ES2314979T3 - Secuencias geneticas y proteinas relacionadas con la enfermedad de alzheimer, y sus uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE LA IDENTIFICACION, AISLAMIENTO, SECUENCIACION Y CARACTERIZACION DE DOS GENES DE PRESENILINA HUMANA, PS OLLO DE ENFERMEDAD DE ALZHEIMER FAMILIAR. SE IDENTIFICAN ASIMISMO HOMOLOGOS DEL GEN DE LA PRESENILINA EN MAMIFEROS, C. ELEGANS Y D. MELANOGASTER. LOS ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS QUE COMPRENDEN O QUE ESTAN DERIVADOS DE LAS PRESENILINAS SON UTILES EN EL ESCRUTINIO Y DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, EN LA IDENTIFICACION Y DESARROLLO DE TERAPIAS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, Y EN LA PRODUCCION DE LINEAS CELULARES Y ANIMALES TRANSGENICOS UTILES COMO MODELOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Description

Secuencias genéticas y proteínas relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, y usos de las mismas.

Remisión a solicitudes relacionadas

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de EE.UU. No. de serie 08/509.359, presentada el 31 de julio de 1995, que es una continuación en parte de la solicitud de EE.UU. No. de serie 08/496.841, presentada el 28 de junio de 1995, que es una continuación en parte de la solicitud de EE.UU. No. de serie 08/431.048, presentada el 28 de abril de 1995, todas las cuales fueron tituladas GENETIC SEQUENCES AND PROTEINS RELATED TO ALZHEIMER'S DISEASE (Inventores: Peter H. St. George-Hyslop, Johanna M. Rommens and Paul E. Fraser).

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al campo de las disfunciones neurológicas y fisiológicas asociadas a la enfermedad de Alzheimer. Más particularmente, la invención se refiere a la identificación, aislamiento y clonación de genes que están asociados a la enfermedad de Alzheimer, así como sus transcritos, productos génicos, información secuencial asociada, y genes relacionados. La presente invención se refiere también a métodos para detectar y diagnosticar portadores de alelos normales y mutantes de estos genes, a métodos para detectar y diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, a métodos de identificación de genes y proteínas relacionadas o que interaccionan con los genes y proteínas de Alzheimer, a métodos de exploración de potenciales productos terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer, a métodos de tratamiento para la enfermedad de Alzheimer y a líneas celulares y modelos animales útiles para explorar y evaluar terapias potencialmente útiles para la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

Para facilitar la referencia a varios artículos de revistas, se proporciona un listado de los artículos al final de esta memoria descriptiva.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno degenerativo del sistema nervioso central humano caracterizado por el deterioro progresivo de la memoria y el declive cognitivo e intelectual desde la mitad hasta el final de la vida del adulto (Katzman, 1986). La enfermedad está acompañada por una constelación de características neuropatológicas, la principal de las cuales es la presencia de amiloide extracelular o placas seniles y la degeneración neurofibrilar de las neuronas. La etiología de esta enfermedad es compleja, aunque en algunas familias parece ser heredada como rasgo dominante autosomal. Sin embargo, incluso entre estas formas heredadas de AD, hay por lo menos tres genes diferentes que confieren susceptibilidad heredada a esta enfermedad (St. George-Hyslop et al., 1990). El polimorfismo alélico \varepsilon4 (C112R) del gen Apolipoproteina E (ApoE) se ha asociado a AD en una proporción significativa de casos con aparición tardía en la vida (Saunders et al., 1993); Strittmatter et al., 1993). Similarmente, una proporción muy pequeña de casos familiares con aparición antes de la edad de 65 años se han asociado a mutaciones en el gen de la proteína precursora del \beta-amiloide (APP) (Chartier-Harlin et al.,1991; Goate et al., 1991; Murrel et al., 1991; Karlinsky et al., 1992; Mullan et al., 1992). Un tercer lugar (AD3) asociado a una mayor proporción de casos de aparición temprana de AD se ha mapeado recientemente en el cromosoma 14q24.3 (Schellenberg et al., 1992; St. George-Hyslop et al., 1992; Van Broeckhoven et al., 1992).

Aunque la región del cromosoma 14q tiene varios genes que se podrían considerar genes candidatos para el sitio de mutaciones asociadas a AD3 (por ejemplo, cFOS, alfa-1-antiquimotripsina, y catepsina G), la mayor parte de estos genes candidatos se han excluido en base a su situación física fuera de la región AD3 y/o a la ausencia de mutaciones en sus respectivos marcos de lectura abierta (Schellenberg et al., 1992; Van Broeckhoven et al., 1992; Rogaev et al., 1993; Wong et al., 1993).

Ha habido varios desarrollos e indicaciones comerciales o estrategias con respecto al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y su diagnóstico. La solicitud PCT publicada WO 9423049 describe la transfección de ADN de YAC de alto peso molecular en células de ratón específicas. Este método se puede usar para analizar grandes complejos génicos. Por ejemplo, los ratones transgénicos pueden tener dosificación de gen APP incrementada, que imita la condición trisómica que prevalece en el síndrome de Down, y permite la generación de modelos animales con \beta-amiloidosis similar a la prevalente en individuos con enfermedad de Alzheimer. La solicitud internacional publicada WO 94 00569 describe animales no humanos transgénicos que albergan grandes transgenes tales como el transgen que comprende un gen APP humano. Tales modelos animales pueden proporcionar modelos útiles de enfermedades genéticas humanas tales como la enfermedad de Alzheimer.

La solicitud de patente canadiense No. 2096911 describe un ácido nucleico que codifica una proteasa de excisión de APP, que está asociado a la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down. La información genética, que se aisló del cromosoma 19, se puede usar para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. La solicitud de patente canadiense 2071105, describe la detección y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer heredada o adquirida por el uso de secuencias de nucleótidos de YAC. Las YACs se identifican por los números 23CB10, 28CA12 y 26FF3.

La patente de EE.UU. 5.297.562, describe la detección de la enfermedad de Alzheimer asociada a la trisomía del cromosoma 21. El tratamiento incluye métodos para reducir la proliferación de la trisomía del cromosoma 21. La solicitud de patente canadiense No. 2054302 describe anticuerpos monoclonales que reconocen una proteína del núcleo de célula de cerebro humano codificada por el cromosoma 21 y se usan para detectar cambios de expresión debidos a la enfermedad de Alzheimer o al síndrome de Down. El anticuerpo monoclonal es específico de una proteína codificada por el cromosoma 21 humano y se encuentra en grandes células piramidales de tejido cerebral humano.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en la identificación, aislamiento, clonación y secuenciación de dos genes de mamífero que han sido designados presenilina-1 (PS1) y presenilina-2 (PS2). Estos dos genes, y sus correspondientes productos proteínicos, son miembros de una familia de genes muy conservada, las presenilinas, con homólogos u ortólogos en otras especies de mamífero (por ejemplo, ratones, ratas) así como ortólogos en especies de invertebrados (por ejemplo, C. elegans, D. melanogaster). Las mutaciones en estos genes se han relacionado con el desarrollo en seres humanos de formas de la enfermedad de Alzheimer familiar y pueden ser las causantes de otros trastornos también (por ejemplo, otros trastornos cognitivos, intelectuales, neurológicos o psicológicos tales como hemorragia cerebral, esquizofrenia, depresión, retraso mental y epilepsia). La presente descripción proporciona secuencias genómicas y de nucleótidos de cADN para genes PS1 humano (hPS1) y PS2 humano (hPS2), un homólogo murino de PS1 (mPS1) y genes relacionados de C. elegans (sel-12, SPE-4) y D. melanogaster (DmPS). La descripción también proporciona las secuencias de aminoácido previstas de las proteínas presenilina codificadas por estos genes y una caracterización estructural de las presenilinas, incluyendo supuestos dominios funcionales y determinantes antigénicos. Varias mutaciones en las presenilinas que son las causantes de la enfermedad de Alzheimer (AD) en seres humanos se describen también y se relacionan con los dominios funcionales de las proteínas.

De este modo, en una serie de realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que incluyen secuencias de nucleótidos que comprenden o se derivan de genes de presenilina y/o codifican polipéptidos que comprenden o se derivan de las proteínas presenilina y son como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las secuencias de presenilina de la invención incluyen las secuencias específicamente descritas, variantes de corte y empalme de estas secuencias, variantes alélicas de estas secuencias, secuencias sinónimas, y variantes homólogas u ortólogas de estas secuencias como se incluyen en las reivindicaciones adjuntas. De este modo, por ejemplo, la invención proporciona secuencias genómicas y de cADN del gen hPS1, del gen hPS2, del gen mPS1, y del gen DmPS. La presente invención también proporciona variantes alélicas y secuencias homólogas u ortólogas proporcionando métodos por los que se pueden obtener rutinariamente tales variantes. La presente invención también proporciona específicamente variantes mutantes o causantes de enfermedades de las presenilinas describiendo varias secuencias mutantes específicas y proporcionando métodos por los que se pueden obtener rutinariamente otras de tales variantes. Debido a que los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar en varias aplicaciones terapéuticas, recombinantes y de diagnóstico, se proporcionan también varios subconjuntos de las secuencias de presenilina y combinaciones de las secuencias de presenilina con secuencias de heterólogos. Por ejemplo, para su uso en exploración de hibridación específica de alelos o técnicas de amplificación por PCR, se proporcionan subconjuntos de las secuencias de presenilina, que incluyen secuencias tanto sentido como antisentido, secuencias tanto normales como mutantes, así como secuencias intrónicas, exónicas y sin trasladar. Tal como se describe aquí, tales secuencias pueden comprender un pequeño número de nucleótidos consecutivos de las secuencias que se describen o si no facilitan aquí pero preferentemente incluyen por lo menos 8-10, y más preferentemente 9-25, nucleótidos consecutivos de una secuencia de presenilina. Otros subconjuntos preferidos de las secuencias de presenilina incluyen aquellos que codifican uno o más de los dominios funcionales o determinantes antigénicos de las proteínas presenilina y, en particular, pueden incluir secuencias normales (wild-type) o secuencias mutantes como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona también varias construcciones de ácido nucleico en las que las secuencias de presenilina, completas o subconjuntos, se unen funcionalmente a secuencias exógenas para formar vectores de clonación, vectores de expresión, vectores de fusión, construcciones transgénicas, y similares. De este modo, según otro aspecto de la invención, se proporciona un vector recombinante para transformar una célula de tejido de mamífero o invertebrado para que exprese una secuencia de presenilina normal o mutante en las células.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona células hospedantes que se han transfectado o si no transformado con uno de los ácidos nucleicos de la invención. Las células se pueden transformar meramente con el propósito de propagar las construcciones de ácido nucleico de la invención, o se pueden transformar para expresar las secuencias de presenilina. Las células transformadas de la invención se pueden usar en ensayos para identificar proteínas y/u otros compuestos que afectan a la expresión de la presenilina normal o mutante, y/o que modulan la función o efectos de las proteínas normales o mutantes, o para producir las proteínas presenilina, proteínas de fusión, dominios funcionales, determinantes antigénicos, y/o anticuerpos de la invención. Las células transformadas se pueden implantar también en hospedantes, incluyendo seres humanos, por razones terapéuticas u otras razones. Las células hospedantes preferidas incluyen células de mamífero de cultivos celulares neuronales, de fibroblastos, médula ósea, bazo, organotípicos o mixtos, así como células bacterianas, de levaduras, nematodos, insectos y de otros invertebrados. Para usos como se describe a continuación, las células preferidas incluyen también células madre embriónicas no humanas, cigotos no humanos, gametos no humanos, y líneas celulares germinales no humanas.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona modelos animales no humanos transgénicos para AD y otras enfermedades o trastornos asociados a mutaciones en los genes de presenilina. El animal puede ser esencialmente cualquier mamífero no humano, que incluye ratas, ratones, hámsters, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos, y primates no humanos. Además, se pueden usar para ciertas aplicaciones modelos invertebrados que incluyen nematodos e insectos. Los modelos animales se producen por métodos transgénicos estándar que incluyen microinyección, transfección, u otras formas de transformación de células madre embriónicas no humanas, cigotos no humanos, gametos no humanos, y líneas celulares germinales no humanas con vectores que incluyen fragmentos genómicos o de cADN, minigenes, vectores de recombinación homólogos, vectores de inserción viral y similares. Los vectores apropiados incluyen virus vaccinia, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, transporte liposomal, virus neuraltrópicos, y virus herpes simple. Los modelos animales se definen en las reivindicaciones adjuntas y pueden incluir secuencias transgénicas que comprenden o se derivan de presenilinas, que incluyen secuencias normales y mutantes, secuencias intrónicas, exónicas y sin traducir, y secuencias que codifican subconjuntos de presenilinas tales como los dominios funcionales. Los principales tipos de modelos animales proporcionados incluyen: (1) Animales en los que un gen de presenilina humana normal se ha introducido recombinantemente en el genoma del animal como gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor endógeno o exógeno, y como minigen o fragmento genómico grande; en los que un gen de presenilina humana normal ha substituido recombinantemente a una o ambas copias del gen de presenilina homólogo del animal por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes; y/o en el que una o ambas copias de uno de los genes de presenilina homólogos del animal se ha "humanizado" recombinantemente por la substitución parcial de secuencias que codifican el homólogo humano por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes. (2) Animales en los que un gen de presenilina humana mutante se ha introducido recombinantemente en el genoma del animal como un gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor endógeno o exógeno, y como un minigen o un fragmento genómico más grande; en los que un gen de presenilina humana mutante ha substituido recombinantemente a una o ambas copias del gen de presenilina homólogo del animal por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes; y/o en el que una o ambas copias de uno de los genes de presenilina homólogos del animal se han "humanizado" recombinantemente por substitución parcial de secuencias que codifican un homólogo humano mutante por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes. (3) Animales en los que una versión mutante de uno de los genes de presenilina de ese animal se ha introducido recombinantemente en el genoma del animal como gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor endógeno o exógeno, y como un minigen o un fragmento genómico grande; y/o en el que una versión mutante de uno de los genes de presenilina de ese animal ha substituido recombinantemente a una o ambas copias del gen de presenilina homólogo del animal por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes. (4) Animales "knock-out" en los que una o ambas copias de uno de los genes de presenilina del animal se han eliminado parcial o completamente por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes, o se han inactivado por la inserción o substitución por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes de secuencias exógenas. En realizaciones preferidas, un modelo de ratón transgénico para AD tiene un transgen que codifica una proteína humana normal PS1 o PS2, una proteína PS1 o PS2 humana o murina mutante, o una proteína PS1 o PS2 murina normal o mutante humanizada.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona preparaciones proteínicas sustancialmente puras que incluyen polipéptidos que comprenden o se derivan de las proteínas presenilinas y son como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las secuencias de proteína presenilina de la invención incluyen las secuencias descritas específicamente, variantes de estas secuencias que son el resultado de corte y empalme alternativo de mARN, variantes alélicas de estas secuencias, y variantes homólogas u ortólogas de estas secuencias tales como se incluyen en las reivindicaciones adjuntas. De este modo, por ejemplo, la invención proporciona secuencias de aminoácidos de la proteína hPS1, la proteína hPS2, la proteína mPS1, y la proteína DmPS. La presente invención también proporciona variantes alélicas y proteínas homólogas u ortólogas proporcionando métodos por los que tales variantes se pueden obtener rutinariamente. La presente invención también proporciona específicamente variantes mutantes o causantes de enfermedades de las presenilinas describiendo varias secuencias mutantes específicas y proporcionando métodos por los cuales se pueden obtener rutinariamente otras de tales variantes. Debido a que las proteínas de la invención se pueden usar en varias aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y recombinantes, se proporcionan también varios subconjuntos de las secuencias de proteína presenilina y combinaciones de las secuencias de proteína presenilina con secuencias heterólogas. Por ejemplo, para uso como inmunogenes o en ensayos de unión, se proporcionan subconjuntos de secuencias de proteína presenilina, que incluyen secuencias tanto normales como mutantes. Tal como se describe aquí, tales secuencias de proteína pueden comprender un pequeño número de restos aminoácido consecutivos de las secuencias que se describen o si no se facilitan aquí pero preferentemente incluyen por lo menos 4-8, y preferentemente por lo menos 9-15 restos aminoácido consecutivos de una secuencia de presenilina. Otros subconjuntos preferidos de las secuencias de proteína presenilina incluyen aquellos que corresponden a uno o más de los dominios funcionales o determinantes antigénicos de las proteínas presenilina y, en particular, pueden incluir secuencias normales (wild-type) o mutantes, como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona también varias construcciones de proteína en las que las secuencias de presenilina, completas o subconjuntos, están unidas a secuencias exógenas para formar proteínas de fusión y similares. Según estas realizaciones, la presente invención proporciona también métodos para producir todas las proteínas anteriormente descritas que comprenden, o se derivan de las presenilinas.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona la producción y uso de anticuerpos monoclonales y policlonales, incluyendo fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos de Fab, F(ab')_{2}, y fragmentos de anticuerpo de una sola cadena, que se unen selectivamente a las presenilinas, o determinantes antigénicos específicos de las presenilinas. Los anticuerpos se pueden generar en ratón, conejo, cabra u otros animales apropiados, o se pueden producir recombinantemente en células cultivadas tales como líneas celulares de hibridoma. Preferentemente, los anticuerpos se generan contra secuencias de presenilina que comprenden por lo menos 4-8, y preferentemente por lo menos 9-15 restos aminoácido consecutivos de una secuencia de presenilina. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en las distintas aplicaciones técnicas, terapéuticas y de diagnóstico descritas aquí.

\newpage

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona métodos de exploración o identificación de proteínas, pequeñas moléculas u otros compuestos que son capaces de inducir o inhibir la expresión de los genes de presenilina y proteínas (por ejemplo, PS1 o PS2). Los ensayos se pueden realizar in vitro usando células no transformadas, líneas celulares inmortalizadas, o líneas celulares recombinantes, o in vivo usando los modelos de animal transgénico facilitados aquí. En particular, los ensayos pueden detectar la presencia de la expresión aumentada o disminuida de PS1 o PS2 u otros genes o proteínas relacionadas con presenilina en base a la expresión aumentada o disminuida de mARN, niveles aumentados o disminuidos de productos de proteína relacionada con presenilina, o niveles aumentados o disminuidos de expresión de un gen marcador (por ejemplo, \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, fosfatasa alcalina o luciferasa) unido funcionalmente a una región reguladora 5' de presenilina en una construcción recombinante. Se incuban células que se sabe que expresan una presenilina particular, o se transforman para expresar una presenilina particular, y se añade al medio uno o más compuestos de ensayo. Después de dejar un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 0-72 horas) para que el compuesto induzca o inhiba la expresión de la presenilina, se puede detectar cualquier cambio de los niveles de expresión de una línea base establecida usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente. En realizaciones particularmente preferidas, las células son de una línea celular inmortalizada tal como
neuroblastoma humano, glioblastoma o una línea celular de hibridoma, o son células transformadas de la invención.

En otra series de realizaciones, la presente invención proporciona métodos para identificar proteínas y otros compuestos que se unen, o si no interaccionan directamente con las presenilinas como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las proteínas y compuestos incluirán componentes celulares endógenos que interaccionan con las presenilinas in vivo y que, por lo tanto, proporcionan nuevas dianas para intervenciones farmacéuticas y terapéuticas, así como compuestos recombinantes, sintéticos y si no exógenos que pueden tener capacidad de unirse a presenilina y, por lo tanto, pueden ser candidatos para agentes farmacéuticos. De este modo, en una serie de realizaciones, se pueden explorar lisatos celulares o homogenatos tisulares (por ejemplo, homogenatos de cerebro humano, lisatos de linfocito) para buscar proteínas o otros compuestos que se unen a una de las presenilinas normal o mutante. Alternativamente, se puede explorar cualquiera de varios compuestos exógenos, tanto naturales como sintéticos (por ejemplo, bibliotecas de pequeñas moléculas o péptidos) para ver la capacidad de unión a presenilina. En cada una de estas realizaciones, se realiza un ensayo para detectar la unión entre un "componente de presenilina" y algún otro resto. El "componente de presenilina" en estos ensayos puede ser cualquier polipéptido que comprende o derivado de una proteína presenilina normal o mutante, incluyendo dominios funcionales o determinantes antigénicos de las presenilinas, o proteínas de fusión de presenilina. La unión se puede detectar por medidas no específicas (por ejemplo, cambios en el Ca^{2+} intracelular, relación GTP/GDP) o por medidas específicas (por ejemplo, cambios en la producción de péptido A\beta o cambios en la expresión de otros genes aguas abajo que se pueden controlar por visualización diferencial, electroforesis en gel en 2D, hibridación diferencial, o métodos SAGE). Los métodos preferidos implican variaciones de las siguientes técnicas: (1) extracción directa por cromatografía de afinidad; (2) co-aislamiento de componentes de presenilina y proteínas unidas u otros compuestos por inmunoprecipitación; (3) el Ensayo de Interacción Biomolecular (BIAcore); y (4) los sistemas de dos híbridos de levadura.

En otra series de realizaciones, la presente invención proporciona métodos para identificar proteínas, pequeñas moléculas y otros compuestos capaces de modular la actividad de presenilinas normales o mutantes como se define en las reivindicaciones adjuntas. Usando células o animales normales, las células transformadas, o células obtenidas de sujetos que tienen genes de presenilina normales o mutantes, la presente invención proporciona métodos para identificar tales compuestos en base a su capacidad para afectar a la expresión de las presenilinas, la localización intracelular de las presenilinas, los niveles o el metabolismo de Ca^{2+}, Na^{+}, K^{+} u otros iones, la aparición o velocidad de apóptosis o muerte celular, los niveles o patrón de producción de péptido A\beta, la presencia o niveles de fosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos, u otros marcadores fisiológicos, histológicos o bioquímicos que distinguen células que tiene secuencias de presenilina normal y mutante. Usando los animales transgénicos de la invención, se proporcionan también métodos para identificar tales compuestos en base a la capacidad de los compuestos para afectar a los fenotipos histológicos, fisiológicos y de comportamiento asociados a mutaciones en las presenilinas.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona métodos para buscar portadores de alelos de presenilina asociados a AD, para el diagnóstico de víctimas de AD, y para la exploración y diagnóstico de demencias seniles y preseniles, enfermedades psiquiátricas tales como esquizofrenia y depresión, y enfermedades neurológicas tales como apoplejía y hemorragia cerebral, que están asociadas a mutaciones en los genes PS1 o PS2. La exploración y/o diagnóstico se puede realizar por métodos basados en los ácidos nucleicos (incluyendo secuencias genómicas y de mARN/cADN), proteínas, y/o anticuerpos descritos y facilitados aquí, que incluyen ensayos funcionales diseñados para detectar el fallo a aumento de la actividad de la presenilina normal y/o la presencia de nuevas actividades específicas conferidas por las presenilinas mutantes. De este modo, se proporcionan exploraciones y diagnósticos basados en las proteínas presenilinas que detectan diferencias entre presenilinas normales y mutantes en movilidad electroforética, en patrones de escisión proteolítica, en relaciones molares de los distintos restos aminoácido, en capacidad de unirse a anticuerpos específicos. Además, se proporcionan exploraciones y diagnósticos basados en ácidos nucleicos (gADN, cADN o mARN) que detectan diferencias en secuencias de nucleótidos por secuenciación directa de nucleótidos, hibridación usando oligonucleótidos específicos de alelo, digestión con enzimas de restricción y cartografía (por ejemplo, RFLP, REF-SSCP), movilidad electroforética (por ejemplo, SSCP, DGGE), cartografía por PCR, protección de RNasa, escisión química de errores de emparejamiento, detección mediada por ligasa, y varios otros métodos. Se proporcionan también otros métodos que detectan el anormal procesamiento de PS1, PS2, APP, o alteraciones de proteínas que reaccionan con PS1, PS2 o APP (por ejemplo, anormal fosforilación, glicosilación, glicación amidación o escisión proteolítica) en transcripción, traducción y modificación post-traducción en presenilina; alteraciones en el tráfico intracelular y extracelular de productos génicos; o anormal localización intracelular de las presenilinas. Según estas realizaciones, se proporcionan también kits de diagnóstico que incluirán los reactivos necesarios para las exploraciones diagnósticas anteriormente descritas.

En otra serie de realizaciones, las moléculas de la presente invención se pueden usar en métodos y preparaciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a presenilina tales como AD. Estos métodos y compuestos farmacéuticos están basados en (1) la administración de proteínas PS1 o PS2 normales, (2) terapia génica con genes PS1 o PS2 normales para compensar o reemplazar a los genes mutantes, (3) terapia génica basada en secuencias antisentido para genes PS1 o PS2 mutantes o que desactivan los genes mutantes, (4) terapia génica basada en secuencias que codifican una proteína que bloquea o corrige los efectos perjudiciales de los PS1 o PS2 mutantes, (5) inmunoterapia basada en anticuerpos para proteínas PS1 o PS2 normales y/o mutantes, o (6) pequeñas moléculas (fármacos) que alteran la expresión de PS1 o PS2, bloquean las interacciones anormales entre formas mutantes de PS1 o PS2 y otras proteínas o ligandos, o que si no bloquean la función aberrante de proteínas PS1 o PS2 mutantes alterando la estructura de las proteínas mutantes, mejorando su evacuación metabólica, o inhibiendo su función.

Según otro aspecto de la invención, las proteínas de la invención se pueden usar como puntos de inicio para el diseño racional de fármacos para proporcionar ligandos, fármacos terapéuticos u otros tipos de pequeñas moléculas químicas. Alternativamente, las pequeñas moléculas u otros compuestos identificados por los ensayos de exploración anteriormente descritos pueden servir como compuestos cabezas de serie (lead compounds) en el diseño racional de fármacos.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos particularmente descritas de la presente invención son las numeradas SEQ ID NOs: 1-25. Además, bajo los términos del tratado de Budapest, se han realizado depósitos biológicos de los ácidos nucleicos particulares descritos aquí en la ATTC (Rockville, MD). Estos depósitos incluyen el número de acceso 97124 (depositado el 28 de abril, 1995), número de acceso 97508 (depositado el 28 de abril, 1995 ), número de acceso 97124 (depositado el 28 de junio, 1995) y el número de acceso 97428 (depositado el 26 de enero, 1996).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Esta figura es una representación de la organización estructural del ADN genómico de hPS1. Los exones que no codifican se representan por medio de cajas rellenas sombreadas. Los exones que codifican se representan por medio de cajas vacías o cajas sombreadas con rayas para secuencias alternativamente cortadas y empalmadas. Los sitios de restricción son: B=BamHI; E=EcoRI; H=HindIII; N=NotI; P=PstI; V=PvuII; X=XbaI. Las discontinuidades en la línea horizontal entre los sitios de restricción representan secuencias genómicas indefinidas. Los fragmentos genómicos clonados que contienen cada exón se representan por flechas horizontales con doble punta. Se proporciona el tamaño de los subclones genómicos y el número de acceso para cada secuencia genómica.

Figura 2: Esta figura es una representación de un gráfico de hidropatía de la supuesta proteína PS1. El gráfico se calculó según el método de Kyte and Doolittle (1982).

Figura 3: Esta figura presenta una alineación de secuencias de las secuencias de proteína hPS1 y mPS1. Las barras verticales indican idénticos aminoácidos.

Figura 4: Esta figura presenta una alineación de secuencias de las secuencias de proteína hPS1 y hPS2. Las barras verticales indican idénticos aminoácidos.

Figura 5: Esta figura es un dibujo esquemático de la estructura prevista de la proteína PS1. Los números romanos representan los dominios transmembrana. Los sitios de supuesta glicosilación están indicados como asteriscos y la mayor parte de los sitios de fosforilación están localizados en el mismo lado de la membrana que los dos bucles hidrófilos ácidos. El sitio de la MAP quinasa está presente en el resto 115 y el sitio PKC en el resto 114. Los sitios de mutación FAD están indicados por flechas horizontales.

Figura 6: Esta figura es un dibujo esquemático de la estructura prevista de la proteína PS2. Los números romanos representan los dominios transmembrana. Los sitios de supuesta glicosilación están indicados como asteriscos y la mayor parte de los sitios de fosforilación están localizados en la misma cara de la membrana que los dos bucles hidrófilos ácidos. Los sitios de mutación FAD están indicados por flechas horizontales.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Para facilitar la revisión de las distintas realizaciones de la invención, y un entendimiento de los distintos elementos y constituyentes usados para hacer y usar la invención, se proporcionan las siguientes definiciones para los términos particulares usados en la descripción y reivindicaciones adjuntas:

Presenilina. Tal como se usa aquí sin modificación adicional, los términos "presenilina" o "presenilinas" quieren decir los genes/proteínas presenilina-1 (PS1) y/o presenilina-2 (PS2). En particular, los términos sin modificar "presenilina" o "presenilinas" se refieren a genes/proteínas de mamífero PS1 y/o PS2 y, preferentemente, genes/proteínas PS1 o PS2 humanas.

Gen de presenilina-1. Tal como se usa aquí, la expresión "gen de presenilina-1" o "gen de PS1" quiere decir el gen de mamífero primero revelado y descrito en la solicitud de EE.UU. No. de serie 08/431.048, presentada el 28 de abril de 1995, y descrito posteriormente en Sherrington et al. (1995), que incluye cualquier variante alélica y homólogos de mamífero heteroespecíficos. Una secuencia de cADN de presenilina-1 humano (hPS1) se describe aquí como SEQ ID NO: 1. Otra secuencia de cADN humano, que es el resultado del corte y empalme alternativo del transcrito de mARN de hPS1, se describe como SEQ ID NO:3. Se han encontrado también variantes de corte y empalme humanas adicionales, como se describe a continuación, en las que una región que codifica treinta y tres restos se puede desempalmar (spliced-out) en algunos transcritos. Un cADN del homólogo murino (mPS1) se describe como SEQ ID NO: 16. La expresión "gen de presenilina-1" o "gen de PS1" principalmente se refiere a una secuencia de codificación, pero puede incluir también algunas o todas las regiones reguladores que la flanquean y/o intrones. La expresión gen de PS1 incluye específicamente genes recombinantes o artificiales creados de cADN o ADN genómico, incluyendo genes basados en variantes de corte y empalme. Al gen de presenilina-1 se le ha denominado también gen S182 (por ejemplo, Sherrington et al., 1995) o gen de proteína de membrana relacionado con Alzheimer (ARMP) (por ejemplo, Solicitud de EE.UU. No de serie 08/431.048, presentada el 28 de abril de 1995).

Proteína presenilina-1. Tal como se usa aquí, la expresión "proteína presenilina-1" o "proteína PS1" quiere decir una proteína codificada por un gen de PS1, incluyendo las variantes alélicas y homólogos de mamífero heteroespecíficos. Una secuencia de proteína presenilina-1 humana (hPS1) se describe aquí como SEQ ID NO: 2. Otra secuencia de proteína PS1 humana, que es el resultado del corte y empalme alternativo del transcrito de mARN hPS1, se describe como SEQ ID NO: 4. Se han encontrado también variantes de corte y empalme humanas adicionales, como se describe a continuación, en las que una región que incluye treinta y tres restos se puede desempalmar en algunos transcritos. Estas variantes también están incluidas en la expresión proteína presenilina-1 tal como se usa aquí. Una secuencia de proteína del homólogo murino (mPS1) se describe como SEQ ID NO: 17. La proteína se puede producir por células u organismos recombinantes, se puede purificar sustancialmente de tejidos o líneas celulares naturales, o se puede sintetizar química o enzimáticamente. Por lo tanto, la expresión "proteína presenilina-1" o "proteína PS1" se desea que incluya la proteína en formas glicosiladas, parcialmente glicosiladas o sin glicosilar, así como en formas sulfatadas, parcialmente sulfatadas o sin sulfatar. La expresión incluye también variantes alélicas y otros equivalentes funcionales de la secuencia de aminoácidos de PS1, incluyendo fragmentos proteolíticos biológicamente activos o otros fragmentos. Esta proteína se ha denominado también proteína S182 (por ejemplo, Sherrington et al., 1995) o proteína de membrana relacionada con el Alzheimer (ARMP) (por ejemplo, solicitud de EE.UU. No. de serie 08/431.048, presentada el 28 de abril de 1995).

Gen y/o proteína hPS1. Tal como se usa aquí, la abreviatura "hPS1" se refiere al homólogo humano y variantes alélicos humanos del gen y/o proteína PS1. Dos secuencias de cADN del gen PS1 humano se describen aquí como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3. Las correspondientes secuencias de proteína hPS1 se describen aquí como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. Numerosas variantes alélicas, que incluyen mutantes perjudiciales, se describen y facilitan en toda la descripción a continuación.

Gen y/o proteína mPS1. Tal como se usa aquí, la abreviatura "mPS1" se refiere a los homólogos murinos y variantes alélicos murinos del gen y/o proteína PS1. Una secuencia de cADN del gen PS1 murino se describe aquí como SEQ ID NO:16. La correspondiente secuencia de proteína mPS1 se describe aquí como SEQ ID NO: 17. Las variantes alélicas, que incluyen mutantes perjudiciales, se facilitan en la descripción a continuación.

Gen de presenilina-2. Tal como se usa aquí, la expresión "gen de presenilina-2" o "gen de PS2" quiere decir el gen de mamífero primero revelado y descrito en la solicitud de EE.UU. No. de serie 08/496.841, presentada el 28 de junio de 1995, y descrito posteriormente en Rogaev et al. (1995) y Levy-Lahad et al., (1995), que incluye cualquier variante alélica y homólogos de mamífero heteroespecíficos. Una secuencia de cADN de presenilina-2 humana (hPS2) se describe aquí como SEQ ID NO: 18. Se han encontrado también variantes de corte y empalme humanas adicionales, como se describe a continuación, en las que un solo codón o una región que codifica treinta y tres restos se puede desempalmar en algunos transcritos. La expresión "gen de presenilina-2" o "gen de PS2" principalmente se refiere a una secuencia de codificación, pero puede incluir también algunas o todas las regiones reguladoras que la flanquean y/o intrones. La expresión gen de PS2 incluye específicamente genes recombinantes o artificiales creados de cADN o ADN genómico, incluyendo genes recombinantes basados en variantes de corte y empalme. Al gen de presenilina-2 se le ha denominado también gen E5-1 (por ejemplo, Rogaev et al., 1995; Solicitud de EE.UU. No. de serie 08/496.841, presentada el 28 de abril de 1995) o el gen STM2 (por ejemplo, Levy-Lahad et al., 1995).

Proteína presenilina-2. Tal como se usa aquí, la expresión "proteína presenilina-2" o "proteína PS2" quiere decir una proteína codificada por un gen de PS2, incluyendo las variantes alélicas y homólogos de mamífero heteroespecíficos. Una secuencia de proteína presenilina-2 humana (hPS2) se describe aquí como SEQ ID NO: 19. Se han encontrado también variantes de corte y empalme humanas adicionales, como se describe a continuación, en las que un solo resto o una región que incluye treinta y tres restos se puede desempalmar en algunos transcritos. Estas variantes también están incluidas en la expresión proteína presenilina-2 tal como se usa aquí. La proteína se puede producir por células u organismos recombinantes, se puede purificar sustancialmente de tejidos o líneas celulares naturales, o se puede sintetizar química o enzimáticamente. Por lo tanto, la expresión "proteína presenilina-2" o "proteína PS2" se desea que incluya la proteína en formas glicosiladas, parcialmente glicosiladas o sin glicosilar, así como en formas fosforilada, parcialmente fosforilada, sin fosforilar, sulfatada, parcialmente sulfatada o sin sulfatar. La expresión incluye también variantes alélicas y otros equivalentes funcionales de la secuencia de aminoácidos de PS2, incluyendo fragmentos proteolíticos biológicamente activos o otros fragmentos. Esta proteína se ha denominado también proteína E5-1 (por ejemplo, Sherrington et al., 1995); solicitud de EE.UU. No. de serie 08/496.841, presentada el 28 de junio de 1995) o proteína STM2 (por ejemplo, Levy-Lahad et al., 1995).

Gen y/o proteína hPS2. Tal como se usa aquí, la abreviatura "hPS2" se refiere al homólogo humano y variantes alélicos humanos del gen y/o proteína PS2. Una secuencia de cADN del gen PS2 humano se describe aquí como SEQ ID NO:18. La correspondiente secuencia de proteína hPS2 se describe aquí como SEQ ID NO: 19. Numerosas variantes alélicas, que incluyen mutantes perjudiciales, se describen y facilitan en toda la descripción a continuación.

Gen y/o proteína DmPS. Tal como se usa aquí, la abreviatura "DmPS" se refiere a los homólogos de Drosophila y variantes alélicos de los genes/proteínas PS1 y PS2. Esta definición se entiende que incluye polimorfismos de secuencia de aminoácidos y ácido nucleico en los que las substituciones, inserciones o eliminaciones en el gen o secuencia de proteína no afectan a la función esencial del producto génico. La secuencia de nucleótidos de un cADN del gen DmPS se describe aquí como SEQ ID NO: 20 y la correspondiente secuencia de aminoácidos se describe aquí como SEQ ID NO: 21. Las expresión "gen DmPS" se refiere principalmente a una secuencia de codificación pero puede incluir también algunas o todas las regiones reguladoras que las flanquean y/o intrones.

Normal. Tal como se usa aquí con respecto a genes, el término "normal" se refiere a un gen que codifica una proteína normal. Tal como se usa aquí con respecto a proteínas, el término "normal" quiere decir una proteína que realiza su papel fisiológico usual o normal y que no está asociada a, o es causa de, un estado patógeno. Por lo tanto, tal como se usa aquí, el término "normal" es esencialmente sinónimo del significado usual de la frase "wild type". Para cualquier gen dado, o proteína correspondiente, puede existir una multiplicidad de variantes alélicos normales, ninguno de los cuales está asociado al desarrollo de una condición o estado patógeno. Tales variantes alélicas normales incluyen, pero no están limitadas a, variantes en las que una o más substituciones de nucleótido no da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada.

Mutante. Tal como se usa aquí con respecto a genes, el término "mutante" se refiere a un gen que codifica una proteína mutante. Tal como se usa aquí con respecto a proteínas, el término "mutante" quiere decir una proteína que no realiza su papel fisiológico usual o normal y que está asociada, o causa, una condición o estado patógeno. Por lo tanto, tal como se usa aquí, el término "mutante" es esencialmente sinónimo de los términos "disfuncional", "patógeno", "causante de enfermedades", y "perjudicial". Con respecto a las proteínas y genes de presenilina de la presente invención el término "mutante" se refiere a genes/proteínas de presenilina que tienen una o más substituciones de nucleótido/aminoácido, inserciones y/o eliminaciones que conducen típicamente al desarrollo de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer y/u otros fenotipos heredables relevantes (por ejemplo, hemorragia cerebral, retraso mental, esquizofrenia, psicosis, y depresión) cuando se expresan en seres humanos. Esta definición se entiende que incluye las distintas mutaciones que existen naturalmente, que incluyen pero no están limitadas a las descritas aquí, así como mutaciones sintéticas o recombinantes producidas por la intervención humana. El término "mutante" como se aplica a los genes de presenilina, no se desea que abarque variantes de secuencia que, debido a la degeneración del código genético, codifican proteínas idénticas a las secuencias normales descritas o si no facilitadas aquí; ni se desea que abarque variantes de secuencia que, aunque codifiquen proteínas diferentes, codifican proteínas que son funcionalmente equivalentes a las proteínas presenilina normales.

Equivalente funcional. Tal como se usa aquí al describir secuencias de genes y secuencias de aminoácidos, la expresión "equivalente funcional" quiere decir que una secuencia citada no necesita ser idéntica a una secuencia particularmente descrita de los SEQ ID NOs sino que solo necesita proporcionar una secuencia que funcione biológicamente y/o químicamente como el equivalente de la secuencia descrita.

Sustancialmente pura. Tal como se usa aquí con respecto a proteínas (incluyendo anticuerpos) o otras preparaciones, la expresión "sustancialmente pura" quiere decir una preparación que es por lo menos 60% en peso (peso en seco) del compuesto de interés. Preferentemente la preparación es por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 90%, y lo más preferentemente por lo menos 99%, en peso del compuesto de interés. La pureza se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel, o análisis por HPLC.

Con respecto a las proteínas, incluyendo los anticuerpos, si una preparación incluye dos o más compuestos de interés (por ejemplo, dos o más diferentes anticuerpos, inmunogenes, dominios funcionales u otros polipéptidos de la invención), una preparación "sustancialmente pura" quiere decir una preparación en la que el peso total (peso en seco) de todos los compuestos de interés es por lo menos 60% del peso seco total. Similarmente, para tales preparaciones que contienen dos o más compuestos de interés, se prefiere que el peso total de los compuestos de interés sea por lo menos 75%, más preferentemente por lo menos 90%, y lo más preferentemente por lo menos 99%, del peso seco total de la preparación.

Ácido nucleico aislado. Tal como se usa aquí, un "ácido nucléico aislado" es un ácido ribonucléico, ácido desoxiribonucléico o análogo de ácido nucléico que comprende una secuencia de polinucleótido que se ha aislado o separado de secuencias que están inmediatamente contiguas (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del que se deriva. La expresión por lo tanto incluye, por ejemplo, un ácido nucléico recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus que se replica autónomamente o en el ADN genómico de un procariota o eucariota; o que existe en forma de molécula separada (por ejemplo, un cADN o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias de polipéptido adicional y/o que incluye elementos reguladores exógenos.

Secuencia sustancialmente idéntica. Tal como se usa aquí, una secuencia de aminoácidos "sustancialmente idéntica" es una secuencia de aminoácidos que difiere solo en substituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo, la substitución de un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, valina por glicina, arginina por lisina, etc.) o por una o más substituciones no conservativas, eliminaciones, o inserciones localizadas en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no destruyen la función de la proteína (ensayada, por ejemplo, como se describe aquí). Preferentemente, tal secuencia es por lo menos 85%, más preferentemente 90%, y lo más preferentemente 95% idéntica a nivel de aminoácidos a la secuencia de la proteína o péptido con el que se está comparando. Para ácidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparación generalmente será de por lo menos 50 nucleótidos, preferentemente por lo menos 60 nucleótidos, más preferentemente por lo menos 75 nucleótidos, y lo más preferentemente 110 nucleótidos. Una secuencia de ácido nucléico "sustancialmente idéntica" codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica como se define anteriormente.

Célula transformada. Tal como se usa aquí, una "célula transformada" es una célula dentro de la que (o dentro de un ancestro de la que) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, una molécula de ácido nucléico de interés. El ácido nucléico de interés típicamente codificará un péptido o proteína. La célula transformada puede expresar la secuencia de interés o se puede usar solo para propagar la secuencia. El término "transformada" se puede usar aquí para abarcar cualquier método para introducir ácidos nucleicos exógenos que incluye, pero no está limitado a, transformación, transfección, electroporación, microinyección, transfección mediada por virus, y similares.

Funcionalmente unida. Tal como se usa aquí, una secuencia de codificación y una región reguladora se dice que están "funcionalmente unidas" cuando están covalentemente unidas de tal modo como para colocar la expresión o transcripción de la secuencia de codificación bajo la influencia o control de la región reguladora. Si se desea que las secuencias de codificación se traduzcan a una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están funcionalmente unidas si la inducción de la función del promotor da como resultado la transcripción de la secuencia de codificación y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región reguladora para dirigir la transcripción de las secuencias de codificación, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente de ser traducido a una proteína. De este modo, una región reguladora estaría funcionalmente unida a una secuencia de codificación si la región reguladora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de tal modo que la transcripción resultante se pudiera traducir a la proteína o polipéptido deseado.

Condiciones severas de hibridación. Las condiciones severas de hibridación es una expresión de la técnica entendida por los de experiencia media en la técnica. Para cualquier secuencia de ácido nucléico dada, las condiciones severas de hibridación son aquellas condiciones de temperatura, ácidos caotrópicos, tampón, y fuerza iónica que permitirán la hibridación de esa secuencia de ácido nucleico a su secuencia complementaria y no a secuencias sustancialmente diferentes. Las condiciones exactas que constituyen condiciones "severas", dependen de la naturaleza de la secuencia de ácido nucléico, la longitud de la secuencia, y la frecuencia de aparición de subconjuntos de esa secuencia dentro de otras secuencias no idénticas. Variando las condiciones de hibridación de un nivel de severidad al que ocurre la hibridación no específica hasta un nivel en el que solo se observa la hibridación específica, uno de experiencia media en la técnica puede, sin excesiva experimentación, determinar condiciones que permitirán a una secuencia dada hibridarse solo con secuencias complementarias. Los intervalos apropiados de tales condiciones de severidad se describen en Krause and Aaronson (1991). Las condiciones de hibridación, dependiendo de la longitud y uniformidad de una secuencia, pueden incluir temperaturas de 20ºC-65ºC y fuerzas iónicas de 5x a 0,1x SSC. Las condiciones de hibridación muy severas pueden incluir temperaturas tan bajas como 40-42ºC (cuando se incluyen desnaturalizantes tales como formamida) o hasta 60-65ºC en fuerzas iónicas tan bajas como 0,1x SSC. Estos intervalos, sin embargo, son solo ilustrativos y, dependiendo de la naturaleza de la secuencia diana, y posibles desarrollos tecnológicos futuros, pueden ser más severas de lo necesario. Se emplean condiciones menos que severas para aislar secuencias de ácido nucléico que son sustancialmente similares, alélicas u homólogas a cualquier secuencia dada.

Se une selectivamente. Tal como se usa aquí con respecto a anticuerpos, se dice que un anticuerpo "se une selectivamente" a una diana si el anticuerpo reconoce y se une a la diana de interés pero no reconoce sustancialmente y se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que incluye la diana de interés.

II. Las presenilinas

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de una familia de genes de mamífero que, cuando mutan, están asociados al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. El descubrimiento de estos genes, designados presenilina-1 y presenilina-2, así como las características de estos genes, sus productos proteínicos, mutantes, y posibles roles funcionales, se describe a continuación. Los homólogos de invertebrados de las presenilinas se discuten también ya que pueden arrojar luz sobre la función de las presenilinas y hasta que punto pueden ser útiles en las distintas realizaciones descritas a continuación.

1. Aislamiento del gen presenilina-1 humano A. Cartografía genético de la región AD3

El aislamiento inicial y caracterización del gen PS1, denominado entonces gen AD3 o gen S182, se describió en Sherrington et al. (1995). Después del cartografía regional inicial de lugar del gen AD3 para 14q24.3 cerca de los marcadores de microsatélite anónimo D14S43 y D14S53 (Schellenberg et al., 1992; St. George-Hyslop et al., 1992; Van Broeckhoven et al., 1992), se usaron veintiún linajes para segregar AD como supuesto rasgo dominante autosomal (St. George-Hyslop et al., 1992) y para investigar la segregación de 18 marcadores genéticos adicionales de la región de 14q24.3 que se había organizado en forma de un mapa de unión genética de alta densidad (Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Los análisis de máxima probabilidad de pares publicados previamente confirmaron evidencia acumulativa sustancial de la relación entre la enfermedad de Alzheimer familiar (FAD) y todos estos marcadores. Sin embargo, muchos de los datos genéticos que avalan la relación con estos marcadores se derivaron de seis grandes linajes de aparición temprana, FAD1 (Nee et al., 1983), FAD2 (Frommelt et al., 1991), FAD3 (Goudsmit et al., 1981; Pollen, 1993), FAD4 (Foncin et al., 1985), TOR1.1 (Bergamini, 1991) y 603 (Pericak-Vance et al., 1988), cada uno de los cuales proporciona por lo menos un marcador genético anónimo de 14q24.3 (St. George-Hyslop et al., 1992).

Para definir más precisamente la localización del gen AD3 con relación a las localizaciones conocidas de los marcadores genéticos de 14q24.3, se buscaron puntos de referencia recombinacionales por inspección directa de los datos del haplotipo en bruto de aquellos miembros afectados genotipados de los seis linajes que mostraban relación definitiva con el cromosoma 14. Esta estrategia selectiva en este caso particular necesariamente descarta datos de los genotipos reconstruidos de miembros afectados muertos así como de miembros asintomáticos viejos de los grandes linajes, y no tiene en cuenta los pequeños linajes de estatus incierto de relación. Sin embargo, esta estrategia es muy buena porque evita también la adquisición de datos de genotipo potencialmente engañosos adquiridos por errores en los genotipos reconstruidos de miembros afectados muertos que surgen de la no paternidad o de errores de muestreo o de la inclusión de linajes no relacionados.

Al inspeccionar los datos del haplotipo para los sujetos afectados, los miembros de los seis grandes linajes cuyos genotipos se determinaron directamente revelaron recombinantes obligados en D14S48 y D14S53, y en D14S258 y D14S63. El recombinante único en D14S53, que representa una frontera telomérica para la región FAD, ocurrió en el mismo sujeto afectado de AD del linaje FAD1 que se había encontrado previamente que era recombinante en varios otros marcadores localizados teloméricos a D14S53, incluyendo D14S48 (St. George-Hyslop et al., 1992). A la inversa, el único recombinante en D14S258, que marca una frontera centrómera de la región FAD, ocurrió en un miembro afectado del linaje FAD3 que también era recombinante en varios otros marcadores centrómeros a D14S258 incluyendo D14S63. Ambos sujetos recombinantes tenían evidencia inequívoca de enfermedad de Alzheimer confirmada por ensayos clínicos estándar de la enfermedad en otros miembros afectados de sus familias, y el genotipo de ambos sujetos recombinantes era informativo y co-segregante en múltiples lugares dentro del intervalo centrómero a D14S53 y telomérico a D14S258.

Cuando los análisis de haplotipo se ampliaron para incluir los genotipos reconstruidos de miembros afectados muertos de los seis grandes linajes así como datos de los restantes quince linajes con probabilidades de relación de menos de 0,95, se detectaron varios recombinantes adicionales en uno o más lugares marcadores dentro del intervalo entre D14S53 y D14S258. De este modo, se detectó un recombinante adicional en el genotipo reconstruido de un miembro afectado muerto de cada uno de tres de los linajes de FAD más grandes (FAD1, FAD2 y otras familias relacionadas), y se detectaron ocho recombinantes adicionales en miembros afectados de cinco linajes de FAD menores. Sin embargo, aunque algunos de estos recombinantes puedan tener correctamente colocado el gen AD3 dentro de una región diana más definida, fue necesario considerar estos potencialmente más cercanos "recombinantes internos" como no fiables no solo por las razones discutidas anteriormente, sino también porque proporcionaron localizaciones mutuamente inconsistentes para el gen AD3 dentro del intervalo D14S53-D14S258.

B. Construcción de un contig físico que abarca la región AD3

Como una etapa inicial hacia la clonación del gen AD3, se construyó un contig de fragmentos de ADN genómico que se solapan clonados en vectores de cromosoma artificial de levadura, vectores de cromosoma artificial de fago y vectores cósmidos. Los estudios de cartografía FISH usando cósmidos derivados de los clones de YAC 932c7 y 964f5 sugirieron que el intervalo más probable de llevar el gen AD3 era por lo menos de cinco megabases de tamaño. Debido a que el gran tamaño de esta región de mínima co-segregación haría intratables las estrategias de clonación posicional, se buscaron indicadores genéticos adicionales que centraran la búsqueda del gen AD3 en una o más subregiones dentro del intervalo flanqueado por D14S53 y D14S258. Los análisis de haplotipo en los marcadores entre D14S53 y D14S258 no detectaron evidencia estadísticamente significativa de relación de desequilibrio y/o asociación alélica entre los rasgos de FAD y alelos en ninguno de estos marcadores, independientemente de si los análisis fueron restringidos a aquellos linajes con formas de FAD de aparición temprana, o fueron generalizados para incluir todos los linajes. Este resultado no era inesperado dados los diversos orígenes étnicos de nuestros linajes. Sin embargo, cuando se recopilaron linajes de similar descendencia étnica, la inspección directa de los haplotipos observados en los cromosomas que llevan la enfermedad que se segregan en diferentes linajes de similar origen étnico revelaron dos grupos de lugares marcadores. El primero de estos grupos localizado centromérico a D14S77 (D14S786, D14S277 y D14S268) y que abarcaba el intervalo físico de 0,95 Mb contenido en YAC 78842. El segundo grupo estaba localizado telómerico a D14S77 (D14S43, D14S273 y D14S76) y que abarcaba el intervalo físico de \sim 1 Mb incluido dentro de los clones de YAC que se solapan 964c2, 74163, 797d11 y parte de 854f5. Se observaron alelos idénticos en por lo menos dos linajes del mismo origen étnico. Como parte de la estrategia, se razonó que la presencia de alelos compartidos en uno de estos grupos de lugares marcadores físicamente agrupados puede reflejar la co-herencia de una pequeña región física que rodea al gen PS1 en el cromosoma del fundador original en cada población étnica. Significantemente, cada uno de los haplotipos extendidos compartidos era raro en poblaciones caucásicas normales y no se observó la compartición de alelos en otros grupos de marcadores que abarcan similares intervalos genéticos en otra parte del cromosoma 14q24.3.

C. Cartografía de la transcripción y análisis de genes candidatos

Para aislar secuencias expresadas codificadas dentro de ambos intervalos críticos, se usó una estrategia de selección directa que implica ADN genómico humano clonado inmovilizado como diana de hibridación para recuperar secuencias transcritas de mezclas de ADN complementario primario derivadas de mARN de cerebro humano (Rommens et al., 1993). Se recuperaron de estas regiones aproximadamente 900 supuestos fragmentos de cADN de tamaño de 100 a 600 pares de bases. Estos fragmentos se hibridaron a Southern blots que contienen ADNs genómicos de cada uno de los clones de YAC solapantes y ADNs genómicos de seres humanos y otros mamíferos. Esto identificó un subconjunto de 151 clones que mostraron evidencia de conservación evolutiva y/o de una estructura compleja que sugería que se derivaban de mARN empalmado. Los clones dentro de este subconjunto se recopilaron en base a su localización física en el mapa, hibridación cruzada y secuencia de nucleótidos, y se usaron para explorar bibliotecas de cADN de cerebro humano convencional para buscar cADNs más largos. Se aislaron por lo menos 19 clones de cADN independientes de alrededor de 1 kb de longitud y a continuación se alinearon en un mapa de transcripción parcial de la región AD3. Solo tres de estos transcritos correspondían a genes caracterizados conocidos (cFOS, dihidrolipoamida succinil transferasa, y proteína 2 de unión del factor de crecimiento de transformación latente).

D. Recuperación de genes candidatos

Cada una de las porciones del marco de lectura abierta de los genes candidatos se recuperaron por RT-PCR de mARN aislado de tejido de cerebro post-mortem de sujetos de control normales y de tejido de cerebro post-mortem de líneas celulares de fibroblastos cultivados de miembros afectados de seis linajes definitivamente relacionados con el cromosoma 14. Los productos de RT-PCR se exploraron a continuación para buscar diferencias de secuencia usando escisión química y métodos de polimorfismo conformacional de secuencia de cadena sencilla de identificación con endonucleasa de restricción (Saleeba and Cotton, 1993); Liu and Sommer, 1995), y por secuenciación directa de nucleótidos. Con una excepción, todos los genes examinados, aunque de interés, no contenían alteraciones en secuencias que fueran únicas de los sujetos afectados, o co-segregados con la enfermedad. La única excepción era el gen candidato representado por el clon S182 que contenía una serie de cambios de nucleótido no observados en sujetos normales, y que se predijo que alteraban la secuencia de aminoácidos en sujetos afectados. El gen que corresponde a este clon ha sido ahora denominado presenilina-1 (PS1). Dos secuencias de cADN de PS1, que representan las variantes de corte y empalme alternativas descritas a continuación, se describen aquí como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3. Las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes se describen como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Los plásmidos Bluescript que tienen clones de estos cADNs han sido depositados en la ATCC, Rockville, Md, con los números de acceso de la ATCC 97124 y 97508 el 28 de abril de 1995. Las secuencias correspondientes a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 han sido depositadas también en la base de datos GenBank y se pueden recuperar con el número de acceso 42110.

2. Aislamiento del gen presenilina-1 murino

Un homólogo murino (mPS1) del gen PS1 humano se recuperó explorando una biblioteca de cADN de ratón con una sonda de ADN humano marcado del gen hPS1. De esta manera, se recuperaron un transcrito parcial de 2 kb (que representa el extremo 3' del gen) y varios productos de RT-PCR que representan el extremo 5'. La secuenciación del transcrito de cADN de consenso del homólogo murino reveló una identidad sustancial de aminoácidos con hPS1. Importantemente, como se detalla a continuación, todos los aminoácidos que eran mutados en los linajes de FAD se conservaron entre el homólogo murino y la variante humana normal. Esta conservación del gen PS1 indica que existe un gen ortólogo en el ratón (mPS1), y que es posible ahora clonar otros homólogos u ortólogos de mamífero explorando bibliotecas genómicas o de cADN usando sondas de PS1 humano. De este modo, un enfoque similar hará posible identificar y caracterizar el gen PS1 en otras especies. La secuencia del ácido nucléico del clon mPS1 se describe aquí como SEQ ID NO: 16 y la secuencia de aminoácidos correspondiente se describe como SEQ ID NO: 17. Ambas secuencias han sido depositadas en la base de datos GenBank y se pueden recuperar con el número de acceso 42177.

3. Aislamiento del gen presenilina-2 humano

Se ha aislado un segundo gen humano, denominado ahora presenilina-2 (PS2), y se ha demostrado que comparte sustancial homología de nucleótidos y aminoácidos con el gen PS1. El aislamiento inicial de este gen se describe en detalle en Rogaev et al., (1995). El aislamiento del gen PS2 humano (denominado "STM2") por métodos casi idénticos se publica también en Levy-Lahad et al., (1995). Brevemente, el gen PS2 fue identificado usando la secuencia de nucleótidos del cADN para PS1 para buscar bases de datos usando el paradigma BLASTN de Altschul et al., (1990). Se localizaron tres sitios marcados de la secuencia expresada (ESTs) identificados por los números de acceso TO3796, R14600 y R05907 que tenían homología sustancial (p < 1,0 e^{-100}, mayor del 97% de identidad en por lo menos 100 pares de bases contiguas).

Se produjeron oligonucleótidos iniciadores de estas secuencias y se usaron para generar productos de PCR por PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). Estos cortos productos de RT-PCR fueron secuenciados parcialmente para confirmar su identidad con las secuencias dentro de la base de datos y a continuación se usaron como sondas de hibridación para explorar bibliotecas de cADN completo. Se recuperaron varios cADNs diferentes de tamaño de 1 kb a 2,3 kb de una biblioteca de cADN de células de cáncer (Caco2) y de una biblioteca de cADN de cerebro humano (E5-1, G1-1, cc54, cc32). La secuencia de nucleótidos de estos clones confirmó que todos eran derivados del mismo transcrito.

El gen que codifica el transcrito, el gen PS2, se mapeó en el cromosoma 1 humano usando paneles de cartografía híbridos para dos grupos de clones Mega YAG del CEPH que se han colocado sobre un mapa físico (contig) (clones de YAC 750g7, 921d12 mapeado por FISH en 1q41; y clon de YAC 787g12 mapeado en 1p36.1-p35). La secuencia del ácido nucléico del clon hPS2 se describe aquí como SEQ ID NO: 18 y la secuencia de aminoácidos correspondiente se describe como SEQ ID NO: 19. Ambas secuencias han sido depositadas en la base de datos GenBank y se pueden recuperar con el número de acceso L44577. La secuencia de ADN del clon hPS2 también ha sido incorporada en un vector y depositada en la ATCC, Rockville, MD, con el número de acceso de la ATCC 97214 el 28 de junio de 1995.

4. Identificación de homólogos en C. elegans y D. melanogaster A. SPE-4 de C. elegans

La comparación de las secuencias del ácido nucléico y de aminoácidos previstos de PS1 con las bases de datos disponibles usando los paradigmas de alineación BLAST reveló una modesta similaridad de aminoácidos con la proteína integral de membrana de esperma de C. elegans SPE-4 (P = 1,5 e^{-25}, 24-37% de identidad en tres grupos de por lo menos 50 restos) y similaridad más débil con porciones de varias otras proteínas transmembrana que incluyen cromogranina A de mamífero y la subunidad alfa de canales de calcio de mamífero dependientes del voltaje (Altschul et al., 1990). Las similaridades de la secuencia de aminoácidos por todos los supuestos dominios transmembrana pueden dar ocasionalmente una alineación que surge simplemente del número limitado de aminoácidos hidrófobos, pero también hay alineamiento de la secuencia extendida entre PS1 y SPE-4 en varios dominios hidrófilos. Se prevé que tanto la supuesta proteína PS1 como la SPE-4 son de tamaño comparativo (467 y 465 restos, respectivamente) y, como se describe más completamente a continuación, contienen por lo menos siete dominios transmembrana con un gran dominio ácido que precede al dominio transmembrana previsto final. La proteína PS1 no tiene una región hidrófila predicha más larga en el N-terminal.

Los análisis de alineamiento BLASTP también detectaron homología significativa entre PS2 y la proteína SPE-4 de C. elegans (p = 3,5 e^{-26}; identidad = 20-63% en cinco dominios de por lo menos 22 restos), y homologías débiles con los canales de sodio del cerebro (subunidad alfa III) y con la subunidad alfa de los canales de calcio dependientes del voltaje de varias especies (p = 0,02; identidades 20-28% en dos o más dominios cada uno de por lo menos 35 restos) (Altschul, 1990). Estos alineamientos son similares a los descritos anteriormente para el gen PS1.

B. Sel-12 de C. elegans

Se encontró que la proteína Sel-12 de 461 restos de C. elegans y S182 (SEQ ID NO: 2) compartían el 48% de identidad de secuencia en 460 aminoácidos (Levitan and Greenwald, 1995). Se cree también que la proteína Sel-12 tiene múltiples dominios transmembrana. El gen sel-12 (número de acceso U35660) se identificó explorando para buscar supresores de una mutación de la ganancia de función en lín-12, y se clonó por "transformation rescue" (Levitan and Greenwald, 1995).

C. DmPS de D. melanogaster

Se prepararon oligonucleótidos redundantes que codifican regiones muy conservadas de las proteínas presenilina/sel 12 y se usaron para identificar mARNs relevantes de D. melanogaster embriónico y adulto. Estos mARNs se secuenciaron y se mostró que contenían un marco de lectura abierta con una supuesta secuencia de aminoácidos altamente homóloga a la de las presenilinas humanas. El cADN de DmPS se identifica como SEQ ID NO: 20.

Esta secuencia codifica un polipéptido de 541 aminoácidos (SEQ ID NO: 21) con alrededor de 52% de identidad a las presenilinas humanas.

La estructura del homólogo de D. melanogaster es similar a la de las presenilinas humanas con por lo menos siete supuestos dominios transmembrana (análisis de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle usando una ventana de 15 y corte de 1,5). Se detectó evidencia de por lo menos una forma de corte y empalme alternativa en la que el clon pds13 contenía un ORF de 541 aminoácidos, mientras que los clones pds7, pds14 y pds1 carecían de nucleótidos 1300-1341 inclusive. Este corte y empalme alternativo daría como resultado la alteración de Gly a Ala en el resto 384 en el supuesto bucle TM6\rightarrow7, y una fusión sin cambio de marco de lectura al resto Glu en el codón 399 del ORF más largo. Las diferencias principales entre la secuencia de aminoácidos de los genes humano y de D. melanogaster estaban en el dominio hidrófilo del ácido N-terminal y en la porción hidrófila ácida del bucle TM6\rightarrow7. Los restos que rodean al bucle TM6\rightarrow7 se conservan especialmente (restos 220-313 y 451-524), sugiriendo que estos son dominios funcionalmente importantes. Dieciséis de los veinte restos identificados que habían mutado en PS1 o PS2 y que daban lugar a la FAD humana se conservan en el homólogo de D. melanogaster.

La secuencia de ADN del gen DmPS tal como se clona se ha incorporado en un plásmido Bluescript. Este vector estable se depositó en la ATCC, Rockville, MD, con el número de acceso de la ATCC 97428 el 26 de enero de 1996.

5. Caracterización de los genes de presenilina humana A. Transcritos hPS1 y estructura génica

La hibridación del clon PS1 (S182) con Northern blots identificó un transcrito expresado ampliamente en muchas áreas del cerebro y tejidos periféricos como un transcrito mayor de \sim2,8 kb y un transcrito menor \sim de 7,5 kb (véase, por ejemplo, la Figura 2 en Sherrington et al., 1995). El PS1 se expresa bastante uniformemente en la mayor parte de las regiones del cerebro y en la mayor parte de los tejidos periféricos excepto el hígado, donde la transcripción es lenta. Aunque la identidad del transcrito de \sim 7,5 kb no es clara, dos observaciones sugieren que el transcrito de \sim2,8 kb representa un producto activo del gen. La hibridación del clon PS1 con Northern blots que contienen mARN de varios tejidos murinos, incluyendo cerebro, identifica solo un único transcrito idéntico en tamaño al transcrito humano de \sim 2,8 kb. Todos los clones de cADN más largos recuperados hasta la fecha (2,6-2,8 kb), que incluyen UTRs tanto 5' como 3' y que dan cuenta de la banda de \sim 2,8 kb sobre el Northern blot, se han mapeado exclusivamente a la misma región física del cromosoma 14.

De estos experimentos el transcrito de \sim 7,5 kb podría representar una rara isoforma poliadenilada o alternativamente cortada y empalmada del transcrito de \sim 2,8 kb, o podría representar otro gen con homología al PS1. Se exploró una biblioteca de cADN de la línea celular Caco2 que expresa altos niveles tanto de PS1 como PS2 para buscar transcritos largos. Se obtuvieron dos clones diferentes, GL40 y B53. La secuenciación reveló que ambos clones contenían un UTR 5' similar y un ORF que era idéntico al de los transcritos de 2,8 kb más cortos en el cerebro.

Ambos clones contenían una inusualmente larga UTR 3' Esta larga UTR 3' representa el uso de un lugar de poliadenilación alterno aproximadamente 3 kb mas aguas abajo. Esta UTR 3' contiene varios motivos de secuencia de nucleótidos que dan como resultado palíndromos o estructuras tallo-bucle. Estas estructuras están asociadas a la estabilidad del mARN y también a la eficiencia de traducción. La utilidad de esta observación es que puede ser posible crear construcciones de expresión recombinantes y/o transgenes en los que se extirpa el sitio de poliadenilación aguas arriba, forzando por ello el uso del sitio de poliadenilación aguas abajo y la UTR 3' más larga. En ciertos casos, esto puede promover la estabilidad de especies de mARN seleccionadas, con traducción preferencial que se podría utilizar para alterar el balance de transcritos mutantes frente a los naturales en líneas celulares usadas como diana. Tales construcciones y/o transgenes pueden ser para uso in vivo en el cerebro, por ejemplo, por el uso de vectores virales tales como vectores de virus de herpes simplex modificado como una forma de terapia
génica.

El gen hPS1 abarca un intervalo genómico de por lo menos 60 kb dentro de un clon PAC1 de 200 kb RPCI-1 54D12 del la biblioteca Roswell Park PAC y tres clones cósmidos solapantes 57-H10, 1-G9 y 24-D5 de la biblioteca de cósmidos del cromosoma 14 de Los Alamos. Los transcritos del gen PS1 contienen ARN de 13 exones que se identificaron por hibridación reiterativa de oligonucleótido y sondas de cADN parcial a fragmentos de restricción subclonados del PAC y clones cósmidos, y por secuenciación directa del nucleótido de estos subclones. La UTR 5' está contenida dentro de los exones 1-4, representando los exones 1 y 2 extremos 5' alternativos del transcrito. El ORF está contenido en los exones 4 a 13, dando como resultado episodios de corte y empalme alternativo en ausencia de parte del exon 4 o todo el exón 9. El exón 13 también incluye la UTR 3'.

A menos que se diga de otro modo, por motivos de claridad y brevedad, todas las referencias a posiciones de nucleótido en las secuencias de nucleótidos derivadas de hPS1 emplearán la numeración base de la SEQ ID NO:1 (L42110), comenzando una secuencia de cADN de hPS1 con el exon 1. En este cADN, el exón 1 está empalmado directamente al exón 3, que está empalmado a los exones 4-13. En la SEQ ID NO: 1, el exón 1 abarca las posiciones de nucleótido de 1 a 113, el exón 3 abarca las posiciones de 114 a 195, el exón 4 abarca las posiciones de 196 a 335, el exón 5 abarca las posiciones 336 a 586, el exón 6 abarca las posiciones 587 a 728, el exón 7 abarca las posiciones 729 a 796, el exón 8 abarca las posiciones 797 a 1017, el exón 9 abarca las posiciones 1018 a 1116, el exón 10 abarca las posiciones 1117 a 1203, el exón 11 abarca las posiciones 1204 a 1377, el exón 12 abarca las posiciones 1378 a 1496, el exón 13 abarca las posiciones 1497 a 2765. Similarmente, a menos que se diga de otra forma, todas las referencias a posiciones de restos aminoácido en las secuencias de proteína derivada de hPS1 emplearán la numeración de restos de la SEQ ID NO: 2, el producto de traducción de la SEQ ID NO: 1.

Se han obtenido secuencias genómicas flanqueantes para los exones 1-12, y se presentan en las SEQ ID Nos: 5-14 (Números de acceso: L76518-L76527). La secuencia genómica 5' del exón 13 se ha determinado también y se presenta en la SEQ ID NO: 15 (Número de acceso: L76528). Las SEQ ID Nos: 5-14 también incluyen las secuencias del exon completo. La SEQ ID NO: 15, sin embargo, no incluye el extremo 3' de exón 13. Las secuencias genómicas correspondientes a los exones 1 y 2 están localizadas aproximadamente 240 bp (pares de bases) aparte en un fragmento BamHI-HindIII de 2,6 kb, SEQ ID NO: 5. Los exones 3 y 4 (que contienen el codón de inicio ATG) están localizados en un fragmento separado BamHI de 3 kb. La secuencia completa del intrón 2 entre el sitio BamHI \sim 850 bp aguas abajo del exón 2 y el sitio BamHI \sim600 bp aguas arriba del exón 3 no se ha identificado todavía, y no se recuperó inmediatamente por PCR extendida usando iniciadores de los sitios BamHI flanqueantes, lo que implica que el intrón 2 puede ser grande.

El análisis de la secuencia de nucleótidos que rodea los exones 1 y 2 (SEQ ID NO: 5) reveló numerosos dinucleótidos CpG que incluyen un sitio de restricción NotI en el intrón 1. Las secuencias de consenso para varias supuestas proteínas reguladoras transcripcionales que incluyen múltiples grupos de proteína-2 de activador (AP-2), transductores de señal y activadores de transcripción (STAT3) (Schindler and Darnell, 1995), secuencias de activador gamma (GAS o STAT1), elemento de sitio de comienzo múltiple aguas abajo (MED) (Ince and Scotto, 1995), y elementos GC estaban presentes tanto en el intrón 1 como en la secuencia 5' del exón 1 (véase la SEQ ID NO: 5). Existen dos supuestas cajas TATA aguas arriba del exón 1, en el bp 925-933 y 778-987 de la SEQ ID NO: 5, y están seguidas de dos supuestas secuencias de consenso de iniciación (CAP o Chambon-Trifonov) de transcripción en 1002-1007 bp y 1038-1043 bp 484 de la SEQ ID NO: 5. En contraste, las secuencias inmediatamente aguas arriba del exón 2 carecen de cajas TATA o sitios CAP, pero están enriquecidas en grupos de islas de CpG.

Un mapa esquemático de la organización estructural del gen hPS1 se presenta como Figura 1. Los exones no codificantes se representan por cajas macizas sombreadas. Los exones codificantes se representan por cajas vacías o cajas sombreadas con líneas para secuencias alternativamente empalmadas. Los sitios de restricción se indican como: B = BamHI; E = EcoRI; H = HingIII; N = NotI; P = PstI; V = PvuII; X = XbaI. Las discontinuidades en la línea horizontal entre sitios de restricción representan secuencias genómicas sin definir. Los fragmentos genómicos clonados que contienen cada exón se representan por flechas horizontales de extremo doble. Se proporciona también el tamaño de los subclones genómicos y el número de acceso para cada secuencia genómica.

Las predicciones de la estructura secundaria del ADN basadas en la secuencia de nucleótidos dentro de 290 bp aguas arriba del exón 1 y dentro del intrón 1 revelan varios palíndromos con estabilidad mayor de 16 kcal/mol. Estos análisis de estructura secundaria también prevén la presencia de tres motivos estables tallo-bucle (en bp 1119-1129/1214-1224; en bp 1387-1394/1462-1469; y en bp 1422-1429/1508-1515; todos en la SEQ ID NO: 5) con un tamaño de bucle suficiente para englobar un nucleosoma (\sim76 bp). Tales estructuras de tallo-bucle son una característica de los genes que contienen TATA (Kollmar and Farnham, 1993).

Se presenta un resumen de las características en estas regiones 5' en la Tabla 1. Todas las referencias a las posiciones base son relativas a la SEQ ID NO: 5.

El marco de lectura abierta previsto más largo en la SEQ ID NO: 1 codifica una proteína de 467 aminoácidos, SEQ ID NO: 2. El codón de inicio para este marco de lectura abierta es el primer ATG en fase localizado aguas debajo de un codón de parada de TGA. No hay secuencias de consenso Kozak clásicas alrededor de los dos primeros codones ATG en fase (Sherrington et al., 1995). Como otros genes que carecen de codones de inicio "fuertes" clásicos, la supuesta UTR 5' del transcrito humano es rica en GC.

B. Transcripción alternativa y corte y empalme de la UTR 5' de hPS1

Aunque los tres primeros exones y parte del cuarto exon contienen secuencias no traducidas, análisis de clones de cADN completo múltiple aislados de una biblioteca de cADN de hipocampo humano (Stratagene, La Jolla Ca) y de una línea celular de adenocarcinoma de colon (Caco2) revelaron que en la mayoría de los clones las secuencias iniciales se derivaron del exón 1 se empalmaron directamente al exón 3 (número de acceso L42110, SEQ ID NO: 1). Menos frecuentemente (1 de 9 clones), las secuencias iniciales transcritas se derivaron del exón 2 y se empalmaron sobre el exón 3 (número de acceso L76517, SEQ ID NO: 3). La secuenciación directa de nucleótidos de por lo menos 40 transcritos de RT-PCR independientes aislados usando un iniciador en el exón 1 no identificó ningún clon que contiene tanto el exón 1 como el exón 2. Finalmente, la inspección de la secuencia genómica aguas arriba del exón 2 no reveló una secuencia de sitio de corte y empalme 3'. Estas observaciones sostienen que el exón 2 es un verdadero exón inicial en lugar de una forma de corte y empalme alternativo de transcritos que empiezan en el exón 1 o un artefacto de la clonación de cADN. Además, dado que se obtuvo un clon (cc44) que contiene el exón 2 de las mismas líneas celulares Caco2 monoclonales, es posible que tanto el transcrito que contiene el exón 1 como el transcrito que contiene el exón 2 existan en las mismas células. Para ensayar las predicciones acerca de los sitios de iniciación de la transcripción basadas en la secuencia de nucleótidos de la región aguas arriba de 5' cerca del exón 1, examinamos la secuencia del extremo 5' de tres clones de cADN independientes "completos" que contienen exón 1 (cc33, cc58 y cc48) y tres secuencias recuperadas por extensión del iniciador usando un iniciador antisentido localizado en el exón 3. La extensión 5' más lejana se vio en el G40L de cADN, que mapeó el sitio de inicio de la transcripción más próximo a la posición 1214 bp en la secuencia genómica que contiene el exón 1 SEQ ID NO: 5 (L76518), y que por lo tanto corresponde a la posición \sim10 de SEQ ID NO: 1. Dos clones adicionales (cc48 de cADN y el producto de RACE 5' nº 5) compartían un sitio de inicio común en la posición 1259 bp en la secuencia genómica, SEQ ID NO: 5, que corresponde a la posición 34 en SEQ ID NO: 1. Los dos restantes cADNs, así como los restantes clones de RACE 5', comenzaron en posiciones más distantes dentro del exón 1. Un clon 5' de RACE nº 8 comenzó en 1224 bp, igual a la posición 1 de la SEQ ID NO:1. Ninguno de estos clones por lo tanto se extendió hasta el sitio CAP previsto aguas arriba del exón 1. Debido a la baja prevalencia de los transcritos que contienen secuencias iniciales del exón 2, no se realizaron estudios similares de sus sitios de inicio.

C. Corte y empalme alternativo del ORF de hPS1

Además de transcritos con diferentes secuencias iniciales, el análisis de múltiples clones de cADN recuperados de varias bibliotecas reveló también dos variaciones en los transcritos de PS1 que afectan al ORF.

La primera de estas es la ausencia de 12 nucleótidos del extremo 3' del exón 4, nucleótidos 324 a 335 de la SEQ ID NO: 1. Esto sería el resultado del corte y empalme del exón 4 después del nucleótido 323 en lugar de después del nucleótido 335. Los transcritos que son el resultado de este corte y empalme alternativo del exón 4 no codifican los restos aminoácido Val26-Arg27-Ser28-Gln29 de la SEQ ID NO:2. Los transcritos que son el resultado de estos dos episodios de corte y empalme alternativo del exón 4 se detectaron con aproximadamente iguales frecuencias en todos los tejidos investigados. Se advierte en los clones examinados hasta la fecha que los transcritos de PS1 murino contienen solo la secuencia de cADN para Ile26-Arg27-Ser28-Gln29, y que la secuencia para el motivo Val-Arg-Ser-Gln se conserva solo parcialmente en PS2 humana como Arg48-Ser49-Gln50 (Rogaev et al., 1995). Cada una de estas observaciones sugiere que estas diferencias no son críticas para el funcionamiento apropiado de PS1.

La segunda variación del corte y empalme que afecta al ORF da como resultado la ausencia del exón 9, nucleótidos 1018 a 1116 en la SEQ ID NO:1. El análisis de los productos de RT-PCR derivados de mARN de varios tejidos mostró que el cerebro (incluyendo las áreas neocorticales típicamente afectadas por AD) y varios otros tejidos (músculo, corazón, pulmón, colon) predominantemente expresaron un solo transcrito que tiene exón 9. Los leucocitos (pero no los linfoblastos) por otra parte, también expresaron una forma más corta que carecía de exón 9. Se prevé que el corte y empalme alternativo del exón 9 cambia un resto aspartato en la posición 257 en la SEQ ID NO: 2 a alanina, elimina los siguientes 33 restos, y da como resultado una fusión sin cambio de marco de lectura al resto de la proteína comenzando en la treonina en la posición 291 codificada en el exón 10.

D. Transcritos de hPS2

El ADN genómico que incluye el gen PS2 humano no se ha caracterizado completamente aún. No obstante, son evidentes muchas similaridades entre los genes PS1 y PS2. Las fronteras intrón/exón de ambos genes, sin embargo, parecen ser muy similares o idénticas excepto en la región del bucle TM6\rightarrow7.

La hibridación de los clones de cADN de PS2 a Northern blots detectó una banda de mARN de \sim2,3 kb en muchos tejidos, incluyendo regiones del cerebro, así como una banda de mARN de \sim2,6 kb en el músculo, músculo cardíaco y páncreas. El PS2 se expresa en bajos niveles en la mayor parte de las regiones del cerebro excepto en el cuerpo calloso, donde la transcripción es alta. En el músculo esquelético, músculo cardíaco y páncreas, el gen PS2 se expresa a niveles relativamente más altos que en el cerebro y en forma de dos diferentes transcritos de \sim2,3 kb y \sim2,6 kb. Ambos transcritos tiene tamaños claramente distinguibles de los del transcrito de PS1 de 2,7 kb, y no se cros-hibridaron con las sondas PS1 a alta severidad. La secuencia de cADN de un alelo de hPS2 se identifica como SEQ ID NO: 18 (Número de acceso L44577).

El ORF más largo dentro de esta secuencia de nucleótidos de consenso de cADN de PS2 prevé un polipéptido que contiene 448 aminoácidos (SEQ ID NO: 19) numerando desde el primer codon ATG en fase, en las posiciones 366-368 en la SEQ ID NO: 18, que estaba rodeado por una secuencia de consenso Kozak. El codón de parada está en las posiciones 1710-1712.

En cuanto al PS1, el análisis de ARN de productos de RT-PCR de PS2 de varios tejidos, que incluyen cerebro y músculos, reveló dos variantes de corte y empalme alternativas en las que se puede empalmar un segmento relativamente grande. De este modo, a una frecuencia relativamente baja, se producen transcritos en los que los nucleótidos 1152-1250 del transcrito de PS2, SEQ ID NO: 18 (que codifican los restos 263-295, SEQ ID NO: 19) están alternativamente empalmados. Como se discute a continuación, este episodio de corte y empalme corresponde estrechamente al corte y empalme alternativo del exón 9 de PS1 (Rogaev et al., 1995).

Se ha encontrado también en todos los tejidos examinados una variante de corte y empalme adicional de la secuencia de cADN de PS2 que carece del triplete GAA en las posiciones de nucleótido 1338-1340 en la SEQ ID NO: 18. Este corte y empalme alternativo da como resultado la omisión de un resto Glu en la posición del aminoácido 325.

6. Estructura de las proteínas presenilina A. La familia de proteínas presenilina

Se revela ahora que las presenilinas son una nueva familia de proteínas integrales de membrana altamente conservadas con un motivo estructural común, patrones comunes de corte y empalme alternativo, y puntos calientes de regiones mutacionales comunes que se correlacionan con supuestos dominios estructurales que están presentes en muchas células de animales vertebrados e invertebrados. El análisis de las secuencias de aminoácidos previstas de los genes de presenilina humana usando el algoritmo de Hopp y Woods sugiere que las proteínas son proteínas integrales de membrana multipaso tales como receptores, proteínas de canal, o proteínas de membrana estructurales. Se representa en la figura 2 un diagrama de hidropatía de Kyte-Doolittle de la supuesta proteína de hPS1. El diagrama de hidropatía y el análisis estructural sugieren que estas proteínas poseen aproximadamente siete dominios transmembrana hidrófobos (designados TM1 a TM7) separados por "bucles" hidrófilos. Se puede prever que otros modelos tienen tan pocos como 5 y tantos como 10 dominios transmembrana dependiendo de los parámetros usados en el algoritmo de predicción. La presencia de siete dominios integrales de membrana, sin embargo, es característica de varias clases de proteínas de receptor acoplado a G, pero también se observa con otras proteínas (por ejemplo, proteínas del canal). Son dignas de mención la ausencia de un péptido de señal reconocible y la penuria de sitios de glicosilación.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas hPS1 y mPS1 se comparan en la Figura 3, y las secuencias de las proteínas hPS1 y hPS2 se comparan en la figura 4. En cada figura, los restos aminoácido idénticos se indican por barras verticales. Los siete supuestos dominios transmembrana están indicados por líneas horizontales encima o debajo de las secuencias.

Las principales diferencias entre miembros de esta familia residen en las secuencias de aminoácidos de los dominios de bucle ácido hidrófilo en el extremo N y entre los supuestos dominios TM6 y TM7 de las proteínas presenilina (el bucle TM6\rightarrow7). La mayoría de los restos codificados por el exón 9 de hPS1, que está alternativamente empalmado en algunos tejidos no neuronales, forman parte del supuesto bucle TM6\rightarrow7. Además, la variante de corte y empalme alternativa correspondiente identificada en hPS2 parece codificar parte del bucle TM6\rightarrow7. El corte y empalme variable de este bucle hidrófilo, y el hecho de que la secuencia de aminoácidos del bucle difiere entre miembros de la familia génica, sugiere que este bucle es un domino funcional importante de la proteína y puede conferir alguna especificidad a las interacciones fisiológicas y patógenas de las proteínas presenilina individuales. Debido a que el dominio hidrófilo N-terminal comparte la misma carga ácida que el bucle ácido hidrófilo TM6\rightarrow7, y en un modelo de siete dominios transmembrana es posible tener la misma orientación con respecto a la membrana, y es también variable entre las presenilinas, es muy posible que estos dos dominios compartan funcionalidad de un modo coordinado o independiente (por ejemplo, los mismos o diferentes ligandos o propiedades funcionales). De este modo, es posible que el extremo N sea también un dominio funcional importante de la proteína y puede conferir alguna especificidad a las interacciones fisiológicas y patógenas de las proteínas presenilina individuales.

Como se detalla a continuación, las mutaciones patógenas en el grupo de PS1 y PS2 alrededor de los dominios de bucle TM1\rightarrow2 y TM6\rightarrow7, sugieren adicionalmente que estos dominios son los dominios funcionales de estas proteínas. Las figuras 5 y 6 representan dibujos esquemáticos de estructuras predichas de las proteínas PS1 y PS2, respectivamente, con los conocidos sitios mutacionales indicados en las figuras. Como se muestra en las figuras, la secuencia de unión TM1\rightarrow2 se prevé que reside en el lado opuesto de la membrana al del extremo N y bucle TM6\rightarrow7, y puede ser importante en la comunicación transmembrana. Esto está avalado por la mutación Y115H de PS1 que se observó en un linaje con aparición temprana de AD familiar (30-40 años) y por mutaciones adicionales en las hélices TM1/2 que se puede esperar que desestabilicen el bucle. El bucle TM1\rightarrow2 es relativamente corto (PS1: restos 101-132; PS2: restos 107-134) haciendo a esta secuencia mas susceptible a la síntesis de péptido convencional. Siete mutaciones de PS1 se agrupan en la región entre alrededor del codón 82 y el codón 146, que comprende el supuesto primer dominio transmembrana (TM1), el bucle TM1\rightarrow2, y el dominio TM2 en PS1. Similarmente, una mutación en el codón 141 de PS2 está también localizada en el dominio TM2. Estas mutaciones probablemente desestabilicen el domino del bucle TM1\rightarrow2 y sus puntos de anclaje en TM1 y TM2. Doce mutaciones de PS1 dan como resultado la alteración de aminoácidos entre alrededor de los codones 246 y 410, que están implicados en los dominios TM6, del bucle TM6\rightarrow7 y TM7. Estas mutaciones pueden modificar la estructura o estabilidad del bucle TM6\rightarrow7 (directamente o modificando la conformación de TM6 o TM7).

Evidencia adicional de un importante papel funcional que reside en el bucle TM6\rightarrow7 es la divergencia de la secuencia en la parte central del bucle TM6\rightarrow7 (aproximadamente aminoácidos 300 a 371) entre diferentes miembros de la familia de proteínas presenilina. Similarmente, debido a que las secuencias del extremo N de miembros de la familia de proteínas presenilina juegan en papel confiriendo especificidad a la función de cada una de las diferentes proteínas presenilina mientras que las secuencias conservadas confieren las actividades biológicas comunes. Estas regiones pueden representar sitios de unión de ligandos. Si esto es así, las mutaciones en la región TM6\rightarrow7 es posible que modifiquen la actividad de unión de ligandos. El bucle TM1\rightarrow2, que se conserva entre diferentes miembros de la familia de proteínas presenilina, probablemente representa un dominio efector sobre la cara de la membrana opuesta. Con la excepción de la mutación de corte y empalme del exón 10, la mayor parte de las otras mutaciones (de sentido erróneo) se alinean sobre las mismas superficies de supuestas hélices transmembrana, lo que sugiere que pueden afectar a la unión de ligandos o a funciones de canal. De este modo, estos dominios (por ejemplo, los buclesTM6\rightarrow7 y TM1\rightarrow2) se pueden usar como sitios para desarrollar agentes de unión específica para inhibir los efectos de las mutaciones y/o restaurar la función normal de la proteína presenilina en sujetos con enfermedad de Alzheimer.

La similaridad entre los supuestos productos de los genes SPE-4 y PS1 de C. elegans implica que pueden tener actividades similares. La proteína SPE-4 parece estar implicada en la formación y estabilización del complejo del orgánulo de membrana de cuerpo fibroso (FBMO) durante la espermatogénesis. El FBMO es un orgánulo derivado de Golgi especializado, que consiste en una vesícula ligada a membrana unida y que rodea en parte a un complejo de fibras de proteína paralelas y puede estar implicado en el transporte y almacenamiento de polipéptidos solubles y unidos a la membrana. Las mutaciones en SPE-4 rompen los complejos de FBMO y detienen la espermatogénesis. Por lo tanto, la función fisiológica de la SPE-4 puede ser estabilizar las interacciones entre la invaginación de la membrana integral y episodios de fusión, o para estabilizar las interacciones entre la membrana y las proteínas fibrilares durante el transporte intracelular del complejo FBMO durante la espermatogénesis. Se podrían prever funciones comparables para las presenilinas. Por ejemplo, la PS1 podría estar implicada en el acoplamiento de otras membranas unidas a membrana tales como \betaAPP, o el transporte axonal y fusión en ciernes de vesículas unidas a membrana durante el transporte de proteínas, tal como en el aparato de Golgi o sistema endosoma-lisosoma. Si estas hipótesis son correctas, entonces se puede esperar que las mutaciones den como resultado el transporte aberrante y procesado de \betaAPP y/o interacciones anormales con proteínas citoesqueléticas tales como la proteína Tau asociada a microtúbulos. Las anormalidades en la disposición intracelular y extracelular tanto de \betaAPP como de Tau son de hecho una parte integral de las características neuropatológicas de la enfermedad de Alzheimer. Aunque la localización de las mutaciones de PS1 y PS2 en restos altamente conservados dentro de dominios conservados de las supuestas proteínas sugieren que son patógenas, por lo menos tres de estas mutaciones son ellas mismas conservadoras, que guarda relación con la aparición de enfermedad en la vida adulta. Debido a que ninguna de las mutaciones observadas hasta ahora son eliminaciones o mutaciones sin sentido que se esperaría que causaran una pérdida completa de la expresión o función, no podemos prever si estas mutaciones tendrán un efecto dominante de ganancia de función, promoviendo de este modo el procesado aberrante de \betaAPP o un efecto dominante de pérdida de función que provoca la detención del procesado normal de \betaAPP. La mutación de corte y empalme del exón 10 provoca una fusión sin cambio de marco de lectura del exón 9 con el exón 10, y puede tener un efecto estructural en la proteína PS1 que podría alterar la inserción intracelular o la unión del ligando, o puede afectar si no a la función de PS1.

Una posibilidad alternativa es que el producto del gen PS1 puede representar un receptor o proteína de canal. Las mutaciones de tales proteínas se han relacionado causalmente con varios otros trastornos neurológicos dominantes en organismos tanto vertebrados (por ejemplo, hipertermia maligna, parálisis periódica hipercalémica en seres humanos) como en invertebrados (mutantes deg-1(d) en C. elegans). Aunque la patología de estos otros trastornos no se parece a la de la enfermedad de Alzheimer, hay evidencia de anormalidades funcionales en los canales iónicos en la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, se han publicado anormalidades en el canal de potasio 113pS sensible al tetraetilamonio y en la homeostasis del calcio. Las perturbaciones en los flujos de calcio transmembrana pueden ser especialmente relevantes en vista de la débil homología entre PS1 y la subunidad de \alpha-ID de los canales de calcio dependientes del voltaje y la observación de que los incrementos en calcio intracelular en células cultivadas pueden replicar algunas de las características bioquímicas de la enfermedad de Alzheimer, tales como la alteración en la fosforilación de la proteína Tau asociada al microtúbulo y la producción incrementada de péptidos A\beta.

B. Estructura de hPS1

Como se muestra en la SEQ ID NO: 2, la forma más grande conocida de la proteína PS1 humana comprende 467 aminoácidos y tiene una masa molecular predicha de aproximadamente 51,37 kDa. Una variante con el corte y empalme alternativo anteriormente descrito del exón 4 (en el que se han eliminado los restos correspondientes a las posiciones 26-29 de la SEQ ID NO: 2) incluiría 4 aminoácidos menos y tendría una masa de aproximadamente 50,93 kDa. Similarmente, una variante con el corte y empalme alternativo anteriormente descrito del exón 9 (en el que se han eliminado los restos correspondientes a las posiciones 258-290 de la SEQ ID NO: 2) incluiría 33 aminoácidos menos y tendría una masa molecular de aproximadamente 47,74 kDa. Las posiciones de los supuestos dominios están representadas en la Tabla 2. Adviértase de nuevo que la numeración de las posiciones de los restos es con respecto a la SEQ ID NO: 2 y es aproximada (es decir \pm 2 restos).

Un dibujo esquemático de la supuesta estructura de PS1 se muestra en la Fig. 5. El extremo N es un dominio muy hidrófilo cargado negativamente con varios dominios de fosforilación potencial, seguido secuencialmente de un dominio transmembrana hidrófobo de aproximadamente 19 restos (TM1), un bucle hidrófilo cargado de aproximadamente 32 restos (TM1\rightarrow2), cinco dominios transmembrana hidrófobos adicionales (TM2 a TM6) intercalados con cortos (1-15 restos) dominios hidrófilos (TM2\rightarrow3 a TM5\rightarrow6), y bucle cargado hidrófilo ácido mas grande adicional (TM6\rightarrow7) y por lo menos uno (TM7), y posiblemente dos, distinto dominios hidrófobos potencialmente transmembrana, culminando en un dominio polar en el carbono terminal.

La proteína también contiene varios sitios de fosforilación potencial, uno de los cuales es un sitio de consenso de quinasa MAP que está también implicado en la hiperfosforilación de Tau durante la conversión de Tau normal en ovillos neurofibrilares. Esta secuencia de consenso puede proporcionar un supuesto elemento que relaciona la actividad de esta proteína con otros aspectos bioquímicos de la enfermedad de Alzheimer, y representaría una posible diana terapéutica. La revisión de la estructura de la proteína revela dos secuencias YTPF (restos 115-118, SEQ ID NO: 2), y STPE (restos 353-356, SEQ ID NO: 2) que representa el motivo 5/T-P que es la secuencia consenso de MAP quinasa. Existen varios otros sitios de fosforilación con secuencias de consenso para la actividad de la proteína quinasa C (PKC). Debido a que la actividad de la PKC está asociada a diferencias en el metabolismo de APP que son relevantes para la enfermedad de Alzheimer, estos sitios en la proteína PS1 y sus homólogos son también sitios para productos terapéuticos diana. La evidencia preliminar indica que, por lo menos en células transfectadas, la proteína PS1 se fosforila solo en menor grado mientras que la proteína PS2 está significativamente fosforilada. Para la PS2 por lo menos, parece que esta fosforilación ocurre en restos serina en el dominio N-terminal por un mecanismo que no implica PKC (Capell et al., 1996).

Adviértase que el corte y empalme alternativo en el extremo del exón 4 retira cuatro aminoácidos del dominio N-terminal hidrófilo, y se esperaría que retirara una secuencia de consenso de fosforilación. Además, el corte y empalme alternativo del exón 9 da como resultado una isoforma truncada de la proteína PS1 en la que están ausentes los cinco restos hidrófobos del C terminal de TM6 y parte del bucle TM6\rightarrow7 hidrófilo negativamente cargado inmediatamente al C terminal de TM6. Esta isoforma alternativamente empalmada está caracterizada por la conservación de la secuencia desde el N-terminal en adelante e incluyendo la tirosina en la posición 256 de la SEQ ID NO: 2, cambiar el aspartato en la posición 257 a alanina, y empalmar a la parte de C-terminal de la proteína de y que incluye tirosina 291. Tales diferencias de corte y empalme están a menudo asociadas a importantes dominios funcionales de las proteínas. Esto sostiene que este bucle hidrófilo (y consecuentemente el bucle hidrófilo N-terminal con similar carga de aminoácidos) es/son dominio(s) funcional(es) activo(s) del producto de PS1 y de este modo sitios para inserción dirigida terapéutica.

C. Estructura de PS2 humano

Las proteínas PS1 y PS2 humanas muestran el 63% de identidad de aminoácidos totales y varios dominios muestran identidad virtualmente completa. Como sería de esperar, por lo tanto, los análisis de hidrofobia sugieren que ambas proteínas comparten también una similar organización estructural. De este modo, se prevé que ambas proteínas poseen siete supuestos dominios transmembrana hidrófobos, y ambas proteínas tienen grandes dominios hidrófobos ácidos en el N-terminal y entre TM6 y TM7. Una similaridad adicional era evidente del análisis anteriormente descrito de producto de RT-PCR de ARN de cerebro y músculo, que reveló que los nucleótidos 1153-1250 del transcrito de PS2 están alternativamente empalmados. Estos nucleótidos codifican los aminoácidos 263-296, que están localizados dentro del dominio del bucle TM6\rightarrow7 de la supuesta proteína PS2 y que comparten el 94% de identidad de secuencia con los aminoácidos alternativamente empalmados 257-290 en PS1.

Las posiciones de los supuestos dominios funcionales de la proteína hPS2 se describen en la Tabla 3. Adviértase que las posiciones de los restos se refieren a las posiciones de los restos de la SEQ ID NO: 19, y que las posiciones son aproximadas (es decir, \pm 2 restos).

Un dibujo esquemático de la supuesta estructura de PS2 se muestra en la Fig. 6. La similaridad entre hPS1 y hPS2 es la mayor en varios dominios de la proteína que corresponden a los intervalos entre TM1 y TM6, y de TM7 al C-terminal de la proteína PS1. Las principales diferencias entre PS1 y PS2 están en el tamaño y las secuencias de aminoácidos de los bucles TM6\rightarrow7 hidrófilos negativamente cargados, y en las secuencias de los dominios hidrófilos del N-terminal.

Las diferencias más apreciables entre las dos secuencias de aminoácidos predichas ocurren en la secuencia de aminoácidos en la porción central del bucle hidrófilo TM6\rightarrow7 (restos 304-374 de hPS1; 310-355 de hPS2), y en el dominio hidrófilo del N terminal. Por analogía, este dominio está también menos altamente conservado entre los genes de PS1 murino y humano (identidad = 47/60 restos), y no muestra similaridad a la región equivalente de SPE-4.

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7. Mutantes de presenilina A. Mutantes de PS1

Se han identificado varias mutaciones en el gen PS1 que provocan un tipo severo de enfermedad de Alzheimer familiar. Una o una combinación de estas mutaciones pueden ser responsables de esta forma de la enfermedad de Alzheimer así como de varios otros trastornos neurológicos. Las mutaciones pueden ser cualquier forma de substitución, inserción o eliminación en la secuencia de nucleótidos que conduce a un cambio en la secuencia de aminoácidos prevista o que conduce a un proceso de transcripción, nivel o estabilidad aberrantes. Las mutaciones específicas causantes de enfermedades en la forma de eliminaciones o substituciones de nucleótidos y/o aminoácidos se describen a continuación pero se anticipa que se encontrarán mutaciones adicionales en otras familias. Ciertamente, después del descubrimiento inicial de cinco mutaciones de sentido erróneo diferentes entre ocho linajes diferentes (Sherrington et al., 1995), se esperaba de la experiencia con otras enfermedades heredadas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica asociada a mutaciones en el gen de superóxido dismutasa de Ca^{2+}) que se identificarían mutaciones adicionales. Esta expectativa se ha hecho realidad por nuestro descubrimiento subsecuente de mutaciones adicionales en las presenilinas (Rogaev et al., 1995) y por observaciones similares de otros (por ejemplo, Cruts et al., 1995; Campion et al., 1995). De este modo, tal como se usa aquí con respecto a los genes y proteínas PS1, el término "mutante" no está restringido a estas mutaciones particulares sino que, en su lugar, se debe interpretar como se define anteriormente.

La secuenciación directa de productos de RT-PCR solapantes que integran el transcrito S182 de 2,8 kb aislado de miembros afectados de los seis grandes linajes relacionados con el cromosoma 14 condujo inicialmente al descubrimiento de cinco mutaciones de sentido erróneo en cada uno de los seis linajes. Cada una de estas mutaciones se co-segregó con la enfermedad en los linajes respectivos, y estaba ausente de más de 142 sujetos neurológicamente normales sin relacionar escogidos de los mismos orígenes étnicos que los linajes de FAD (248 cromosomas sin relacionar). La localización del gen dentro del intervalo físico que se segrega con el rasgo de AD3, la presencia de ocho diferentes mutaciones de sentido erróneo que se co-segregaron con el rasgo de la enfermedad en seis linajes definitivamente relacionada con el cromosoma 14, y la ausencia de estas mutaciones en 284 cromosomas normales independientes acumulativamente confirmó que el gen PS1 es el lugar de AD3. Un aval biológico adicional para esta hipótesis surge de los hechos de que los restos mutados en parientes con FAD se conservan en la evolución (por ejemplo, hPS1 v. mPS1), que las mutaciones están localizadas en dominios de la proteína que están también muy conservados en otros vertebrados y homólogos invertebrados, y que el producto del gen PS1 se expresa en altos niveles en la mayor parte de las regiones del cerebro, incluyendo las más severamente afectadas por la AD.

Desde el descubrimiento original del gen PS1, se han catalogado muchas mutaciones adicionales asociadas con el desarrollo de la AD. La Tabla 4 caracteriza varias de estas. Cada una de las eliminaciones o substituciones de nucleótidos observadas ocurrió dentro del supuesto ORF del transcrito de PS1, y se prevería que cambiara el aminoácido codificado en las posiciones mostradas. Las mutaciones se listan con referencia a las localizaciones de sus nucleótidos en la SEQ ID NO: 1 y con referencia a las posiciones de sus aminoácidos en la SEQ ID NO: 2. Una entrada "NA" indica que el dato no estaba disponible.

Como se discute en la siguiente sección, se han encontrado también varias mutaciones de PS2. Una comparación de las secuencias de hPS1 y hPS2 se muestra también en la figura 4 y revela que estas mutaciones patógenas son en regiones de la proteína PS2 que se conservan en la proteína PS1. Por lo tanto, se espera también que las mutaciones correspondientes en la proteína PS1 sean patógenas y se incluyen en los mutantes de PS1 proporcionados y facilitados aquí. Además, cualquier mutación patógena identificada en cualquier región conservada de un gen de presenilina se puede suponer que representa un mutante de las otras presenilinas que comparten la región conservada.

Interesantemente, las mutaciones A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, \Delta291-319, G384A, L392V, y C410Y todas ocurren en o cerca del bucle hidrófilo ácido entre los supuestos dominios transmembrana TM6 y TM7. Ocho de estas mutaciones (A26OV, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V) están también localizadas en el dominio de corte y empalme alternativo (restos 257-290 de la SEQ ID NO: 2).

Todas estas mutaciones se pueden ensayar por varias estrategias (secuenciación directa de nucleótidos, oligonucleótidos específicos de alelo, reacción en cadena de la polimerasa ligadura, SSPC, RFLPs, nuevas tecnologías de "chip de ADN", etc.) que usan productos de RT-PCR que representan la secuencia de mARN/cADN madura o el ADN genómico.

Finalmente, se debe advertir que se han descubierto también varios polimorfismos sin aparente efecto perjudicial. Uno de estos, un cambio T\rightarrowG del nucleótido 863 de la SEQ ID NO:1, provoca un polimorfismo de F205L en TM4. Otros (C\rightarrowA en bp 1700; G\rightarrowA en bp 2603; eliminación de bp 2620) están en la UTR 3'.

B. Mutantes de PS2

La marcada similaridad entre PS1 y el producto del gen PS2 elevó la posibilidad de que el gen PS2 pudiera ser el sitio de mutaciones causantes de enfermedad en algunos de un pequeño número de linajes de AD de aparición temprana en los que los estudios de relación genética han excluido los cromosomas 14, 19 y 21. Se usó RT-PCR para aislar cADNs que corresponden al transcrito de PS2 de linfoblastos, fibroblastos o tejido cerebral post-mortem de miembros afectados de ocho linajes con aparición temprana de AD en los que las mutaciones en los genes \betaAPP y PS1 se habían excluido previamente por estudios de secuenciación directa.

El examen de estos productos de RT-PCR detectó una substitución A\rightarrowG heterocigótica en el nucleótido 1080 en los cuatro miembros afectados de un linaje extenso de origen italiano (Flo10) con FAD de aparición temprana patológicamente confirmada (aparición a los 50-70 años). Se prevería que esta mutación causara una mutación de sentido erróneo Met\rightarrowVal en el codón 239 en TMS.

Se encontró una segunda mutación (A\rightarrowT en el nucleótido 787) que provoca una substitución Asn\rightarrowIle en el codón 141 en TM2 en los miembros afectados de un grupo de linajes relacionados de ascendencia germanorusa (representados por las líneas celulares AG09369, AG09907, AG09952, y AG09905, Coriell Institute, Camden NJ). Significativamente, un sujeto (AG09907) era homocigótico para esta mutación, una observación compatible con la naturaleza endogámica de estos linajes. Significativamente, este sujeto no tenía un cuadro clínico significativamente diferente de los sujetos heterocigóticos para la mutación N141I. No se encontró ninguna de las mutaciones del gen PS2 en los 284 controles caucásicos normales ni estaba presente en miembros afectados de linajes con el tipo de AD3 de AD.

Ambas de estas mutaciones de PS2 se prevería que causaran la substitución de restos que están muy conservados dentro de la familia de genes PS1/PS2.

Una mutación de PS2 adicional está causada por una substitución T\rightarrowC en el par de bases 1624 provocando una substitución de Ile por Thr en el codón 420 del C-terminal. Esta mutación se encontró en un caso adicional de aparición temprana (45 años) de AD familiar.

Estas mutaciones de hPS2 se listan en la Tabla 5 con referencia a las localizaciones de sus nucleótidos en la SEQ ID NO: 18 y con referencia a las posiciones de sus aminoácidos en la SEQ ID NO: 19. Una entrada "NA" en la tabla indica que los datos no estaban disponibles.

Como se discute en la sección previa, se han encontrado también varias mutaciones de PS1. Una comparación de las secuencias de hPS1 y hPS2 se muestra también en la figura 4 y revela que estas mutaciones patógenas están en regiones de la proteína PS1 que se conservan en gran parte en la proteína PS2. Por lo tanto, se espera también que las mutaciones correspondientes en la proteína PS2 sean patógenas y se incluyen en los mutantes de PS2 proporcionados y facilitados aquí. Además, cualquier mutación patógena identificada en cualquier región conservada de un gen de presenilina se puede suponer que representa un mutante de las otras presenilinas que comparten la región conservada.

El hallazgo de un gen cuyo producto se prevé que comparta similaridades sustanciales estructurales y de aminoácidos con el producto del gen PS1 sugiere que estas proteínas pueden estar funcionalmente relacionadas como proteínas independientes con funciones solapantes pero quizás con ligeramente diferentes actividades específicas, como subunidades físicamente asociadas de un polipéptido multimérico o como proteínas independientes realizando funciones consecutivas en el mismo camino.

La observación de tres mutaciones de sentido erróneo diferentes en dominios conservados de la proteína PS2 en sujetos con una forma familiar de AD sostiene que esta mutaciones son, como aquellas en el gen PS1, causa de AD. Esta conclusión es significativa porque, aunque el fenotipo de la enfermedad asociado a mutaciones en el gen PS1 (aparición a los 30-50 años, duración de 10 años) es sutilmente diferente del asociado a mutaciones en el gen PS2 (aparición a los 40-70 años, duración hasta 20 años), las similaridades generales claramente sostienen que el camino bioquímico subsumido por miembros de esta familia de genes es fundamental para la génesis de por lo menos la AD de aparición prematura. Las diferencias sutiles en el fenotipo de la enfermedad pueden reflejar un nivel más bajo de expresión del transcrito de PS2 en el SNC, o pueden reflejar un papel diferente para el producto del gen PS2.

Por analogía con los efectos de las mutaciones de PS1, el PS2 cuando muta puede provocar el procesado aberrante del APP (proteína del precursor amiloide) a péptido A\beta, hiperfosforilación de la proteína Tau asociada al microtúbulo y anormalidades de homeostasis de calcio intracelular. La interferencia con estas interacciones anómalas proporciona intervención terapéutica en AD.

Finalmente, se ha encontrado por lo menos un polimorfismo de nucleótido en un individuo normal cuyo cADN de PS2 tenía un cambio T\rightarrowC en bp 626 de la SEQ ID NO: 18, sin ningún cambio en la secuencia de aminoácidos codificada.

III. Realizaciones preferidas

Basado, en parte, en los descubrimientos revelados y descritos aquí, se proporcionan las siguientes realizaciones preferidas de la presente invención.

1. Ácidos nucleicos aislados

En una serie de realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que son como se define en las reivindicaciones adjuntas. Estos ácidos nucleicos corresponden, o se relacionan con, las secuencias de ácidos nucleicos de presenilina descritas aquí. Como se describe más completamente a continuación, estas secuencias incluyen secuencias de PS1 y PS2 normal de seres humanos y de otras especies de mamíferos, secuencias homólogas de especies no mamíferos tales como Drosophila y C. elegans, subconjuntos de estas secuencias útiles como sondas e iniciadores de PCR, subconjuntos de estas secuencias que codifican fragmentos de las proteínas presenilina o que corresponden a dominios estructurales particulares o regiones polimórficas, secuencias complementarias o antisentido que corresponden a fragmentos de los genes de presenilina, secuencias en las que las regiones que codifican presenilina se han unido funcionalmente a regiones reguladoras exógenas, y secuencias que codifican proteínas de fusión de las porciones de las proteínas presenilina unidas a otras proteínas útiles como marcadores de expresión, como "etiquetas" para purificación, o en exploraciones y ensayos para buscar proteínas que interaccionan con las presenilinas.

De este modo, en una primera serie de realizaciones, se proporcionan secuencias de ácido nucléico aisladas que codifican versiones normales o mutantes de las proteínas PS1 y PS2 como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos de tales secuencias de ácido nucleico se describen aquí. Estos ácidos nucleicos pueden ser secuencias genómicas (por ejemplo, SEQ ID NOs: 5-15) o pueden ser secuencias de cADN (por ejemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, 16 y 18). Además, los ácidos nucleicos pueden ser genes recombinantes o "minigenes" en los que todas o algunas de las distintas combinaciones de intrones de los intrones y exones y elementos reguladores locales que actúan en cis se pueden manipular genéticamente en forma de construcciones o vectores de propagación o expresión. De este modo, por ejemplo, la invención proporciona secuencias de ácido nucléico en las que las variaciones de corte y empalme alternativo descritas aquí se incorporan a nivel de ADN, permitiendo de este modo que las células que incluyen estas secuencias expresen solo una de las variantes empalmadas alternativas en cada posición de corte y empalme. Como ejemplo, se puede producir un gen recombinante en el que el extremo 3' del exón 1 del gen PS1 (bp 1337 de la SEQ ID NO: 5) se ha unido directamente al extremo 5' del exón 3 (bp 588 de la SEQ ID NO: 6) de modo que solo se produzcan transcritos que corresponden al transcrito predominante. Obviamente, se puede crear también un gen recombinante "forzando" el corte y empalme alternativo del exón 2 y el exón 3. Similarmente, se puede producir un gen recombinante en el que una de las variantes de corte y empalme del exón 4 o exón 9 de PS1 (o la correspondiente variante del corte y empalme TM6\rightarrow7 de PS2) se incorpora en ADN de tal modo que las células que incluyen este gen recombinante pueden expresar solo una de estas variantes. Con el propósito de reducir el tamaño de un gen de presenilina recombinante, se puede emplear un gen de cADN o se pueden retirar de una construcción de ADN varias combinaciones de los intrones y exones sin traducir. Finalmente, se pueden producir genes recombinantes en los que la UTR 5' está alterada de tal modo que la transcripción avanza necesariamente desde uno o el otro de los dos sitios de iniciación de la transcripción. Tales construcciones pueden ser particularmente útiles, como se describe a continuación, para identificar compuestos que pueden inducir o reprimir la expresión de las presenilinas. Muchas variaciones en estas realizaciones se facilitan ahora por la descripción detallada de los genes de presenilina proporcionados aquí.

Además de las secuencias de presenilina descritas, uno de experiencia media en la técnica es capaz de identificar y aislar ácidos nucleicos que representan genes de presenilina o cADNs que son alélicos de las secuencias descritas o que son homólogos heteroespecíficos. De este modo, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados correspondientes a estos alelos y homólogos, así como las distintas construcciones recombinantes descritas anteriormente derivadas de estas secuencias, por medios que son bien conocidos en la técnica. Brevemente, uno de experiencia media en la técnica puede explorar ahora preparaciones de ADN genómico o cADN, incluyendo muestras preparadas de organismos individuales (por ejemplo, pacientes de AD humano o los miembros de sus familias) así como bacterias, virus, levaduras u otras bibliotecas de ADN genómico o cADN, usando sondas o iniciadores de PCR para identificar secuencias alélicas u homólogas. Debido a que es deseable identificar mutaciones de genes de presenilina adicionales que pueden contribuir al desarrollo de AD u otros trastornos, debido a que es deseable identificar polimorfismos de presenilina adicionales que no son patógenos, y debido a que se desea también crear varios modelos animales que se pueden usar para estudiar AD y buscar productos terapéuticos adicionales, se contempla particularmente que se aislarán secuencias de presenilina adicionales de otras preparaciones o bibliotecas de ácidos nucleicos humanos y de preparaciones o bibliotecas de animales incluyendo ratas, ratones, hámsters, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos, y primates no humanos. Además, los homólogos de presenilina de levadura o especies de invertebrados, incluyendo C. elegans y otros nematodos, así como Drosophila y otros insectos, pueden tener particular utilidad para la búsqueda de fármacos. Por ejemplo, se pueden usar invertebrados que tienen homólogos de presenilina mutante (o transgenes de presenilina de mamífero) que provocan un fenotipo que ocurre rápidamente y que se valora fácilmente (por ejemplo, desarrollo anormal de la vulva o el ojo después de varios días) como análisis para fármacos que bloquean el efecto del gen mutante. Tales invertebrados pueden resultar mucho más rápidos y eficientes para exploraciones en masa que los animales vertebrados mayores. Una vez que se han encontrado compuestos guía por medio de tales exploraciones, se pueden ensayar en animales superiores.

Se puede emplear análisis de hibridación estándar o técnicas de PCR (como se usa, por ejemplo, en la identificación del gen mPS1) para identificar y/o aislar tales secuencias alélicas y homólogas usando relativamente cortas secuencias genéticas de presenilina. Las secuencias pueden incluir 8 o menos nucleótidos dependiendo de la naturaleza de las secuencias diana, del método empleado, y de la especificidad requerida. Los desarrollos tecnológicos futuros pueden permitir el uso ventajoso de secuencias incluso más cortas. Con la actual tecnología, se prefieren secuencias de 9-50 nucleótidos y preferentemente de alrededor de 18-24. Estas secuencias se pueden escoger de las descritas aquí, o se pueden derivar de otros homólogos alélicos o heteroespecíficos facilitados aquí. Cuando se sondea mRNA o se exploran bibliotecas de cADN, se emplean preferentemente sondas e iniciadores de secuencias de codificación (en lugar de intrones), y se evitan típicamente las secuencias que se omiten en variantes de corte y empalme alternativo a menos que se desee específicamente identificar esas variantes. Se puede esperar que las variantes alélicas de los genes de presenilina se hibriden a las secuencias descritas en condiciones severas de hibridación, como se define aquí, mientras que se puede emplear una menor severidad para identificar homólogos heteroespecíficos.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que incluyen subconjuntos de las secuencias de presenilina o sus complementos. Como se advierte anteriormente, tales secuencias tendrán utilidad como sondas e iniciadores de PCR en la identificación y aislamiento de variantes alélicas y homólogas de los genes de presenilina. Las subsecuencias que corresponden a las regiones polimórficas de las presenilinas, como se describe anteriormente, tendrán también utilidad particular al explorar y/o genotipar individuos con propósitos de diagnóstico, como se describe a continuación. Además, y también como se describe a continuación, tales subconjuntos tendrán utilidad para codificar (1) fragmentos de las proteínas presenilina para la inclusión en proteínas de fusión, (2) fragmentos que comprenden dominios funcionales de las proteínas presenilina para uso en estudios de unión, (3) fragmentos de las proteínas presenilina que se pueden usar como inmunogenes para generar anticuerpos contra las proteínas presenilina, y (4) fragmentos de presenilinas que pueden actuar como inhibidores competitivos o como miméticos de las presenilinas para inhibir o imitar sus funciones fisiológicas. Finalmente, tales subconjuntos pueden codificar o representar secuencias complementarias o antisentido que se pueden hibridar a los genes de presenilina o transcritos de mARN de presenilina en condiciones fisiológicas para inhibir la transcripción o traducción de esas secuencias. Por lo tanto, dependiendo del uso deseado, se describen aquí subsecuencias de ácido nucléico de los genes de presenilina que pueden tener longitudes que varían de 8-10 nucleótidos (por ejemplo, para su uso como iniciadores de PCR) hasta casi el tamaño total de los ADNs genómicos o cADNs. De este modo, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden secuencias que corresponden a por lo menos 15, y más preferentemente por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de los genes de presenilina, como se describe o si no facilita aquí, o a sus complementos. Como se advierte anteriormente, sin embargo, secuencias más cortas pueden ser útiles con diferentes tecnologías.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos en los que las secuencias de codificación de presenilina, con o sin intrones o recombinantemente manipuladas como se describe anteriormente, se unen funcionalmente a regiones reguladoras 5' y/o 3' endógenas o exógenas. Las regiones reguladoras endógenas del gen hPS1 se revelan y describen con detalle aquí. Usando la presente descripción y técnicas genéticas estándar (por ejemplo, extensiones PCR, "targeting gene walking"), uno de experiencia media en la técnica está también ahora capacitado para clonar las correspondientes regiones reguladoras endógenas 5' y/o 3' de hPS2. Similarmente, las variantes alélicas de las regiones reguladoras endógenas de hPS1 y hPS2, así como regiones reguladoras endógenas de otros homólogos de mamífero, son posibles similarmente sin excesiva experimentación. Alternativamente, las regiones reguladoras exógenas (es decir, las regiones reguladoras de un gen coespecífico diferente o una región reguladora heteroespecífica) se pueden unir funcionalmente a las secuencias de codificación de presenilina para conducir la expresión. Las regiones reguladoras 5' apropiadas incluirán elementos promotores y pueden incluir también elementos adicionales tales como secuencias operadoras o mejoradoras, secuencias de unión de ribosoma, secuencias de terminación de ARN, y similares. La región reguladora se puede seleccionar de secuencias que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas, sus virus, y sus combinaciones. Tales regiones reguladoras incluyen, pero no están limitadas a, el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, y el sistema trc; las regiones principales de operador y promotor del fago \lambda; la región de control de la proteína de cabra fd; promotores tempranos y tardíos de SV40; promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus, baculovirus, y virus de simio; promotor de 3-fosfogliceratoquinasa; promotores de fosfatasa ácida de levadura; factores alfa-mating de levadura; elementos promotores de otros genes de eucariotas expresados en neuronas de otros tipos de células; y sus combinaciones. En particular, se pueden escoger elementos reguladores que son inducibles o reprimibles (por ejemplo, el promotor de \beta-galactosidasa) para permitir la expresión controlada y/o manipulable de los genes de presenilina en células transformadas con estos ácidos nucleicos. Alternativamente, las regiones de codificación de presenilina se pueden unir operativamente con elementos reguladores que proporcionan expresión específica del tejido en organismos multicelulares. Tales construcciones son particularmente útiles para la producción de organismos transgénicos para provocar la expresión de los genes de presenilina solo en tejidos apropiados. La elección de regiones reguladoras apropiadas está dentro de la capacidad y a discreción de uno de experiencia media en la técnica y el uso recombinante de muchas de tales regiones reguladoras está ahora establecido en la técnica.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican todas o una porción de las proteínas presenilina de la invención en forma de una proteína de fusión. En estas realizaciones, una región reguladora de ácido nucléico (endógena o exógena) se une funcionalmente a una primera región de codificación que está covalentemente unida sin cambio de marco de lectura a una segunda región de codificación. La segunda región de codificación opcionalmente puede estar covalentemente unida a una o más regiones de codificación adicional y la última región de codificación está unida a un codón de terminación y, opcionalmente a regiones reguladoras 3' apropiadas (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias de presenilina de la proteína de fusión pueden representar la primera, segunda o cualquier región adicional de codificación. Las secuencias de presenilina pueden ser dominios conservados o no conservados y se pueden colocar en cualquier región de codificación de la fusión. Las secuencias de no-presenilina de la fusión se pueden escoger según las necesidades y a discreción del profesional y no están limitadas a la presente invención. Las secuencias no-presenilina útiles incluyen, sin embargo, cortas "etiquetas" de secuencia tales como determinantes antígenos o etiquetas poli-His que se pueden usar para ayudar a la identificación o purificación de la proteína de fusión resultante. Alternativamente, la región de codificación no-presenilina puede codificar una proteína grande o un fragmento de proteína, tal como una enzima o proteína de unión que también puede ayudar a la identificación y purificación de la proteína, o que puede ser útil en un ensayo tal como aquellos descritos a continuación. Las proteínas de fusión de presenilina particularmente contempladas incluyen fusiones de poli-His y GST (glutation S-transferasa) que son útiles para aislar y purificar las presenilinas, y las fusiones de dos híbridos de levadura, descritas a continuación, que son útiles en ensayos para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con las presenilinas.

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados en forma de construcciones de ADN recombinante en las que un marcador o gen indicador (por ejemplo, \beta-galactosidasa, luciferasa) está unido funcionalmente a la región reguladora 5' de un gen de presenilina de tal modo que la expresión del gen marcador está bajo el control de las secuencias reguladoras de presenilina. Usando las regiones reguladoras de presenilina descritas o si no facilitadas aquí, incluyendo las regiones reguladoras de los genes PS1 y PS2 de seres humanos y otras especies de mamíferos, uno de experiencia media en la técnica es ahora capaz de producir tales construcciones. Como se discute más completamente a continuación, tales ácidos nucleicos aislados se pueden usar para producir células, líneas celulares o animales transgénicos que son útiles en la identificación de compuestos que pueden, directa o indirectamente, afectar diferencialmente a la expresión de las presenilinas.

Finalmente, los ácidos nucleicos aislados de la presente invención incluyen cualquiera de las anteriormente descritas secuencias cuando se incluyen en vectores. Los vectores apropiados incluyen vectores de clonación y vectores de expresión de todos los tipos, incluyendo plásmidos, fagémidos, cósmidos, episomas, y similares, así como vectores de integración. Los vectores pueden incluir también varios genes marcadores (por ejemplo, genes de susceptibilidad o de resistencia antibiótica) que son útiles para identificar células transformadas exitosamente con ellos. Además, los vectores pueden incluir secuencias reguladoras a las que están unidos funcionalmente los ácidos nucleicos de la invención, y/o pueden incluir también regiones de codificación tales que los ácidos nucleicos de la invención, cuando están apropiadamente unidos a un vector, se expresan como proteínas de fusión. Tales vectores pueden incluir también vectores para su uso en "dos híbridos" de levadura, baculovirus, y sistemas de presentación en fagos. Los vectores se pueden elegir para que sean útiles para expresión procariota, eucariota o viral, según sea necesario o se desee para la aplicación particular. Por ejemplo, vectores de virus vaccinia o vectores de virus de simios con el promotor SV40 (por ejemplo, pSV2), o virus herpes simple o virus adenoasociados pueden ser para uso en la transfección de células de mamífero incluyendo neuronas en cultivo o in vivo, y los vectores de baculovirus se pueden usar para transfectar células de insectos (por ejemplo, células de mariposa). Una gran variedad de vectores diferentes están ahora comercialmente disponibles y si no se conocen en la técnica, y la elección de un vector apropiado está dentro de la capacidad y a discreción de uno de experiencia media en la técnica.

2. Proteínas sustancialmente puras

La presente invención proporciona preparaciones sustancialmente puras de las proteínas presenilina, fragmentos de las proteínas presenilina, y proteínas de fusión que incluyen las presenilinas o sus fragmentos que son como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las proteínas, fragmentos y fusiones tienen utilidad, como se describe aquí, en la generación de anticuerpos para presenilinas normales y mutantes, en la identificación de proteínas que se unen a presenilina, y en métodos terapéuticos y de diagnóstico. Por lo tanto, dependiendo del uso deseado, la presente invención proporciona proteínas o péptidos sustancialmente puros que comprenden secuencias de aminoácidos que son subsecuencias de las proteínas presenilina completas, por ejemplo, que comprenden por lo menos 10 o por lo menos 15 aminoácidos consecutivos, o comprenden los dominios funcionales como se define en la reivindicación 12. También se proporcionan secuencias de presenilina que pueden tener longitudes que varían de 10-100 aminoácidos (por ejemplo, para uso en ensayos de unión), a las proteínas presenilina completas. También se describen aquí secuencias de 4-10 aminoácidos (por ejemplo, para su uso como inmunogenes). De este modo, la presente invención proporciona proteínas sustancialmente puras o péptidos que comprenden secuencias preferentemente por lo menos de 50 o 100 aminoácidos consecutivos de las proteínas presenilina, como se describe o si no facilita aquí. También se describen aquí secuencias que corresponden a por lo menos 4-5, preferentemente 6-10 aminoácidos.

Las proteínas o péptidos de la invención se pueden aislar o purificar por cualquiera de varios métodos seleccionados en base a las propiedades reveladas por sus secuencias de proteína. Debido a que las presenilinas poseen propiedades de proteínas integrales de membrana o transmembrana, se puede aislar una fracción de la membrana de las células en las que la presenilina está normalmente altamente expresada (por ejemplo, neuronas, oligodendroglia, músculo, páncreas) y extraer las proteínas, por ejemplo, por solubilización en detergente. Alternativamente, la proteína presenilina, proteína de fusión, o su fragmento se puede purificar de células transformadas o transfectadas con vectores de expresión (por ejemplo, sistemas de baculovirus tales como los vectores pPbac y pMbac (Stratagene, La Jolla, Ca); sistemas de expresión de levadura tales como los vectores Xpress pYESHIS (Invitrogen, San Diego, CA); sistemas de expresión eucariota tales como pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) que tienen expresión constitutiva constante, o LacSwitch (Stratagene, La Jolla, CA) que es inducible; o vectores de expresión procariótica tales como pKK233-3 (Clontech, Palo Alto, CA). En el caso en el que la proteína o fragmento se integra en el retículo endoplasmático o membrana plasmática de las células recombinantes (por ejemplo, líneas celulares humanas inmortalizadas u otras células eucariotas), la proteína se puede purificar de la fracción de membrana. Alternativamente, si la proteína no está apropiadamente localizada o se agrega en cuerpos de inclusión dentro de las células recombinantes (por ejemplo, células procariotas), la proteína se puede purificar de células lisadas enteras o de cuerpos de inclusión solubilizados.

La purificación se puede conseguir usando procedimientos estándar de purificación de proteínas que incluyen, pero no están limitados a, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (RP-HPLC, HPLC de intercambio iónico, HPLC de exclusión de tamaños, cromatografía cromatofocusing de alto rendimiento, cromatografía de interacción hidrófoba, inmunoprecipitación, o purificación por inmunoafinidad). También se puede usar electroforesis en gel (por ejemplo, PAGE, SDS-PAGE) para aislar una proteína o péptido basado en su peso molecular, propiedades de carga e hidrofobicidad.

Una proteína presenilina, o uno de sus fragmentos, se puede también purificar convenientemente creando una proteína de fusión que incluye la secuencia de presenilina deseada fusionada a otro péptido tal como un determinante antigénico o marcador poli-His (por ejemplo, vectores QIAexpress, QIAGEN Corp., Chatsworth, CA), o una proteína más grande (por ejemplo, GST que usa el vector pGEX-27 (Amrad, USA) o proteína fluorescente verde que usa el vector Green Lantern (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD). La proteína de fusión se puede expresar y recuperar de células procariotas y eucariotas y purificar por cualquier método estándar basado en la secuencia del vector de fusión. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede purificar por inmunoafinidad o inmunoprecipitación con un anticuerpo para la porción no-presenilina de la fusión o, en el caso de una etiqueta poly-His, por unión de afinidad a una columna de níquel. La proteína o fragmento de presenilina deseado se puede purificar adicionalmente a continuación de la proteína de fusión por escisión enzimática de la proteína de fusión. Los métodos para preparar y usar tales construcciones de fusión para la purificación de proteínas son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles ahora varios kits para este propósito. A la luz de la presente descripción, uno es ahora capaz de emplear tales construcciones de fusión con las presenilinas.

3. Anticuerpos para las presenilinas

La presente invención proporciona también anticuerpos, y métodos para fabricar anticuerpos, que se unen selectivamente a las proteínas presenilina o sus fragmentos. De particular importancia, identificando los dominios funcionales de las presenilinas y las regiones polimórficas asociadas a AD, la presente invención proporciona anticuerpos, y métodos para fabricar anticuerpos, que se unirán selectivamente a, y por lo tanto, identificarán y/o distinguirán formas normales y mutantes (es decir, patógenas) de las proteínas presenilina. Los anticuerpos de la invención tienen utilidad como reactivos de laboratorio para, entre otras cosas, la purificación por inmunoafinidad de las presenilinas, el uso de Western blots para identificar células o tejidos que expresan las presenilinas, y técnicas de inmunocitoquímica o inmunofluorescencia para establecer la localización subcelular de la proteína. Además, como se describe a continuación, los anticuerpos de la invención se pueden usar como herramientas de diagnóstico para identificar portadores de alelos de presenilina relacionados con AD, o puede ser para uso como herramientas terapéuticas para aglomerar selectivamente e inhibir formas patógenas de las proteínas presenilina in vivo.

Los anticuerpos de la invención se pueden generar usando las proteínas presenilina de la invención enteras o usando cualquier epitopo de presenilina que es característico de esa proteína y que sustancialmente la distingue de otras proteínas del hospedante. Tales epitopos se pueden identificar comparando secuencias de, por ejemplo, restos de 4-10 aminoácidos de una secuencia de presenilina con bases de datos informáticas de secuencias de proteína del hospedante relevante. Preferentemente, los epitopos se escogen de los N y C terminales, o de los dominios de bucle que conectan los dominios transmembrana de las proteínas. En particular, se espera que los anticuerpos de la región N-terminal polimórfica, bucle TM1\rightarrow2, o bucle TM6\rightarrow7 tengan la mayor utilidad tanto terapéuticamente como en diagnóstico. Por otra parte, se espera que los anticuerpos contra dominios altamente conservados tenga la más alta utilidad para la purificación o identificación de presenilinas.

Usando el programa Pustell/IBI, se identificaron las posiciones de resto aminoácido como sitios antigénicos potenciales en la proteína hPS1 y pueden ser útiles para generar los anticuerpos de la invención. Estas posiciones, que corresponden a las posiciones en la SEQ ID NO: 2, se listan en la Tabla 6.

Por supuesto, se conocen en la técnica y se pueden emplear otros métodos para escoger determinantes antigénicos. Además, se pueden emplear también fragmentos más grandes (por ejemplo, 8-20 o, preferentemente, 9-15 restos) que incluyen algunos de estos epitopos. Por ejemplo, un fragmento que incluye el epitopo 109-112 puede comprender los restos 107-114, o 105-116. Se pueden preferir también fragmentos incluso más grandes, que incluyen por ejemplo dominios funcionales enteros o dominios de función múltiple (por ejemplo, TM1, TM1\rightarrow2, y TM2 o TM6, TM6\rightarrow7, y TM7). Para otras proteínas presenilina (por ejemplo, para mPS1 u otros homólogos no humanos, o para PS2), se pueden escoger sitios homólogos.

Usando el mismo programa Pustell/IBI, se identificaron posiciones de resto aminoácido como sitios antigénicos potenciales en la proteína hPS2 y pueden ser útiles para generar los anticuerpos de la invención. Estas posiciones, que corresponden a las posiciones en la SEQ ID NO: 19, se listan en la Tabla 7.

En cuanto a PS1, por supuesto, se conocen en la técnica y se pueden emplear otros métodos para escoger determinantes antigénicos. Además, se pueden emplear también fragmentos más grandes (por ejemplo, 8-20 o, preferentemente, 9-15 restos) que incluyen algunos de estos epitopos. Por ejemplo, un fragmento que incluye el epitopo 310-314 puede comprender los restos 308-316, o 307-317. Se pueden preferir también fragmentos incluso más grandes, que incluyen por ejemplo dominios funcionales enteros o dominios de función múltiple (por ejemplo, TM1, TM1\rightarrow2, y TM2 o TM6, TM6\rightarrow7, y TM7). Para otras proteínas presenilina (por ejemplo, para mPS2 u otros homólogos no humanos, o para PS1), se pueden escoger sitios homólogos.

Se pueden producir preparaciones de inmunogen de presenilina de extractos en bruto (por ejemplo, fracciones de membrana de células que expresan altamente las proteínas), de proteínas o péptidos sustancialmente purificados de células que los expresan natural o recombinantemente o, de inmunogenes cortos, por síntesis química de péptidos. Los inmunogenes de presenilina pueden estar también en la forma de una proteína de fusión en la que la región de no-presenilina se escoge por sus propiedades adyuvantes. Tal como se usa aquí, un inmunogen de presenilina se definirá como una preparación que incluye un péptido que comprende por lo menos 4-8, y preferentemente por lo menos 9-15 restos aminoácido consecutivos de las proteínas presenilina, como se describe o si no facilita aquí. Por supuesto, las secuencias de menos restos pueden tener también utilidad dependiendo del uso deseado y de los desarrollos tecnológicos futuros. Por lo tanto, cualquier secuencia derivada de presenilina que se emplee para generar anticuerpos de las presenilinas se puede considerar como inmunogen de la presenilina.

Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, o pueden ser fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos Fab, F(ab')_{2}, y fragmentos de anticuerpo de una sola cadena. Además, después de identificar los anticuerpos útiles por el método de la invención, se pueden generar anticuerpos recombinantes, que incluyen cualquiera de los fragmentos de anticuerpo listados anteriormente, así como anticuerpos humanizados basados en anticuerpos no humanos de las proteínas presenilina. A la luz de las presentes descripciones de proteínas presenilina, así como la caracterización de otras presenilinas facilitadas aquí, uno de experiencia media en la técnica puede producir los anticuerpos anteriormente descritos por cualquiera de varios medios estándar bien conocidos en la técnica. Para una revisión de técnicas de anticuerpos, véase Antibody Engineering: A Practical Guide, Borrebaek, ed., W.H: Freeman & Company, NY (1992), o Antibody Engineering, 2^{nd} Ed., Borrebaek, ed., Oxford University Press, Oxford
(1995).

En general, se pueden generar anticuerpos policlonales inmunizando primero un ratón, conejo, cabra u otro animal apropiado con el inmunogen de presenilina en un portador apropiado. Para incrementar la inmunogenicidad de la preparación, el inmunogen se puede acoplar a una proteína portadora o mezclar con un adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund). Se recomiendan, aunque no son necesarias, las inyecciones de refuerzo. Después de un periodo apropiado para permitir el desarrollo de una respuesta humoral, preferentemente varias semanas, se sangran los animales y se purifica el suero para aislar el componente de inmunoglobulina.

Similarmente, en general, se pueden producir anticuerpos monoclonales anti-presenilina inyectando primero un ratón, conejo, cabra u otro animal apropiado con un inmunogen de presenilina en un portador apropiado. Como anteriormente, se pueden utilizar proteínas portadoras o adyuvantes y se recomiendan inyecciones de refuerzo (por ejemplo, bi- o tri-semanalmente durante 8-10 semanas). Después de permitir el desarrollo de una respuesta humoral, los animales se sacrifican y se retiran sus bazos y se resuspenden en, por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células de bazo sirven como fuente de linfocitos, algunos de los cuales están produciendo anticuerpos de la especificidad apropiada. Estas células se fusionan a continuación con una línea celular inmortalizada (por ejemplo, mieloma), y los productos de la fusión se depositan en placa en varios pocillos de cultivo de tejido en presencia de un agente selectivo tal como HAT. Los pocillos se exploran en serie y se vuelve a depositar producto en las placas, seleccionando cada vez células que fabrican anticuerpos útiles. Típicamente, se llevan a cabo varios procedimientos de exploración y redeposición en placas hasta que alrededor del 90% de los pocillos contienen clones individuales que son positivos para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales producidos por tales clones se pueden purificar por métodos estándar tales como cromatografía de afinidad usando Protein A Sepharose, por cromatografía de intercambio iónico, o por variaciones y combinaciones de estas técnicas.

Los anticuerpos de la invención se pueden marcar o conjugar con otros compuestos o materiales para diagnóstico y/o usos terapéuticos. Por ejemplo, se pueden acoplar a radionúclidos, compuestos fluorescentes, o enzimas para la formación de imágenes o terapia, o a liposomas para la asignación de compuestos contenidos en los liposomas a una localización de tejido específica.

4. Líneas celulares transformadas

La presente invención proporciona también células o líneas celulares, tanto procariotas como eucariotas, que se han transformado o transfectado con los ácidos nucleicos de la presente invención para provocar la propagación clonal de estos ácidos nucleicos y/o la expresión de las proteínas o péptidos codificados por ellos. Tales células o líneas celulares tendrán utilidad tanto en la propagación como en la producción de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención pero también, como se describe adicionalmente aquí, como sistemas modelo para ensayos terapéuticos y de diagnóstico. Tal como se usa aquí, la expresión "célula transformada" se desea que abarque cualquier célula, o descendiente de cualquier célula, en la que se ha introducido cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención, por transformación, transfección, infección u otros medios. Los métodos para producir vectores apropiados, transformar células con esos vectores, e identificar tranformadores son bien conocidos en la técnica y se revisan aquí solo brevemente (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Las células procariotas útiles para producir las células transformadas de la invención incluyen miembros del género bacteriano Escherichia (por ejemplo, E. coli), Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), y Bacillus (por ejemplo, B. subtillus, B. stearothermophilus), así como muchos otros bien conocidos y frecuentemente usados en la técnica. Las células procariotas son particularmente útiles para la producción de grandes cantidades de las proteínas o péptidos de la invención (por ejemplo, presenilinas normales o mutantes, fragmentos de las presenilinas, proteínas de fusión de las presenilinas). Las células bacterianas (por ejemplo, E. coli) se pueden usar en varios sistemas de vector de expresión que incluyen, por ejemplo, plásmidos con el sistema ARN T7 polimerasa/promotor, secuencias reguladoras \lambda de bacteriófago, o fago de M13 mGPI-2. Los hospedantes bacterianos se pueden transformar también con vectores de proteína de fusión que crean, por ejemplo, lacZ, trpE, proteína que se une a la maltosa, etiquetas poly-His, o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa. Todos estos, así como muchos otros sistemas de expresión procariotas, son bien conocidos en la técnica y están ampliamente disponibles comercialmente (por ejemplo, pGEX-27 (Amrad, USA) para fusiones GST).

Las células y las líneas celulares eucariotas útiles para producir las células transformadas de la invención incluyen células y líneas celulares de mamífero (por ejemplo, PC12, COS, CHO, fibroblastos, mielomas, neuroblastomas, hibridomas, riñón embriónico humano 293, oocitos no humanos, células madre embriónicas no humanas, líneas celulares de insectos (por ejemplo, usando vectores de baculovirus tales como pPbac o pMbac (Stratagene, La Jolla, CA)), levaduras (por ejemplo, usando vectores de expresión de levadura tales como pYESHIS (Invitrogen, CA), y hongos. Las células eucariotas son particularmente útiles para realizaciones en las que es necesario que las proteínas presenilina, o sus fragmentos funcionales, realicen las funciones y/o sufran las interacciones intracelulares asociadas con las proteínas normales o mutantes. De este modo, por ejemplo, se prefieren las células eucariotas transformadas para su uso como modelos de función o interacción de presenilina, y los ensayos para explorar candidatos terapéuticos que preferentemente emplean células eucariotas transformadas.

Para conseguir la expresión en células eucariotas, se han desarrollado y están comercialmente disponibles una amplia variedad de vectores que permiten la expresión inducible (por ejemplo, vectores de expresión LacSwitch, Stratagene, La Jolla, CA) o cognada (por ejemplo, vectores pcDNA3, Invitrogen, Chatsworth, CA) de secuencias de nucleótido de presenilina bajo la regulación de un elemento promotor artificial. Tales elementos promotores se derivan a menudo de CMV o genes virales de SV40, aunque se pueden emplear también otros fuertes elementos promotores que son activos en células eucariotas para inducir la transcripción de secuencias de nucleótido de presenilina. Típicamente, estos vectores contienen también una secuencia de poliadenilación artificial y UTR 3' que se pueden derivar de secuencias de gen viral exógenas o de otros genes eucariotas. Además, en algunas construcciones, se incluyen exones e intrones empalmables no codificantes artificiales en el vector para mejorar la expresión de las secuencias de nucleótido de interés (en este caso, secuencias de presenilina). Estos sistemas de expresión están comúnmente disponibles de fuentes comerciales y están tipificados por vectores tales como pcDNA3 y pZeoSV (Invitrogen, San Diego, CA). Ambos vectores anteriores se han usado con éxito para provocar la expresión de proteínas presenilina en células COS, CHO y PC12 transfectadas (Levesque et al., 1996). Innumerables vectores de expresión comercialmente disponibles así como diseñados a medida están disponibles de fuentes comerciales para permitir la expresión de cualquier transcrito de presenilina deseado en más o menos cualquier tipo de célula deseada, constitutivamente o después de la exposición a cierto estímulo exógeno (por ejemplo, retirada de tetraciclina o exposición a IPTG).

Se pueden introducir vectores en las células del receptor u "hospedante" por varios métodos bien conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, trasfección con fosfato de calcio, transfección con fosfato de estroncio, transfección con DEAE dextrano, electroporación, lipofección (por ejemplo, reactivo de transfección liposomal Dosper, Boehringer Mannheim, Alemania), microinyección, inserción balística o de micropelets, fusión protoplasmática o, para vectores virales o de fago, por infección con el virus o fago recombinante.

5. Modelos animales transgénicos

La presente invención proporciona también la producción de modelos animales no humanos transgénicos para el estudio de la enfermedad de Alzheimer, para la exploración de compuestos farmacéuticos candidatos, para la creación de cultivos celulares de SNC de mamífero explantados (por ejemplo, cultivos celulares neuronales, gliales, organotípicos o mixtos) en los que se expresan secuencias de presenilina naturales o mutantes o en los que los genes de presenilina han sido inactivados (por ejemplo, eliminaciones "knock out") y para la evaluación de potenciales intervenciones terapéuticas. Previamente a la presente invención, existía un modelo animal parcial para la enfermedad de Alzheimer vía la inserción y sobreexpresión de una forma mutante del gen de proteína precursora de amiloide humano en forma de minigen bajo la regulación del elemento promotor del receptor \beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (Games et al., 1995). Este mutante (\betaAPP_{717} Val\rightarrowIle) provoca la aparición de patología sináptica y deposición de péptido \beta amiloide en el cerebro de animales transgénicos que tienen este transgen en un número de copias muy alto. Estos cambios en el cerebro del animal transgénico son muy similares a los vistos en la AD humana (Games et al., 1995). No está sin embargo claro todavía si estos animales se volvieron dementes, pero hay un consenso general de que ahora es posible recrear por lo menos algunos aspectos de la AD en ratones.

Las especies de animales que son apropiadas para el uso en los modelos animales de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, ratas, ratones, hámsters, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos, y primates no humanos (por ejemplo, monos Rhesus, chimpancés). Para estudios iniciales, se prefieren roedores transgénicos (por ejemplo, ratones) debido a su relativa facilidad de mantenimiento y vidas más cortas. Ciertamente, como se advierte anteriormente, se puede preferir para algunos estudios levaduras transgénicas o invertebrados (por ejemplo, nematodos, insectos) porque permitirán una exploración incluso más rápida y barata. Los primates no humanos transgénicos, sin embargo, se pueden preferir para estudios de más duración debido a su mayor similaridad con los seres humanos y sus superiores capacidades cognitivas.

Usando los ácidos nucleicos descritos y si no facilitados aquí, hay ahora varios enfoques disponibles para la creación de un modelo de animal transgénico para la enfermedad de Alzheimer. De este modo, los modelos animales facilitados incluyen (1) Animales en los que se ha introducido recombinantemente un gen de presenilina humana normal dentro del genoma del animal como un gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor exógeno o endógeno, y como minigen o fragmento genómico más grande; en los que se ha substituido recombinantemente un gen de presenilina normal por una o ambas copias del gen de presenilina homóloga del animal por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes; y/o en los que una o ambas copias de uno de los genes de presenilina homóloga del animal se han "humanizado" recombinantemente por substitución parcial de secuencias que codifican el homólogo humano por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes. Estos animales son útiles para evaluar los efectos de los procedimientos transgénicos, y los efectos de la introducción o substitución de un gen de presenilina humano o humanizado: (2) Animales en los que se ha introducido un gen de presenilina humano mutante (es decir, patógeno) en el genoma del animal como un gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor exógeno o endógeno, y como minigen o fragmento genómico grande; en los que un gen de presenilina humano mutante ha substituido a una o ambas copias del gen de presenilina homólogo del animal por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes; y/o en los que una o ambas copias de uno de los genes de presenilina homólogos del animal se han "humanizado" recombinantemente por la substitución parcial de las secuencias que codifican un homólogo humano mutante por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes. Estos animales son útiles como modelos que mostrarán algunas o todas las características, a nivel bioquímico, fisiológico y/o de comportamiento, de seres humanos que tienen uno o más alelos que son patógenos de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades asociadas a mutaciones en los genes de presenilina. (3) Animales en los que se ha introducido recombinantemente una versión mutante de uno de los genes de presenilina de ese animal (que tiene, por ejemplo, una mutación específica que corresponde o es similar a una de las mutaciones patógenas de las presenilinas humanas) en el genoma del animal como gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor exógeno o endógeno, y como minigen o fragmento genómico grande; y/o en los que una versión mutante de uno de los genes de presenilina de ese animal (que tiene por ejemplo, una mutación específica que corresponde o es similar a una de las mutaciones patógenas de las presenilinas humanas) ha substituido recombinantemente a una o ambas copias del gen de presenilina homólogo del animal por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes. Estos animales son también útiles como modelos que mostrarán algunas o todas las características, a nivel bioquímico, fisiológico y/o de comportamiento, de seres humanos que tienen uno o más alelos que son patógenos de la enfermedad de Alzheimer. (4) Animales "knock-out" en los que una o ambas copias de uno de los genes de presenilina del animal se han eliminado parcial o completamente por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes, o se han inactivado por la inserción o substitución por recombinación homóloga o inserción dirigida de genes de secuencias exógenas (por ejemplo, codones de parada, sitios lox p). Tales animales son modelos útiles para estudiar los efectos que puede tener la pérdida de la expresión del gen de presenilina, para evaluar si la pérdida de función es preferible a la expresión continua de formas mutantes, y para examinar si se pueden reclutar otros genes para remplazar una presenilina mutante (por ejemplo, substituir PS1 con PS2) o para interferir en los efectos de otros genes (por ejemplo, APP o ApoE) que provocan AD, como tratamiento para AD u otros trastornos. Por ejemplo, un gen de presenilina normal puede ser necesario para que la acción de los genes APP mutantes se exprese realmente como AD y, por lo tanto, los modelos animales de presenilina transgénicos pueden ser de utilidad para elucidar tales interacciones multigénicas.

Para crear un modelo animal (por ejemplo, un ratón transgénico), un gen de presenilina normal o mutante (por ejemplo, hPS1, mPS1, hPS2, mPS2, etc. normal o mutante) o una versión normal o mutante de un ácido nucléico recombinante que codifica por lo menos un dominio funcional de presenilina (por ejemplo, una construcción recombinante que comprende una secuencia de mPS1 en la que se ha substituido una secuencia de nucleótidos que corresponde una secuencia mutante humana) se puede insertar en una célula madre no humana o línea celular germinal no humana usando técnicas estándar de microinyección de oocitos, o transfección o microinyección en células madre embriónicas no humanas. Los animales producidos por estos u otros procedimientos similares se denominan transgénicos. Similarmente, si se desea inactivar o reemplazar un gen de presenilina endógeno, se puede emplear recombinación homóloga usando células madre embriónicas no humanas. Los animales producidos por estos o similares procedimientos se denominan modelos "knock out" (inactivación) o "knock in" (remplazo).

Para la inyección de oocito, una o más copias de las construcciones de ADN recombinante de la presente invención se pueden insertar en el pronúcleo de un oocito no humano recién fertilizado. Este oocito se reimplanta a continuación en una madre adoptiva pseudopreñada. Los animales nacidos vivos se exploran para buscar integrantes usando análisis de ADN (por ejemplo, de las venas de la cola de los ratones de la camada) para buscar la presencia de las secuencias de transgen recombinante insertado. El transgen puede ser una secuencia genómica completa inyectada como YAC, BAC, PAC u otro fragmento de ADN cromosómico, un cADN con el promotor natural o un promotor heterólogo, o un minigen que contiene toda la región de codificación y otros elementos que se encuentra que son necesarios para la óptima expresión.

Se puede realizar también la infección retroviral de embriones no humanos tempranos para insertar las construcciones de ADN recombinante de la invención. En este método, el transgen (por ejemplo, una secuencia de hPS1 o PS2 normal o mutante) se inserta en un vector retroviral que se usa para infectar embriones no humanos (por ejemplo, embriones de ratón o de primate no humano) directamente durante las primeras etapas de desarrollo para generar quimeras, algunas de las cuales conducirán a la transmisión de la línea germinal.

La recombinación homóloga que usa células madre permite la exploración de células de transferencia de genes para identificar los raros episodios de recombinación homóloga. Una vez identificados, estos se pueden usar para generar quimeras por inyección de blastocistos, y una proporción de los animales resultantes mostrarán transmisión de la línea germinal de la línea recombinante. Esta metodología es especialmente útil si se desea la inactivación de un gen de presenilina. Por ejemplo, la inactivación del gen mPS1 en ratones se puede conseguir diseñando un fragmento de ADN que contiene secuencias de un exón de mPS1 que flanquea a un marcador seleccionable. La recombinación homóloga conduce a la inserción de las secuencias marcadoras en la mitad de un exón, provocando la inactivación del gen mPS1 y/o la eliminación de secuencias internas. El análisis de ADN de clones individuales se puede usar entonces para reconocer los episodios de recombinación homóloga.

Las técnicas de generar animales transgénicos, así como las técnicas para recombinación homóloga o inserción dirigida de genes, son ahora ampliamente aceptadas y practicadas. Está disponible, por ejemplo, un manual de laboratorio sobre la manipulación del embrión de ratón que detalla las técnicas de laboratorio estándar para la producción de ratones transgénicos (Hogan et al., 1986). Para crear un transgen, la secuencia diana de interés (por ejemplo, secuencias de presenilina natural o mutante) se ligan típicamente dentro de un sitio de clonación localizado aguas abajo de algún elemento promotor que regulará la expresión de ARN de la secuencia de presenilina. Aguas abajo de la secuencia de presenilina, hay típicamente una secuencia de poliadenilación artificial. En los modelos transgénicos que se han usado para crear con éxito animales que imitan aspectos de enfermedades neurodegenerativas humanas heredadas, los elementos promotores más exitosos han sido el promotor de la subunidad de gen \beta receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y el promotor de gen de proteína de prion de hámster, aunque serían también útiles otros elementos promotores que dirigen la expresión en células del sistema nervioso central. Un enfoque alternativo para crear un transgen es usar un promotor de presenilina endógeno y secuencias reguladoras para conducir la expresión del transgen de presenilina. Finalmente, es posible crear transgenes usando grandes fragmentos de ADN genómico tales como YACs que contienen todo el gen de presenilina así como sus secuencias reguladoras apropiadas. Tales construcciones se han usado con éxito para conducir la expresión de APP humano en ratones transgénicos (Lamb et al., 1993).

Los modelos animales se pueden crear también insertando dirigidamente el gen de presenilina endógeno para alterar la secuencia de presenilina endógena por recombinación homóloga. Estos episodios de destrucción dirigida pueden tener el efecto de retirar la secuencia endógena (knock out) o alterar la secuencia endógena para crear un cambio de aminoácido asociado a la enfermedad humana o una por lo demás secuencia anormal (por ejemplo, una secuencia que es más como la secuencia humana que la secuencia animal original) (modelos de animales knock in). Están disponibles gran número de vectores para conseguir esto y están comercialmente disponibles fuentes apropiadas de AND genómico para ratones y otros genomas animales para ser sometidos a destrucción dirigida de compañías tales como GenomeSystems Inc. (St. Louis, Missouri, USA). La característica típica de estas construcciones de vector de destrucción dirigida es que de 2 a 4 kb de ADN genómico está ligado en 5' a un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina bacteriano bajo su propio elemento promotor denominado un "casete de neomicina"). Un segundo fragmento de ADN del gen de interés se liga a continuación aguas abajo del casete de neomicina pero aguas arriba de un segundo marcador seleccionable (por ejemplo, timidina quinasa). Los fragmentos de ADN se escogen de tal manera que se puedan introducir secuencias mutantes en la línea germinal del animal sometido a inserción dirigida de genes por reemplazo homólogo de las secuencias endógenas por una cualquiera de las secuencias incluidas en el vector.

Alternativamente, las secuencias se pueden escoger para provocar la eliminación de secuencias que normalmente residirían entre los brazos izquierdo y derecho del vector que rodea al casete de neomicina. El anterior es conocido como knock-in, y el último es conocido como knock-out. De nuevo, se han creado innumerables sistemas modelo, particularmente para knock-outs insertados de genes que incluyen aquellos relevantes para enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, targeted deletions of the murine APP gene por Zheng et al. 1995; targeted deletion of the murine prion gene associated with adult onset human CNS degeneration por Bueler et al., 1996).

Finalmente, se pueden producir equivalentes de animales transgénicos, que incluyen animales con genes de presenilina inactivados o mutados, usando mutagénesis química o de rayos X de gametos no humanos, seguida de fertilización. Usando los ácidos nucleicos aislados descritos o si no facilitados aquí, uno de experiencia media puede explorar más rápidamente la progenie resultante, por ejemplo, por secuenciación directa RFLP, PCR, o análisis de hibridación para detectar mutantes, o Southern blots para demostrar la pérdida de un alelo por dosificación.

6. Ensayos para fármacos que afectan a la expresión de presenilina

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona ensayos para identificar pequeñas moléculas u otros compuestos que son capaces de inducir o inhibir la expresión de los genes y proteínas presenilina (por ejemplo, PS1 o PS2). Los ensayos se pueden realizar in vitro usando células no transformadas, líneas celulares inmortalizadas, o líneas celulares recombinantes, o in vivo usando los modelos de animal transgénico facilitados aquí.

En particular, los ensayos pueden detectar la presencia de expresión incrementada o disminuida de PS1, PS2 u otros genes o proteínas relacionados con presenilina en base a la expresión incrementada o disminuida de mARN (usando, por ejemplo, las sondas de ácido nucléico descritas y facilitadas aquí), niveles incrementados o disminuidos de PS1 o PS2 u otros productos de proteína relacionados con presenilina (usando, por ejemplo, los anticuerpos anti-presenilina descritos y facilitados aquí), o niveles incrementados o disminuidos de expresión de un gen marcador (por ejemplo, \beta-galactosidasa, luciferasa) funcionalmente unido a una región reguladora 5' de presenilina en una construcción recombinante.

De este modo, por ejemplo, se pueden cultivar células que se sabe que expresan una presenilina particular y añadir al medio de cultivo uno o más compuestos de ensayo. Después de dejar un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 0-72 horas) para que el compuesto indujera o inhibiera la expresión de la presenilina, cualquier cambio en los niveles de expresión con respecto a una línea base establecida se puede detectar usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente y bien conocidas en la técnica. En realizaciones particularmente preferidas, las células son de una línea celular inmortalizada tal como un neuroblastoma, glioblastoma o una línea celular de hibridoma humanos. Usando las sondas de ácido nucléico y/o anticuerpos descritos y facilitados aquí, la detección de cambios en la expresión de una presenilina, y de este modo la identificación del compuesto como inductor o represor de la expresión de presenilina, requiere solo experimentación de rutina.

En realizaciones particularmente preferidas, se emplea un ensayo recombinante en el que un gen indicador tal como una \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, fosfatasa alcalina, o luciferasa se une funcionalmente a las regiones reguladoras de 5' de un gen de presenilina. Los vectores preferidos incluyen el vector Green Lantern 1 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, Md y el vector Great EscAPe pSEAP (Clontech, Palo Alto). Las regiones reguladoras de hPS1 descritas aquí, u otras regiones reguladoras de presenilina, se pueden aislar fácilmente y clonar por uno de experiencia media en la técnica a la luz de la presente descripción de las regiones de codificación de estos genes. El gen indicador y las regiones reguladoras se juntan en un marco (o en cada uno de los tres marcos de lectura posibles) de modo que la transcripción y traducción del gen indicador pueda proseguir bajo el control de los elementos reguladores de presenilina. La construcción recombinante se puede introducir a continuación en cualquier tipo de célula apropiada aunque se prefieren las células de mamífero, y las células humanas son las más preferidas. Las células transformadas se pueden hacer crecer en un cultivo y, después de establecer la línea base del nivel de expresión del gen indicador, se pueden añadir compuestos de ensayo al medio. La facilidad de detección de la expresión del gen indicador proporciona un ensayo rápido de alto rendimiento para la indicación de inductores y represores del gen de presenilina.

Los compuestos identificados por este método tendrán potencial utilidad para modificar la expresión del PS1, PS2 u otros genes relacionados con la presenilina in vivo. Estos compuestos se pueden ensayar adicionalmente en los modelos animales descritos y facilitados aquí para identificar los compuestos que tienen los efectos más potentes in vivo. Además, como se describe aquí con respecto a pequeñas moléculas que tienen actividad de unión a presenilina, estas moléculas pueden servir como "compuestos líder" para el posterior desarrollo de productos farmacéuticos, por ejemplo, sometiendo los compuestos a modificaciones secuenciales, modelado molecular, y otros procedimientos de rutina empleados en el diseño racional de fármacos.

7. Identificación de compuestos con capacidad de unión a presenilina

A la luz de la presente descripción, uno de experiencia media en la técnica está capacitado para practicar nuevas metodologías de exploración que serán útiles en la identificación de proteínas y otros compuestos que se unen, o si no interaccionan directamente con las presenilinas. Las proteínas y compuestos incluirán componentes celulares endógenos que interaccionan con las presenilinas in vivo y que, por lo tanto, proporcionan nuevas dianas para intervenciones farmacéuticas y terapéuticas, así como compuestos recombinantes, sintéticos y si no exógenos que pueden tener capacidad de unirse a presenilina y, por lo tanto, ser candidatos para agentes farmacéuticos. De este modo, en una serie de realizaciones, se pueden explorar lisatos celulares u homogenatos tisulares (por ejemplo, homogenatos de cerebro humano, lisatos de linfocitos) para buscar proteínas u otros compuestos que se unen a una de las presenilinas normal o mutante. Alternativamente, se puede explorar cualquiera de varios compuestos exógenos, tanto naturales como sintéticos (por ejemplo, bibliotecas de pequeñas moléculas o péptidos), para buscar la capacidad de unión a presenilina. Las pequeñas moléculas son particularmente preferidas en este contexto porque se absorben más fácilmente después de la administración oral, tienen menores determinantes antigénicos potenciales, y/o es más probable que crucen la barrera sangre-cerebro que las moléculas más grandes tales como ácidos nucleicos o proteínas. Los métodos de la presente invención son particularmente útiles porque se pueden usar para identificar moléculas que selectiva o preferencialmente se unen a una forma mutante de una proteína presenilina (en lugar de a una forma normal) y, por lo tanto, pueden tener particular utilidad al tratar las víctimas heterocigóticas de esta enfermedad autosomal dominante.

Debido a que los papeles fisiológicos normales de PS1 y PS2 son aún desconocidos, los compuestos que se unen a formas normales, mutantes, o ambas de estas presenilinas pueden tener utilidad en tratamientos y diagnósticos. Los compuestos que se unen solo a una presenilina normal pueden, por ejemplo, actuar como mejoradores de su actividad normal y por ello por lo menos parcialmente compensar la actividad perdida o anormal de las formas mutantes de la presenilina en las víctimas de la enfermedad de Alzheimer. Los compuestos que se unen a las formas tanto normal como mutante de una presenilina pueden tener utilidad si afectan diferencialmente a las actividades de las dos formas para aliviar la desviación total de la función normal. Alternativamente, bloquear la actividad de las formas tanto mutante como normal de PS1 o PS2 puede tener consecuencias fisiológicas y clínicas menos severas que el progreso normal de la enfermedad y, por lo tanto, los compuestos que se unen a e inhiben la actividad de las formas tanto normal como mutante de una presenilina pueden ser terapéuticamente útiles. Preferentemente, sin embargo, se identifican compuesto que tienen una más alta afinidad de unión a presenilina mutante que a presenilina normal (por ejemplo, por lo menos 2-10 veces más alta K_{a}) y que selectiva o preferencialmente inhiben la actividad de la forma mutante. Tales compuestos se pueden identificar usando cualquiera de las técnicas descritas aquí y comparando a continuación las afinidades de unión del(de los) compuesto(s) candidato(s) para las formas normal y mutante de PS1 o PS2.

El efecto de agentes que se unen a las presenilinas (formas mutantes o normales) se puede controlar por el control directo de esta unión usando instrumentos (por ejemplo, BIAcore, LKB Pharmatia, Suecia) para detectar esta unión, por ejemplo, por un cambio en fluorescencia, peso molecular, o concentración de cualquiera del agente de unión o componente de presenilina, en una fase soluble o en una fase unida al substrato.

Una vez identificados por los métodos descritos anteriormente, los compuestos candidatos se pueden producir a continuación en cantidades suficientes para administración farmacéutica o ensayo (por ejemplo, \mug o mg o cantidades mayores), y formular en un vehículo farmacéuticamente aceptable (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990). Estos compuestos candidatos se pueden administrar a continuación a las células transformadas de la invención, a los modelos de animal transgénico de la invención, a las líneas celulares derivadas de los modelos animales o de pacientes humanos, o a pacientes de Alzheimer. Los modelos animales descritos anteriormente y facilitados aquí son de utilidad particular para analizar adicionalmente compuestos candidatos que se unen a presenilina normal o mutante para ver su eficacia terapéutica.

Además, una vez identificados por los métodos descritos anteriormente, los compuestos candidatos pueden servir también como "compuestos guía" en el diseño y desarrollo de nuevos productos farmacéuticos. Por ejemplo, como es bien sabido en la técnica, la modificación secuencial de pequeñas moléculas (por ejemplo, el reemplazo de restos aminoácido con péptidos; el reemplazo de grupos funcionales con péptidos o con compuestos no péptido) es un enfoque estándar en la industria farmacéutica para el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos. Tal desarrollo generalmente prosigue de un "compuesto guía" que se muestra que tiene por lo menos algo de la actividad (por ejemplo, capacidad de unión o bloqueo de PS1) del producto farmacéutico deseado. En particular, cuando se identifican uno o más compuestos que tienen por lo menos alguna actividad de interés (por ejemplo, modulación de la actividad de presenilina), la comparación estructural de las moléculas puede informar enormemente al profesional experto sugiriendo porciones de los compuestos guía que se deberían conservar y porciones que se pueden variar en el diseño de nuevos compuestos candidatos. De este modo, la presente invención proporciona también un medio de identificar compuestos guía que se pueden modificar secuencialmente para producir nuevos compuestos candidato para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Estos nuevos compuestos a continuación se pueden ensayar tanto para unión como para bloqueo de la presenilina (por ejemplo, en los ensayos de unión descritos anteriormente) y para ver la eficacia terapéutica (por ejemplo, en los modelos animales descritos aquí). Este procedimiento se puede iterar hasta que se identifican los compuestos que tiene la actividad y/o eficacia terapéutica deseada.

En cada una de la presente serie de realizaciones, se realiza un ensayo para detectar la unión entre un "componente de presenilina" y algún otro resto. De particular utilidad serán los ensayos secuenciales en los que se ensayan compuestos para ver la capacidad de unirse solo a la forma normal o solo a la forma mutante de los dominios funcionales de presenilina usando componentes de presenilina normal o mutante en los ensayos de unión. Se espera que tales componentes tengan las mayores utilidades terapéuticas, como se describe más completamente a continuación. El "componente de presenilina" en estos ensayos puede ser pero no es necesario que sea una forma completa normal o mutante de una proteína presenilina (por ejemplo, una variante de hPS1 o hPS2). En su lugar, se pueden emplear dominios funcionales particulares de las presenilinas, como se describe anteriormente, como moléculas separadas o como parte de una proteína de fusión. Por ejemplo, para aislar proteínas o compuestos que interaccionan con estos dominios funcionales, se puede llevar a cabo una exploración usando construcciones de fusión y/o péptidos sintéticos correspondientes a estas regiones. De este modo, para PS2, se pueden hacer péptidos de fusión-GST que incluyen secuencias que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 1 a 87 (N-terminal), o 269-387 (bucle TM6\rightarrow7), o a cualquier otro dominio conservado de interés. Para dominios funcionales más cortos, se puede producir un péptido sintético correspondiente, por ejemplo, aproximadamente a aminoácidos 107 a 134 (bucle TM1\rightarrow2). Similarmente, para PS1, se pueden producir GST u otros péptidos de fusión que incluyen secuencias que corresponden aproximadamente a aminoácidos 1 a 18 (N-terminal) o 266 a 410 (bucle TM6\rightarrow7) o se puede producir un péptido sintético que corresponde aproximadamente a los aminoácidos 101 a 131 (bucle TM1\rightarrow2). Obviamente, son posibles varias combinaciones de proteínas de fusión y dominios funcionales de presenilina y estos son meramente ejemplos. Además, los dominios funcionales se pueden alterar para ayudar en el ensayo, por ejemplo, introduciendo en el dominio funcional un grupo reactivo o resto aminoácido (por ejemplo, cisteína) que facilitará la inmovilización del dominio sobre un substrato (por ejemplo, usando reacciones de sulfhidrilo). De este modo, se ha sintetizado, por ejemplo, el fragmento del bucle TM1\rightarrow2 de PS1 (31-mer) que contiene un resto cisteína de C-terminal adicional. Este péptido se usará para crear un substrato de afinidad para cromatografía de afinidad (Sulpho-link; Pierce) para aislar proteínas de unión para microsecuenciación. Similarmente, se puede crear otro dominio funcional o fragmentos antigénicos con restos modificados (véase, por ejemplo, Ejemplo 10).

Las proteínas u otros compuestos identificados por estos métodos se pueden purificar y caracterizar por cualquiera de los métodos estándar conocidos en la técnica. Las proteínas se pueden purificar, por ejemplo, y separar usando técnicas electroforéticas (por ejemplo, SDS-PAGE, 2D PAGE) o cromatográficas (por ejemplo, HPLC) y a continuación se pueden microsecuenciar. Para proteínas con un N-terminal bloqueado, la escisión (por ejemplo, por CNBr y/o tripsina) de la proteína de unión particular se usa para desprender fragmentos de péptido. La purificación/caracterización adicional por HPLC y el microsecuenciado y/o espectrometría de masas por métodos convencionales proporciona datos de secuencia internos en tales proteínas bloqueadas. Para compuestos no proteína, se pueden emplear técnicas de análisis químico orgánico estándar (por ejemplo, IR, RMN y espectrometría de masas; análisis de grupos funcionales; cristalografía de rayos X) para determinar su estructura e identidad.

Los métodos para explorar lisatos celulares, homogenatos tisulares, o bibliotecas de moléculas pequeñas para buscar moléculas candidatas para unirse a presenilina son bien conocidos en la técnica y, a la vista de la presente descripción, se pueden emplear ahora para identificar compuestos que se unen a componentes de presenilina normal o mutante o que modulan la actividad de presenilina como se define por medidas no específicas (por ejemplo, cambios en el Ca^{2+} intracelular, relación GTP/GDP) o por medidas específicas (por ejemplo, cambios en la producción del péptido A\beta o cambios en la expresión de otros genes aguas abajo que se pueden controlar por visualización diferencial, electroforesis en gel en 2D, hibridación diferencial, o métodos SAGE). Los métodos preferidos implican variaciones de las técnicas siguientes: (1) extracción directa por cromatografía de afinidad; (2) co-aislamiento de componentes de presenilina y proteínas unidas u otros compuestos por inmunoprecipitación; (3) el ensayo de interacción biomolecular (BIAcore); y (4) los sistemas de dos híbridos de levadura. Estos y otros se discuten separadamente a continuación.

A. Cromatografía de afinidad

A la luz de la presente descripción, se pueden emplear varias técnicas de unión por afinidad bien conocidas en la técnica para aislar proteínas u otros compuestos que se unen a las presenilinas descritas o si no facilitadas aquí. En general, un componente de presenilina se puede inmovilizar sobre un substrato (por ejemplo, una columna o filtro) y se pone en contacto una disolución que incluye el(los) compuesto(s) de ensayo con la proteína, fusión o fragmento de presenilina, en condiciones que son permisivas para la unión. El substrato se lava a continuación con una disolución para retirar las moléculas sin unir o débilmente unidas. Un segundo lavado puede eluir a continuación esos compuestos que se unen fuertemente al componente inmovilizado de proteína normal o mutante. Alternativamente, los compuestos de ensayo se pueden inmovilizar y una disolución que contiene uno o más componentes de presenilina se puede poner en contacto con la columna, filtro u otro substrato. La capacidad del componente de presenilina para unirse a los compuestos de ensayo se puede determinar como anteriormente o se puede usar una forma marcada del componente de presenilina (por ejemplo, un dominio funcional quimiluminiscente o radiomarcado) para evaluar más rápidamente la unión del(de los) compuesto(s) inmovilizado(s) en el substrato. Además, como se cree que ambas PS1 y PS2 son proteínas asociadas a la membrana, se puede preferir que las proteínas, fusión o fragmentos de presenilina se incorporen en bicapas de lípido (por ejemplo, liposomas) para promover su propio doblado. Esto es particularmente cierto cuando se emplea un componente de presenilina que incluye por lo menos un dominio transmembrana. Tales presenilina-liposomas se pueden inmovilizar en substratos (directamente o por medio de otro elemento en la membrana de liposoma), pasar sobre substratos con compuestos de ensayo inmovilizados, o usar en varios otros ensayos de unión para proteínas de membrana bien conocidos. Alternativamente, el componente de presenilina se puede aislar en una fracción de membrana de células que producen el componente, y esta fracción de membrana se puede usar en el ensayo de unión.

B. Co-inmunoprecipitación

Otra técnica bien caracterizada para el aislamiento de los componentes de presenilina y sus proteínas asociadas u otros compuestos es la inmunoprecipitación directa con anticuerpos. Este procedimiento se ha usado con éxito, por ejemplo, para aislar muchas de las proteínas asociadas a la vesícula sináptica (Phizicky and Fields, 1994). De este modo, los componentes de presenilina normal o mutante, libre o unida a la membrana se pueden mezclar en una disolución con el(los) componente(s) candidato(s) en condiciones que son permisivas para la unión, y el componente de presenilina se puede inmunoprecipitar. Las proteínas u otros compuestos que co-inmunoprecipitan con el componente de presenilina se pueden identificar a continuación por técnicas estándar como se describe anteriormente. Se pueden encontrar técnicas generales para inmunoprecipitación en, por ejemplo, Harlow and Lane (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

Los anticuerpos empleados en este ensayo, como se describe y facilita aquí, pueden ser policlonales o monoclonales, e incluyen los distintos fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}) así como los anticuerpos de una sola cadena, y similares.

C. El ensayo de interacción biomolecular

Otro método útil para la detección y aislamiento de proteínas de unión es el ensayo de interacción biomolecular o sistema "BIAcore" desarrollado por Pharmacia Biosensor y descrito en el protocolo del fabricante (LKB Pharmacia, Suecia). A la luz de la presente descripción, uno de experiencia media en la técnica está ahora capacitado para emplear este sistema, o un equivalente sustancial, para identificar proteínas u otros compuestos que tienen capacidad de unirse a presenilina. El sistema BIAcore usa un anticuerpo de afinidad anti-GST purificado para inmovilizar las proteínas de fusión GST sobre un chip sensor. Obviamente, se puede substituir por otras proteínas de fusión y sus correspondientes anticuerpos. El sensor utiliza la resonancia de los plasmones superficiales que es un fenómeno óptico que detecta cambios en los índices de refracción. Se pasa sobre la proteína de fusión inmovilizada un homogenato de un tejido de interés y se registran las interacciones proteína-proteína en forma de cambios en el índice de refracción. Este sistema se puede usar para determinar la cinética de la unión y para evaluar si cualquier unión observada es de relevancia fisiológica.

D. El sistema de dos híbridos de levadura

El sistema de "dos híbridos" de levadura aprovecha los factores transcripcionales que están compuestos de dos dominios funcionales físicamente separables (Phizicky and Fields, 1994). El más comúnmente usado es el activador transcripcional GAL4 de levadura que consiste en un dominio de unión de ADN y un dominio de activación transcripcional. Se usan dos vectores de clonación diferentes para generar fusiones separadas de los dominios GAL4 a los genes que codifican potenciales proteínas de unión. Las proteínas de fusión se co-expresan, insertan en el núcleo y, si ocurren interacciones, la activación de un gen indicador (por ejemplo, lacZ) produce un fenotipo detectable. Por ejemplo, se puede usar el sistema-2 de Clontech Matchmaker con la biblioteca de fusión de dominio de activación de GAL4 de cADN de cerebro de Clontech con clones de fusión de dominio de unión a presenilina-GAL4 (Clontech, Palo Alto, CA). A la luz de las presentes descripciones, uno de experiencia media en la técnica está ahora capacitado para producir varias de las fusiones de presenilina, incluyendo las fusiones que incluyen dominios funcionales normales o mutantes de las proteínas presenilina, y para explorar tales bibliotecas de fusión para identificar proteínas de unión a presenilina.

E. Otros métodos

Las secuencias de nucleótido y productos proteínicos, que incluyen las formas tanto normal como mutante de estos ácidos nucleicos y sus proteínas correspondientes, se pueden usar con las técnicas anteriores para aislar otras proteínas interactuantes, y para identificar otros genes cuya expresión es alterada por la sobreexpresión de secuencias de presenilina normal, por la sub-expresión de secuencias de presenilinas normales, o por la expresión de secuencias de presenilina mutante. La identificación de estas proteínas interactuantes, así como la identificación de otros genes cuyos niveles de expresión están alterados ante secuencias de presenilina mutante (por ejemplo) identificará otras dianas génicas que tienen relevancia directa para la patogénesis de esta enfermedad en sus formas clínica o patológica. Específicamente, se identificaron otros genes que pueden ser ellos mismos el sitio de otras mutaciones que causan la enfermedad de Alzheimer, o que pueden ser insertados ellos mismos terapéuticamente (por ejemplo, para reducir sus niveles de expresión a normales o para bloquear farmacológicamente los efectos de su sobreexpresión) como tratamiento potencial para esta enfermedad. Específicamente, estás técnicas se basan en métodos basados en PCR y/o métodos basados en hibridación para identificar genes que se expresan diferencialmente entre dos estados (una línea celular que expresa presenilinas normales comparada con el mismo tipo de célula que expresa una secuencia de presenilina mutante). Estas técnicas incluyen visualización diferencial, análisis en serie de expresión génica (SAGE), y espectrometría de masas de proteína 2D-geles e hibridación substractiva (revisada en Nowak, 1995 and Kahn, 1995).

Como será obvio para uno de experiencia media en la técnica, hay numerosos otros métodos de explorar proteínas individuales u otros compuestos, así como grandes bibliotecas de proteínas u otros compuestos (por ejemplo, bibliotecas de muestra de fagos y sistemas de clonación de Stratagene, La Jolla, CA) para identificar moléculas que se unen a componentes de presenilina normal o mutante. Todos estos métodos comprenden la etapa de mezclar una proteína, fusión o fragmento de presenilina con compuestos de ensayo, permitiendo la unión (si la hay), y ensayando para buscar complejos unidos. Todos estos métodos se facilitan ahora por la presente descripción de presenilinas sustancialmente puras, fragmentos de dominio funcional de presenilina sustancialmente pura, proteínas de fusión de presenilina, anticuerpos de presenilina, y métodos para fabricar y usar los mismos.

8. Métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de presenilina

En otra serie de realizaciones, la presente invención proporciona métodos de identificar compuestos con la capacidad para modular la actividad de presenilinas normales y mutantes. Tal como se usa con respecto a esta serie de realizaciones, el término "actividad" ampliamente incluye gen y expresión de proteína, procesado post-traducción de proteína presenilina, tráfico y localización, y cualquier actividad funcional (por ejemplo, enzimática, receptor-efector, unión, canal), así como efectos aguas abajo de cualquiera de estos. Las presenilinas parecen ser proteínas integrales de membrana normalmente asociadas al retículo endoplásmico y/o aparato de Golgi y pueden tener funciones implicadas en el transporte o tráfico de APP y/o la regulación de los niveles de calcio intracelular. Además, se sabe que las mutaciones de presenilina están asociadas a la producción incrementada de péptidos A\beta, la aparición de placas amiloides y ovillos neurofibrilares, disminuciones de la función cognitiva, y muerte celular apoptótica. Por lo tanto, usando las células transformadas y los modelos de animal transgénico de la presente invención, células obtenidas de sujetos que tienen un gen de presenilina mutante, o animales o sujetos humanos que tienen mutaciones de presenilina que ocurren de manera natural, es posible ahora explorar productos farmacéuticos candidatos y tratamientos para ver sus efectos terapéuticos detectando cambios en una o más de estas características funcionales o manifestaciones fenotípicas de la expresión de presenilina normal o mutante.

De este modo, la presente invención proporciona métodos para explorar o ensayar proteínas, pequeñas moléculas u otros compuestos que modulan la actividad de la presenilina poniendo en contacto una célula in vivo o in vitro con un compuesto candidato y ensayando para ver un cambio en un marcador asociado a la actividad de presenilina normal o mutante. El marcador asociado a la actividad de la presenilina puede ser cualquier característica bioquímica, fisiológica, histológica y/o de comportamiento medible, característica que distingue células, tejidos, animales o individuos que tienen por lo menos un gen de presenilina mutante de sus homólogos normales. Además, el marcador puede ser cualquier medida específica o no específica de la actividad de la presenilina. Las medidas específicas de la presenilina incluyen medidas de la expresión de la presenilina (por ejemplo, mARN de presenilina o niveles de proteína) que pueden emplear las sondas de ácido nucléico o anticuerpos de la presente invención. Las medidas no específicas incluyen cambios en fisiología celular tales como pH, calcio intracelular, niveles de AMP cíclico, relaciones GTP/GDP, actividad de fosfatidilinositol, fosforilación de proteína, etc., que se pueden controlar en dispositivos tales como el microfisiómetro citosensor (Molecular Devices Inc., EE.UU.). La activación o inhibición de la actividad de la presenilina en su forma mutante o normal se puede controlar también examinando cambios en la expresión de otros genes que son específicos del camino de la presenilina que conducen a la enfermedad de Alzheimer. Estas se pueden ensayar por tales técnicas como visualización diferencial, hibridación diferencial, y SAGE (análisis secuencial de la expresión génica), así como por electroforesis en gel en dos dimensiones de lisatos celulares. En cada caso, los genes diferencialmente expresados se pueden establecer por inspección de estudios idénticos antes y después de la aplicación del compuesto candidato. Además, como se advirtió en otra parte, los genes particulares cuya expresión es modulada por la administración del compuesto candidato se pueden establecer por clonación, secuenciación de nucleótidos, secuenciación de aminoácidos, o espectrometría de masas (revisado en Nowak, 1995).

En general, una célula se puede poner en contacto con un compuesto candidato y, después de un periodo apropiado (por ejemplo, 0-72 horas para la mayor parte de las medidas bioquímicas y células cultivadas), el marcador de la actividad de presenilina se puede ensayar y comparar con una medida de la línea base. La medida de la línea base se puede realizar previamente a poner en contacto la célula con el compuesto candidato o puede ser una línea base externa establecida por otros experimentos o conocida en la técnica. La célula puede ser una célula transformada de la presente invención o un explante de un animal o individuo. En particular, la célula puede ser un explante de un portador de una mutación de presenilina (por ejemplo, un sujeto humano con enfermedad de Alzheimer) o un modelo animal de la invención (por ejemplo, un nematodo o ratón transgénico que tiene un gen de presenilina mutante). Para aumentar el efecto de las mutaciones de presenilina en el camino de A\beta, se pueden emplear células o animales transgénicos que tienen producción de A\beta incrementada. Las células preferidas incluyen aquellas de tejidos neurológicos tales como cultivos de células neuronales, gliales o mixtas; y fibroblastos cultivados, hígado, riñón, bazo o médula ósea. Las células se pueden poner en contacto con los compuestos candidatos en un cultivo in vitro o las células pueden ser para uso para ser administradas in vivo a un animal o sujeto humano vivo. Para animales o sujetos humanos vivos, el compuesto de ensayo se puede administrar oralmente o por cualquier ruta parenteral apropiada para el compuesto. Para ensayos clínicos de sujetos humanos, las medidas se pueden realizar periódicamente (por ejemplo, diariamente, semanalmente, o mensualmente) durante varios meses o años.

Debido a que la mayoría de los portadores de mutaciones de presenilina serán heterocigóticos (es decir, que tienen un alelo de presenilina normal y uno mutante), los compuestos se pueden ensayar para ver su capacidad para modular la actividad de la presenilina normal así como mutante. De este modo, por ejemplo, los compuestos que mejoran la función de presenilinas normales pueden tener utilidad para tratar trastornos asociados a presenilina tales como la enfermedad de Alzheimer. Alternativamente, debido a que la supresión de la actividad de presenilinas tanto normales como mutantes en un individuo heterocigótico puede tener menos severas consecuencias clínicas que la progresión de la enfermedad asociada, se puede desear identificar el compuesto que inactiva o suprime todas las formas de las presenilinas. Preferentemente, sin embargo, se identifican compuestos que selectiva o específicamente inactivan o suprimen la actividad de una presenilina mutante sin perturbar la función de un gen o proteína presenilina normal.

A la luz de la presente identificación, caracterización, y descripción de los genes y proteínas presenilina, las sondas y anticuerpos de ácido nucléico de presenilina, y las células transformadas con presenilina y los animales transgénicos de la invención, uno de experiencia media en la técnica está ahora habilitado para realizar un gran variedad de ensayos que detectarán la modulación de la actividad de la presenilina por compuestos candidatos. Las realizaciones contempladas y particularmente preferidas se discuten con algún detalle a continuación.

A. Expresión de presenilina

En una serie de realizaciones, se emplean medidas específicas de expresión de presenilina para explorar compuestos candidatos para ver su capacidad para afectar a la actividad de la presenilina. De este modo, usando los ácidos nucleicos y anticuerpos de presenilina descritos y si no facilitados aquí, se pueden usar niveles de mARN o niveles de proteína como marcador de la capacidad de un compuesto candidato para modular la actividad de la presenilina. El uso de tales sondas y anticuerpos para medir la expresión del gen y proteína es bien conocido en la técnica y se discute aquí en otra parte. Puede ser de particular interés la identificación de compuestos que pueden alterar los niveles relativos de diferentes variantes de corte y empalme de las presenilinas. Muchas de las mutaciones de presenilina asociadas a la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, están localizadas en la región del supuesto bucle TM6\rightarrow7 que está sujeto a corte y empalme alternativo en algunos tejidos periféricos (por ejemplo, glóbulos blancos). Los compuestos que pueden incrementar la frecuencia relativa de este episodio de corte y empalme pueden, por lo tanto, ser efectivos para prevenir la expresión de las mutaciones en esta región.

B. Localización intracelular

En otra serie de realizaciones, se pueden explorar compuestos para ver su capacidad para modular la actividad de las presenilinas basado en sus efectos sobre el tráfico y localización intracelular de las presenilinas. Se ha visto inmunocitoquímicamente que las presenilinas están localizadas en estructuras de membrana asociadas al retículo endoplasmático y aparato de Golgi, y un mutante de presenilina (H163R), pero no otros, ha sido visualizado en pequeñas vesículas citoplasmáticas de función desconocida. Las diferencias de localización de las presenilinas normal y mutante pueden, por lo tanto, contribuir a la etiología de las enfermedades relacionadas con la presenilina. Los compuestos que pueden afectar a la localización de las presenilinas se pueden, por lo tanto, identificar como productos terapéuticos potenciales. Las técnicas estándar conocidas en la técnica se pueden emplear para detectar la localización de las presenilinas. Generalmente, estas técnicas emplearán los anticuerpos de la presente invención, y en particular anticuerpos que se unen selectivamente a una o más presenilinas mutantes pero no a presenilinas normales. Como es bien sabido en la técnica, tales anticuerpos se pueden marcar por cualquiera de varias técnicas (por ejemplo, marcadores fluorescentes o radiactivos, anticuerpos secundarios marcados, avidina-biotina, etc. ) para ayudar a visualizar la localización intracelular de las presenilinas. Las presenilinas se pueden co-localizar en estructuras particulares, como es sabido en la técnica, usando anticuerpos de los marcadores de estas estructuras (por ejemplo, TGN38 para el Golgi, receptor de transferrina para vesículas de transporte post-Golgi, LAMP2 para lisosomas). También se pueden emplear Western blots de fracciones purificadas de lisatos celulares enriquecidos para orgánulos unidos a membrana intracelular (por ejemplo, lisosomas, sinaptosomas, Golgi). Además, la orientación relativa de diferentes dominios de las presenilinas a través de dominios celulares se puede ensayar usando, por ejemplo, microscopía electrónica y anticuerpos generados para esos dominios.

B. Regulación iónica/Metabolismo

En otra serie de realizaciones, se pueden explorar compuestos para ver su capacidad para modular la actividad de las presenilinas basado en medidas de los niveles o metabolismo de Ca^{2+}, Na^{+} o K^{+} intracelular. Como se advierte aquí, las presenilinas son proteínas asociadas a la membrana que pueden servir como, o interaccionar con, receptores de iones o canales de iones. De este modo, se pueden explorar compuestos para ver su capacidad para modular calcio relacionado con presenilina o el metabolismo de otros iones por medidas in vivo o in vitro de los flujos del canal de iones y/o voltaje transmembrana o flujos de corriente que usan control en parche "patch clamp", fijación de voltaje "voltage clamp" y colorantes fluorescentes sensibles al calcio intracelular o voltaje transmembrana. La función de canal de iones o receptor se puede ensayar también por medidas de activación de segundos mensajeros tales como AMP cíclico, tirosina quinasas cGMP, fosfatos, incrementos de los niveles de Ca^{2+} intracelular, etc. Las proteínas fabricadas recombinantemente se pueden reconstruir también en sistemas de membrana artificial para estudiar la conductancia del canal de iones y, por lo tanto, la "célula" empleada en tales ensayos puede comprender una célula o membrana artificial. Los ensayos para cambios en regulación iónica o metabolismo se pueden realizar en células cultivadas que expresan presenilinas endógenas normales o mutantes. Tales estudios se pueden realizar también en células transfectadas con vectores capaces de expresar una de las presenilinas, en forma normal o mutante. Además, para mejorar la señal medida en tales ensayos, las células se pueden co-transfectar con genes que codifican las proteínas de canal de iones. Por ejemplo, se pueden transfectar oocitos Xenopus o células de riñón de rata (HEK293) con secuencias de presenilina normal o mutante y secuencias que codifican subunidades \beta1 Na^{+} de cerebro de rata, subunidades Ca^{2} \beta1 de músculo esquelético de conejo, o subunidades \beta1 Na^{+} de corazón de rata. Los cambios de actividad del canal de iones relacionados con la presenilina o mediados por la presenilina se pueden medir por medio de registros de fijación de voltaje de dos microelectrodos en oocitos o por registros de control en parche de toda la célula en células HEK293.

C. Apóptosis o muerte celular

En otra serie de realizaciones, se pueden explorar compuestos para ver su capacidad para modular la actividad de las presenilinas basado en sus efectos sobre la apóptosis o muerte celular relacionada con la presenilina o mediada por la presenilina. De este modo, por ejemplo, se puede establecer la línea base para las tasas de apóptosis o muerte celular para células en cultivo, o se puede establecer la de línea base para el grado de pérdida neuronal a una edad particular post-mortem para modelos animales o sujetos humanos, y se puede medir la capacidad de un compuesto candidato para suprimir o inhibir la apóptosis o muerte celular. La muerte celular se puede medir por técnicas microscópicas estándar (por ejemplo, microscopía óptica) o la apóptosis se puede medir más específicamente por morfologías nucleares características o diagramas de fragmentación de ADN que crean escaleras nucleosomales (véase, Gavrieli et al., 1992; Jacobson et al., 1993; Vito et al., 1996). Se puede emplear también TUNEL para evaluar la muerte celular en el cerebro (véase por ejemplo, Lassmann et al., 1995). En realizaciones preferidas, se exploran compuestos para ver su capacidad para suprimir o inhibir la pérdida neuronal en los modelos de animal transgénico de la invención. Se pueden emplear ratones transgénicos que tienen, por ejemplo, un gen mutante humano, gen de ratón mutante, o gen mutante humanizado de presenilina para identificar o evaluar compuestos que pueden detener o retrasar la neurodegeneración asociada a la enfermedad de Alzheimer. Un modelo de ratón transgénico similar, que tiene un gen APP mutante ha sido publicado recientemente por Games et al., (1995).

D. Producción de péptido A\beta

En otra serie de realizaciones, se pueden explorar compuestos para ver su capacidad para modular cambios relacionados con presenilina o mediados por presenilina en el procesado de APP. El péptido A\beta se produce en varias isoformas que son el resultado de diferencias en el procesado de APP. El péptido A\beta es un derivado de 39 a 43 aminoácidos de \betaAPP que se deposita progresivamente en placas difusas y seniles y en los vasos sanguíneos de sujetos con AD. En el cerebro humano, los péptidos A\beta son heterogéneos tanto en el N-terminal como en el C-terminal. Varias observaciones, sin embargo, sugieren que tanto la forma completa como la truncada de N-terminal de los péptidos A\beta largos que terminan en el resto 42 o 43 (es decir, A\beta1-42/43 y A\betax-42/43) tiene un papel más importante en la AD que los péptidos que terminan en el resto 40. De este modo, los A\beta1-42/43 y A\betax-42/43 son una temprana y prominente característica tanto de las placas seniles como de las placas difusas, mientras que los péptidos que terminan en el resto 40 (es decir, A\beta1-40 y A\betax-40) están predominantemente asociados a un subconjunto de placas maduras y con vasos sanguíneos amiloidóticos (véase, por ejemplo, Iwatsubo et al., 1995; Gravina et al., 1995; Tamaoka et al., 1995; Podlisny et al., 1995). Además, las isoformas largas tienen una mayor propensión a la formación de fibrilla, y se cree que son más neurotóxicas que los péptidos A\beta1-40 (Pike et al., 1993; Hilbich et al., 1991). Finalmente, las mutaciones de sentido erróneo en el codón 717 del gen \betaAPP asociadas con la aparición temprana de AD dan como resultado la sobreproducción de A\beta largo en el cerebro de los portadores de mutación afectados, en células periféricas y plasma en portadores tanto afectados como presintomáticos, y en líneas celulares transfectadas con cADNs mutantes de \betaAPP_{717} (Tamaoka et al., 1994; Suzuki et al., 1994). Como se describe en el Ejemplo 18 a continuación, describimos ahora que la producción incrementada de las formas largas del péptido A\beta están también asociadas con mutaciones en los genes de presenilina.

De este modo, en una serie de realizaciones, la presente invención proporciona métodos para explorar compuestos candidatos por su capacidad para bloquear o inhibir la producción incrementada de isoformas largas de los péptidos A\beta en células o animales transgénicos que expresan un gen de presenilina mutante. En particular, la presente invención proporciona tales métodos en los que se han transformado células de mamífero cultivadas, tales como células cerebrales o fibroblastos, según los métodos descritos aquí, o en las que se han producido animales transgénicos, tales como roedores o primates no humanos, por los métodos descritos aquí, para expresar relativamente altos niveles de una presenilina mutante. Opcionalmente, tales células o animales transgénicos se pueden transformar también para expresar una forma normal de la proteína \betaAPP a niveles relativamente altos.

En esta serie de realizaciones, el compuesto candidato se administra a la línea celular o animales transgénicos (por ejemplo, por adición al medio de células en cultivo; o por administración oral o parenteral al animal) y, después de un periodo apropiado (por ejemplo, 0-72 horas para células en cultivo, días o meses para modelos animales), se recoge una muestra biológica (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular o lisato celular de células en cultivo; homogenato tisular o plasma de un animal) y se ensaya para ver el nivel de las isoformas largas de los péptidos A\beta. Los niveles de los péptidos se pueden determinar en un sentido absoluto (por ejemplo, nMol/ml) o en un sentido relativo (por ejemplo, relación de isoforma larga a isoforma corta de A\beta) Las isoformas de A\beta se pueden detectar por cualquier medio conocido en la técnica (por ejemplo, separación electroforética y secuenciación), pero, preferentemente, se emplean anticuerpos que son específicos de la isoforma larga para determinar los niveles absolutos o relativos de los péptidos A\beta1-42/43 o A\betax-42/43. Los productos farmacéuticos candidatos o terapias que reducen los niveles absolutos o relativos de estas isoformas largas de A\beta, particularmente en los modelos animales transgénicos de la invención, es probable que tengan utilidad terapéutica en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, u otros trastornos causados por mutaciones de presenilina o aberraciones en el metabolismo de APP.

E. Fosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos

En otra serie de realizaciones, se pueden explorar los compuestos candidato para ver su capacidad para modular la actividad de la presenilina evaluando el efecto del compuesto en los niveles de fosforilación de las proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs) tales como Tau. La fosforilación anormal de Tau y otras MAPs en los cerebros de víctimas de la enfermedad de Alzheimer es bien conocida en la técnica. De este modo, los compuestos que previenen o inhiben la fosforilación anormal de MAPs pueden tener utilidad para tratar enfermedades asociadas a presenilina tales como AD. Como anteriormente, se pueden emplear células de animales o sujetos normales o mutantes, o líneas celulares transformadas y modelos animales de la invención. Los ensayos preferidos emplearán líneas celulares o modelos animales transformados con un gen de presenilina mutante humano o mutante humanizado. Se puede establecer la línea base del estado de fosforilación de MAPs en estas células y a continuación se pueden ensayar compuestos candidato para ver su capacidad para prevenir, inhibir o contrarrestar la hiperfosforilación asociada a los mutantes. El estado de fosforilación de los MAPs se puede determinar por cualquier método estándar conocido en la técnica, pero preferentemente, se emplean anticuerpos que se unen selectivamente a los epitopos fosforilados o sin fosforilar. Tales anticuerpos de epitopos de fosforilación de la proteína Tau son conocidos en la técnica (por ejemplo, ALZ50).

9. Exploración y diagnósticos para la enfermedad de Alzheimer A. Métodos de diagnóstico general

Los genes de presenilina y los productos génicos, así como las sondas derivadas de presenilina, iniciadores y anticuerpos, descritos o de otro modo facilitados aquí, son útiles en la exploración de portadores o alelos asociados con la enfermedad de Alzheimer, para el diagnóstico de víctimas de la enfermedad de Alzheimer, y para la exploración y diagnóstico de demencias preseniles y seniles relacionadas, trastornos psiquiátricos tales como esquizofrenia y depresión, y enfermedades neurológicas tales como apoplejía y hemorragia cerebral, todas la cuales se ven en mayor o menor medida en sujetos humanos sintomáticos que tienen mutaciones en los genes PS1 y PS2 o en el gen APP. Los individuos con riesgo de la enfermedad de Alzheimer, tales como aquellos con AD presente en el linaje familiar, o individuos que previamente no se sabe que tienen riesgo, se pueden explorar rutinariamente usando sondas para detectar la presencia de un gen o proteína presenilina mutante por varias técnicas. El diagnóstico de casos heredados de estas enfermedades se puede conseguir por métodos basados en los ácidos nucleicos (incluyendo secuencias genómicas y mARN/cADN), proteínas, y/o anticuerpos descritos y facilitados aquí, incluyendo ensayos funcionales diseñados para detectar el fallo o aumento de la actividad de la presenilina normal y/o la presencia de nuevas actividades específicas conferidas por las presenilinas mutantes. Preferentemente, los métodos y productos están basados en los ácidos nucleicos, proteínas o anticuerpos de PS1 o PS2 humana, como se describe o si no facilita aquí. Como será obvio para uno de experiencia media en la técnica, sin embargo, la conservación evolutiva significativa de grandes porciones de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PS1 y PS2, incluso en especies tan diversas como seres humanos, ratones, C. elegans, y Drosophila, permiten al profesional experto hacer uso de tales ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos homólogos de presenilina no humanos, incluso para aplicaciones dirigidas a seres humanos u otros sujetos animales. De este modo, por brevedad de exposición, pero sin limitar el alcance de la invención, la siguiente descripción se centrará en los usos de los homólogos humanos de PS1 y PS2. Se entenderá, sin embargo, que las secuencias homólogas de otras especies, incluyendo aquellas descritas aquí, serán equivalentes para muchos propósitos.

Como se apreciará por uno de experiencia media en la técnica, la elección de métodos de diagnóstico de la presente invención estará influenciada por la naturaleza de las muestras biológicamente disponibles para ser ensayadas y de la naturaleza de la información requerida. La PS1 está altamente expresada en tejido cerebral pero las biobsias cerebrales son procedimientos invasivos y caros, particularmente para exploración de rutina. Otros tejidos que expresan PS1 a niveles significativos, sin embargo, pueden demostrar un corte y empalme alternativo (por ejemplo, linfocitos) y, por lo tanto, el mARN o la proteína PS1 de tales células pueden ser menos informativas. De este modo, un ensayo basado en el ADN de PS1 genómico de un sujeto puede ser el preferido porque ninguna información dependerá del corte y empalme alternativo y porque esencialmente cualquier célula nucleada puede proporcionar una muestra utilizable. Los diagnósticos basados en otras presenilinas (por ejemplo, hPS2, mPS1) están sometidos a similares consideraciones: disponibilidad de tejidos, niveles de expresión en varios tejidos, y mARN y productos de proteína alternativos resultantes del corte y empalme alternativo.

B. Exploraciones y diagnósticos basados en proteínas

Cuando un ensayo de diagnóstico se va a basar en proteínas presenilina, son posibles varios enfoques. Por ejemplo, el diagnóstico se puede conseguir controlando las diferencias en la movilidad electroforética de proteínas normales y mutantes. Tal enfoque será particularmente útil para identificar mutantes en los que están presentes substituciones de carga, o en los que las inserciones, eliminaciones o substituciones han dado como resultado un cambio significativo en la migración electroforética de la proteína resultante. Alternativamente, el diagnóstico se puede basar en diferencias en los diagramas de escisión proteolítica de proteínas normales y mutantes, diferencias en relaciones molares de los distintos restos aminoácido, o por ensayos funcionales que demuestran la función alterada de los productos génicos.

En realizaciones preferidas, los diagnósticos basados en proteínas emplearán diferencias en la capacidad de los anticuerpos para unirse a proteínas presenilina normal y mutante (especialmente hPS1 o hPS2). Tales ensayos de diagnóstico pueden emplear anticuerpos que se unen a las proteínas normales pero no a las proteínas mutantes, o viceversa. En particular, se puede emplear un ensayo en el que una pluralidad de anticuerpos monoclonales, cada uno capaz de unirse a un epitopo mutante. Los niveles de anticuerpo antimutante que se une en una muestra obtenida de un sujeto de ensayo (visualizados, por ejemplo, por radiomarcado, ELISA o quimiluminiscencia) se pueden comparar con los niveles de unión a una muestra de control. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que se unen a presenilinas normales pero no a mutantes, y las disminuciones en el nivel de unión del anticuerpo se pueden usar para distinguir individuos homocigóticos normales de heterocigóticos y homocigóticos mutantes. Tales diagnósticos de anticuerpos se pueden usar para inmunohistoquímica in situ usando muestras de biopsia de tejidos de SNC obtenidos antemortem o postmortem, incluyendo estructuras neuropatológicas asociadas a estas enfermedades tales como ovillos neurofibrilares y placas amiloides, o se pueden usar con muestras de fluido tales como fluido cerebroespinal o con tejidos periféricos tales como glóbulos blancos.

C. Exploraciones y diagnósticos basados en ácido nucléico

Cuando el ensayo de diagnóstico se va a basar en ácidos nucleicos de una muestra, el ensayo puede estar basado en mARN, cADN o ADN genómico. Cuando se usa mARN de una muestra, valen muchas de las mismas consideraciones con respecto a los tejidos fuente y a la posibilidad de corte y empalme alternativo. Esto es, puede haber poca o ninguna expresión de transcritos a menos que se escojan o estén disponibles fuentes de tejido apropiadas, el corte y empalme alternativo puede dar como resultado la pérdida de alguna información o dificultad de interpretación. Sin embargo, hemos mostrado ya (Sherrington et al., 1995; Rogaev, 1995) que las mutaciones en, UTR 5', UTR 3', marco de lectura abierta y sitios de corte y empalme tanto de PS1 como de PS2 se pueden identificar de buena fuente en mARN/cADN aislado de glóbulos blancos y/o fibroblastos de la piel. Si se ensaya mARN, cADN o ADN genómico, se pueden usar métodos estándar bien conocidos en la técnica para detectar la presencia de una secuencia particular in situ o in vitro (véase, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). En general, sin embargo, se puede examinar cualquier tejido con células
nucleadas.

El ADN genómico usado para el diagnóstico se puede obtener de células del cuerpo, tales como aquellas presentes en la sangre, biopsia de tejidos, muestra quirúrgica, o material de autopsia. El ADN se puede aislar y usar directamente para la detección de una secuencia específica o se puede amplificar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) previamente al análisis. Similarmente, se pueden usar también ARN o cADN, con o sin amplificación por PCR. Para detectar una secuencia específica de ácido nucléico, se puede emplear secuenciación directa de nucleótidos, hibridación usando oligonucleótidos específicos, digestión con enzimas de restricción y cartografía, cartografía por PCR, protección de Rnasa, escisión química de errores de emparejamiento, detección mediada por ligasa y varios otros métodos. Los oligonucleótidos específicos para secuencias particulares se pueden sintetizar químicamente y marcar radiactivamente o no radiactivamente (por ejemplo, marcadores de biotina, bromuro de etidio), e hidridar a muestras individuales inmovilizadas en membranas u otros soportes sólidos (por ejemplo, por hibridación en gota "dot-blot" o transferencia de geles después de la electroforesis), o en disolución. La presencia o ausencia de las secuencias objetivo se puede visualizar a continuación usando métodos tales como autoradiografía, fluorometría, o colorimetría. Estos procedimientos se pueden automatizar usando oligonucleótidos cortos redundantes de secuencia conocida fijados en alta densidad a chips de silicio.

(1) Sondas e iniciadores apropiados

Para hibridación, protección de Rnasa, detección mediada por ligasa, amplificación por PCR o cualquier otro método estándar descrito aquí y bien conocido en la técnica, serán útiles como sondas y/o iniciadores varias subsecuencias de las secuencias de presenilina descritas aquí o si no facilitadas aquí. Estas secuencias o subsecuencias incluirán tanto secuencias de presenilina normal como secuencias mutantes perjudiciales. En general, las secuencias útiles incluirán por lo menos 8-9, más preferentemente 10-50, y lo más preferentemente 18-24 nucleótidos consecutivos de los intrones, exones o bordes intrón/exón de presenilina. Dependiendo de la secuencia objetivo, la especificidad requerida, y los futuros desarrollos tecnológicos, pueden tener también utilidad secuencias más cortas. Por lo tanto, cualquier secuencia derivada de presenilina que se emplea para aislar, clonar, amplificar, identificar o si no manipular una secuencia de presenilina se puede considerar una sonda o iniciador apropiado. Serán contempladas particularmente como útiles las secuencias que incluyen posiciones de nucleótidos de los genes de presenilina en las que se sabe que están presentes las mutaciones que provocan enfermedades, o secuencias que flanquean estas posiciones.

(a) Sondas e iniciadores de PS1

Como se discutió anteriormente, se han identificado ahora varias mutaciones que provocan enfermedades en el gen PS1 humano. La detección de estas y otras mutaciones de PS1 se facilita ahora usando sondas o iniciadores de ácido nucléico aislado derivados de genes PS1 normales o mutantes. Se contemplan particularmente como útiles las sondas o iniciadores derivados de secuencias que codifican el N-terminal, la región TM1-TM2, y la región TM6-TM7. Como se describe anteriormente, sin embargo, se han detectado ya mutaciones que afectan a otras regiones de la proteína PS1 y, usando los métodos descritos aquí, se detectarán más indudablemente. Por lo tanto, la presente invención proporciona sondas e iniciadores de ácido nucleico aislados que corresponden a secuencias normales y mutantes de cualquier porción del gen PS1, incluyendo los intrones y UTRs 5' y 3', que se puede mostrar que están asociados al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.

Meramente como ejemplo, y sin limitar la invención, las sondas e iniciadores derivados del segmento de ADN de hPS1 que rodea inmediatamente a la mutación C410Y se pueden emplear en métodos de exploración y diagnóstico. Esta mutación surge, por lo menos en algunos individuos, de la substitución de una A por G en la posición 1477 de la SEQ ID NO: 1. De este modo, se puede explorar ADN genómico, mARN o cADN adquirido de muestras de sangre periférica de un individuo usando sondas o iniciadores de oligonucleótido que incluyen este sitio potencialmente mutante. Para sondas de hibridación para esta mutación, se pueden emplear sondas de 8-50, y más preferentemente de 18-24 bases que abarcan el sitio de mutación (por ejemplo, bp 1467-1487 de la SEQ ID NO: 1). Si la sonda se va a usar con mARN, debe ser por supuesto complementaria del mARN (y, por lo tanto, corresponde a la hebra no codificante del gen PS1). Para sondas que se van a usar con ADN genómico o cADN, la sonda puede ser complementaria de cualquier hebra. Para detectar secuencias que incluyen esta mutación por métodos de PCR, los iniciadores apropiados incluirían secuencias de 8-50, y preferentemente de 18-24 nucleótidos de longitud derivadas de las regiones que flanquean la mutación en ambos lados, y que corresponden a posiciones en cualquier lugar de 1 a 1000 bp, pero preferentemente 1-200 bp, retiradas del sitio de la mutación. Los iniciadores de PCR que están en 5' respecto al sitio de mutación (en la hebra de codificación) deben corresponder en secuencia a la hebra de codificación del gen PS1 mientras que los iniciadores de PCR que están en 3' respecto al sitio de mutación (en la hebra de codificación) deben corresponder a la hebra antisentido o no codificante (por ejemplo, un iniciador 5' que corresponde a bp 1451-1468 de la SEQ ID NO: 1 y un iniciador 3' que corresponde al complemento de 719-699 de la SEQ ID NO: 14).

Se pueden escoger iniciadores similares para otras mutaciones de PS1 o para los "puntos calientes" mutacionales en general. Por ejemplo, un iniciador de PCR 5' para la mutación M146L (A\rightarrowC en bp 684) puede comprender una secuencia que corresponde a aproximadamente bp 601-620 de la SEQ ID NO: 1 y un iniciador 3' puede corresponder al complemento de aproximadamente bp 1328-1301 de la SEQ ID NO: 8. Adviértase que este ejemplo emplea iniciadores de secuencias tanto intrónicas como exónicas. Como otro ejemplo, un iniciador 5' apropiado para la mutación A246E (C\rightarrowA en bp 985) puede comprender una secuencia que corresponde a aproximadamente bp 907-925 de la SEQ ID NO: 1 o un iniciador 3' que corresponde al complemento de aproximadamente bp 1010-990 de la SEQ ID NO: 1. Como otro ejemplo, un iniciador 5' apropiado para la mutación H163R (A\rightarrowG en bp 736 de la SEQ ID NO: 1 o bp 419 de la SEQ ID NO: 9) que comprende una secuencia que corresponde a aproximadamente bp 354-375 de la SEQ ID NO: 9 con un iniciador 3' que corresponde al complemento de aproximadamente bp 581-559 de la SEQ ID NO: 9. Similarmente, se pueden emplear secuencias intrónicas o exónicas, por ejemplo, para producir un iniciador 5' para la mutación L286V (C\rightarrowG en bp 1104 de la SEQ ID NO: 1 o bp 398 de la SEQ ID NO: 11) que comprende una secuencia que corresponde a aproximadamente bp 249-268 de la SEQ ID NO: 11 o bp 1020-1039 de la SEQ ID NO: 1, y un iniciador 3' que corresponde al complemento de aproximadamente bp 510-491 de la SEQ ID NO: 11.

Se debe advertir también que las sondas e iniciadores pueden incluir nucleótidos mutados específicos. De este modo, por ejemplo, se puede producir una sonda de hibridación o iniciador 5' para la mutación C410Y que comprende una secuencia que corresponde a aproximadamente bp 1468-1486 de la SEQ ID NO: 1 para explorar o amplificar alelos normales, o que corresponde a la misma secuencia pero con el bp que corresponde a bp 1477 alterado (G\rightarrowT) para explorar o amplificar alelos mutantes.

(b) Sondas e iniciadores de PS2

Las mismas consideraciones generales descritas anteriormente con respecto a sondas e iniciadores para PS1, valen igualmente para sondas e iniciadores para PS2. En particular, las sondas e iniciadores pueden corresponder a secuencias de intrón, exón, o borde de intrón/exón, pueden corresponder a secuencias de las hebras codificante o no codificante (antisentido), y pueden corresponder a secuencias normales o mutantes.

Meramente como ejemplos, la mutación N141I de PS1 (A\rightarrowT en bp 787) se puede explorar por amplificación por PCR del fragmento de ADN circundante usando un iniciador 5' que corresponde a aproximadamente bp 733-751 de la SEQ ID NO: 18 y un iniciador 3' que corresponde al complemento de aproximadamente bp 846-829 de la SEQ ID NO: 18. Similarmente, un iniciador 5' para la mutación M239V (A\rightarrowG en bp 1080) puede comprender una secuencia que corresponde a aproximadamente bp 1009-1026 y un iniciador 3' puede corresponder al complemento de aproximadamente bp 1118-1101 de la SEQ ID NO: 18. Como otro ejemplo, la secuencia que codifica la región que rodea la mutación I420T (T\rightarrowC en bp 1624) se puede explorar por amplificación por PCR de ADN genómico usando un iniciador 5' que corresponde a aproximadamente bp 1576-1593 de la SEQ ID NO: 18 y un iniciador 3' que corresponde al complemento de aproximadamente bp 1721-1701 de la SEQ ID NO: 18 para generar un producto de 146 pares de bases. Este producto, por ejemplo, se puede sondear con oligonucleótidos específicos de alelo para secuencias de tipo natural (por ejemplo, bp 1616-1632 de la SEQ ID NO: 18) y/o mutantes (por ejemplo, bp 1616-1632 de la SEQ ID NO: 18 con T\rightarrowC en bp 1624).

(2) Exploración de hibridación

Para la detección in situ de una presenilina PS1, PS2 u otra secuencia de ácido nucléico relacionada con la presenilina, se puede preparar una muestra de tejido por técnicas estándar y poner en contacto a continuación con una o más de las anteriormente descritas sondas, preferentemente una que está marcada para facilitar la detección, y se realiza un ensayo para hibridación de ácido nucléico en condiciones severas que permiten la hibridación solo entre la sonda y secuencias altamente o perfectamente complementarias. Debido a que la mayoría de las mutaciones de PS1 y PS2 detectadas hasta la fecha consisten en la substitución de un solo nucleótido, se requerirán condiciones de hibridación de alta severidad para distinguir secuencias normales de la mayoría de las secuencias mutantes. Cuando se conocen los genotipos de presenilina de los padres del sujeto se pueden escoger las sondas en consecuencia. Alternativamente, se pueden emplear sondas para varios mutantes secuencialmente o en combinación. Debido a que la mayoría de los individuos que tienen mutantes de presenilina serán heterocigóticos, se pueden emplear también sondas para secuencias normales y los individuos normales homocigóticos se pueden distinguir de los mutantes heterocigóticos por la cantidad de unión (por ejemplo, por la intensidad de la señal radiactiva). En otra variación, se pueden emplear ensayos de unión competitiva en los que se pueden usan sondas tanto normales como mutantes pero solo una está marcada.

(3) Cartografía de restricción

Las alteraciones de la secuencia pueden también crear o destruir sitios de reconocimiento de enzima de restricción fortuitos que se revelan por el uso de digestión enzimática apropiada seguido de hibridación gel-blot. Los fragmentos de ADN que llevan el sitio (normal o mutante) se detectan por su aumento o reducción de tamaño, o por el aumento o disminución de los números de fragmentos de restricción correspondientes. Tal análisis del polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP), o cartografía de restricción, se puede emplear con ADN genómico, mARN o cADN. Las secuencias de presenilina se pueden amplificar por PCR usando los iniciadores anteriormente descritos previamente a la restricción, en tal caso las longitudes de los productos de PCR pueden indicar la presencia o ausencia de sitios de restricción particulares, y/o se pueden someter a restricción después de la amplificación. Los fragmentos de presenilina
se pueden visualizar por cualquier medio conveniente (por ejemplo, bajo luz UV en presencia de bromuro de etidio).

Meramente como ejemplos, se advierte que la mutación M146L de PS1 (A\rightarrowC en bp 684 de la SEQ ID NO: 1) destruye un sitio PsphI; la mutación H163R (A\rightarrowG en bp 736) destruye un sitio N1aIII; la mutación A246E (C\rightarrowA en bp 985) crea un sitio DdeI; y la mutación L286V (C\rightarrowG en bp 1104) crea un sitio PvuIII. Uno de experiencia media en la técnica puede escoger fácilmente entre las muchas enzimas de restricción comercialmente disponibles y, basado en las secuencias normales y mutantes descritas y si no facilitadas aquí, realizar un análisis de cartografía de restricciones que detectará virtualmente cualquier mutación de presenilina.

(4) Cartografía por PCR

En otra serie de realizaciones, se puede detectar una mutación de substitución de una sola base basado en la diferente longitud del producto de PCR o producción en PCR. De este modo, los iniciadores que integran sitios mutantes o que, preferentemente, tienen términos 3' en sitios de mutación, se pueden emplear para amplificar una muestra de AND genómico, mARN o cADN de un sujeto. Un error de emparejamiento en un sitio mutacional se puede esperar que altere la capacidad de los iniciadores normal o mutante para promover la reacción de la polimerasa y, por ello, dar como resultado la producción de perfiles que difieren entre sujetos normales y heterocigóticos y/o mutantes de presenilina homocigóticos. Los productos de PCR del gen normal y mutante se pueden separar diferencialmente y detectar por técnicas estándar, tales como electroforesis en poliacrilamida o gel de agarosa y visualización con sondas marcadas, bromuro de etidio o similares. Debido a la posible no específica iniciación o translectura de sitios de mutación, así como al hecho de que la mayoría de los portadores de alelos mutantes serán heterocigóticos, el potencial de esta técnica puede ser bajo.

(5) Movilidad electroforética

El ensayo genético basado en diferencias de la secuencia de ADN se puede conseguir también por detección de alteraciones en la movilidad electroforética de ADN, mARN o fragmentos de cADN en geles. Las pequeñas eliminaciones o inserciones en la secuencia, por ejemplo, se pueden visualizar por electroforesis en gel de alta resolución de ADN de una o dos hebras, o como cambios en el diagrama de migración de heterodúplex de ADN en electroforesis en gel no desnaturalizante. Se pueden detectar también mutaciones o polimorfismos de presenilina por métodos que explotan las desviaciones de movilidad debido a polimorfismos conformacionales de una sola hebra (SSCP) asociados a mARN o estructuras secundarias de ADN de una sola hebra.

(6) Escisión química de errores de emparejamiento

Las mutaciones en las presenilinas se pueden detectar también empleando el método de escisión química de errores de emparejamiento (CCM) (véase, por ejemplo, Saleeba and Cotton, 1993, y sus referencias). En esta técnica, se pueden mezclar sondas (hasta \sim 1 kb) con una muestra de ADN, cADN o mRNA obtenido de un sujeto. La muestra y las sondas se mezclan y se someten a condiciones que permiten la formación de heterodúplex (si lo hay). Preferentemente, tanto la sonda como los ácidos nucleicos son de doble hebra, o la sonda y la muestra se pueden amplificar conjuntamente por PCR, para asegurar la creación de todos los heterodúplex mal emparejados posibles. Los restos T mal emparejados son reactivos con tetróxido de osmio y los restos C mal emparejados son reactivos con hidroxilamina. Debido a que cada A mal emparejado estará acompañado de por un T mal emparejado, y a que cada G mal emparejado estará acompañado por un C mal emparejado, cualquier diferencia de nucleótido entre la sonda y la muestra (incluyendo pequeñas inserciones o eliminaciones) conducirá a la formación de por lo menos un heterodúplex reactivo. Después del tratamiento con tetróxido de osmio y/o hidroxilamina para modificar cual sitio mal emparejado, la mezcla se somete a escisión química en cualquier sitio de error de emparejamiento modificado, por ejemplo, por reacción con piperidina. La mezcla se puede analizar a continuación por técnicas estándar tales como electroforesis en gel para detectar productos de escisión que indicarían errores de emparejamiento entre la sonda y la muestra.

(7) Otros métodos

Varios otros métodos para detectar mutaciones de presenilina, basados en las secuencias de presenilina descritas y si no facilitadas aquí, serán evidentes para los de experiencia media en la técnica. Cualquiera de estos se puede emplear según la presente invención. Estos incluyen, pero no están limitados a, ensayos de protección de nucleasa (S1 o mediada por ligasa), PCR ligada, electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE; véase, por ejemplo, Fischer and Lerman, 1983), identificación de endonucleasa de restricción combinada con SSCP (REF-SSCP; véase, por ejemplo, Liu and Sommer, 1995), y similares.

D. Otras exploraciones y diagnósticos

En casos heredados, como primer episodio, y en casos no heredados como segundo episodio debido al estado de la enfermedad, puede ocurrir un procesado anormal de PS1, PS2, APP, o proteínas que reaccionan con PS1, PS2 o APP. Esto se puede detectar como anormal fosforilación, glicosilación, glicación amidación o productos de escisión proteolítica en tejidos o fluidos corporales (por ejemplo, CSF o sangre).

El diagnóstico se puede realizar también por observación de alteraciones en la transcripción de presenilina, traducción, y modificación y procesado post-traducción así como alteraciones en el tráfico intracelular y extracelular de los productos del gen de presenilina en el cerebro y células periféricas. Tales cambios incluirán alteraciones en la cantidad de ARN mensajero de presenilina y/o proteína, alteración del estado de fosforilación, anormal localización/distribución intracelular, anormal distribución extracelular, etc. Tales ensayos incluirán: Northern blots (con sondas de nucleótido específico y no específico de presenilina), Western blots y ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) (con anticuerpos generados específicamente para presenilina o un dominio funcional de presenilina, incluyendo varios estados de modificación post-traducción que incluyen isoformas glicosiladas y fosforiladas). Estos ensayos se pueden realizar en tejidos periféricos (por ejemplo, células sanguíneas, plasma, tejidos cultivados u otros tejidos de fibroblasto, etc.) así como en biopsias de tejidos del SNC obtenidos antemortem o postmortem, y en fluido cerebroespinal. Tales ensayos pueden incluir también hibridación in situ e inmunohistoquímica (para localizar ARN mensajero y proteínas para compartimentos subcelulares específicos y/o dentro de estructuras neuropatológicas asociadas a estas enfermedades tales como ovillos neurofibrilares y placas amiloides).

E. Kits de exploración y diagnóstico

Según la presente invención, se proporcionan también kits de diagnóstico que incluirán los reactivos necesarios para las exploraciones diagnósticas anteriormente descritas. Por ejemplo, se pueden proporcionar kits que incluyen anticuerpos o conjuntos de anticuerpos que son específicos de uno o más epitopos mutantes. Estos anticuerpos, en particular, pueden estar marcados por cualquiera de los medios estándar que facilitan la visualización de la unión. Alternativamente, se pueden proporcionar kits en los que están presentes sondas de oligonucleótido o iniciadores de PCR, como se describe anteriormente, para la detección y/o amplificación de PS1 mutante, PS2 u otras secuencias de nucleótido relacionadas con presenilina. De nuevo, tales sondas pueden estar marcadas para la detección más fácil de la hibridación específica. Cuando sea apropiado para las distintas realizaciones de diagnóstico descritas anteriormente, las sondas o anticuerpos de oligonucleótido en tales kits pueden estar inmovilizadas a substratos y se pueden proporcionar controles apropiados.

10. Métodos de tratamiento

Se entiende que esta sección se refiere a métodos de tratamiento en los que se pueden usar las moléculas de la presente invención.

La presente invención proporciona ahora una base para la intervención terapéutica en enfermedades que son causadas, o que pueden ser causadas por mutaciones en las presenilinas. Como se detalló anteriormente, las mutaciones en los genes hPS1 y hPS2 se han asociado al desarrollo de formas de aparición temprana de enfermedad de Alzheimer y, por lo tanto, la presente invención se refiere particularmente al tratamiento de sujetos diagnosticados, o con riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. En vista de la expresión de los genes PS1 y PS2 en varios tejidos, sin embargo, es bastante probable que los efectos de las mutaciones en estos lugares no estén restringidas al cerebro y, por lo tanto, pueden causar trastornos además de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a enfermedades que se manifiestan en otros tejidos que pueden surgir de mutaciones, error de expresión, error de metabolismo u otras alteraciones heredadas o adquiridas en los genes y productos génicos de presenilina. Además, aunque la enfermedad de Alzheimer se manifiesta como trastorno neurológico, esta manifestación puede ser causada por mutaciones en las presenilinas que primero afectan a tejidos de otros órganos (por ejemplo, hígado), que a continuación pueden desprender factores que afectan a la actividad cerebral, y finalmente causan la enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, al considerar las distintas terapias descritas a continuación, se entiende que tales terapias pueden ir dirigidas a órganos distintos del cerebro, tales como corazón, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas, donde se expresan también PS1 y/o PS2.

Sin estar vinculados a ninguna teoría particular de la invención, el efecto de las mutaciones relacionadas con la enfermedad de Alzheimer en las presenilinas parece ser una ganancia de una nueva función, o una aceleración de una función normal, lo que causa directa o indirectamente el procesado aberrante de la proteína precursora de amiloide (APP) en péptido A\beta, homeostasis de fosforilación anormal, y/o apóptosis anormal en el cerebro. Tal ganancia de función o aceleración del modelo de función sería consistente con la aparición en adultos de los síntomas y la herencia dominante de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el mecanismo por el que las mutaciones en las presenilinas pueden causar estos efectos sigue sin ser conocido.

Se sabe que la APP se puede metabolizar por dos caminos. En el primero, la APP se metaboliza por el paso a través del aparato de Golgi y a continuación a los caminos secretores vía vesículas revestidas de clatrina. La APP madura se pasa a continuación a la membrana plasmática en la que se escinde por \alpha-secretasa para producir una fracción soluble (Proteasa Nexin II) más un péptido de C-terminal no amiloidogénico (Selkoe et al., 1995; Gandy et al., 1993). Alternativamente, la APP madura se puede dirigir al camino endosoma-lisosoma donde sufre escisión por \beta y \gamma-secretasa para producir péptidos A\beta. Los derivados de péptido A\beta de APP son neurotóxicos (Selkoe et al., 1994). El estado de fosforilación de la célula determina el equilibrio relativo entre los caminos de \alpha-secretasa (no amiloidogénica) o A\beta (camino amiloidogénico) (Gandy et al., 1993), y se puede modificar farmacológicamente por ésteres de forbol, agonistas muscarínicos y otros agentes. El estado de fosforilación de la célula parece ser mediado por factores citosólicos (especialmente proteína quinasa C) que actúan sobre una o más proteínas integrales de membrana en el aparato de Golgi.

Sin estar vinculados a ninguna teoría particular de la invención, las presenilinas, en particular hPS1 o hPS2 (que llevan varias secuencias de consenso de fosforilación para proteína quinasa C), pueden ser las proteínas integrales de membrana cuyo estado de fosforilación determina el equilibrio relativo entre los caminos de \alpha-secretasa y A\beta. De este modo, las mutaciones en los genes PS1 o PS2 pueden causar alteraciones en la estructura y función de sus productos conduciendo a interacciones defectuosas con elementos reguladores (por ejemplo, proteína quinasa C) o con APP, promoviendo por ello que la APP se dirija al camino miloidogénico endosoma-lisosoma. Los factores medioambientales (por ejemplo, virus, toxinas o envejecimiento ) pueden tener también efectos similares sobre PS1 o PS2.

De nuevo sin estar vinculados a ninguna teoría particular de la invención, se advierte también que tanto las proteínas PS1 como PS2 tienen sustancial homología de la secuencia de aminoácidos con las proteínas de canal iónico y receptores humanos. Por ejemplo, la proteína PS2 muestra sustancial homología con la \alpha-subunidad del canal de sodio humano (E=0,18, P=0,16, identidades = 22-27% en dos regiones de por lo menos 35 restos aminoácido) usando el paradigma BLASTP de Altschul et al. (1990). Otras enfermedades (tales como hipertermia maligna y parálisis periódica hipercalémica en seres humanos, y la degeneración de las neuronas mecanosensoriales en C. elegans) surgen de mutaciones en proteínas de receptor o de canales iónicos. La mutación del gen PS1 o PS2 podría, por lo tanto, afectar a funciones similares y conducir a la enfermedad de Alzheimer y/u otras enfermedades psiquiátricas y neurológicas.

Las terapias para tratar enfermedades asociadas a presenilina tales como AD se pueden basar en (1) la administración de proteínas PS1 o PS2 normales, (2) terapia génica con genes PS1 o PS2 normales para compensar o reemplazar los genes mutantes, (3) terapia génica basada en secuencias antisentido para genes PS1 o PS2 mutantes o que elimina los genes mutantes, (4) terapia génica basada en secuencias que codifican una proteína que bloquea o corrige los efectos perjudiciales de los PS1 o PS2 mutantes, (5) inmunoterapia basada en anticuerpos de proteínas PS1 o PS2 normales y/o mutantes, o (6) pequeñas moléculas (fármacos) que alteran la expresión de PS1 o PS2, bloquean las interacciones anormales entre formas mutantes de PS1 o PS2 y otras proteínas o ligandos, o que si no bloquean la función aberrante de las proteínas PS1 o PS2 mutantes alterando la estructura de las proteínas mutantes, mejorando su eliminación metabólica, o inhibiendo su función.

A. Terapia proteínica

El tratamiento de la enfermedad de Alzheimer relacionada con presenilina, u otros trastornos que son el resultado de mutaciones de presenilina, se puede realizar reemplazando la proteína mutante con proteína normal, modulando la función de la proteína mutante, o proporcionando un exceso de proteína para reducir el efecto de cualquier función aberrante de las proteínas mutantes.

Para conseguir esto, es necesario obtener, como se describe y facilita aquí, grandes cantidades de proteína PS1 o proteína PS2 sustancialmente pura de sistemas de células cultivadas que pueden expresar la proteína. El suministro de la proteína a las áreas cerebrales afectadas o a otros tejidos se puede efectuar a continuación usando sistemas apropiados de envase o administración que incluyen, por ejemplo, suministro de proteína mediado por liposoma a las células objetivo.

B. Terapia génica

En una serie de realizaciones, se puede emplear terapia génica en la que se introducen en pacientes copias normales del gen PS1 o del gen PS2 para que codifiquen con éxito proteína normal en uno o más tipos de células afectadas. El gen se puede suministrar a esas células en una forma en la que puede ser captado y codifica proteína suficiente para proporcionar la función efectiva. De este modo, se prefiere que el gen recombinante se una funcionalmente a un promotor fuerte para proporcionar un alto nivel de expresión que compensará, o dejará fuera de competencia a las proteínas mutantes. Como se advierte anteriormente, la construcción recombinante puede contener elementos reguladores endógenos o exógenos, elementos reguladores inducibles o reprimibles, o elementos reguladores específicos del tejido.

En otra serie de realizaciones, se puede emplear terapia génica para reemplazar el gen mutante por recombinación homóloga con una construcción recombinante. La construcción recombinante puede contener una copia normal del gen de presenilina insertado, en tal caso el defecto se corrige in situ, o puede contener una construcción "knock-out" que introduce un codón de detención, mutación de sentido erróneo, o eliminación que abole la función del gen mutante. Se debe advertir en este aspecto que tal construcción puede eliminar las copias tanto normal como mutante del gen de presenilina insertado en un individuo heterocigótico, pero la pérdida total de función del gen de presenilina puede ser menos perjudicial para el individuo que la progresión continua del estado de enfermedad.

En otra serie de realizaciones, se puede emplear terapia génica antisentido. La terapia antisentido se basa en el hecho de que la supresión específica de la secuencia de la expresión del gen se puede conseguir por hibridación intracelular entre mARN o ADN y una especie antisentido complementaria. La formación de un dúplex híbrido puede interferir a continuación con la transcripción del gen y/o el procesado, transporte, traducción y/o estabilidad del mARN de presenilina objetivo. Las estrategias antisentido pueden usar varios enfoques que incluyen la administración de oligonucleótidos antisentido o análogos de oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, análogos con estructuras principales de fosforotioato) o transfección con vectores de expresión de RNA antisentido. De nuevo, tales vectores pueden incluir regiones reguladoras endógenas o exógenas, elementos reguladores inducibles o reprimibles, o elementos reguladores específicos del tejido.

En otra serie de realizaciones, se puede usar terapia génica para introducir una construcción recombinante que codifica una proteína o péptido que bloquea o si no corrige la función aberrante causada por un gen de presenilina mutante. En una realización, el gen recombinante puede codificar un péptido que corresponde a un dominio mutante de una presenilina que se ha encontrado que interacciona anormalmente con otra proteína celular u otro ligando celular. De este modo, por ejemplo, si se encuentra que un dominio mutante TM6\rightarrow7 interacciona con una proteína celular particular pero el correspondiente dominio TM6\rightarrow7 normal no sufre esta interacción, se puede emplear terapia génica para proporcionar un exceso del dominio TM6\rightarrow7 mutante que puede competir con la proteína mutante e inhibir o bloquear la interacción aberrante. Alternativamente, la porción de una proteína que interacciona con una presenilina mutante, pero no con una normal, se puede codificar y expresar por medio de una construcción recombinante para competir, y por ello inhibir o bloquear, la interacción aberrante. Finalmente, en otra realización, se puede conseguir el mismo efecto insertando una segunda proteína mutante por terapia génica en un enfoque similar a la corrección de las mutaciones "Deg 1(d)" y "Mec 4(d)" en C. elegans por inserción de transgenes mutantes.

Se pueden usar vectores retrovirales para terapia génica de células somáticas especialmente debido a su alta eficiencia de infección e integración estable y expresión. Las células insertadas sin embargo deben ser capaces de dividirse y la expresión de los niveles de proteína normal debe ser alta porque la enfermedad es dominante. Los genes PS1 o PS2 completos, las subsecuencias que codifican dominios funcionales de las presenilinas, o cualquiera de los otros péptidos terapéuticos descritos anteriormente, se pueden clonar en un vector retroviral y conducir desde su promotor endógeno, desde la repetición terminal larga retroviral, o desde un promotor especifico al tipo de célula objetivo de interés (por ejemplo, neuronas). Otros vectores virales que se pueden usar incluyen virus adenoasociados, virus vaccinia, virus del papiloma bovino, o un virus herpes tal como el virus de Epstein-Barr.

C. Inmunoterapia

También es posible la inmunoterapia para la enfermedad de Alzheimer. Se generan anticuerpos para una proteína PS1 o PS2 mutante (o una de sus porciones) y se administran al paciente para unirse a o bloquear la proteína mutante y prevenir sus efectos perjudiciales. Simultáneamente, se podría fomentar la expresión del producto proteínico normal. Alternativamente, se generan anticuerpos para complejos específicos entre PS1 o PS2 normal o mutante y sus compañeros de interacción.

Un enfoque adicional es estimular la producción de anticuerpo endógeno para el antígeno deseado. La administración podría ser en la forma de una preparación inmunógena de una sola vez o inmunización en vacuna. Se puede preparar una composición inmunógena en forma de disoluciones líquidas o emulsiones inyectables. La proteína PS1 o PS2 u otro antígeno se puede mezclar con excipientes farmacéuticamente aceptables compatibles con la proteína. Tales excipientes pueden incluir agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol y sus combinaciones. La composición inmunógena y la vacuna pueden contener adicionalmente substancias auxiliares tales como agentes emulsionantes o adyuvantes para mejorar la efectividad. Las composiciones inmunógenas y vacunas se pueden administrar parenteralmente por inyección subcutáneamente o intramuscularmente.

Las preparaciones inmunógenas y vacunas se administran en tal cantidad como sea terapéuticamente efectiva, protectora e inmunógena. La dosificación depende de la ruta de administración y variará según el tamaño del hospedante.

D. Terapia de pequeñas moléculas

Tal como se describe y facilita aquí, la presente invención proporciona varios métodos de identificar pequeñas moléculas u otros compuestos que pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer u otros trastornos causados por mutaciones en las presenilinas. De este modo, por ejemplo, la presente invención proporciona métodos de identificar proteínas, y en particular métodos para identificar proteínas u otros componentes celulares que se unen o si no interaccionan con presenilinas mutantes pero no con presenilinas normales. La invención proporciona también métodos para identificar pequeñas moléculas que se pueden usar para afectar a las interacciones aberrantes entre presenilinas mutantes y tales proteínas u otros componentes celulares.

Tales interacciones, que implican presenilinas mutantes pero no las normales, no solo proporcionan información útil para entender los caminos bioquímicos afectados por mutaciones en las presenilinas, y causantes de la enfermedad de Alzheimer, sino que también proporcionan dianas terapéuticas inmediatas para la intervención en la etiología de la enfermedad. Identificando estas proteínas y analizando estas interacciones, es posible explorar o diseñar compuestos que contrarrestan o previenen la interacción, proporcionando de este modo un posible tratamiento para interacciones anormales. Estos tratamientos alterarían las interacciones de las presenilinas con estos compañeros, alterarían la función de la proteína de interacción, alterarían la cantidad o distribución de tejido o expresión de los compañeros de interacción, o alterarían propiedades similares de las presenilinas mismas.

Se pueden diseñar terapias para modular estas interacciones y de este modo para modular la enfermedad de Alzheimer y los otros estados asociados a anormalidades adquiridas o heredadas de los genes PS1 o PS2 o sus productos génicos. La eficacia potencial de estas terapias se puede ensayar analizando la afinidad y función de estas interacciones después de la exposición al agente terapéutico por medidas farmacocinéticas estándar de afinidad (Kd y Vmax etc.) usando péptidos sintéticos o proteínas recombinantes que corresponden a dominios funcionales del gen PS1, el gen PS2 u otros homólogos de presenilina. Otro método para ensayar el efecto de cualquier interacción que implica dominios funcionales tales como el bucle hidrófilo es controlar los cambios en el tráfico intracelular y la modificación post-traducción de los genes relevantes por hibridación in situ, inmunohistoquímica, Western blots y estudios de seguimiento metabólico usando radioisótopos, en presencia de, y en ausencia de, los agentes terapéuticos. Un método adicional es controlar los efectos de los episodios "aguas abajo" que incluyen (i) cambios en el metabolismo intracelular, tráfico y inserción dirigida de APP y sus productos; (ii) cambios en episodios de segundo mensajero, por ejemplo, Ca^{2+} intracelular de cAMP, actividades de proteína quinasa, etc.

Como se advierte anteriormente, las presenilinas pueden estar implicadas en el metabolismo de APP y el estado de fosforilación de las presenilinas puede ser crítico para el equilibrio entre los caminos de \alpha-secretasa y A\beta del procesado de APP. Usando las células transformadas y modelos animales de la presente invención, uno está capacitado para entender mejor estos caminos y los episodios aberrantes que ocurren en mutantes de presenilina. Usando este conocimiento, uno puede diseñar a continuación estrategias terapéuticas para contrarrestar los efectos perjudiciales de los mutantes de presenilina.

Para tratar la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, el estado de fosforilación de PS1 se puede alterar por agentes químicos y bioquímicos (por ejemplo, fármacos, péptidos y otros compuestos) que alteran la efectividad de la proteína quinasa C y otras proteína quinasas, o que alteran la actividad de proteína fosfatasas, o que modifican la disponibilidad de PS1 para ser modificada post-traducción. Las interacciones de quinasas y fosfatasas con las proteínas presenilina, y las interacciones de las proteínas presenilina con otras proteínas implicadas en el tráfico de APP dentro del aparato de Golgi, se pueden modular para disminuir el tráfico de vesículas de Golgi al camino endosoma-lisosoma, inhibiendo por ello la producción de péptido A\beta. Tales compuestos incluirán análogos de péptido de APP, PS1, PS2 y otros homólogos de presenilina, así como otras proteínas de interacción, lípidos, azúcares, y agentes que promueven la glicosilación diferencial de PS1, PS2 y/o sus homólogos; agentes que alteran la semivida biológica de mARN o proteínas presenilina, incluyendo anticuerpos y oligonucleótidos antisentido; y agentes que actúan sobre la transcripción de PS1 y/o PS2.

El efecto de estos agentes en líneas celulares y animales completos se puede controlar controlando la transcripción, traducción, y modificación post-traducción de PS1 y/o PS2 (por ejemplo, fosforilación o glicosilación), así como el tráfico intracelular de PS1 y/o PS2 a través de varios compartimentos intracelulares y extracelulares. Los métodos para estos estudios incluyen Western y Northern blots, inmunoprecipitación después del marcado metabólico (pulse-chase) con metionina radiomarcada y ATP, e inmunohistoquímica. El efecto de estos agentes se puede controlar también usando estudios que examinan las afinidades de unión relativas y las cantidades relativas de proteínas PS1 y/o PS2 implicadas en interacciones con proteína quinasa C y/o APP, usando ensayos de afinidad de unión estándar o coprecipitación y Western blots usando anticuerpos para proteína quinasa C, APP, PS1, PS2, u otros homólogos de presenilina. El efecto de estos agentes se puede controlar también evaluando la producción de péptidos A\beta por ELISA antes y después de la exposición al supuesto agente terapéutico (véase, por ejemplo, Huang et al., 1993). El efecto se puede controlar también evaluando la viabilidad de líneas celulares después de la exposición a sales de aluminio y/o los péptidos A\beta que se cree que son neurotóxicos en la enfermedad de Alzheimer. Finalmente, el efecto de estos agentes se puede controlar evaluando la función cognitiva de animales que tienen genotipos normales en APP y/o sus homólogos de presenilina, tienen transgenes APP humano (con o sin mutaciones), tienen transgenes de presenilina humana (con o sin mutaciones), o tienen cualquier combinación de estos.

Similarmente, como se advierte anteriormente, las presenilinas pueden estar implicadas en la regulación de Ca^{2+} como receptores en canales de iones. Este papel de las presenilinas se puede explorar también usando las líneas celulares transformadas y modelos animales de la invención. Basado en estos resultados, se puede producir un ensayo para la enfermedad de Alzheimer para detectar un receptor anormal o una anormal función del canal de iones relacionada con anormalidades que son adquiridas o heredadas en los genes de presenilina y sus productos, o en uno de los genes homólogos y sus productos. Este ensayo se puede realizar in vivo o in vitro por medidas de flujos del canal de iones y/o voltaje transmembrana o flujos de corriente usando control en parche, fijación de voltaje y colorantes fluorescentes sensibles al calcio intracelular o voltaje transmembrana. El canal de iones o la función receptora defectuosa se pueden ensayar también por medidas de activación de segundos mensajeros tales como AMP cíclico, tirosina quinasas cGMP, fosfatos, incrementos en los niveles de Ca^{2+} intracelular, etc. Las proteínas fabricadas recombinantemente se pueden reconstruir también en sistemas de membrana artificial para estudiar la conductancia del canal de iones. Las terapias que afectan a la enfermedad de Alzheimer (debido a defectos adquiridos/heredados en el gen PS1 o gen PS2; debido a defectos en otros caminos que conducen a esta enfermedad tales como mutaciones en APP; y debido a agentes medioambientales) se pueden ensayar por análisis de su capacidad para modificar un anormal canal de iones o función receptora inducida por mutación en un gen de presenilina. Se podrían también ensayar terapias por su capacidad para modificar la función normal de un canal de iones o capacidad receptora de las proteínas presenilina. Tales ensayos se pueden realizar en células cultivadas que expresan genes/productos génicos de PS1 endógenos normales o mutantes o genes/productos génicos de PS2. Tales estudios se pueden realizar también en células transfectadas con vectores capaces de expresar una de las presenilinas, o dominios funcionales de una de las presenilinas, en forma normal o mutante. Se pueden idear terapias para la enfermedad de Alzheimer para modificar un anormal canal de iones o función receptora del gen PS1 o gen PS2. Tales terapias pueden ser fármacos, péptidos, azúcares, o lípidos convencionales así como anticuerpos u otros ligandos que afectan a las propiedades del producto génico de PS1 o PS2. Tales terapias se pueden realizar también por reemplazo directo del gen PS1 y/o gen PS2 por terapia génica. En el caso de un canal de iones, la terapia génica se podría realizar usando minigenes (cADN más un promotor) o construcciones genómicas que tienen secuencias de ADN genómico para partes o todo el gen de presenilina. Se pueden usar también presenilinas mutantes o secuencias de gen homólogo para contrarrestar el efecto de las anormalidades adquiridas o heredadas de los genes de presenilina como se ha hecho recientemente para el reemplazo del Mec 4 y Deg 1 en C. elegans (Huang and Chalfie, 1994). La terapia se puede dirigir también a aumentar la función receptora o de canal de iones de un homólogo, tal como el gen PS2, para que asuma potencialmente las funciones de una forma mutante de otro homólogo (por ejemplo, un gen PS1 convertido en defectuoso por defectos adquiridos o heredados). La terapia que usa oligonucleótidos antisentido para bloquear la expresión del gen PS1 mutante o del gen PS2 mutante, coordinada con el reemplazamiento del gen con gen PS1 o PS2 normal se puede aplicar también usando técnicas estándar de terapia génica o terapia de reemplazo de proteínas.

Ejemplos Ejemplo 1 Desarrollo del mapa genético, físico "contig" y transcripcional de la región de co-segregación mínima

Se investigó en Mega YAC del CEPH y en las bibliotecas de ADN genómico completo humano PAC RPCI para buscar clones que contienen fragmentos de ADN genómico de la región AD3 del cromosoma 14q24.3 usando sondas de oligonucleótido para cada uno de los 12 lugares marcadores SSR usados en los estudios de unión genética así como marcadores adicionales (Albertsen et al., 1990; Chumakov et al., 1992; Ioannu et al., 1994). Las distancias en el mapa genético entre cada marcador se representan encima del contig, y se derivan de datos publicados (NIH/CEPH Collaborative Mapping Group, 1992; Wang, 1992; Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Los clones recuperados por cada uno de los lugares marcadores iniciales se dispusieron en una serie ordenada de clones que se solapan parcialmente ("contig") usando cuatro métodos independientes. Primero, las secuencias que representan los extremos del inserto de YAC se aislaron por PCR inversa (Riley et al., 1990), y se hibridaron a paneles de Southern blots que contienen digeridos de restricción de ADN de todos los clones de YAC recuperados para todos los lugares iniciales para identificar otros clones de YAC que tienen secuencias que se solapan. Segundo, se realizó PCR inter-Alu en cada YAC, y los patrones de bandas resultantes se compararon en todo el conjunto de clones de YAC recuperados para identificar otros clones que tienen secuencias que se solapan (Bellamne-Chartelot et al., 1992; Chumakov et al., 1992). Tercero, para mejorar la especificidad de la identificación de Alu-PCR, el ADN de YAC se restringió con HaeIII o RsaI, los productos de restricción se amplificaron con iniciadores de consenso tanto Alu como L1H, y los productos se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida. Finalmente, a medida que se generaron STSs adicionales durante la búsqueda de secuencias transcritas, estos STSs se usaron también para identificar solapamientos. El contig resultante era completo excepto por una única discontinuidad entre YAC932C7 que tiene D14S53 y YAC746B4 que contiene D14S61. El orden en el mapa físico de los STSs dentro del contig era en gran medida según el mapa de unión genética para esta región (NIH/CEPH Collaborative Mapping Group, 1992; Wang and Weber, 1992; Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Sin embargo, como con los mapas genéticos, no fue posible resolver sin ambigüedad el orden relativo de los lugares dentro del grupo D14S43/D14S71 y el grupo D14S76/D14S273. Los clones PAC1 sugirieron que el D14S277 es telomérico de D14S268, mientras que los mapas genéticos han sugerido el orden inverso. Además, unas pocas sondas STS no detectaron diagramas de hibridación en por lo menos un clon de YAC que, en base al más austero mapa físico de consenso y del mapa genético, se habría previsto que contenían ese STS. Por ejemplo, el D14S268 (AFM265) y los STSs RSCAT7 están ausentes de YAC788H12. Debido a que estos resultados fueron reproducibles, y ocurrieron con varios marcadores STS diferentes, estos resultados lo más probablemente reflejan la presencia de pequeñas eliminaciones intersticiales dentro de uno de los clones de YAC.

Ejemplo 2 Valores lod de dos puntos acumulativos para marcadores de cromosoma 14q24.3

Los genotipos en cada lugar marcador de microsatélite polimórfico se determinaron por PCR de 100 ng de ADN genómico de todos los miembros del linaje afectados y sin afectar disponibles como se describe previamente (St. Geoge-Hyslop et al., 1992) usando secuencias de iniciador específicas para cada lugar microsatélite (Weissenbach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). La frecuencia de población normal de cada alelo se determinó usando esposas y otros sujetos neurológicamente normales de los mismos grupos étnicos, pero no difirió significativamente de la establecida para poblaciones caucásicas mixtas (Weissembach et al., 1992; Gyapay et al., 1994). Los cálculos de máxima probabilidad supusieron una corrección de la edad de aparición, frecuencias de alelo marcador derivadas de series publicadas de sujetos caucásicos mixtos, y una frecuencia de alelo estimada para la mutación AD3 de 1:1000 como se describió previamente (St. George-Hyslop et al., 1992). Los análisis se repitieron usando iguales frecuencias de alelo marcador, y usando información del fenotipo solo de miembros del linaje afectado como se describe previamente para asegurar que las imprecisiones en los parámetros estimados usados en los cálculos de máxima probabilidad no condujeran a error en los análisis (St. George-Hyslop et al., 1992). Estos análisis suplementarios no alteraron significativamente la evidencia que apoya la relación, o el descubrimiento de episodios de recombinación.

Ejemplo 3 Haplotipos entre marcadores flanqueantes que se segregan con AD3 en FAD

Los haplotipos extendidos entre los marcadores flanqueantes centromérico y telomérico en la copia parental del cromosoma 14 que se segregan con AD3 en catorce linajes de FAD de aparición temprana (linajes NIH2, MGH1, Tor1.1, FAD4, FAD1, MEX1 y FAD2) muestran valores lod específicos de linaje > +3,00 con por lo menos un marcador entre D14S258 y D14S53. Se observan haplotipos parciales idénticos en dos regiones del cromosoma que lleva la enfermedad que se segregan en varios linajes de similar origen étnico. En la región A, se ven alelos compartidos en D14S268 ("B": tamaño de alelo = 126 bp, frecuencia del alelo en caucásicos normales = 0,04; "C": tamaño = 124 bp, frecuencia = 0,38); D14S277 ("B": tamaño = 156 bp, frecuencia = 0,19; "C": tamaño = 154 bp, frecuencia =
0,33); y RSCAT6 ("D": tamaño = 111 bp, frecuencia = 0,25; "E": tamaño = 109 bp, frecuencia = 0,20; "F": tamaño = 107 bp, frecuencia = 0,47). En la región B, se observan alelos de tamaño idéntico en D14S43 ("A": tamaño = 193 bp, frecuencia = 0,01; "D": tamaño = 187 bp, frecuencia = 0,12; "E": tamaño = 185 bp, frecuencia = 0,26; "I":
tamaño = 0,60 bp, frecuencia = 0,38); D14S273 ("3": tamaño = 193 bp, frecuencia = 0,38; "4" tamaño = 191 bp, frecuencia = 0,16; "5" tamaño = 189 bp, frecuencia = 0,34; "6": tamaño = 187 bp, frecuencia = 0,02) y D14S76 ("1": tamaño = bp, frecuencia = 0,01; "5": tamaño = bp, frecuencia = 0,38; "6": tamaño = bp, frecuencia = 0,07; "9": tamaño =
bp, frecuencia = 0,38). Véase Sherrington et al. (1995) para detalles.

Ejemplo 4 Recuperación de secuencias transcritas del intervalo AD3

Las supuestas secuencias transcritas codificadas en el intervalo AD3 se recuperaron usando un método de hibridación directa en el que cortos fragmentos de cADN generados de mRNA de cerebro humano se hibridaron a fragmentos de ADN genómico clonado inmovilizados (Rommens et al., 1993). Las secuencias cortas supuestamente transcritas resultantes se usaron como sondas para recuperar transcritos más largos de bibliotecas de cADN de cerebro humano (Stratagene, La Jolla). Las localizaciones físicas del clon corto original y de los clones de cADN más largo subsecuentemente adquiridos se establecieron por análisis del diagrama de hibridación generado hibridando la sonda a Southern blots que contienen un panel de muestras de ADN total digeridas en EcoRI aisladas de clones de YAC individuales dentro del contig. La secuencia de nucleótidos de cada uno de los clones de cADN más largo se determinó por secuenciado cíclico automatizado (Applied Biosystems Inc., CA) y se comparó con otras secuencias en bases de datos de nucleótidos y proteínas usando el algoritmo blast (Altschul et al., 1990). Los números de acceso para las secuencias transcritas son: L40391, L40392; L40393, L40394, L40395, L40396, L40397, L40398, L40399, L40400, L40401, L40402 y L40203.

Ejemplo 5 Localizando mutaciones en el gen PS1 usando enzimas de restricción

La presencia de la mutación A246E, que crea un sitio de restricción DdeI, se ensayó en ADN genómico por PCR usando un iniciador de extremo marcado que corresponde esencialmente a bp 907-925 de la SEQ ID NO: 1 y un iniciador sin marcar que corresponde al complemento de bp 1010-990 de la SEQ ID NO: 1, para amplificar un fragmento de exón genómico de 84 bp usando un patrón de 100 ng de ADN genómico, MgCl_{2} 2 mM, 10 pmoles de cada iniciador, 0,5U de Taq polimerasa, 250 uM de dNTPs para 30 ciclos de 95ºC x 20 segundos, 60ºC x 20 segundos, 72ºC x 5 segundos. Los productos se incubaron con un exceso de DdeI durante 2 horas según el protocolo del fabricante, y los fragmentos de restricción resultantes se resolvieron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizado al 6% y se visualizaron por autoradiografía. La presencia de la mutación se infirió de la escisión del fragmento de 84 bp debido a la presencia de un sitio de restricción de DdeI. Todos los miembros afectados del linaje FAD1 y varios miembros con riesgo llevaban el sitio DdeI. Ninguno de los liberados obligados (aquellos individuos que no contraen la enfermedad, edad > 70 años), y ninguno de los controles normales llevaba la mutación DdeI.

Ejemplo 6 Localizando mutaciones en el gen PS1 usando oligonucleótidos específicos de alelo

La presencia de la mutación C410Y se ensayó usando oligonucleótidos específicos de alelo. Se amplificaron 100 ng de ADN genómico con un iniciador de secuencia exónica que corresponde a bp 1451-1468 de la SEQ ID NO: 1 y un iniciador de secuencia intrónica opuesta complementario de bp 719-699 de la SEQ ID NO: 14 usando las anteriores condiciones de reacción excepto MgCl_{2} 2,5 mM, y condiciones de ciclado de 94ºC x 20 segundos, 58ºC x 20 segundos, y 72ºC x 10 segundos. El fragmento genómico de 216 bp resultante se desnaturalizó por dilución diez veces en NaOH 0,4 M, EDTA 25 mM, y se sometió a slot blots a vacío en membranas de nailon por duplicado. Un iniciador "natural" marcado en el extremo (correspondiente a bp 1468-1486 de la SEQ ID NO: 1) y un iniciador "mutante" marcado en el extremo (correspondiente a la misma secuencia pero con una substitución G\rightarrowA en la posición 1477) se hibridaron a copias separadas de los filtros de slot blots en SSC x5, Denhardt's x5, 0,5% SDS durante 1 hora a 48ºC, y a continuación se lavó sucesivamente en SSC x2 a 23ºC y SSC x2, SDS al 0,1% a 50ºC y a continuación se expuso a película de rayos X. Todos los miembros afectados medibles así como algunos miembros en peligro de los linajes AD3 y NIH2 poseían la mutación C410Y. Los intentos de detectar la mutación C410Y por SSCP revelaron que un polimorfismo de secuencia intrónica común migró con el mismo patrón de SSCP.

Ejemplo 7 Hibridación de Northern que demuestra la expresión de mARN de proteína PS1 en varios tejidos

Se aisló ARN citoplasmático completo de varias muestras de tejido (incluyendo, corazón, cerebro y diferentes regiones de placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas) obtenidas de patología quirúrgica usando procedimientos estándar tales como purificación con CsCl. El ARN se sometió a electroforesis a continuación en un gel de formaldehído para permitir el fraccionamiento de tamaño. Se preparó la membrana de nitrocelulosa y el ARN se transfirió a continuación sobre la membrana. Se prepararon sondas de cADN marcadas con ^{32}P y se añadieron a la membrana para que ocurriera la hibridación entre la sonda y el ARN. Después de lavar, la membrana se envolvió en película de plástico y se colocó en casetes de formación de imagen que contienen película de rayos X. A continuación se dejó que se revelaran las autoradiografías durante uno a varios días. El tamaño se estableció por comparación con marcadores de ARN estándar. El análisis de las autoradiografías reveló una banda prominente a 3,0 kb de tamaño (véase la Figura 2 de Sherrington et al., 1995). Estos Northern blots demostraron que el gen PS1 se expresa en todos los tejidos examinados.

Ejemplo 8 Sistemas de vector de expresión eucariota y procariota

Se han generado construcciones apropiadas para uso en sistemas de expresión eucariotas y procariotas usando tres clases diferentes de inserciones de secuencia de cADN de nucleótido de PS1. En la primera clase, denominadas construcciones completas, se inserta toda la secuencia de cADN de PS1 en un plásmido de expresión en la orientación correcta, e incluye las secuencias naturales tanto UTR 5' como UTR 3' así como todo el marco de lectura abierta. Los marcos de lectura abierta tienen un casete de secuencia de nucleótidos que permite que el marco de lectura abierta natural se incluya en el sistema de expresión o alternativamente, se puede insertar una sola mutación o una combinación de mutaciones dobles en un marco de lectura abierta. Esto se consiguió retirando un fragmento de restricción del marco de lectura abierta natural usando las enzimas NarI y PflmI y reemplazándolo con un fragmento similar generado por PCR de transcriptasa inversa y que tiene la secuencia de nucleótidos que codifica la mutación M146L o la mutación H163R. Se retiró un segundo fragmento de restricción de la secuencia de nucleótidos normal natural para el marco de lectura abierta por escisión con las enzimas PflmI y NcoI y se reemplazó por un fragmento de restricción que tiene la secuencia de nucleótidos que codifica la mutación A246E, la mutación A260V, la mutación A285V, la mutación L286V, la mutación L392V o la mutación C410Y. Una tercera variante, que tiene una combinación de la mutación M146L o H163R en tándem con una de las mutaciones restantes, se realizó uniendo un fragmento NarI-PflmI que tiene una de las mutaciones anteriores y un fragmento PflmI-NcoI que tiene una de las últimas mutaciones.

La segunda clase de inserciones de cADN, denominadas construcciones truncadas, se construyó retirando la secuencia UTR 5' y parte de la UTR 3' de las secuencias de cADN completo natural o mutante. La secuencia UTR 5' se reemplazó por un oligonucleótido sintético que contiene un sitio de restricción KpnI (GGTAC/C) y una pequeña secuencia (GCCACC) para crear un sitio de iniciación Kozak alrededor del ATG en el comienzo del ORF de PS1 (bp 249-267 de la SEQ ID NO: 1). La UTR 3' se reemplazó con un oligonucleótido que corresponde al complemento de bp 2568-2586 de la SEQ ID NO: 1 con un sitio EcoRI artificial en el extremo 5'. Las variantes mutantes de esta construcción se prepararon a continuación insertando las secuencias mutantes descritas anteriormente en los sitios NarI-PflmI y PsImI-NcoI como se describe anteriormente.

La tercera clase de construcciones incluía secuencias derivadas del clon cc44 en el que un corte y empalme alternativo del exón 4 da como resultado la eliminación de cuatro restos en el N-terminal (SEQ ID NO: 3).

Para la expresión eucariótica, estas distintas construcciones de cADN que tienen secuencias mutantes y naturales, como se describe anteriormente, se clonaron en el vector de expresión pZeoSV en el que el casete promotor de SV60 se había retirado por digestión de la restricción y reemplazado con el elemento promotor de CMV de pcDNA3 (Invitrogen). Para la expresión procariótica, se han preparado construcciones usando el vector de fusión de glutation S-transferasa (GST) pGEX-kg. Las inserciones que se han unido a la secuencia de nucleótidos de fusión de GST son las mismas secuencias de nucleótidos descritas anteriormente que tienen la secuencia de nucleótidos de marco de lectura abierta normal, o que tienen una combinación de mutaciones individuales o dobles como se describe anteriormente. Estas construcciones de fusión de GST permiten la expresión de la proteína parcial o completa en sistemas de células procariotas como proteínas de fusión de GST mutantes o naturales, permitiendo de este modo la purificación de la proteína completa seguido de la retirada del producto de fusión GST por digestión de trombina. Se preparó una construcción de cADN adicional con el vector de fusión GST, para permitir la producción de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio de bucle ácido hidrófilo entre TM6 y TM7 de la proteína completa, en forma de secuencia de nucleótidos natural o en forma de secuencia mutante que tiene la mutación A285V, la mutación L286V o la mutación L392V. Esto se consiguió recuperando la secuencia natural o mutante de fuentes apropiadas de ARN usando un iniciador de oligonucleótido 5' correspondiente a bp 1044-1061 de la SEQ ID NO: 1 con un sitio de restricción BamHI 5' (G/GATCC), y un iniciador 3' correspondiente al complemento de bp 1476-1458 de la SEQ ID NO: 1 con un sito de restricción EcoRI 5' (G/AATTC). Esto permitió la clonación de la secuencia de nucleótido natural o mutante apropiada
correspondiente al dominio de bucle ácido hidrófilo en los sitios de BamHI y EcoRI dentro del vector pGEX-KG.

Ejemplo 9 Localizando mutaciones adicionales en el gen PS1

Las mutaciones en el gen PS1 se pueden ensayar por varias estrategias (secuenciación de nucleótidos directa, oligos específicos de alelo, reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento, SSCP, RFLPs) usando productos de RT-PCR que representan la secuencia madura de mARN/cADN o ADN genómico. Para las mutaciones A260V y A285V, el ADN genómico que lleva el exón se puede amplificar usando los mismos iniciadores y métodos de PCR que para la mutación L286V.

Los productos de PCR se desnaturalizaron a continuación y se sometieron a slot blots en membranas de nailon por duplicado usando el protocolo de slot blots descrito para la mutación C410Y.

La mutación A260V se valoró en estos blots usando hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo marcados en el extremo que corresponden a la secuencia natural (bp 1017-1036 de la SEQ ID NO: 1) o la secuencia mutante (bp 1017-1036 de la SEQ ID NO: 1 con C\rightarrowT en el bp 1027) por hibridación a 48ºC seguida de un lavado a 52ºC en tampón SSC que contiene 0,1% SDS x3. La mutación A285V se valoró en estos slot blots como se describe anteriormente usando en su lugar los oligonucleótidos específicos de alelo para la secuencia natural (bp 1093-1111 de la SEQ ID NO: 1) o el iniciador mutante (bp 1093-1111 de la SEQ ID NO: 1 con C\rightarrowT en el bp 1102) a 48ºC seguido de lavado a 52ºC como anteriormente excepto que la disolución de lavado era SSC x2.

La mutación L392V se valoró por amplificación del exón de ADN genómico usando iniciadores (5' correspondiente a bp 439-456 de la SEQ ID NO: 14 y 3' complementaria de 719-699 de la SEQ ID NO: 14) usando condiciones de tampón de PCR estándar excepto que la concentración de magnesio era 2 mM y las condiciones del ciclo eran
94ºC x 10 segundos, 56ºC x 20 segundos, y 72ºC x 10 segundos. El fragmento genómico de 200 pares de bases resultante se desnaturalizó como se describió para la mutación C410Y y se sometió a slot blots en membranas de nailon por duplicado. La presencia a ausencia de la mutación se valoró a continuación por hibridación diferencial a oligonucleótido natural marcado en el extremo (bp 1413-1431 de la SEQ ID NO: 1 con C\rightarrowG en el bp 1422) por hibridación a 45ºC y a continuación lavado sucesivo en SSC x2 a 23ºC y a continuación a 68ºC.

Ejemplo 10 Producción de anticuerpos

Los antígenos de péptido que corresponden a porciones de la proteína PS1 se sintetizaron por técnicas de fase sólida y se purificaron por cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa. Los péptidos estaban unidos covalentemente a hemocianina de megathura crenulata (lapa californiana) (KLH) vía puentes disulfuro que se hicieron posibles por la adición de un resto cisteína en el C-terminal del péptido del fragmento de presenilina. Este resto adicional no aparece normalmente en la secuencia de proteína y se incluyó solo para facilitar la unión a la molécula de KLH. Las secuencias de presenilina específicas para las que se generaron anticuerpos son como sigue:

100

Estas secuencias están contenidas dentro de dominios específicos de la proteína PS1. Por ejemplo, los restos 30-44 están dentro del N-terminal, los restos 109-123 están dentro del bucle TM1\rightarrow2, y los restos 304-318 y 346-360 están dentro del bucle grande TM6\rightarrow7. Cada uno de estos dominios se expone al medio acuoso y puede estar implicado en la unión a otras proteínas críticas para el desarrollo del fenotipo de la enfermedad. La elección de péptidos se basó en el análisis de la secuencia de la proteína usando el algoritmo de predicción de antigenicidad IBI Pustell.

Se inmunizaron un total de tres conejos blancos de Nueva Zelanda con complejos péptido-KLH para cada péptido antígeno en combinación con adyuvante de Freund y se les dieron subsecuentemente inyecciones de refuerzo a intervalos de siete días. Se recogieron antisueros para cada péptido y se mezclaron y la IgG se precipitó con sulfato de amonio. Los anticuerpos a continuación se purificaron por afinidad con agarosa Sulfo-link (Pierce) copulados con el péptido apropiado. Esta purificación final se requiere para retirar las interacciones no específicas de otros anticuerpos presentes en el suero pre- o post-inmune.

La especificidad de cada anticuerpo se confirmó por tres ensayos. Primero, cada uno detectó bandas predominantes individuales del tamaño aproximado previsto para presenilina-1 en Western blots de homogenato de cerebro. Segundo, cada uno reaccionó transversalmente con proteínas de fusión recombinantes que tienen la secuencia apropiada. Tercero, cada uno podría ser específicamente bloqueado por preabsorción con PS1 recombinante o el péptido inmunizante.

Además, se han usado dos proteínas de fusión de glutatión S-transferasa (GST) de péptido de PS1 diferentes para generar anticuerpos de PS1. La primera proteína de fusión incluía los aminoácidos 1-81 (N-terminal) de PS1 unidos a GST. La segunda proteína de fusión incluía los aminoácidos 266-410 (el dominio del bucle TM6\rightarrow7) de PS1 unidos a GST. Las construcciones que codifican estas proteínas de fusión se generaron insertando las secuencias de nucleótido apropiadas en plásmido de expresión pGEX-2T (Amrad). Las construcciones resultantes incluían secuencias que codifican GST y un sitio de escisión sensible a la trombina entre GST y el péptido de PS1. Las construcciones de expresión se transfectaron a DH5a de E. coli y se indujo la expresión de las proteínas de fusión usando IPTG. Los pelets bacterianos se lisaron y las proteínas de fusión-GST solubles se purificaron por cromatografía de afinidad de una sola etapa en bolas de sefarosa con glutation (Boehringer-Mannheim, Montreal). Las proteínas de fusión-GST se usaron para inmunizar ratones para generar anticuerpos monoclonales usando procedimientos estándar. Los clones obtenidos de estos ratones se exploraron con fragmentos de presenilina purificada.

Además, las proteínas de fusión-GST se escindieron con trombina para desprender péptido de PS1. Los péptidos desprendidos se purificaron por HPLC de exclusión de tamaños y se usaron para inmunizar conejos para la generación de antisuero policlonal.

Por métodos similares, se prepararon proteínas de fusión-GST usando construcciones que incluyen secuencias de nucleótidos para los aminoácidos 1 a 87 (N-terminal) o 272 a 390 (bucle TM6\rightarrow7) de presenilina-2 y se emplearon para generar anticuerpos monoclonales para esa proteína. Las proteínas de fusión de PS2-GST se escindieron también con trombina y los péptidos desprendidos purificados se usaron para inmunizar conejos para preparar sueros policlonales.

Ejemplo 11 Identificación de mutaciones en el gen PS2

Los productos de RT-PCR correspondientes al ORF de PS2 se generaron de RNA de linfoblastos o tejido cerebral post-mortem congelado usando un primer par de iniciadores de oligonucleótido con el iniciador 5' correspondiente a bp 478-496 de la SEQ ID NO: 18, y el iniciador 3' complementario de bp 1366-1348 de la SEQ ID NO: 18, para un producto de 888 bp, y un segundo par de iniciadores con el iniciador 5' correspondiente a 1083-1102 de la SEQ ID NO: 18, y el iniciador 3' complementario de bp 1909-1892 de la SEQ ID NO: 18, para un producto de 826 bp. Se realizó la PCR usando 250 mMol de dNTPs, MgCl_{2} 2,5 mM, 10 pMol de oligonucleótidos en 10 ml ciclado durante 40 ciclos de 94ºC x 20 segundos, 58ºC x 20 segundos, 72ºC x 45 segundos. Los productos de PCR se secuenciaron por secuenciación cíclica automatizada (ABI, Foster City, CA) y se analizaron los cromatogramas fluorescentes para buscar substituciones de nucleótido heterocigótico por inspección directa y por los paquetes de software Factura (ver 1.2.0) y Sequence Navigator (ver 1.0.1b15) (no se muestran los datos).

Detección de la mutación N141I: La substitución A\rightarrowT en el nucleótido 787 crea un sitio de restricción de Bc1I. El exón que tiene esta mutación se amplificó a partir de 100 ng de ADN genómico usando 10 pMol de cada uno de los oligonucleótidos que corresponden a bp 733-751 de la SEQ ID NO: 18 (marcada en un extremo) y el complemento de bp 846-829 de la SEQ ID NO: 18 (sin marcar), y las condiciones de reacción de PCR similares a las descritas a continuación para la mutación M239V. 2 ml del producto de PCR se restringieron con bc1I (NEBL, Beverly, MA) en 10 ml de volumen de reacción según el protocolo del fabricante, y los productos se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. En sujetos con secuencias naturales, el producto de PCR de 114 bp se escinde en fragmentos de 68 bp y 46 bp. Las secuencias mutantes provocan que el producto se escinda en 53 bp, 46 bp y 15 bp.

Detección de la mutación M239V: La substitución A\rightarrowG en el nucleótido 1080 elimina un sitio de restricción de N1aIII, permitiendo que la presencia de la mutación M239V sea detectada por amplificación de 100 ng del ADN genómico usando 10 pMol de cada uno de los oligonucleótidos correspondientes a bp 1009-1026 de la SEQ ID NO: 18 y el complemento de bp 1118-1107 de la SEQ ID NO: 18. Las condiciones de PCR eran: 0,5 U de Taq polimerasa, 250 mM de dNTPs, 1 mCi \alpha^{32}P-dCTP, MgCl_{2} 1,5 mM, 10 ml de volumen; 30 ciclos de 94ºC x 30 segundos, 58ºC x 20 segundos, 72ºC x 20 segundos, para generar un producto de 110 bp. 2 ml de la reacción de PCR se diluyeron en 10 ml y se restringieron con 3 U de N1aIII (NEBL, Beverly, MA) durante 3 horas. Los productos de restricción se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante y se visualizaron por autoradiografía. Los sujetos normales muestran productos de escisión de 55, 35 y 6 bp, mientras que la secuencia mutante da fragmentos de 55, 50, y 6 bp.

Detección de la mutación I420T: Similarmente a los procedimientos anteriores, la mutación I420T se puede explorar por amplificación por PCR de ADN genómico usando iniciadores que corresponden a bp 1576-1593 de la SEQ ID NO: 18 y el complemento de bp 1721-1701 de la SEQ ID NO: 18 para generar un producto de 146 pares de bases. Este producto se puede sondear a continuación con oligonucleótidos específicos de alelo para las secuencias natural (por ejemplo, bp 1616-1632 de la SEQ ID NO:18) y mutante (por ejemplo, bp 1616-1632 de la SEQ ID NO: 18 con una substitución T\rightarrowC en bp 1624).

Ejemplo 12 Ratones transgénicos

Se construyeron una serie de genes PS1 y PS2 mutantes y naturales para su uso en la preparación de ratones transgénicos. Las versiones mutantes de PS1 y PS2 se generaron por mutagénesis dirigida al sitio de los cADNs clonados cc33 (PS1) y cc32 (PS2) usando técnicas estándar.

Los cADNs cc33 y cc32 y sus versiones mutantes se usaron para preparar dos clases de cADNs de PS1 y PS2 mutantes y naturales, como se describe en el Ejemplo 8. La primer clase, denominados cADNs "completos", se prepararon retirando aproximadamente 200 bp de la región sin trasladar 3' inmediatamente antes del sitio poli A por digestión con EcoRI (PS1) o PvuII (PS2). La segunda clase, denominados cADNs "truncados", se prepararon reemplazando la región sin traducir 5' con un sitio de unión de ribosoma (secuencia de consenso Kozak) colocado inmediatamente a 5' del codón de inicio de ATG.

Varios cADNs de PS1 y PS2 naturales y mutantes, completos y truncados, preparados como se describe anteriormente, se introdujeron en uno o más de los siguientes vectores y las construcciones resultantes se usaron como fuente de genes para la producción de ratones transgénicos.

El vector de expresión cos-TET: Este vector se derivó de un clon de cósmido que contiene el gen Prp de hámster sirio. Se ha descrito en detalle por Scott et al. (1992) y Hsiao et al. (1995). Los cADNs de PS1 y PS2 (completos o truncados) se insertaron en este vector en su sitio Sa1I. Las construcciones finales contenían 20 kb de la secuencia 5' flanqueando al cADN insertado. Esta secuencia flanqueante 5' incluye el promotor del gen PrP, 50 bp de un exón de la región sin traducir 5' del gen PrP, un sitio donante de corte y empalme, un intrón de 1 kb, y un sitio aceptor de corte y empalme localizado inmediatamente adyacente al sitio SalI en el que se insertó el cADN de PS1 o PS2. La secuencia 3' que flanquea el cAND insertado incluye un segmento de aproximadamente 8 kb de la región sin traducir 3' de PrP que incluye una señal de poliadenilación. La digestión de esta construcción con NotI (PS1) o FseI (PS2) desprendió un fragmento que contiene un gen mutante o natural de PS bajo el control del promotor PrP. El fragmento desprendido se purificó en gel y se inyectó en el pronúcleo de huevos de ratón fertilizados usando el método de Hsiao et al. (1995).

Construcciones de \beta-subunidad de receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas: Se introdujeron también cADNs de PS entre el SalI (cADNs de PS1 completos) o HindIII (cADNs de PS1 truncados, cADNs de PS2 completos, y cADNs de PS2 truncados) en el extremo 3' del promotor de \beta-subunidad de receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas y el sitio EcoRI en el extremo 5' de la secuencia poly A SV40 y el casete completo se clonó en el vector pZeoSV (Invitrogen, San Diego, CA). Los fragmentos desprendidos por la digestión de ScaI/BamHI se purificaron en gel y se inyectaron en los pronúcleos de huevos de ratón fertilizados usando el método de Hsiao et al. (1995).

Construcciones de \beta-actina humana: Se insertaron cADNs de PS1 y PS2 en el sitio de SalI de pBAcGH. La construcción producida por esta inserción incluye 3,4 kb de la secuencia de flanqueo 5' de \beta-actina humana (el promotor de \beta-actina humana, un exón e intrón sin traducir de 5' de \beta-actina humana de 78 bp cortado y empalmado) y la inserción de PS1 o PS2 seguido de 2,2 kb de secuencia genómica de hormona de crecimiento humana que contiene varios intrones y exones así como una señal de poliadenilación. Se usó SfiI para desprender un fragmento que contiene PS que se purificó en gel y se inyectó en los pronúcleos de huevos de ratón fertilizados usando el método de Hsiao et al. (1995).

Construcciones de fosfoglicerato quinasa: Se introdujeron cADNs de PS1 y PS2 en el vector pkJ90. Las cADNs se insertaron entre el sitio KpnI aguas abajo del promotor de fosfoglicerato quinasa humano y el sitio XbaI aguas arriba de la región 3' sin traducir del gen de fosfoglicerato quinasa humano. Se usó la digestión de PvuII/HindIII (cADNs de PS1) o PvuII (cADNs de PS2) para desprender un fragmento que contiene PS que se purificó en gel a continuación y se inyectó en los pronúcleos de huevos de ratón fertilizados como se describe anteriormente.

Ejemplo 13 Expresión de PS1 y PS2 recombinante en células eucariotas

PS1 y PS2 recombinantes se han expresado en varios tipos de células (por ejemplo, PC12, neuroblastoma, ovario de hámster chino, y células 293 de riñón embriónico humano) usando el vector pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). Los cADNs de PS1 y PS2 insertados en este vector fueron los mismos cADNs completos y truncados descritos en el Ejemplo 8.

Estos cADNs se insertaron entre el promotor CMV y el sitio de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina de pcDNA3. Los transgenes se expresaron en altos niveles.

Además, PS1 y PS2 se han expresado en células COS usando el vector pCMX. Para facilitar el marcado y seguimiento de la localización intracelular de las proteínas presenilina, oligonucleótidos que codifican una secuencia de 11 aminoácidos derivados del antígeno c-myc humano (véase, por ejemplo, Evan et al., 1985) y reconocidos por el anticuerpo anti-myc monoclonal MYC 1-9E10.2 (Producto CRL 1729, ATCC, Rockville, Md.) se ligaron sin cambio de marco de lectura inmediatamente delante o inmediatamente detrás del marco de lectura abierta de cADNs de PS1 y PS2. También se prepararon construcciones pCMX sin marcar. Las construcciones c-myc-marcadas se introdujeron también en pcDNA3 para transfección en células CHO.

La transfección estable y transitoria de estas construcciones se ha conseguido usando Lipofectamina (Gibco/BRL) según los protocolos del fabricante. Se ensayaron cultivos para ver la expresión transitoria después de 48 horas. Las líneas establemente transfectadas se seleccionaron usando 0,5 mg/ml de Geneticina (Gibco/BRL).

Se ensayó la expresión de proteínas PS transfectadas por Western blots usando los anticuerpos anti-presenilina 1142, 519 y 520 descritos anteriormente. Brevemente, las células transfectadas cultivadas se solubilizaron (2% SDS, EDTA 5 mM, 1 mg/ml de leupeptina y aprotinina), y se determinó la concentración de proteína por Lowry. Las proteínas se separaron en geles de gradiente SDS/PAGE (4-20% Novex) y se transfirieron a PVDF (CAPS 10 mM) durante 2 h a voltaje constante (50 V). La unión no específica se bloqueó con leche desnatada (5%) durante 1 h. Las proteínas se sondearon a continuación con los dos anticuerpos policlonales de conejo (\sim1 mg/ml en TBS, pH 7,4) durante 12 horas. Las especies de reacción cruzada con presenilina se identificaron usando anticuerpo secundario de cabra anti-conejo biotinilado que se visualizó usando estreptavidina terciaria conjugada con peroxidasa de rábano, 4-cloronaftol y peróxido de hidrógeno. Los péptidos de presenilina marcados con c-myc se ensayaron por Western blots usando tanto los anticuerpos anti-presenilina descritos anteriormente (para detectar el antígeno péptido de presenilina) como el sobrenadante del cultivo del hibridoma MYC 1-9E10.2 diluido 1:10 para Western blots y 1:3 para inmunocitoquímica (para detectar el myc-epitopo). Se identificó una banda principal de inmunoreactividad de 50-60 kDa por cada uno de los distintos anticuerpos de presenilina, y por los anticuerpos de myc-epitopo (para líneas celulares transfectadas con plásmidos que contienen myc). Se detectaron bandas minoritarias a \sim10-19 kDa y a \sim70 kDa por algunos anticuerpos de presenilina.

Para inmunocitoquímica, las células transfectadas se fijaron con formaldehído al 4% en disolución salina tamponada con Tris (TBS), se lavaron exhaustivamente con TBS más Triton al 0,1% y la unión no específica se bloqueó con BSA al 3%. Las células fijadas se sondearon con los anticuerpos de presenilina (por ejemplo, anticuerpos 520 y 1142, anteriores; típicamente 5-10 mg/ml), se lavaron y se visualizaron con anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con rodamina o FITC. Para las construcciones de presenilina marcada con c-myc, el sobrenadante MYC 1-9E10.2 de hibridoma diluido 1:3 se usó con anticuerpo secundario antiratón. Se prepararon portaobjetos en glicerol al 90% con fenilendiamina al 0,1% (ICN) para preservar la fluorescencia. Se usaron anti-BIP (o anti-calnexina) (StressGen, Victoria, B.C.) y aglutinina de germen de trigo (EY Las, San Mateo, CA) como marcadores del retículo endoplásmico y Golgi respectivamente. Se realizó también un doble inmunomarcado con anti-actina (Sigma, St. Louis, Mo.), anti-(proteína precursora de amiloide) (22C11, Boehringer Mannheim) y anti-neurofilamento (NF-M específico, Sigma) en la línea neuronal NSC34. Estos estudios de inmunofluorescencia demostraron que el producto de transfección está ampliamente distribuido dentro de la célula, con una particularmente intensa localización perinuclear que hace pensar en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, que es similar a la observada en células sin transfectar pero es más intensa, a veces extendiéndose dentro de la membrana nuclear. La co-inmunolocalización del c-myc y epitopos de PS se observó en células CHO y COS transientemente transfectadas con las construcciones de presenilina marcadas con myc.

La sólida expresión del gen de presenilina transfectado en células transfectadas se probó de esta manera por inmunocitoquímica, Northern blots, Western blots (usando anticuerpos para presenilinas como anteriormente, y usando el anticuerpo monoclonal MYC 1-9E10.2 para el marcador myc en construcciones con marcadores c-myc 3' o 5').

Ejemplo 14 Aislamiento de proteínas que se unen a presenilina por cromatografía de afinidad

Para identificar las proteínas que pueden estar implicadas en la función bioquímica de las presenilinas, se aislaron proteínas que se unen a PS1 usando cromatografía de afinidad. Se usó una proteína de fusión-GST que contiene el bucle TM6\rightarrow7 de PS1, preparada como se describe en el Ejemplo 8, para sondear extractos de cerebro humano, preparados homogeneizando tejido cerebral por Polytron en disolución de sal fisiológica. La unión no específica se eliminó pre-limpiando los homogenatos de cerebro de componentes que se unen a GST endógenos por incubación con bolas de glutation-Sefarosa. Estos homogenatos libres de GST se incubaron a continuación con las proteínas de fusión PS-GST para producir los complejos deseados con proteínas de unión funcional. Estos complejos se recuperaron a continuación usando las bolas de glutation-Sefarosa de afinidad. Después de lavado exhaustivo con disolución salina tamponada con fosfato, la colección de proteínas aislada se separó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE; gel de gradiente de Tris-tricina 4-20%). Se observaron dos bandas principales a \sim14 y 20 kD además de varias bandas más débiles que varían de 50 a 60 kD.

La modificación farmacológica de la interacción entre estas proteínas y el bucle TM6\rightarrow7 se puede emplear en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Además, estas proteínas que es probable que actúen dentro del camino bioquímico de la presenilina pueden ser nuevos sitios de mutaciones que provocan la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 15 Aislamiento de proteínas que se unen a presenilina por el sistema de dos híbridos de levadura

Para identificar proteínas que interaccionan con las proteínas presenilina, se generó un vector plásmido de expresión de levadura (pAS2-1, Clontech) ligando una secuencia de cADN parcial sin cambio de marco de lectura que codifica los restos 266-409 de la proteína PS1 o los restos 272-390 de la proteína PS2 en los sitios EcoRI y BamHI del vector. La proteína de fusión resultante contiene el dominio de unión de ADN GAL4 acoplado sin cambio de marco de lectura al bucle TM6\rightarrow7 de la proteína PS1 o al bucle TM6\rightarrow7 de la proteína PS2. Estos plásmidos de expresión se co-transformaron, junto con el ADN de plásmido purificado de la biblioteca de cADN:pACT de cerebro humano, en levadura usando los protocolos del kit de dos híbridos de levadura Matchmaker de Clontech. Los clones de levadura que tienen cADNs de cerebro humano que interaccionan con el dominio del bucle TM6\rightarrow7 se seleccionaron por resistencia a HIS y \betagal+activación. Los clones se seleccionaron adicionalmente por la sensibilidad a ciclohexamida y las inserciones de los cADNs de cerebro humano se aislaron por PCR y se secuenciaron. De 6 millones de transformantes iniciales, se obtuvieron 200 clones positivos después de la selección por HIS, y 42 después de la selección por \betagal+color, llevadas a cabo según el protocolo del fabricante para la selección de colonias positivas. De estos 42 clones había varios (5-8) clones independientes que representan a los mismos genes. Esto indica que estas interacciones son biológicamente reales y reproducibles.

Ejemplo 16 C. elegans transgénico

Se obtuvieron C. elegans transgénicos por microinyección de oocitos. Los vectores pPD49.3 hsp 16-41 y pPD49.78 hsp 16-2 se escogieron para este propósito. Usando el primero de estos vectores, se produjeron C. elegans transgénicos en los que se introdujo un gen hPS1 normal o uno mutante (L392V). Los animales transformados se detectaron ensayando la expresión de cADN humano en Northern blots o Western blots usando sonda de cADN cc32 humana y anticuerpos 519, 520 y 1142, descritos anteriormente. Se prepararon y/o inyectaron también vectores que tienen un gen hPS1 mutante doble cis (M146L y L392V), un gen hPS2 normal, y un gen hPS2 mutante (N141I).

Ejemplo 17 Clonación de un homólogo de presenilina de drosophila, DmPS

Se diseñaron oligonucleótidos redundantes 5' ctn ccn gar tgg acn gyc tgg (SEQ ID NO: 22) y 5' rca ngc (agt) en ngt ngt rtt cca (SEQ ID NO: 23) de datos de secuencias de nucleótidos publicadas para regiones altamente conservadas de las proteínas presenilina/sel-12 que terminan/comienzan con Trp (por ejemplo, en los restos Trp247 y Trp404 en PS1; Trp253 y Trp385 en PS2). Estos iniciadores se usaron para RT-PCR (50 ml de volumen, MgCl_{2} 2 mM, 30 ciclos de 94ºC x 30'', 57ºC x 20'', 72ºC x 20'') de mARN de D. melanogaster adulta y embriónica. Los productos se amplificaron a continuación usando condiciones de ciclado de 94ºC x 1', 59ºC x 0,5' y 72ºC x 1' y el iniciador redundante conservado interno 5' ttt ttt ctg gag acn gcn car gar aga aay ga (SEQ ID NO: 24) y 5' ttt ttt gga tcc tar aa(agt) atr aar tcn cc (SEQ ID NO: 25). El producto de \sim600 bp se clonó en los sitios BamHI y XhoI de pBS. Estos productos se secuenciaron y se muestra que contienen un marco de lectura abierta con una supuesta secuencia de aminoácidos altamente homóloga a la de las presenilinas humanas. Este fragmento se usó a continuación para explorar una biblioteca de cADN/Zap de D. melanogaster convencional (Stratagene, CA) para recuperar seis clones de cADN independientes de tamaño \sim2-2,5 kb (clones pds8, pds13, pds1, pds3, pds7 y pds14) que se secuenciaron. El ORF más largo codifica un polipéptido de 541 aminoácidos con 52% de identidad con las presenilinas humanas.

Ejemplo 18 Ensayos para isoformas largas de los péptidos A\beta

Se extrajeron péptidos A\beta con ácido fórmico al 99% durante 60 minutos (20ºC) de cortex cerebral congelado de casos confirmados histopatológicamente de FAD con PS1 o mutaciones BAPP_{717}; AD esporádica sin historia familiar conocida de la enfermedad; otros trastornos neurodegenerativos de aparición en adultos (HD = Enfermedad de Huntington; ALS = esclerosis lateral amiotrófica); Síndrome de Down (DS); y sujetos de control sin síntomas neurológicos. Después de la centrifugación a 200.000 x g durante 20 minutos, el sobrenadante se separó de las plaquetas, se diluyó, neutralizó y examinó por ELISA. Para cuantificar diferentes especies de A\beta, se usaron cuatro anticuerpos monoclonales. El anticuerpo BNT-77 (que detecta epitopos del centro de A\beta) y el anticuerpo BAN-50 (que detecta restos N-terminales) se usaron primero para unirse a tipos al1 de A\beta que incluyen formas heterólogas con o sin truncamiento del N-terminal (BNT-77) o solo sin truncamiento del N-terminal (BAN-50). Dos anticuerpos monoclonales adicionales, que detectan específicamente A\beta de cadena corta que termina en el resto 40 (anticuerpo BA-27) o A\beta de cadena larga que termina en los restos 42/43 (anticuerpo BC-05), se usaron a continuación para distinguir las diferentes formas de C-terminal de A\beta. Se llevó a cabo el ELISA de dos sitios como se describió previamente (Tamakoa et al., 1994; Suzuki et al., 1994). Brevemente, 100 \mug de péptidos estándar o los sobrenadantes de tejido cerebral se aplicaron sobre microplacas revestidas con el anticuerpo BNT-77, se incubaron a 4ºC durante 24 horas, se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato, y a continuación se incubaron con anticuerpos BA-27 y BC-05 marcados con HRP a 4ºC durante 24 horas. Se ensayaron las actividades de HRP por desarrollo de color usando el sistema de peroxidasa en micropocillo TNB como se describió previamente. Se compararon los niveles de A\beta cortical entre grupos de diagnóstico usando test de t de Student por pares. La evaluación conjunta de todos los datos de la isoforma de A\beta, usando la comparación múltiple de Student-Newman-Keuls de ensayo de medias, reveló que los niveles de A\beta1-42 de BAPP_{717} y los sujetos con AD esporádica eran distintos de aquellos de los casos de mutación de PS1, pero similares a los controles. En contraste, eran distinguibles tres grupos cuando se consideraron los niveles de Abx-42: alto (PS1 y BAPP_{717} en AD), medio (AD esporádico) y bajo (control).

Específicamente, la medida de las concentraciones de las distintas isoformas de A\beta en el cortex cerebral de 14 sujetos de control, incluyendo cinco sujetos con otras enfermedades neurodegenerativas con aparición en la cuarta y quinta década de la vida, reveló solo bajas concentraciones tanto de A\beta corto (A\beta1-40; 0,06 \pm 0,02 nMol/gramo de tejido húmedo \pm SEM; A\betax-40: 0,17 \pm 0,40) y A\beta largo (A\beta1-42/43; 0,35 \pm 0,17; A\betax-42/43: 0,17 \pm 0,80). En contraste, los péptidos A\beta largos eran significativamente elevados en el cortex cerebral de los cuatro sujetos con mutaciones de PS1 (A\beta1-42/43; 6,54 \pm 2,0, p = 0,05; A\betax-42/43: 23,91 \pm 4,00, p<0,01). Se detectaron similares incrementos en la concentración de péptidos A\beta largos en el cortex tanto de sujetos con mutaciones \betaAPP_{717} (A\beta1-42/43; 2,03 \pm 1,04; A\betax-42/43: 25,15 \pm 5,74) como de sujetos con AD esporádica (A\beta1-42/43; 1,21 \pm 0,40, p = 0,008; A\betax-42/43: 14,45 \pm 2,81, p<0,001). En sujetos con mutaciones en PS1 o \betaAPP_{717}, este incremento en isoformas largas de A\beta estaba acompañado de un pequeño pero no significativo incremento en isoformas cortas de A\beta (por ejemplo, A\betax-40: 3,08 \pm1,31 en mutantes de PS1; 1,56 \pm 0,07 en mutantes de \betaAPP_{717}). De este modo la relación de isoformas largas a cortas se incrementó también significativamente. Sin embargo, en los casos de AD esporádica, el incremento observado en A\beta largo estaba acompañado típicamente de un incremento mucho más grande en isoformas cortas de A\beta (A\beta1-40; 3,92 \pm 1,42; A\betax-40: 16,60 \pm 5,88). Este incremento en A\beta corto era estadísticamente significativo cuando se comparaba con los controles (p<0,03 tanto para A\beta1-40 como para A\betax-40), pero era de significancia estadística dudosa cuando se comparaba con los casos de PS1 y \betaAPP_{717} (p<0,05). El análisis de muestras corticales de un sujeto adulto con síndrome de Down reveló un patrón similar al observado en la AD esporádica.

Aunque se han descrito aquí con detalle las realizaciones preferidas de la invención, se entenderá por los expertos en la técnica que se le pueden hacer variaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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TABLA 1

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TABLA 2

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5

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TABLA 6

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TABLA 7

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\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HSC RESEARCH AND DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 555 University Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): M5G 1X8

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (416) 813-5982

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

FAX: (416) 813-5085

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 106, Simcoe Hall, 27 King's College Circle

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): M5S 1A1

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (416) 978-7461

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

FAX: (416) 978-1678

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: ST. GEORGE-HYSLOP, Peter H.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 210 Richview Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL(ZIP): M5P 3G3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: FRASER, Paul E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 611 Windermere Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): M6S 3L9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: ROMMENS, Johanna M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 105 McCaul Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): M5T 2XT

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias genéticas y proteínas relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, y usos de las mismas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Sim & McBurney

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 330 University Avenue, 6th Floor

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Toronto

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: M5G 1R7

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, version #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA ACTUAL SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/CA96/00263

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: April 29, 1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/509,359

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN 31-JUL-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/496,841

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN 28-JUN-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/431,048

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-APR-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: RAE, Patricia A.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7425-16

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (416) 595-1155

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (416) 595-1163

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2765 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 249..1649

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2675

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "hPS1-1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 467 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3086 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 557..1945

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..3086

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "hPS1-2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 463 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2494 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mist_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2494

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex1n2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1117

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex3n4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1727 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1727

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1883 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1883

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex6"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 823 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..823

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex7"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 945 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..945

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex8"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 540 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 509 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..509

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex10"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1092 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1092

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex11"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1003 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1003

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex12"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 736 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..736

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "1Ex13"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1964 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 188..1588

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1964

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "mPS1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 467 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2229 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 366..1712

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2226

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "hPS2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 449 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1895 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 140..1762

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1895

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "DmPS"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 541 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm54

Claims (44)

1. Un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica

(i) una proteína presenilina-1 seleccionada de:

(a)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 2;

(b)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 4;

(c)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 murina de la SEQ ID NO: 17; y

(ii) una proteína presenilina-1 que es por lo menos en el 85% idéntica a las proteínas (a), (b) o (c).

2. Un ácido nucléico aislado, según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína presenilina-1 que es por lo menos en el 90% idéntica a las proteínas (a), (b) o (c).

3. Un ácido nucléico aislado, según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína presenilina-1 que es por lo menos en el 95% idéntica a las proteínas (a), (b) o (c).

4. Un ácido nucléico aislado, según la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucléico se selecciona del grupo que consiste en

(a) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 4;

(c) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 murina de la SEQ ID NO: 17;

(d) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; en la que el resto 257 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 258-290;

(e) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; en la que el resto 253 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 254-286; y

(f) una secuencia que codifica una proteína presenilina y es capaz de hibridarse a una secuencia complementaria de cualquier secuencia de (a)-(e) en condiciones severas de hibridación.

5. Un ácido nucléico aislado que codifica una proteína presenilina-1 mutante, comprendiendo dicho ácido nucléico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 4;

(c) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 murina de la SEQ ID NO: 17;

(d) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que el resto 257 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 258-290;

(e) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, en la que el resto 253 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 254-286; y

(f) una secuencia que codifica una proteína presenilina y es capaz de hibridarse a una secuencia complementaria de cualquier secuencia de (a)-(e) en condiciones severas de hibridación,

y teniendo dicha secuencia de nucleótidos por lo menos una mutación, correspondiendo dicha por lo menos una mutación a una mutación de la SEQ ID NO: 2 seleccionada del grupo que consiste en una mutación de Ala 79 a otro aminoácido, V82L, V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, \Delta291-319, G384A, L392V y C410Y.

6. Un ácido nucléico aislado, según la reivindicación 2, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 16 y una secuencia complementaria de cualquiera de estas secuencias.

7. Un ácido nucléico aislado, según la reivindicación 3, comprendiendo dicho ácido nucléico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 16 y una secuencia complementaria de cualquiera de estas secuencias, y teniendo dicha secuencia de nucleótidos por lo menos una mutación, siendo seleccionada dicha por lo menos una mutación del grupo que consiste en una mutación que corresponde a una mutación de la SEQ ID NO: 2 seleccionada del grupo que consiste en una mutación de Ala 79 a otro aminoácido, V82L, V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285V, L286V, \Delta291-319, G384A, L392V y
C410Y.

8. Un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de un ácido nucléico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7; y

(b) por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de un ácido nucléico según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

10. Un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido codificado por un inserto de presenilina en un plásmido seleccionado del grupo que consiste en el número de acceso de la ATCC 97124 y número de acceso de la ATCC 97428.

11. Un ácido nucléico aislado, en el que dicho ácido nucléico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21;

(b) la SEQ ID NO: 20; y

(c) una secuencia que codifica una proteína presenilina y es capaz de hibridarse a una secuencia complementaria de la secuencia de (a) o (b) en condiciones severas de hibridación.

12. Un vector recombinante que comprende un ácido nucléico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Una célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 12.

14. Una proteína presenilina-1 sustancialmente pura seleccionada de:

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 2;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 humana de la SEQ ID NO: 4;

(c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-1 murina de la SEQ ID NO: 17; y

(d) una proteína que es por lo menos en el 85% idéntica a las proteínas (a), (b) o (c).

15. Una proteína presenilina-1 sustancialmente pura según la reivindicación 14(d) que es por lo menos en el 90% idéntica a las proteínas (a), (b) o (c).

16. Una proteína presenilina-1 sustancialmente pura según la reivindicación 14(d) que es por lo menos en el 95% idéntica a las proteínas (a), (b) o (c).

17. Una proteína según la reivindicación 14, en la que dicha proteína comprende una proteína presenilina seleccionada del grupo que consiste en

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que el resto 257 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 258-290; y

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, en la que el resto 253 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 254-286.

\newpage

18. Una proteína según la reivindicación 14, comprendiendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;

(c) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17;

(d) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en la que el resto 257 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 258-290;

(e) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, en la que el resto 253 está reemplazado por alanina y se omiten los restos 254-286;

y teniendo dicha secuencia de aminoácidos por lo menos una mutación, correspondiendo dicha por lo menos una mutación a una mutación de la SEQ ID NO: 2 seleccionada del grupo que consiste en una mutación de Ala 79 a otro aminoácido, V82L, V96F, Y115H, M139T, M139V, I143T, M146L, M146V, H163R, H163Y, L171P, G209V, I211T, A231T, A246E, A260V, C263R, P264L, P267S, E280A, E280G, A285G, L286V, A291-319, G384A, L392V y C410Y.

19. Un polipéptido sustancialmente puro que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) por lo menos 10 restos aminoácido consecutivos de una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18; y

(b) por lo menos 15 restos aminoácido consecutivos de una proteína como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

20. Una preparación sustancialmente pura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.

21. Una preparación sustancialmente pura de un polipéptido que comprende por lo menos un dominio funcional de una proteína presenilina-1 (PS1) como se define en cualquiera de la reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque dichos dominios funcionales se definen como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

101

22. Una preparación sustancialmente pura de un anticuerpo que se une sustancialmente a un determinante antigénico de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.

23. Un método para identificar compuestos que pueden modular la expresión de un gen de presenilina-1 que comprende

poner en contacto una célula con un compuesto candidato, en el que dicha célula incluye una región reguladora de un gen de presenilina-1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes funcionalmente unida a una región de codificación; y detectar un cambio en la expresión de dicha región de codificación.

24. Un método para identificar compuestos que se pueden unir selectivamente a una proteína presenilina-1 que comprende las etapas de

proporcionar una preparación que incluye por lo menos un componente de presenilina-1 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes;

poner en contacto dicha preparación con una muestra que incluye por lo menos un compuesto candidato;

y

detectar la unión de dicho componente presenilina-1 con dicho compuesto candidato.

25. Un método para identificar compuestos que pueden modular la actividad de una presenilina-1 que comprende las etapas de

proporcionar una célula que expresa un gen de presenilina-1 o presenilina-1 mutante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; poner en contacto dicha célula con por lo menos un compuesto candidato; y detectar un cambio en un marcador de dicha actividad.

26. Un método de diagnóstico para determinar si un sujeto tiene un gen de presenilina-1 mutante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende

detectar en una muestra biológica de dicho sujeto un ácido nucléico de presenilina-1 mutante, una proteína presenilina-1 mutante o una actividad de presenilina-1 mutante.

27. Una composición farmacéutica que comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en

(a) una proteína presenilina-1 sustancialmente pura como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18;

(b) un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína presenilina-1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

(c) un vector de expresión que codifica funcionalmente una proteína presenilina-1, y que comprende un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha proteína presenilina-1 en un sujeto humano; y

(d) un vector de expresión que codifica funcionalmente una secuencia antisentido de presenilina-1 de un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha secuencia antisentido de presenilina-1 en un sujeto humano.

28. Un método para producir una proteína presenilina-1 de mamífero, que comprende cultivar una célula hospedante como se define en la reivindicación 13 en condiciones apropiadas para la expresión de dicha proteína

\hbox{presenilina-1.}

29. Un kit de diagnóstico para determinar si un sujeto tiene un gen de presenilina-1 mutante que comprende un componente del kit seleccionado de:

(a) una proteína presenilina-1 sustancialmente pura como se define en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18;

(b) un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína presenilina-1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

(c) un vector de expresión que codifica funcionalmente una proteína presenilina-1, y que comprende un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha proteína presenilina-1 en un sujeto humano; y

(d) un vector de expresión que codifica funcionalmente una secuencia antisentido de presenilina-1 de un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha secuencia antisentido de presenilina-1 en un sujeto humano.

30. Un animal transgénico no humano en el que un genoma de dicho animal, o de uno de sus ancestros, ha sido modificado por la introducción de una modificación seleccionada del grupo que consiste en

(a) la inserción de un ácido nucléico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12;

(b) la inserción de un ácido nucléico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18;

(c) la inactivación de un gen de presenilina endógeno como se define en cualquier reivindicación precedente.

31. Un ácido nucléico aislado que codifica una proteína presenilina-2 mutante, comprendiendo dicho ácido nucléico una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-2 humana de la SEQ ID NO: 19;

(b) una secuencia que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de presenilina-2 humana de la SEQ ID NO: 19, en la que se omiten los restos 263-296; y

(c) una secuencia que codifica una proteína presenilina y es capaz de hibridarse a una secuencia complementaria de cualquier secuencia de (a)-(b) en condiciones severas de hibridación,

y teniendo dicha secuencia de nucleótidos por lo menos una mutación, correspondiendo dicha por lo menos una mutación a una mutación de la SEQ ID NO: 19 seleccionada del grupo que consiste en M239V y I420T.

32. Un ácido nucléico aislado, según la reivindicación 31, comprendiendo dicho ácido nucléico una secuencia de nucléotidos del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 18 y una secuencia complementaria de esta secuencia, y teniendo dicha secuencia de nucléotidos por lo menos una mutación, correspondiendo dicha por lo menos una mutación a una mutación de la SEQ ID NO: 19 seleccionada del grupo que consiste en M239V y I420T.

33. Un vector recombinante que comprende un ácido nucléico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32.

34. Una célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 33.

35. Una proteína presenilina-2 sustancialmente pura que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

(a) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; y

(b) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, en la que se omiten los restos 263-296,

y teniendo dicha secuencia de aminoácidos por lo menos una mutación que corresponde a una mutación de la SEQ ID NO: 19 seleccionada del grupo que consiste en M239V y I420T.

36. Una preparación sustancialmente pura de un anticuerpo que se une selectivamente a un determinante antigénico de una proteína según la reivindicación 35.

37. Un método para identificar compuestos que pueden modular la expresión de un gen de presenilina-2 que comprende

poner en contacto una célula con un compuesto candidato en el que dicha célula incluye una región reguladora de un gen de presenilina-2 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 funcionalmente unida a una región de codificación; y detectar un cambio en la expresión de dicha región de codificación.

38. Un método para identificar compuestos que se pueden unir selectivamente a una proteína presenilina-2 que comprende las etapas de

proporcionar una preparación que incluye por lo menos un componente de presenilina-2 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35;

poner en contacto dicha preparación con una muestra que incluye por lo menos un compuesto candidato,

y

detectar la unión de dicho componente de presenilina-2 con dicho compuesto candidato.

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39. Un método para identificar compuestos que pueden modular la actividad de una presenilina-2 que comprende las etapas de

proporcionar una célula que expresa un gen de presenilina-2 o presenilina-2 mutante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35; poner en contacto dicha célula con por lo menos un compuesto candidato; y detectar un cambio en un marcador de dicha actividad.

40. Un método de diagnóstico para determinar si un sujeto tiene un gen de presenilina-2 mutante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35; que comprende

detectar en una muestra biológica de dicho sujeto un ácido nucléico de presenilina-2 mutante, una proteína presenilina-2 mutante o una actividad de presenilina-2 mutante.

41. Una composición farmacéutica que comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en

(a) una proteína presenilina-2 sustancialmente pura como se define en la reivindicación 35;

(b) un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína presenilina-2 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32;

(c) un vector de expresión que codifica funcionalmente una proteína presenilina-2, y que comprende un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha proteína presenilina-2 en un sujeto humano; y

(d) un vector de expresión que codifica funcionalmente una secuencia antisentido de presenilina-2 de un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha secuencia antisentido de presenilina-2 en un sujeto humano.

42. Un método para producir una proteína presenilina-2 de mamífero, que comprende cultivar una célula hospedante como en la reivindicación 34 en condiciones apropiadas para la expresión de dicha proteína presenilina-2.

43. Un kit de diagnóstico para determinar si un sujeto tiene un gen de presenilina-2 mutante que comprende un componente del kit seleccionado de:

(a) una proteína presenilina-2 sustancialmente pura como se define en la reivindicación 35;

(b) un ácido nucléico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína presenilina-2 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32;

(c) un vector de expresión que codifica funcionalmente una proteína presenilina-2, y que comprende un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha proteína presenilina-2 en un sujeto humano; y

(d) un vector de expresión que codifica funcionalmente una secuencia antisentido de presenilina-2 de un ácido nucléico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32, en el que dicho vector de expresión puede expresar dicha secuencia antisentido de presenilina-2 en un sujeto humano.

44. Un animal transgénico no humano en el que un genoma de dicho animal, o de uno de sus ancestros, ha sido modificado por la introducción de una modificación seleccionada del grupo que consiste en

(a) la inserción de un ácido nucléico según una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33;

(b) la inserción de un ácido nucléico que codifica una proteína según la reivindicación 35;

(c) la inactivación de un gen de presenilina endógeno como se define en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35.