 1 v SEQ ID NO: 1. Žádný z těchto klonů proto nesahal k předpokládanému CAP místu upstream od exonu 1. Díky nízké prevalenci transkriptů obsahujících iniciální sekvence z exonu 2 nebyly podobné studie jejich start míst provedeny.
C. Alternativní sestřih hPSl ORF
Kromě transkriptů s různými iniciálními sekvencemi odhalila analýza mnoha cDNA klonů získaných z různých knihoven také dvě variace v PSI transkriptech, které narušují ORF.
První z těchto je absence 12 nukleotidů z 3' konce exonu 4, nukleotidů 324 až 335 SEQ ID NO: 1. Toto může vznikat ze sestřihu exonu 4 po nukleotidu 323 místo po nukleotidu 335. Transkripty vzniklé z tohoto alternativního sestřižení exonu 4 nekódují aminokyselinové zbytky Val26-Arg27-Ser28-Gln29 SEQ ID NO: 2.
·>· · · · ·
Transkripty vzniklé z těchto dvou alternativních sestřižení exonu 4 byly detekovány v přibližně stejné frekvenci ve všech přežívajících tkáních. U těchto dosud vyšetřovaných klonů je zajímavé, že myší PSI transkripty obsahují pouze cDNA sekvence pro Ile26-Arg-27-Ser28~Gln29 a že sekvence pro Val-Arg-Ser-Gln motiv je pouze částečně konzervovaná v lidském PS2 jako Arg48-Ser49-Gln50 (Rogaev et al., 1995). Každé z těchto pozorování naznačuje, Že tyto rozdíly nejsou zásadní pro vlastní PSI funkci.
Druhá varianta sestřihu ovlivňující ORF vede k absenci exonu 9, nukleotidů 1018 až 1116 v SEQ ID NO: 1. Analýza RT-PCR produktů odvozených z mRNA mnoha tkání ukázala, že mozek (včetně neokortikálních oblastí typicky postižených AD) a několik jiných tkání (svaly, srdce, plíce, tlusté střevo) predominantně exprivují jeden transkript nesoucí exon 9. Leukocyty (ale ne lymfoblasty) na druhou stranu, také exprivují kratší formu postrádající exon 9. 0 alternativním sestřihu exonu 9 se předpokládá, že mění aspartatový zbytek v pozici 257 SEQ ID NO: 2 na alanin, že eliminuje dalších 33 zbytků a že vede k fůzy v rámečku na zbytek proteinu začínající threoninem v pozici 291 kódovaným v exonu 10.
D. hPS2 transkripty
Genomová DNA obsahující lidský hPS2 gen nebyla doposud plně charakterizována. Nicméně, mnoho podobností mezi PSI a PS2 geny je jasných. Intron/exon vazba obou genů, nicméně, se zdá být velmi podobná nebo shodná s výjimkou regionu TM6->7 smyčky.
Hybridizace PS2 cDNA klonů na Northern Bloty detekovala asi
2,3 kb mRNA proužek v mnoha tkáních, včetně regionů mozku, stejně jako asi 2,6 kb mRNA proužek ve svalech, srdečním svalu a slinivce. PS2 je exprivován v nízké hladině ve většině regionů v mozku s výjimkou corpus callosum, kde je transkripce vysoká. Ve svalech skeletu, srdečním svalu a slinivce je PS2 gen exprivován v relativně vyšších hladinách než v mozku a jako dva různé transkripty 2,3 kb a 2,6 kb. Oba transkripty mají velikost zřetelně odlišnou od 2,7 kb PSI transkriptu a nehybridizují zkříženě s PSI probami za vysoké přísnosti. cDNA sekvence jedné hPS2 alely je identifikována SEQ ID NO: 18 (přírůstkové číslo: L44577).
Nejdelší ORF v této PS2 cDNA konsensuální nukleotidové sekvenci určuje polypeptid obsahující 448 aminokyselin (SEQ ID NO: 19) počítaných od prvního ve fázy ATG kodonu, v pozici 366 368 v SEQ ID NO: 18, který je obklopen Kozák konsensuální sekvencí. Stop kodon je v pozici 1710 - 1712.
Jako bylo provedeno pro PSI, analýza PS2 RT-PCR produktů z několika tkání, včetně mozku a svalů, RNA ukázala dvě alternativní varianty sestřižení, ve kterých může být relativně velký segment vystřižen. Tak, s relativně nízkou frekvencí, jsou produkovány transkripty, ve kterých jsou nukleotidy 1152 - 1250 PS2 transkriptu, SEQ ID NO: 18, (kódující zbytky 263 - 295, SEQ ID NO: 19) alternativně sestřiženy. Jak bylo uvedeno výše, toto sestřižení těsně koresponduje s alternativním sestřihem exonu 9 PSI (Rogaev et al., 1995).
Další varianta sestřihu PS2 cDNA sekvence postrádající GAA triplet v pozici nukleotidů 1338 - 1340 v SEQ ID NO: 18 může být také nalezena ve všech vyšetřovaných tkáních. Tento alternativní
• · ♦ ·· ·♦ sestřih vede k vynechání Glu zbytku v aminokyselinové pozici 325.
6. Struktura presenilinových proteinů
A. Rodina presenilinových proteinů
Preseniliny jsou nyní popsány jako nová rodina vysoce konzervovaných integrálních membránových proteinů se společným strukturálním motivem, společnými vzory alternativního sestřižení, a společnými mutačními regiony hot spots, které korelují s putativními strukturálními doménami, které jsou přítomné u mnoha zvířecích buněk od bezobratlých a od obratlovců. Analýza předpoklýádaných aminokyselinových sekvencí lidských genů pro preseniliny za použití Hopp and Woods algoritmu naznačila, že proteiny jsou rozsáhlé integrální membránové proteiny jako jsou receptory, kánálové proteiny nebo strukturální membránové proteiny.Kyte-Doolittle hydropatické znázornění putativního hPSl proteinu je znázorněno na obrázku 2. Hydropatické znázornění a strukturální analýzy naznačují, že tyto proteiny mají asi sedm hydrofobních transmembránových domén (označených TMI až TM7) separovaných hydrofilními smyčkami. U jiných modelů může být předpokládáno, že mají nejméně 5 a nejvíce 10 transmembránových domén v závislosti na parametrech použitých v algoritmu pro tento předpoklad. Přítomnost sedmi membránu překlenujících domén, nicméně, je charakteristikou několika tříd G-vázaných receptorových proteinů, ale je také pozorována u jiných proteinů (např. kanálových proteinů). Absence rozpoznatelného signálního peptidů a malý počet glykosylačních míst jsou pozoruhodné.
Aminokyselinové sekvence hPSl a mPSl proteinů jsou srovnány na obrázku 3 a sekvence hPS2 a mPS2 proteinů j sou srovnány na obrázku 4. V každém obrázku jsou shodné aminokyselinové zbytky
ukázány horizontálními čarami. Sedm putativních transmembránových domén je ukázáno horizontálními liniemi nad nebo pod sekvencemi.
Hlavní rozdíly mezi členy této rodiny jsou v sekvencích aminokyselin hydrofilních, acidických smyčkových domén na Nkonci a mezi putativní TM6 a TM7 doménou presenilinových proteinů (TM6->7 smyčka). Většina ze zbytků kódovaných hPSl exonem 9, který je alternativně sestřižen v některých non-neurálních tkáních, tvořila část putativní TM6->7 smyčky. Kromě toho, u korespondujících alternativně sestřižených variant identifikovaných v hPS2 se zdálo, že kódují část TM6->7 smyčky. Variabilní sestřih této hydrofilní smyčky a skutečnost, že aminokyselinová sekvence smyčky se liší mezi členy genové rodiny, naznačuje, že tato smyčka je významnou funkční doménou proteinu a může udílet určitou specificitu fyziologickým a patogením interakcím jednotlivých presenilinových proteinů. Protože N-terminální hydrofilní doména nese určitý acidický náboj jako TM6->7 hydrofilní acidická smyčka a v modelu sedmi transmembránových domén je pravděpodobné, že má stejnou orientaci s ohledem na membránu, a je také variabilní mezi preseniliny, je velmi pravděpodobné, že tyto dvě domény mají funkci buď koordinovaným nebo nezávislým způsobem (např. stejné nebo různé ligandy nebo funkční vlastnosti). Tak je pravděpodobné, že N-konec je také významnou funkční doménou proteinu a může udílet určitou specificitu fyziologickým a patogením interakcím jednotlivých presenilinových proteinů.
Jak je podrobněji popsáno níže, patogení mutace v PSI a PS2 seskupení v oblasti TMI->2 smyčkové a TM6->7 smyčkové domény dále naznačují, že tyto domény jsou funkčními doménami těchto proteinů. Obrázky 5 a 6 jsou schematické obrázky předpokládané • ·· · struktury PSI a PS2 proteinů, v příslušném pořadí, se známými mutačními místy ukázanými na obrázcích. Jak je ukázáno na obrázcích, TMI->2 vazebná sekvence je předpokládané umístěná na opačné straně membrány než je N-konec a TM6->7 smyčka, a může být významná ve transmembránové komunikaciToto je podporováno PSI Y115H mutací, která byla pozorována v rodokmenech s časným nástupem familiární AD (30 - 40 roků) a dalšími mutacemi v TM1/2 šroubovicích, u kterých může být očekáváno, že destabilizují smyčku. TMI->2 smyčka je relativně krátká (PSI: zbytky 101 - 132; PS2: zbytky 107 - 134), což činí tuto sekvenci více přístupnou pro konvenční syntesu peptidů. Sedm PSI mutací je seskupeno v regionu mezi kodonem 82 a kodonem 146, který obsahuje putativní první transmembránovou doménu (TMI), TMl->2 smyčku a TM2 doménu v PSI. Obdobně, mutace v kodonů 141 PS2 je také umístěna v TM2 doméně. Tyto mutace pravděpodobně destabilizují TMI->2 smyčkovou doménu a její kotvící bod v TMI a TM2. Dvanáct PSI mutací vede k alteraci aminokyselin mezi kodony 246 a 410, které jsou zahrnuty v TM6, TM6->7 smyčce, a TM7 doméně. Tyto mutace mohou modifikovat strukturu nebo stabilitu TM6->7 smyčky (buď přímo nebo modifikací konformace TM6 nebo TM7).
Další důkaz pro významnou funkční roli umístěnou v TM6->7 smyčce je divergence sekvence v centrální části TM6->7 smyčky (přibližně aminokyseliny 300 - 671) mezi různými členy presenilinové rodiny proteinů. Podobně, jelikož N-terminální sekvence členů presenilinové rodiny proteinů je také divergentní, je pravděpodobné, že mírně divergentní sekvence hrají roli v udílení specificity funkce pro každý z různých presenilinových proteinů, zatímco konzervované sekvence udílejí společné biologické aktivity. Tyto regiony mohou representovat ligandová vazebná místa. Pokud je tomu tak, pak mutace v TM6->7 regionu
4444
pravděpodobně modifikují vazebnou aktivitu ligandů. TMI->2 smyčka, která je konzervována mezi různými členy presenilinové rodiny proteinů, pravděpodobně representuje efektorovou doménu na opačné straně membrány. S výjimkou mutace sestřihu exonu 10, většina z jiných (chybných) mutací je připojena na stejné povrchy putativních transmembránových šroubovic, což naznačuje, že mohou ovlivňovat vazbu ligandů a funkci kanálů. Tak tyto domény (naúř. TM6->7 a TMl->2 smyčky) mohou být použity jako místa pro vývoj specifických vazebných agens pro inhibici účinku mutací a/nebo pro znovunastolení normální funkce presenilinového proteinu u subjektu s Alzheimerovou chorobou.
Podobnost mezi putativními produkty C. elegans SPE-4 a PSI geny implikuje, že mohou mít podobné aktivity. U SPE-4 proteinu se zdá, že je zahrnut ve tvorbě a stabilizaci komplexu fibrosní tělo - membránová arganela (FBMO) během spermatogenese. FBMO je specializovaná organela odvozená od Golgiho systému, která se skládá z membránově vázaných váčků připojených na a částečně obklopených komplexem paralelních proteinových vláken a může být zahrnuta v transportu a skladování solubilních a na membránu vázaných polypeptidů. Mutace v SPE_4 narušují FBMO komplexy a ukončují spermatogenesi. Proto může být fyziologickou funkcí SPE-4 buď stabilizace mezi integrálním mebránovým pučením a fúsemi, nebo stabilizace interakcí mezi membránovými a fibrilárními proteiny v průběhu intracelulárního transportu FBMO komplexu během spermatogenese. O srovnatelných funkcích je možné uvažovat pro preseniliny. Například, PSI může být zahrnut buď v prostoru jiných na membránu vázaných proteinů jako je SAPP, nebo v axonálním transportu a fúsním štěpení membránově vázaných vesikulí během transportu proteinů, tak jako v Golgiho aparátu nebo systému endosom-lysosom. Pokud jsou tyto hypotesy správné, pak může být u mutací očekáváno, že povedou k aberantnímu transportu a zpracování SAPP a/nebo abnormálním interakcím s proteiny sytoskeletu jako je s mikrotubuly asociovaný protein Tau. Abnormality v intracelulámí a extracelulární dispozici SAPP a Tau jsou skutečně součástí neuropatologických vlastností Alzheimerovy choroby. Ačkoliv umístění PSI a PS2 mutací ve vysoce konzervovaných zbytcích v konzervovaných doménách putativních proteinů naznačují, že jsou patogení, jsou alespoň tři z těchto mutací sami konzervativní, což je v souladu s nástupem choroby v dospělosti. Jelikož žádná z těchto dosud pozorovaných mutací není delece ani nesmyslná mutace, u kterých je předpokládáno, že způsobují úplnou ztrátu exprese nebo funkce, nemůžeme předpokládat, zda tyto mutace budou mít dominantní účinek nabytí funkce, což navodí aberantní zpracování SAPP nebo dominantní účinek ztráty funkce, což způsobí zástavu normálního zpracování βΑΡΡ. Sestřihová mutace exonu 10 způsobuje fůzy v rámečku exonu 9 na exon 10 a může mít strukturální účinek na PSI protein, což může pozměnit intracelulámí zaměření nebo vazbu ligandu, nebo to může jinak ovlivnit funkci PSI.
Alternativní možností je, že produkt PSI genu může representovat receptor nebo protein kanálu. Mutace takového proteinu může být v příčinném vztahu k několika jiným neurologickým chorobám jak u obratlovců (např. maligní hypertermie, hyperkalemická periodická paralýza u lidí), tak u bezobratlých organismů (deg-l(d) mutanty C. elegans). Ačkoliv se patologie těchto jiných onemocnění nepodobá patologii Alzheimerovy choroby, existuje zde důkaz pro funkční abnormality iontových kanálů u Alzheimerovy choroby. Například, byly popsány anomálie v tetra-ethylamonium-sensitivním 113pS draslíkovém kanálu a v homeostase vápníku. Poruchy v transmembranovém proudění vápníku mohou být zejména relevantní ve světle slabé homologie mezi PSI a a-ID podjednotkou napěťově závislého vápníkového kanálu a ve světle pozorování, že zvýšení intracelulárního vápníku v kultivovaných buňkách může napodobit některé biochemické vlastnosti Alzheimerovy choroby, jako je alterace ve fosforylaci Tau-s mikrotubuly asociovaného proteinu a zvýšená produkce AS-peptidů.
B. Struktura hPSl
Jak je ukázáno v SEQ ID NO: 2, největší známá forma lidského PSI proteinu obsahuje 467 aminokyselin a má předpokládanou molekulovou hmotnost asi 51,37 kDa. Varianta s výše popsaným alternativním sestřižením exonu 4 (ve které jsou deletovány zbytky korespondující pozicím 26 - 29 SEQ ID NO: 2) bude obsahovat o 4 aminokyseliny méně a bude mít hmotnost okolo 50,93 kDa. Podobně, varianta s výše popsaným alternativním sestřižením exonu 9 (ve které jsou deletovány zbytky korespondující pozicím 258 - 290 SEQ ID NO: 2) bude obsahovat o 33 aminokyselin méně a bude mít hmotnost okolo 47,74 kDa.
Umístění putativních domén je presentováno v tabulce 2. Znovu si povšimněte, že číslování pozice zbytků je s ohledem na SEQ ID NO: 2 a je přibližné (t.j. + 2 zbytky).
Schematické znázornění putativní PSI struktury je ukázáno na obrázku 5. N-konec je vysoce hydrofilní, negativně nabitá doména s několika potenciálními fosforylačními doménami, následovaná sekvenčně hydrofobní membránu překlenující doménou o přibližně 19 zbytcích (TMI), nabitou hydrofilní smyčkou o přibližně 32
zbytcích (TMI->2), pěti dalšími membránu překlenujíčími doménami (TM2 až TM6) oddělenými krátkými (1 - 15 zbytků) hydrofilními doménami (TM2->3 až TM5->6) a další rozsáhlou, acidickou hydrofilní nabitou smyčkou (TM6->7) a alespoň jednou (TM7) a možná dvěma, jinými hydrofobními potenciálně membránu překlenujíčími doménami, kulminujícími v polární doméně na C-konci.
Protein také obsahuje mnoho potenciálních fosforylačních míst, kde jedním z nich je MAP kinasa konsensuální místo, které je také obsaženo v hyperfosforylaci Tau během konverse normálního Tau na neurofibrilární síť. Tato konsensuální sekvence může poskytnout putativní element vážící tuto proteinovou aktivitu na jiné biochemické aspekty Alzheimerovy choroby, a může representovat pravděpodobný terapeutický cíl. Prohlídka proteinové struktury odhalila dvě sekvence YTPF (zbytky 115 - 118, SEQ ID NO: 2) a STPE (zbytky 353 - 356, SEQ ID NO: 2), které representují 5/T-P motiv, který je MAP kinasa konsensuální sekvencí. Několik jiných fosforylačních míst existuje s konsensuálními sekvencemi pro protein kinasa C (PKC) aktivitu. Protože PKC aktivita je asociována s odlišnostmi metabolismu APP, které jsou relevantní k Alzheimerově chorobě, jsou tato místa na PSI proteinu a jeho homolozích také cílem pro terapeutika. Předběžné důkazy ukazují, že, alespoň v transfektováných buňkách, PSI protein je fosforylován pouze v malé míře, zatímco PS2 protein je signifikantně fosforylován. Alespoň pro PS2 se zdá, že se tato fosforylace vyskytuje na serinových zbytcích na N-terminální doméně mechanismem, který nevyžaduje PKC (Capell et al., 1996).
Povšimněte si, že alternativní sestřih na konci exonu 4 odstraňuje 4 aminokyseliny z hydrofilní N-terminální domény a může být očekáváno, že odstraňuje konsensuální fosforylační sekvenci. Kromě toho, alternativní sestřih exonu 9 vede ke zkrácené izoformě PSI proteinu, kde je nepřítomno pět terminálních hydrofobních zbytků TM6 a část hydrofilní negativně nabité TM6->7 smyčky ihned C-terminálně k TM6. Tato alternativně sestřižená izoforma je charakterizována zachováním sekvence z N-konce dále a tím, že obsahuje tyrosin v pozici 256 SEQ ID NO: 2, změnu aspartatu v pozici 257 na alanin a sestřihC-terminální části proteinu a tím, že obsahuje tyrosin 291. Takové rozdíly v sestřižení jsou často asociovány s důleležitými funkčními doménami proteinů. Toto dokazuje, že tato hydrofilní smyčka (a následně N-terminální hydrofilní smyčka s podobným aminokyselinovým nábojem) je/jsou aktivní funkční domény PSI produktu a tak jsou místem pro terapeutický zásah.
C. Struktura lidského PS2
Lidské PSI a PS2 proteiny vykazují 63% celkovou identitu aminokyselin a několik domén vykazuje úplnou identitu. Jak může být proto očekáváno, analýzy hydrofobicity naznačují, že oba proteiny také mají podobnou strukturální organizaci. Tak je o obou proteinech předpokládáno, že mají sedm hydrofobních putativních transmembránových domén a oba proteiny mají velké acidické hydrofilní domény na N-konci a mezi TM6 a TM7. Další podobnost byla zřejmá z výše popsané strukturální analýzy RT-PCR produktů z mozkové a svalové RNA, která ukázala, že nukleotidy 1153 - 1250 PS2 transkriptu jsou alternativně sestřiženy. Tyto nukleotidy kódují aminokyseliny 263 - 296, které jsou umístěny v TM6->7 smyčkové doméně putativního PS2 proteinu a které mají 94% identitu sekvence s alternativně sestřiženými aminokyselinami 257 - 290 v PSI.
·· ····
Umístění putativních domén hPS2 proteinu je presentováno v tabulce 3. Povšimněte si, že číslování pozice zbytků je s ohledem na SEQ ID NO: 19 a je přibližné (t.j. + 2 zbytky).
Schematické znázornění putativní PS2 struktury je ukázáno na obrázku 6. Podobnost mezi hPSl a hPS2 je největší v několika doménách proteinu korespondujících intervalům mezi TMI a TM6, a od TM7 do C-konce PSI proteinu. Hlavní rozdíly mezi PSI a PS2 jsou ve velikosti a sekvencích aminokyselin negativně nabité hydrofilní TM6->7 smyčky a v sekvencích N-terminálních hydrofilních domén.
Nejpatrnější rozdíly mezi dvěma předpokládanými aminokyselinovými sekvencemi se vyskytují v centrální části TM6->7 hydrofilní smyčky (zbytky 304 - 374 hPSl; 310 - 355 hPS2) a v N-terminální hydrofilní doméně. Analogicky, tato doména je také méně vysoce konzervována mezi myším a lidským PSi genem (identita = 47/60 zbytků) a nevykazuje žádnou podobnost k ekvivalentím regionům SPE-4.
7. Presenilinové mutanty
A. PSI mutanty
Bylo identifikováno několik mutací v PSI genu, které způsobují vážný typ familiární Alzheimerovy choroby. Jedna nebo kombinace těchto mutací může být odpovědná za tuto formu Alzheimerovi choroby, stejně jako za několik jiných neurologických onemocnění. Mutace mohou být jakoukoliv formou substituce, inserce nebo ·· ···· delece nukleotidová sekvence, které vedou ke změnám v předpokládané sekvenci aminokyselin nebo které vedou k aberantnímu zpracování transkriptu, aberantní hladině nebo stabilitě. Specifické choroby způsobující mutace ve formě nukleotidových aúnebo aminokyselinových delecí nebo substitucí jsou popsány níže, ale je předpokládáno, že další mutace mohou být nalezeny u jiných rodin. Skutečně, po počátečním objevu pěti různých chybných mutací u osmi různých rodokmenů (Sherrington et al., 1995) bylo očekáváno ze zkušeností z jiných dědičných onemocnění (např. amyotrofické laterální sklerosy asociované s mutací v Ca2* superoxid dismutasovém genu), že budou identifikovány další mutace. Toto očekávání bylo naplněno naším následujícím objevem dalších mutací presenilinů (Rogaev et al., 1995) a obdobnými pozorováními, která uskutečnili jiní (např. Cruts et al., 1995; Campion et al., 1995). Tak, jak je zde použito s ohledem na PSI geny a proteiny, není termín mutantní omezen na tyto jednotlivé mutace, ale spíše je konstruován tak, jak je definováno výše.
Přímé sekvencování překrývajících se RT-PCR produktů pokrývajících 2,8 kb S182 transkript izolovaný od postižených členů šesti velkých rodokmenů vázaných na chromosom 14 vedlo nejprve k objevu pěti chybných mutací v každém ze šesti rodokmenů. Každá z těchto mutací kosegregovala s onemocněním v příslušném rodokmenu a nebyla přítomná v asi 142 nepříbuzných neurologicky normálních subjektů stejného etnického původu jako FAD rodokmeny (248 nepříbuzných chromosomů). Umístění genu v fyzikálním intervalu segregujícím s AD3 rysem, přítomnost osmi různých chybných mutací, které kosegregovaly s rysem onemocnění v šesti rodokmenech definitivně vázaných na chromosom 14 a nepřítomnost těchto mutací v 284 nezávislých normálních • · ··· · chromosomech dohromady potvrdila, že PSI gen je AD3 lokus. Další biologická podpora pro tuto skutečnost vychází ze skutečnosti, že zbytky mutované u FAD příbuzných jsou konservovány v evoluci (např. hPSl v. mPSl), že mutace jsou umístěny v doménách proteinu, které jsou také vysoce konservované u homologů jiných obratlovců a bezobratlých a že produkt PSi genu je exprivován ve vysokých hladinách ve většině regionů mozku, včetně těch, které jsou nejvážněji postiženy AD.
Od původního objevu PSI genu bylo zmapováno mnoho dalších mutací asociovaných s rozvojem AD. Tabulka 4 charakterizuje mnoho z nich.Každá z pozorovaných delecí nebo substitucí nukleotidů se vyskytla v putativním ORF PSI transkriptu a určuje změnu kódované aminokyseliny v ukázané pozici. Mutace jsou uvedeny s odkazem na jejich nukleotidové umístění v SEQ ID NO: las ohledem na jejich aminokyselinové umístění v SEQ ID NO: 2. Vstup NA ukazuje, že data nejsou dostupná.
Jak bude zmíněno v další sekci, bylo také nalezeno mnoho PS2 mutací. Srovnání hPSl a hPS2 sekvencí je ukázáno na obrázku 4 a ukazuje, že tyto patogení mutace jsou v regionech PS2 proteinu, které jsou konservovány v PSI proteinu. Proto, korespondující mutace v PSI proteinu mohou také být očekávány jako patogení a jsou obsaženy v PSI mutantech zde poskytnutých. Dále, jakékoliv patogení mutace identifikované v jakémkoliv konservovaném regionu genu pro presenilin mohou být považovány za representující mutant jiných presenilinů, které nesou tento konzervovaný region.
Zajímavé je, že mutace A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, 291-319, G384A, L392V a C410Y se všechny vyskytují v nebo poblíž acidické hydrofilní smyčky mezi • · · · · ·
putativními transmembránovými doménami TM6 a TM7. Osm z těchto mutací (A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V) je také umístěno v alternativně sestřižené doméně (zbytky 257 290 v SEQ ID NO: 2).
Všechny z těchto mutací mohou být testovány mnoha strategiemi (přímé sekvencování nukleotidů, ligační polymerasová řetězová reakce, SSCP, RFLP, nové DNA chip technologie, atd.) za použití RT-PCR produktů representujících zralé mRNA/cDNA sekvence nebo genomovou DNA.
Konečně, mělo by být zmíněno, že bylo zjištěno také několik polymorfismů, které neměly zřejmý škodlivý účinek. Jeden z nich, T->G změna nukleotidu 863 SEQ ID NO: 1, způsobuje F205L polymorfismus v TM4. Jiné (C->A v bp 1700; G->A v bp 2603; delece bp2620) jsou v 3' UTR.
B. PS2 mutanty
Silná podobnost mezi PSI a PS2 genovými produkty vedla k možnosti, že PS2 gen může být místem onemocnění způsobujících mutací v některých z malého počtu AD rodokmenů s časným nástupem, u kterých studie genetické vazby vyloučily chromosomy 14, 19 a 21. RT-PCXR byla použita pro izolaci cDNA korespondujících k PS2 transkriptu z lymfoblastů, fibroblastů nebo mrtvé mozkové tkáně od postižených členů osmi rodokmenů s časným nástupem FAD, u kterých byly mutace ve SAPP a PSI genech dříve vyloučeny studiemi přímým sekvencováním.
Vyšetření těchto RT-PCR produktů detekovalo heterozygotní A->G substituci v nukleotidu 1080 u všech čtyř postižených členů ··· ·· ··· ··· rozšířeného rodokmenu italského původu (FlolO) s časným nástupem patologicky potvrzené FAD (nástup 50 - 70 let). O této mutaci může být předpokládáno, že způsobuje Met->Val chybnou mutaci v kodonů 239 v TM5.
Druhá mutace (A->T v nukleotidu 787) způsobující Asn->Ile substituci v kodonů 141 v TM2 byla nalezena u postižených členů skupiny příbuzných rodokmenů Volga German původu (representován buněčnými liniemi AG09369, AG09907, AG09952 a AG09905, Coriell Institute, Camden NJ). Signifikantně, jeden subjekt (AG09907) byl homozygotní pro tuto mutaci, což je pozorování, které je kompatibilní s přirozeným křížením těchto rodokmenů. Signifikantně, tento subjekt neměl signifikantně odlišný obraz od subjektů heterozygotních pro N141I mutaci. Mutace PS2 genu nebyly nalezeny v 284 normálních kavkazských kontrolách ani nebyly přítomny u postižených členů rodokmenů s AD3 typem AD.
Obě tyto PS2 mutace způsobují substituce zbytků, které jsou vysoce konzervovány v PS1/PS2 genové rodině.
Další PS2 mutace je způsobena T->C substitucí v páru baží 1624, což způsobuje substituci Ile na Thr v kodonů 420 C-konce. Tato mutace byla nalezena v dalších případech familiární AD s časným nástupem (45 let).
Tyto hPS2 mutace jsou uvedeny v tabulce 5 s odkazem na jejich nukleotidové umístění v sekvence SEQ ID NO: 18 a s odkazem na jejich aminokyselinovou pozici v SEQ ID NO: 19. Vstup NA ukazuje, že data nejsou dostupná.
Jak bylo zmíněno v předchozí sekci, bylo také nalezeno mnoho • · · · · · • to • · · · • · ··· ·· ··· ··· ♦ · ·
PSI mutací. Srovnání hPSl a hPS2 sekvencí je ukázáno na obrázku 4 a ukazuje, že tyto patogení mutace jsou v regionech PSI proteinu, které jsou rozsáhle konservovány v PS2 proteinu. Proto, korespondující mutace v PS2 proteinu mohou také být očekávány jako patogení a jsou obsaženy v PS2 mutantech zde poskytnutých. Dále, jakékoliv patogení mutace identifikované v jakémkoliv konservovaném regionu genu pro presenilin mohou být považovány za representující mutant jiných presenilinů, které nesou tento konzervovaný region.
Nalezení genu, o jehož produktu se soudí, že nese významné aminokyselinové a strukturální podobnosti s produktem PSI genu naznačuje, že tyto proteiny mohou být ve funkčním vztahu jako nezávislé proteiny s překrývající se funkcí, ale snad s mírně odlišnými specifickými aktivitami, jako fyzikálně asociované podjednotky multimerického polypeptidu nebo jako nezávislé proteiny provádějící následující funkce ve stejné dráze.
Pozorování tří různých chybných mutací v konzervovaných doménách PS2 proteinu u subjektů s familiární formou AD naznačuje, že tyto mutace jsou, podobně jako mutace v PSI genu, příčinné pro AD. Tento závěr je signifikantní jelikož, ačkoliv fenotyp onemocnění asociovaný s mutacemi v PSI genu (nástup 30 - 50 let, trvání 10 let) je nepatrně odlišný od fenotypu asociovaného s mutacemi PS2 genu (nástup 40 - 70 let, trvání více než 20 let), obecné podobnosti jasně ukazují, že biochemická dráha vyjadřovaná členy této genové rodiny je centrální pro genesi alespoň AD s časným nástupem. Jemné rozdíly ve fenotypu onemocnění mohou odrážet nižší hladinu exprese PS2 transkriptu v CNS, nebo mohou odrážet odlišnou roli pro genový produkt PS2.
Analogicky k účinkům PSI mutací může PS2, pokud je mutován, způsobit aberantní zpracování APP (Prokursorový protein pro amyloid) na AS peptid, hyperfosforylaci Tau s mikrotubuly asociovaného proteinu a abnormality v intracelulární homeostase vápníku. Interfernce s těmito abnormálními interakcemi poskytuje cíl pro terapeutické intervence u AD.
Konečně, byl nalezen alespoň jeden nukleotidový polymorfismus u jednoho normálního individua, jehož PS2 cDNA měla T->C změnu v bp 626 SEQ ID NO: 18, bez jakékoliv změny v kódované sekvenci aminokyselin.
III. Preferovaná provedení
Částečně na základě objevů zde popsaných jsou poskytnuta následující preferovaná provedení předkládaného vynálezu
1. Izolované nukleové kyseliny
V jedné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález izolované nukleové kyseliny korespondující k, nebo ve vztahu k, sekvenci nukleové kyseliny pro presenilin, která je zde popsána. Jak je podrobněji popsáno dále, tyto sekvence obsahují normální PSI a PS2 sekvence od lidí a od jiných druhů savců, homologní sekvence z nesavčích druhů jako je Drosophila a C. elegans, podsady těchto sekvencí použitelné jako proby a PCR primery, podsady těchto sekvencí kódující fragmenty presenilinových proteinů nebo korespondujících jednotlivých strukturállních domén nebo polymorfnich regionů, komplementární nebo antisense sekvence korespondující fragmentům presenilinových genů, sekvence, ve • · · · · · kterých byl presenilin kódující region operativně připojen na exogení regulační regiony a sekvence kódující fúsní proteiny částí presenilinových proteinů fúsovaných na jiné proteiny použitelné jako markéry exprese, jako cíle pro purifikaci nebo ve vyšetřeních a testech pro proteiny interagující s preseniliny.
Tak v první sérii provedení jsou poskytnuty izolované sekvence nukleových kyselin, které kódují normální nebo mutantní verse PSI a PS2 proteinů. Příklady takových sekvencí nukleových kyselin jsou zde popsány. Tyto nukleové kyseliny mohou být genomové sekvence /např. SEQ ID NO: 5 - 15) nebo mohou být cDNA sekvence (např. SEQ ID NO: 1, 3, 16 a 18). Kromě toho, nukleové kyseliny mohou být rekombinantí geny nebo minigeny, ve kterých všechny nebo některé introny různých kombinací intronů a exonů a lokálně cis účinkujících regulačních elementů mohou zapracovány v propagaci nebo expresi konstruktů nabo vektorů. Tak, například, vynález poskyutuje sekvence nukleové kyseliny, ve které jsou inkorporovány alternativně sestřižené variace zde popsané na DNA úrovni, což umožňuje buňkám obsahujícím tyto sekvence exprivovat pouze jednu z alternativně sestřižených variant v každé pozici sestřihu. Například, může být produkován rekombinantní gen, ve kterém 3' konec exonu 1 PSI genu (bp 1337 SEQ ID NO: 5) je připojen přímo na 5' konec exonu 3 (bp 588 SEQ ID NO: 6) takže je produkován pouze transkript korespondující predominantnímu transkriptu. Nezávisle na tom může být vytvořen rekombinantní gen posilující alternativní sestřih exonu 2 a exonu 3. Obdobně, mohou být produkovány rekombinantní geny, ve kterých jsou inkorporovány exon 4 nebo exon 9 sestřihové varianty PSI (nebo korespondující TM6->7 sestřihové varianty PS2) do DNA, takže buňky obsahující těmto rekombinantní gen mohou exprivovat pouze jednu z těchto variant. Za účelem redukce velikosti ♦ · · · ······ ·· ·· ·· ·· · • · · · · · · ···· · · · · · · · • · · · · ··· ·· ··· ··· 9· · rekombinantního genu pro presenilin může být využita cDNA nebo mohou být různé kombinace netranslatovaných exonů a intronů odstraněny z DNA konstruktu, konečně, mohou být produkovány rekombinantní geny, ve kterých je 5' UTR pozměněn, takže transkripční probíhá nutně od jednoho nebo od druhého ze dvou transkripčních iniciačních míst. Takové konstrukty mohou být zejména užitečné, jak je popsáno níže, v identifikaci sloučenin, které mohou indukovat nebo reprivovat expresi presenilinů. Mnoho variací těchto provedení je nyní poskytnuto detailním popisem genů pro preseniliny, který je zde poskytnut.
Kromě popsaných sekvencí pro presenilin je odborník v oboru nyní schopen identifikovat a izolovat nukleové kyseliny representující geny pro preseniliny nebo cDNA, které jsou alelické k popsaným sekvencím nebo které jsou heterospecifické homology. Tak, předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny korespondující k těmto alelám a homologům, stejně jako různé výše popsané rekombinantní konstrukty odvozené z těchto sekvencí, prostředky, které jsou v oboru dobře známé. Stručně, odborník v oboru může nyní vyšetřovat přípravky genomové nebo cDNA, včetně vzorků připravených z jednotlivých organismů (např., lidských AD pacientů nebo členů jejich rodiny) stejně jako bakteriální, virové, kvasinkové a jiné knihovny na genomovou nebo cDNA, za použití prob nebo PCR primerů pro identifikaci alelických nebo homologních sekvencí, protože je žádoucí identifikovat další mutace genu pro presenilin, které mohou přispívat k rozvoji AD nebo jiných onemocnění, protože je žádoucí identifikovat další presenilinové polymorfismy, které nejsou patogení a protože je také žádoucí vytvořit různé zvířecí modely, které mohou být použity pro studium AD a pro vyhledávání potenciálních terapeutik, je zejména předpokládáno, že další ·· · ·· ·
• · ······ • · · · ··· ·· · ·· · presenilinové sekvence budou izolovány z jiných přípravků nebo knihoven lidských nukleových kyselin a z přípravků nebo knihoven od zvířat včetně krys, myší, křečků, morčat, králíků, psů, koček, koz, ovcí, prasat, a ne-lidských primátů. Dále, homology presenilinů od kvasinek nebo jiných druhů bezobratlých, včetně C. elegans nebo jiných hlístů, stejně jako Drosophila nebo jiného hmyzu, mohou být zejména užitečné pro vyšetřování léčiv. Například, bezobratlý nesoucí mutantní presenilinové homology (nebo savčí presenilinové transgeny), které způsobují rychle se vyskytující a snadno odečitatelný fenotyp (např. abnormální vulvu nebo vývoj oka po několika dnech) mohou být pro vyhledávání léčiv, která blokují účinek mutantního genu. Takový bezobratlý mohou sloužit o mnoho rychleji a účinněji pro hromadné vyšetřování než obratlovci. Pokud je takovýmto způsobem nalezena sloučenina, může být testována na vyšších zvířatech.
Standartní hybridizačni vyšetření nebo PCR techniky mohou být použity (jak jsou použity, například, v identifikaci mPSl genu) pro identifikaci a/nebo izolaci takových alelických a homologních sekvencí za použití relativně krátké sekvence genu pro presenilin. Sekvence mohou obsahovat 8 nebo méně nukleotidů v závislosti na charakteru cílové sekvence, použité metodě a požadované specificitě. Budoucí vývoj techniky může umožnit použití ještě kratších sekvencí. S nyní dostupnou technologií jsou preferovány sekvence 9-50 nukleotidů, a lépe okolo 18 - 24 nukleotidů. Tyto sekvence mohou být vybrány z těch, které jsou zde popsány, nebo mohou být odvozeny od alelických nebo heterospecifických homologů zde popsaných. Při probování mRNA nebo při vyšetřování cDNA knihoven jsou preferovaně použity proby a primery z kódujících sekvencí (spíše než introny) a sekvence, které jsou vynechány v alternativně sestřižených variantách jsou ·· ·♦·· • · • · • · ··· • ·· • · · · · • · · · · · · • · · · ··· ··· ·· ·
typicky vypuštěny, pokud není specificky požadována idenmtifikace těchto variant. Alelické varianty genů pro presenilin budou pravděpodobně hybridizovat na popsané sekvence za přísných hybridizačních podmínek, jak jsou zde definovány, zatímco podmínky nízké přísnosti mohou být použity pro identifikaci heterospecifických homologů.
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález izolované nukleové kyseliny, které obsahují subsady sekvencí pro presenilin nebo jejich komplementy. Jak bylo uvedeno výše, takové sekvence mají uplatnění jako proby a PCR primery pro identifikaci a izolaci alelických nebo homologních variant genů pro preseniliny. Subsekvence korespondujíc k polymorfním regionům presenilinů, jak je popsáno výše, budou také mít uplatnění ve vyšetřováné a/nebo genotypizaci jedinců pro diagnostické účely, jak je popsáno dále. Kromě toho, a také jak je popsáno dále, takové subsady budou mít uplatnění pro kódování
1) fragmentů presenilinových proteinů pro obsažení ve fúsních proteinech,
2) fragmentů, které obsahují funkční domény presenilinových proteinů pro užití ve vazebných studiích,
3) fragmentů presenilinových proteinů, které mohou být použity jako imunogeny pro vznik protilátek proti presenilinovým proteinům, a
4) fragmenty presenilinů, které mohou účinkovat jako kompetitivní inhibitory nebo jako napodobovači presenilinů pro inhibici nebo napodobení jejich fyziologických funkcí.
·· ····
• · • · • ·· • ·· • · · • · · ··· · • · • · ·
Konečně, takové subsady mohou kodovat nebo representovat komplementární nebo antisense sekvence, které mohou hybridizovat na geny pro preseniliny nebo na presenilinové mRNA transkripty za fyziologických podmínek pro inhibicí transkripce nebo translace těchto sekvencí. Proto, v závislosti na zamýšleném použití, předkládaný vynález poskytuje subsekvence nukleových kyselin genů pro preseniliny, které mohou mít délku v rozsahu od 8 - 10 nukleotidů (např. pro použití jako PCr primery) do téměř plné velikosti genomové nebo cDNA. Tak předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující sekvence korespondující alespoň 8-10, lépe 15 a nejlépe alespoň 20 sousedícím nukleotidům genů pro preseniliny, jak jsou zde popsány nebo jinak poskytnuty, nebo jejich komplementy. Jak bylo uvedeno výše, nicméně, kratší sekvence mohou být užitečné s jinými technologiemi.
V jiné sérii provedení předkládaný vynález poskytuje nukleové kyseliny, ve kterých jsou sekvence kódující presenilin, s nebo bez intronů nebo rekombinantně zpracované jak bylo popsáno výše, operativně připojeny na endogení nebo exogení 5' a/nebo 3' regulační regiony. Endogení regulační regiony hPSl genu jsou zde popsány a detailně uvedeny. Za použití předkládaného objevu a standartních genetických technik (např. PCR extense, cíleného gene walking), je odborník v oboru nyní také schopen klonování korespondujících 5' a/nebo 3' endogeních regulačních regionů. Obdobně, alelické varianty hPSl a hPS2 endogenních regulačních regionů, stejně jako endodgenní regulační regiony z jiných savčích homologů, jsou podobně poskytnuty bez zbytečného experimentování.
• · · · · • · · · · · · • · · · • · · ··· ·· ·
Alternativně, exogení regulační regiony (t.j. regulační regiony z jiných konspecifických genů nebo heterospecifické regulační regiony) mohou být operativně připojeny na sekvence kódující presenilin tak, aby řídily expresi. Vhodné 5' regulační regiony budou zahrnovat promotorové elementy a mohou také zahrnovat další elementy jako je operátorová nebo enhancerová sekvence , ribosomová vazebná sekvence, RNA čepičkovací sekvence, a podobně. Regulační region může být vybrán ze sekvencí, které kontrolují expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk, jejich virů nebo jejich kombinací. Takové regulační regiony obsahují, ale nejsou omezeny na, lac systém, trp systém, tac systém, a trc systém; hlavní operátor a promotorové regiony fágu lambda; kontrolní region fd obalového proteinu; časné a pozdní promotor SV40; promotory odvozené od polyomaviru, adenoviru, retroviru, bakuloviru a opičího viru; 3-fosfoglycerát kinasový promotor; promotory kvasinkové kyselé fosfatasy; kvasinkové alfa-rozmnožovací faktory; promotorové elementy jiných eukaryotických genů exprivované v neuronech nebo jiných typech buněk; a jejich kombinace. Zejména mohou být vybrány ty regulační elementy, které jsou indukovatelné nebo reprivovatelné (např. E-galaktosidasový promotor) pro umožnění kontroly a/nebo manipulovatelnosti exprese genů pro presenilin v buňkách transformovaných těmito nukleovými kyselinami. Alternativně mohou být kódující regiony pro presenilin operativně spojeny s regulačními elementy, které umožňují tkáňově specifickou expresi v mnohobuněčném organismu. Takové konstrukty jsou zejména užitečné pro produkci transgeních organismů pro zajištění exprese genů pro presenilin pouze ve vhodných tkáních. Volba vhodných regulačních regionů je v možnostech odborníka a rekombinantní použití mnoha takových regulačních regionů je nyní v oboru zavedeno.
• · · · · ·
V jiné sérii provedení předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny kódující celé nebo části presenilinových proteinů ve formě fúsního proteinu. V těchto provedeních je regulační region nukleové kyseliny (endogení nebo exogení) operativně připojen na první kódující region, který je kovalentně navázán v rámečku na druhý kódující region. Druhý kódující region může být volitelně navázán na jeden nebo více dalších kódujících regionů a poslední kódující region je připojen na terminační kodon a, volitelně, na vhodné 3' regulační regiony (např. polyadenylační signály). Sekvence pro presenilin ve fúsním proteinu mohou representovat první, druhý nebo jakýkoliv další kódující region. Sekvence pro presenilin mohou být konzervované nebo nekonzervované domény a mohou být umístěny v kterémkoliv kódujícím regionu fúze. Non-presenilinové sekvence fúse mohou být vybrány podle potřeby a úvahy provádějící osoby a nejsou omezeny předkládaným vynálezem. Užitečné non-presenilinové sekvence, nicméně, zahrnují krátké sekvence smyček jako jsou antigenní determinanty nebo poly-His smyčky, které mohou být použity při purifikaci nebo identifikaci vzniklého fúsního proteinu. Alternativně může non-presenilinový kódující region kodovat velký protein nebo proteinový fragment, jako je enzym nebo vazebný protein, který může také asistovat při identifikaci a purifikaci proteinu, nebo může být užitečný v testech jak jsou popsány dále. Jednotlivé předpokládané presenilinové fůsní proteiny zahrnují poly-His a GST (glutathion S-transferasa) fúse, které jsou užitečné při izolaci a purifikaci presenilinů, a kvasinkové dvouhybridové fúze, popsané dále, které jsou užitečné v testech pro identifikaci jiných proteinů, které se váží na nebo interagují s preseniliny.
V jiné sérii provedení předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny ve formě rekombinantních DNA konstruktů, ve kterých je markerový nebo reporterový gen (např. β-galaktosidasa, luciferasa) operativně připojen na 5' regulační region genu pro presenilin tak, že exprese markerového genu je pod kontrolou regulačních sekvencí pro presenilin. Za použití regulačních regionů pro presenilin popsaných nebo jinak uvedených v předkládaném vynálezu, včetně regulačních regionů z PSI a PS2 genů od lidí nebo jiných savčích druhů, je odborník v oboru nyní schopen produkovat takové konstrukty. Jak je podrobněji uvedeno dále, takové izolované nukleové kyseliny mohou být použity pro produkci buněk, buněčných linií nebo transgeních zvířat, které jsou užitečné při identifikaci sloučenin, které mohou, přímo nebo nepřímo, různě ovlivňovat expresi presenilinů.
Konečně, izolované nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu zahrnují jakoukoliv z výše uvedených sekvencí, pokud je obsažena ve vektoru. Vhodné vektory obsahují klonovací vektory a expresní vektory všech typů, včetně plasmidů, fagemidů, kosmidů, episomů a podobně, stejně jako integrační vektory. Tyto vektory mohou také obsahovat různé markerové geny (např. geny pro resistenci nebo citlivost na antibiotika), které jsou užitečné při identifikaci buněk úspěšně transformovaných vektorem. Kromě toho, vektory mohou obsahovat regulační sekvence, na které jsou nukleové kyseliny podle vynálezu operativně připojeny a/nebo mohou také obsahovat kódující regiony tak, že nukleové kyseliny podle vynálezu, pokud jsou vhodně ligovány do vektoru, jsou exprivovány jako fúsní proteiny. Takové vektory mohou také obsahovat vektory pro použití ve kvasinkovém dvouhybridovém, bakulovirovém a fag-vystaveném systému. Vektory mohou být vybrány tak, aby byly použitelné pro prokaryotní, eukaryotní nebo virovou • ···· · · · ··· · • · · · · · ♦ ·· · · · · · · · · ·· · expresi, jak je nutné nebo potřebné pro jednotlivé aplikace. Například, vektor viru vakcinie nebo vektor opičího viru s SV40 promotorem (např. pSV2), nebo Herpes simplex virus nebo adenoasociovaný virus mohou být užitečné pro transfekci savčích buněk včetně neuronů v kultuře in vivo, a bakulovirový vektor může být použit při transfekci hmyzích buněk (např. motýlých buněk). Velký počet různých vektorů je nyní komerčně dostupný a jinak v oboru známý, a volba vhodného vektoru je na schopnostech a rozvaze odborníka.
2. V podstatě čisté proteiny
Předkládaný vynález poskytuje v podstatě čisté přípravky presenilinových proteinů, fragmentů presenilinových proteinů a fúsních proteinů obsahujících preseniliny nebo jejich fragmenty. Proteiny, fragmenty a fúse mají význam, jak je zde popsáno, při generování protilátek k normálním nebo mutantním presenilinům, v identifikaci vazebných proteinů pro preseniliny, a v diagnostických a terapeutických metodách. Proto, v závislosti na zamýšleném použití, poskytuje předkládaný vynález v podstatě čisté proteiny nebo peptidy obsahující aminokyselinové sekvence, které jsou podsekvencemi kompletních presenilinových proteinů a které mohou mít délku v rozsahu 4-10 aminokyselin (např. pro použití jako imunogeny), nebo 10 - 100 aminokyselin (např. pro použití v testech vazby), kompletních presenilinových proteinů. Tak poskytuje předkládaný vynález v podstatě čisté proteiny nebo peptidy obsahující sekvence korespondující alespoň 4-5, lépe 6 - 10 a nejlépe alespoň 50 nebo 100 následujícím aminokyselinám presenilinových proteinů, jak jsou zde popsány nebo jinak uvedeny.
Proteiny nebo peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány a purifikovány jakoukoliv z mnoha metod vybraných na základě vlastností vykazovaných jejich proteinovými sekvencemi. Jelikož mají preseniliny vlastnosti integrálních nebo membránu překlenujících proteinů, může být membránová frakce buněk, ve kterých je presenilin normálně vysoce exprivován (např. neuronů, oligodendroglií, svalu, slinivky) izolována a proteiny mohou být extrahovány, například, solubilizací detergentem. Alternativně může být presenilinový protein, fúsní protein nebo jeho fragment purifikován z buněk transformovaných nebo transfektovaných expresními vektory (např. bakulovirovým systémem jako jsou pPbac a pMbac vektory (Stratagene, La Jolla, CA); kvasinkovými expresními systémy jako je pYESHIS Xpress vektor (Invitrogen, San Diego, CA); eukaryotickými expresními systémy jako je pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), který má konstantní konstitutivní expresi, nebo LacSwitch (Stratagene, La Jolla, CA), který je indukovatelný; nebo prokaryotními expresními vektory jako je pKK233-3 (Clontech, Palo Alto, CA). Za té situace, že protein nebo fragmenty integrují do endoplasmatického retikula nebo plasmatické membrány rekombinantních buněk (např. imortalizovaných lidských buněčných linií nebo jiných eukaryotických buněk), může být protein purifikován z membránové frakce. Alternativně, pokud není protein správně lokalizován nebo agreguje v inklusních tělískách v rekombinantních buňkách (např. prokaryotických buňkách), pak může být protein purifikován z kompletního lysátu buněk nebo ze solubilizovaných inklusních tělísek.
Purifikace může být provedena za použití standartních technik purifikace proteinů včetně, ale nejenom, gelové filtrační chromatografie, iontové výměnné chromatografie, vysoce účinné kapalinové chromatografie (RP-HPLC, iontová výměnná HPLC, HPLC s -vylučováním podle velikosti, vysoce účinná chromatofokusační chromatografie, hydrofobní interakční chromatografie, imunoprecipitace nebo imunoafinitní purifikace. Gelová elektroforesa (např. PAGE, SDS-PAGE) může být také použita pro izolování proteinů nebo peptidů na základě jejich molekulové hmotnosti, charakteru náboje a hydrofobicity.
Presenilinový protein, nebo jeho fragment může být také konvenčně purifikován vytvořením fúsního proteinu obsahujícího požadovanou presenilinovou sekvenci fúsovanou na jiný peptid jako je antigenní determinanta nebo poly-His smyčka (např. QIAexpress vektory, QIAGEN Corp. Chatsworth, CA), nebo větší protein (např. GST využívající pGEX-27 vektor (Amrad, USA) nebo zelený flurescentní protein využívající Green Lantern vektor (Gibco/BRL. Gaithersburg, MD). Fúsní protein může být exprivován a získán z prokaryotických nebo eukaryotických buněk a může být purifikován za použití jakékoliv standartní metody založené na sekvenci fúsního vektoru. Například, fúsní protein může být purifikován imunoafinitně nebo imunoprecipitačně s protilátkou k non-presenilinové části fúse nebo, v případě poly-His smyčky, afinitní vazbou na niklovou kolonu. Požadovaný presenilinový protein nebo fragment může pak být dále purifikován z fúsního proteinu enzymatickým štěpením fúsního proteinu. Metody pro přípravu a použití takových fúsních konstruktů pro purifikaci proteinů jsou v oboru dobře známé a někoik kitů pro tento účel je nyní komerčně dostupných. Ve světle předkládaného vynálezu je nyní umožněno použití takových fúsních konstruktů s preseniliny.
3. Protilátky k presenilinům ··· · · ··· • · · · · · · · ···· • · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· ·
Předkládaný vynález tako poskytuje protilátky a metody pro výrobu protilátek, které se selektivně vážou na presenilinové proteiny nebo jejich fragmenty. Zejména, identifikováním funkčních domén presenilinů a polymorfních regionů asociovaných s AD poskytuje předkládaný vynález protilátky, a metody pro výrobu protilátek, které se budou selektivně vázat na a, proto, idetifikovat a/nebo rozlišovat normální a mutantní (t.j. patogení) formy presenilinových proteinů. Protilátky podle vynálezu mají použití jako laboratorní reagens pro, inter alia, imunoafinitní purifikací presenilinů, Western blotting pro identifikaci buněk nebo tkání exprivujících preseniliny a imunocytochemické nebo imunoflurescenční techniky pro stanovení subcelulární lokalizace proteinu. Kromě toho, jak je popsáno dále, protilátky podle vynálezu mohou být použity jako diagnostické nástroje pro identifikaci nosičů presenilinových alel spojených s AD nebo jako terapeutický nástroj pro selektivní vazbu a inhibici patogeních forem presenilinových proteinů in vivo.
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být generovány za použití celých presenilinových proteinů podle vynálezu nebo za použití jakéhokoliv presenilinového epitopů, který je charakteristický pro tento protein a který je významně odlišný od ostatních hostitelských proteinů. Takové epitopy mohou být identifikovány, například, srovnáním sekvence 4-10 aminokyselinových zbytků ze sekvence pro presenilin s počítačovou databazí proteinových sekvencí od relevantního hostitele. Preferovaně jsou epitopy vybrány z N- a C- konců, nebo ze smyčkových domén, které spojují transmembránové domény proteinů. Konkrétně, předpokládá se, že protilátky k polymorfnímu Nterminálnímu regionu, TMI->2 smyčce nebo TM6->7 smyčce mají • · · · · · největší využití jak v diagnostice, tak v terapii. Na druhou stranu, protilátky proti vysoce konzervovaným doménám by měly mít největší význam pro purifikaci nebo identifikaci presenilinů.
Za použití IBM Pustell programu byly identifikovány umístění aminokyselinových zbytků jako potenciální antigení místa v hPSl proteinu a mohou být užitečné při generování protilátek podle vynálezu. Tyto pozice, korespondující pozicím v SEQ ID NO: 2, jsou uvedeny v tabulce 6.
Jiné metody vybrání antigeních determinant jsou, samozřejmě, v oboru známy a mohou být využity. Kromě toho mohou být využity větší fragmenty (např. 8-20 nebo, preferovaně, 9-15 zbytků) obsahující některé z těchto epitopů. Například, fragment obsahující 109 - 112 epitopů může obsahovat zbytky 107 - 114, nebo 105 - 116. Také větší fragmenty, obsahující například celé funkční domény nebo mnohotné funkční domény (např. TMI, TMI->2, a TM2 nebo TM6, TM6->7 a TM7) mohou být také preferovány. Pro jiné presenilinové proteiny (např. pro mPSl nebo pro jiné non-lidské homology, nebo pro PS2) mohou být vybrána homologní místa.
Za použití stejného IBM Pustell programu byly identifikovány umístění aminokyselinových zbytků jako potenciální antigení místa v hPS2 proteinu a mohou být užitečné při generování protilátek podle vynálezu. Tyto pozice, korespondující pozicím v SEQ ID NO: 19, jsou uvedeny v tabulce 7.
Jako pro PSI, jiné metody vybrání antigeních determinant jsou, samozřejmě, v oboru známy a mohou být využity. Kromě toho mohou být využity větší fragmenty (např. 8-20 nebo, preferovaně, 9-15 zbytků) obsahující některé z těchto epitopů. Například, •Φ * · ······ ·· ·· · · · · · • · · · · · · ···· · · · ··· · • · · · · ··· ·· ······ ·· · fragment obsahující 310 - 314 epitopů může obsahovat zbytky 308 - 316, nebo 307 - 317. Také větší fragmenty, obsahující například celé funkční domény nebo mnohotné funkční domény (např. TMI, TMI->2, a TM2 nebo TM6, TM6->7 a TM7) mohou být také preferovány. Pro jiné presenilinové proteiny (např. pro mPSl nebo pro jiné non-lidské homology, nebo pro PSI) mohou být vybrána homologní místa.
Presenilinové imunogení přípravky mohou být produkovány ze surových extraktů (např. membránové frakce buněk vysoce exprivujících protein), z proteinů nebo peptidů významně purifikovaných z buněk, které je rekombinantně nebo přirozeně exprivují nebo, pro krátké imunogeny, chemickou syntesou peptidů. Presenilinové imunogeny mohou také být ve formě fúsních proteinů, ve kterých je non-presenilinový region vybrán pro své adjuvantní vlastnosti. Jak je zde použito, presenilinový imunogen by měl být definován jako přípravek obsahující peptid obsahující alespoň 4 -8, a lépe alespoň 9-15 následujících aminokyselinových zbytků presenilinových proteinů, jak jsou zde popsány nebo jinak uvedeny. Sekvence o méně zbytcích mohou, samozřejmě, také být užitečné v závislosti na zamýšleném použití a budoucím vývoji techniky. Proto, jakékoliv od presenilinů odvozené sekvence, které jsou použity pro generování protilátek k presenilinům by měly být považovány za presenilinové imunogeny.
Protilátky podle vynálezu mohou být polyklonální nebo monoklonální, nebo to mohou být fragmenty protilátek, včetně Fab fragmentů, F(ab')2 a jednořetězcových fragmentů protilátek. Kromě toho, po identifikaci užitečných protilátek metodou podle vynálezu, mohou být generovány rekombinantní protilátky, včetně jakýchkoliv fragmentů protilátky uvedených výše, stejně jako ·· ···♦ humanizované protilátky na základě non-lidských protilátek k presenilinovým proteinům. Ve světle předkládaných objevů presenilinových proteinů, stejně jako charakterizování jiných presenilinů jak je zde uvedeno, může odborník v oboru produkovat výše uvedené protilátky jakýmkoliv z mnoha standartních prostředků v oboru dobře známých. Pro přehled protilátkových technik, viz. Antibody Enineering: A Practical Guide, Borrebaek, ed., W.H. Freeman and Company, NY (1992), nebo Antibody Engineering, 2. vyd., Borrebaek, ed., Oxford University Press, Oxford (1995).
Obecně, polyklonální protilátky mohou být generovány nejprve imunizací myší, králíků, koz nebo jiných vhodných zvířat presenilinovým imunogenem ve vhodném nosiči. Pro zvýšení imunogenicity přípravku může být imunogen připojen na proteinový nosič nebo může být smísen s adjuvans (např. Freundovým adjuvans). Dosycovací injekce, ačkoliv nejsou nezbytné, jsou doporučovány. Po vhodné době pro umožnění vývoje protilátkové odpovědi, preferovaně po několika týdnech, může být zvířatům odebrána krev a sérum může být purifikováno pro izolování imunoglobulinových složek.
Podobně, obecně, anti-presenilinové monoklonální protilátky mohou být produkovány nejprve injikováním myší, králíků, koz nebo jiných vhodných zvířat presenilinovým imunogenem ve vhodném nosiči. Stěně jako výše může být použit proteinový nosič nebo adjuvans a dosycovací injekce (např. dva- nebo třikrát týdně během 8 až 10 týdnů) jsou doporučovány. Po umožnění vývoje protilátkové odpovědi jsou zvířata usmrcena a jejich sleziny jsou odstraněny a resuspendovány v, například, fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS). Buňky sleziny slouží jako zdroj • · · · · ·
lymfocytů, z nichž některé produkují protilátky vhodné specificity. Tyto buňky jsou potom fúsovány s imortalizovanou buněčnou linií (např. myelomovou) a produkty fúse jsou umístěny do mnoha tkáňových kultivačních jamek za přítomnosti selektivního agens jako je HAT. Jamky jsou potom sériově vyšetřovány a znovu umístěny na plotny, kdy se pokaždé selektují buňky vytvářející požadovanou protilátku. Typicky je provedeno několik vyšetření a opětovných umístění, dokud více než 90% jamek neobsahuje jeden klon, který je pozitivní na produkci protilátek. Monoklonální protilátky produkované takovými klony mohou být purifikovány standartními metodami jako je afinitní chromatografie za použití Protein A sepharosy, iontovou výměnnou chromatografií nebo variacemi a kombinacemi těchto technik.
Protilátky podle vynálezu mohou být značeny nebo konjugovány s jinými sloučeninami nebo materiály pro diagnostické a/nebo terapeutické použití. Například, mohou být navázány na radionuklidy, fluorescentní sloučeniny nebo enzymy pro zobrazení nebo terapii, nebo na liposomy pro zacílení sloučenin obsažených v liposomech na specifickou tkáň.
4. Transformované buněčné linie
Předkládaný vynález také poskytuje buňky nebo buněčné linie, jak prokaryotické, tak eukaryotické, které byly transformovány nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu, což způsobilo klonální propagaci těchto nukleových kyselin a/nebo expresi proteinů nebo peptidů jimi kódovaných. Tak buňky nebo buněčné linie budou mít využití nejen v propagaci a produkci nukleových kyselin a proteinů podle předkládaného vynálezu, ale také, jak je popsáno dále, jako modelové systémy pro diagnostické a terapeutické testy. Jak je zde použito, termín transformované buňky je míněn tak, aby zahrnoval jakoukoiv buňku, nebo potomstvo jakékoliv buňky, do které byla zavedena jakákoliv nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu, bud' transformací, transfekcí, infekcí nebo jinými prostředky. Metody pro produkci vhodných vektorů, transformování buněk těmito vektory a identifikování transformantů jsou dobře známé v oboru a jsou zde pouze stručně uvedeny (viz např. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Prokaryotické buňky použitelné pro produkci transformovaných buněk podle vynálezu zahrnují členy bakteriálních rodů Escherichia (např. E. coli), Pseudomonas (např. P. aeruginosa), a GBacillus (např. B. subtilis, B. stearothermophilus), stejně jako mnoho jiných a často v oboru používaných. Prokaryotické buňky jsou zejména užitečné pro produkci velkého množství proteinů a peptidů podle vynálezu (např. normálních nebo mutantních presenilinů, fragmentů presenilinů, fúsních proteinů presenilinů). Bakteriální buňky (např. E. coli) mohou být použity v mnoha expresních vektorových systémech včetně, např. plasmidů s T7 RNA polymerasa/promotor systémem, bakterifág lambda regulačními sekvencemi, nebo M13 fág mGPI-2. Bakteriální hostitelé mohou také být transformovány fúsními proteinovými vektory, které tvoří, například, lacZ, trpE, maltosa-vazebný protein, poly-His smyčky, nebo gluthation-S-transferasa fusní proteiny. Všechny z těchto, stejně jako mnoho jiných prokaryotních expresních systémů, je dobře známo v oboru a je běžně komerčně dostupných (např. pGEX-27 (Amrad, USA) pro GST fúse).
·· ···· • 9 ·
I « ·
* • · · *
9· ···
Eukarytní buňky a buněčné linie použitelné pro produkci transformovaných buněk podle vynálezu zahrnují savčí buňky a buněčné linie (např. PC12, COS, CHO, fibroblasty, myelomové buňky, neuroblastomy, hybridomy, buňky lidské embryonální ledviny 293, oocyty, embryonální kmenové buňky), hmyzí buněčné linie (např. za použití bakulovirového vektoru jako je pPbac nebo pMbac (Stratagene, La Jolla, CA)), kvasinky (za použití kvasinkového expresního vektoru jako je pYESHIS (Invitrogen, CA)), a houby. Eukaryotní buňky jsou zejména užitečné pro provedení, ve kterých je nezbytné, aby presenilinové proteiny, nebo jejich funkční fragmenty, prováděli funkci a/nebo podléhaly intracelulárním interakcím asociovaným s bud' normálními, nebo mutantními proteiny. Tak, například, transformované eukaryotické buňky jsou preferovány pro použití jako modely funkce nebo interakcí presenilinů a testy na vyšetřování kandidátů terapeutik preferovaně využívají transformovaných eukaryotických buněk.
Pro provedení exprese v eukaryotických buňkách může být vyvinuta řada vektorů a jsou komerčně dostupné, které umožňují indukovatelnou (např. LacSwitch expresní vektory, Stratagene, La Jolla, CA) nebo příbuznou (např. pcDNA3 vektory, Invitrogen, Chatsworth, CA) expresi presenilinových nukleotidových sekvencí pod regulací arteficiálního promotorového elementu. Takové promotorové elementy jsou často odvozeny od CMV nebo SV40 virových genů, ačkoliv jiné silné promotorové elementy, které jsou aktivní v eukaryotických buňkách mohou být také použity pro indukci transkripce presenilinových nukleotidových sekvencí. Typicky tyto vektory také obsahují arteficiální polyadenylační sekvence a 3' UTR, které mohou být také odvozeny od exogeních virových genových sekvencí nebo od jiných eukaryotických genů. Dále, v některých konstruktech jsou také ve vektoru obsaženy • · to · · · arteficiální, nekódující, sestřihovatelné introny a exony pro posílení exprese požadované nukleotidové sekvence (v tomto případě sekvencí pro preseniliny). Tyto expresní systémy jsou běžně dostupné z komerčních zdrojů a jsou typizovány vektory jako je pcDNA3 a pZeoSV (Invitrogen, San Diego, CA). Oba poslední vektory byly úspěšně použity pro způsobení exprese presenilinových proteinů v transfektovaných COS, CHO a PC12 buňkách (Levesque et al, 1996). Nespočet komerčně dostupných stejně jako na zakázku projektovaných vektorů je dostupno z komerčních zdrojů pro umožnění exprese jakéhokoliv požadovaného presenilinového transkriptu ve více méně jakémkoliv typu buněk, bud' konstitutivně, nebo po vystavení jistým exogením stimulům (např. odstranění tetracyklinu nebo expozice IPTG).
Vektory mohou být zavedeny do buněk příjemce nebo do hostitelských buněk různými metodami dobře v oboru známými včetně, ale nejenom, transfekce fosforečnanem vápenatým, transfekce fosforečnanem stroncia, DEAE dextranové transfekce, elektroporace, lipofekce (např. Dosper Liposomal transfekční reagens, Boehringer Mannheim, Germany), mikroinjekce, balistická inserce na mikrokorálky, protoplastová fúze nebo, pro virové nebo fágové vektory, infekce rekombinantním virem nebo fágem.
5. Modely transgeních zvířat
Předkládaný vynález také poskytuje produkci transgeních non-lidských zvířecích modelů pro studium Alzheimerovy choroby, pro vyšetřování kandidátů farmaceutických sloučenin, pro vytvoření explantovaných savčích CNS buněčných kultur (např. neuronálních, gliálních, organotypických nebo smíšených buněčných kultur), ve kterých je mutantni nebo divoký typ presenilinových sekvencí exprivován nebo ve kterých byly geny pro presenilin inaktivovány (např. knock-out delece), a pro hodnocení potenciálních terapeutických intervencí. Před předkládaným vynálezem existoval částečný zvířecí model pro Alzheimerovu chorobu prostřednictvím inserce a nadměrné exprese mutantní formy lidského genu pro proteinový prekursor amyloidu jako minigenu pod regulací promotorového elementu receptorů pro destičkový růstový faktor β (Games et al., 1995). Tento mutant (EAPP Val->Ile)
17 způsobuje objevení synaptické patologie a deposit amyloidového β peptidu v mozku transgeních zvířat nesoucích tento transgen ve velkém množství kopií. Tyto změny v mozku transgeních zvířat jsou velmi podobné těm, které jsou pozorovány pro lidskou AD (Games et al., 1995). Je, nicméně, stále nejasné, zda se tato zvířata stanou dementními, ale existuje obecný konsensus, že je nyní možné vytvořit alespoň některé aspekty AD u myší.
Zvířecí druhy, které jsou vhodné pro použití ve zvířecích modelech podle předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na, krysy,myši, křečky, morčata, králíky, psi, kočky, kozy, ovce, prasata, a non-lidské primáty (např. opice Rhesus, šimpanze). Pro použití v počátečních studiích jsou preferováni transgení hlodavci (např. myši) vzhledem k relativní snadnosti chovu a krátkému životu. Kromě toho, jak bylo uvedeno výše, transgení kvasinky nebo bezobratlý (např. hlísti, hmyz) mohou být preferováni pro některé studie, protože umožňují ještě rychlejší a levnější vyšetřování. Transgení non-lidští primáti mohou být nicméně preferováni pro dlouhodobější studie vzhledem k jejich větší podobnosti k lidem a jejich vyšším kognitivním schopnostem.
Za použití nukleových kyselin popsaných nebo jinak uvedených v tomto vynálezu existuje několik dostupných přístupů pro vytvoření c· ··· · • · · · ·***·· ·· 4 transgeních zvířecích modelů pro Alzheimerovu chorobu. Tak poskytnuté zvířecí modely zahrnují:
1) Zvířata, u kterých byl rekombinantně zaveden normální lidský gen pro presenilin do genomu jako další gen, pod regulací bud' exogeních, nebo endogeních promotorových elementů, a bud' jako minigen, nebo jako větší genomový fragment; u kterých byl normální lidský gen pro presenilin rekombinantně substituován za jednu nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin homologní rekombinací nebo zaměřením genu; a/nebo u kterých byla jedna nebo obě kopie zvířecích homologních genů pro presenilin rekombinantně humanizována částečnou substitucí sekvencí kódujících lidský homolog homologní rekombinací nebo zaměřením genu. Tato zvířata jsou užitečná pro hodnocení účinku transgeních postupů a účinků zavedení nebo substituce lidských nebo humanizovaných genů pro presenilin.
2) Zvířata, u kterých byl rekombinantně zaveden mutantní (t.j. patogení) lidský gen pro presenilin do genomu jako další gen, pod regulací bud' exogeních, nebo endogeních promotorových elementů, a bud' jako minigen, nebo jako větší genomový fragment; u kterých byl mutantní lidský gen pro presenilin rekombinantně substituován za jednu nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin homologní rekombinací nebo zaměřením genu; a/nebo u kterých byla jedna nebo obě kopie zvířecích homologních genů pro presenilin rekombinantně humanizována částečnou substitucí sekvencí kódujících mutantní lidský homolog homologní rekombinací nebo zaměřením genu. Tato zvířata jsou užitečná jako modely, které budou ukazovat některé nebo všechny charakteristiky, na biochemické, fyziologické úrovni nebo na úrovni chování, lidí nesoucích jednu nebo více alel, které jsou patogení pro Alzheimerovu chorobu nebo jiná onemocnění asociovaná s geny pro f · · · · presenilin.
3) Zvířata, u kterých byla rekombinantně zavedena mutantní verse jednoho ze zvířecích genů pro presenilin (nesoucí, například, specifickou mutaci korespondující, nebo podobnou, jedné z patogeních mutací lidských presenilinů) do genomu jako další gen, pod regulací buď exogeních, nebo endogeních promotorových elementů, a buď jako minigen, nebo jako větší genomový fragment; a/nebo u kterých byla mutantní verse jednoho ze zvířecích genů pro presenilin (např. nesoucí specifickou mutaci korespondující, nebo podobnou, jedné z patogeních mutací lidských presenilinů) rekombinantně substituována za jednu nebo obě kopie zvířecího homologního genu pro presenilin homologní rekombinací nebo zaměřením genu. Tato zvířata jsou užitečná jako také modely, které budou ukazovat některé nebo všechny charakteristiky, na biochemické, fyziologické úrovni nebo na úrovni chování, lidí nesoucích jednu nebo více alel, které jsou patogení pro Alzheimerovu chorobu nebo jiná onemocnění asociovaná s geny pro presenilin.
4) Knock-out zvířata, u kterých byla jedna nebo obě kopie genu pro zvířecí presenilin parciálně nebo kompletně deletována homologní rekombinací nebo zaměřením genu, nebo byla inaktivována insercí nebo substitucí exogení sekvence homologní rekombinací nebo zaměřením genu exogení sekvence (např. stop kodonů, lox p míst). Taková zvířata jsou použitelná jako modely pro studium účinků, které může mít ztráta exprese genu pro presenilin, pro hodnocení toho, zda ztráta funkce je preferovatelná pro pokračování exprese mutantních forem a pro vyšetření toho, zda mohou být vyvolány jiné geny pro nahrazení mutantních presenilinů (např. substituce PSI PS2) nebo pro intervenci s účinky jiných genů (např. APP nebo ApoE) způsobujících AD pro léčbu AD a jiných chorob. Například, normální gen pro presenilin může být nezbytný pro účinek mutantních APP genů pro jejich aktuální vyjádření jako AD a, proto, transgení presenilinové zvířecí modely mohou být užitečné v hodnocení takových mnohogenových interakcí.
Pro vytvoření zvířecího modelu (např. transgení myši) může být normální nebo mutantní gen pro presenilin (např. normální nebo mutantní hPSl, mPSl, hPS2, mPS2 atd.), nebo normální nebo mutantní verse rekombinantní nukleové kyseliny kódující alespoň funkční doménu presenilinu (například rekombinantní konstrukt obsahující mPSl sekvenci, do které byla substituována nukleotidové sekvence korespondující lidské mutantní sekvenci) insertována do buněk zárodečné linie nebo do kmenových buněk za použití standartních technik mikroinjekce do oocytu, nebo transfekce nebo mikroinjekce do embryonálních kmenových buněk. Zvířata produkovaná těmito nebo podobnými procesy jsou označována jako transgení. Podobně, pokud je požadováno inaktivovat nebo nahradit endogení gen pro presenilin, může být použita homologní rekombinace za použití embryonálních kmenových buněk. Zvířata produkovaná těmito nebo podobnými procesy jsou označována jako knock-out (inaktivovace) nebo knock-in (nahrazení) modely.
Pro injikování do oocytu může být jedna nebo více kopií rekombinantních DNA konstruktů podle předkládaného vynálezu insertována do pronukleu právě fertilizovaného oocytu. Tento oocyt je potom reimplantován do pseudo-těhotné náhradní matky. Živě narozená zvířata jsou vyšetřována na integranty za použití analýzy DNA (např. z ocasních žil myšího potomstva) na přítomnost insertovaných rekombinantních transgeních sekvencí. Transgeny ·· ····
mohou být buď kompletní genomové sekvence injikované jako YAC,
BAC, PAC nebo jiné chromosomální DNA fragmenty, cDNA s buď přirozeným promotorem nebo s heterologním promotorem, nebo minigen obsahující všechny kódující regiony nebo jiné elementy, které jsou nezbytné pro optimální expresi.
Retrovirová infekce časných embryí může být také provedena pro inserci rekombinantních DNA konstruktů podle vynálezu. V této metodě je transgen (např. normální nebo mutantní hPSl nebo PS2 sekvence) insertován do retrovirového vektoru, který je použit pro infikování embryí (např. myších nebo embryí non-lidských primátů) přímo během ranných stadií vývoje za generování chimér, z nichž některé povedou k transmisi zárodečné linie.
Homologní rekombinace za použití kmenových buněk umožňuje vyšetřování buněk s přeneseným genem pro identifikaci vzácných homologních rekombinací. Pokud jsou identifikovány, mohou být použity pro generování chimér za pomoci injikování blastocyst a část vzniklých zvířat bude vykazovat transmisi zárodečné linie z rekombinantní linie. Tato metoda je zejména užitečná, pokud je požadována inaktivace genu pro presenilin. Například, inaktivace mPSl genu u myší může být provedena projektováním DNA fragmentu, který obsahuje sekvence z mPSl exonu spolu se selektovatelným markérem. Homologní rekombinace vede k inserci markerové sekvence do prostředku exonu, což způsobí inaktivaci mPSl genu a/nebo deleci vnitřních sekvencí. DNA analýza jednotlivých klonů může potom být použita pro rozpoznání homologní rekombinace.
Techniky pro generování transgeních zvířat, stejně jako techniky pro homologní rekombinací nebo pro zaměření genu, jsou široce akceptovány a prováděny. Je dostupný laboratorní manuál
• · · • · · ·· ·· •· • ·· pro manipulaci s myšími embryi, například, který podrobně popisuje standartní laboratorní techniky pro produkci transgeních myší (Hogan et al., 1986). Pro vytvoření transgenu je požadovaná cílová sekvence )např. mutantní nebo přirozená sekvence pro presenilin) typicky ligována do klonovacího místa umístěného downstream od nějakého promotorového elementu, ktrerý bude regulovat expresi RNA ze sekvence pro presenilin. Downstream od sekvence pro presenilin je typicky arteficiální polyadenylační sekvence. V transgeních modelech, které byly použity pro úspěšné vytvoření zvířat, která napodobují aspekty dědičných lidských neurodegenerativních onemocnění, byly nejúspěšnější promotorové elementy promotor genu pro β podjednotku receptorú pro destičkový růstový faktor a křeččí promotor genu pro prionový protein, ačkoli jiné promotorové elementy, které řídí expresi v buňkách centrálního nervového systému mohou být také užitečné. Alternativním přístupem pro vytvoření transgenu je použití endogeního presenilinového promotoru a regulačních sekvencí pro řízení exprese presenilinového transgenu. Konečně, je možné vytvořit transgen za použití velkých genomových DNA fragmentů jako jsou YAC, které obsahují celý gen pro presenilin stejně jako jeho vhodné regulační sekvence. Takové konstrukty byly úspěšně použity pro řízení lidské APP exprese v transgeních myších (Lamb et al., 1993) .
Zvířecí modely mohou být také vytvořeny zaměřením endogeního genu pro presenilin tak, aby se alterovala endogení sekvence pro presenilin homologní rekombinací. Toto zacílení může mít za následek odstranění endogení sekvence (knock-out) nebo pozměnění endogení sekvence za vytvoření aminokyselinové změny asociované s lidským onemocněním nebo jinak abnormální sekvence (např. sekvence, která je více podobná lidské sekvenci než původní • · · · A • · · · · · ♦ zvířecí sekvence) (knock-in zvířecí modely). Je dostupné velké množství vektorů pro provedení tohoto a také jsou dostupné vhodné zdrohje genomové DNA pro yší a jiné zvířecí genomy, které může být zaměřena, od společností jako je Genome Systems lne. (St. Lous, Missouri, USA). Typickou vlastností těchto zaměřovačích vektorových konstruktů je to, že 2 až 4 kb genomové DNA je ligováno 5' na selektovatelný markér (např. bakteriální gen pro resistenci na neomycin pod kontrolou jeho vlasního promotorového elementu nazývaného neomycinová kazeta). Druhý DNA fragment z požadovaného genu je potom ligován downstream od neomycinové kazety, ale upstream od druhého selektovatelného markéru (např. thymidin kinasy). DNA fragmenty jsou vybrány tak, že mutantni sekvence mohou být zavedeny do zárodečné linie zaměřeného zvířete homologním nahrazením endogeních sekvencí jednou ze sekvecí obsažených ve vektoru. Alternativně, sekvence může být vybrána tak, aby způsobila deleci sekvence, které je normálně umístěna mezi levým a pravým raménem vektoru obklopujícím neomycinovou kazetu. První je známý jako knock in, druhý je známý jako knock-out. Opět, nespočet modelových systémů bylo vytvořeno, zejména pro zaměření knock-outů genů obsahujících ty, které jsou relevantní k neurodegenerativním onemocněním (např. zaměření delecí myšího APP genu zhengem et al., 1995; zaměření delecí myšího prionového genu asociovaného s degenerací CNS u lidí s nástupem v dospělosti, které provedl Bueler et al., 1996) .
Konečně, ekvivalenty transgeních zvířat, včetně zvířat s mutovanými enbo inaktivovanými geny pro presenilin, mohou být produkovány za použití chemiké nebo rentgenové mutagenese gamet, následované oplodněním. Za použití izolovaných nukleových kyselin, které jsou zde popsány nebo jinak dány, může odborník v oboru rychle vyšetřit vzniklé potomstvo pomocí, například,
přímého sekvencování, RFLP, PCR, nebo hybridizační analýzy pro detekování mutantů, nebo Suothern blottingu pro demonstrování ztráty jedné alely dávkou.
6. Testy pro léčiva, která ovlivňují expresi presenilinů
V jiné sérii provedení předkládaný vynález poskytuje testy pro identifikaci malých molekul nebo jiných sloučenin, které jsou schopné indukce nebo inhibice exprese presenilinových genů nebo proteinů (např. PSI nebo PS2).Testy mohou být provedeny in vitro za použití netransformovaných buněk, imortalizovaných buněčných linií nebo rekombinantních buněčných linií, nebo in vivo za použití transgeních zvířecích modelů, které jsou zde dány.
Konkrétně, testy mohou detekovat přítomnost zvýšené nebo snížené exprese PSI, PS2 nebo jiných s preseniliny spojených genů nebo proteinů na základě zvýšené nebo snížené exprese mRNA (za použití, např., prob nukleových kyselin, které jsou zde popsány), zvýšené nebo snížené hladiny PSI, PS2 nebo jiných s preseniliny příbuzných proteinových produktů (za použití , např., antipresenilinových protilátek, které jsou zde popsány), nebo zvýšené nebo snížené exprese markerového genu (např. β galatosidasy nebo luciferasy) operativně připojeného k presenilin 5' regulačnímu regionu v rekombinantním konstruktu.
Tak, například, je možné kultivovat buňky, o kterých je známo, že exprivují určitý presenilin a přidat do kultivačního media jednu nebo více testovaných sloučenin. Po ponechání dostatečně dlouhé doby (např. 0-72 hodin) pro to, aby mohla sloučenina indukovat nebo inhibovat expresi presenilinů může být jakákoliv změna v expresi od stanovéné základní hladiny detekována za ··· · · · · · • ··· · · · · ··· ♦ • · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· · použití jakékoliv techniky popsané výše a v oboru známé. V jednotlivých preferovaných provedeních jsou buňky z imortalizované buněčné linie jako je lidská neuroblastomová, glioblastomová nebo hybridomní buněčná linie. Za použití prob nukleových kyselin a/nebo protilátek popsaných v tomto vynálezu je detekce změn v expresi presenilinů, a tak identifikace sloučenin, které indukují nebo reprivují expresi presenilinů, pouze rutiním experimentováním.
V jednotlivých preferovaných provedeních je využit rekombinantní test, ve kterém je reporterový gen jako β-galaktosidasa, zelený fluorescentní protein, alkalická fosfatasa nebo luciferasa operativně připojen na 5' regulační regiony genu pro presenilin. Preferované vektory zahrnují Green Lantern 1 vektor (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) a Great AScAPe pSEAP vektor (Clontech, Palo Alto). hPSl regulační regiony zde popsané, nebo jiné presenilinové regulační regiony, mohou být snadno izolovány a klonovány odborníkem ve světle předkládaných objevů kódujících regionů těchto genů. Reporterový gen a regulační regiony jsou připojeny v rámečku (nebo v jednom ze třech možných čtecích rámečků) tak, že transkripce a translace reporterového genu může proběhnout pod kontrolou regulačních elementů pro presenilin. Rekombinantní konstrukt může potom být zaveden do jakéhokoliv vhodného typu buněk, ačkoliv savčí buňky jsou preferovány, a lidské buňky jsou nejvíce preferovány. Transformované buňky mohou být kultivovány v kultuře a, po stanovení základní hladiny exprese reporterového genu, může být testovaná sloučenina přidána do media. Snadná detekce exprese reporterového genu poskytuje rychlý, vysoce dokonalý test pro identifikaci induktorů a represorů genu pro presenilin.
·· ·· · · • · · · · • · · · · · · • · · · ······ ·· ·
Sloučeniny identifikované touto metodou budou mít potenciální použití při modifikaci exprese PSI, PS2 nebo jiných s preseniliny spojených genů in vivo. Tyto sloučeniny mohou být dále testovány na zvířecích modelech zde popsaných pro identifikaci těch sloučenin, které mají nej silnější in vivo účinek. Kromě toho, jak je zdee popsáno s ohledem na malé molekuly maící vazebnou aktivitu pro preseniliny, mohou tyto molekuly sloužit jako úvodní sloučeniny pro další vývoj farmaceutických sloučenin, například, podrobením těchto sloučenin sekvenčním modifikacím, molekulárnímu modelování a jiným běžným postupům využívaným při racionálním vývoji léčiv.
7. Identifikace sloučenin s vazebnou kapacitou pro presenilin
Ve světle předkládaných objevů bude odborník v oboru schopen provádět nové vyšetřovací metody pro identifikaci proteinů a jiných sloučenin, které se váží na, nebo jinak interagují s, preseniliny. Proteiny a sloučeniny budou zahrnovat endogení buněčné složky, které interagují s preseniliny in vivo a které, proto, poskytují nové cíle pro farmaceutické a terapeutické intervence, stejně jako budou zahrnovat rekombinantní, syntetické a jiné exogení sloučeniny, které mohou mít vazebnou kapacitu pro presenilin a, proto, mohou být kandidáty na farmaceutická agens. Tak, v jedné sérii provedení, buněčné lysáty nebo tkáňové homogenizáty (např. homogenizát lidského mozku, lyzát lymfocytů) může být vyšetřován na proteiny nebo jiné sloučeniny, které se váží na normální nebo na mutantní presenilin. Alternativně, jakákoliv z mnoha exogeních sloučenin, přirozeně se vyskytující a/nebo syntetická (např. knihovny malých molekul nebo peptidů) může být vyšetřována na vazebnou aktivitu pro presenilin. Malé molekuly jsou v tomto kontextu zejména preferovány, protože mohou být lépe absorbovány po orálním podání, mají méně potenciálních antigeních determinant a/nebo s větší pravděpodobností překonávají hematencefalickou barieru než větší molekuly jako jsou nukleové kyseliny nebo proteiny. Metody podle předkládaného vynálezu jsou zejména užitečné v tom, že mohou být použity pro identifikaci molekul, které se selektivně nebo preferovaně váží na mutantní formu presenilinového proteinu (více než na normální formu a proto mohou mít zejména význam v léčbě heterozygotních obětí této dominantní autosomální choroby.
Protože normální fyziologické role PSI a PS2 jsou dosud neznámé, mohou mít sloučeniny, které se vážou na normální, mutantní nebo na obě formy těchto presenilinů využití v léčbě a diagnostice. Sloučeniny, které se vážou pouze na normální presenilin mohou, například, účinkovat jako enhancery jejich normální aktivity a proto alespoň částečně kompenzovat ztracenou nebo nepřítomnou aktivitu mutantních forem presenilinů u obětí Alzheimerovy choroby. Sloučeniny, které se vážou jak na normální, tak na mutantní formy presenilinů mohou být užitečné, pokud různě ovlivňují aktivity dvou forem tak, že zmírňují celkovou odchylku od normální funkce. Alternativně, blokování aktivity jak normálních, tak mutantních forem jak PSI, tak PS2 může mít méně vážné fyziologické a klinické následky než normální progrese choroby a proto sloučeniny, které se váží na a inhibují jak normální, tak mutantní formy presenilinů, mohou být terapeuticky použitelné. Preferovaně jsou, nicméně, identifikovány sloučeniny, které mají vyšší vazebnou afinitu k mutantním presenilinům než k normálním presenilinům (např. alespoň 2-10 krát vyšší Ka) a které selektivně nebo preferovaně inhibují aktivitu mutantní formy. Takové sloučeniny mohou být identifikovány za použití jakýchkoliv technik zde popsaných a ··
«·« ··· ·· · potom srovnáním vazebných afinit pro normální a mutantní formy PSI a PS2 sloučeniny, která je kandidátem.
Účinek agens, které se vážou na preseniliny (normální nebo mutantní formy) může být monitorován buď přímým monitorováním této vazby za použití přístrojů (např. BIAcore, LKB Pharmacia, Sweden) pro detekci této vazby, například, podle změny ve fluorescenci, podle molekulové hmotnosti nebo podle koncentrace buď vazebného agens nebo presenilinové složky, buď v rozpustné fázy nebo v na substrát vázané fázy.
Po identifikaci metodou popsanou výše může být sloučenina, která je kandidátem produkována v množstvích dostatečných pro farmaceutické podání a testování (např. μ$ nebo mg vebo větší množství) a může být formulována ve farmaceuticky akceptovatelných nosičích (viz např. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A., vyd., Mack Pub., 1990). Tyto kandidáti sloučenin mohou pak být podány k transformovaným buňkám podle vynálezu, transgením zvířecím modelům podle vynálezu, k buněčným liniím odvozeným od zvířecích modelů nebo od lidských pacientů nebo pacientům trpícím Alzheimerovou chorobou. Zvířecí modely zde popsané jsou zejména užitečné v testování kandidátových sloučenin, které se váží na normální nebo mutantní presenilin na jejich terapeutickou účinnost.
Kromě toho, po identifikaci metodou popsanou výše může sloučenina, která je kandidátem, sloužit také jako úvodní sloučenina v projektování a vývoji nových léčiv. Například, jak je v oboru dobře známo, sekvenční modifikace malých molekul (např. nahrazení aminokyselinového zbytku s peptidy; nahrazení funkčních skupi peptidovými nebo non-peptidovými sloučeninami) je standartní přístup ve farmaceutické průmyslu pro vývoj nových ··· · · ··· • ··· · · · · ···· • · · · · · ··· φ· ··« ··· ·· · farmaceutických sloučenin. Takový vývoj obecně probíhá od úvodní sloučeniny, o které je známo, že má alespoň nějakou aktivitu (např. vazbu na PSI nebo blokovací schopnost) požadované farmaceutické látky. Konkrétně, pokud je identifikována jedna nebo více sloučeni, které mají alespoň nějakou pořžadovanou aktivitu (např. modulaci aktivity presenilinů), pak může strukturální srovnání molekul značně informovat odborníka naznačením částí úvodních sloučenin, které by měly být konservovány a částí, které mohou být měněny při rojektování nové kandidátové sloučeniny. Tak poskytuje předkládaný vynález také prostředky pro identifikaci úvodních sloučenin, které mohou být sekvenčně modifikovány za produkce nových kandidátových sloučenin pro použití v léčbě Alzheimerovy choroby. Tyto nové sloučeniny potom mohou být testovány jak na vazbu na presenilin, tak na blokování (např., v testech vazby popsaných výše) a na terapeutickou účinnst (např. na zvířecích modelech zde popsaných). Tento postup může být opakován dokud nejsou identifikovány sloučeniny, které mají požadovanou terapeutickou aktivitu a/nebo účinnost.
V každé presentované sérii provedení je proveden test pro detekci vazby mezi presenilinovou složkou a nějakou jinou skupinou. Zejména užitečné budou sekvenční testy, ve kterých jsou sloučeniny testovány na schopnost vazby na pouze normální nebo na pouze mutantní formy presenilinových funkčních domén za popužití mutantních a normálních presenilinových složek ve vazebném testu. U takových sloučenin se očekává, že budou mít největší terapeutický užitek, jak je podrobněji popsáno dále.
Presenilinovou složkou v testu může být kompletní normální nebo mutantní forma presenilinového proteinu (např. hPSl nebo hPS2 varianta), ale nemusí být. Spíše mohou být využity jednotlivé • ·
• · · · 4 ·· • · · · · • · 4 · · ·· •· · · ··· 4 4 · · ·· funkční domény presenilinů, jak byly popsány výše, buď jako separátní molekuly nebo jako část fúsního proteinu. Například, pro izolaci proteinů a sloučenin, které interagují s těmito funkčními doménami může být vyšetření provedeno za použití fúsních konstruktů a/nebo syntetických peptidů korespondujících k těmto regionům. Tak, pro PS2, mohou být vyrobeny GST-fúsní peptidy obsahující sekvence korespondující přibližně aminokyselinám 1 až 87 (N-konec), nebo 269 - 387 (TM6->7 smyčka), nebo jakýmkoliv jiným požadovaným konservovaným doménám. Pro kratší funkční domény může být produkován syntetický peptid korespondující, například, přibližně aminokyselinám 107 až 134 (TMI->2 smyčka). Podobně, pro PSI, mohou být vyrobeny GST- nebo jiné fúsní peptidy obsahující sekvence korespondující přibližně aminokyselinám 1 až 81 (N-konec), nebo 266 - 410 (TM6->7 smyčka), nebo syntetické peptidy korespondující, například, přibližně aminokyselinám 101 až 131 (TMl->2 smyčka). Volitelně, jsou možné různé kombinace fúsních proteinů a presenilinových funkčních domén a zde jsou uvedeny mnohé příklady. Kromě toho, funkční domény mohou být pozměněny pro tento test, například, zavedením reaktivní skupiny nebo aminokyselinového zbytku (např. cysteinu) do funkční domény, aby se usnadnila imobilizace domény na substrátu (např. za použití sulfhydrylových reakcí). Tak byl například syntetizován TMl->2 smyčkový fragment (31-mer) obsahující další C-terminální cysteinový zbytek. Tento peptid byl použit pro vytvoření afinitního substrátu pro afinitní chromatografii (Sulfo-link; Pierce) pro izolaci vazebných proteinů pro mikrosekvencování. Podobně mohou být vytvořeny j iné funkční domény nebo antigení fragmenty s modifikovanými zbytky (viz., např. příklad 10).
Proteiny a jiné sloučeniny identifikované těmito metodami mohou být purifikovány a charakterizovány akýmikoliv standartními metodami známými v oboru. Proteinu mohou, například, být purifikovány a separovány za použití elektroforetických (např. SDS-PAGE, 2D-PAGE) nebo chromatografických (např. HPLC) technik a mohou potom být mikrosekvencovány. Pro proteiny s blokovaným Nkoncem je použito štěpení (např. CNBr a/nebo trypsinem) určitého vazebného proteinu pro uvolnění peptidových fragmentů. Následující purifikace/charakterizace HPLC a mikrosekvencováním a/nebo spektrometrií hmoty konvenčními metodami poskytuje data vnitřní sekvence takových blokovaných proteinů. Pro neproteinové sloučeniny mohou být použity standartní analytické techniky organické chemie (např. IR, NMR a hmotová spektrometrie, analýzy funkčních skupin; rentgenová krystalografie) pro určení jejich struktury a identity.
Metody pro vyšetření buněčných lysátů, tkáňových homogenizátů, nebo knihoven malých molekul na kandidáty vazebných molekul pro presenilinysou v oboru dobře známy a, ve světle předkládaného objevu mohou být nyní využity pro identifikaci sloučenin, které se vážou na normální nebo mutantní presenilinové složky nebo které modulují aktivitu presenilinů jak je definována nespecifickými měřeními (např. změnami intracelulárního Ca1 2*, poměru GTP/GDP) nebo specifickými měřeními (např. změno v Αβ peptidové produkci nebo změnami v expresi jiných downstream genů, které mohou být monitorovány různými metodami, 2D gelovou elektroforesou, různou hybridizací nebo SAGE metodami). Preferované metody obsahují variace následujících technik:
1) přímé extrakce afinitní chromatografií;
2) ko-izolace presenilinových složek a navázaných proteinů nebo jiných sloučenin imunoprecipitací;
3) Biomolecular Interaction Assay (BiaCore); a
4) kvasinkových dvouhybridových systémů.
Tyto a jiné jsou diskutovány odděleně níže.
A. Afinitní chromatografie
Ve světle předkládaných objevů může být využito mnoha afinitních vazebných technik známých v oboru pro izolaci proteinů nebo jiných sloučenin, které se váží na preseniliny zde popsané. Obecně, presenilinová složka musí být imobilizována na substrátu (např. koloně nebo filtru) a roztok obsahující testovanou sloučeninu je uveden do kontaktu s presenilinovým proteinem, fúsí nebo fragmentem za podmínek, které jsou permisivní pro vazbu. Substrát je potom promyt roztokem pro odstranění nenavázaných nebo slabě naázaných molekul. Druhé promytí může potom eluovat ty sloučeniny, které se silně vážou na imobilizované normální nebo mutantní presenilinové složky. Alternativně, testované sloučeniny mohou být imobilizovány a roztok obsahují jednu nebo více složek presenilinů může být uveden do kontaktu s kolonou, filtrem nebo jiným substrátem. Schopnost presenilinových složek vázat se na testované sloučeniny může být určena stejně, jak bylo uvedeno výše nebo může být použita označená forma presenilinové složky (např. radioznačená nebo chemiluminiscentní funkční doména) pro rychlejší hodnocení vazby na substrátu imobilizovaných sloučenin. Kromě toho, protože jak o PSI, tak o PS2 se soudí, že to jsou s membránou asociované proteiny, může být preferováno, aby presenilinové proteiny, fúse nebo fragmenty byly inkorporovány do lipidových dvojvrstev (např. liposomů) pro navození jejich správného složení. Toto zejména platí, pokud je použita presenilinová složka obsahující alespoň jednu transmembránovou doménu. Takové presenilin-liposomy mohou být imobilizovány na
·· • · • · ··· < ·· • · ·· ···· ·· ·· · · · • · · · · • · ·♦···· • · · · ··* ··· ·· · substrátech (buď přímo nebo prostřednictvím j iného elementu v liposomové membráně), mohou procházet přes substrát s imobilizovanými testovanými sloučeninami, nebo mohou být použity v jakékoliv z mnoha dobře známých vazebných testů pro membránové proteiny. Alternativně může být presenilinová složka izolována v membránové frakci z buněk produkujících složku a tato membránová frakce může být použita ve vazebném testu.
B. Ko-imunoprecipitace
Jinou dobře charakterizovanou technikou pro izolaci presenilinových složek a jejich asociovaných proteinů nebo jiných sloučenin je přímá imunoprecipitace s protilátkami. Tato technika byla úsěšně použita, například, pro izolaci mnoha proteinů asociovaných se synaptickými váčky (Phizicky and Fields, 1994). Tak, buď normální nebo mutantni, volné nebo membránově vázané složky presenilinů mohou být smíseny v roztoku se sloučeninami, které jsou kandidáty, za podmínek, které jsou permisivní pro vazbu a presenilinové složky mohou být imunoprecipitovány. Proteiny nebo jiné sloučeniny mohou potom být identifikovány standartními technikami jak je popsáno výše.Obecné techniky pro imunoprecipitaci mohou být nalezeny v, například, Harlow and Lané, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.
Protilátky použité v tomto testu, jak je zde popsán, mohou být polyklonální nebo monoklonální, a zahrnují různé fragmenty protilátek (např. Fab, F(ab')2), stejně jako jednořetězcové protilátky a podobně.
C. Biomolecular Interaction Assay • β · · · ·
Jinou použitelnou metodou pro detekci a izolaci vazebných proteinů je Biomolecular Interaction Assay nebo BIAcore systém vyvinutý Pharmacia Biosensor a popsaný v protokolu výrobce (LKB Pharmacia, Sweden). Ve světle předkládaného vynálezu je odborník nyní schopen využít tento systém, nebo systém v podstatě ekvivalentní, pro identifikaci proteinů nebo jiných sloučenin majících vazebnou kapacitu pro preseniliny. BIAcore systém využívá afinitně purifikované anti-GST protilátky pro imobilizaci GST-fúsních proteinů na sensorovém čipu. Volitelně, jiné fúsní proteiny a korespondující protilátky mohou být substituovány. Sensor využívá povrchové plasmonové resonance, což je optický fenomen, který detekuje změny v indexech lomu. Homogenizát požadované tkáně probíhá přes imobilizovaný fúsní prtoein a interakce protein-protein jsou registrovány jako změny v indexu lomu. Tento systém může být použit pro určení kinetiky vazby a pro hodnocení toho, zda je pozorovaná vazba fyziologicky relevantní.
D. Kvasinkový dvouhybridový systém
Kvasinkové dvouhybridové systémy mají výhodu ve transkripčních faktorech, které jsou složeny ze dvou fyzikálně separovatelných, funkčních domén (Phizicky and Fields, 1994). Nejběžněji používaný je kvasinkový GAL4 transkripční aktivátor skládající se z DNA vazebné domény a transkripční aktivátorové domény. Dva různé klonovací vektory jsou použity pro generování separátních fúsí GAL4 domén na geny kódující potenciální vazebné proteiny. Fúsní prtoeiny jsou ko-exprivovány, zaměřeny na jádro a, pokud se interakce vyskytnou, produkuje aktivace reporterového genu (např. lacZ) detekovatelný fenotyp. například, Clontech
Matchmaker Systém-2 může být použit s Clontech mozkovou cDNA GAL4 aktivační doménovou fúsní knihovnou s presenilin-GAL4 vazebnými doménovými fúsními klony (Clontech, Palo Alto, CA). Ve světle těchto objevů je nyní odborník v oboru schopen produkovat mnoho presenilinových fúsí, včetně fúsí obsahujících buď normální nebo mutantní funkční domény presenilinových proteinů, a vyšetřit takové fúsní knihovny tak, aby identifikoval presenilinové vazebné proteiny.
E. Jiné metody
Sekvence nukleotidů a proteinových produktů, včetně mutantních a normálních forem těchto nukleových kyselin a jejich korespondujících proteinů, mohou být použity ve výše uvedených technikách pro izolaci jiných interagujících proteinů a pro identifikaci jiných genů, jejichž exprese je alterována nadměrnou expresí normálních presenilinových sekvencí, nebo sníženou expresí presenilinových sekvencí, nebo expresí mutantních presenilinových sekvencí. Identifikace těchto interagujících proteinů, stejně jako identifikace jiných genů, jejichž úroveň exprese je alterována působením mutantních presenilinových sekvencí (například) bude identifikovat jiné genové cíle, které budou mít přímý vliv na patogenesi této choroby v její klinické nebo patologické formě. Přesněji, budou identifikovány jiné geny, které mohou sami být místem jiných mutací způsobujících Alzheimerovu chorobu, nebo které mohou sami být cílem cíleného terapeutického zásahu (např. pro redukci hladin exprese k normálu nebo pro farmokologický blok účinků jejich nadměrné exprese) jako potenciální léčby této choroby. Přesněji, tyto techniky spočívají na PCR-založených a/nebo na hybridizaci založených metodách pro identifikaci genů, které sou různě exprivovány mezi dvěma stavy (buněčná linie exprivující normální preseniliny ve srovnání se stejnou buněčnou linií exprivující mutantní presenilinové sekvence). Tyto techniky zahrnují různé zobrazení, sériové analýzy genové exprese (SAGE), a hmotovou spektrometrii proteinových 2D-gelů a subtraktivní hybridizaci (popsanou Nowakem, 1995 a Kahnem, 1995).
Podle volby odborníka v oboru zde existuje mnoho jiných metod a vyšetření pro jednotlivé proteiny a jiné sloučeniny, stejně jako existují rozsáhlé knihovny proteinů a jiných sloučenin (např. fágové zobrazovací knihovny a klonovací systémy od Stratagene, La Jolla, CA) pro identifikaci molekul, které se váží na normální nebo mutantní složky presenilinů. Všechny z těchto metod obsahují krok smísení normálního nebo mutantniho presenilinového proteinu, fúse nebo fragmentu s testovanými sloučeninami, umožnění vazby (pokud se nějaká vyskytne) a testování navázaných komplexů. Všechny takové metody jsou nyní dostupné díky předkládanému objevu v podstatě čistých presenilinů, fragmetů funkčních domén podstatě čistých presenilinů, presenilinových fúsních proteinů, protilátek k presenilinům, a metod pro jejich výrobu a použití.
8. Metody pro identifikaci sloučenin pro modulaci aktivity presenilinů
V jiné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody pro identifikaci sloučenin se schopností modulovat aktivitu normálních a mutantních presenilinů. Jak je zde použito s ohledem na tuto sérii provedení zahrnuje termín ativita široce genovou a proteinovou expresi, post-translační zpracování presenilinového proteinu, přenos a lokalizaci, a jakoukoliv funkční aktivitu
100 (např. enzymatickou, receptořovou-efektořovou, vazebnou, kanálovou), stejně jako downstream účinky kterékoliv z nich. Preseniliny se zdají být integrálními membránovými proteiny normálně asociovanými s endoplasmatickým retikulem a/nebo Golgiho aparátem a mohou mít funkce zapojené v transportu nebo přenosu APP a /nebo v reguaci intracelulámí hladiny vápníku. Kromě toho, je známo, že presenilinové mutace jsou asociovány se zvýšenou produkcí AS peptidů, s objevením se plaků amyloidu a neurofibrilárních změtí, se snížením kognitivní funkce a s apoptotickou smrtí buněk. Proto, za použití transformovaných buněk a modelů transgeních zvířat podle předkládaného vynálezu, buněk získaných od subjektu nesoucích mutantní gen pro presenilin nebo zvířecích nebo lidských subjektů nesoucích přirozeně se vyskytující presenilinové mutace je nyní možné vyšetřovat farmaceutické a terapeutické kandidáty na jejich léčebné účinky detekováním změn v jedné nebo více z těchto funkčních charakteristik nebo fenotypových manifestací normální nebo mutantní presenilinové exprese.
Tak poskytuje předkládaný vynález metody pro vyšetřování nebo testování proteinů, malých molekul nebo jiných sloučenin, které modulují aktivitu presenilinu uvedením buněk in vivo nebo in vitro do kontaktu se sloučeninou, která je kandidátem a testováním změn v markérech asociovaných s normální nebo s mutantní aktivitou presenilinu. Markér asociovaný s aktivitou presenilinu může být jakákoliv měřitelná biochemická, fyziologická, histologická a/nebo behaviorální charakteristika asociovaná s expresí presenilinu. Konkrétně, užitečné markéry zahrnují jakoukoliv měřitelnou biochemickou, fyziologickou, histologickou a/nebo behaviorální charakteristiku, která odlišuje buňky, tkáně, zvířata nebo jednotlivce nesoucí alespoň jeden
J • · · ·
101 · ··· · · · · ··· · · · · · · f ··· ·· ··· ··· ·· * mutantní gen pro presenilin od jejich normálních protějšků, kromě toho, markérem může být jakékoliv specifické nebo nespecifické měření aktivity presenilinů. Presenilin specifická měření zahrnují měření exprese presenilinů (např. hladin presenilinové mRNA nebo proteinů), která mohou využívat proby nukleových kyselin nebo protilátek podle předkládaného vynálezu. Nespecifická měření zahrnují změny v buněčné fyziologii jako je pH, intracelulární vápník, hladiny cyklického AMP, poměry GTP/GDP, aktivita fosfatidylinositolu, fosforylace proteinů, atd., což může být monitorováno prostředky jako je cytosensorový mikrofyziometr (Molecuiar Devices lne., Spojené státy americké). Aktivace nebo inhibice aktivity presenilinů v jeho mutantní nebo normální formě může být také monitorována vyšetřením změn v expresi jiných genů, které jsou specifické pro presenilinovou dráhu vedoucí k Alzheimerově chorobě. Toto může být zobrazeno takovými technikami jako je diferenciální zobrazení, diferenciální hybridizace a SAGE (sekvenční analýza genové exprese), stejně jako dvourozměrovou gelovou elektroforesou buněčných lysátů. V každém případě, různě exprivované geny mohou být obasněny identickými studiemi před a po aplikaci sloučeniny, terá je kandidátem. Dále, jednotlivé geny, jejichž exprese je modulována podáním kandidátních sloučenin, mohou být zjištěny klonováním, sekvencováním nukleotidů, sekvencováním aminokyselin nebo hmotovou spektrometrií (viz Nowak, 1995).
Obecně, buňky mohou být uvedeny do kontaktu se sloučeninou, která je kandidátem a, po vhodné době (např. 0-72 hodin pro většinu biochemických měření kultivovaných buněk), může být testován markér aktivity presenilinů a ten může potom být srovnán se základním měřením.Základní měření může být provedeno před uvedením buněk do kontaktu se sloučeninou, která je kandidátem,
102 • · · · ·«· ·· ··· ··· nebo to může být externí základ stanovený jinými pokusy nebo jinak známý v oboru. Buňky mohou být transformované buňky podle předkládaného vynálezu nebo to mohou být explantáty od zvířat či jednotlivců. Konkrétně, buňky mohou být explantáty od nosičů mutací presenilinů (např. lidských subjektů s Alzheimerovou chorobou), nebo mohou být ze zvířecího modelu podle předkládaného vynálezu (např. transgení hlísti nebo myši nesoucí mutantní geny pro presenilin). Pro zvýšení účinku presenilinových mutací na AS dráhu mohou být použity transgení buňky nebo zvířata, která mají zvýšenou AS produkci. Preferované buňky zahrnují ty, které jsou z neurologických tkání jako jsou neuronální, gliální nebo smíšené buněčné kultury; a kultury fibroblastů, jater, ledvin, sleziny nebo kostní dřeně. Buňky mohou být uvedeny do kontaktu se sloučeninami, které jsou kandidát v kultuře in vitro, nebo mohou být podány in vivo živým zvířatům nebo lidským jedincům. Pro živá zvířata a lidské jedince může být testovaná sloučenina podána orálně nebo parenterálním způsobem vhodným pro sloučeninu. Pro klinické testy lidských subjektů může být měření prováděno periodicky (např. denně, týdně nebo měsíčně) po dobu několika měsíců nebo let.
Protože většina nosičů presenilinových mutací bude heterozygotních (t.j. nesoucích jednu normální a jednu mutantní presenilinovou alelu) mohou být sloučeniny testovány na svou schopnost modulovat normální, stejně jako presenilinovou aktivitu. Tak, například, sloučenina, která zvyšuje funkci normálních presenilinů může být užitečná v léčbě s preseniliny asociovaných chorob ako je Alzheimerova choroba. Alternativně, protože suprese aktivity jak normálních, tak mutantních presenilinů u heterozygotních jedinců může mít méně závažné klinické následky než progrese asociovaných onemocnění, může být
103 • 44 · 4 · · · • ···· · 444444 • · · · · ·
444 ·· ··· ··· »4 · žáoucí identifikovat sloučeniny, které inaktivují nebo suprivují všechny formy presenilinů. Preferovaně, nicméně, jsou identifikovány sloučeniny, které selektivně a specificky inaktivují nebo suprivují aktivitu mutantních presenilinů bez porušení funkce normálního presenilinového genu nebo proteinu.
Ve světle identifikace, charakterizace a objevů presenilinových genů a proteinů, nukleokyselinových prob pro preseniliny a protilátek pro preseniliny, a presenilinových transformovaných buněk a transgeních zvířat podle předkládaného vynálezu je nyní odborník v oboru schopen provádět mnoho testů, které budou detekovat modulování aktivity presenilinů sloučeninami, které jsou kandidáty. Zejména preferovaná a uvažovaná provedení j sou dále popsána o něco podrobněj i.
A. Exprese presenilinů
V jedné sérii provedení jsou využita specifická měření exprese presenilinů pro vyšetřování kandidátových sloučenin pro jejich schopnost ovlivňovat aktivitu presenilinů. Tak, za použití presenilinových nukleových kyselin a protilátek zde popsaných je možné použít hladiny mRNA nebo proteinů jako merkeru pro schopnost sloučeniny, která je kandidátem, modulovat aktivitu presenilinů. Použití takových prob a protilátek pro měření genové a proteinové exprese je dobře v oboru známé a je zde popsáno na jiném místě. Zejména žádoucí může být identifikace sloučenin, které mohou měnit relativní hadiny různých sestřižených variant presenilinů. Mnoho z těchto presenilinových mutací asociovaných s Alzheimerovou chorobou, například, je umístěno v regionu putativní TM6->7 smyčky, která je subjektem alternativního sestřihu v některých periferních tkáních (např. v bílých
104 krvinkách). Sloučeniny, teré mohou zvyšovat relativní frakvenci tohoto sestřihu mohou být proto účinné v zabránění exprese mutací v tomto regionu.
B. Intracelulární lokalizace
V jiné sérii provedení mohou být sloučeniny vyšetřovány na svou schopnost modulovat aktivitu presenilinů na základě jejich účinku na přenos a intracelulární lokalizaci presenilinů. Imunocytochemicky bylo u presenilinů ukázáno, že jsou lokalizovány v membránových strukturách asociovaných s endoplasmatickým retikulem a Golgiho aparátem, a jeden presenilinový mutant (H163R), ale žádný jiný, byl vizualizován v malých cytopiasmátických vesikulích neznámé funkce. Rozdíly v lokalizaci normálních a mutantních presenilinů mohou proto přispívat k etiologii s preseniliny spřažených onemocnění. Sloučeniny, které mohou ovlivňovat lokalizaci presenilinů mohou proto být identifikovány jako potenciální terapeutika. Standartní techniky známé v oboru mohou být využity pro detekci lokalizace presenilinů. Obecně, tyto techniky budou využívat protilátek podle předkládaného vynálezu a zejména protilátek, které se selektivně váží na jeden nebo více mutantních presenilinů, ale ne na normální preseniliny. Ja je dobře známé v oboru, takové protilátky mohou být značeny jakoukoliv z mnoha technik (např. flurescentní nebo radioaktivní značkou, značenými sekundárními protilátkami, avidin-biotinem, atd.) pro vizualizaci intracelulárního umístění presenilinů. Preseniliny mohou být ko-lokalizovány na určité struktury, jak je v oboru známo, za použití protilátek k markérům těchto struktur (např. TGN38 pro Golgiho, receptor pro transferin pro post-Golgiho transportní váčky, AMP2 pro lysozomy). Western bloty purifikovaných frakcí • · 4 ·
105 · ··; · ; : · ·· ·«· ·· ··· ··· ·· z buněčných lyzátů obohacených na různé intracelulárně membránově vázané organely (např. lysozomy, synaptosomy, Golgiho aparát) mohou být také použity. Kromě toho, relativní orientace různých domén presenilinů přes buněčné domény může být testována, například, elektronovou mikroskopií a protilátkami namířenými k těmto doménám.
B. Iontová regulace/metabolismus
V jiné sérii provedení mohou být sloučeniny testovány na jejich schopnost modulovat aktivitu presenilinů na základě měření intracelulárních hladin Ca2*, Na* nebo K* nebo jejich metabolismu. Jak bylo uvedeno výše, preseniliny jsou s membránou asociované proteiny, které mohou sloužit jako, nebo interagovat s, iontovými receptory nebo iontovými kanály. Tak, sloučeniny mohou být vyšetřovány na svou schopnost modulovat s preseniliny spojený vápník nebo jiné iontové metabolismy měřením bud' in vivo, nebo in vitro průtoku iontovými kanály a/nebo transmembránové napětí nebo proud za použití náplasťových svorek, napěťových svorek a fluorescentního barviva sensitivního na intracelulámí vápník nebo transmembránové napětí. Iontový kanál nebo funkce receptorů může být také testována měřením aktivace druhých poslů jako je cyklický ΆΜΡ, cGMP tyrosin kinas, fosfatas, zvýšením intracelulárního vápníku a podobně. Rekombinantně vyrobené proteiny mohou také být rekonstruovány v artificielních membránových systémech pro studium konduktance iontových kanálů a, proto, buňka použitá v tomto testu může obsahovat artificiální membránu nebo buňku. Testy na změnu v iontové regulaci nebo metabolismu mohou být provedeny na kultivovaných buňkách exprivujících endogenní normální nebo mutantní preseniliny. Takové studie mohou také být provedeny na buňkách • · • · · ·
106 transfektovaných vektory schopnými exprese ednoho z presenilinů, nebo funkční domény jednoho z presenilinů, v normální nebo v mutantní formě. Kromě toho, pro zvýšení signálu měřeného v takových testech mohou být buňky kotransfektovány geny kódujícími proteiny iontových kanálů. Například, Xenopus oocytární buňky nebo krysí ledvině (HEK293)buňky mohou být kotransfektovány normálními nebo mutantními sekvencemi pro preseniliny a sekvencemi kódujícími krysí mozkovou Na· SI podjednotku, Ca* βΐ podjednotku králičího kosterního svalu, nebo K* βΐ podjednotku krysího srdce. Změny v s presenilinem spojené nebo presenilinem zprostředkované aktivitě iontového kanálu mohou být měřeny dvěma mikroelektrodovými napěťovými svorkami v případě oocytů nebo celobuněčnými náplasúovými svorkami zaznamenávajícími HEK293 buňky.
C. Apoptosa nebo buněčná smrt
V jiné sérii provedení mohou být sloučeniny testovány na jejich schopnost modulovat aktivitu presenilinů na základě jejich účinku na s preseniliny spojenou nebo preseniliny zprostředkovanou apoptosu nebo smrt buněk. Tak, například, může být stanovena základní hladina apoptosy nebo buněčné smrti pro buňky v kultuře, nebo může být posmrtně určen základní stupeň ztráty neuronů v určitém věku pro zvířecí modely nebo pro lidské subjekty, a schopnost sloučeniny, která je kandidátem suprivovat nebo inhibovat apoptosu nebo buněčnou smrt může být měřena. Buněčná smrt může být měřena standartními mikroskopickými technikami (např. světelnou mikroskopií) nebo může být přesněji měřena apoptosa za pomoci charakteristicé morfologie jádra nebo charakteristické fragmentace DNA, která vytváří jaderná oka (viz Gavrieli et al., 1992; Jacobson et al., 1993; Vito et al., 1996).
• · · · ··· ·· ··· ··· ··
TUNEL může být také použit pro hodnocení smrti buněk v mozku (viz např. Lassmann et al., 1995). V preferovaných provedeních jsou sloučeniny vyšetřovány na svou schopnost suprivovat nebo inhibovat ztrátu neuronů v transgeních zvířecích modelech podle předkládaného vynálezu. Transgení myší nesoucí, například, mutantní lidský, mutantní myší nebo humanizovaný mutantní presenilinový gen mohou být použity pro identifikaci nebo pro hodnocení sloučenin, které mohou oddálit nebo zabránit neurodegeneraci asociované s Alzheimerovou chorobou. Podobný model transgeních myší, nesoucích mutantní APP gen, byl nedávno popsán Gamesem et al., (1995).
D. AS peptidová produkce
V jiné sérii provedení mohou být sloučeniny vyšetřovány na jejich schopnost modulovat s preseniliny spojenou nebo preseniliny zprostředkovanou změnu ve zpracování APP. AS eptid je produkován v několika izoformách vznikajících rozdíly ve zpracování APP. AS peptid je od 39 do 43 aminokyselinový derivát SAPP, který je progresivně deponován v difusních a senilních plácích a v krevních cévách subjektů s AD. v lidském mozku jsou AS peptidy heterogení jak v N-, tak v C-konci. několik pozorování, nicméně, naznačilo, že jak kompletní, tak N-terminálně zkrácené formy dlouhých AS peptidů končících zbytky 42 nebo 43 (t.j. AS1-42/43 a ASx-42/43) mají významnější roli u AD než peptidy končící zbytkem 40. Tak, AS1-42/43 a ASx-42/43 jsou časným a významným rysem jak senilních plaků, tak difúsních plaků, zatímco peptidy končící zbytkem 40 (t.j. AS1-40 a ASx-40) jsou predominantně asociovány s podsadou zralých plaků a s amyloidovými krevními cévami (viz např. Iwatsubo et al., 1995; Gravina et al., 1995; Tamaoka et al., 1995; Podlisny et al.,
108
1995). Kromě toho, izoformu s dlouhou koncovou částí mají větší náchylnost ke tvorbě vláken, a je proto míněno, že jsou více neurotoxické než AS1-40 peptidy (Pike et al., 1993; Hilbich et al., 1991). Konečně, chybné mutace v kodonu 717 SAPP genu asociované s časným nástupem FAD vedou k nadprodukci AS s dlouhým koncem v mozku postižených nosičů mutace, v periferních bu%ňkách a plasmě jak postižených, tak presymptomatických jedinců a v buněčných liniích transfektovaných SAPP7i7 mutantni cDNA (Tamaoka et al., 1994; Suzuki et al., 1994). jak je popsáno v příkladu 18 níže, nyní jsme objevili, že zvýšená produkce AS peptidů s dlouhým koncem je také asociována s mutacemi v genech pro preseniliny.
Tak v jedné sérii provedení poskytuje předkládaný vynález metody pro vyšetření kandidátových sloučenin na jejich schopnost blokovat nebo inhibovat zvýšenou produkci dlouhých izoforem AS peptidů v buňkách a transgeních zvířatech exprivujících mutantni gen pro presenilin. Konkrétně, předkládaný vynález poskytuje takové metody, ve kterých byly kultivované savčí buňky, jako jsou mozkové buňky nebo fibroblasty, transformovány podle metod zde popsaných, nebo ve kterých byla transgení zvířata, jako jsou hlodavci nebo non-lidští primáti, produkovány metodami, které jsou zde popsány tak, že exprivují reativně vysoké hladiny mutantních presenilinů. Volitelně mohou být takové buňky nebo transgení zvířata také transformována tak, aby exprivovaly normální formu SApp proteinu v relativně vysokých hladinách.
V této sérii provedení je sloučenina, která je kandidátem, podána k buněčné linii nebo transgením zvířatům (např. přidáním do media buněk v kultuře; nebo orálním nebo parenterálním způsobem zvířatům) a, po vhodné době (např. 0-72 hodin pro
109 • · · · · · · • ··· · · · · ··· · • · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· · buňky v kultuře, dnech nebo měsících pro zvířací modely) je odebrán biologický vzorek (např. supernatant buněčné kultury nebo buněčný lysát z buněk v kultuře; tkáňový homogenizát nebo plasma od zvířat) a je testován' na hladinu dlouhých izoforem AE peptidů. Mohou být určeny absolutní hladiny peptidů (např. nMol/ml) nebo relativní hladiny (např., poměr dlouhých a krátkých AE izoforem). AE izoformy mohou být detekovány jakýmkoliv způsobem v oboru známým )např. elektroforetickou separací nebo sekvencováním) ale, preferovaně, jsou využity protilátky, které jsou specifické k dlouhým izoformám pro určení absolutních nebo reativních hladin AE1-42/43 nebo AEx-42/43 peptidů. Kandidáti farmaceutik nebo terapeutik, které redukují absolutní nebo relativní hladiny těchto dlouhých AE izoforem, zejména v modelech transgeních zvířat podle předkládaného vynálezu, budou pravděpodobně mít terapeutický užitek v léčbě Alzheimerovy choroby, nebo jiných chorob způsobených mutacemi presenilinů nebo aberacemi v APP metabolismu.
E. Fosforylace mikrotubulárních asociovaných proteinů
V jiné sérii provedení mohou být sloučeniny, které jsou kandidáty vyšetřovány na svou schopnost modulovat aktivitu presenilinů hodnocením účinku sloučeniny na úroveň fosforylace mikrotubulárních asociovaných proteinů (MAP) jako je Tau. Abnormální fosforylace Tau a jiných MAP v mozku obětí Alzheimerovy choroby je v oboru dobře známá. Tak sloučeniny, které mohou zabránit nebo inhibovat abnormální fosforylaci MAP mohou mít užitek v léčbě s preseniliny asociovaných onemocnění jako je AD. Jak je uvedeno výše, buňky od normálních nebo mutantních zvířat nebo subjektů, nebo transformované buněčné linie a zvířecí modely podle předkládaného vynálezumohou být •4 4444 použity. Preferované testy budou využívat buněčné linie nebo zvířecí modely transformované mutantními lidskými nebo humanizovanými mutantními geny pro presenilin. Základní stav fosforylace MAP v těchto buňkách může být stanoven a potom může být sloučenina, která je kandidátem, testována na svou schopnost zabránit, inhibovat nebo působit proti hyperfosforylaci asociované s mutanty. Stav fosforylace MAP může být určen jakoukoliv standartní metodou známou v oboru, ale preferovaně jsou využity protilátky, které se vážou selektivně ne fosforylované nebo nefosforylované epitopy. Takové protilátky k fosforylovaným epitopům Tau proteinu jsou známé v oboru (např. ALZ50).
9. Vyšetřování a diagnostika Alzheimerovy choroby
A. Obecné diagnostické metody
Geny pro preseniliny a genové produkty, stejně jako od presenilinů odvozené proby, primery a protilátky,které jsou zde popsané, jsou užitečné při vyšetřování nosičů alel asociovaných s Alzheimerovou chorobou, pro diagnostiku obětí Alzheimerovi choroby, a pro vyšetřování a diagnostiku příbuzných presenilních a senilních demencí, psychyatrických onemocnění jako je schizofrenie adeprese a neurologických onemocnění jako je mrtvice a mozkové krvácení, kde všechny jsou pozorovány ve větším nebo menším rozsahu u symptomatických subjektů nesoucích mutace PSi nebo PS2 genů nebo APP genu. Jedinci rizikový pro Alzheimerovu chorobu, jako jsou ti s AD přítomnou vrodiném rodokmenu, nebo jedinci, kteří nejsou známý jako rizikový, mohou být rutině vyšetřováni za použití prob pro detekci přítomnosti mutantních presenilinových genů nebo proteinů různými technikami. Diagnostia
111 dědičných případů těchto chorob může být provedena technikami založenými na nukleových kyselinách (včetně genomových a mRNA/cDNA sekvencích), proteinech a/nebo protilátkách zde popsaných, včetně funkčních testů projektovaných pro detekci selhání nebo zvýšení normální presenilinové aktivity a/nebo přítomnosti specifikých nových aktivit způsobených mutantními preseniliny. Preferovaně jsou metody a produkty založeny na lidských PSI nebo PS2 nukleových kyselinách, proteinech nebo protilátkách jak jsou zde popsány. Jak bude odborníkům v oboru nicméně jasné, signifikantní evoluční konservace velkých částí PSI a PS2 nukleotidových a aminokyselinových sekvencí, i v druzích tak odlišných jako jsou lidé, myši, C. elegans a Drosophila,umožňuje odborníkům použít takové non-lidské homologní nukleové kyseliny, proteiny a protilátky i pro aplikace zaměřené na lidské nebo jiné zvířecí subjekty. Tak bude, pro stručnost, ale bez omezení rozsahu vynálezu, následující popis zaměřen na použití lidských homologů PSI a PS2. Bude nicméně jasné, že homologní sekvence z jiných druhů, včetně těch, které jsou zde popsány, budou pro mnohé účely ekvivalentní.
Jak bude odborníkem oceněno, volba diagnostické metody podle předkládaného vynálezu bude ovlivněna charakterem dostupných biologických vzorků, které budou testovány a charakterem požadované informace. PSI, například, je vysoce exprivován v mozkové tkáni, ale mozkové biopsie jsou invazivní a nákladné postupy, zejména pro rutiní vyšetřování. Jiné tkáně, které exprivují signifikantní hladiny PSI, nicméně, mohou demostrovat alternativní sestřih (např. lymfocyty) a proto, PSI mRNA nebo protein z frakových buněk může být méně informativní. Tak může být preferován test založený na genomové PSI DNA, protože žádná informace nebude záviset na alternativním sestřihu a protože v ·· • · • · ··· • ·· • · · ··· · • · · · ··· ··· ·· ·
112 podstatě všechny jaderné buňky mohou poskytnout použitelný vzorek.Diagnostiká založená na jiných presenilinech (např. hPS2, mPSl) jsou subjektem podobných úvah: dostupností tkání, hladin exprese v různých tkáních a alternativních mRNA a proteinových produktů vzniklých z alternativního sestřihu.
B. Na proteinech založená vyšetření a diagnostika
Pokud je diagnostický test založen na presenilinových proteinech, pak je mnoho způsobů možných, například, diagnosa může být dosažena monitorováním rozdílů v elektroforetické mobilitě normálních a mutantních proteinů. Takový přístup bude zejména užitečný pro identifikaci mutantů, ve kterých je přítomna substituce náboje, nebo ve kterých inserce, delece nebo substituce vedly k signifikantní změně v elektroforetické migraci vzniklého proteinu. Alternativně, diagnosa může být založena na rozdíelech charakteru proteolytického štěpení normálních a mutantních proteinů, rozdílech v molárních poměrech různých aminokyselinových zbytků nebo na funkčních testech demonstrujících pozměněnou funkci genových produktů.
V preferovaných provedeních bude na proteinech založená diagnostika využívat rozdílů ve schopnosti protilátek vázat se na normální a mutantní presenilinové proteiny (zejména na hPSl nebo hPS2). Takové diagnostické testy mohou využívat protilátek, které se váží na normální proteiny, ale ne na mutantní proteiny, nebo naopak. Jednotlivě, může být použit test, ve kterém je mnoho monoklonálních protilátek, každá schopná vazby na mutantní epitop. Hladina navázané anti-mutantní protilátky ve vzorku získaného od testovaného subjektu (vizualizovaná například radioznačením, ELISA nebo chemiluminiscencí) může být srovnána s • ·· · · ·· ···· ···· ···· ·· · ··· · · · · · • ··· · · · · ··· · • · · · · · ··· »· ··· ··· ·· · hladinou vazby v kontrolním vzorku. Alternativně, může být použita protilátka, která se váže na normální, ale ne na mutantní preseniliny a snížená hladina vazby protilátky může být použita pro odlišení homozygotních normálních jedinců od mutantních heterozygotů nebo homozygotů. Takové protilátková diagnostika může být použita pro in sítu imunochistochemii za použití bioptických vzorků ze tkání CNS získaných antemortem nebo postmortem, včetně neuropatologických struktur asociovaných s těmito chorobami jako jsou neurofibrilární oka a plaky amyloidu, nebo může být použita se vzorky kapalin jako je mozkomíšní mok nebo s periferní tkání jako jsou bílé krvinky.
C. Na nukleových kyselinách založená vyšetření a diagnostika
Pokud je diagnostický test založený na nukleových kyselinách ze vzorku, pak může být test založen na mRNA, cDNA nebo genomové DNA. Pokud je použita mRNA ze vzorku, pak musí být provedeno mnoho stejných úvah s ohledem na zdroj tkáně a pravděpodobnost alternativního sestřihu. To znamená, že zde musí být malá nebo žádná exprese transkriptů, pokud nejsou vybrány nebo dostupné vhodné zdroje, a alternativní sestřih může vést ke ztrátě nějaké informace nebo k obtížné interpretaci. Nicméně, již jsme ukázali (Sherrington et al., 1995; Rogaev, 1995), že mutace v 5' UTR, 3' UTR, otevřeném čtecím rámečku a místech sestřihu jak PSI, tak PS2 mohou být spolehlivě identifikovány v mRNA/cDNA izolované z bílých krvinek a/nebo kožních fibroblastů. Pokud je testována mRNA, cDNA nebo genomová DNA, mohou být použity standartní metody dobře známé v oboru pro detekci přítomnosti určité sekvence buď in sítu nebo in vitro (viz např. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Obecně
114 může nicméně být vyšetřována jakákoliv tkáň nebo jaderné buňky.
Genomová DNA použitá pro diagnosu může být získána z tělesných buněk, jako jsou ty, které jsou přítomny v krvi, tkáňových biopsiích, chirurgických vzorcích nebo autoptickém materiálu. DNA může být izolována a použita přímo pro detekci specifické sekvence, nebo může být amplifikována polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) před anaýzou. Podobně, RNA nebo cDNA mohou být také použity, s nebo bez PCR amplifikace. Pro detekci specifické sekvence nukleových kyselin může být použito přímé sekvencování nukleotidů, hybridizace za použití specifických oligonukleotidů, trávení restrikčními enzymy a mapování, PCR mapování, RNAsová protekce, chemické chybné štěpení, ligasou zprostředkovaná detekce a různé jiné metody. Oligonukleotidy specifické pro jednotlivé sekvence mohou být chemicky syntetizovány a radioaktivně nebo neradioaktivně (např. biotinem, ethidiumbromid) značeny a hybridizovány na jednotlivé vzorky imobilizované na membránách nebo na jiných pevných nosičích (např. dot-blot nebo přenosem z gelů po elektroforese), nebo v roztoku. Přítomnost nebo absence cílových sekvencí může být potom vizualizována za pomoci metod jako je autoradiografie, fluorometrie nebo kolorimetrie. Tyto postupy mohou být automatizovány za použití mnoha krátkých oligonukleotidů známé sekvence fixovaných ve známé hustotě na silikonové plátky.
1. Vhodné proby a primery
Pro hybridizaci, RNAsovou protekci, ligasou zprostředkovanou detekci, PCR amplifikaci nebo pro jakoukoliv jinou standartní metodu bude mnoho subsekvencí sekvencí pro preseniliny zde popsaných použitelných jako proby a/nebo primery. Tyto sekvence a • · ··· ·
115 subsekvence budou zahrnovat jak normální presenilinové sekvence, tak poškozující mutantní sekvence. Obecně, použitelné sekvence budou obsahovat alespoň 8-9, lépe 10 - 50 a nejlépe 18 - 24 souvislých nukleotidů z presenilinových intronů, exonů nebo intro/exon spojení. V závislosti na cílové sekvenci, požadované specificitě a budoucím vývoji techniky mohou mít význam také kratší sekvence. Proto, jakákoliv od presenilinů odvozená sekvence, která je použita pro izolaci, klonování, amplifikaci, identifikaci nebo jinou manipulaci s presenilínovou sekvencí může být považována za vhodnou probu nebo primer. Zejména budou považovány za užitečné sekvence obsahující nukleotidové pozice z genů pro preseniliny, o kterých je známo, že jsou zde přítomny chorobu způsobující mutace, nebo sekvence, které sousedí s těmito pozicemi.
(a) PSI proby a primery
Jak bylo uvedeno výš, bylo nyní identifikováno mnoho chorobu způsobujících mutací v lidském PSI genu. Detekce těchto a jiných PSI mutací je nyní umožněna za použití izolovaných prob nukleových kyselin nebo primerů odvozených od normálních nebo od mutantních PSI genů. Zejména užitečné jsou proby nebo primery, odvozené od sekvencí kódujících N-konec, TM1-TM2 region a TM6-TM7 region. Jak bylo uvedeno výše, nicméně, byly již identifikovány mutace, které ovlivňují jiné regiony PSI proteinu a, za použití metod zde popsaných, jich bude více jednoznačně identifikováno. Proto, předkládaný vynález poskytuje izolované proby a primery nukleových kyselin korespondující normálním a mutantním sekvencím z jakékoliv části PSI genu, včetně intronů a 5' a 3' UTR, u kterých může být ukázáno, že jsou asociovány s vývojem Alzheimerovy choroby.
• · ···*
116 * ··· · ζ ζ · ·· ··· ·· »·» ··· ··
Pouze jako příklad, a bez omezení vynálezu, mohou být využity proby a primery odvozené od hPSl DNA segmentu bezprostředně sousedícího C410Y mutaci ve vyšetřovacích a diagnostických metodách. Tato mutace vzniká,alespoň u některých jedinců, ze substituce A za G v pozici 1477 SEQ ID NO: 1. Tak, genomová DNA, mRNA nebo cDNA získaná ze vzorků periferní krve od jedince mohou být vyšetřovány za použití oligonukleotidových prob nebo primerů obsahujících toto potenciální místo mutace. Pro hybridizační proby pro tuto mutaci mohou být využity proby o 8 - 50 a lépe proby o 18 - 24 bazích překlenující místo mutace (např. bp 1467 1487 v SEQ ID NO: 1). Pokud má být proba použita s mRNA, pak by samozřejmě měla být komplementární k mRNA (a proto korespondující nekódujícímu řetězci PSI genu). Pro proby použité s genomovou DNA nebo s cDNA může být komplementární k oboum řetězců. Pro detekci sekvencí obsahujících tuto mutaci PCR metodou by měly vhodné primery obsahovat sekvence o 8 - 50, a lépe 18 - 24 nukleotidech délky odvozené od regionů sousedících s mutací na kterékoliv straně, a které korespondují pozicím kdekoliv od 1 do 1000 bp, ale lépe od 1 - 200 bp, vzdálené od místa mutace. PCR primery, které jsou 5' od místa mutace (na kódujícím řetězci) by měly korespondovat v sekvenci kódujícímu řetězci PSI genu, zatímco PCR primery, které jsou 3' k místu mutace (na kódujícím řetězci) by měly korespondovat nekódujícímu nebo anti-sense řetězci (např. 5' primer korespondující bp 1451 - 1468 SEQ ID NO: 1 a 3' primer korespondující komplementu 719 - 699 SEQ ID NO: 14).
Podobné primery mohou být vybrány pro jiné PSI mutace nebo pro mutace hot-spots obecně. Například, 5' PCR primer pro M146L mutaci (A->C v bp 684) může obsahovat sekvenci korespondující přibližně bp 601 - 620 SEQ ID NO: 1 a 3' primer může ·· ····
117 •· •« • ···· korespondovat komplementu o přibližně 1328 - 1309 SEQ ID NO: 8. Povšimněte si, že tento příklad využívá primerů jak z intronových, tak z exonových sekvencí. Jako jiný příklad, vhodný 5' primer pro A246E mutaci (C->A v bp 985) může obsahovat sekvence korespondující přibližně bp 907 - 925 SEQ ID NO: 1 nebo 3' primer může korespondovat komplementu o přibližně 1010 - 990 SEQ ID NO: 1. Jako jiný příklad, 5' primer pro H163R mutaci (A->G v bp 736 SEQ ID NO: 1 nebo v bp 419 SEQ ID NO: 9) může obsahovat sekvence korespondující přibližně bp 354 - 375 SEQ ID NO: 9 nebo 3' primer může korespondovat komplementu o přibližně 581 - 559 SEQ ID NO: 1. Podobně, mohou být využity intronové nebo exonové sekvence, například, pro produkci 5' primerů pro L286V mutaci (C->G v bp 1104 SEQ ID NO: 1 nebo v bp 398 SEQ ID NO: 11) obsahující sekvenci korespondující přibližně bp 249 - 268 SEQ ID NO: 11 nebo bp 1020 - 1039 SEQ ID NO: 1, a 3' primery korespondující komplementu přibližně bp 510 - 491 SEQ ID NO: 11.
Mělo by být uvedeno, že proby a primery mohou obsahovat specificky mutované nukleotidy. Tak, například, hybridizační proba nebo 5' primer mohou být produkovány pro C410Y mutaci tak, že obsahují sekvenci korespondující přibližně bp 1468 - 1486 SEQ ID NO: 1 pro vyšetření nebo pro amplifikaci normálních alel, nebo korespondující stejné sekvenci, ale s bp korespondující bp 1477 pozměněnou (G->T) pro vyšetření nebo amplifikaci mutantních alel.
(b) PS2 proby a primery
Stejné obecné úvahy jak byly popsány výše s ohledem na proby a primery pro PSI mohou být stejně aplikovány na proby a primery pro PS2. Konkrétně, proby a primery mohou korespondovat intronovým, exonovým nebo intron/exonovým vazebným sekvencím, «· ···· ·· ·· · · * • · · · · , *··*·· • · · :
• · · · · · ·· · • ·
118 mohou korespondovat sekvencím z kódujících nebo nekódujících (antisense) řetězců, a mohou korespondovat normálním nebo mutovaným sekvencím.
Pouze jako příklad, PSI N141I mutace (A->T v bp 787) může být vyšetřována PCR amplifikací sousedního DNA fragmentu za použití 5' primeru korespondujícího přibližně bp 733 - 751 SEQ ID NO: 18 a 3' primeru korespondujícího komplementu přibližně bp 846 - 829 SEQ ID NO: 18. Podobně, 5' primer pro M239V mutaci (A->G v bp 1080) může obsahovat sekvenci korespondujícího přibližně bp 1009 - 1026 a 3' primer může korespondovat komplementu přibližně bp 1118 - 1101 SEQ ID NO: 18. Jako jiný příklad, sekvence kódující region sousedící s I420T mutací (T->C v bp 1624) může být vyšetřována PCR amplifikací genomové DNA za použití 5' primeru korespondujícího přibližně bp 1576 - 1593 SEQ ID NO: 18 a 3' primeru korespondujícího komplementu přibližně bp 1721 - 1701 SEQ ID NO: 18 pro generování produktu o 146 párech baží. Tento produkt, například, může být potom probován alelově specifickými oligonukleotidy pro divoký typ (např. bp 1616 - 1632 SEQ ID NO: 18) a/nebo pro mutantní typ (např. bp 1616 - 1632 SEQ ID NO: 18 s T->C v bp 1624) sekvence.
(2) Hybridizační vyšetřování
Pro in sítu detekci normálních nebo mutantních PSI, PS2 nebo jiných s preseniliny spojených sekvencí nukleových kyselin může být standartními technikami připraven vzorek tkáně a potom může být uveden do kontaktu s jednou nebo více z výše popsaných prob, preferovaně s takovou, která je značena pro usnadnění detekce a test pro hybridizaci nukleových kyselin je proveden za přísných podmínek, které umožňují hybridizaci pouze mezi probou a vysoce
119 nebo přesně komplementárními sekvencemi. Protože se většina s doposud detekovaných mutací PSI a PS2 skládá ze substituce jedné nukleové kyseliny, budou vyžadovány hybridizační podmínky vysoké přísnosti pro odlišení normálních sekvencí od většiny mutantních sekvencí. Pokud je známý presenilinový genotyp rodičů subjektu, pak mohou být proby vybrány podle něj. Alternativně mohou být využity proby pro mnoho mutantů sekvenčně nebo v kombinaci. Protože většina jedinců majících mutace presenilinů bude heterozygotních, mohou být také použity proby k normálním sekvencím a homozygotní normální individua mohou být odlišena podle množství vazby (např. podle intensity radioaktivního signálu). V jiné variaci může být využit test kompetitivní vazby, ve kterém jsou použity jak normální, tak mutantní proby, ale pouze jedna z nich je značena.
(3) Restrikční mapování
Alterace sekvence mohou také tvořit nebo rušit náhodná místa pro restrikční enzymy, která jsou odhalena použitím trávení vhodným enzymem, které je násedováno gel-blot hybridizací. DNA fragmenty nesoucí místo (normální nebo mutantní) jsou detekovány zvýšením nebo snížením jejich velikosti, nebo zvýšením nebo snížením počtu korespondujících restrikčních fragmentů. Taková analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP), nebo restrikční mapování, může být použito s genomovou DNA, mRNA nebo cDNA. Sekvence pro preseniliny mohou být amplifikovány PCR za použití výše popsaných primerů před restrikcí, a v tomto případě může délka PCR produktů ukazovat na přítomnost nebo absenci jednotlivých restrikčních míst, a/nebo mohou být podrobeny restrikci po amplifikaci. Fragmenty presenilinů mohou být vizualizovány běžnými prostředky (např. UV světlem za přítomnosti • · · · ·· ·· · · • · · · • · · · · · · • · · · ··· ··· *· · • · • · • ··
120 ethidium bromidu).
Pouze jako příklad je zde uvedeno, že PSI M146L mutace (A->C v bp 684 SEQ ID NO: 1) ruší Psphl místo; H163R mutace (A->G v bp 736) ruší NlalII místo; A246E mutace (C->A v bp 985) vytváří Ddel místo; a L286V mutace (C->G v bp 1104) vytváří PvuIII místo. Odborník v oboru si může snadno vybrat z mnoha komerčně dostupných restrikčních enzymů a, na základě normálních a mutantních sekvencí popsaných v předkládaném vynálezu, může provést analýzu restrikčního mapování, která bude detekovat v podstatě jakoukoliv mutaci presenilinů.
(4) PCR mapování
V jiné sérii provedení může být mutace substituce jedné baze detekována v PCR na základě různé délky nebo produkce PCR produktu. Tak, primery, které překlenují místa mutace nebo které, preferovaně, mají 3' konce v místech mutace, mohou být využity pro amplifikaci vzorku genomové DNA, mRNA nebo cDNA od subjektu. U chyby v místu mutace může být očekáváno, že změní schopnost normálních a mutantních primerů navodit polymerasovou reakci a, proto, může vést k profilům produktů, které se liší mezi normálními subjekty a heterozygotními a/nebo homozygotními presenilinovými mutanty. PCR produkty normálního a mutantního genu mohou být různě separovány a detekovány standartními technikami, jako je polyakrylamidová nebo agarosová gelová elektroforesa a vizualizace se značenými probami, ethidium bromidem a podobně. Vzhledem k možnému nespecifickému primingu nebo přeskočení míst mutace, stejně jako vzhledem k faktu, že většina nosičů mutantních alel bude heterozygotních, může být účinnost této techniky snížena.
121 (5) Elektroforetická mobilita
Genetické testování založené na odlišnostech DNA sekvence může také být dosaženo detekcí alterací elektroforetické mobility DNA, mRNA nebo cDNA fragmentů v gelech. Malé delece a inserce sekvence, například, mohou být vizualizovány gelovou elektroforesou s vysokou rozlišovací schopností jedno nebo dvou řetězcové DNA, nebo jako změny v charakteru migrace DNA heteroduplexů v non-denaturační gelové elektroforese. Mutace presenilinů nebo polymorfismus může být také detekován metodami, které využívají posuny mobility během jednořetězcového konformačního polymorfisku (SSCP) asociovaného se sekundární strukturou mRNA nebo jednořetězcové DNA.
(6) Chemické štěpení chyb
Mutace v presenilinech mohou být také detekovány využitím metody chemického štěpení chyb (CCM) (viz např. Saleeba and Cotton, 1993, a refernce tam uvedené). V této technice mohou být proby (větší než 1 b) smíseny se vzorkem genomové DNA, cDNA nebo mRNA získané od subjektu. Vzorek a proby jsou smíseny a podrobeny podmínkám, které umožňují tvorbu heteroduplexů (pokud se nějaké tvoří). Preferovaně jsou jak proby, tak vzorky nukleových kyselin dvouřetězcové, nebo mohou proba a vzorek být společně amplifikovány PCR, pro zajištění tvorby všech možných chybných heteroduplexů. Chybně spárované T zbytky jsou reaktivní s oxidem osmičelým a chybně spárované C zbytky jsou reaktivní s hydroxylaminem. Protože každý chybně spárovaný A bude doprovázen chybně spárovaným T a každý chybně spárovaný G bude doprovázen • · · · • · · · · · · · *
122 chybně spárovaným C, povede jakýkoliv rozdíl v nukleotidech mezi probou a vzorkem (včetně malých insercí a delecí) k tvorbě alespoň jednoho reaktivního heterouplexu. Po ošetření oxidem osmičelým a/nebo hydroxylaminem pro modifikaci jakýchkoliv míst chybného párování, je směs podrobena chemickému štěpení v jakémkoiv modifikovaném chybně spárovaném místě, například, reakcí s piperidinem. Směs může potom být analyzována standartními technikami jako je gelová elektroforesa pro detekci produktů štěpení, které budou ukazovat chybné párování mezi probou a vzorkem.
(7) Jiné metody
Různé jiné metody pro detekci mutací presenilinů, založené na sekvencích presenilinů zde popsaných, budou jasné odborníkům v oboru. Jakákoliv z těchto může být využita v souladu s předkládaným vynáezem. Tyto zahrnují, ale nejsou omezeny na, nukleasové protekční testy (SI nebo ligasou zprostředkované), ligovaný PCR, denaturační gradientní gelovou elektroforesu (DGGE; viz např. Fischer and Lerman, 1983), vyhledávání restrikčními endonukleasami v kombinaci s SSCP (REF-SSCP; viz např. Liu and Sommer, 1995), a podobně.
D. Jiná vyšetření a diagnostika
V dědičných případech, jako primární událost, a v nedědičných případech jako sekundární událost způsobená stavem choroby, se může vyskytnout abnormální zpracování PSI, PS2, APP nebo proteinů reagujících s PSI, PS2 nebo APP. Toto může být detekováno jako abnormální fosforylace, glykosylace, glykační amidace, nebo proteolytické štěpné produkty v tělesných tkáních nebo tekutinách
123 (např. CSF nebo krvi).
Diagnosa může také být provedena pozorováním alterací v presenilinové transkripci, tramslaci a posttranslační modifikaci a zpracování, stejně jako alterací v intracelulárním a extracelulárním přenosu produktu genu pro presenilin v mozku a periferních buňkách. Takové změny budou obsahovat alterace v množství presenilinové messengerové RNA a/nebo proteinu, alterace ve fosforylačním stavu, abnormální intracelulární umístění/distribuci, atd. Takové testy budou zahrnovat: Northern Blots (s presenilin specifickými a nespecifickými nukleotidovými probami), Western blots a enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA) (s protilátkami namířenými specificky k presenilinů nebo k presenilinové funkční doméně, včetně různých post-translačních modifikačních stavů včetně glykosylováných a fosforylovaných izoforem). Tyto testy mohou být provedeny na periferních tkáních (např. krevních buňkách, plasmě, kultivovaných nebo jiných fibroblastových tkáních, atd.) stejně jako na biopsiích CNS tkání získaných antemortem nebo postmortem, a na mozkomíšní tekutině. Takové testy mohou také obsahovat in šitu hybridizaci a imunohistochemické vyšetření (pro lokalizaci messengerové RNA a proteinu do specifických subcelulárních kompártměntů a/nebo v neuropatologických strukturách asociovaných s těmito chorobami jako jsou neurofibrilární oka nebo plaky amyloidu).
E. Vyšetřovací a diagnostické kity
V souladu s předkládaným vynálezem jsou také poskytnuty diagnostické kity, které obšahují reagens nezbytná pro výše popsaná diagnostická vyšetření. Například, mohou být poskytnuty ,1· kity obsahující protilátky nebo sady protilátek, které jsou ······ ·· ·
124 specifické pro jeden nebo více mutantních epitopů. Tyto protilátky mohou být v jednotlivém provedení značeny jakýmikoliv standartními prostředky, které usnadňují vizualizaci a vazbu. Alternativně, mohou být poskytnuty kity, ve kterých jsou přítomny oligonukleotidové proby nebo PCR primery, jak byly popsány výše, pro detekci a/nebo amplifikaci mutantních PSI, PS2 a jiných s preseniliny spojených sekvencí. Opět, takové proby mohou být značeny pro snadnější detekci specifické hybridizace. podle vhodnosti pro různá diagnostická provedení popsaná výše, oligonukleotidové proby a protilátky v takových kitech mohou být imobilizovány na substrátech a mohou být poskytnuty vhodné kontroly.
10. Metody léčby
Předkládaný vynález nyní poskytuje základ pro terapeutický zásah u onemocnění, která jsou způsobena, nebo která mohou být způsobena, mutacemi presenilinů. jak bylo podrobně popsáno výše, mutace v PSI a PS2 genech jsou asociovány s vývojem forem Alzheimerovy choroby s časným nástupem a proto je předkládaný vynález zejména zaměřen na ne léčbu subjektů s diagnostikovanou Alzheimerovou chorobou, nebo těch, u kterých je riziko jejího rozvoje. Ve světle exprese PSI a PS2 genů v různých tkáních je nicméně dosti pravděpodobné, že účinek mutací v tomto lokusu není omezen na mozek a proto že mohou být příčinou jiných chorob než Alzheimerovy choroby. Proto je předkládaný vynález také zaměřen na choroby manifestující se v jiných tkáních, které mohou vznikat z mutací, chybné exprese, chybného metabolismu nebo jiných zděděných nebo získaných alterací genů pro preseniliny a genových produktů. Kromě toho, ačkoliv se Alzheimerova choroba manifestuje jako neurologické onemocnění, může být tato manifestace způsobena
125 • · · · · · · • ··· · · ······ • · · · · · ··· ·· ·4· ♦·· ·· * mutacemi v presenilinech, které nejprve ovlivňují jiné orgánové tkáně (např. játra), které potom uvolňují faktory, které ovlivňují mozkovou aktivitu a nakonec způsobují Alzheimerovu chorobu. Proto, po zvážaní různých terapií uvedených dále, je chápáno, že takové terapie mohou být zaměřeny na tkáně jiné než je mozková, jako je srdce, placenta, plíce, játra, kosterní sval, ledvina a slinivka, kde jsou PSI a/nebo PS2 také exprivovány.
Bez vazby na jakoukoliv jednotlivou teorii podle vynálezu se účinek mutací spojených Alzheimerovou chorobou zdá být výsledkem získání nové funkce nebo akcelerace normální funkce, což přímo nebo nepřímo způsobuje aberantní zpracování prekursorového proteinu pro amyloid (APP) na AS peptid, abnormální homeostasu fosforylace, a/nebo abnormální apoptosu v mozku. Takové zídkání funkce nebo akcelerace funkčního modelu bude konsistentní s nástupem symptomů v dospělosti a s dominantní dědičností Alzheimerovy choroby. Nicméně, mechanismus, kterým mohou mutace v presenilinech způsobit tyto účinky zůstává neznámý.
Je známo, že APP může být metabolizován dvěma cestami. V první je APP metabolizován pasáží přes Golgiho síť a potom sekreční dráhou prostřednictvím clathrinem potažených váčků. Zralý APP je potom pasážován do plasmatické membrány, kde je štěpen a-sekretasou za produkce solubilní frakce (Proteasa Nexin II) plus non-amyloiudogeního C-terminálního peptidu (Selkoe et al., 1995; Gandy et al., 1993). Alternativně může být zralý APP nasměrován do endosom-lysozomové dráhy, kde podléhá štěpení S a gamma-sekretase za produkce AS peptidu. AS peptidové deriváty APP jsou neurotoxické (Selkoe et al., 1994). Fosforylační stav buňky určuje relativní rovnováhu mezi a-sekretasovou (non-amyloidogenní) a AS dráhou (amyloidogenní dráhou) (Gandy et
126 al., 1993) a může být modifikován farmakologicky forbololovými estery, agonisty muskarinu a jinými agens. Fosforylační stav buňky se zdá být ovlivněn faktory cytosolu (zejména protein kinasou C) účinkujícími pod jedním nebo více integrálními membránovými proteiny v Golgiho síti.
Bez vazby na jakoukoliv jednotlivou teorii podle vynálezu, preseniliny, zejména hPSl a hPS2 (které nesou několik konsensuálních sekvencí pro protein kinasu C) mohou být integrální membránové proteiny, jejich fosforylační stav určuje relativní rovnováhu mezi a-sekretasovou a AS dráhou. Tak mutace v PSI nebo PS2 genech mohou způsobovat alterace ve struktuře a funkci jejich produktů vedoucí k defektním interakcím s regulačními elementy (např. protein kiansou C) nebo s APP, což způsobí, že APP je nasměrován k amyloidogení endosom-lysozomové dráze. Faktory prostředí (např. viry, toxiny nebo věk) mohou mít také podobný účinek na PSI nebo na PS2.
Opět bez vazby na jakoukoliv jednotlivou teorii podle vynálezu je také zaznamenáno, že oba PSI a PS2 proteiny mají významnou homologii sekvence aminokyselin s lidskými proteiny iontových kanálů a receptorů. Například, PS2 protein vykazuje významnou homologii k a- podjednotce lidského sodíkového kanálu (E=0,18, P = 0,16, identity = 22 - 27% ve dvou regionech o alespoň 35 aminokyselinových zbytcích) za použití BLASTP vzorce podle Altschula et al., (1990). Jiná onemocnění (jako je maligní hypertermie a hyperkalemická periodická paralýza u lidí, a degenerace mechanosensorických neuronů u C. elegans) vznikají z mutací iontových kanálů nebo receptorových proteinů. Mutace PSI nebo PS2 genu mohou, proto, postihovat podobné funkce a vést k Alzheimerově chorobě a/nebo jiným psychiatrickým a neurologickým
127 onemocněním.
Terapie pro léčbu s preseniliny asociovaných onemocnění jako je AD mohou být založeny na:
1) podání normálních PSI nebo PS2 proteinů,
2) genové terapii normálními PSI nebo PS2 geny pro kompenzaci nebo nahrazení mutantnich genů,
3) genové terapii založené na antisense sekvencích k mutantním PSI nebo PS2 genům nebo na těch, které knok-outují mutantni geny,
4) genové terapii založené na sekvencích, které kódují protein, který blokuje nebo napravuje škodlivý účinek PSI nebo PS2 mutantů,
5) imunoterapii založené na protilátkách k normálním a/nebo mutantním PSI nebo PS2 proteinům, nebo
6) na malých molekulách (léčivech), které alterují expresi PSI nebo PS2, blokují abnormální interakce mezi mutantními formami PSI nebo PS2 a jinými proteiny a ligandy, nebo které jinak blokuj í aberantní funkci mutantních PSI nebo PS2 proteinů alterací struktury mutantních proteinů, zvýšením jejich metabolické clearence nebo inhibicí jejich funkce.
A. Proteinová terapie
Léčba s preseniliny spojené Alzheimerovy choroby, nebo jiných
128 onemocnění vziklých z mutací presenilinů. může být provedena nahrazením mutantního proteinu normálním proteinem, modulováním funkce normálního proteinu pro redukci účinku jakékoliv aberantní funkce mutantních proteinů.
Pro provedení tohoto je nezbytné získat, jak je zde popsáno, velká množství v podstatě čistých PSI proteinu nebo PS2 proteinu ze systémů kultivovaných buněk, které mohou exprivovat tento protein. Dopravení proteinu do postižených oblastí mozku může být provedeno za použití vhodných obalových nebo podávačích systémů včetně, například, liposomy zprostředkovaného podání proteinů cílovým buňkám.
B. Genová terapie
V jedné sérii provedení může být využita genová terapie, ve které jsou normální kopie PSI genu nebo PS2 genu zavedeny pacientovi pro úspěšné kódování normálního proteinu v jednom nebo více typech postižených buněk. Gen musí být těmto buňkám dopraven v takové formě, ve které může být vychytáván a může dostatečně kodovat protein pro poskytnutí efektivní funkce. Tak je preferováno, aby rekombinantní gen byl operativně připojen na silný promotor tak, aby byla poskytnuta vysoká hladina exprese, která bude kompenzovat, nebo převažovat, mutantní proteiny. Jak je uvedeno výše, rekombinantní konstrukty mohou obsahovat endogení nebo exogení regulační elementy, indukovatelné nebo reprivovatelné regulační elementy nebo tkáňově specifické regulační elementy.
V jiné sérii provedení může být genová terapie využita pro nahrazení mutantního genu homologní rekombinací s rekombinantním
129 konstruktem. Rekombinantní konstrukt může obsahovat normální kopii cílového genu pro presenilin, a v tom případě je defekt korigován in šitu, nebo může obsahovat knock-out konstrukt, který zavádí stop kodon, chybnou mutaci nebo deleci, která ruší funkci mutantního genu. S ohledem na toto by mělo být zmíněno, že takový konstrukt může vyřadit jak normální, tak mutantní kopie cílového genu pro presenilin u heterozygotního jedince, ale celková ztráta funkce genu pro presenilin může být méně škodlivá pro jedince než trvalá progrese chorobného stavu.
V jiné sérii provedení může být využita antisense genová terapie. Antisense terapie je založena na skutečnosti, že sekvenčně specifická suprese genové exprese může být dosažena intracelulámí hybridizací mezi mRNA nebo DNA a komplementárními antisense druhy. Tvorba hybridiního duplexu může potom interferovat s transkripcí genu a/nebo se zpracováním, transportem, transací a/nebo stabilitou cílové presenilinové mRNA. Antisense strategie může využívat mnoha přístupů včetně podání antisense oligonukleotidů nebo antisense oligonukleotidových analogů (např. analogů s fosforylovanou kostrou) nebo transfekce s antisense RNA expresními vektory. Opět, takové vektory mohou obsahovat endogení nebo exogení regulační elementy, indukovatelné nebo reprivovatelné regulační elementy nebo tkáňově specifické regulační elementy.
V jiné sérii provedení může být genová terapie použita pro zavedení rekombinantního konstruktu kódujícího protein nebo peptid, který bokuje nebo jinak koriguje aberantní funkci způsobenou mutantním genem pro presenilin. V jednom provedení může rekombinantní gen kodovat peptid, který koresponduje mutantní doméně presenilinu, o které bylo zjištěno, že abnormálně ·· ···· ··· ·· ··· ···
interaguje s jiným buněčným proteinem nebo s jiným buněčným ligandem. Tak, například, pokud je o mutantní TM6->7 doméně zjištěno, že interaguje s určitým buněčným proteinem, ale že korespondující normální TM6->7 doména nepodléhá této interakci, může být genová terapie použita pro poskytnutí přebytku mutantní TM6->7 domény, která může soutěžit s mutantním proteinem a inhibovat nebo blokovat aberantní interakci. Alternativně, část proteinu, která interaguje s mutantním, ale nikoliv s normálním, presenilinem, může být kódována a exprivována rekombinantním konstruktem tak, aby soutěžila s, a proto inhibovala nebo blokovala, aberantní interakci. Konečně, v jiném provedení, stejný účinek může být dosažen insercí druhého mutantního proteinu genovou terapií v přístupu podobném korekci Deg l(d) a Mec 4(d) mutací u C. elegans insercí mutantních transgenů.
Retrovirové vektory mohou být použity pro genovou terapii pro somatické buňky zejména pro jejich vysokou účinnost infekce a stabilní integraci a expresi. Cílová buňka musí být nicméně schopná dělení a hladiny exprese normálního proteinu by měly být vysoké, protože onemocnění je dominantní. Kompletní PSI nebo PS2 geny, subsekvence kódující funkční domény presenilinů nebo jakékoliv iné terapeutické peptidy popsané výše mohou být konovány do retrovirového vektoru a řízeny z jeho endogeního promotoru, z retrovirového dlouhého terminálního repeatu, nebo z promotoru specifického pro požadovaný typ cílových buněk (např. neuronů). Jiné virové vektory, které mohou být použity, obsahují adeno-asociované viry, virus vakcinie, hovězí papiloma virus, nebo herpetické viry jako je virus Epsteina-Barrové.
C. Imunoterapie ·· ····
131 ;··:·: :
··· ·· ··· ···
Imunoterkpie je pro Alzheimerovu chorobu také možná. Protilátky jsou namířeny proti mutantním PSI a PS2 proteinům (nebo jejich části) a jsou pacientovi podány pro vazbu nebo pro blokování mutantniho proteinu a pro zabránění jeho škodlivým účinkům. Simultáně, exprese normálního proteinového produktu může být podpořena. Alternativně jsou protilátky namířeny proti specifickým komplexům mezi mutantním nebo divokým typem PSI nebo PS2 a jejich interakčními partnery.
Daším přístupem je stimulace endogení produkce protilátek k požadovanému antigenu. Podání může být provedeno ve formě jednorázového imunogeního přípravku nebo vakcinové imunizace. Imunogení kompozice může být připravena jako injikovatelná, jako kapalný roztok nebo jako emulze. PSI a PS2 protein nebo jiný antigen může být smísen s farmaceuticky akceptovatelným excipiens kompatibilním s proteinem. Taková excipiens mohou zahrnovat vodu, salinický roztok, dextrosu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Imunogení kompozice a vakciny mohou také dále obsahovat přídatné substance jako jsou emulsifikační agens nebo adjuvans pro zvýšení účinnosti. Imunogení kompozice a vakciny mohou být podány parenterálně injekcí subkutáně nebo intramuskulárně.
Imunogení přípravky a vakciny jsou podány v takovém množství, aby byy terapeuticky účinné, ochranné a imunogení. Dávkování závisí na způsobu podání a bude se velmi lišit podle velikosti pacienta.
D. Terapeutika malých molekul
Jak je zde popsáno, poskytuje předkládaný vynález mnoho metod pro identifikaci malých molekul a jiných sloučenin, které mohou ·· ···· být užitečné v léčbě Alzheimerovy choroby a jiných onemocnění způsobených preseniliny. Tak, například, předkládaný vynález poskytuje metody pro identifikaci vazebných proteinů pro preseniliny, a zejména, metody pro identifikaci proteinů a jiných buněčných složek, které se váží na nebo jinak interagují s mutantními preseniliny, ale nikoli s normálními preseniliny. Vynález také poskytuje metody pro identifikaci malých molekul, které mohou být použity pro narušení aberantních interakcí mezi mutantními preseniliny a takovými proteiny nebo jinými buněčnými složkami.
Takové interakce, vyžadující mutantní, ale ne normální preseniliny, neposkytují pouze informaci užitečnou v pochopení biochemické dráhy narušené mutací v presenilinech, a kauzální pro Alzheimerovu chorobu, ale také poskytují bezprostřední terapeutický cíl pro intervenci v etiologii onemocnění. Identifikací těchto proteinů a anaýzou těchto interakcí je možné vyšetřovat nebo projektovat sloučeniny, které působí proti nebo brání interakcím, což poskytuje možnou léčbu pro abnormální interakce. Tato léčba bude měnit interakce presenilinů s jejich partnery, měnit funkci interagujícího proteinu, měnit množství nebo tkáňovou distribuci exprese interakčních partnerů nebo měnit podobné vlastnosti u presenilinů samotných.
Terapie mohou být projektovány pro modulaci těchto interakcí a tak pro modulaci Alzheimerovy choroby a jiných stavů asociovaných se získanými nebo dědičnými abnormalitami PSI nebo PS2 genů nebo jejich genových produktů. Potenciální účinnost této terapie může být testována analyzováním afinity a funkce těchto interakcí po expozici terapeutického agens standartnímu farmakokinetickému měření afinity (Kd a Vmax atd.) za použití syntetických peptidů ·· ····
133 nebo rekombinantních proteinů korespondujících funkčním doménám PSI genu, PS2 genu nebo jiných presenilinových homologů. Jiná metoda pro testování účinku takových interakcí obsahujících funkční domény jako jsou hydrofilní smyčky je monitorování změn v intracelulárním přenosu a posttranslační modifikaci relevantního genu in sítu hybridizcí, imunohistochemií, Western blotem a metabolickými pulsními radioaktivně značenými studiemi studiemi za přítomnosti nebo za absemnce terapeutikých agens. Další metodou je monitorování účinků downstream dějů, jako jsou (i) změny v intracelulárním metabolismu, přenosu a zaměření APP a jeho produktů; (ii) změny v dějích druhého posla, např. cAMP intracelulárni Ca2*, aktivity protein kinas atd.
Jak bylo uvedeno výše, mohou být preseniliny zahrnuty v metabolismu APP a fosforylační stav presenilinů může být zásadní pro rovnováhu mezi α-sekretasovou a Αβ dráhou ve zpracování APP. Za použití transformovaných buněk a zvířecích modelů podle předkládaného vynálezu je možné lépe pochopit tyto dráhy a aberantní děje, které se vyskytují u presenilinových mutantů. Za použití těchto znalostí je možné projektovat terapeutické strategie působící proti škodlivým účinkům presenilinových mutantů.
Pro léčbu Alzheimerovy choroby, například, může být fosofrylační stav PSI pozměněn chemickýmia biochemickými agens (např. léky, peptidy a jinými sloučeninami), které mění aktivitu protein kinasy C a jiných protein kinas, nebo které mění aktivitu protein fosfatas, nebo které modifikují dostupnost PSI, který má být posttranslačně modifikován. Interakce kinas a fosfatas s presenilinovými proteiny a interakce presenilinových proteinů s jinými proteiny obsaženými v přenosu APP v Golgiho síti, mohou
134 • · · · • · · · · • · · ··· ·· ··· ··· ·· · být modulovány ke snížení Golgiho váčků do endosom-lysozomové dráhy, což inhibuje produkci AS peptidu. Takové sloučeniny budou zahrnovat peptidová analoga APP, PSI, PS2 a jiných homologů presenilinů, stejně jako jiné interagující proteiny, lipidy, cukry a agens, která navozují různou glykosylaci PSI, PS2 a/nebo jejich homologů; agens, která mění biologický poločas presenilinové mRNA nebo proteinů, včetně protilátek a antisense oligonukleotidů; a agens, která působí na PSI a/nebo PS2 transkripci.
Účinek těchto agens v buněčných liniích a na zvířatech může být monitorován monitorováním transkripce, translace a post-translační modifikace PSI a/nebo PS2 (např. fosforylace nebo glykosylace), stejně jako monitorováním intracelulárního přenosu PSI a/nebo PS2 přes různé intracelulární a extracelulámí kompártmenty. Metody pro tyto studie zahrnují Western a Norther bloty, imunoprecipitaci po metabolickém značení (pulse-chase) radioznačeným methioninem a ATP, a imunohistochemii. Účinek těchto agens může být také monitorován za použití studií, které vyšetřují relativní vazebné afinity a relativní množství PSi a/nebo PS2 proteinů obsažených v interakcích s protein kinasou C a/nebo APP za použití bud' standartních testů vazebné afinity nebo ko-presipitace a Western blotů za použití protilátek k protein kinase C, APP, PSI, PS2 nebo jiným presenilinovým homologům. Účinek těchto agens může být také monitorován hodnocením produkce AS peptidů ELISA před a po expozici putativnímu terapeutickému agens (viz např. Huang et al., 1993). Účinek může být také monitorován hodnocením životaschopnosti buněčných linií po expozici solím hliníku a/nebo AS peptidům, o kterých se soudí, že jsou neurotoxické u Alzheimerovy choroby. Konečně, účinek těchto agens může být také monitorován hodnocením kognitivní funkce
135 zvířat nesoucích normální genotypy v APP a/nebo jejich presenilinových homologách, zvířat nesoucích APP transgeny (s nebo bez mutací), zvířat nesoucích lidské presenilinové transgeny (s nebo bez mutací), nebo nesoucích jakékoliv kombinace výše uvedených.
Podobně, jak bylo uvedeno výše, preseniliny mohou být obsaženy v regulaci Ca2* jako receptory nebo jako iontové kanály. Tato role presenilinů může být také vyšetřována za použití buněčných linií a zvířecích modelů podle předkládaného vynálezu. Vzhledem k těmto výsledkům nůže být produkován test pro Alzheimerovu chorobu pro detekci abnormální receptorové funkce nebo abnormální funkce iontového kanálu spojenou s abnormalitami, které jsou získány nebo zděděny v genech pro preseniliny nebo jejich produktech, nebo v jednom z homologních genů nebo jejich produktech.Tento test může být proveden jak in vivo, tak in vitro měřením průtoku iontovým kanálem a/nebo transmembránového napětí nebo proudu za použití náplasúových svorek, napěčových svorek a fluorescentních barviv sensitivních na intracelulární vápník nebo na transmembránové napětí. Defektní funkce iontového kanálu nebo receptoru může také být měřena aktivací druhého posla jako je cyklický AMP, cGMP tyrosin kinasa, fosfatasa, zvýšení hladin intracelulárního Ca2*, atd. Také mohou být rekonstruovány rekombinantně vyrobené proteiny v arteficiálních membránových systémech pro studium vodivosti iontového kanálu. Terapie, které ovlivňují Alzheimerovu chorobu (způsobenou získanými nebo zděděnými defekty v PSI genu nebo v PS2 genu; způsobenou defekty v jiné dráze, které vedou k této chorobě, jako jsou mutace v APP; a způsobenou faktory prostředí) mohou být testovány analýzou jejich schopnosti modifikovat abnormální funkci iontového kanálu enbo receptoru indukovanou mutací v genu pro presenilin.Terapie
136
·· mohou být také testovány jejich schoppností modifikovat normální funkci iontového kanálu nebo kapacity receptoru presenilinových proteinů. Takové testy mohou být provedeny na kultivovaných buňkách exprivujících normální nebo mutantní PSI geny/ genové produkty nebo PS2 geny/genové produkty. Takové studie mohou také být provedeny na buňkách transfektovaných vektory schopnými exprese presenilinů, nebo funkčních domén jednoho z presenilinů, v normální nebo mutantní formě. Terapie pro Alzheimerovu chorobu mohou být navrženy pro modifikaci abnormální funkce iontového kanálu nebo receptoru PSI genu nebo PS2 genu. Takovými terapeutickými látkami mohou být běžná léčiva, peptidy, cukry nebo lipidy, stejně jako protilátky nebo jiné ligandy, které ovlivňují vlastnosti PSI nebo PS2 genového produktu. Takové terapie mohou také být provedeny přímým nahrazením PSI genu a/nebo PS2 genu genovou terapií. V případě iontového kanálu může být genová terapie provedena za použití buď minigenů (cDNA plus promotoru), nebo genomových konstruktů nesoucích genomové DNA sekvence pro části nebo pro celý gen pro presenilin. Mutantní presenilinové nebo homologní genové sekvence mohou také být použity pro bránění účinku dědičných a získaných abnormalit v genech pro preseniliny jak bylo nedávno provedeno nahrazením Mec 4 a Deg 1 u C. elegans (Huang and Chalfie, 1994). Terapie může také být zaměřena na posílení funkce receptoru nebo iontového kanálu jednoho homologu, tak jako je PS2 gen, tak, aby mohl potenciálnmě převzít funkce mutantní formy jiného homologu (např. PSi genu, který je defektní díky získaným nebo dědičným defektům). Terapie za použití antisense oligonukleotidů pro blokování exprese mutantního PSI genu nebo mutantního PS2 genu, koordinovaná s genovým nahrazením normálního PSI nebo PS2 genu může také být aplikována za použití standartních technik buď genové terapie, nebo terapie proteinové náhrady.
137 ··· · · · · ··· · • · · · · • ·· *·· ··· ·· ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Vývoj genetického, fyzikálního obsahu a transkripční mapy minimálního kosegregačního regionu
CEPH MegaYac a RPCI PAC lidské knihovny celkové genomové DNA byly prohledávány na klony, obsahující genomové DNA fragmenty z AD3 regionu chromosomu 14q24.3 za použití oligonukleotidových prob pro každý z 12 SSR makerových lokusů použitých ve studiích genetické vazby, stejně jako za použití dalších markérů (Albertsen et al., 1990; Chumakov et al., 1992; Ioannu et al., 1994). Vzdálenosti v genetické mapě mezi každým markérem jsou znázorněny nad sousedními úseky, a jsou odvozeny od publikovaných dat (NIH/CEPH Colaborative Mapping Group, 1992; Wang, 1992; Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Klony získané pro každý počáteční markerový lokus byly sestaveny do řádných sérií částečně se překrývajících klonů (sousedů) za použití čtyř nezávislých metod. První, sekvence representující konce YAC insertů byly izolovány inversním PCR (Riley et al., 1990) a hybridizovány na Southern blot panely obsahující produkty restrikčniho trávení DNA ze všech YAC klonů získaných pro všechny počáteční lokusy tak, aby se identifikovaly jiné YAC klony nesoucí překrývající se sekvence. Za durhé, byla provedena inter-Alu PCR na každém YAC a vzešlé vzorky proužků byly srovnávány mezi pooly získaných YAC klonů tak, aby se identifikovaly jiné klony nesoucí překrývající se sekvence (Bellamne-Chartelot et al., 1992; Chumakov et al., 1992). Za třetí, pro vylepšení specificity Alu-PCR vyhledávání byla YAC DNA
138 restrihována HaelII nebo Rsal, restrikční produkty byly amplifikovány jak Alu, tak LÍH konsensuálními priméry a produkty byly vyšetřovány polyakrylamidovou gelovou elektroforesou. Konečně, protože další STS byly generovány v průběhu vyhledávání transkribovaných sekvencí, byly tyto STS také použity pro identifikaci překrývajících se klonů. Výsledné sousedící úseky byly kompletní kromě jediné diskontinuity mezi YAC932C7 nesoucím D14S53 a YAC746B4 nesoucím D14S61. Fyzikální mapa pořadí STS v sousedních úsecích byla v souladu s mapou genetické vazby pro tento region (NIH/CEPH Colaborative Mapping Group, 1992; Wang and Weber, 1992; Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Nicméně, stejně jako v genetrických mapách, nebylo možné jednoznačně vyřešit relativní řád lokusů v D14S43/D14S71 seskupení a D14S76/D14S273 seskupení. PAC1 klony naznačovaly, že D14S277 je telomerický k D14S268, zatímco genetické mapování naznačovaly opačné pořadí. Dále, několik STS prob selhalo při detekci hybridizačních vzorků u alespoň jednoho YAC klonu, u kterého, na základě nej šetrnější konsensuální fyzikální mapy a z genetické mapy, bylo předpokládáno, že obsahuje tento STS. Například, D14S268 (AFM265) a RSCAT7 STS sou nepřítomné v YAC788H12. Protože tyto výsledky byly reprodukovatelné a vyskytovaly se s několika různými STS markéry, odrážejí tyto výsledky s největší pravděpodobností přítomnost malých intersticiálních delecí v jednom z YAC klonů.
Příklad 2
Kumulativní dvoubodové lod skoré pro chromosomové 14q24.3 markéry
Genotypy v každém polymorfním mikrosatelitním markerovém • 4 9 9 9 ·
139 · ...........
· · · · · · ··· 99 999 999 99 9 lokusu byly určeny PCR ze 100 ng genomové DNA od všech dostupných postižených nebo nepostižených členů rodokmenu jak bylo popsáno dříve (St. George-Hyslop et al., 1992) za použití sekvencí primerů specifických pro každý mikrosatelitní lokus (Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Normální populační frekvence každé alely byla určena za použití manželů a jiných neurologicky normálních subjektů ze stejné etnocké skupiny, ale nelišila se signifikantně od frekvence stanovené pro smíšenou Kavkazskou populaci (Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994) . Maximálně pravděpodobné kalkulace hodnocené ve věku nástupu korekce, frekvence markerové alely odvozené od publikovaných sérií smíšenýCH Kavkazských subjektů a stanovené frekvence alel pro AD3 mutaci 1:1000 byly jak bylo dříve popsáno (St.
George-Hyslop et al., 1992). Analýzy byly opakovány za použití stejných frekvencí markerových alel a za použití fenotypové informace pouze od postižených členů rodokmenů jak bylo dříve popsáno pro zajištění toho, že nepřesnosti v hodnocených parametrech použitých v kalkulacích maximální pravděpodobnosti nebudou zavádějící pro analýzu (St. George-Hyslop et al., 1992). Tyto doplňkové analýzy nealterovaly signifikantně ani důkazy podporující vazbu, ani objev rekombinantních dějů.
Příklad 3
Haplotypy mezi sousedícími markéry segregují s AD3 ve FAD
Haplotypy v rozsahu mezi centromerickými a telomerickými sousedícími markéry na původní kopii chromosomu 14 segregující s AD3 u čtrnácti FAD rodokmenů s časným nástupem FAD (rodokmeny NIH2, MGH1, Torl.l, FAD4, FAD1, MEX1 a FAD2) ukazovaly rodokmenově specifické lod skoré > +3,00 s alespoň jedním
140 markérem mezi D14S258 a D14S53. Identické částečné haplotypy jsou pozorovány ve dvou regionech onemocnění nesoucího chromosomu segregujícího v několika rodokmenech podobného etnického původu. V regionu A jsou podílící se alely pozorovány v D14S268 (B: velikost alely = 126 bp, frekvence alely u normální Kavkazské populace = 0,04; C: velikost = 124 bp, frekvence = 0,38); D14S277 (B: velikost = 156 bp, frekvence = 0,19; C: velikost = 154 bp, frekvence = 0,33); a RSCAT6 (D: velikost = 111 bp, frekvence = 0,25; E: velikost = 109 bp, frekvence = 0,20; F: velikost = 107 bp, frekvence = 0,47). V regionu B jsou alely identické velikosti pozorovány v D14S43 (A: velikost = 193 bp, frekvence = 0,01; D: velikost = 187 bp, frekvence = 0,12; E: velikost = 185 bp, frekvence = 0,26; I: velikost = 160 bp, frekvence = 0,38; D14S273 (3: velikost = 193 bp, frekvence = 0,38; 4: velikost = 191 bp, frekvence = 0,16; 5: velikost = 189 bp, frekvence = 0,34; 6: velikost = 187 bp, frekvence = 0,02) a D14S76 (1: velikost = bp, frekvence = 0,01); 5: velikost = bp, frekvence = 0,38); 6: velikost = bp, frekvence = 0,07); 9: velikost = bp, frekvence = 0,38). Viz Sherrington et al., (1995) pro podrobnosti.
Příklad 4
Získání transkribovaných sekvencí z AD 3 intervalu
Putativní transkribované sekvence kódované v AD3 intervalu byly získány za použití přímé hybridizační metody, ve které byly krátké hybridizační fragmenty generované z lidské mozkové mRNA hybridizovány na imobilizované klonované genomové cDNA fragmenty (Rommens et al., 1993). Vzniklé krátké putativně transkribované sekvence byly použity jako proby pro získání delších transkriptů • · · · · ·
141 z knihoven lidské mozkové cDNA (Stratagene, La Jolla). Fyzikální umístění originálních krátkých klonů a následně získaných delších cDNA klonů bylo stanoveno analýzou hybridizačních vzorků generovaných hybridizací proby na Southern bloty obsahující panel EcoRi trávených celkových DNA vzorků izolovaných od jednotlivých YAC klonů v sousedících úsecích. Sekvence nukleotidů každého z delších cDNA klonů byla určena automatizovaným cyklickým sekvencováním (Applied Biosystems lne., CA), a byla srovnána s jinými sekvencemi v nukleotidové a proteinové databasy za použití blast algoritmu (Altschul et al., 1990). Přírůstková čísla pro transkribované sekvence jsou: L40391, L40392, L40393, L40394, L40395, L40396, L40397, L40398, L40399, L40340, L40341, L40342 a L40343.
Příklad 5
Lokalizace mutací v PSI genu za použití restrikčních enzymů
Přítomnost A246E mutace, která vytváří Ddel restrikční místo, byla testována v genomové DNA PCR za použití koncově značených primerů korespondujících v podtatě bp 907 - 925 v SEQ ID NO: 1 a neznačených primerů korespondujících komplementu bp 1010 - 990 v SEQ ID NO: 1, za amplifikace 84 bp genomového exonového fragmentu za použití 100 ng genomového DNA templátu, 2 mM MgCl^, 10 pmol aždého primerů, 0,5 U Taq polymerasy, 250 μΜ dNTP pro 30 cyklů 95 °C x 20 sekund, 60 °C x 20 sekund, 72 °C x 5 sekund. Produkty byly inkubovány s přebytkem Ddel po 2 hodiny podle protokolu výrobce a vzniklé restrikční fragmenty byly vyšetřovány na 6% nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu a vizualizovány autoradiografií. Přítomnost mutací byla odvozena ze štěpení 84 bp fragmentu díky přítomnosti Ddel restrikčního místa. Všichni
142 postižení členi FAD1 rodokmenu a několik rizikových členů neslo
Ddel místo. Nikdo z obligátně nepostižených (těch jedinců, kteří nemají onemocnění a mají věk vyšší než 70 let) a nikdo z normálních kontrol nenesl Ddel mutaci.
Příklad 6
Přítomnost C410Y mutace byla testována za použití alelově specifických nukleotidů. 100 ng genomové DNA bylo amplifikováno za použití primeru exonové sekvence korespondujícího bp 1451 1468 SEQ ID NO: 1 a protějšího primeru intronové sekvence korespondujícího komplementárním bp k bp 719 - 699 SEQ ID NO: 14 za použití výše uvedených reakčních podmínek kromě 2,5 mM MgCl^, a podmínek cyklu 94 °C x 20 sekund, 58 °C x 20 sekund, 72 °C x 10 sekund. Vzniklý 216 bp genomový fragment byl denaturován 10-násobným ředěním v 0,4 M NaOH, 25 mM EDTA a byl vakuově slot-blotován na dvojité nylonové membrány. Koncově značený primer ůdivokého typu (korespondující bp 1468 - 1486 SEQ ID NO: 1) a koncově značený mutantni primer (korespondující stejné sekvenci, ale s G->A substitucí v pozici 1477) byly hybridizovány na separátní kopie slot-blotových filtrů v 5 x SSC, 5 xc Denhart, 0,5% SDS po 1 hodinu při 48 °C a potom byly promyty následně v 2 x SSC při 23 °C a 2 x SSC, 0,1% SDS při 50 °C a potom exponovány na rentgenovém filmu. Všichni testovatelní postižení členi stejně jako někteří rizikový členi AD3 a NIH2 rodokmenů měli C410Y mutaci. Pokusy o detekci C410Y mutace SSCP odhalil, že společný polymorfismus intronové sekvence migroval se stejnými SSCP vzorky.
Příklad 7
143
Northern hybridizace demonstrující expresi PSI proteinové mmRNA v různých tkáních
Celková cytoplasmatická RNA byla izolována ze vzorků různých tkání (včetně srdce, mozku, a různých regionů placenty, plic, jater, kosterního svalu, ledvin a slinivky) získaných od chirurgického patologa za použití standartních postupů jako je CsCl purifikace. RNA byla potom elektroforesována na formaldehydovém gelu pro umožnění frakcionace podle velikosti. Byla řipravena nitrocelulosová membrána a RNA byla potom transferována na membránu. 32P-značené cDNA proby byly připraveny a přidány na membránu pro hybridizaci mezi probou a RNA. Po promytí byla membrána obalena v plastovém filmu a umístěna do zobrazovacích kazet obsahujících rentgenový film. Autoradiagrafy byly potom vyvíjeny po jeden až několik dní. Velikost byla stanovena srovnáním se standartními RNA markéry. Analýza autoradiografií odhalila prominentní prouže velikosti 3,0 kb (viz obrázek 2 podle Sherrington et al., 1995). Northern bloty demonstrovaly, že PSI gen je exprivován ve všech vyšetřovaných tkáních.
Příklad 8
Eukaryotické a prokaryotické expresní vektorové systémy
Konstrukty vhodné pro použití v prokaryotických a eukaryotických expresních systémech byly generovány za použití tří různých tříd insertů PSI nukleotidové cDNA sekvence. V první třídě, nazývané konstrukty plné délky, je celá PSI DNA sekvence insertována do expresního plasmidu ve správné orientaci a obsahuje jak přirozený 5' UTR, tak 3' UTR sekvence stejně jako
144 celý otevřený čtecí rámeček. Otevřený čtecí rámeček nese kazetu nukleotidové sekvence, která umožňuje, aby byl buď otevřený čtecí rámeček divokého typu obsažen v expresním systému, nebo alternativně, aby jedna nebo kombinace dvojitých mutací mohla být insertována do otevřeného čtecího rámečku. Toto bylo provedeno odstraněním restrikčního fragmentu z divokého typu otevřeného čtecího rámečku za použití enzymů Narl a Pflml a jeho nahrazením podobným fragmentem generovaným reversní transkriptasovou PCR a nesoucím nukleotidovou sekvenci kódující buď M146L mutaci, nebo H163R mutaci. Druhý restrikční fragment byl odstraněn z divokého typu normální nukleotidové sekvence pro otevřený čtecí rámeček štěpením enzymy Pfmll a Ncol a restrikčním fragmentem nesoucím nukleotidovou sekvenci kódující A246E mutaci, A260V mutaci. A285V mutaci, L286V mutaci, L392V mutaci nebo C410Y mutaci. Třetí varianta, nesoucí kombinaci buď M146L nebo H163R mutací v tandemu s jednou ze zbývajících mutací, byla provedena vazbou Narl-Pflml fragmentu nesoucího jednu z dříve uvedených mutací a Pflml-Ncol fragmentu nesoucího jednu z později uvedených mutací.
Druhá třída cDNA insertů, nazývaná zkrácené konstrukty, byla konstruována odstraněním 5' UTR a části 3' UTR sekvence z kompletní sekvence divokého typu nebo mutantni cDNA sekvence. 5' UTR sekvence byla nahrazena syntetickým oligonukleotidem obsahujícím KpnI restrikční místo (GGTAC/C) a malou sekvenci (GCCACC) pro vytvoření Kozák iniciačního místa okolo ATG v počátku PSI ORF (bp 249 - 267 SEQ ID NO: 1). 3' UTR byl nahrazen oligonukleotidem korespondujícím komplementu bp 2568 - 2586 SEQ ID NO: 1 s arteficiálním EcoRI místem v 5' konci. Mutantni varianty tohoto konstruktu byly potom vytvořeny insercí mutantnich sekvencí popsaných výše v Narl-Pflml a Psími-Ncol místech jak bylo popsáno -výše.
• · · · · ·
145
Třetí třída konstruktů obsahovala sekvence odvozené od klonu cc44, ve kterém alternativní sestřih Exonu 4 vedl k eliminaci čtyřech zbytků v N-konci (SEQ ID NO: 3).
Pro eukaryotickou expresi byly tyto různé cDNA konstrukty nesoucí sekvence divokého a mutantního typu jak byly popsány výše, klonovány do expresního vektoru pZeoSV, ve kterém byla SV60 promotorové kazeta odstraněna restrikčním trávením a byla nahrazena CMV promotorovým elementem pcDNA3 (Invitrogen). Pro prokaryotickou expresi byly konstrukty vyrobeny za použití glutathion S-transferasa (GST) fúsního vektoru pGEX-kg. Inserty, které byly připojeny na GST fúsní nukleotidové sekvence jsou stejné nukleotidové sekvence jako byly popsány výše nesoucí buď normální sekvence nukleotidů otevřeného čtecího rámečku, nebo nesoucí kombinace jednotliých a dvojitých mutací jak bylo popsáno výše. Tyto GST fúsní konstrukty umožňovaly expresi částečného nebo celého proteinu v systémech prokaryotických buněk jako mutantní nebo divoký typ GST fúsních proteinů, což umožňovalo purifikaci kompletního proteinu následovanou odstraněním GST fúsního produktu trávením trombinem. Další cDNA konstrukty byly vyrobeny s GST fúsním vektorem pro umožnění produkce aminokyselinové sekvence korespondující hydrofilní acidické smyčkové doméně mezi TM6 a TM7 úplného proteinu, buď jako divoký typ nukleotidové sekvence nebo jako mutantní sekvence nesoucí buď A285V mutaci, L286V mutaci nebo L392V mutaci. Toto bylo provedeno odebráním sekvencí divokého nebo mutantního typu z vhodných zdrojů RNA za použití 5' oligonukleotidového primerů korespondujícího bp 1044 - 1061 SEQ ID NO: 1 s 5' BamHI restrikčním místem (G/GATCC), a 3' primerů korespondujícího komplementu bp 1476 - 1458 SEQ ID NO: 1 s 5' EcoRI restrikčním místem (G/AATTC). Toto umožnilo klonování vhodné nukleotidové • · · · · ·
146 ;··;·: :
··· ·· ·♦· ♦·· sekvence mutantního nebo divokého typu korespondující hydrofilní acidické smyčkové doméně v BamHI a EcoRI místech v pGEX-KG vektoru.
Příklad 9
Lokalizace dalších mutací v PSI genu
Mutace v PSI genu mohou být testovány mnoha strategiemi (přímé sekvencování nukleotidů, alelově specifickými oligonukleotidy, ligační polymerasovou řetězovou reakcí, SSCP, RFLP) za použití RT-PCRproduktů representujících zralé mRNA/cDNA sekvence nebo genomovou DNA. Pro A260V a A285V mutace může být genomová DNA nesoucí exon amplifikována za použití stejných PCR primerů a metod jako pro L286V mutaci.
PCR produkty byly potom denaturovány a slot-blotovány na dvojité nylonové membrány za použití slot blot protokolu pro C410Y mutaci.
A260V mutace byla odečítána na těchto blotech za použití hybridizace koncově značených alelově specifických oligonukleotidů korespondujících divokému typu sekvence (bp 1017 - 1036 SEQ ID NO: 1) nebo mutantní sekvenci (bp 1017 - 1036 SEQ ID NO: 1 s C->T v bp 1027) hybridizací při 48 °C po které následovalo promytí při 52 °C v 3x SSC pufru obsahujícím 0,1% SDS. A285V mutace byla odečítána na těchto slot blotech jak bylo uvedeno výše, kromě použití alelově specifických oligonukleotidů pro divoký typ sekvence (bp 1093 - 1111 SEQ ID NO: 1) nebo mutantního primeru (bp 1093 - 1111 SEQ ID NO: 1 s C->T v bp 1102) při 48 °Cjak bylo uvedeno výše, kromě toho, že promývací roztok ·· ····
147
byl 2x SSC.
L392V mutace byla odečítána amplifikací exonu z genomové DNA za použití primerů (5' korespondujících bp 439 - 456 SEQ ID NO: 14 a 3' komplementárních k 719 - 699 SEQ ID NO: 14) za použití standartních PCR pufrovacích podmínek kromé toho, že koncentrace hořčíku byla 2 mM a podmínky cykluy byly 94 °C x 10 sekund, 56 °C x 20 sekund a 72 °C x 10 sekund. Vzniklý genomový fragment o 200 párech baží byl denaturován jak je popsáno pro C410Y mutaci a slot-blotován na dvojité nylonové membrány. Přítomnost nebo absence mutace byla potom odečítána podle různé hybridizace s buď divokým typem koncově značeného oligonukleotidů (bp 1413 - 1431 SEQ ID NO: 1) nebo s koncově značeným mutantním primerem (bp 1413 - 1431 SEQ ID NO: 1 s C->G v bp 1422) hybridizací při 45 °C a potom následným promytím v 2x SSC při 23 °C a potom při 68 °C.
Příklad 10
Produkce protilátek
Peptidové antigeny korespondující částem psi proteinu byly syntetizovány technikou pevné fáze a byly purifikovány reversní fází vysokotlaké kapalinové chromatografíe. Peptidy byly kovalentně vázány na keyhole přílipkový hemocyanin (KLH) cestou disulfidové vazby, což umožnilo přidání cysteinového zbytku C-konec peptidů presenilinového fragmentu. Tento další zbytek nebyl v proteinové sekvenci normální a byl obsažen pouze pro usnadnění vazby na KLH molekulu. Specifické presenilinové sekvence, proti kterým byly protilátky namířeny, jsou následuj ící:
148
Polyklonální protilátka č. hPSl antigen (SEQ ID NO: 2)
1142 30 - 44
519 109 -123
520 304 -318
1143 346 -360
Tyto sekvence jsou obsaženy ve specifických doménách PSI proteinu. Například, zbytky 30 - 44 jsou v N-konci, zbytky 109 123 jsou v TMl->2 smyčce a zbytky 304 - 318 a 346 - 360 jsou ve velké TM6->7 smyčce. Každá z těchto domén je vystavena do vodné media a může být zahrnuta ve vazbě na jiné proteiny zásadní pro vývoj fenotypu onemocnění. Volba peptidů byla založena na analýze proteinové sekvence za použití IBI Pustell algoritmu předpokládané antigenicity.
Celkem tři Novozélandští bílí králíci byly imunizováni peptid-KLH komplexy pro každý peptidový antigen v kombinaci s Freundovým adjuvans a byly jim následně podány dosycovací injekce v sedmideních intervalech. Antisérum bylo odebráno pro každý peptid a bylo poolováno a IgG byl precipitován se síranem amonným. Protilátky byly potom afinitně purifikovány se Sulfo-link agarosou (Pierce) navázanou na vhodný peptid. Tato konečná purifikace je vyžadována pro odstranění nespecifických interakcí jiných protilátek přítomných v bud' pre- nebo post-imunitním séru.
Specificita každé protilátky byla potvrzena třemi testy. Za prvé, každá detekovala eden predominantní proužek přibližné velikosti předpokládané pro presenilin-1 na Western blotech ·· · ···
149
mozkového homogenátu. Za druhé, každá zkříženě reagovala s rekombinantními fúsními proteiny nesoucími vhodné sekvence. Za třetí, každá může být specificky blokována pre-absorpcí s rekombinantním PSI nebo imunizujícím peptidem.
Kromě toho, dva různé PSI peptid glutathion S-transferasa (GST) fúsní proteiny byly použity pro generování PSI protilátek. První fúsní protein obsahoval aminoyseliny 1-81 (N-konec) PSI fušované na GST. Druhý fúsní protein obsahoval aminokyseliny 266 - 410 (TM6->7 smyčková doména) PSI fušované na GST. Konstrukty kódující tyto fúsní proteiny byly generovány insercí vhodných nukleotidových sekvencí do pGEX-2T expresního plasmidů (Amrad). Vzniklé konstrukty obsahovaly sekvence kódující GST a místo pro trombin sensitivní štěpení mezi GST a PSI peptidem. Expresní konstrukty byly transfektovány do DH5a E. coli a exprese fúsních proteinů byla indukována za použití IPTG. Bakteriální pelety byly lyžovány a solubilní GST-fúsní proteiny byly purifikovány jednokrokovou afinitní chromatografií na glutathion sepharosových korálcích (Boehringer Mannheim, Montreal). GST fúsní proteiny byly použity pro imunizaci myší pro generování monoklonálních protilátek za použití standartních postupů. Klony získané od těchto myší byly vyšetřovány s purifikovanými fragmenty presenilinů.
Kromě toho, GST fúsní proteiny byly štěpenyt trombinem pro uvolnění PSI peptodu. Uvolněné peptidy byly purifikovány HPLC s vylučováním podle velikosti a použity pro imunizaci králíků pro generování polyklonálního antiséra.
Podobnými metodami byly vyrobeny GST fúsní proteiny za použití konstruktů obsahujících nukleotidové sekevence pro aminokyseliny
150
1-87 (N konec) nebo 272 až 390 (TM6->TM7 smyčka) presenilinu-2 a byly použity pro generování monoklonálních protilátek k tomuto proteinu. PS2-GST fúsní proteiny byly také štěpeny thrombinem a uvolněné, purifikované peptidy byly použity pro imunizaci králíků pro přípravu polyklonálního antiséra.
Příklad 11
Identifikace mutací v PS2 genu
RT-PCR produkty korespondující PS2 ORF byly generovány z RNA lymfoblastů nebo zmražené mrtvé mozkové tkáně za použití prvního páru oligonukleotidových primerů s 5' primerem korespondujícím bp 478 - 496 SEQ ID NO: 18 a 3' primerem komplementárním k bp 1366 1348 SEQ ID NO: 18, za vzniku 888 bp produktu, a s druhým párem primerů s 5' primerem korespondujícím bp 1083 - 1102 SEQ ID NO: 18 a 3' primerem komplementárním k bp 1909 - 1892 SEQ ID NO: 18, za vzniku 826 bp produktu. PCR byla provedena za použití 250 mMol dNTP, 2,5 mM MgCl2, 10 pMol oligonukleotidů v 10 ml za cyklování 40 cyklů o 94 °C x 20 sekund, 58 °C x 20 sekund, 72 °C x 45 sekund. PCR produkty byly sekvencovány automatizovaným cyklickým sekvencováním (ABI, Foster City, CA) a fluorescentní chromatogramy byly snímány na heterozygotní nukleotidovou substituci přímou inspekcí a pomocí Factura (ver 1.2.0) a Sequence Navigátor (ver 1.0.1bl5) softwerových balíčků (data nejsou ukázána).
Detekce N141I mutace: A->T substituce v nukleotidu 787 vytvořila Bell restrikční místo. Exon nesoucí tuto mutaci byl amplifikován ze 100 ng genomové DNAza použití 10 pMol každého z oligonukleotidů korespondujících bp 733 - 751 SEQ ID NO: 18 ·· ····
151 (koncově značený) a komplementu bp 846 - 829 SEQ ID NO: 18 (neznačený) a podmínek PCR reakce podobných podmínkám popsaným dále pro M239V mutaci. 2 ml PCR produktu byly restrihovány Bell (NEBL, Beverly, MA) v 10 ml reakčního objemu podle protokolu výrobce a produkty byly vyšetřovány nedenaturační polyakrylamidovou gelovou elektroforesou. U subjektů s divokým typem sekvencí je 114 bp PCR produkt štěpen na 68 bp a 46 bp fragmenty. Mutantní sekvence způsobují, že je produkt štěpen na 53 bp, 46 bp a 15 bp.
Detekce M239V mutace: A->G substituce v nukleotidu 1080 deletuje NlalII restrikční místo, což umožňuje, že M239V mutace je detekována amplifikací ze 100 ng genomové DNA za použití 10 pMol každého z oligonukleotidů korespondujících p 1009 - 1026 SEQ ID NO: 18 a komplementu bp 1118 - 1101 SEQ ID NO: 18. PCR podmínky byly: 0,5 U Taq polymerasy, 250 mM dNTPS, 1 mCi a32P-dCTP, 1,5 mM MgCl2, objem 10 ml; 30 cyklů o 94 °C x 30 sekund, 72 °C x 20 sekund, 72 °C x 20 sekund, za generování produktu o 110 bp. 2 ml PCR reakce byly ředěny do 10 ml a restrihovány 3 U NlalII (Nebi, beverly, MA) po 3 hodiny. Restrikční produkty byly vyšetřovány nedenaturační polyakrylamidovou gelovou elektroforesou a vizualizovány autoradiografií. Normální subjekty vykazovaly štěpení produktů o 55, 35, 15 a 6 bp, zatímco mutantní sekevence dávaly fragmenty o 55, 50 a 6 bp.
Detece 1420T mutace: Podobně jako ve výše popsané proceduře může být I420T mutace vyšetřována na PCR amplifikací genomové DNA za použití primerů korespondujících bp 1576 - 1593 SEQ ID NO: 18 a komplementu bp 1721 - 1701 SEQ ID NO: 18 za generování produktu o 146 párech baží. Tento produkt může potom být probován alelově
specifickými oligonukleotidy pro divoký typ (např. bp 1616 - 1632
SEQ ID NO: 18) a mutantní (např. bp 1616 - 1632 SEQ ID NO: 18 s
T->C substitucí v bp 1624) sekvence.
Příklad 12
Transgení myši
Serie PSI a PS2 genů divokého a mutantního typu byly konstruovány pro použití v přípravě transgeních myší. Mutantní verse PSI a PS2 byly generovány místně řízenou mutagenesí klonované cDNA cc33 (PSI) a cc32 (PS2) za použití standartních technik.
cDNA cc33 a cc32 a jejich mutantní verse byly použity pro přípravu dvou tříd PSI a PS2 cDNA - mutantní a divokého typu, jak je popsáno v příkladu 8. První třída, označovaná jako kompletní cDNA, byla připravena odstraněním přibližně 200 bp 3' netranslatovaného regionu ihned po póly a místě trávením EcoRI (PSI) a PvuII (PS2). Druhá třída, označovaná jako zkrácená cDNA, byla připravena nahrazením 5' netranslatovaného regionu vazebným místem pro ribosom (Kozák konsensuální sekvencí) umístěnou ihned 5' k ATG start kodonu.
Různé kompletní a zkrácené PSI a PS2 cDNA divokého a mutantního typu, připravené jak bylo popsáno výše, byly zavedeny do jednoho nebo více z následujících vektorů a vzniklé konstrukty byly použity jako zdroj genů pro produkci transgeních myší.
cos.TET expresní vektor:
·· ····
153 : ’·:
«·· ··
Tento vektor byl odvozen od kosmidového klonu obsahujícího PrP gen syrského křečka. Podrobně ho popsal Scott et al. (1992) a
Hsiao et al., (1995). PSI a PS2 cDNA (kompletní nebo zkrácené) byly insertovány do tohoto vektoru v jeho Sáli místě. Konečné konstrukty obsahovaly 20 kb 5' sekvence sousedící s insertovanou cDNA. Tato 5' sousedící sekvence obsahovaa PrP genový promotor, 50 bp PrP genového 5' netranslatovaného exonu, sestřihové donor místo, 1 kb intron, a sestřihové akceptorové místo umístěné ihned sousedně k Sáli místu, do kterého byla PSI nebo PS2 cDNA insertována. 3' sekvence sousedící s insertovanou DNA obsahovala přibližně 8 kb segment PrP 3' netranslatovaného regionu obsahujícího polyadenylační signál. Trávení tohoto konstruktu Notl (PSI) nebo Fsel (PS2) uvolnilo fragment obsahující mutantní nebo divoký typ PS genu pod kontrolou PrP promotoru. Uvolněný fragment byl purifikován na gelu a injikován do pronukleolu fertilizovaného myšího vajíčka za použití metody popsané Hsiao et al., (1995).
Konstrukty β-podjednotky receptoru pro růstový faktor odvozený od destiček.
PS cDNA byly také zavedeny mezi Sáli (kompletní PSI cDNA) nebo HindlII (zkrácená PSI cDNA, kompletní PS2 cDNA a zkrácená PS2 cDNA) ve 3' konci lidského promotoru β-podjednotky receptoru pro růstový faktor odvozený od destiček a EcoRI místo v 5' konci SV40 póly A sekvence a celá kazeta byla klonována do pZeoSV vektoru (Invitrogen, San Diego, CA). Fragmenty uvolněné Scal/BamHI trávením byly purifikovány na gelu a injikovány do pronukleolu fertilizovaného myšího vajíčka za použití metody, kterou popsal Hsiao et al., (1995).
·· ···*
154
Konstrukty lidského β-aktinu
PSI a PS2 cDNA byly insertovány do Sáli místa pBAcGH.
Konstrukt produkovaný touto insercí obsahoval 3,4 kb lidské β aktinové 5' sousední sekvence (lidský β aktinový promotor, sestřižený 78 bp lidský β aktinový 5' netranslatovaný exon a intron) a PSI a PS2 insert násedovaný 2,2 kb genomové sekvence lidského růstového hormonu obsahujícího několik intronů a exonů, stejně jako polyadenylační signál. Sfil byl použit pro uvolnění PS-obsahujíčího fragmentu, který byl purifikován na gelu a injikován do pronukleolu fertilizovaného myšího vajíčka za použití metody, kterou popsal Hsiao et al., (1995).
Konstrukty fosfoglycerát kinasy:
PSI a PS2 cDNA byly insertovány do pkJ90 vektoru. cDNA byla insertována mezi KpnI místo downstream od promotoru lidské fosfoglycerát kinasy a Xbal místa upstream od 3' netranslatovaného regionu lidského genu pro fosfoglycerát kinasu. Pvull/HindlII (PSI cDNA) nebo PvuII (PS2 cDNA) trávení bylo použito pro uvolnění PS-obsahujíčího fragmentu, který byl purifikován na gelu a injikován do pronukleolu fertilizovaného myšího vajíčka za použití metody popsané výše.
Příklad 13
Exprese rekombinantního PSi a PS2 v eukaryotických buňkách
Rekombinantní PSI a PS2 byly exprivovány v mnoha typech buněk (např. PC12, neurobíastomových, ovariálních čínského křečka, a
155 lidských embryonálních ledviných 293 buňkách) za použití pcDNA 3 vektoru (Invitrogen, San Diego, CA). PSI a PS2 cDNA insertované do tohoto vektoru byly stejné kompletní a zkrácené cDNA jako byly popsány v příkladu 8.
Tyto cDNA byly insertovány mezi CMV promotor a polyadenylační místo hovězího růstového hormonu pcDNA3. Transgeny byly exprivovány ve vysokých hladinách.
Kromě toho, PSI a PS2 byly exprivovány v COS buňkách za použití pCMX vektoru. Pro usnadnění zapojení a rozpoznání intracelulární lokalizace presenillnových proteinů byly oligonukleotidy kódující sekvenci o 11 aminokyselinách odvozenou od lidského c-myc antigenu (viz např. Evan et al., 1985) a rozpoznávané monoklonální anti-myc protilátkou MYC-1-9E10.2 (produkt CRL 1729, ATCC, Rockville, Md.) ligovány v rámečku buď ihned před nebo ihned po otevřeném čtecím rámečku PSI a PS2 cDNA. Byly také připraveny nezapojené pCMX konstrukty, c-myc spojené konstrukty byly také zavedeny do pcDNA3 pro transfekci v CHO buňkách.
Transientní a stabilní transfekce těchto konstruktů byla dosažena za použití Lipofectaminu (Gibco/BRL) podle návodu výrovbce. Kultury byly testovány na transientní expresi po 48 hodinách. Stabilně transfektované linie byly selektovány za použití 0,5 mg/ml Geneticinu (Gibco/BRL).
Exprese transfektovaných PS proteinů byla testována Western blottingem za použití anti-presenilinových protilátek 1142, 519 a 520 popsaných výše. Stručně, kultivované transfektované buňky byly solubilizovány (2% SDS, 5 mM EDTA, 1 mg/ml leupeptin a
156 aprotinin) a koncentrace proteinu bya určena podle Lowry.
Proteiny byly separovánY NA sds_PAGe gradientových gelech (4-20% Novex) a byly transferovány na PVDF (10 mM CAPS) po 2 hodiny při konstantním napětí (50 V) . Nespecifická vazba byla blokována odstředěným mlékem (5%) po 1 hodinu. Proteiny byly potom probovány dvěma králičími polyklonálními protilátkami (1 mg/ml v TBS, pH 7,4) po 12 hodin. Presenilin zkříženě reaktivní druhy byly identifikovány za použití biotynylované kozí anti-králičí sekundární protilátky, která byla vizualizována za použití křenová peroxidasa-konjugované streptravidin terciární, 4-chloro-naftolu a peroxidu vodíku. S c-myc spojené presenilinové peptidy bylytestovány Western blotingem za použití obou anti-presenilinových protilátek popsaných výše (pro detekci presenilinového peptidového antigenu), a supernatantu kultury z hybridomu MYC 1-9E10.2 ředěného 1:10 pro Western bloty a 1:3 pro imunocytochemii (pro detekci myc-epitopu). Byl identifikován hlavní proužek imunoreaktivity o 50 - 60 kDa každou různých presenilinových protilátek a protilátkami pro myc-epitop (pro buněčné linie transfektované myc-obsahujíčími plasmidy).
Některými presenilínovými protilátkami byly identifikovány menší proužky o asi 10 - 19 kDa a asi 70 kDa.
Pro imunocytochemii byly transfektované buňky fixovány 4% formaldehydem v Tris pufrovaném salinickém roztoku (TBS), byly extensivně promyty TBS plus 0,1% triton a nespecificky blokovány 3% BSA. Fixované buňky byly probovány presenilinovými protilátkami (např. protilátkami 520 a 1142, výše; typicky 5-10 mg/ml), promyty a vizualizovány FITC- nebo rhodamin- konjugovanou ozí nebo králičí sekundární protilátkou. Pro c-myc připojené presenilinové konstrukty byl použit hybridomní MYC 1 - 9E10.2 supernantant ředěný 1:3 spolu s anti-myší sekundární protilátkou.
157
Slídy byly umístěny v 90% glycerolu s 0,1% fenylendiaminem (ICN) pro zachování fluorescence. Anti-BIP (nebo anti-calnexin) StressGen, Victoria, B.C.) a aglutinin pšeničných klíčků (EY Labs, San Mateo, CA) byly použity jako markéry endoplasmatického retikula a Golgiho aparátu, v příslušném pořadí. Dvojité imunoznačení bylo také provedeno anti-actinem (Sigma, St. Louis, Mo.), anti-amyloid prekursorový protein (22C11, boehringer Mannheim) a anti-neurofilamenta (NF-M specifické, Sigma) v neuronální linii NSC34. Tyto imunofluorescenční studie demonstrovaly, že produkt transfekce je rozsáhle distribuován v buňce, s určitým zvýrazněním perinukleární lokalizace naznačujícícm endoplasmatické retiulum a Golgiho aparát, které je podobné jako u netransfektovaných buněk, ale výraznější, někdy přesahující přes adernou membránu. Ko-imunolokalizace c-myc a S epitopů byla pozorována u CHO a COS buněk transientně transfektovaných myc-připojenými presenilinovými konstrukty. Robusní exprese transfektovaného presenilinového genu v transfektovaných buňkách byla tak prokázána imunocytochemií, Northern blotem, Western bloty (za použití protilátek k presenilinům jak byly popsány výše a za použití monoklonální protilátky MYC 1-9E10.2 pro myc připojení v konstruktech s 3' nebo 5' c-myc přípojkách).
Příklad 14
Izolace presenilinových vazebných protinů afinitní chromatografií
Pro identifikaci proteinů, které mohou být zahrnuty v biochemické funkci presenilinů byly PSI vazebné proteiny izolovány za použití afinitní chromatografie. GST fúsní protein
158 obsahující PSI TM6->7 smyčku, připravený jak je popsáno v příkladu 8, byl použit k probování lidských mozkových extraktů, připravených homogenizací lidské mozkové tkáně na Polytronu ve fyziologickém roztoku. Nespecifická vazba byla eliminována předčištěním mozkových homogenátů endogeních GST vazebných složek inkubací s glutathion-Sepharosovými korálky. GST prosté homogenáty byly potom inkubovány s GST fúsními proteiny za produkce požadvaných komplexů s funkčními vazebnými proteiny. Tyto komplexy byly potom odebrány za použití afintních glutathion-Sepharosových korálků. Po extensivním promytí fosfátem pufrovaným salinickým roztokem byl izolovaný soubor proteinů separován SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforesou (SDS-PAGE; Tris-tricin gradientový gel 4 - 20%). Byly pozorovány dva hlavní proužky v 14 a 20 kD spolu s několika slabšími proužky od 50 do 60 kD.
Farmakologická modifikace interakcí mezi těmito proteiny a TM6->7 smyčkou může být využita v léčbě Alzheimerovy choroby. Kromě toho, tyto proteiny, které pravděpodobně účinkují v presenilinové biochemické dráze, mohou být novými místy mutací způsobujících Alzheimerovu chorobu.
Příklad 15
Izolace presenilinových vazebných proteinů dvouhybridovým kvasinkovým systémem
Pro identifikaci proteinů interagujících s presenilinovými proteiny byl generován kvasinkový expresní plasmidový vektor (pAS-1, Clontech) ligací v rámečku částečné cDNA sekvence kódující buď zbytky 266 - 409 PSI proteinu nebo zbytky 272 - 390
159
PS2 proteinu do EcoRi a BamHI míst vektoru. Vzniklý fúsní protein obsahoval GAL4 DNA vazebnou doménu navázanou v rámečku bud' na TM6->7 smyčku PSI proteinu nebo na TM6->7 smyčku PS2 proteinu. Tyto expresní plasmidy byly kotransformovány, spolu s purifikovanou plasmidovou DNA z lidské mozkové cDNA:pACT knihovny, do kvasinek za použití protokolu Clontech Matchmaker kvasinkového dvouhybridového kitu (Clontech). Kvasinkové klony nesoucí lidskou mozkovou cDNA interagující s TM6->7 smyčkovou doménou byly selektovány HIS resistencí a Sgal+ aktivací. Klony byy dále selektovány sensitivitou na cyklohexamin a inserty lidských mozkových cDNA byly izolovány PCR a sekvencovány. Ze 6 milionů počátečních transformantů bylo získáno 200 pozitivních koňů po HIS selekci a 42 po Sgal+ barevné selekci, provedených podle návodu výrobce pro selekci pozitivních kolonií. Z těchto 42 klonů bylo několik (5 - 8) nezávislých klonů representujících stejné geny. Toto ukazuje, že tyto interakce jsou biologicky reálné a reprodukovatelné.
Příklad 16
Transgení C. elegans
Transgení C. elegans byly získány mikroinjikováním oocytů. Vektory pPD49.3 hsp 16 - 41 a pPD49.78 hsp 16-2 byly vybrány pro tento účel. Za použití prvního z těchto vektorů byly produkovány transgení C. elegans, ve kterých byl zaveden normální hPSl gen nebo mutantní gen (L392V). Transformovaná zvířata byla detekována testováním exprese lidské cDNA na northern blotech nebo na western blotech za použití lidské cDNA proby cc32 a protilátek 519, 520 a 1142, jak je popsáno výše. Byly také připraveny a/nebo injikovány vektory nesoucí cis dvojité mutanty
160 hPSl genu (M146L a L392V), normální hPS2 gen a mutantní (N141I) hPS2 gen.
Příklad 17
Klonování Drosophilího homologu pro presenilin, DmPS
Redundantní oligonukleotidy 5'ctn ccn gar tgg acn gyc tgg (SEQ ID NO: 22) a 5' rca ngc (agt)at ngt ngt rtt cca (SEQ ID NO: 23) byly projektovány z publikovaných dat nukleotidové sekvence pro vysoce konzervované regiony presenilin/sel-12 proteinů končících/začínajících Trp (např. zbytky Trp247 a Trp404 v PSI; Trp253 a Trp385 v PS2). Tyto primery byly použity pro RT-PCR (50 ml objem, 2 mM MgClz, 30 cyklů 94 °C x 30'', 57 °C x 20'', 72 °C x 20'') z mRNA od dospělých a embryonálních D. melanogaster. produkty byly potom reamplifikovány za použití podmíne cyklu 94 °C x 1', 59 °C x 0,5' a 72 °C x 1' a vnitřního konzervovaného redundantního primerů 5' ttt ttt ctc gag acn gen gar gar aga aay ga (SEQ ID NO: 24) a 5' ttt ttt gga tcc tar aa(agt) atr aar ten cc (SEQ ID NO: 25). 600 bp produkt byl klonován do BamHI a Xhol míst pBS. tyto produkty byly sekvencovány a ukázalo se, že obsahují otevřený čtecí rámeček s putativní aminokyselinovou sekvencí vysoce homologní k sekvenci presenilinů. Tyto fragmenty byly potom použity pro vyšetření konvenční D. melanogaster cDNA/Zap knihovny (Stratagene, CA) pro získání šesti nezávislých cDNA klonů velikosti 2 - 2,5 kb (klony pds8, pdsl3, pds3, pds7 a pdsl4), které bylu sekvencovány. Nejdelší ORF kodoval polypeptid o 541 aminokyselinách s 52% identitou k lidským presenilinům.
161
Příklad 18
Testy pro dlouhé izoformy Αβ peptidů
Αβ peptidy byly extrahovány 99% kyselinou mravenčí po dobu 60 minut (20 °C) ze zmrazené mozkové kůry histopatologicky potvrzených případů FAD s PSI nebo βΑΡΡ^^^ mutacemi; sporadických případů AD bez pozitivní rodině anamesy choroby; jiých neurodegenerativních onemocnění s nástupem v dospělosti (HD = Huntingtonova chorea; ALS = Amyotrofická laterální sklerosa); Downova syndromu; a kontrolních subjektů bez neurologických symptomů, po centrifugací při 200000 x g po 20 minut byl supernatant separován z pelet, ředěn, neutralizován a vyšetřován ELISA. Pro kvantifikaci různých druhů Αβ byly použity čtyři monoklonální protilátky. Protilátka BNT-77 (která detekuje epitopy z centra Αβ) a protilátka BAN-50 (která detekuje N-terminální zbytky) byly použity pro prvotní vazbu všech typů Αβ včetně heterologníh forem s nebo bez N-terminálního zkrácení (BNT-77) nebo pouze bez N-terminálního zkrácení (BAN-50). Dvě daší monokonální protilátky, které specificky detekují krátké Αβ končící ve zbytku 40 (protilátka BA-27) nebo dlouhé Αβ končící ve zbytku 42/43 (protilátka BC-05) byly potom použity pro odlišení různých C-terminálních forem Αβ. Dvumístná ELISA byla provedena jak bylo již popsáno (Tamaoka et al., 1994; Suzuki et al., 1994). Stručně, 100 standartních peptidů nebo supernatantů z mozkové tkáně bylo aplikováno na mikroplotnu potaženou BNT-77 protilátkou, inkubováno při 4 °C po 2 hodin, promyto fosfátem pufrovaným salinickým roztokem a potom inkubováno s HRP-značenou BA-27 a BC-05 protilátkou při 4 °C po 24 hodin.HRP aktivity byly testovány vývojem barvy za použití TNB mikrojamkového
162
peroxidasového systému jak bylo popsáno dříve. Kortikální Αβ hladiny byly porovnávány mezi diagnostikovanými skupinami za použití párových Student-t testů. Společné hodnocení dat všech Αβ izoforem, za použití Student-Newman-Keuls průměrů testů ukázalo, že Αβ1-42 hladiny od βΑΡΡ7ΐ7 a sporadických AD subjektů byly odlišné od případů PSI mutace, ale že byly podobné jako u kontrol. Oproti tomu, tři skupiny byly odlišitelné, když byly srovnávány Αβχ-42 hladiny: vysoká (PSI a βΑΡΡ7ΐν AD), střední (sporadická AD) a nízká (kontrola).
Přesněji, měření koncentrace různých Αβ izoforem v mozkové kůře 14 kontrolních subjektů, včetně pěti subjektů s jinými neurodegenerativními onemocněními s nástupem ve čtvrté a páté dekádě života ukázalo pouze nízké koncentrace jak krátkých Αβ (Αβ1-40: 0,06 + 0,02 nMol/g čerstvé tkáně + SEM; Αβχ-40: 0,17 + 0,40) a dlouhých Αβ (Afil-42/43: 0,35 ± 0,17; Αβχ-42/43: 1,17 + 0,80) . Oproti tomu, Αβ peptidy s dlouhým koncem byly signifikantně elevovány v mozkové kůře všech čtyřech subjektů s PSI mutací (Αβ1-42/43: 6,54 + 2,00, p = 0,05; Αβχ-42/43: 23,91 ± 4,00, p > 0,01). Podobná zvýšení v koncentracích Αβ peptidů byla detekována v kůře obou subjektů s βΑΡΡ7χ7 mutacemi (Afil-42/43: 2,03 + 1,04; Αβχ-42/43: 25,15 + 5,74) a subjektů se sporadickou AD (Αβ1-42/43: 1,21 + 0,40, p = 0,008; Αβχ-42/43: 14,45 + 2,81, p = 0,001). U subjektů s PSI nebo βΑΡΡ mutacemi bylo toto
717 -* zvýšení dlouhých izoforem Αβ spojeno s malým, ale ne-signifikantním zvýšením krátkých Αβ izoforem (např. Αβχ-40: 3,08 ± 1,31 u PSI mutantů; 1,56 + 0,07 u βΑΡΡνιν mutantů). Tak poměr dlouhých a krátkých izoforem byl také signifikantně zvýšen. Nicméně, u sporadických AD bylo pozorované zvýšení dlouhých Αβ typicky spojeno s mnohem vyšším zvýšením krátkých Αβ izoforem (Αβ1-40: 3,92 + 1,42; Αβχ-40: 16,60 + 5,88). Toto zvýšení
163 • · · · • ·· krátkých Αβ bylo statisticky signifikantní ve srovnání s kontrolami (p > 0,03 pro oba Αβ1-40 a Αβχ-40), ale bylo hraničně statisticky signifikantní ve srovnání s PSI a βΑΡΡ7ΐν případy (p_0,05). Analýza korových vzorků od dospělých jedinců s Downovým syndromem odhalila vzorky podobné těm, které byly pozorovány pro sporadickou AD.
Ačkoliv preferovaná provedení zde byla popsána podrobně bude odborníků jasné, že mohou být provedeny variace k těmto provedením bez překročení rozsahu myšlenky vynálezu a bez narušení rozsahu připojených nároků.
164
Tabulka 1 element umístění element umístění
STATI (GAS) i 34-46 278-286 611-619 631-639 CAT box 895-900 975-982
1 431-439 1582-1590 TATA box 925-933
443-451 1965-1973 978-988
495-503 2125-2133 TFIID 578-581
533-541 982-985
STÁT 3 36-43 737-744 TRXN (CAP) 1002-1007
start
124-131 811-898 1038-1043
429-436 1063-1070 GC box 1453-1460
(SPI)
496-503 1686-1693 1454-1452
533-540 1966-1973 AP2, AP2-like numerous occurrences
537-544 2104-2111 throughout sequence
632-639 2407-2414 NFIL6 611-620 1567-1576
MEDl,MEDl-like 1121-1126 1235-1240 890-899 1945-1954
1126-1131 1716-1721 1062-1071
165
Tabulka 2
PSI doména přibližná pozice
N-terminus 1-81
TMI 82-100
TMl-»2 101-132
TM2 133-154
TM2-»3 155-163
TM3 164-183
TM3->4 184-194
TM4 195-212
TM4-»5 213-220
TM5 221-238
TM5-»6 239-243
TM 6 244-262
TM6->7 263-407
TM 7 408-428
C-terminus 429-467
166
Tabulka 3
PS2 doména přibližná pozice N_terminus
TMI
TMI*2
TM2
TM2^3
TM3
TM3-*4
TM4 r£j44-»5
TM5
TM5-*6
TM 6 lM6-*7
TM7 c-terminus
1-87
88-1°6
107-134 135_16°
161169
170-189
190-200
201-218
219-224
225-244
245-249
250-268
269-387
388-409
410-448 • · · · · ·
167
Tabulka 4
Pozice v seqidno.i SKy 1U ΙΊ'μΖ . J. Nukleotidová změna Aminokyselinová změna Funkční doména Věk nástupu FAD
1. NA NA A79? N-terminus f'AU 64
2 . 492 G->C V82L TMI 55
3 . NA NA V96F TMI NA
45 591 T-»C Y115H TM1-2 37
5 . 664 T->C M139T TM2 49
6 . NA NA M139V TM2 40
7 . 676 T-*C I143T TM2 35
8 . 684 A-*C M146L TM2 45
20 NA NA M146V TM2 38
10 . 736 A-»G H163R TM2^3 50
11. NA NA H163Y TM2-»3 47
12 . NA NA L171P TM3 35
13 . NA NA G209V TM4 na
HIS. NA NA I211T TM4 NA
15 . 939 G-»A A231T TM 5 52
16 . 985 C-*A A246E TM 6 55
17 . 1027 C->T A2 6 0V TM 6 40
18. NA NA C263R TM6-.7 47
I2S0. 1039 C-»T P264L TM6-»7 45
20 . NA NA P267S TM6-»7 35
21. NA NA E280A TM6-»7 47
22 . NA NA E280G TM6-»7 42
23 . 1102 C-*T A2 85V TM6->7 50
23£. 1104 C-»G L286V TM6->7 50
25 . NA deletion Δ291-319 TM6-»7 NA
26 . 1399 G-»C G3 84A TM6-»7 35
27 . 1422 C-»G L392V TM6-»7 25-40
28 . 1477 G-»A C410Y TM 7 48
168
Tabulka 5
Pozice v SEQ Π) NO: 18 < Nukleotidová změna Aminokyselinová změna Funkční doména Věk nástupu FAD
1. 787 A-»T N141I TM2 50-65
2 . 1080 A-»G M239V TM5 50-70
3 . 1624 T-*C I420T C-terminus 45
5 Tabulka 6
28-61 302-310
65-71 311-325
109-112 332-342
120-122 346-359
218-221 372-382
241-243 400-410
267-269
TabulkaT
25-45 282-290
50-63 310-314
70-75 321-338
114-120 345-352
127-132 380-390
162-167 430-435
221-226
169
Odkazy:
Albertsen et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 87:42564260 .
Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.
Bellamne-Chartelot et al. (1992) Cell 70:1059-1068.
Bergamini et al. (1991) Acta Neurol. 13:534-538.
Brand and Perrimon (1993) Development 118:401-415.
Bueler et al. (1996) Nátuře 356:577-582.
Campion et al., (1995) Hum. Molec. Genet. 4:2373-2377.
Campos-Ortega and Jan (1991) Ann. Rev. Neurosci. 14:399.
Canadian Patent Application No. 2,096,911
Canadian Patent Application No. 2,071,105
Chartier-Harlin et al. (1991) Nátuře 353:844-846.
Chumakov et al. (1992) Nátuře 359:380-387.
Cruts et al. (1995) Hum. Molec. Genet.. 4:2363-2371.
Davis (1996) Physiol. Reviews (in press).
Evan et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:3610-3616.
Fischer and Lerman (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 80:1579
1583 .
Foncin et al. (1985) Rev. Neurol. (Paris) 141:194-202.
Frommelt et al. (1991) Alzheimer Dis. Assoc. Disorders 5:36-43.
Games et al. (1995) Nátuře 373:523-527.
Gandy et al. (1993)
Gavrieli et al. (1992) J. Cell Biol. 119:493-501.
Goate et al. (1991) Nátuře 349:704-706.
Goudsmit et al. (1981) J. Neurol. Sci. 49:79-87.
Gravina et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016.
Gyapay et al. (1994) Nátuře Genetics 7:246-339.
Hilbich et al. (1991) J. Mol. Biol. 218:149-163.
Hogan et al. (1986) Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring
Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York.
Hsiao et al. (1995) Neuron. (in press).
Huang and Chalfie (1994)
Huang et al. (1993)
Ince and Scotto (1995) J. Biol. Chem. 270:30249-30252.
International Patent Application No. WO 94/23049
International Patent Application No. WO 94/00569
Ioannu et al. (1994) Nátuře Genetics 6:84-89.
170
Iwatsubo et al. (1995) Ann. Neurol. 37:294-299.
Jacobson et al. (1993) Nátuře 361:365.
Kahn (1995) Science 270:369-370.
Karlínsky et al. (1992) Neurology 42:1445-1453.
Katzman (1986) N. Eng. J. Med. 314:964-973.
Kollmar and Farnham (1993) Proč. Soc. Expt. Biol. Med. 203:127137 .
Krause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556.
Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105
Lamb et al. (1993) Nátuře Genetice 5:22-29
Lassmann et al. (1995) Acta Neuropathol. 89:35.
Levesque et al. (1996) in press.
Levitan and Greenwald (1995) Nátuře 377:351-354.
Liu and Sommer (1995) Biotechnigues 18:470-477.
Martin et al. (1995) NeuroReport (in press).
Mullan et al. (1992) Nátuře Genetics 1:345-347.
Murrell et al. (1991) Science 254:97-99.
Nee et al. (1983) Are. Neurol. 40:203-208.
NIH/CEPH Collaborative Mapping Group (1992) Science 258:67-86.
Nowak (1995) Science 270:368-371.
Obermeir et al. (1994) Embo J. 7:1585-1590.
Pericak-Vance et al. (1988) Exp. Neurol. 102:271-279.
Phizicky and Fields (1994) Microbiol. Reviews 59:94-123.
Pike et al. (1993) J. Neurosci. 13:1676-1678.
Podlisny et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:9564-9570.
Pollen (1993) Hannah's Heirs: The Ouest for the Genetic Origins of Alzheimer's
Disease, Oxford University Press, Oxford.
Querfurth et al. (1995) Molec. Brain Res. 28:319-337.
Riley et al. (1990) Nucl. Acid Res. 18:2887-2890.
Rogaev et al. (1993) Neurology 43:2275-2279.
Rogaev et al. (1995) Nátuře 376:775-778.
Rommens et al. (1993) Hum. Molec. Genet. 2:901-907.
Saleeba and Cotton (1993) Methods in Enzymology 217:286-295.
Saunders et al. (1993) Neurology 43:1467-1472/
Schellenberg et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 53:619-628.
Schellenberg et al. (1992) Science 258:668-670.
Scheuner et al. (1995) Soc. Neurosci. Abstr. 21:1500.
Schindler and Darnell (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:621-651.
Scott et al. (1992) • · · · · ·
171
Selkoe et al. (1995)
Selkoe et al. (1994)
Sherrington et al. (1995) Nátuře 375:754-760.
St. George-Hyslop et al. (1990) Nátuře 347:194-197.
St. George-Hyslop et al. (1994) Science 263:537.
Strittmatter et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 90:19771981.
Suzuki et al. (1994) Science 264:1336-1340.
Tamaoka et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:32721-32724.
Tamaoka et al. (1995) Brain Res. 679:151-156.
United States Patent No. 5,297,562
Van Broeckhoven et al. (1992) Nátuře Genetics 2:335-339.
Vito et al. (1996) Science 271:521-525.
Wang (1992) Genomics 13: 532-536.
Weissenbach et al. (1992) Nátuře 359:794-798.
Wong et al. (1993) Neurosci. Lett. 152:96-98.
Zheng et al. (1995) Cell 81:525-531 • ·
172 • ··
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: HSC RESEARCH AND DEVOLOPMENT LIMITED
PARTNERSHIP (B) Ulice: 555 University Avenue (C) Město: Toronto (D) Stát: Ontario (E) Země: Canada (F) Poštovní kod (ZIP): M5G 1X8 (G) Telefon: (416) 813-5982 (H) Telefax: (416) 813- 5085 (A) Jméno: THE GOVERING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF
TORONTO (B) Ulice: 106, Simcoe Halí, 27 King's College Circle (C) Město: Toronto (D) Stát: Ontario (E) Země: Canada (F) Poštovní kod (ZIP): M5S 1A1 (G) Telefon: (416) 978-7461 (H) Telefax: (416) 978-1878 (A) Jméno: ST. GEORGE-HYSLOP, Peter H.
(B) Ulice: 210 Richview Avenue (C) Město: Toronto (D) Stát: Ontario (E) Země: Canada • · · · · ·
173
(F) Poštovní kod (ZIP): M5P 3G3
(A) Jméno: FRASER, Paul E.
(B) Ulice: 611 Windermere Avenue
(C) Město: Toronto
(D) Stát: Ontario
(E) Země: Canada
(F) Poštovní kod (ZIP): M6S 3L9
(A) Jméno: ROMMENS, Johanna M.
(B) Ulice: 105 McCaul Streetenue
(C) Město: Toronto
(D) Stát: Ontario
(E) Země: Canada
(F) Poštovní kod (ZIP): M5T 2 XT
(ii) Název vynálezu: Genetické sekvence a proteiny týkající se Alzheimerovy choroby a jejich použití (iii) Počet sekvencí: 25 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Sim & McBurney (B) Ulice: 330 University Avenue, 6th floor (C) Město: Toronto (D) Stát: Ontario (E) Země: Canada (F) ZIP: M5G 1R7 (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní • · · · · ·
174 (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Údaje o současné přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: PCT/CA96/00263 (B) Datum podání: 29.5.1996 (C) Klasifikace:
(vii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/509359 (B) Datum podání: 31.7.1995 (vii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/496841 (B) Datum podání: 28.7.1995 (vii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/431048 (B) Datum podání: 28.5.1995 (viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: RAE, Patricia A.
(C) Reference/číslo rejstříku: 7425-16 (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: (416) 595-1155 (B) Telefax: (416) 595 - 1163 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
175 (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2765 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 249...1649 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...2675
(D) Jiné informace: /notě = hPSl-1
Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:
TGGGACAGGC AGCTCCGGGG TCCGCGGTTT CACATCGGAA ACAAAACAGC GGCTGGTCTG 60
GAAGGAACCT GAGCTACGAG CCGCGGCGGC AGCGGGGCGG CGGGGAAGCG TATACCTAAT 120
CTGGGAGCCT GCAAGTGACA ACAGCCTTTG CGGTCCTTAG ACAGCTTGGC CTGGAGGAGA 180
ACACATGAAA GAAAGAACCT CAAGAGGCTT TGTTTTCTGT GAAACAGTAT TTCTATACAG 240
TTGCTCCA ATG ACA GAG TTA CCT GCA CCG TTG TCC TAC TTC CAG AAT GCA 290
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gin Asn Ala
10
CAG ATG TCT GAG GAC Asp AAC Asn 20 CAC His CTG AGC AAT ACT GTA Val CGT Arg AGC Ser CAG Gin AAT Asn 30 338
Gin 15 Met Ser Glu Leu Ser Asn Thr 25
GAC AAT AGA GAA CGG CAG GAG CAC AAC GAC AGA CGG AGC CTT GGC CAC 386
Asp Asn Arg Glu Arg Gin Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His
35 40 45
CCT GAG CCA TTA TCT AAT GGA CGA CCC CAG GGT AAC TCC CGG CAG GTG 434
Pro Glu Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gin Gly Asn Ser Arg Gin Val
50 55 60
GTG GAG CAA GAT GAG GAA GAA GAT GAG GAG CTG ACA TTG AAA TAT GGC 482
Val Glu Gin Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly
65 70 75
GCC AAG CAT GTG ATC ATG CTC TTT GTC CCT GTG ACT CTC TGC ATG GTG 530
Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val
80 35 90
176 • · • · • · • · · • ··
GTG GTC GTG GCT ACC Thr ATT Ile 100 AAG Lys TCA GTC AGC Ser TTT Phe 105 TAT Tyr ACC Thr CGG Arg AAG Lys GAT Asp 110 578
Val 95 Val Val Ala Ser Val
GC-G CAG CTA ATC TAT ACC CCA TTC ACA GAA GAT ACC GAG ACT GTG GGC 626
Gly Gin Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly
115 120 125
CAG AGA GCC CTG CAC TCA ATT CTG AAT GCT GCC ATC ATG ATC AGT GTC 674
Gin Arg Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val
130 135 140
ATT GTT GTC ATG ACT ATC CTC CTG GTG GTT CTG TAT AAA TAC AGG TGC 722
Ile Val Val Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys
145 150 155
TAT AAG GTC ATC CAT GCC TGG CTT ATT ATA TCA TCT CTA TTG TTG CTG 770
Tyr Lys Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu
160 165 170
TTC TTT TTT TCA TTC ATT TAC TTG GGG GAA GTG TTT AAA ACC TAT AAC 818
Phe Phe Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn
175 180 185 190
GTT GCT GTG GAC TAC ATT ACT GTT GCA CTC CTG ATC TGG AAT TTT GGT 866
Val Ala Val Asp Tyr Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly
195 200 205
GTG GTG GGA ATG ATT TCC ATT CAC TGG AAA GGT CCA CTT CGA CTC CAG 914
Val Val Gly Met Ile Ser Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin
210 215 220 -
CAG GCA TAT CTC ATT ATG ATT AGT GCC CTC ATG GCC CTG GTG TTT ATC 962
Gin Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile
225 230 235
AAG TAC CTC CCT GAA TGG ACT GCG TGG CTC ATC TTG GCT GTG ATT TCA 1010
Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser
240 245 250
GTA TAT GAT TTA GTG GCT GTT TTG TGT CCG AAA GGT CCA CTT CGT ATG 1058
Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met
255 260 265 270
CTG GTT GAA ACA GCT CAG GAG AGA AAT GAA ACG CTT TTT CCA GCT CTC 1106
Leu Val Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu
275 280 285
ATT TAC TCC TCA ACA ATG GTG TGG TTG GTG AAT ATG GCA GAA GGA GAC 1154
Ile Tyr Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp
290 295 300
CCG GAA GCT CAA AGG AGA GTA TCC AAA AAT TCC AAG TAT AAT GCA GAA 1202
Pro Glu Ala Gin Arg Arg Val Ser Lys Asn Ser Lys Tyr Asn Ala Glu
305 310 315
AGC ACA GAA AGG GAG TCA CAA GAC ACT GTT GCA GAG AAT GAT GAT GGC 1250
Ser Thr Glu Arg Glu Ser Gin Asp Thr Val Ala Glu Asn Asp Asp Gly
320 325 330
GGG TTC AGT GAG GAA TGG GAA GCC CAG AGG GAC AGT CAT CTA GGG CCT 1298
Gly Phe Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gin Arg Asp Ser His Leu Gly Pro'
335 340 345 350
CAT CGC TCT ACA CCT GAG TCA CGA GCT GCT GTC CAG GAA CTT TCC AGC 1346
His Arg Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gin Glu Leu Ser Ser
355 360 365
AGT ATC CTC GCT GGT GAA GAC CCA GAG GAA AGG GGA GTA AAA CTT GGA 1394
Ser Ile Leu Ala Gly Glu Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly
370 375 380
• · ··· · · · • · ·
177
TTG Leu GGA GAT TTC Phe ATT Ile TTC Phe TAC Tyr AGT GTT CTG Leu GTT GGT AAA GCC TCA Ser GCA Ala 1442
Gly Asp 385 Ser 390 Val Val Gly Lys 395 Ala
ACA GCC AGT GGA GAC TGG AAC ACA ACC ATA GCC TGT TTC GTA GCC ATA 1490
Thr Ala Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile
400 405 410
TTA ATT GGT TTG TGC CTT ACA TTA TTA CTC CTT GCC ATT TTC AAG AAA 1538
Leu Ile Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys
415 420 425 430
GCA TTG CCA GCT CTT CCA ATC TCC ATC ACC TTT GGG CTT GTT TTC TAC 1586
Ala Leu Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr
435 440 445
TTT GCC ACA GAT TAT CTT GTA CAG CCT TTT ATG GAC CAA TTA GCA TTC 1634
Phe Ala Thr Asp Tyr Leu Val Gin Pro Phe Met Asp Gin Leu Ala Phe
450 455 460
1689
CAT CAA TTT TAT ATC TAGCATATTT GCGGTTAGAA TCCCATGGAT GTTTCTTCTT
His Gin Phe Tyr Ile
465
TGACTATAAC CAAATCTGGG GAGGACAAAG GTGATTTTCC TGTGTCCACA TCTAACAAAG 1749
TCAAGATTCC CGGCTGGACT TTTGCAGCTT CCTTCCAAGT CTTCCTGACC ACCTTGCACT 1809
ATTGGACTTT GGAAGGAGGT GCCTATAGAA AACGATTTTG AACATACTTC ATCGCAGTGG 1869
ACTGTGTCCC TCGGTGCAGA AACTACCAGA TTTGAGGGAC GAGGTCAAGG AGATATGATA 1929
GGCCCGGAAG TTGCTGTGCC CCATCAGCAG CTTGACGCGT GGTCACAGGA CGATTTCACT 1989
GACACTGCGA ACTCTCAGGA CTACCGGTTA CCAAGAGGTT AGGTGAAGTG GTTTAAACCA 2049
AACGGAACTC TTCATCTTAA ACTACACGTT GAAAATCAAC CCAATAATTC TGTATTAACT 2109
GAATTCTGAA CTTTTCAGGA GGTACTGTGA GGAAGAGCAG GCACCAGCAG CAGAATGGGG 2169
AATGGAGAGG TGGGCAGGGG TTCCAGCTTC CCTTTGATTT TTTGCTGCAG ACTCATCCTT 2229
TTTAAATGAG ACTTGTTTTC CCCTCTCTTT GAGTCAAGTC AAATATGTAG ATTGCCTTTG 2289
GCAATTCTTC TTCTCAAGCA CTGACACTCA TTACCGTCTG TGATTGCCAT TTCTTCCCAA 2349
GGCCAGTCTG AACCTGAGGT TGCTTTATCC TAAAAGTTTT AACCTCAGGT TCCAAATTCA 2409
GTAAATTTTG GAAACAGTAC AGCTATTTCT CATCAATTCT CTATCATGTT GAAGTCAAAT 2469
TTGGATTTTC CACCAAATTC TGAATTTGTA GACATACTTG TACGCTCACT TGCCCCCAGA 2529
TGCCTCCTCT GTCCTCATTC TTCTCTCCCA CACAAGCAGT CTTTTTCTAC AGCCAGTAAG 2589
GCAGCTCTGT CRTGGTAGCA GATGGTCCCA TTATTCTAGG GTCTTACTCT TTGTATGATG 2649
AAAAGAATGT GTTATGAATC GGTGCTGTCA GCCCTGCTGT CAGACCTTCT TCCACAGCAA 2709
ATGAGATGTA TGCCCAAAGC GGTAGAATTA AAGAAGAGTA AAATGGCTGT TGAAGC 2765
(2)
Informace pro SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristiky sekvence
178 (A) Délka: 467 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:
Met 1 Thr Glu Leu Pro 5 Ala Pro Leu Ser Tyr 10 Phe Gin Asn Ala Gin 15 Met
Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gin Asn Asp Asn
20 25 30
Arg Glu Arg Gin Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu
35 40 45
Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gin Gly Asn Ser Arg Gin Val Val Glu
50 55 60
Gin Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys
65 70 75 80
His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val Val
85 90 95
Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gin
100 105 110
Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gin Arg
115 120 125
Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val
130 135 140
Val Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys
145 150 155 160
Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe
165 170 175
Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala
180 185 190
Val Asp Tyr Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly Val Val
195 200 205
Gly Met Ile Ser Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin Gin Ala
210 215 220
Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr
225 230 235 240
Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val
260 265 270
Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu Ile Tyr
275 280 285
Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro Glu
290 295 300
Ala Gin Arg Arg Val Ser Lys Asn Ser Lys Tyr Asn Ala Glu Ser Thr
305 310 315 320
Glu Arg Glu Ser Gin Asp Thr Val Ala Glu Asn Asp Asp Gly Gly Phe
325 330 335
• · 4 4 · · • 4 · · · ··· · · · ·· 4
179
Ser Glu Glu Trp 340 Glu Ala Gin Arg Asp 345 Ser His Leu Gly Pro 350 His Arg
Ser Thr Pro 355 Glu Ser Arg Ala Ala 360 Val Gin Glu Leu Ser 365 Ser Ser Ile
Leu Ala 370 Gly Glu Asp Pro Glu 375 Glu Arg Gly Val Lys 380 Leu Gly Leu Gly
Asp 385 Phe Ile Phe Tyr Ser 390 Val Leu Val Gly Lys 395 Ala Ser Ala Thr Ala 400
Ser Gly Asp Trp Asn 405 Thr Thr Ile Ala Cys 410 Phe Val Ala Ile Leu 415 Ile
Gly Leu Cys Leu 420 Thr Leu Leu Leu Leu 425 Ala Ile Phe Lys Lys 430 Ala Leu
Pro Ala Leu 435 Pro Ile Ser Ile Thr 440 Phe Gly Leu Val Phe 445 Tyr Phe Ala
Thr Asp 450 Tyr Leu Val Gin Pro 455 Phe Met Asp Gin Leu 460 Ala Phe His Gin
Phe Tyr Ile
465 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 3086 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 557...1945 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...3086 (D) Jiné informace: /notě = hPSl-2 ·· ·*··
180
(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:
GAATTCGGCA CGAGGGAAAT GCTGTTTGCT CGAAGACGTC TCAGGGCGCA GGTGCCTTGG 60
GCCGGGATTA GTAGCCGTCT GAACTGGAGT GGAGTAGGAG AAAGAGGAAG CGTCTTGGGC 120
TGGGTCTGCT TGAGCAACTG GTGAAACTCC GCGCCTCACG CCCCGGGTGT GTCCTTGTCC 180
AGGGGCGACG AGCATTCTGG GCGAAGTCCG CACSCCTCTT GTTCGAGGCG GAAGACGGGG 240
TCTGATSCTT TCTCCTTGGT CGGGMCTGTC TCGAGGCATG CATGTCCAGT GACTCTTGTG 300
TTTGCTGCTG CTTCCCTCTC AGATTCTTCT CACCGTTGTG GTCAGCTCTG CTTTAGGCAT 360
ATTAATCCAT AGTGGAGGCT GGGATGGGTG AGAGAATTGA GGTGACTTTT CCATAATTCA 420
GACCTAATCT GGGAGCCTGC AAGTGACAAC AGCCTTTGCG GTCCTTAGAC AGCTTGGCCT 480
GGAGGAGAAC ACATGAAAGA AAGAACCTCA AGAGGCTTTG TTTTCTGTGA AACAGTATTT 540
589
CTATACAGTT GCTCCA ATG ACA GAG TTA CCT GCA CCG TTG TCC TAC TTC
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe 1 5 10
CAG AAT GCA CAG Gin 15 ATG Met TCT Ser GAG GAC AAC Glu Asp Asn 20 CAC His CTG AGC AAT Asn ACT Thr 25 AAT Asn GAC Asp
Gin Asn Ala Leu Ser
AAT AGA GAA CGG CAG GAG CAC AAC GAC AGA CGG AGC CTT GGC CAC CCT
Asn Arg Glu Arg Gin Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro
30 35 40
GAG CCA TTA TCT AAT GGA CGA CCC CAG GGT AAC TCC CGG CAG GTG GTG
Glu Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gin Gly Asn Ser Arg Gin Val Val
45 50 55
637
685
733
181
• · • • ·· ····
• « • · • · • · ·
• · • • • · *
• · · · • • • · · · ·
• • • • ·
• ·· ··· ··· ·· ·
GAG CAA GAT Asp GAG Glu GAA GAA Glu Glu 65 GAT Asp GAG GAG CTG ACA TTG AAA TAT GGC Gly GCC Ala 75 781
Glu 60 Gin Glu Glu Leu Thr 70 Leu Lys Tyr
AAG CAT GTG ATC ATG CTC TTT GTC CCT GTG ACT CTC TGC ATG GTG GTG 829
Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val
80 85 90
GTC GTG GCT ACC ATT AAG TCA GTC AGC TTT TAT ACC CGG AAG GAT GGG 877
Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly
95 100 105
CAG CTA ATC TAT ACC CCA TTC ACA GAA GAT ACC GAG ACT GTG GGC CAG 925
Gin Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gin
110 115 120
AGA GCC CTG CAC TCA ATT CTG AAT GCT GCC ATC ATG ATC AGT GTC ATT 973
Arg Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile
125 130 135
GTT GTC ATG ACT ATC CTC CTG GTG GTT CTG TAT AAA TAC AGG TGC TAT 1021
Val Val Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr
140 145 150 155
AAG GTC ATC CAT GCC TGG CTT ATT ATA TCA TCT CTA TTG TTG CTG TTC 1069
Lys Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe
160 165 170
TTT TTT TCA TTC ATT TAC TTG GGG GAA GTG TTT AAA ACC TAT AAC GTT 1117
Phe Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val
175 180 185 v
GCT GTG GAC TAC ATT ACT GTT GCA CTC CTG ATC TGG AAT TTG GGT GTG 1165
Ala Val Asp Tyr Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Leu Gly Val
190 195 200
GTG GGA ATG ATT TCC ATT CAC TGG AAA GGT CCA CTT CGA CTC CAG CAG 1213
Val Gly Met Ile Ser Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin Gin
205 210 215
GCA TAT CTC ATT ATG ATT AGT GCC CTC ATG GCC CTG GTG TTT ATC AAG 1261
Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys
220 225 230 235
TAC CTC CCT GAA TGG ACT GCG TGG CTC ATC TTG GCT GTG ATT TCA GTA 1309
Tyr Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val
240 245 250
TAT GAT TTA GTG GCT GTT TTG TGT CCG AAA GGT CCA CTT CGT ATG CTG 1357
Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu
255 260 265
GTT GAA ACA GCT CAG GAG AGA AAT GAA ACG CTT TTT CCA GCT CTC ATT 1405
Val Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu Ile
270 275 280
TAC TCC TCA ACA ATG GTG TGG TTG GTG AAT ATG GCA GAA GGA GAC CCG 1453
Tyr Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro
285 290 295
GAA GCT CAA AGG AGA GTA TCC AAA AAT TCC AAG TAT AA.T GCA GAA AGC 1501
Glu Ala Gin Arg Arg Val Ser Lys Asn Ser Lys Tyr Asn Ala Glu Ser
300 305 310 315
ACA GAA AGG GAG TCA CAA GAC ACT GTT GCA GAG AAT GAT GAT GGC GGG 1549
Thr Glu Arg Glu Ser Gin Asp Thr Val Ala Glu Asn Asp Asp Gly Gly
320 325 330
TTC AGT GAG GAA TGG GAA GCC CAG AGG GAC AGT CAT CTA GGG CCT CAT 1597
Phe Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gin Arg Asp Ser His Leu Gly Pro His
335 340 345
182
CGC TCT ACA CCT GAG TCA CGA GCT GCT GTC CAG GAA CTT TCC AGC AGT1645
Arg Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gin Glu Leu Ser SerSer
350 355360
ATC CTC GCT GGT GAA GAC CCA GAG GAA AGG GGA GTA AAA CTT GGA TTG1693
Ile Leu Ala Gly Glu Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu GlyLeu
365 370375
GGA GAT TTC ATT TTC TAC AGT GTT CTG GTT GGT AAA GCC TCA GCA ACA1741
Gly Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser AlaThr
380 385 390395
GCC AGT GGA GAC TGG AAC ACA ACC ATA GCC TGT TTC GTA GCC ΑΤΑ TTA1789
Ala Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala IleLeu
400 405410
ATT GGT TTG TGC CTT ACA TTA TTA CTC CTT GCC ATT TTC AAG AAA GCA1837
Ile Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys LysAla
415 420425
TTG CCA GCT CTT CCA ATC TCC ATC ACC TTT GGG CTT GTT TTC TAC TTT1885
Leu Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe TyrPhe
430 435440
GCC ACA GAT TAT CTT GTA CAG CCT TTT ATG GAC CAA TTA GCA TTC CAT1933
Ala Thr Asp Tyr Leu Val Gin Pro Phe Met Asp Gin Leu Ala PheHis
445 450455
CM TTT TAT ATC TAGCATATTT GCGGTTAGAA TCCCATGGAT GTTTCTTCTT1985
Gin Phe Tyr Ile
460
TGACTATAAC CAAATCTGGG GAGGACAAAG GTGATTTTCC TGTGTCCACA TCTAACAAAG2045
TCAAGATTCC CGGCTGGACT TTTGCAGCTT CCTTCCAAGT CTTCCTGACC ACCTTGCACT2105
ATTGGACTTT GGAAGGAGGT GCCTATAGAA AACGATTTTG AACATACTTC ATCGCAGTGG2165
ACTGTGTCCT CGGTGCAGAA ACTACCAGAT TTGAGGGACG AGGTCAAGGA GATATGATAG2225
GCCCGGAAGT TGCTGTGCCC CATCAGCAGC TTGACGCGTG GTCACAGGAC GATTTCACTG2285
ACACTGCGAA CTCTCAGGAC TACCGGTTAC CAAGAGGTTA GGTGAAGTGG TTTAAACCAA2345
ACGGAACTCT TCATCTTAAA CTACACGTTG AAAATCAACC CAATAATTCT GTATTAACTG2405
AATTCTGAAC TTTTCAGGAG GTACTGTGAG GAAGAGCAGG CACCAGCAGC AGAATGGGGA2465
ATGGAGAGGT GGGCAGGGGT TCCAGCTTCC CTTTGATTTT TTGCTGCAGA CTCATCCTTT2525
TTAAATGAGA CTTGTTTTCC CCTCTCTTTG AGTCAAGTCA AATATGTAGA TGCCTTTGGC2585
AATTCTTCTT CTCAAGCACT GACACTCATT ACCGTCTGTG ATTGCCATTT CTTCCCAAGG2645
CCAGTCTGAA CCTGAGGTTG CTTTATCCTA AAAGTTTTAA CCTCAGGTTC CAAATTCAGT2705
AAATTTTGGA AACAGTACAG CTATTTCTCA TCAATTCTCT ATCATGTTGA AGTCAAATTT2765
GGATTTTCCA CCAAATTCTG AATTTGTAGA CATACTTGTA CGCTCACTTG CCCCAGATGC2825
CTCCTCTGTC CTCATTCTTC TCTCCCACAC AAGCAGTCTT TTTCTACAGC CAGTAAGGCA2885
GCTCTGTCGT GGTAGCAGAT GGTCCCACTT ATTCTAGGGT CTTACTCTTT GTATGATGAA2945
AAGAATGTGT TATGAATCGG TGCTGTCAGC CCTGCTGTCA GACCTTCTTC CACAGCAAAT3005
GAGATGTATG CCCAAAGCGG TAGAATTAAA GAAGAGTAAA ATGGCTGTTG AAGCAAAAAA3065
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A
3086
183 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 463 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO : 4
Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gin Asn Ala Gin Met
1 5 10 15
Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Asn Asp Asn Arg Glu Arg Gin
20 25 30
Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu Pro Leu Ser Asn
35 40 45
Gly Arg Pro Gin Gly Asn Ser Arg Gin Val Val Glu Gin Asp Glu Glu
50 55 60
Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met
65 70 75 80
Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val Val Val Ala Thr Ile
85 90 95
Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gin Leu Ile Tyr Thr
100 105 110
Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gin Arg Ala Leu His Ser
115 120 125
Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile
130 135 140
Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Val Ile His Ala
145 150 155 160
Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Phe Ser Phe Ile
165 170 175
Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala Val Asp Tyr Ile
180 185 190
Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Leu Gly Val Val Gly Met Ile Ser
195 200 205
Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin Gin Ala Tyr Leu Ile Met
210 215 220
Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp
225 230 235 240
Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val Tyr Asp Leu Val Ala
245 250 255
Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala Gin
260 265 270
Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Met
275 280 285
184
Val Trp 290 Leu Val Asn Met Ala 295 Glu Gly Asp Pro Glu 300 Ala Gin Arg Arg
Val 305 Ser Lys Asn Ser Lys 310 Tyr Asn Ala Glu Ser 315 Thr Glu Arg Glu Ser 320
Gin Asp Thr Val Ala 325 Glu Asn Asp Asp Gly 330 Gly Phe Ser Glu Glu 335 Trp
Glu Ala Gin Arg Asp Ser His 340 Leu Gly Pro 345 His Arg Ser Thr 350 Pro Glu
Ser Arg Ala Ala Val Gin Glu Leu Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gly Glu
355 360 365
Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile Phe
370 375 380
Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Asp Trp
385 390 395 400
Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys Leu
405 410 415
Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu Pro
420 425 430
Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala Thr Asp Tyr Leu
435 440 445
Val Gin Pro Phe Met Asp Gin Leu Ala Phe His Gin Phe Tyr Ile
450 455 460
(2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2494 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...2494 (D) Jiné informace: /notě = lExln2 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:
• · · · · ·
185
AAGCTTTTGT GTGTAAAAAG TATTAGAATC TCATGTTTTT GAACAAGGTT GGCAGTGGGT 60
TGGGAGGAGG GATTGGAGAT TGATGCGATA GGAATGTGAA GGGATAGCTT GGGGTGGATT 120
TTATTTTTTA ATTTTAATTT TTATTTKTTG AGATGGAGTC TTGCTCTGTC TCCCAGGCTG 180
GAGTGCAGTG GTGTGATCTC AGCTCACGGG TTCAAGCGAT TCTCCTGCTG CAGCCTCCCG 240
AGTAGCTGGG ATTACAGGAG CGCGCCACCA CACCCGGNTA ATTTNNTTGT ATTTTTAGTA 300
GAGACGGGGT TTCACCATGT TGGGTTAGGC TGGTCTAGAA CTCCCAACCT CATGATCCGC 360
CTGCTTCGGC CTCCCAAAGT GCCGGAATTA CAGGCGTGAG CGACTGCACC CGGCCGCTTG 420
GGGGTGGATT TTTAAAGAAA CTTTAGAAGA ATGTAACTTG SCCAGATACC ATGTACCGTT 480
AATTTCATTT TCGGTTTT-TK GAATACCCAT GTTTGACATT TMTCCGTTCA CCTTGATTAA 540
ATAAGGTAGT ATTCATTTTT TAGTTTTAGC TTTTGGATAT ATGTGTAAGT GTGGTATGCT 600
GTCTAATGAA TTAAGACAAT TGGTNCTKTC TTTACCCMAM ANCTGGACMA AGAGCAGGCA 660
AGATGCAAAA ATCAAGTGAC CCAGCAAACC AGACACATTT TCTGCTCTCA GCTAGCTTGC 720
CACCTAGAAA GACTGGTTGT CAAAGTTGGA GTCCAAGAAT CGCGGAGGAT GTTTAAAATG 780
CAGTTTCTCA GGTTCTCNCC ACCCACCAGA AGTTTTGATT CATTGAGTGG TGGGAGAGGG 840
CAGAGATATT TGCGATTTTA ACAGCATTCT CTTGATTGTG ATGCAGCTGG TTCSCAAATA 900
GGTACCCTAA AGAAATGACA GGTGTTAAAT TTAGGATGGC CATCGCTTGT ATGCCGGGAG 960
AAGCACACGC TGGGCCCAAT TTATATAGGG GCTTTCGTCC TCAGCTCGAG CARCCTCAGA 1020
ACCCCGACAA CCYACGCCAG CKCTCTGGGC GGATTCCRTC AGKTGGGGAA GSCCAGGTGG 1080
AGCTCTGGKT TCTCCCCGCA ATCGTTTCTC CAGGCCGGAG GCCCCGCCCC CTTCCTCCTG 1140
GCTCCTCCCC TCCTCCGTGG GCCGNCCGCC AACGACGCCA GAGCCGGAAA TGACGACAAC 1200
GGTGAGGGTT CTCGGGCGGG GCCTGGGACA GGCAGCTCCG GGGTCCGCGG TTTTCACATC 1260
GGAAACAAAA CAGCGGCTGG TCTGGAAGGA ACCTGAGCTA CGACCCGCGG CGGCAGCGGG 1320
GCGGCGGGGA AGCGTATGTG CGTGATGGGG AGTCCGGGCA AGCCAGGAAG GCACCGCGGA 1380
CATGGGCGGC CGCGGGCAGG GNCCGGNCCT TTGTGGCCGC CCGGGCCGCG AAGCCGGTGT 1440
CCTAAAAGAT GAGGGGCGGG GCGCGGCCGG TTGGGGCTGG GGAACCCCGT GTGGGAAACC 1500
AGGAGGGGCG GCCCGTTTCT CGGGCTTCGG GCGCGGCCGG GTGGAGAGAG ATTCCGGGGA 1560
GCCTTGGTCC GGAAATGCTG TTTGCTCGAA GACGTCTCAG GGCGCAGGTG CCTTGGGCCG 1620
GGATTAGTAG CCGTCTGAAC TGGAGTGGAG TAGGAGAAAG AGGAAGCGTC TTGGGCTGGG 1680
186
TCTGCTTGAG CAACTGGTGA AACTCCGCGC CTCACGCCCC GGGTGTGTCC TTGTCCAGGG 1740
GCGACGAGCA TTCTGGGCGA AGTCCGCACG CCTCTTGTTC GAGGCGGAAG ACGGGGTCTT 1800
GATGCTTTCT CCTTGGTCGG GACTGTCTCG AGGCATGCAT GTCCAGTGAC TCTTGTGTTT 1860
GCTGCTGCTT CCCTCTCAGA TTCTTCTCAC CGTTGTGGTC AGCTCTGCTT TAGGCATATT 1920
AATCCATAGT GGAGGCTGGG ATGGGTGAGA GAATTGAGGT GACTTTTCCA TAATTCAGGT 1980
GAGATGTGAT TAGAGTYCGG ATCCTNCGGT GGTGGCAGAG GCTTACCAAG AAACACTAAC 2040
GGGACATGGG AACCAATTGA GGATCCAGGG AATAAAGTGT GAAGTTGACT AGGAGGTTTT 2100
CAGTTTAAGA ACATGGCAGA GACATTCTCA GAAATAAGGA AGTTAGGAAG AAAGACCTGG 2160
TTTAGAGAGG AGGGCGAGGA AGTGGTTTGG AAGTGTCACT TTGGAAGTGC CAGCAGGTGA 2220
AAATGCCCTG TGAACAGGAC TGGAGCTGAA AACAGGAATC AATTCCATAG ATTTCCAGTT 2280
GATGTTGGAG CAGTGGAGAA GTCTAANCTA AGGAAGGGGA AGAGGAGGCC AAGCCAAACA 2340
CTTAGGAACA CTTNCNACGA GGGGGTGGAA GAAGAGCAAG GAGCCAGCTG AGGAGAATGA 2400
GTGTGGTTGG AGAACCACCA CAGCNCAGGG TCGCCAGANC TGAGGAAGGG GAGGGAAGCT 2460
TATCGAGKAM SGWCRACMKC GAGTTGGCAG GGAT 2494
(2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1117 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1117 (D) Jiné informace: /notě = 1Εχ3η4
187
(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 6:
GGATCCGCCC GCCTTGGCCT CCCAAAGTGC TGGGATTACA GGCATGAGCC ACCGCTCCTG 60
GCTGAGTCTG CGATTTCTTG CCAGCTCTAC CCAGTTGTGT CATCTTAAGC AAGTCACTGA 120
ACTTCTCTGG ATTCCCTTCT CCTNNWGTAA AATAAGNATG TTATCTGNCC NNCCTGCCTT 180
C-GGCATTGTG ATAAGGATAA GATGACATTA TAGAATNTNG CAAAATTAAA AGCGCTAGAC 240
AAATGATTTT ATGAAAATAT AAAGATTAGN TTGAGTTTGG GCCAGCATAG AAAAAGGAAT 300
GTTGAGAACA TTCCNTTAAG GATTACTCAA GCYCCCCTTT TGSTGKNWAA TCAGANNGTC 360
ATNNAMNTAT CNTNTGTGGG YTGAAAATGT TTGGTTGTCT CAGGCGGTTC CTACTTATTG 420
CTAAAGAGTC CTACCTTGAG CTTATAGTAA ATTTGTCAGT TAGTTGAAAG TCGTGACAAA 480
TTAATACATT CCTGGTTTAC AAATTGGTCT TATAAGTATT TGATTGGTNT AAATGNATTT 540
ACTAGGATTT AACTAACAAT GGATGACCTG GTGAAATCCT ATTTCAGACC TAATCTGGGA 600
GCCTGCAAGT GACAACAGCC TTTGCGGTCC TTAGACAGCT TGGCCTGGAG GAGAACACAT 660
GAAAGAAAGG TTTGWNTCTG NTTAWTGTAA TCTATGRAAG TGTTTTTWAT MACAGTATAA 720
TTGTMTGMAC AAAGTTCTGT TTTTCTTTCC CTTTNCAGAA CCTCAAGAGG CTTTGTTTTC 780
TGTGAAACAG TATTTCTATA CAGTTGCTCC AATGACAGAG TTACCTGCAC CGTTGTCCTA 840
CTTCCAGAAT GCACAGATGT CTGAGGACAA CCACCTGAGC AATACTGTAC GTAGCCAGGT 900
ACAGCGTCAG TYTCTNAAAC TGCCTYYGNC AGACTGGATT CACTTATCAT CTCCCCTCAC 960
CTCTGAGAAA TGCTGAGGGG GSTAGGNAGG GCTTTCTCTA CTTNACCACA TTTNATAATT 1020
ATTTTTGGGT GACCTTCAGC TGATCGCTGG GAGGGACACA GGGCTTNTTT AACACATAGG 1080
GTGTTGGATA CAGNCCCTCC CTAATTCACA TTTCANC
1117 • · · · · · (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
188 (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1727 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1727 (D) Jiné informace: /notě = !Ex5 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 7:
GGATCCCTCC CCTTTTTAGA CCATACAAGG TAACTTCCGG ACGTTGCCAT GGCATCTGTA 60
AACTGTCATG GTGTTGGCGG GGAGTGTCTT TTAGCATGCT AATGTATTAT AATTAGCGTA 120
TAGTGAGCAG TGAGGATAAC CAGAGGTCAC TCTCCTCACC ATCTTGGTTT TGGTGGGTTT 180
TGGCCAGCTT CTTTATTGCA ACCAGTTTTA TCAGCAAGAT CTTTATGAGC TGTATCTTGT 240
GCTGACTTCC TATCTCATCC CGNAACTAAG AGTACCTAAC CTCCTGCAAA TTGMAGNCCA 300
GNAGGTCTTG GNCTTATTTN ACCCAGCCCC TATTCAARAT AGAGTNGYTC TTGGNCCAAA 360
CGCCYCTGAC ACAAGGATTT TAAAGTCTTA TTAATTAAGG TAAGATAGKT CCTTGSATAT 420
GTGGTCTGAA ATCACAGAAA GCTGAATTTG GAAAAAGGTG CTTGGASCTG CAGCCAGTAA 480
ACAAGTTTTC ATGCAGGTGT CAGTATTTAA GGTACATCTC AAAGGATAAG TACAATTGTG 540
TATGTTGGGA TGAACAGAGA GAATGGAGCA ANCCAAGACC CAGGTAAAAG AGAGGACCTG 600
AATGCCTTCA GTGAACAATG ATAGATAATC TAGACTTTTA AACTGCATAC TTCCTGTACA 660
TTGTTTTTTC TTGCTTCAGG TTTTTAGAAC TCATAGTGAC GGGTCTGTTG TTAATCCCAG 720
GTCTAACCGT TACCTTGATT CTGCTGAGAA TCTGATTTAC TGAAAATGTT TTTCTTGTGC 780
189
TTATAGAATG ACAATAGAGA ACGGCAGGAG CACAACGACA GACGGAGCCT TGGCCACCCT 340
GAGCCATTAT CTAATGGACG ACCCCAGGGT AACTCCCGGC AGGTGGTGGA GCAAGATGAG 900
GAAGAAGATG AGGAGCTGAC ATTGAAATAT GGCGCCAAGC ATGTGATCAT GCTCTTTGTC 960
CCTGTGACTC TCTGCATGGT GGTGGTCGTG GCTACCATTA AGTCAGTCAG CTTTTATACC 1020
CGGAAGGATG GGCAGCTGTA CGTATGAGTT TKGTTTTATT ATTCTCAAAS CCAGTGTGGC 1080
TTTTCTTTAC AGCATGTCAT CATCACCTTG AAGGCCTCTN CATTGAAGGG GCATGACTTA 1140
GCTGGAGAGC CCATCCTCTG TGATGGTCAG GAGCAGTTGA GAGANCGAGG GGTTATTACT 1200
TCATGTTTTA AGTGGAGAAA AGGAACACTG CAGAAGTATG TTTCCTGTAT GGTATTACTG 1260
GATAGGGCTG AAGTTATGCT GAATTGAACA CATAAATTCT TTTCCACCTC AGGGNCATTG 1320
GGCGCCCATT GNTCTTCTGC CTAGAATATT CTTTCCTTTN CTNACTTKGG NGGATTAAAT 1380
TCCTGTCATC CCCCTCCTCT TGGTGTTATA TATAAAGTNT TGGTGCCGCA AAAGAAGTAG 1440
CACTCGAATA TAAAATTTTC CTTTTAATTC TCAGCAAGGN AAGTTACTTC TATATAGAAG 1500
GGTGCACCCN TACAGATGGA ACAATGGCAA GCGCACATTT GGGACAAGGG AGGGGAAAGG 1560
GTTCTTATCC CTGACACACG TGGTCCCNGC TGNTGTGTNC TNCCCCCACT GANTAGGGTT 1620
AGACTGGACA GGCTTAAACT AATTCCAATT GGNTAATTTA AAGAGAATNA TGGGGTGAAT 1680
GCTTTGGGAG GAGTCAAGGA AGAGNAGGTA GNAGGTAACT TGAATGA
1727 • · · · · ·
190
(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1883 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1883 (D) Jiné informace: /notě = 1Ex6 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 8:
CNCGTATAAA AGACCAACAT TGCCANCNAC AACCACAGGC AAGATCTTCT CCTACCTTCC 60
CCCNNGGTGT AATACCAAGT ATTCNCCAAT TTGTGATAAA CTTTCATTGG AAAGTGACCA 120
CCCTCCTTGG TTAATACATT GTCTGTGCCT GCTTTCACAC TACAGTAGCA CAGTTGAGTG 180
TTTGCCCTGG AGACCATATG ACCCATAGAG CTTAAAATAT TCAGTCTGGC TTTTTACAGA 240
GATGTTTCTG ACTTTGTTAA TAGAAAATCA ACCCAACTGG TTTAAATAAT GCACATACTT 300
TCTCTCTCAT AGAGTAGTGC AGAGGTAGNC AGTCCAGATT AGTASGGTGG CTTCACGTTC 360
ATCCAAGGAC TCAATCTCCT TCTTTCTTCT TTAGCTTCTA ACCTCTAGCT TACTTCAGGG 420
TCCAGGCTGG AGCCCTASCC TTCATTTCTG ACAGTAGGAA GGAGTAGGGG AGAAAAGAAC 480
ATAGGACATG TCAGCAGAAT TCTCTCCTTA GAAGTTCCAT ACACAACACA TCTCCCTAGA 540
AGTCATTGCC CTTACTTGTT CTCATAGCCA TCCTAAATAT AAGGGAGTCA GAAGTAAAGT 600
CTKKNTGGCT GGGAATATTG GCACCTGGAA TAAAAATGTT TTTCTGTGAA TGAGAAACAA 660
GGGGAAGATG GATATGTGAC ATTATCTTAA GACAACTCCA GTTGCAATTA CTCTGCAGAT 720
GAGAGGCACT AATTATAAGC CATATTACCT TTCTTCTGAC AACCACTTGT CAGCCCNCGT 780
GGTTTCTGTG GCAGAATCTG GTTCYATAMC AAGTTCCTAA TAANCTGTAS CCNAAAAAAT 840
TTGATGAGGT ATTATAATTA TTTCAATATA AAGCACCCAC TAGATGGAGC CAGTGTCTGC 900
• · · · · ·
• · · · ·
191
TTCACATGTT AAGTCCTTCT TTCCATATGT TAGACATTTT CTTTGAAGCA ATTTTAGAGT 960
GTAGCTGTTT TTCTCAGGTT AAAAATTCTT AGCTAGGATT GGTGAGTTGG GGAAAAGTGA 1020
CTTATAAGAT NCGAATTGAA TTAAGAAAAA GAAAATTCTG TGTTGGAGGT GGTAATGTGG 1080
KTGGTGATCT YCATTAACAC TGANCTAGGG CTTTKGKGTT TGKTTTATTG TAGAATCTAT 114Ó
ACCCCATTCA CAGAAGATAC CGAGACTGTG GGCCAGAGAG CCCTGCACTC AATTCTGAAT 1200
GCTGCCATCA TGATCAGTGT CATTGTTGTC ATGACTATCC TCCTGGTGGT TCTGTATAAA 1260
TACAGGTGCT ATAAGGTGAG CATGAGACAC AGATCTTTGN TTTCCACCCT GTTCTTCTTA 1320
TGGTTGGGTA TTCTTGTCAC AGTAACTTAA CTGATCTAGG AAAGAAAAAA TGTTTTGTCT 1380
TCTAGAGATA AGTTAATTTT TAGTTTTCTT CCTCCTCACT GTGGAACATT CAAAAAATAC 1440
AAAAAGGAAG CCAGGTGCAT GTGTAATGCC AGGCTCAGAG GCTGAGGCAG GAGGATCGCT 1500
TGGGCCCAGG AGTTCACAAG CAGCTTGGGC AACGTAGCAA GACCCTGCCT CTATTAAAGA 1560
AAACAAAAAA CAAATATTGG AAGTATTTTA TATGCATGGA ATCTATATGT CATGAAAAAA 1620
TTAGTGTAAA ATATATATAT TATGATTAGN TATCAAGATT TAGTGATAAT TTATGTTATT 1680
TTGGGATTTC AATGCCTTTT TAGGCCATTG TCTCAAMAAA TAAAAGCAGA AAACAAAAAA 1740
AGTTGTAACT GAAAAATAAA CATTTCCATA TAATAGCACA ATCTAAGTGG GTTTTTGNTT 1800
GTTTGTTTGN TTGTTGAAGC AGGGCCTTGC CCTNYCACCC AGGNTGGAGT GAAGTGCAGT 1860
GGCACGATTT TGGCTCACTG CAG 1883
(2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 823 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...823 (D) Jiné informace: /notě = 1Ex7 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 9:
CAGGAGTGGA CTAGGTAAAT GNAAGNTGTT TTAAAGAGAG ATGNGGNCNG GGACATAGTG 60
GTACACANCT GTAATGCT.CA NCACTKATGG GGAGTACTGA AGGNGGNSGG ATCACTTGNG 120
GGTCNGGAAT NTGAGANCAG CCTGGGCAAN ATGGCGAAAC CCTGTCTCTA CTAAAAATAG 180
CCANAAWNWA GCCTAGCGTG GTGGCGCRCA CGCGTGGTTC CACCTACTCA GGAGGCNTAA 240
GCACGAGNAN TNCTTGAACC CAGGAGGCAG AGGNTGTGGT GARCTGAGAT CGTGCCACTG 300
CACTCCAGTC TGGGCGACMA AGTGAGACCC TGTCTCCNNN AAGAAAAAAA AAATCTGTAC 360
TTTTTAAGGG TTGTGGGACC TGTTAATTAT ATTGAAATGC TTCTYTTCTA GGTCATCCAT 420
GCCTGGCTTA TTATATCATC TCTATTGTTG CTGTTCTTTT TTTCATTCAT TTACTTGGGG 480
TAAGTTGTGA AATTTGGGGT CTGTCTTTCA GAATTAACTA CCTNNGTGCT GTGTAGCTAT 540
192
CATTTAAAGC CATGTACTTT GNTGATGAAT TACTCTGAAG TTTTAATTGT NTCCACATAT 600
AGGTCATACT TGGTATATAA AAGACTAGNC AGTATTACTA ATTGAGACAT TCTTCTGTNG 660
CTCCTNGCTT ATAATAAGTA GAACTGAAAG NAACTTAAGA CTACAGTTAA TTCTAAGCCT 720
TTGGGGAAGG ATTATATAGC CTTCTAGTAG GAAGTCTTGT GCNATCAGAA TGTTTNTAAA 780
GAAAGGGTNT CAAGGAATNG TATAAANACC AAAAATAATT GAT 823
(2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 945 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...945 (D) Jiné informace: /notě = 1Ex8 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 10:
·· ····
193
GTTNTCCNAA CCAACTTAGG AGNTTGGACC TGGGRAAGAC CNACNTGATC TCCGGGAGGN 60
AAAGACTNCA GTTGAGCCGT GATTGCACCC ACTTTACTCC AAGCCTGGGC AACCAAAATG 120
AGACACTGGC TCCAAACACA AAAACAAAAA CAAAAAAAGA GTAAATTAAT TTANAGGGAA 180
GNATTAAATA AATAATAGCA CAGTTGATAT AGGTTATGGT AAAATTATAA AGGTGGGANA 240
TTAATATCTA ATGTTTGGGA GCCATCACAT TATTCTAAAT AATGTTTTGG TGGAAATTAT 300
TGTACATCTT TTAAAATCTG TGTAATTTTT TTTCAGGGAA GTGTTTAAAA CCTATAACGT 360
TGCTGTGGAC TACATTACTG TTGCACTCCT GATCTGGAAT TTTGGTGTGG TGGGAATGAT 420
TTCCATTCAC TGGAAAGGTC CACTTCGACT CCAGCAGGCA TATCTCATTA TGATTAGTGC 480
CCTCATGGCC CTGGTGTTTA TCAAGTACCT CCCTGAATGG ACTGCGTGGC TCATCTTGGC 540
TGTGATTTCA GTATATGGTA AAACCCAAGA CTGATAATTT GTTTGTCACA GGAATGCCCC 600
ACTGGAGTGT TTTCTTTCCT CATCTCTTTA TCTTGATTTA GAGAAAATGG TAACGTGTAC 660
ATCCCATAAC TCTTCAGTAA ATCATTAATT AGCTATAGTA ACTTTTTCAT TTGAAGATTT 720
CGGCTGGGCA TGGTAGCTCA TGCCTGTAAT CTTAGCACTT TGGGAGGCTG AGGCGGGCAG 780
ATCACCTAAG CCCAGAGTTC AAGACCAGCC TGGGCAACAT GGCAAAACCT CGTATCTACA 840
GAAAATACAA AAATTAGCCG GGCATGGTGG TGCACACCTG TAGTTCCAGC TACTTAGGAG 900
GCTGAGGTGG GAGGATCGAT TGATCCCAGG AGGTCAAGNC TGCAG 945
(2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 540 párů basí (B) Typ: nukíeová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 11:
CTGCAGCTTT CCTTTAAACT AGGAAGACTT GTTCCTATAC CCCAGTAACG ATACACTGTA
CACTAAGCAA ATAGCAGTCA AACCCAAATG aaatttntac AGATGTTCTG TGTCATTTTA 120
TNTTGTTTAT GTTGTCTCCC CCACCCCCAC CAGTTCACCT GCCATTTATT TCATATTCAT 180
TCAACGTCTN NNTGTGTAAA AAGAGACAAA AAACATTAAA CTTTTTTCCT TCGTTAATTC 240
CTCCCTACCA CCCATTTACA AGTTTAGCCC ATACATTTTA TTAGATGTCT TTTATGTTTT 300
TCTTTTNCTA GATTTAGTGG CTGTTTTGTG TCCGAAAGGT CCACTTCGTA TGCTGGTTGA 360
AACAGCTCAG GAGAGAAATG AAACGCTTTT TCCAGCTCTC ATTTACTCCT GTAAGTATTT 420
GGAGAATGAT ATTGAATTAG TAATCAGNGT AGAATTTATC GGGAACTTGA AGANATGTNA 480
CTATGGCAAT TTCANGGNAC TTGTCTCATC TTAAATGANA GNATCCCTGG ACTCCTGNAG 540
·· ·· ····
194 • · • ·· ·· • · ·· · (2)
Informace pro SEQ ID NO: 12
Charakteristiky sekvence (A)
Délka
509 párů basí (B) (C)
Typ: nukleová kyselina
Řetězec: j ednoduchý (D)
Topologie: lineární (ix)
Vlastosti (A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1
509 (D) Jiné informace: /notě (xi)
1EX10
Popis sekvence:SEQ ID NO: 12:
CCCCGTCNAT
GCATACTTTG
TGTGTCCAGT
GCTTACCTGG
AATCCNGTCT
TTCCCAACAG
CAACAATGGT
GTGGTTGGTG
AATATGGCAG
AAGGAGACCC
GGAAGCTCAA
AGGAGAGTAT
120
CCAAAAATTC
CAAGTATAAT
GCAGAAAGTA
GGTAACTYYY
NTTAGATAMN
ATCTTGATTT
180
TNCAGGGTCA
CTGTTATAAG
CTAACAGTAT
AGNAATGTTT
TTATCGTCTT
TCTNKGGNCA
240
TAGACTCCTN
KGAGAATCTC
TTGAGAACTA
TGATAATGCC
CAGTAAATAC
NCAGATAAGT
300
ATTTAAGGAG
TNCAGATACT
CAAANCCCAA
CAATACNGTC
AAAGCATCCT
AGGTTAAGAC
360
AMCNCCCATT
AAATACAGAA
TACCAGCATG
GAAAGGTTCA
GGCTGAGGTT
ATGATTGGGT
420
CAAACATGTA AAAGTAAGAA TCTCCTAAA
509
TTGGGTTTTG
GGNNNGTTTT
TTATAAGTCA
TGATTTTAAA
AAGAAAAAAT
AAACTCTCTC
480
195 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1092 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1092 (D) Jiné informace: /notě = lExll (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 13:
GTCTAGATAA GNCAACATTC AGGGGTAGAA GGGGACTGTT TATTTTTTCC TTTAGTCTCT
196
CTTAAAGAGT GAGAAAAATT TTCCCAGGAA TCCCGGTGGA CTTTGCTTCA CCACTCATAG 120
GTTCATACCA AGTTACAACC CCACAACCTT AGAGCTTTTG TTAGGAAGAG GCTTGGTGGG 180
ATTACCGTGC TTGGCTTGGC TTGGTCAGGA TTCACCACCA GAGTCATGTG GGAGGGGGTG 240
GGAACCCAAA CAATTCAGGA TTCTGCCCTC AGGAAATAAA GGAGAAAATA GCTGTTGGAT 300
AAACTACCAG CAGGCACTGC TACAGCCCAT GCTTTGTGGT TTAAGGGCCA GCTAGTTACA 360
ATGACAGCTA GTTACTGTTT CCATGTAATT TTCTTAAAGG TATTAAATTT TTCTAAATAT 420
TAGAGCTGTA ACTTCCACTT TCTCTTGAAG GCACAGAAAG GGAGTCACAA GACACTGTTG 480
CAGAGAATGA TGATGGCGGG TTCAGTGAGG AATGGGAAGC CCAGAGGGAC AGTCATCTAG 540
GGCCTCATCG CTCTACACCT GAGTCACGAG CTGCTGTCCA GGAACTTTCC AGCAGTATCC 600
TCGCTGGTGA AGACCCAGAG GAAAGTATGT TCANTTCTCC ATNTTTCAAA GTCATGGATT 660
CCTTTAGGTA GCTACATTAT CAACCTTTTT GAGAATAAAA TGAATTGAGA GTGTTACAGT 720
CTAATTCTAT ATCACATGTA ACTTTTATTT GGATATATCA GTAATAGTGC TTTTTYNTTT 780
TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTNGGNGA NAGAGTCTCG CTCTGTCGCC AGGTTGGAGT 840
GCAATGGTGC GATCTTGGCT CACTGAAAGC TCCACCNCCC GGGTTCAAGT GATTCTCCTG 900
CCTCAGCCNC CCAAGTAGNT GGGACTACAG GGGTGCGCCA CCACGCCTGG GATAATTTTG 960
GGNTTTTTAG TAGAGATGGC GTTTCACCAN CTTGGNGCAG GCTGGTCTTG GAACTCCTGA 1020
NATCATGATC TGCCTGCCTT AGCCTCCCCA AAGTGCTGGG ATTNCAGGGG TGAGCCACTG 1080
TTCCTGGGCC TC 1092
(2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1003 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1003 ··· · (D) Jiné informace: /notě = 1Ex12
197
(xi) Popis sekvence:SEQ ID NO : 14:
CTGCAGTGAG CCGAGATCAT gctgctgtac TCCAGCCTGG GCCACAGAGC CAAACTCCAT 60
CTCCCAAAAA AAAAAAATAT TAATTAATAT GATNAAATGA TGCCTATCTC AGAATTCTTG 120
TAAGGATTTC TTAGKACAAG TGCTGGGTAT AAACTATANA TTCRATAGAT GNCGATTATT 180
ACTTAYTATT GTTATTGATA AATAACAGCA GCATCTACAG TTAAGACTCC AGAGTCAGTC 240
ACATAGAATC TGGNACTCCT ATTGTAGNAA ACCCCNMMAG AAAGAAAACA CAGCTGAAGC 300
CTAATTTTGT ATATCATTTA CTGACTTCTC TCATTCATTG TGGGGTTGAG TAGGGCAGTG 360
ATATTTTTGA ATTGTGAAAT CATANCAAAG AGTGACCAAC TTTTTAATAT TTGTAACCTT 420
TCCTTTTTAG GGGGAGTAAA ACTTGGATTG GGAGATTTCA TTTTCTACAG TGTTCTGGTT 480
GGTAAAGCCT CAGCAACAGC CAGTGGAGAC TGGAACACAA CCATAGCCTG TTTCGTAGCC 540
ATATTAATTG TMMSTATACA CTAATAAGAA TGTGTCAGAG CTCTTAATGT CMAAACTTTG 600
ATTACACAGT CCCTTTAAGG CAGTTCTGTT TTAACCCCAG GTGGGTTAAA TATTCCAGCT 660
ATCTGAGGAG CTTTTNGATA ATTGGACCTC ACCTTAGTAG TTCTCTACCC TGGCCACACA 720
TTAGAATCAC TTGGGAGCTT TTAAAACTGT AAGCTCTGCC CTGAGATATT CTTACTCAAT 780
TTAATTGTGT AGTTTTTAAA ATTCCCCAGG AAATTCTGGT ATTTCTGTTT AGGAACCGCT 840
GCCTCAAGCC TAGCAGCACA GATATGTAGG AAATTAGCTC TGTAAGGTTG GTCTTACAGG 900
GATAAACAGA TCCTTCCTTA GTCCCTGGAC TTAATCACTG AGAGTTTGGG TGGTGGTTTT 960
GGATTTAATG ACACAACCTG TAGCATGCAG TGTTACTTAA GAC 1003
(2) Informace pro SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 736 párů basí
198 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...736 (D) Jiné informace: /notě = 1Ex13 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 15:
GTCTTTCCCA TCTTCTCCAC AGGGTTTGTG CCTTACATTA TTACTCCTTG CCATTTTCAA 60
GAAAGCATTG CCAGCTCTTC CAATCTCCAT CACCTTTGGG CTTGTTTTCT ACTTTGCCAC 120
AGATTATCTT GTACAGCCTT TTATGGACCA ATTAGCATTC CATCAATTTT ATATCTAGCA 180
TATTTGCGGT TAGAATCCCA TGGATGTTTC TTCTTTGACT ATAACAAAAT CTGGGGAGGA 240
CAAAGGTGAT TTCCTGTGTC CACATCTAAC AAATCAAGAT CCCCGGCTGG ACTTTTGGAG 300
GTTCCTTCCA AGTCTTCCTG ACCACCTTGC ACTATTGGAC TTTGGAAGGA GGTGCCTATA 360
GAAAACGATT TTGAACATAC TTCATCGCAG TGGACTGTGT CCTCGGTGCA GAAACTACCA 420
GATTTGAGGG ACGAGGTCAA GGAGATATGA TAGGCCCGGA AGTTGCTGTG CCCCATCAGC 480
AGCTTGACGC GTGGTCACAG GACGATTTTC ACTGACACTG CGAACTCTCA GGACTACCGT 540
TACCAAGAGG TTAGGTGAAG TGGTTTAAAC CAAACGGAAC TCTTCATCTT AAACTACACG 600
TTGAAAATCA ACCCAATAAT TCTGTATTAA CTGAATTCTG AACTTTTCAG GAGGTACTGT 660
GAGGAAGAGC AGGCACCACC AGCAGAATGG GGAATGGAGA GGTGGGCAGG GGTTCCAGCT 720
TCCCTTTGAT TTTTTG 736
(2) Informace pro SEQ ID NO: 16 • · ·
199 (i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1964 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 188...1588 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1964 (D) Jiné informace: /notě = mPSl (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 16:
ACCANACANC GGCAGCTGAG GCGGAAACCT AGGCTGCGAG CCGGCCGCCC
GGGCGCGGAG
AGAGAAGGAA CCAACACAAG ACAGCAGCCC TTCGAGGTCT TTAGGCAGCT
TGGAGGAGAA
120
CACATGAGAG AAAGAATCCC AAGAGGTTTT GTTTTCTTTG
AGAAGGTATT
TCTGTCCAGC
180
TGCTCCA ATG ACA Thr GAG Glu ATA Ile CCT GCA CCT Pro TTG Leu TCC TAC TTC CAG Gin AAT Asn GCC Ala 229
Met 1 Pro 5 Ala Ser Tyr 10 Phe
CAG ATG TCT GAG GAC AGC CAC TCC AGC AGC GCC ATC CGG AGC CAG AAT 277
Gin Met Ser Glu Asp Ser His Ser Ser Ser Ala Ile Arg Ser Gin Asn
15 20 25 30
GAC AGC CAA GAA CGG CAG CAG CAG CAT GAC AGG CAG AGA CTT GAC AAC 325
Asp Ser Gin Glu Arg Gin Gin Gin His Asp Arg Gin Arg Leu Asp Asn
35 40 45
CCT GAG CCA ATA TCT AAT GGG CGG ccc CAG AGT AAC TCA AGA CAG GTG 373
Pro Glu Pro Ile Ser Asn Gly Arg Pro Gin Ser Asn Ser Arg Gin Val
50 55 60
GTG GAA CAA GAT GAG GAG GAA GAC GAA GAG CTG ACA TTG AAA TAT GGA 421
Val Glu Gin Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly
65 70 75
GCC AAG CAT GTC ATC ATG CTC TTT GTC CCC GTG ACC CTC TGC ATG GTC 469
Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val
80 85 90
GTC GTC GTG GCC ACC ATC AAA TCA GTC AGC TTC TAT ACC CGG AAG GAC 517
Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp
95 100 105 110
GGT CAG CTA ATC TAC ACC CCA TTC ACA GAA GAC ACT GAG ACT GTA GGC 565
Gly Gin Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly
115 120 125
• · · ·
200 • · · • · • · · · · · « ·
CAA AGA GCC CTG CAC TCG ATC CTG AAT GCG GCC ATC ATG ATC AGT GTC 613
Gin Arg Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val
130 135 140
ATT GTC ATT ATG ACC ATC CTC CTG GTG GTC CTG TAT AAA TAC AGG TGC 661
Ile Val Ile Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys
145 150 155
TAC AAG GTC ATC CAC GCC TGG CTT ATT ATT TCA TCT CTG TTG TTG CTG 709
Tyr Lys Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu
160 165 170
TTC TTT TTT TCG TTC ATT TAC TTA GGG GAA GTA TTT AAG ACC TAC AAT 757
Phe Phe Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn
175 180 185 190
GTC GCC GTG GAC TAC GTT ACA GTA GCA CTC CTA ATC TGG AAT TTT GGT 805
Val Ala Val Asp Tyr Val Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly
195 200 205
GTG GTC GGG ATG ATT GCC ATC CAC TGG AAA GGC CCC CTT CGA CTG CAG 853
Val Val Gly Met Ile Ala Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin
210 215 220
CAG GCG TAT CTC ATT ATG ATC AGT GCC CTC ATG GCC CTG GTA TTT ATC 901
Gin Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile
225 230 235
AAG Lys TAC Tyr 240 CTC Leu CCC Pro GAA Glu TGG ACC GCA TGG CTC Leu ATC Ile TTG Leu 250 GCT Ala GTG Val ATT Ile TCA Ser 949
Trp Thr 245 Ala Trp
GTA TAT GAT TTG GTG GCT GTT TTA TGT CCC AAA GGC CCA CTT CGT ATG 997
Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met
255 260 265 270
CTG GTT GAA ACA GCT CAG GAA AGA AAT GAG ACT CTC TTT CCA GCT CTT 1045
Leu Val Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu
275 280 285
ATC TAT TCC TCA ACA ATG GTG TGG TTG GTG AAT ATG GCT GAA GGA GAC 1093
Ile Tyr Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp
290 295 300
CCA GAA GCC CAA AGG AGG GTA CCC AAG AAC CCC AAG TAT AAC ACA CAA 1141
Pro Glu Ala Gin Arg Arg Val Pro Lys Asn Pro Lys Tyr Asn Thr Gin
305 310 315
AGA GCG GAG AGA GAG ACA CAG GAC AGT GGT TCT GGG AAC GAT GAT GGT 1189
Arg Ala Glu Arg Glu Thr Gin Asp Ser Gly Ser Gly Asn Asp Asp Gly
320 325 330
GGC TTC AGT GAG GAG TGG GAG GCC CAA AGA GAC AGT CAC CTG GGG CCT 1237
Gly Phe Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gin Arg Asp Ser His Leu Gly Pro
335 340 345 350
CAT CGC TCC ACT CCC GAG TCA AGA GCT GCT GTC CAG GAA CTT TCT GGG 1285
His Arg Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gin Glu Leu Ser Gly
355 360 365
• · · ·
201
AGC ATT CTA ACG AGT GAA GAC Asp CCG GAG GAA AGA GGA GTA AAA CTT GGA 1333
Ser Ile Leu Thr 370 Ser Glu Pro Glu 375 Glu Arg Gly Val Lys 380 Leu Gly
CTG GGA GAT TTC ATT TTC TAC AGT GTT CTG GTT GGT AAG GCC TCA GCA 1381
Leu Gly Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala
385 390 395
ACC GCC AGT GGA GAC TGG AAC ACA ACC ATA GCC TGC TTT GTA GCC ATA 1429
Thr Ala Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile
400 405 410
CTG ATC GGC CTG TGC CTT ACA TTA CTC CTG CTC GCC ATT TTC AAG AAA 1477
Leu Ile Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys
415 420 425 430
GCG TTG CCA GCC CTC CCC ATC TCC ATC ACC TTC GGG CTC GTG TTC TAC 1525
Ala Leu Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr
435 440 445
TTC GCC ACG GAT TAC CTT GTG CAG CCC TTC ATG GAC CAA CTT GCA TTC 1573
Phe Ala Thr Asp Tyr Leu Val Gin Pro Phe Met Asp Gin Leu Ala Phe
450 455 460
CAT CAG TTT TAT ATC TAGCCTTTCT GCAGTTAGAA CATGGATGTT TCTTCTTTGA 1628
His Gin Phe Tyr Ile
465
TTATCAAAAA CACAAAAACA GAGAGCAAGC CCGAGGAGGA GACTGGTGAC TTTCCTGTGT 1688
CCTCAGCTAA CAAAGGCAGG ACTCCAGCTG GACTTCTGCA GCTTCCTTCC GAGTCTCCCT 1748
AGCCACCCGC ACTACTGGAC TGTGGAAGGA AGCGTCTACA GAGGAACGGT TTCCAACATC 1808
CATCGCTGCA GCAGACGGTG TCCCTCAGTG ACTTGAGAGA CAAGGACAAG GAAATGTGCT 1868
GGGCCAAGGA GCTGCCGTGC TCTGCTAGCT TTGACCGTGG GCATGGAGAT TTACCCGCAC 1928
TGTGAACTCT CTAAGGTAAA CAAAGTGAGG TGAACC 1964
(2) Informace pro SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 467 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 17:
··· ·
202
Met 1 Thr Glu Ile Pro Ala 5 Pro Leu Ser Tyr Phe 10 Gin Asn Ala Gin 15 Met
Ser Glu Asp Ser His Ser Ser Ser Ala Ile Arg Ser Gin Asn Asp Ser
20 25 30
Gin Glu Arg Gin Gin Gin His Asp Arg Gin Arg Leu Asp Asn Pro Glu
35 40 45
Pro Ile Ser Asn Gly Arg Pro Gin Ser Asn Ser Arg Gin Val Val Glu
50 55 60
Gin Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys
65 70 75 80
His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val Val
85 90 95
Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gin
100 105 110
Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr Glu Thr Val Gly Gin Arg
115 120 125
Ala Leu His Ser Ile Leu Asn Ala Ala Ile Met Ile Ser Val Ile Val
130 135 140
Ile Met Thr Ile Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys
145 150 155 160
Val Ile His Ala Trp Leu Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe
165 170 175
Phe Ser Phe Ile Tyr Leu Gly Glu Val Phe Lys Thr Tyr Asn Val Ala
180 185 190
Val Asp Tyr Val Thr Val Ala Leu Leu Ile Trp Asn Phe Gly Val Val
195 200 205
Gly Met Ile Ala Ile His Trp Lys Gly Pro Leu Arg Leu Gin Gin Ala
210 215 220
Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr
225 230 235 240
Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Val Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val
260 265 270
Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Thr Leu Phe Pro Ala Leu Ile Tyr
275 280 285
Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro Glu
290 295 300
Ala Gin Arg Arg Val Pro Lys Asn Pro Lys Tyr Asn Thr Gin Arg Ala
305 310 315 320
Glu Arg Glu Thr Gin Asp Ser Gly Ser Gly Asn Asp Asp Gly Gly Phe
325 330 335
• · · ·
203 V • ·· · • • · • • · •
Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gin Arg Asp Ser His Leu Gly Pro His Arg
340 345 350
Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gin Glu Leu Ser Gly Ser Ile
355 360 365
Leu Thr Ser Glu Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly
370 375 380
Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala
385 390 395 400
Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile
405 410 415
Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu
420 425 430
Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala
435 440 445
Thr Asp Tyr Leu Val Gin Pro Phe Met Asp Gin Leu Ala Phe His Gin
450 455 460
Phe Tyr Ile
465 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2229 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 366...1712 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...2226 (D) Jiné informace: /notě = hPS2 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 18:
204
GAATTCGGCA CGAGGGCATT TCCAGCAGTG AGGAGACAGC CAGAAGCAAG CTTTTGGAGC 60
TGAAGGAACC TGAGACAGAA GCTAGTCCCC CCTCTGAATT TTACTGATGA AGAAACTGAG 120
GCCACAGAGC TAAAGTGACT TTTCCCAAGG TCGCCCAGCG AGGACGTGGG ACTTCTCAGA 180
CGTCAGGAGA GTGATGTGAG GGAGCTGTGT GACCATAGAA AGTGACGTGT TAAAAACCAG 240
CGCTGCCCTC TTTGAAAGCC AGGGAGCATC ATTCATTTAG CCTGCTGAGA AGAAGAAACC 300
AAGTGTCCGG GATTCAAGAC CTCTCTGCGG CCCCAAGTGT TCGTGGTGCT TCCAGAGGCA 360
GGGCT ATG CTC ACA TTC ATG GCC TCT GAC AGC GAG GAA GAA GTG TGT 407
Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys
GAT GAG Asp Glu 15 CGG ACG TCC Ser CTA ATG TCG Ser GCC GAG AGC CCC ACG CCG CGC Arg TCC Ser 30 455
Arg Thr Leu 20 Met Ala Glu Ser 25 Pro Thr Pro
TGC CAG GAG GGC AGG CAG GGC CCA GAG GAT GGA GAG AAT ACT GCC CAG 503
Cys Gin Glu Gly Arg Gin Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gin
35 40 45
TGG AGA AGC CAG GAG AAC GAG GAG Glu GAC GGT GAG GAG GAC CCT GAC CGC Arg 551
Trp Arg Ser Gin Glu Asn Glu Asp Gly 55 Glu Glu Asp Pro 60 Asp
50
TAT GTC TGT AGT GGG GTT CCC GGG CGG CCG CCA GGC CTG GAG GAA GAG 599
Tyr Val Cys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu
65 70 75
CTG ACC CTC AAA TAC GGA GCG AAG CAT GTG ATC ATG CTG TTT GTG CCT 647
Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro
80 85 90
GTC ACT CTG TGC ATG ATC GTG GTG GTA GCC ACC ATC AAG TCT GTG CGC 695
Val Thr Leu Cys Met Ile Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Arg
95 100 105 110
TTC TAC ACA GAG AAG AAT GGA CAG CTC ATC TAC ACG CCA TTC ACT GAG 743
Phe Tyr Thr Glu Lys Asn Gly Gin Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu
115 120 125
GAC ACA CCC TCG GTG GGC CAG CGC CTC CTC AAC TCC GTG CTG AAC ACC 791
Asp Thr Pro Ser Val Gly Gin Arg Leu Leu Asn Ser Val Leu Asn Thr
140
135
130
839
GTG
ACC
TTC
TTG
GTG
GTG
GTT
ATG
ATC
ATC
GTC
ATG
ATC
AGC
ATC
CTC
Leu Ile Met 145 Ile Ser Val Ile Val 150 Val Met Thr Ile Phe 155 Leu Val Val
CTC TAC AAG TAC CGC TGC TAC AAG TTC ATC CAT GGC TGG TTG ATC ATG
Leu Tyr Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Phe Ile His Gly Trp Leu Ile Met
160 165 170 ’·
TCT TCA CTG ATG CTG CTG TTC CTC TTC ACC TAT ATC TAC CTT GGG GAA
Ser Ser Leu Met Leu Leu Phe Leu Phe Thr Tyr Ile Tyr Leu Gly Glu
175 180 185 190
GTG CTC AAG ACC TAC AAT GTG GCC ATG GAC TAC CCC ACC CTC TTG CTG
Val Leu Lys Thr Tyr Asn Val Ala Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu
195 200 205
ACT GTC TGG AAC TTC GGG GCA GTG GGC ATG GTG TGC ATC CAC TGG AAG
Thr Val Trp Asn Phe Gly Ala Val Gly Met Val Cys Ile His Trp Lys
210 215 220
GGC CCT CTG GTG CTG CAG CAG GCC TAC CTC ATC ATG ATC AGT GCG CTC
Gly Pro Leu Val Leu Gin Gin Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu
225 230 235
887
935
983
1031
1079 • · • ·
205 • · • • • ·· · • · • · ·· · • • · • • • • · · • · • · • · « · · · · • · • · • · · · • • ·
ATG GCC CTA GTG TTC ATC AAG TAC CTC CCA GAG TGG TCC GCG TGG GTC 1127
Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Ser Ala Trp Val
240 245 250
ATC CTG GGC GCC ATC TCT GTG TAT GAT CTC GTG GCT GTG CTG TGT CCC 1175
Ile Leu Gly Ala Ile Ser Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro
255 260 265 270
AAA GGG CCT CTG AGA ATG CTG GTA GAA ACT GCC CAG GAG AGA AAT GAG 1223
Lys Gly Pro Leu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu
275 280 285
CCC ATA TTC CCT GCC CTG ATA TAC TCA TCT GCC ATG GTG TGG ACG GTT 1271
Pro Ile Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Ala Met Val Trp Thr Val
290 295 300
GGC ATG GCG AAG CTG GAC CCC TCC TCT CAG GGT GCC CTC CAG CTC CCC 1319
Gly Met Ala Lys Leu Asp Pro Ser Ser Gin Gly Ala Leu Gin Leu Pro
305 310 315
TAC GAC CCG GAG ATG GAA GAA GAC TCC TAT GAC AGT TTT GGG GAG CCT 1367
Tyr Asp Pro Glu Met Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Ser Phe Gly Glu Pro
320 325 330
TCA TAC CCC GAA GTC TTT GAG CCT CCC TTG ACT GGC TAC CCA GGG GAG 1415
Ser Tyr Pro Glu Val Phe Glu Pro Pro Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Glu
335 340 345 350
GAG CTG GAG GAA GAG GAG GAA AGG GGC GTG AAG CTT GGC CTC GGG GAC 1463
Glu Leu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp
355 360 365
TTC ATC TTC TAC AGT GTG CTG GTG GGC AAG GCG GCT GCC ACG GGC AGC 1511
Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gly Ser
370 375 380
GGG GAC TGG AAT ACC ACG CTG GCC TGC TTC GTG GCC ATC CTC ATT GGC 1559
Gly Asp Trp Asn Thr Thr Leu Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly
385 390 395
TTG TGT CTG ACC CTC CTG CTG CTT GCT GTG TTC AAG AAG GCG CTG CCC 1607
Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Phe Lys Lys Ala Leu Pro
400 405 410
GCC CTC CCC ATC TCC ATC ACG TTC GGG CTC ATC TTT TAC TTC TCC ACG 1655
Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Phe Ser Thr
415 420 425 430
GAC AAC CTG GTG CGG CCG TTC ATG GAC ACC CTG GCC TCC CAT CAG CTC 1703
Asp Asn Leu Val Arg Pro Phe Met Asp Thr Leu Ala Ser His Gin Leu
435 440 445
1752
GGGACATGGT GTGCCACAGG CTGCAAGCTG CAGGGAATTT
TGA ★
TAC
Tyr
ATC Ile v
TCATTGGATG CAGTTGTATA GTTTTACACT CTAGTGCCAT ATATTTTTAA GACTTTTCTT 1812
TCCTTAAAAA ATAAAGTACG TGTTTACTTG GTGAGGAGGA GGCAGAACCA GCTCTTTGGT 1872
GCCAGCTGTT TCATCACCAG ACTTTGGCTC CCGCTTTGGG GAGCGCCTCG CTTCACGGAC 1932
AGGAAGCACA GCAGGTTTAT CCAGATGAAC TGAGAAGGTC AGATTAGGGT GGGGAGAAGA 1992
GCATCCGGCA TGAGGGCTGA GATGCCCAAA GAGTGTGCTC GGGAGTGGCC CCTGGCACCT 2052
GGGTGCTCTG GCTGGAGAGG AAAAGCCAGT TCCCTACGAG GAGTGTTCCC AATGCTTTGT 2112
CCATGATGTC CTTGTTATTT TATTNCCYTT ANAAACTGAN TCCTNTTNTT NTTDCGGCAG 2172
TCACMCTNCT GGGRAGTGGC TTAATAGTAA NATCAATAAA NAGNTGAGTC CTNTTAG
2229 ·· ····
206
(2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 449 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
Popis sekvence:SEQ ID NO: 19 ♦
Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gin
20 25 30
Glu Gly Arg Gin Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gin Trp Arg
35 40 45
Ser Gin Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val
50 55 60
Cys 65 Ser Gly Val Pro Gly 70 Arg Pro Pro Gly Leu Glu 75 Glu Glu Leu Thr 80
Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr
85 90 95
Leu Cys Met Ile Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Arg Phe Tyr
100 105 110
Thr Glu Lys Asn Gly Gin Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr
115 120 125
Pro Ser Val Gly Gin Arg Leu Leu Asn Ser Val Leu Asn Thr Leu Ile
130 135 140
Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile Phe Leu Val Val Leu Tyr
145 150 155 160
Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Phe Ile His Gly Trp Leu Ile Met Ser Ser
165 170 175
Leu Met Leu Leu Phe Leu Phe Thr Tyr Ile Tyr Leu Gly Glu Val Leu
180 185 190
Lys Thr Tyr Asn Val Ala Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Thr Val
195 200 205
207
Trp Asn 210 Phe Gly Ala Val Gly 215 Met Val Cys Ile His 220 Trp Lys Gly Pro
Leu Val Leu Gin Gin Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu 'Met Ala
225 230 235 240
Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Ser Ala Trp Val Ile Leu
245 250 255
Gly Ala Ile Ser Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly
260 265 270
Pro Leu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Pro Ile
275 280 285
Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Ala Met Val Trp Thr Val Gly Met
290 295 300
Ala Lys Leu Asp Pro Ser Ser Gin Gly Ala Leu Gin Leu Pro Tyr Asp
305 310 315 320
Pro Glu Met Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Ser Phe Gly Glu Pro Ser Tyr
325 330 335
Pro Glu Val Phe Glu Pro Pro Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Glu Glu Leu
340 345 350
Glu Glu Glu Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile
355 360 365
Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gly Ser Gly Asp
370 375 380
Trp Asn Thr Thr Leu Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys
385 390 395 400
Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu
405 410 415
Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Phe Ser Thr Asp Asn
420 425 430
Leu Val Arg Pro Phe Met Asp Thr Leu Ala Ser His Gin Leu Tyr Ile
435 440 445
(2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 1895 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární • ·
208 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 140...1762 (ix) Vlastosti:
(A) Jméno/klíč: misc_feature (B) Umístění: 1...1895 (D) Jiné informace: /notě = DmPS (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 20:
TATATGAGTC GCTTTAAAAC AAAAGAAAGT TTTTACCAGC TACATTCCTT TGGTTTCCTT60
AACTAAATCC CATCACACAA CTACGGCTTC GCAGGGGGAG GCGTCCAGCG CTACGGAGGC120
GAACGAACGC ACACCACTG ATG GCT GCT GTC AAT CTC CAG GCT TCG TGC TCC172
Met Ala Ala Val Asn Leu Gin Ala Ser Cys Ser
1510
TCC Ser GGG Gly CTC GCC TCT GAG GAT GAC GCC AAT GTG GGC AGC CAG Gin 25 ATA Ile GGC Gly 220
Leu Ala 15 Ser Glu Asp Asp Ala 20 Asn Val Gly Ser
GCG GCG GAG CGT TTG GAA CGA CCT CCA AGG CGG CAA CAG CAG CGG AAC 268
Ala Ala Glu Arg Leu Glu Arg Pro Pro Arg Arg Gin Gin Gin Arg Asn
30 35 40
AAC TAC GGC TCC AGC AAT CAG GAT CAA CCG GAT GCT GCC ATA CTT GCT 316
Asn Tyr Gly Ser Ser Asn Gin Asp Gin Pro Asp Ala Ala Ile Leu Ala
45 50 55
GTG CCC AAT GTG GTG ATG CGT GAA CCT TGT GGC TCG CGC CCT TCA AGA 364
Val Pro Asn Val Val Met Arg Glu Pro Cys Gly Ser Arg Pro Ser Arg
60 65 70 75
CTG ACC GGT GGA GGA GGC GGC AGT GGT GGT CCG CCC ACA AAT GAA ATG 412
Leu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Pro Thr Asn Glu Met
80 85 90
GAG GAA GAG CAG GGC CTG AAA TAC GGG GCC CAG CAT GTG ATC AAG TTA 460
Glu Glu Glu Gin Gly Leu Lys Tyr Gly Ala Gin His Val Ile Lys Leu
95 100 105
TTC GTC CCC GTC TCC CTT TGC ATG CTG C-TA GTG GTG GCT ACC ATC AAC 508
Phe Val Pro Val Ser Leu Cys Met Leu Val Val Val Ala Thr Ile Asn
110 115 120
TCC ATC AGC TTC TAC AAC AGC ACG GAT GTC TAT CTC CTC TAC ACA CCT 556
Ser Ile Ser Phe Tyr Asn Ser Thr Asp Val Tyr Leu Leu Tyr Thr Pro
125 130 135
TTC CAT GAA CAA TCG CCC GAG CCT AGT GTT AAG TTC TGG AGT GCC TTG 604
Phe His Glu Gin Ser Pro Glu Pro Ser Val Lys Phe Trp Ser Ala Leu
140 145 150 155
GCG AAC TCC CTG ATC CTG ATG AGC GTG GTG GTG GTG ATG ACC TTT TTG 652
Ala Asn Ser Leu Ile Leu Met Ser Val Val Val Val Met Thr Phe Leu
160 165 170
CTG ATT GTT TTG TAC AAG AAG CGT TGC TAT CGC ATC ATT CAC GGC TGG 700
Leu Ile Val Leu Tyr Lys Lys Arg Cys Tyr Arg Ile Ile His Gly Trp
175 180 185
• ·
209
CTG Leu ATT Ile CTC Leu 190 TCC Ser TCC Ser TTC Phe ATG Met TTG Leu 195 TTG Leu TTC Phe ATT Ile TTT ACG TAC Tyr TTA Leu TAT Tyr 748
Phe Thr 200
TTG GAA GAG CTT CTT CGC GCC TAT AAC ATA CCG ATG GAC TAC CCT ACT 796
Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Tyr Asn Ile Pro Met Asp Tyr Pro Thr
205 210 215
GCA CTA CTG ATT ATG TGG AAC TTT GGA GTG GTC GGA ATG ATG TCC ATC 844
Ala Leu Leu Ile Met Trp Asn Phe Gly Val Val Gly Met Met Ser Ile
220 225 230 235
CAT TGG CAG GGA CCT CTG CGG TTG CAG CAA GGA TAT CTC ATT TTC GTG 892
His Trp Gin Gly Pro Leu Arg Leu Gin Gin Gly Tyr Leu Ile Phe Val
240 245 250
GCA GCC TTG ATG GCC TTG GTG TTC ATT AAA TAC CTG CCT GAA TGG ACT 940
Ala Ala Leu Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Thr
255 260 265
GCC TGG GCT GTA TTG GCT GCC ATT TCT ATT TGG GAT CTT ATT GCT GTC 988
Ala Trp Ala Val Leu Ala Ala Ile Ser Ile Trp Asp Leu Ile Ala Val
270 275 280
CTT TCG CCA AGA GGA CCC CTC CGC ATT CTG GTG GAA ACG GCT CAG GAG 1036
Leu Ser Pro Arg Gly Pro Leu Arg Ile Leu Val Glu Thr Ala Gin Glu
285 290 295
CGA AAT GAG CAA ATC TTC CCC GCT CTG ATT TAT TCA TCC ACT GTC GTT 1084
Arg Asn Glu Gin Ile Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Val Val
300 305 310 315
TAC GCA CTT GTA AAC ACT GTT ACG CCG CAG CAA TCG CAG GCC ACA GCT 1132
Tyr Ala Leu Val Asn Thr Val Thr Pro Gin Gin Ser Gin Ala Thr Ala
320 325 330
TCC TCC TCG CCG TCG TCC AGC AAC TCC ACC ACA ACC ACG AGG GCC ACG 1180
Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Asn Ser Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr
335 340 345
CAG AAC TCG CTG GCT TCG CCA GAG GCA GCA GCG GCT AGT GGC CAA CGC 1228
Gin Asn Ser Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gin Arg
350 355 360
ACA GGT AAC TCC CAT CCT CGA CAG AAT CAG CGG GAT GAC GGC AGT GTA 1276
Thr Gly Asn Ser His Pro Arg Gin Asn Gin Arg Asp Asp Gly Ser Val
365 370 375
CTG GCA ACT GAA GGT ATG CCA CTT GTG ACT TTT AAA AGC AAT TTG CGC 1324
Leu Ala Thr Glu Gly Met Pro Leu Val Thr Phe Lys Ser Asn Leu Arg
380 385 390 395
GGA AAC GCT GAG GCT GCG GGT TTC ACG CAA GAG TGG TCA GCT AAC TTG 1372
Gly Asn Ala Glu Ala Ala Gly Phe Thr Gin Glu Trp Ser Ala Asn Leu
400 405 410
AGC GAA CGT GTG GCT CGT CGC CAG ATT GAA GTT CAA AGT ACT CAG AGT 1420
Ser Glu Arg Val Ala Arg Arg Gin Ile Glu Val Gin Ser Thr Gin Ser
415 420 425
GGA AAC GCT CAG CGC TCC AAC GAG TAT AGG ACA GTA ACA GCT CCG GAT 1463
Gly Asn Ala Gin Arg Ser Asn Glu Tyr Arg Thr Val Thr Ala Pro Asp
430 435 440
CAG AAT CAT CCG GAT GGG CAA GAA GAA CGT GGC ATA AAG CTT GGC CTC 1516
Gin Asn His Pro Asp Gly Gin Glu Glu Arg Gly Ile Lys Leu Gly Leu
445 450 455
GGC GAC TTC ATC TTC TAC TCG GTA TTA GTG GGC AAG GCC TCC AGC TAC 1564
Gly Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ser Tyr
460 465 470 475
210
GGC GAC TGG ACG ACC ACA Thr ATC GCT TGC Cys TTT Phe 485 GTG Val GCC Ala ATC Ile CTC Leu ATT Ile 490 GGA Gly 1612
Gly Asp Trp Thr Thr 480 Ile Ala
CTC TGC CTC ACT CTT CTG CTT CTG GCC ATT TGG CGC AAG GCG CTA CCC 1660
Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Trp Arg Lys Ala Leu Pro
495 500 505
GCC CTG CCC ATC TCA ATA ACG TTC GGA TTG ATA TTT TGC TTC GCC ACT 1708
Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Ile Phe Cys Phe Ala Thr
510 515 520
AGT GCG GTG GTC AAG CCG TTC ATG GAG GAT CTA TCG GCC AAG CAG GTG 1756
Ser Ala Val Val Lys Pro Phe Met Glu Asp Leu Ser Ala Lys Gin Val
525 530 535
ΤΤΤ ΑΤΑ TAAACTTGAA AAGACAAGGA CACATCAAGT GTCTTACAGT ATCATAGTCT 1812
Phe Ile
540
AACAAAGCTT TTTGTAATCC AATTCTTTAT TTAACCAAAT GCATAGTAAC AACCTCGACT 1872
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA
1895 (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 541 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 21:
Met 1 Ala Ala Val Asn 5 Leu Gin Ala Ser Cys 10 Ser Ser Gly Leu Ala 15 Ser
Glu Asp Asp Ala 20 Asn Val Gly Ser Gin 25 Ile Gly Ala Ala Glu 30 Arg Leu
Glu Arg Pro 35 Pro Arg Arg Gin Gin 40 Gin Arg Asn Asn Tyr 45 Gly Ser Ser
Asn Gin 50 Asp Gin Pro Asp Ala 55 Ala Ile Leu Ala Val 60 Pro Asn Val Val
Met 65 Arg Glu Pro Cys Gly 70 Ser Arg Pro Ser Arg 75 Leu Thr Gly Gly Gly 80
·· ····
211
Gly Gly Ser Gly Gly 85 Pro Pro Thr Asn Glu Met 90 Glu Glu Glu Gin 95 Gly
Leu Lys Tyr Gly Ala Gin His Val Ile Lys Leu Phe Val Pro Val Ser
100 105 110
Leu Cys Met Leu Val Val Val Ala Thr Ile Asn Ser Ile Ser Phe Tyr
115 120 125
Asn Ser Thr Asp Val Tyr Leu Leu Tyr Thr Pro Phe His Glu Gin Ser
130 135 140
Pro Glu Pro Ser Val Lys Phe Trp Ser Ala Leu Ala Asn Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Met Ser Val Val Val Val Met Thr Phe Leu Leu Ile Val Leu Tyr
165 170 175
Lys Lys Arg Cys Tyr Arg Ile Ile His Gly Trp Leu Ile Leu Ser Ser
180 185 190
Phe Met Leu 195 Leu Phe Ile Phe Thr Tyr 200 Leu Tyr Leu Glu 205 Glu Leu Leu
Arg Ala Tyr Asn Ile Pro Met Asp Tyr Pro Thr Ala Leu Leu Ile Met
210 215 220
Trp Asn Phe Gly Val Val Gly Met Met Ser Ile His Trp Gin Gly Pro
225 230 235 240
Leu Arg Leu Gin Gin Gly Tyr Leu Ile Phe Val Ala Ala Leu Met Ala
245 250 255
Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Thr Ala Trp Ala Val Leu
260 265 270
Ala Ala Ile Ser Ile Trp Asp Leu Ile Ala Val Leu Ser Pro Arg Gly
275 280 285
Pro Leu Arg Ile Leu Val Glu Thr Ala Gin Glu Arg Asn Glu Gin Ile
290 295 300
Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Thr Val Val Tyr Ala Leu Val Asn
305 310 315 320
Thr Val Thr Pro Gin Gin Ser Gin Ala Thr Ala Ser Ser Ser Pro Ser
325 330 335
Ser Ser Asn Ser Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Gin Asn Ser Leu Ala
340 345 350
Ser Pro Glu Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gin Arg Thr Gly Asn Ser His
355 360 365
Pro Arg Gin Asn Gin Arg Asp Asp Gly Ser Val Leu Ala Thr Glu Gly
370 375 380
Met Pro Leu Val Thr Phe Lys Ser Asn Leu Arg Gly Asn Ala Glu Ala
385 390 395 400
Ala Gly Phe Thr Gin Glu Trp Ser Ala Asn Leu Ser Glu Arg Val Ala
405 410 415
Arg Arg Gin Ile Glu Val Gin Ser Thr Gin Ser Gly Asn Ala Gin Arg
420 425 430
212
Ser Asn Glu 435 Tyr Arg Thr Val Thr 440 Ala Pro Asp Gin Asn 445 His Pro Asp
Gly Gin 450 Glu Glu Arg Gly Ile 455 Lys Leu Gly Leu Gly 460 Asp Phe Ile Phe
Tyr 465 Ser Val Leu Val Gly 470 Lys Ala Ser Ser Tyr 475 Gly Asp Trp Thr Thr 480
Thr Ile Ala Cys Phe 485 Val Ala Ile Leu Ile 490 Gly Leu Cys Leu Thr 495 Leu
Leu Leu Leu Ala 500 Ile Trp Arg Lys Ala 505 Leu Pro Ala Leu Pro 510 Ile Ser
Ile Thr Phe 515 Gly Leu Ile Phe Cys 520 Phe Ala Thr Ser Ala 525 Val Val Lys
Pro Phe 530 Met Glu Asp Leu Ser 535 Ala Lys Gin Val Phe 540 Ile
(2) Informace pro SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 22:
CTNCCNGART GGACNGYCTG G (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární
213 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 23:
RCANGCDANT GTNGTRTTCC A (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 24:
TTTTTTCTCG AGACNCNCA RGARAGAAAY GA (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 29 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 25:
TTTTTTGGAT CCTARAADAT RAARTCNCC

Claims (111)

  1. (1) aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 19; a (2) aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 19, kde jsou zbytky 263 - 296 vynechány.
    (1) proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19; a (2) proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 19, kde jsou zbytky 263 - 296 vynechány.
    230 • · · · · * · · • ···· · · · ···· • · · · · · • 9 · · · ··· · · · · · 9
    (1) ami noky sel i nové sekvenci SEQ ID NO: 2; (2) aminokysel inové sekvenci SEQ ID NO: 4; (3) aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 17; (4) ami noky s e1inové sekvenci SEQ ID NO: 2, kde je zbytek 257 nahrazen alaninem a zbytky 258 - - 290 j SOU vynechány; (5) aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 4, kde je zbytek 253
    nahrazen alaninem a zbytky 254 - 286 jsou vynechány.
    (1) (2) (3) proteinu proteinu proteinu (4)
    (1) inserce nukleotidových sekvencí kódujících alespoň funkční doménu heterospecifického normálního genu pro presenilin, (2) inserce nukleotidových sekvencí kódujících alespoň funkční doménu heterospecifického mutantního genu pro presenilin, (3) inserce nukleotidových sekvencí kódujících alespoň funkční doménu konspecifického homologu heterospecifického mutantního
    227 • · · · · · · • ···« · · · · · · · • · · · · · ··· ·· ··· ·♦· ·· · genu pro presenilin, a (4) inaktivace endogeního genu pro presenilin.
    (1) sekvence kódující protein obsahující DmPS aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 21;
    (1) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-2 podle SEQ ID NO: 19;
    (1) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-2 podle SEQ ID NO: 19;
    (1) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-2 podle SEQ ID NO: 19;
    (1) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-1 podle SEQ ID NO: 2;
    (1) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-1 podle SEQ ID NO: 2;
    (1) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-1 podle SEQ ID NO: 2;
    1. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein vybraný ze skupiny skládající se z normálního presenilin-1 proteinu, mutantního presenilin-1 proteinu, normálního presenilin-2 proteinu a mutantního presenilin-2 proteinu.
  2. 2, kde vynechány;
    obsahuj ícího obsahujícího obsahuj ícího obsahuj ícího aminokyseli novou aminokyseli novou aminokyseli novou sekvenci sekvenci sekvenci
    SEQ
    SEQ
    SEQ
    ID
    ID
    ID
    NO:
    NO:
    NO:
    proteinu je zbytek 257 nahrazen alaninem a zbytky 258 - 290 jsou aminokyseli novou sekvenci
    SEQ
    ID
    NO:
    2;
    (2) sekvence kódující presenilinový homologní protein a schopné hybridizace k sekvenci komplementární k sekvenci (1) za přísných hybridizačních podmínek.
    (2) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-2 podle SEQ ID NO: 19, kde jsou zbytky 263 - 296 vynechány;
    (2) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-2 podle SEQ ID NO: 19, kde jsou zbytky 263 - 296 vynechány;
    (2) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-2 podle SEQ ID NO: 19, kde jsou zbytky 263 - 296 vynechány;
    (2) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-1 podle SEQ ID NO: 4;
    (2) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-1 podle SEQ ID NO: 4;
    (2) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro lidský presenilin-1 podle SEQ ID NO: 4;
    2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina kóduje normální presenilin-1 protein a kde je uvedená nukleotidová sekvence vybrána ze skupiny skládající se z:
  3. (3) sekvence kódující normální presenilin-2 protein a schopné hybridizace na sekvenci komplementární k jakékoliv sekvenci (1) (2) za podmínek přísné hybridizace.
    (3) sekvence kódující normální presenilin-2 protein a schopné hybridizace na sekvenci komplementární k jakékoliv sekvenci (1) (2) za podmínek přísné hybridizace.
    218
    (3) sekvence kódující normální presenilin-2 protein a schopné hybridizace na sekvenci komplementární k jakékoliv sekvenci (1) (2) za podmínek přísné hybridizace.
    (3) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro myší presenilin-1 podle SEQ ID NO: 17;
    (3) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro myší presenilin-1 podle SEQ ID NO: 17;
    3. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina kóduje mutantní presenilin-1 protein, kde uvedená sekvence nukleotidů kóduje alespoň jednu mutaci korespondující mutaci SEQ ID NO: 2 vybrané ze skupiny skládající se z A79?, V82L, V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280A, E280G, A285V, L286V, £291-319, G384A, L392V A C410Y; a kde uvedená nukleotidové sekvence jinak koresponduje nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny skládající se z:
    (3) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci pro myší presenilin-1 podle SEQ ID NO: 17;
  4. 4;
    (4) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 2, kde je zbytek 257 nahrazen alaninem a zbytky 258 - 290 jsou vynechány;
    4. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina kóduje mutantní presenilin-1 protein, kde uvedená sekvence nukleotidů kóduje alespoň jednu mutaci korespondující mutaci SEQ ID NO: 19 vybrané ze skupiny skládající se z M239V, N141I a I420T; a kde uvedené nukleotidové sekvence jinak korespondují nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny skládající se z:
    (4) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 2, kde je zbytek 257 nahrazen alaninem a zbytky 258 - 290 jsou vynechány;
    (4) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 2, kde je zbytek 257 nahrazen alaninem a zbytky 258 - 290 jsou vynechány;
  5. (5) proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 4, kde je zbytek 253 nahrazen alaninem a zbytky 254 - 286 jsou vynechány.
    229 ··
    5. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina kóduje normální presenilin-2 protein a kde je uvedená nukleotidové sekvence vybrána ze skupiny skládající se z:
    (5) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 4, kde je zbytek 253 nahrazen alaninem a zbytky 254 - 286 jsou vynechány; a (6) sekvence kódující normální presenilin-1 protein a schopné hybridizace na sekvenci komplementární k jakékoliv sekvenci (1) -
    217 (5) za podmínek přísné hybridizace.
    (5) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 4, kde je zbytek 253 nahrazen alaninem a zbytky 254 - 286 jsou vynechány; a • · · · v ·
    216 (6) sekvence kódující normální presenilin-1 protein a schopné hybridizace na sekvenci komplementární k jakékoliv sekvenci (1) (5) za podmínek přísné hybridizace.
    (5) sekvence kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence SEQ ID NO: 4, kde je zbytek 253 nahrazen alaninem a zbytky 254 - 286 jsou vynechány; a (6) sekvence kódující normální presenilin-1 protein a schopné • · · · hybridizace na sekvenci komplementární k jakékoliv sekvenci (1) (5) za podmínek přísné hybridizace.
  6. 6. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina kóduje mutantní presenilin-2 protein, kde uvedená sekvence nukleotidů kóduje alespoň jednu mutaci korespondující mutaci SEQ ID NO: 19 vybrané ze skupiny skládající se z M239V, N141I a I420T; a kde uvedené nukleotidové sekvence jinak korespondují nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny skládající se z:
  7. 7. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedená nukleová kyselina kóduje mutantní presenilin-2 protein, kde uvedená sekvence nukleotidů kóduje alespoň jednu mutaci korespondující mutaci SEQ ID NO: 2 vybrané ze skupiny skládající se z A79?, V82L, V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280A, E280G, A285V, L286V, 1291-319, G384A, L392V A C410Y; a kde uvedená nukleotidová sekvence jinak koresponduje nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny skládající se z:
  8. 8. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci o alespoň 10 sousedních nukleotidech vybranou ze skupiny • · · ·
    219
    Skládající se z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 a sekvencí komplementárních k jakékoliv z těchto sekvencí.
  9. 9. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci o alespoň 15 sousedních nukleotidech vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 a sekvencí komplementárních k jakékoliv z těchto sekvencí.
  10. 10. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci o alespoň 20 sousedních nukleotidech vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 a sekvencí komplementárních k jakékoliv z těchto sekvencí.
  11. 11. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň 10 sousedních nukleotidů z presenilinového insertu v plasmidu vybraném ze skupiny skládající se z ATCC přírůstkové č. 97214, ATCC přírůstkové č. 97508, ATCC přírůstkové č. 97124 a ATCC přírůstkové č. 97428.
  12. 12. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující alespoň jednu funkční doménu presenilinového proteinu vybraného ze skupiny skládající se z normálního • · · · · ·
    220 presenilin-1 proteinu, mutantního presenilin-1 proteinu, normálního presenilin-2 proteinu a mutantního presenilin-2 proteinu.
  13. 13. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12, kde uvedená funkční doména je presenilin-1 funkční doména korespondující doméně vybrané ze skupiny skládající se z presenilin-1 N-koncové, TMI, ΤΜ1->2, TM2, TM2->3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5->6, TM6, TM6->7, TM7 a C-koncové domény.
  14. 14. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12, kde uvedená funkční doména je presenilin-2 funkční doména korespondující doméně vybrané ze skupiny skládající se z presenilin-2 N-koncové, TMI, TMI->2, TM2, TM2->3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5->6, TM6, TM6->7, TM7 a C-koncové domény.
  15. 15. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující antigení determinantu presenilinového proteinu vybraného ze skupiny skládající se z normálního presenilin-1 proteinu, mutantního presenilin-1 proteinu, normálního presenilin-2 proteinu a mutantního presenilin-2 proteinu.
  16. 16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 15, kde uvedená sekvence kóduje presenilin-1 antigení determinantu korespondující presenilin-1 antigení determinantě vybrané ze skupiny skládající se z aminokyselinových zbytků 27 - 44, 28 - 61, 46 - 48, 50 - 60,
  17. 17;
    17. Izolovaná nukíeová kyselina podle nároku 15, kde uvedená sekvence kóduje presenilin-2 antigení determinantu korespondující presenilin-2 antigení determinantě vybrané ze skupiny skládající se z aminokyselinových zbytků 25 - 45, 50 - 63, 70 - 75, 114 120, 127 - 132, 162 - 167, 221 - 226, 282 - 290, 310 - 314, 321 338, 345 - 352, 380 - 390 a 430 - 435 SEQ ID NO: 19.
  18. 18. Způsob pro identifikaci alelických variant nebo heterospecifických homologů lidského presenilinového genu vyznačující se tím, že obsahuje vybrání nukleokyselinové proby nebo primeru schopného hybridizace na sekvenci lidského genu pro presenilin za přísných hybridizačních podmínek;
    smísení uvedené proby nebo primeru se vzorkem nukleové kyseliny, který může obsahovat nukleovou kyselinu korespondující uvedené variantě nebo homologů;
    detekci hybridizace uvedené proby nebo primeru na nukleovou kyselinu korespondující uvedené variantě nebo homologů.
  19. 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje vzorek nukleové kyseliny vybraný ze skupiny skládající se z lidské genomové DNA, lidské mRNA a lidské cDNA.
  20. 20. Způsob podle nároku 18 vyznačuj ící se tím, že uvedený vzorek obsahuje vzorek nukleové kyseliny vybraný ze • · · ·
    222 skupiny skládající se ze savčí genomové DNA, savčí mRNA a savčí cDNA.
  21. 21. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje vzorek nukleové kyseliny vybraný ze skupiny skládající se z genomové DNA, mRNA a cDNA od bezobratlých.
  22. 22. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že dále obsahuje krok izolace uvedené nukleové kyseliny korespondující uvedené variantě nebo homologu.
  23. 23. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedená nukleová kyselina je identifikována hybridizací.
  24. 24. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedená nukleová kyselina je identifikována PCR amplifikací.
  25. 25. Způsob pro identifikaci alelických variant nebo heterospecifických homologů lidského presenilinového genu vyznačující se tím, že obsahuje vybrání protilátky schopné selektivní vazby na lidský presenilinový protein;
    smísení uvedené protilátky se vzorkem proteinů , který může obsahovat proteiny korespondující uvedené variantě nebo homologu;
    detekci vazby uvedené protilátky ne uvedený protein korespondující uvedené variantě nebo homologu.
    ·· ····
    223
  26. 26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje vzorek proteinů vybraných ze skupiny skládající se z lidských proteinů, lidských fúsních proteinů a jejich proteolytických fragmentů.
  27. 27. Způsob podle nároku 25 vyznačuj ící se tím, že uvedený vzorek obsahuje vzorek nukleových kyselin vybraných ze skupiny skládající se z savčích proteinů, savčích fúsních proteinů a jejich proteolytických fragmentů.
  28. 28. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje vzorek nukleových kyselin vybraný ze skupiny skládající se proteinů od bezobratlých, fúsních proteinů od bezobratlých a jejich proteolytických fragmentů.
  29. 29. Způsob podle nároku 25 vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje podstatného čištění uvedeného proteinu korespondujícího variantě nebo homologu.
  30. 30. Izolovaná nukleová kyselina obsahující alelickou variantu nebo heterospecifický homolog lidského genu pro presenilin.
  31. 31. Izolovaná nukleová kyselina kódující alelickou variantu nebo heterospecifický homolog lidského presenilinového proteinu.
  32. 32. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 31, kde uvedená nukleová kyselina kóduje Drosophila melanogaster homolog lidského genu pro presenilin.
  33. 33. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 32, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze
    224 <9 · skupiny skládaj ící se z:
  34. 34. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci alespoň 10 sousedních nukleotidů vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 21 a sekvence komplementární k SEQ ID NO: 21.
  35. 35. Izolovaná nukleová kyselina obsahující rekombinantní vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle jakéhokoliv z nároků 1 - 34.
  36. 36. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 35, kde uvedený vektor je expresní vektor a uedená presenilinová nukleotidové sekvence e operativně připojena na regulační region.
  37. 37. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 36, kde uvedený expresní vektor může exprivovat uvedenou presenilinovou sekvenci v savčích buňkách.
  38. 38. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 37, kde jsou uvedené buňky vybrány ze skupiny skládající se z fibroblastových, jaterních, ledviných, sleziných neurologických buněk a buněk kostní dřeně.
    225
  39. 39. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 37, kde uvedený vektor je vybrán ze skupiny skládající se z viru vakcinie, adenoviru, retroviru, neurotrofních virů a Herpes simplex viru.
  40. 40. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 36, kde uvedený expresní vektor kóduje alespoň funkční doménu presenilinového proteinu vybranou ze skupiny skládající se z normálního presenilin-1, mutantního presenilin-1, normálního presenilin-2 a mutantního presenilin-2.
  41. 41. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 36, kde uvedený vektor dále obsahuje sekvence kódující exogení protein operativně připojený na uvedenou presenilinovou sekvenci a kde uvedený vektor kóduje presenilinový fúsní protein.
  42. 42. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 41, kde uvedený exogení protein je vybrán ze skupiny skládající se z lacZ, trpE, maltosového vazebného proteinu, poly-His smyček nebo glutathion-S-transferasy.
  43. 43. Izolovaná nukleová kyselina obsahující rekombinantní expresní vektor obsahující nukleotidové sekvence korespondující endogenímu regulačnímu regionu presenilinového genu.
  44. - 44, 28 - 61, 46 - 48, 50 - 60, 65 - 71, 66 - 67, 107 - 111,
    44. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 43, kde je uvedený endogení regulační region operativně připojen na markerový gen.
  45. - 45, 50 - 63, 70 - 75, 114 - 120, 127 - 132, 162 - 167, 221
    - 226, 282 - 290, 310 - 314, 321 - 338, 345 - 352, 380 - 390 a 430 - 435 SEQ ID NO: 19.
    45. Hostitelská buňka transformovaná expresním vektorem podle jakéhokoliv z nároků 36 - 44, nebo jejich potomstva.
    226
  46. 46. Hostitelská buňka podle nároku 45, kde je uvedená hostitelská buňka vybrána ze skupiny skládající se z bakteriálních buněk a buněk kvasinek.
  47. 47. Hostitelská buňka podle nároku 45, kde je uvedená hostitelská buňka vybrána ze skupiny skládající se z fetálních buněk, emryonálních kmenových buněk, zygot, gamet a buněk zárodečné linie.
  48. 48. Hostitelská buňka podle nároku 45, kde je uvedená hostitelská buňka vybrána ze skupiny skládající se z fibroblastových, jaterních, ledviných, sleziných, neurologických buněk a buněk kostní dřeně.
  49. 49. Hostitelská buňka podle nároku 45, kde je uvedená buňka buňkou od bezobratlých.
  50. 50. Non-lidský zvířecí model pro Alzheimerovu chorobu, kde genom uvedeného zvířete, nebo jeho předchůdce, byl modifikován alespoň jedním rekombinantním konstruktem, a kde uvedený rekombinantní konstrukt obsahoval modifikace vybrané ze skupiny skládající se z:
  51. 51. Zvíře podle nároku 50, kde uvedená modifikace je inserce nukleotidové sekvence kódující alespoň funkční doménu normální lidského genu pro presenilin-1.
  52. 52. Zvíře podle nároku 50, kde uvedená modifikace je inserce nukleotidové sekvence kódující alespoň funkční doménu mutantního lidského genu pro presenilin-1.
  53. 53. Zvíře podle nároku 50, kde uvedená modifikace je inserce nukleotidové sekvence kódující alespoň funkční doménu normální lidského genu pro presenilin-2.
  54. 54. Zvíře podle nároku 50, kde uvedená modifikace je inserce nukleotidové sekvence kóduj ící alespoň funkční doménu mutantního lidského genu pro presenilin-2.
  55. 55. Zvíře podle nároku 50, kde uvedená modifikace je inserce nukleotidové sekvence kódující alespoň funkční doménu normálního nebo mutantního presenilinového proteinu.
  56. 56. Zvíře podle nároku 50, kde uvedené zvíře je vybráno ze skupiny skládající se z krys, myší, křečků, morčat, králíků, psů, koček, koz, ovcí, prasat, a non-lidských primátů.
  57. 57. Zvíře podle nároku 50, kde uvedené zvíře je bezobratlý.
  58. 58. Způsob pro produkci alespoň funkční domény presenilinového
    228 proteinu vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci hostitelské buňky podle jakéhokoliv z nároků45 - 49 za vhodných podmínek pro produkci uvedeného presenilinů prostřednictvím exprese uvedené nukleové kyseliny.
  59. 59. V podstatě čistý přípravek proteinu vybraný ze skupiny skládající se z normálního presenilin-1 proteinu, mutantního presenilin-1 proteinu, normálního presenilin-2 proteinu a mutantního presenilin-2 proteinu.
  60. 60. V podstatě čistý přípravek podle nároku 59, kde uvedený protein obsahuje normání presenilin-1 protein vybraný ze skupiny skládající se z:
  61. 61. V podstatě čistý přípravek podle nároku 59, kde uvedený protein obsahuje mutantní presenilin-1 protein obsahující alespoň jednu mutaci, která koresponduje mutaci SEQ ID NO: 2 vybrané ze skupiny skládající se z A79?, V82L, V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280A, E280G, A285V, L286V, 2291-319, G384A, L392V A C410Y; a kde uvedený protein jinak koresponduje aminokyselinové sekvenci vybrané ze skupiny skládající se z:
  62. 62. V podstatě čistý přípravek podle nároku 59, kde uvedený protein obsahuje normání presenilin-2 protein vybraný ze skupiny skládající se z:
  63. 63. V podstatě čistý přípravek podle nároku 59, kde uvedený protein obsahuje mutantní presenilin~2 protein obsahující alespoň jednu mutaci, která koresponduje mutaci SEQ ID NO: 19 vybrané ze skupiny skládající se z M239V, N141I a I420T; a kde uvedený protein jinak koresponduje aminokyselinové sekvenci vybrané ze skupiny skládající se z:
  64. 64. V podstatě čistý přípravek polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci alespoň 5 sousedících aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 21.
  65. 65. V podstatě čistý přípravek polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci alespoň 10 sousedících aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 21.
    65 - 71, 66 - 67, 107 - ni, 109 - 112, 120 - 121, 120 - 122, 125 - 126, 155 - 160, 185 - 189, 214 - 223, 218 - 221, 220 - 230, 240 - 245, 241 - 243, 267 - 269, 273 - 282, 300 - 370, 302 - 310, 311 - 325, 332 - 342, 346 - 359, 372 - 382, 400 - 410 a 400 - 420 SEQ
    221
    ID NO: 2.
  66. 66. V podstatě čistý přípravek polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci alespoň 15 sousedících aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny skládající se z SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 21.
  67. 67. V podstatě čistý přípravek polypeptidů obsahujícího alespoň jednu funkční doménu presenilinového proteinu vybraného ·· ····
    231 ze skupiny skládající se z normálního presenilin-1 proteinu, mutantního presenilin-1 proteinu, normálního presenilin-2 proteinu a mutantního presenilin-2 proteinu.
  68. 68. V podstatě čistý přípravek podle nároku 67, kde uvedená funkční doména je presenilin-1 funkční doména korespondující doméně vybrané ze skupiny skládající se z presenilin-1 N-koncové, TMI, ΤΜ1->2, TM2, TM2->3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5->6, TM6, TM6->7, TM7 a C-koncové domény.
  69. 69. V podstatě čistý přípravek podle nároku 67, kde uvedená funkční doména je presenilin-2 funkční doména korespondující doméně vybrané ze skupiny skládající se z presenilin-2 N-koncové, TMI, TMI->2, TM2, TM2->3, TM3, TM3->4, TM4, TM4->5, TM5, TM5->6, TM6, TM6->7, TM7 a C-koncové domény.
  70. 70. V podstatě čistý přípravek polypeptidu obsahujícího antigení determinantu presenilinového proteinu vybraného ze skupiny skládající se z normálního presenilin-1 proteinu, mutantního presenilin-1 proteinu, normálního presenilin-2 proteinu a mutantního presenilin-2 proteinu.
  71. 71. V podstatě čistý přípravek podle nároku 70, kde uvedený polypeptid obsahuje presenilin-1 antigení determinantu korespondující presenilin-1 antigení determinantě vybrané ze skupiny nukleotidů skládající se z aminokyselinových zbytků 27
  72. 72. V podstatě čistý přípravek podle nároku 70, kde uvedený polypeptid obsahuje presenilin-1 antigení determinantu korespondující presenilin-1 antigení determinantě vybrané ze skupiny nukleotidů skládající se z aminokyselinových zbytků 25
  73. 73. Způsob pro produkci protilátek, které se selektivně váží na presenilin vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
    podání imunogenicky účinného množství presenilinového imunogenu zvířeti;
    umožně produkce protilátek uvedeným zvířetem k uvedenému imunogenu; a získání uvedených protilátek od uvedeného zvířete nebo z buněčné kultury od něj odvozené.
  74. 74. V podstatě čistý přípravek protilátky, která se selektivně váže na antigení determinanty presenilinového proteinu vybraného ze skupiny skládající se z normálního presenilinů-1, mutantního presenilinů-1, normálního presenilinu-2 a mutantního presenilinu-2.
  75. 75. V podstatě čistý přípravek protilátky podle nároku 74, kde uvedená protilátka se selektivně váže na antigení determinanty mutantního presenilinů-1 a selhává ve vazbě na normální
    233 presenilin-1 protein.
  76. 76. V podstatě čistý přípravek protilátky podle nároku 74, kde uvedená protilátka se selektivně váže na antigení determinanty mutantního presenilinu-2 a selhává ve vazbě na normální presenilin-2 protein.
  77. 77. Buněčná linie produkující protilátky podle jakéhokoliv z nároků 74 - 76.
  78. 78. Způsob pro identifikování sloučenin, které mohou modulovat expresi genu pro presenilin vyznačující se tím, že obsahuj e kontaktování buněk s testovaným kandidátem, kde uvedené buňky obsahují regulační region genu pro presenilin operativně připojený na kódující region; a detekování změn v expresi uvedeného kódujícího regionu.
  79. 79. Způsob podle nároku 78vyznačující se tím, že uvedená změna zahrnuje změnu na úrovni mRNA transkriptů kódovaného uvedeným kódujícím regionem.
  80. 80. Způsob podle nároku 78 vyznačuj ící se tím, že uvedená změna zahrnuje změnu na úrovni proteinu kódovaného uvedeným kódujícím regionem.
  81. 81. Způsob podle nároku 78 vyznačuj ící se tím, že uvedená změna je výsledekem aktivity proteinu kódovaného uvedeným kódujícím regionem.
    ·· ···♦
    234
  82. 82. Způsob podle nároku 78 vyznačující se tím, že uvedený kódující region kóduje markerový protein vybraný ze skupiny skládající se z B-galaktosidasy, alkalické fosfatasy, zeleného fluorescentního proteinu a luciferasy.
  83. 83. Způsob pro identifikaci sloučenin, které se mohou selektivně vázat na presenilinový protein vyznačuj ící se t í m, že obsahuje kroky:
    poskytnutí přípravku obsahujícího alespoň jednu presenilinovou složku;
    kontaktování uvedeného přípravku se vzorkem obsahuj ícím alespoň jednu kandidátovou sloučeninu; a detekování vazby uvedené presenilinové složky na uvedenou kandidátovou sloučeninu.
  84. 84. Způsob podle nároku 83 vyznačuj ící se tím, že vazba na uvedenou presenilinovou složku je detekována testem vybraným ze skupiny skládající se z: afinitní chromatografie, ko-imunoprecipitace, Biomoecular Interaction Assay a kvasinkového dvouhybridového systému.
  85. 85. Způsob pro identifikování sloučenin, které mohou modulovat aktivitu presenilinů vyznačující se tím, že obsahuje kroky poskytnutí buněk exprivujících normální nebo mutantní gen pro presenilin;
    235 kontaktování buněk s alespoň jednou testovanou kandidátovou sloučeninou; a detekování změn v markéru uvedené aktivity.
  86. 86. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že měření uvedeného markéru ukazuje rozdíl mezi buňkami nesoucími exprivovaný mutantní gen pro presenilin a jinak identickými buňkami bez exprivovaného mutantního genu pro presenilin.
  87. 87. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že uvedená změna obsahuje změnu v nespecifickém markéru buněčné fyziologie vybraném ze skupiny skládající se z pH, intracelulárního vápníku, hladin cyklického AMP, poměrů GTP/DP, aktivity fosfatidylinositolu, a proteinové fosforylace.
  88. 88. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že uvedená změna obsahuje změnu v expresi uvedeného presenilinů.
  89. 89. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že uvedená změna obsahuje změnu v intracelulárni koncentraci nebo proudu iontů vybraných ze skupiny skládající se z Ca2*, Na* a K*.
  90. 90. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že uvedená změna obsahuje změnu ve výskytu nebo stupni apoptosy nebo buněčné smrti.
  91. 91. Způsob podle nároku 85 vyznačující se tím, že uvedená změna obsahuje změnu v produkci AS peptidů.
  92. 92. Způsob podle nároku 85 vyznačující se tím, že uvedená změna obsahuje změnu ve fosforylaci alespoň jednoho s mikrotubuly asociovaného proteinu.
    236
  93. 93. Způsob podle nároku 85 vyznačující se tím, že uvedená buňka je buňka kultivovaná in vitro.
  94. 94. Způsob podle nároku 93 vyznačující se tím, že uvedená buňka je transformovaná hostitelská buňka podle jakéhokoliv z nároků 45 - 49.
  95. 95. Způsob podle nároku 93 vyznačuj ící se tím, že uvedená buňka je explantována z hostitele nesoucího alespoň jeden mutantní gen pro presenilin.
  96. 96. Způsob podle nároku 93 vyznačuj ící se tím, že uvedená buňka je explantována z transgeního zvířete podle jakéhokoliv z nároků 50 - 57.
  97. 97. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že uvedená buňka je buňka v živém zvířeti.
  98. 98. Způsob podle nároku 97 vyznačující se tím, že uvedená buňka je buňka transgeního zvířete podle jakéhokoliv z nároků 50 - 57.
  99. 99. Způsob podle nároku 85 vyznačuj ící se tím, že uvedená buňka je v lidském subjektu v klinickém pokusu.
  100. 100. Diagnostická metoda pro určení toho, zda subjekt nese mutantní gen pro presenilin, která obsahuje kroky:
    • · · · · ·
    237 poskytnutí biologického vzorku od uvedeného subjektu;
    detekování v uvedeném vzorku mutantní nukleové kyseliny pro presenilin, mutantního presenilinového proteinu, nebo aktivity mutantního presenilinů.
  101. 101. Způsob podle nároku 100 vyznačující se tím, že mutantní presenilinová nukleová kyselina je detekována testem vybraným ze skupiny skládající se z přímého sekvencování nukleotidů, probové specifické hybridizace, trávení restrikčními enzymy a mapování, PCR mapování, ligasou mediaované PCR detekce, RNAsové protekce, detekcí posunu elektroforetické mobility a chemickým chybným štěpením.
  102. 102. Způsob podle nároku 100 vyznačující se tím, že mutantní presenilinový protein je detekován testem vybraným ze skupiny skládající se z imunotestu, proteasového testu a testu elektroforetické mobility.
  103. 103. Farmaceutický přípravek obsahující v podstatě čistý presenilinový protein a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  104. 104. Farmaceutický přípravek obsahující expresní vektor operativně kódující presenilinový protein, kde uvedený expresní vektor může exprivovat uvedený presenilinový protein v lidských subjektech, a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  105. 105. Farmaceutický přípravek obsahující expresní vektor operativně kódující presenilinovou antisense sekvenci, kde uvedený expresní vektor může exprivovat uvedenou presenilinovou antisense sekvenci v lidských subjektech, a farmaceuticky • · · · · ·
    238 akceptovatelný nosič.
  106. 106. Farmaceutický přípravek obsahující v podstatě čistou protilátku, kde se uvedená protilátka selektivně váže na mutantní presenilinový protein, a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  107. 107. Farmaceutický přípravek podle nároku 106, kde je uvedený přípravek v podstatě bez protilátky, která se selektivně váže na normální presenilinový protein.
  108. 108. Farmaceutický přípravek obsahující v podstatě čistý přípravek antigeních determinant mutantního presenilinového proteinu.
  109. 109. Farmaceutický přípravek podle nároku 108, kde je uvedený přípravek v podstatě bez antigeních determinant normálního presenilinového proteinu.
    109 - 112, 120 - 121, 120 - 122, 125 - 126, 155 - 160, 185
    - 189, 214 - 223, 218 - 221, 220 - 230, 240 - 245, 241 - 243,
    267 - 269, 273 - 282, 300 - 370, 302 - 310, 311 - 325, 332
    - 342, 346 - 359, 372 - 382, 400 - 410 a 400 - 420 SEQ ID NO: 2.
    • ·
    232
  110. 110. Způsob pro léčbu pacientů majících mutantní gen pro presenilin vyznačuj ícísetím, že obsahuje krok podání terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku podle jakéhokoliv z nároků 103 - 109 uvedenému pacientovi.
  111. 111. Způsob podle nároku 110 vyznačující se tím, že uvedený farmaceutický přípravek je zaměřena na typ buněk vybraný ze srdečních, mozkových, plicních, jaterních buněk, buněk kosterního svalu, ledviny slinivky a neurologických buněk.
CZ973390A 1995-04-28 1996-04-29 Genetické sekvence a proteiny týkající se Alzheimerovi choroby a jejich použití CZ339097A3 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/431,048 US6531586B1 (en) 1995-04-28 1995-04-28 Genetic sequences related to Alzheimer's Disease
US08/496,841 US6210919B1 (en) 1995-04-28 1995-06-28 Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US50935995A 1995-07-31 1995-07-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ339097A3 true CZ339097A3 (cs) 1998-02-18

Family

ID=27411707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ973390A CZ339097A3 (cs) 1995-04-28 1996-04-29 Genetické sekvence a proteiny týkající se Alzheimerovi choroby a jejich použití

Country Status (19)

Country Link
US (9) US5986054A (cs)
EP (2) EP2000479A1 (cs)
JP (3) JP4504463B2 (cs)
KR (1) KR19990008181A (cs)
AT (1) ATE405645T1 (cs)
AU (1) AU716307B2 (cs)
BR (1) BR9608140A (cs)
CA (1) CA2219214A1 (cs)
CZ (1) CZ339097A3 (cs)
DE (1) DE69637649D1 (cs)
DK (1) DK0826042T3 (cs)
ES (1) ES2314979T3 (cs)
HU (1) HUP9801639A3 (cs)
MX (1) MX9708270A (cs)
NO (1) NO974964L (cs)
NZ (2) NZ305822A (cs)
PL (1) PL185549B1 (cs)
SK (1) SK145397A3 (cs)
WO (1) WO1996034099A2 (cs)

Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
DE69635207T2 (de) * 1995-07-07 2006-06-22 Darwin Molecular Corp. Auf Chromosom 1 lokalisiertes Gen dessen Genprodukt mit der Alzheimerschen Krankheit assoziiert ist.
WO1997003999A1 (en) * 1995-07-18 1997-02-06 Washington University School Of Medicine Mutant s182 genes
US5985564A (en) * 1995-08-16 1999-11-16 President And Fellows Of Harvard College Assay for identifying agents that inhibit chromosome non-disjunction
US6248555B1 (en) 1995-08-31 2001-06-19 The General Hospital Corporation Genetic alterations related to familial alzheimer's disease
CA2233297A1 (en) * 1995-09-27 1997-04-03 Iva Greenwald Identification of sel-12 and uses thereof
ZA968898B (en) * 1995-10-25 1998-03-30 Washington University Of Medic Method for elucidation and detection of polymorphisms, splice variants and proximal coding mutations using intronic sequences of the mutations Alzheimer's S182 gene.
JPH10327897A (ja) * 1996-01-19 1998-12-15 Washington Univ プレセニリン−１遺伝子の配列を用いる疾患の診断および予後診断
WO1997027296A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Hsc Research And Development Limited Partnership Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor
WO1997038133A1 (en) * 1996-04-04 1997-10-16 University Of South Florida Variant presenilin-2 genes
WO1997046678A1 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Bayer Corporation Nucleic acids and polypeptides related to presenilin
EP0811695A3 (en) * 1996-06-06 1998-07-29 Washington University Mutant S182(PS-1) genes
EP0814157A3 (en) * 1996-06-18 1998-01-07 Smithkline Beecham Corporation Diagnostic marker for variants of presenilin genes associated with Alzheimers Disease and Familial Adult Onset Alzheimers Disease
JP2000516087A (ja) * 1996-07-05 2000-12-05 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用
WO1998025142A1 (en) 1996-12-02 1998-06-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Alarm related peptides and nucleic acids and diagnosis using them
US6121045A (en) * 1997-04-04 2000-09-19 Millennium Biotherapeutics, Inc. Human Delta3 nucleic acid molecules
US6376239B1 (en) * 1997-04-04 2002-04-23 Elegene Gmbh DNA molecules comprising a promoter capable of conferring expression of a heterologous DNA sequence
WO1998047917A2 (en) * 1997-04-24 1998-10-29 The General Hospital Corporation A PURIFIED 20 kDa PRESENILIN 2 C-TERMINAL FRAGMENT AND METHODS OF SCREENING FOR COMPOUNDS THAT INHIBIT PROTEOLYSIS OF PRESENILIN 2
CA2290039A1 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Merck & Co., Inc. Transgenic animal expressing non-native wild-type and familial alzheimer's disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background
ES2128265B1 (es) * 1997-06-04 2000-03-01 Euroespes S A Kit genetico para la caracterizacion molecular de la enfermedad de alzheimer.
US7923015B2 (en) * 1997-08-14 2011-04-12 Institut Pasteur Methods for direct visualization of active synapses
US7923216B2 (en) * 1997-08-14 2011-04-12 Institut Pasteur In vivo modulation of neuronal transport
US20100081197A1 (en) * 1997-08-14 2010-04-01 Sylvie Roux In vivo modulation of neuronal transport
ATE352558T1 (de) * 1997-08-14 2007-02-15 Pasteur Institut Hybdride tetanustoxinproteine die rückwirkend und transsynatisch ins zns migrieren
US6284944B1 (en) * 1997-08-29 2001-09-04 Cephalon, Inc, Gene-targeted non-human mammal with a human fad presenilin mutation and generational offspring
US6255473B1 (en) * 1997-08-29 2001-07-03 Duke University Presenilin-1 gene promoter
FR2768346B1 (fr) 1997-09-15 2002-04-19 Fond Jean Dausset Ceph Compose assurant l'inhibition de la preseniline 1 pour la preparation d'un medicament et agent de diagnostic
JP2001521043A (ja) * 1997-10-24 2001-11-06 アバンテイス・フアルマ・エス・アー プレセニリンとβ−アミロイドペプチドまたはその前駆体との相互作用を阻害し得るペプチド
FR2770217B1 (fr) * 1997-10-24 2001-12-07 Rhone Poulenc Rorer Sa Peptides capables d'inhiber l'interaction entre les presenilines et le precurseur du peptide b-amyloide et/ou le peptide b-amyloide
EP1044605B1 (en) * 1998-01-08 2007-04-25 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Gene mutant animals
WO1999035501A1 (en) * 1998-01-09 1999-07-15 The Governing Council Of The University Of Toronto Presenilin protein interactions
EP1849477A1 (en) * 1998-02-25 2007-10-31 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES, as represented by THE SECRETARY OF THE ARMY Use of skin penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response induced by ADP-ribosylating exotoxin
DE69940906D1 (de) * 1998-05-21 2009-07-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Verfahren zur untersuchung von krankheiten des zentralen nervensystems und verfahren zum aufsuchen von arzneimitteln
AR020329A1 (es) * 1998-07-09 2002-05-08 Boehringer Ingelheim Pharma UNA SUSTANCIA, EN PARTICULAR UNA RIBOZIMA, CAPAZ DE INHIBIR LA EXPRESION DE PRESENILINA 2, UNA MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE QUE CODIFICA DICHA RIBOZIMA, UNVECTOR RECOMBINANTE QUE COMPRENDE EL cDNA CORRESPONDIENTE A DICHA RIBOZIMA, UNA CELULA HOSPEDADORA QUE COMPRENDE DICHO VECTOR RECOMBINANTE, UNA C
JP2002520055A (ja) * 1998-07-16 2002-07-09 インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド ヒトプレセニリン関連タンパク質
US6797480B1 (en) 1998-10-05 2004-09-28 University Of Connecticut Health Center Purification of heat shock/stress protein cell surface receptors and their use as immunotherapeutic agents
US6723557B1 (en) 1999-01-06 2004-04-20 California Institute Of Technology Caenorhabditis elegans LOV-1 gene
US6783982B1 (en) 1999-02-12 2004-08-31 The Governing Council Of The University Of Toronto Proteins related to neuronal regeneration and uses thereof
US6812337B1 (en) * 1999-04-01 2004-11-02 The Governing Council Of The University Of Toronto Presenilin associated membrane protein and uses thereof
WO2000059297A2 (en) * 1999-04-06 2000-10-12 Harrington Arthritis Research Center Methods for tracking the progression of alzheimer's disease and identifying treatments using transgenic mice
US6890726B1 (en) 1999-04-06 2005-05-10 Oklahoma Medical Research Foundation Method for selecting recombinase variants with altered specificity
US20030131364A1 (en) * 1999-04-27 2003-07-10 Karen Duff Method for producing transgenic animal models with modulated phenotype and animals produced therefrom
AU6265600A (en) * 1999-06-22 2001-01-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Method for detection of early-onset alzheimer's disease
EP1194449B1 (en) * 1999-06-28 2010-09-22 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibitors of memapsin 2 and use thereof
US20020049303A1 (en) * 1999-06-28 2002-04-25 Tang Jordan J. N. Catalytically active recombinant memapsin and methods of use thereof
FR2798821B1 (fr) * 1999-09-27 2001-10-26 Aventis Pharma Sa Animal transgenique exprimant une forme multi-mutee de la preseniline 1
AU2001227960A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-31 University Of Connecticut Health Center Heat shock/stress protein complexes as vaccines against neurodegenerative disorders
IL151828A0 (en) 2000-04-03 2003-04-10 Bristol Myers Squibb Pharma Co Proteins having gamma-secretase activity and methods for isolating the same and methods detecting said activity
AU2001264950A1 (en) * 2000-05-26 2001-12-11 Duke University Methods of screening for parkinson's disease
US6930169B2 (en) * 2000-06-12 2005-08-16 University Of Baltimore Biotechnology Institute Method of controlling the binding of calmyrin to presenilin
US7371920B2 (en) 2000-06-20 2008-05-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Transgenic mouse model of neurodegenerative disorders
AU2001273661A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-14 Duke University Methods of screening for alzheimer's disease
DE10032709A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-24 Boehringer Ingelheim Pharma Aspartyl-Protease
WO2002005634A2 (en) 2000-07-13 2002-01-24 University Of South Florida Transgenic animal and methods
JP2002142765A (ja) * 2000-07-14 2002-05-21 Tosoh Corp 新規ゲノム解析法
WO2002014546A1 (en) * 2000-08-16 2002-02-21 Markus Fritzsche Use of microbial dna sequences for the identification of human diseases
AU2001287448A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-13 The Governing Council Of The University Of Toronto Proteins related to schizophrenia and uses thereof
US6900367B2 (en) * 2000-09-29 2005-05-31 Novartis Transgenic Drosophila melanogaster expressing a β42 in the eye
US6495335B2 (en) * 2000-12-07 2002-12-17 Mario Chojkier Compositions and methods for diagnosing alzheimer's disease
US20040121947A1 (en) * 2000-12-28 2004-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof
US6815175B2 (en) 2001-03-16 2004-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Anti-amyloid peptide antibody based diagnosis and treatment of a neurological disease or disorder
US20030073608A1 (en) * 2001-04-10 2003-04-17 Woolf Nancy J. Process for treating disease
GB2375771A (en) * 2001-05-24 2002-11-27 Univ Leeds Decellularisation of tissue implant material
JP2003012548A (ja) * 2001-06-27 2003-01-15 Japan Science & Technology Corp 医薬組成物
EP2354793B1 (en) 2001-08-14 2016-06-22 Sentigen Biosciences, Inc. Nucleic acids and proteins of insect OR83B odorant receptor genes and uses thereof
US20060234944A1 (en) * 2001-10-23 2006-10-19 Oklahoma Medical Reseach Foundation Beta-secretase inhibitors and methods of use
EP1448218A4 (en) * 2001-10-23 2009-01-14 Oklahoma Med Res Found BETA SECRETASE INHIBITORS AND METHOD OF USE
EP1456668B1 (en) * 2001-12-05 2007-05-02 Sense Proteomic Limited Protein arrays for allelic variants and uses thereof
AU2002359781A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Regents Of The University Of California Triple transgenic mouse model of alzheimer's disease
US20040014109A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-22 Pericak-Vance Margaret A. Methods and genes associated with screening assays for age at onset and common neurodegenerative diseases
WO2004005921A1 (en) * 2002-07-05 2004-01-15 Evotec Neurosciences Gmbh Diagnostic and therapeutic use of tb2 gene and protein for neurodegenerative diseases
US20060183117A1 (en) * 2002-07-08 2006-08-17 Pericak-Vance Margaret A Screening for alzheimer's disease
US20040076606A1 (en) * 2002-09-14 2004-04-22 Ming-Shi Chang Methods of modulating inflammation by administration of interleukin-19 and inhibitors of IL-19 binding
US7022481B2 (en) 2002-12-19 2006-04-04 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of using glucan synthase pathway reporter genes to screen for antifungal compounds
US20060246437A1 (en) * 2003-07-11 2006-11-02 Pericak-Vance Margaret A Genetic susceptibility genes for asthma and atopy and asthma-related and atopic-related phenotypes
US20060068428A1 (en) * 2003-11-03 2006-03-30 Duke University Identification of genetic markers associated with parkinson disease
US20050191652A1 (en) * 2003-11-03 2005-09-01 Vance Jeffery M. Identification of genetic forms of a gene that leads to high risk for parkinson disease
WO2005075684A2 (en) * 2004-01-30 2005-08-18 Xenoport, Inc. Use of organic anion transporter b in screens for candidate substrates for crossing the blood brain barrier
US20050170392A1 (en) * 2004-01-30 2005-08-04 Xenoport, Inc. OAT3 transporters expressed in blood brain barrier cells
SE0400707D0 (sv) 2004-03-22 2004-03-22 Bioarctic Neuroscience Ab Transgenic animal model
US7790390B2 (en) * 2004-10-27 2010-09-07 Duke University Methods for identifying an individual at increased risk of developing coronary artery disease
US7807465B2 (en) * 2004-10-27 2010-10-05 Duke University Methods for identifying an individual at increased risk of developing coronary artery disease
US7833725B2 (en) * 2005-01-06 2010-11-16 President And Fellows Of Harvard College Mass spectrometric methods and products
US20070092449A1 (en) * 2005-04-05 2007-04-26 Rafael Vazquez-Martinez Methods for direct visualization of active synapses
US20070148661A1 (en) * 2005-07-19 2007-06-28 Duke University LSAMP Gene Associated With Cardiovascular Disease
US7704696B2 (en) * 2005-07-29 2010-04-27 Xenoport, Inc. Screening of compounds for OCTN2 transporter activity
US7670782B2 (en) * 2005-07-29 2010-03-02 Xenoport, Inc. Screening of compounds for CAT1 transporter activity
US7691584B2 (en) * 2005-07-29 2010-04-06 Xenoport, Inc. Screening of compounds for OCT3 transporter activity
US7704695B2 (en) * 2005-07-29 2010-04-27 Xenoport, Inc. Screening of compounds for BGT1 transporter activity
WO2007016159A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Xenoport, Inc. Gat2 transporters expressed in blood brain barrier cells
WO2007021886A2 (en) * 2005-08-10 2007-02-22 Oklahoma Medical Research Foundation Truncated memapsin 2 for use for treating alzheimer's disease
US20090226420A1 (en) * 2005-11-10 2009-09-10 Elizabeth Hauser Methods of Determining the Risk of Developing Coronary Artery Disease
US8852585B2 (en) 2006-01-30 2014-10-07 Grifols Therapeutics Inc. Method of treatment and prophylaxis of diseases related to amyloid deposition using IgM
WO2007092861A2 (en) * 2006-02-06 2007-08-16 Elan Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors specific of presenilin-1 and their uses
WO2007123680A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating neurodegenerative disorders and alzheimer's disease and improving normal memory
US8129334B2 (en) 2006-03-31 2012-03-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating neurodegenerative disorders and Alzheimer'S disease and improving normal memory
US7771741B2 (en) * 2006-05-01 2010-08-10 Warsaw Orthopedic, Inc Demineralized bone matrix devices
EP2024503A2 (en) * 2006-05-01 2009-02-18 Aarhus Universitet An animal model and a method for producing an animal model
EP2134846B1 (en) * 2007-03-07 2018-08-08 Aarhus Universitet Transgenic pig as a model of alzheimer's disease
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9068006B2 (en) 2010-08-25 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Glycated CD59 peptides, their preparation, and uses thereof
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20140193341A1 (en) * 2011-01-19 2014-07-10 Asa Abeliovich Human induced neuronal cells
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012178183A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Human age-related neurodegenerative nematode model and methods
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PT3682905T (pt) 2011-10-03 2022-04-07 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações
EP2791159A4 (en) * 2011-12-14 2015-10-14 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND ACUTE TREATMENT USES THEREOF
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
ES2530141B1 (es) * 2013-08-26 2016-01-15 Juan Carlos GALLAR RUIZ Péptido útil como diana farmacológica para el cribado de moléculas para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer, anticuerpo frente al mismo y uso del anticuerpo para el tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad.
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
EP3347486A4 (en) 2015-09-09 2019-06-19 The Trustees of Columbia University in the City of New York REDUCTION OF ER-MAM-LOCALIZED APP-C99 AND METHOD FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER DISEASE
CN111201030B (zh) 2017-07-25 2024-11-01 真和制药有限公司 通过阻断tim-3和其配体的相互作用治疗癌症
ES2817910T3 (es) * 2017-08-04 2021-04-08 Alzheimur 2012 S L Uso de un anticuerpo antipresenilina para la prevención y/o tratamiento del cáncer
AU2019272848A1 (en) * 2018-05-22 2020-12-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Gene therapy for alzheimer's disease
KR20210124308A (ko) 2019-01-30 2021-10-14 트루바인딩 아이엔씨. 항-gal3 항체 및 이의 용도
CA3141712A1 (en) * 2019-05-24 2020-12-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Gene therapy for alzheimer's disease
AU2020393917A1 (en) 2019-11-29 2022-06-23 Paros Bio, Inc. Gene therapy for neurodegenerative disorders
MX2022014786A (es) 2020-05-26 2023-01-16 Truebinding Inc Metodos para tratar enfermedades inflamatorias mediante el bloqueo de galectina-3.
KR102584857B1 (ko) * 2020-09-23 2023-10-06 재단법인대구경북과학기술원 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도
KR20230009140A (ko) * 2021-07-08 2023-01-17 주식회사 엠케이바이오텍 Human mutant Presenilin-1 발현 인지장애 모델 개의 생산

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690893A (en) * 1985-05-03 1987-09-01 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies which specifically bind to mouse interleukin-2
JPH0779702B2 (ja) * 1986-11-17 1995-08-30 サイオス ノバ インコーポレイテッド 組換えアルツハイマーアミロイドタンパク
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5262332A (en) * 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
JPH06507782A (ja) * 1990-06-15 1994-09-08 サイオス　ノバ　インコーポレイテッド アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物
JPH05199896A (ja) * 1990-10-29 1993-08-10 Shinetsu Bio Inc モノクローナル抗体含有試薬
JP3293622B2 (ja) 1991-03-15 2002-06-17 エイチエスシー リサーチ アンド ディヴェロップメント リミテッド パートナーシップ 形質転換された魚類の製造用の遺伝子構築体
US5297562A (en) * 1991-04-01 1994-03-29 President And Fellows Of Harvard College Method for detecting and treating Alzheimer's disease
NZ242955A (en) * 1991-06-13 1995-01-27 Ici Plc Dna containing gene sequences corresponding to sequences causing alzheimers disease, detection, recombinant yeast with such code
IL105793A0 (en) * 1992-05-28 1993-09-22 Lilly Co Eli Protease and related dna compounds
WO1994000569A1 (en) * 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
US5668006A (en) * 1992-07-17 1997-09-16 American Cyanamid Company Somatostatin receptors
US5449604A (en) * 1992-10-21 1995-09-12 University Of Washington Chromosome 14 and familial Alzheimers disease genetic markers and assays
WO1994010569A1 (en) * 1992-10-26 1994-05-11 Schenk Dale B METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF SOLUBLE β-AMYLOID PEPTIDE
WO1994023049A2 (en) * 1993-04-02 1994-10-13 The Johns Hopkins University The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals
US6998467B1 (en) * 1995-04-28 2006-02-14 The Hospital For Sick Children Antibody specific for presenilin 1 and method of use thereof
US6210919B1 (en) * 1995-04-28 2001-04-03 Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US5986054A (en) 1995-04-28 1999-11-16 The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease
US6531586B1 (en) * 1995-04-28 2003-03-11 The Hospital For Sick Children Genetic sequences related to Alzheimer's Disease
DE69635207T2 (de) 1995-07-07 2006-06-22 Darwin Molecular Corp. Auf Chromosom 1 lokalisiertes Gen dessen Genprodukt mit der Alzheimerschen Krankheit assoziiert ist.
WO1997003086A1 (en) * 1995-07-13 1997-01-30 University Of South Florida Early onset alzheimer's disease gene and gene products
WO1997003999A1 (en) * 1995-07-18 1997-02-06 Washington University School Of Medicine Mutant s182 genes
WO1997027296A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Hsc Research And Development Limited Partnership Nucleic acids and proteins related to alzheimer's disease, and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
ATE405645T1 (de) 2008-09-15
HUP9801639A3 (en) 2001-01-29
EP0826042A2 (en) 1998-03-04
NZ305822A (en) 2000-08-25
US7507798B2 (en) 2009-03-24
US7846679B2 (en) 2010-12-07
NZ335945A (en) 2000-09-29
JP4504463B2 (ja) 2010-07-14
CA2219214A1 (en) 1996-10-31
DK0826042T3 (da) 2008-11-24
DE69637649D1 (de) 2008-10-02
BR9608140A (pt) 1999-12-07
EP0826042B1 (en) 2008-08-20
EP2000479A1 (en) 2008-12-10
NO974964L (no) 1997-12-29
US20050214837A1 (en) 2005-09-29
ES2314979T3 (es) 2009-03-16
AU5394096A (en) 1996-11-18
US7838247B2 (en) 2010-11-23
US6117978A (en) 2000-09-12
US20080286813A1 (en) 2008-11-20
US5840540A (en) 1998-11-24
JP2007297407A (ja) 2007-11-15
SK145397A3 (en) 1998-09-09
PL185549B1 (pl) 2003-05-30
US20090191650A1 (en) 2009-07-30
US6395960B1 (en) 2002-05-28
PL323109A1 (en) 1998-03-16
US6485911B1 (en) 2002-11-26
HUP9801639A2 (hu) 1998-10-28
JP2013107890A (ja) 2013-06-06
KR19990008181A (ko) 1999-01-25
US6194153B1 (en) 2001-02-27
JPH11504214A (ja) 1999-04-20
MX9708270A (es) 1998-06-28
US5986054A (en) 1999-11-16
WO1996034099A2 (en) 1996-10-31
WO1996034099A3 (en) 1996-12-05
NO974964D0 (no) 1997-10-27
AU716307B2 (en) 2000-02-24
JP5053746B2 (ja) 2012-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU716307B2 (en) Genetic sequences and proteins related to alzheimer&#39;s disease, and uses therfor
US6020143A (en) Method for identifying substances that affect the interaction of a presenilin-1-interacting protein with a mammalian presenilin-1 protein
US7309812B2 (en) Perlecan transgenic animals and methods of identifying compounds for the treatment of amyloidoses
EP0914428A2 (en) Genetic sequences and proteins related to alzheimer&#39;s disease, and uses therefor
US6998467B1 (en) Antibody specific for presenilin 1 and method of use thereof
JP5379119B2 (ja) アルツハイマー病に関連する遺伝子配列およびタンパク質、ならびにその使用
HK1126504A (en) Genetic sequences and proteins related to alzheimer&#39;s disease, and uses therefor
CA2257304C (en) Perlecan transgenic animals and methods of identifying compounds for the treatment of amyloidoses
CN1188508A (zh) 与早老性痴呆病有关的基因序列和蛋白及其用途
CA2244412A1 (en) Nucleic acids and proteins related to alzheimer&#39;s disease, and uses therefor

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic