CZ361499A3 - Nový způsob přípravy antigenních receptorů a jejich použití - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu produkce anti-lidského antigenního receptoru, který je málo imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto způsob obsahuje kroky selekce a kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, kde alespoň uvedený řetězec VH pochází ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou vpodstatě anergní, a zmíněný řetězec VL pochází z repertoáru přirozeně se vyskytujících lidských B buněk, přičemž uvedené řetězce jsou exprimovány pomocí rekombinantního vektoru a používají in vitro detekční (expoziční) systém na vazbu k lidskému antigenu.

Předkládaný vynález se dále týká receptorů, které jsou jen slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní pro člověka a jsou namířeny proti lidským antigenům, přičemž uvedené receptory se dají získat způsobem podle vynálezu. Uvedené receptory jsou výhodně protilátky nebo jejich fragmenty nebo imunokonjugáty obsahující řetězce VH/VL zmíněné protilátky. Receptory podle -vynálezu jsou namířeny zejména proti lidským nádorovým antigenům, výhodně proti lidskému nádorovému antigenu 17-1 A, známému také jako EpCAM, EGP nebo GA 733-2. A nakonec se předkládaný vynález týká diagnostických souprav (kitů) použitelných pro provádění způsobu podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systémy savců, jako je lidský imunitní systém, rozpoznávají imunokompetentní buňky a molekuly, které jsou specifické pro autoantigeny. Porucha regulace imunitního systému z tohoto hlediska ,*· ': .·· '· • · · · • · · · · · • · • · · · může mít za následek autoimunitní nemoci, jako je revmatoidní artritida. Obecně je tudíž imunitní dohled vzhledem k autoreaktivním protilátkám nebo T buňkám vysoce prospěšný. Avšak může nastat případ, kdy je výhodné mít autoreaktivní protilátky, které jsou namířeny proti antigenům exprimovaným v savčím a zejména v lidském těle. Takové antigeny jsou například nádorové antigeny. Například bylo ukázáno, že lidský antigen 17-1A nebo EpCAM, povrchový glykoprotein exprimovaný buňkami jednoduchého epitelu a maligními nádory, které z něho vycházejí, je vhodný cíl pro monoklonální protilátku při léčbě rakoviny, zejména u pacientů s minimální reziduální nemocí, kteří mají diseminované nádorové buňky, které mohou později způsobit solidní metastázy, a tak zhoršit pacientovu prognózu. U pacientů s minimální reziduální kolorektální rakovinou snížila myší monoklonální protilátka specifická pro lidský' antigen 17-1A pětiletou úmrtnost o 30 % ve srovnání s neléčenými pacienty při systémové aplikaci v pěti dávkách během čtyř měsíců po chirurgickém odstranění primárního nádoru, každý pacient byl léčen celkem 900 mg protilátky (Riethmůller, Lancet, 343, 1177-1183, 1994). Ale v průběhu léčby protilátkou se u pacientů vyvinula silná protilátková reakce proti myšímu imunoglobulinu. Tyto lidské proti-myší protilátky (HAMAs) silně omezují kontinuální podávání protilátkové léčby a stoupající měrou snižují její účinnost. Kromě toho předem vytvořené HAMAs indukované dřívější protilátkovou léčbou nebo jiným kontaktem s myším imunoglobulinem mohou vážně interferovat s pozdější léčbou protilátkou.

Aby se předešlo těmto problémům, jsou výhodnější léčebné protilátky minimálně imunogenní. Pro dosažení tohoto cíle se může například uvažovat o tom, že léčebné protilátky⁷ nebo jejich deriváty jsou kompletně lidské svou aminokyselinovou sekvencí a imunogenní profil lidské idiotypové protilátky se minimalizuje použitím variabilních oblastí lidských imunoglobulinů, u kterých je pravděpodobné, že budou tolerovány lidským imunitním systémem.

• ·

Ale příprava lidských protilátek proti lidským antigenům čelí dvěma hlavním problémům:

1) ukázalo se, že hybridom nebo jiné techniky⁷ buněčné imortalizace jsou zcela neúčinné pro vznik buněčných linií produkujících lidské protilátky ve srovnání s technologií myších hybridomů.

2) autoreaktivní protilátky⁷ jsou relativně účinně zbaveny repertoáru přirozeně se vyskytujících protilátek díky⁷ mechanismu zprostředkované au to tolerance.

Lidské protilátky se všeobecně staly dostupnější díky⁷ použitelnosti transgenních myší exprimujících lidské protilátky (Bruggemann, Immunol. Today, 17, 391-397, 1996) a díky technikám kombinační protilátkové knihovny a fágové expozice (tj. technika phage display pro kterou není dosud ustálený český⁷ termín, umožňuje detekovat gen, např. cDNA, klonovaný do fága, exponovaný po expresi v bakteriích, např. pomocí protilátek, a pak izolovat klon exprimující požadovaný gen,), které umožňují in vitro kombinaci variabilních oblastí imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců (VH a VL) a in vitro selekci podle specifické vazby antigenu (Winter, Annu. Rev. Immunol., 2, 433-455, 1994). Použitím metody fágové expozice mohou být snadno izolovány vzácné jevy⁷, jako je jedna specifická vazebná skupina z 10⁷ až 10⁹ různých párů VL/VH nebo VH/VL, což je obzvláště spolehlivé, když byl repertoár variabilních oblastí obohacen o specifické vazebné skupiny použitím B lymfocytů z imunizovaných hostitelů jako zdroje pro klonování repertoáru.

Avšak často je v repertoárech přirozeně se vyskytujících protilátek výskyt specifických vazebných skupin podstatně snížen. To je pravdivé zejména u případů protilátek vázajících se na autoantigeny. Náhodné kombinace oblastí VL a VH au to tolerantního hostitele mající za následek kombinační protilátkové knihovny obvyklé velikosti (10⁷ až 10⁹ nezávislých klonů) často nejsou postačující pro úspěšnou in vitro selekci autoreaktivních protilátek metodou fágové expozice.

Jednou strategií, jak obejít tento problém, je použití velmi rozsáhlých kombinačních protilátkových knihoven, které svou velikostí kompenzují »· · · · ·4 malý výskyt autoreaktivních protilátek v přirozeně se vyskytujících repertoárech. Ale je obtížné získat kombinační protilátkové knihovny překračující velikost 10⁹ nezávislých klonů díky současnému technickému limitu účinnosti transformace plazmidové DNA do buněk E. coli.

Aby se zabránilo systematické chybě vyvolané autotolerancí v repertoárech přirozeně se vyskytujících protilátek, kdy jsou autoreaktivní protilátky⁷ zachycovány ve snížené míře a významně se snižují šance na izolaci protilátek specificky rozpoznávajících autoantigeny, byly vyvinuty postupy používající semisyntetické nebo zcela syntetické repertoáry⁷ řetězců VH a/nebo VL. Například byl klonován téměř úplný repertoár nepřestavěných segmentů lidského V genu z genomové DNA a použit pro in vitro rekombinace funkčních genů variabilní oblasti, připomínající V-Jnebo V-D-J- rekombinace in vivo (Hoogenboom, J. Mol. Biol., 227, 381388, 1992, Nissim, EMBO J., 13, 692-698, 1994, Griffiths, EMBO J., 13, 3245-3260, 1994). Obvykle je diverzita spojení V-D-/D-J- a D-segmentu, která je převážně zodpovědná za neobvyklou délku a sekvenční variabilitu těžkého řetězce CDR3, a také diverzita spojení V-J-, která přispívá k sekvenční variabilitě lehkého řetězce CDR3, imitována náhodnými sekvencemi používajícími degenerované oligonukleotidy v postupech plně syntetických a semisyntetických (Hoogenboom, 1994, viz výše, Nissim, viz výše, Griffiths, viz výše, Barbas, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89, 44574461, 1992).

Ale u párů VL/VH nebo VH/VL vybraných pro vazbu k lidskému antigenů z těchto semisyntetických nebo zcela syntetických repertoárů založených na sekvencích lidského V genu je riziko, že mohou tvořit imunogenní epitopy, které mohou u lidí indukovat nežádoucí imunitní reakci (Hoogenboom, TIBTECH, 15, 62-70, 1997), zejména oblasti CDR3 pocházející z repertoárů úplně randomizovaných (náhodných) sekvencí jsou předurčené ke tvorbě potenciálně imunogenních epitopů, protože nikdy nebyly vystaveny imunitnímu dohledu člověka, aniž by byly rozpoznány jako cizorodý antigen a v důsledku toho později eliminovány. Stejně tak to platí pro lidské protilátky z transgenních myší exprimujících ·· • · · · • · · · · · . 9.· · ».« ·• · « ♦ * * · ··«· »· lidské protilátky, protože tyto molekuly imunoglobulinů byly vybrány pro to, zeje toleruje myší, ale už ne lidský imunitní systém.

Podstata vynálezu

Technickým problémem, který je řešen předkládaným vynálezem, bylo poskytnout způsob, který umožňuje přípravu receptorů, které jsou slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní pro člověka a které mohou být použity pro cílení antigenů v lidském těle. Řešení uvedeného technického problému bylo dosaženo provedeními vynálezu, jejichž význaky jsou popsány v patentových nárocích.

Předkládaný vynález se tudíž týká způsobu přípravy anti-lidského antigenního receptorů, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto způsob obsahuje kroky selekce a kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, kde alespoň uvedený řetězec VH pochází ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou vpodstatě anergní, a zmíněný řetězec VL pochází z repertoáru přirozeně se vyskytujících lidských B buněk, uvedené řetězce jsou exprimovány pomocí rekombinantního vektoru a používají in vitro detekční (expoziční) systém pro vazbu k lidskému antigenů.

Způsob podle předkládaného vynálezu je výhodný pro přípravu receptorů, které mohou být použity pro cílení antigenů u lidí a které samy nejsou imunogenní bud vůbec nebo alespoň ne do významné míiy. Tyto receptory mohou být výhodně použity pro léčbu celé řady nemocí jako nádorů nebo autoimunitních chorob, rejekce (odhojení) štěpu po transplantaci a infekčních nemocí, a to tím, že se cílí na buněčné receptory, a nebo k léčení nemocí alergických, zánětlivých, endokrinních a degenerativních tím, že se cílí na klíčové molekuly zapojené do patologického procesu.

»·· *·· ··· ·««·

9- . ' ·: :

Imunoglobulínové řetězce VH/VL receptorů předkládaného vynálezu mohou být ovšem dále zkoumány, co se týče jejich sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí s použitím technik v oboru známých, viz např. Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,

1989). Jakmile byla jednou určena sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselinová sekvence, mohou být receptory podle vynálezu připraveny také jinými metodami, jako jsou syntetické nebo semisyntetické metody poskytující syntetické nebo semisyntetické receptory, nebo v transgenních myších exprimujících lidské imunoglobulínové receptory, čili receptory nesoucí vlastnosti vyjmenované výše v tomto textu a tvořené takovými syntetickými nebo semisyntetickými metodami nebo v transgenních myších jsou také zahrnuty do rámce předkládaného vynálezu.

Po navázání receptorů na lidský antigen může být receptor dále purifikován. Například nenavázané receptory, které nenesou antigenní specifitu, mohou být odstraněny promýváním. Navázaný receptor může být eluován z lidského antigenu a dále purifikován, mohou být použity další cykly exprese, vazby a selekce požadovaného receptorů, dokud není požadovaný receptor a/nebo odpovídající rekombinantní vektor izolován v čisté formě.

Způsob předkládaného vynálezu tedy používá třídění variabilních oblastí imunoglobulinů lidským imunitním systémem. Receptory pocházejí z repertoáru vybraného ín vitro z lidských kombinačních protilátkových knihoven výlučně nebo přednostně vytvořených z repertoáru přirozeně se vyskytujících protilátek exprimovaných zralými lidskými lymfocyty B, které jsou v podstatě nesenzibilizované, nebo lidskými B buňkami, které jsou v podstatě anergní.

Ale imunoglobulínové variabilní domény mohou také pocházet z celé řady dalších zdrojů, které představují tyto předem vybrané populace B buněk.

Vědecký podklad pokud se týká původu B buněk fungujících jako zdroj uvedených řetězců VH nebo VL může být vysvětlen následovně:

• · · · · ·'*· '··· · e · • · · · « · · • · • · « · • ·

Zralé nesenzibilizované (naivní) B lymfocyty, které exprimují IgD a IgM jako membránové antigenní receptory, vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální selekci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními, a žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů.

Kontakt nezralých B buněk, které exprimují výlučně IgM, s autoantigenem v kostní dřeni má za následek klonální delecí nebo anergii v závislosti na valenci antigenu. Anergní B buňky, ačkoliv exprimují povrchový IgD, jsou neschopné odpovídat tímto receptorem na antigen; bez přístupu do primárních folikulů a v nepřítomnosti pomocných T buněk tyto buňky mají poločas života krátký pouze několik dnů.

Na rozdíl od toho zralé naivní B lymfocyty, které se nesetkaly s autoantigenem a mají tudíž přístup do primárních folikulů, mají poločas života dlouhý několik týdnů. Navzdory popsaným mechanismům zprostředkovávajícím autotoleranci si tyto populace dlouho žijících zralých naivních B lymfocytů stále udržují potenciálně autoreaktivní B buňky, je ale nepravděpodobné, že naleznou specifickou pomoc T buněk díky T buněčné toleranci, a tak je zadržena jejich proliferace a sekrece protilátek. Ukazuje se, že neodpovídavost B buněk na mnoho autoantigenů, které se vyskytují v nízkých hladinách, je tohoto typu, ovlivňující pomocné T buňky, ale ne B buňky. V předkládaném vynálezu jsou tyto dlouho žijící neodpovídavé potenciálně autoreaktivní zralé naivní B lymfocyty identifikovány jako nej slibnější repertoár přirozeně se vyskytujících lidských protilátek pro konstrukci kombinačních protilátkových knihoven vhodných zejména pro výběr lidských protilátek k lidským antigenům, například metodou fágové expozice.

Lze očekávat, že tento vysoce selektovaný repertoár protilátek použitý jako základ pro předkládaný vynález, pocházející hlavně z B buněk s dlouhým poločasem života in vivo, které jsou tudíž vystaveny lidskému imunitnímu systému po delší dobu, je významně ochuzen o protilátkové ··. · · « • · ♦ · · • 9· · 99 molekuly tvořící epitopy, zejména ve vysoce variabilních oblastech CDR3, které jsou imunogenní pro lidský imunitní systém. Proto se očekává, že lidské protilátky vybrané z tohoto repertoáru protilátek mají u člověka nižší imunogenní profil, než lidské protilátky vybírané z semisyntetických nebo plně syntetických knihoven lidských protilátek.

Zralé naivní (nesenzibilizované) B buňky, které jsou aktivovány kontaktem s cizorodým antigenem, zastaví exprese IgD a počnou klonální proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky secernující rozpustný imunoglobulin, časným stadiím protilátkové reakce dominují protilátky⁷ IgM, zatímco později jsou převládající izotypy IgG a IgA, přičemž IgE přispívá malou, ale biologicky důležitou částí protilátkové reakce. Na rozdíl od IgD-negativních zralých, antigenem aktivovaných B lymfocytů exprimujících IgM, IgG, IgA nebo IgE, IgD-pozitivní zralé naivní B buňky dosud nepodstoupily klonální proliferaci, takže kombinační IgD knihovny nezachycují nadměrně protilátkové specifity, které jsou v současné době nebo byly dříve zapojeny do imunitních reakcí obvykle řízených cizorodým antigenem, tudíž se snižuje diverzita repertoáru a plýtvá se místem v knihovně pro protilátkové kandidáty, u nichž je nepravděpodobná vazba autoantigenu. To je ve zřetelném kontrastu se stavem techniky, který doporučuje použití lidské IgM kombinační protilátkové knihovny pro in vitro selekci lidských protilátek proti lidským antigenům z repertoárů přirozeně se vyskytujících lidských protilátek (Hoogenboom, 1997, výše).

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je uvedený antigenní receptor imunoglobulin nebo jeho fragment.

Fragment imunoglobulinu může být každý fragment, který je v oboru znám, jako jsou fragmenty Fab nebo F(ab)2.

V obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený fragment imunoglobulinu fragment Fv.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu pocházejí alespoň uvedený VH a volitelně uvedený VL imunoglobulinový řetězec z repertoáru lidského IgD.

« ... ΦΦ . ΦΦ •',Φ·. ....-2..·./. -Φ • · · · · • · ·Φ Φ ΦΦΦ φ φ Φ ·Φ· Φ· Φ· »φ • · * ·

Byl učiněn závěr, že tento receptor a výhodně repertoár protilátek vybraných pro nízkou imunogeničnost jsou nejlépe reprezentovány v protilátkové knihovně lidského IgD. IgD je exprimován jako membránový antigenní receptor spolu s povrchovým IgM na zralých naivních B lymfocytech, které vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální deleci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními a pak žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů. Kromě repertoáru protilátek zralých naivních B lymfocytů, lidské IgD knihovny pouze dále představují ty krátce žijící B buňky, které se staly anergními při kontaktu s rozpustným monovalentním autoantigenem, ale je nepravděpodobné, že přispějí specifickými vazebnými skupinami k povrchovým molekulám lidské buňky připomínajícím multivalentní autoantigeny, které indukují klonální deleci B buněk namísto anergie.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený in vitro detekční systém technika fágové expozice.

Systém fágové expozice byl v minulosti obyčejně použit pro selekci celé řady peptidů a proteinů, které se vážou na specifické cíle. Na základě této znalosti mohou být imunoglobulinové řetězce VH a VL pohodlně klonovány do vektorů, které také obsahují molekuly použitelné pro systémy fágové expozice. Takové molekuly a vektory jsou v oboru dobře známy (Winter, výše, Barbas, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2, 119-124, 1991) a není třeba je zde detailněji vysvětlovat.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu je uvedená kombinace přestavěných řetězců exprimována v jedné nebo více různých knihovnách.

Toto provedení je zejména výhodné, je-li známo, že řetězec VH nebo VL se váže na specifický cíl a vybere se odpovídající druhý řetězec V, který vytváří nebo zlepšuje vazbu.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu uvedený lidský antigen je nádorový antigen.

*4 4 · 4

».......* 4 · '· » 4 4 4

444 444 t ”9.....'·' • · • 4 4

Jestliže lidský antigen je nádorový' antigen, je uvedený antigen výhodně exprimován na povrchu uvedeného nádoru. V tomto případě jsou řetězce VH a VL výhodně spojeny s toxinem. Vazba může být provedena na úrovni nukleové kyseliny metodami genetického inženýrství nebo na proteinové úrovni pomocí například chemické vazby/kondenzace.

Je zejména výhodné, když uvedený nádorový antigen je antigen 17-1A,

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu uvedený řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo uvedený řetězec VL obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321). Receptory s těmito specifickými oblastmi VH a VL, kde uvedená oblast VL může být spojena s oběmi oblastmi VH, jsou první lidské protilátky, které jsou specifické pro lidský antigen 17-1 A.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu uvedený krok selekce zahrnuje

I) vazbu expozičního prostředku (nosiče) exprimujícího antigenní receptor

a) na imobilizovaný cílový' antigen nebo jeho fragmenty,

b) na volitelně značené buňky exprimující cílový' antigen nebo jeho fragmenty, nebo

c) na rozpustný, výhodně značený cílový antigen nebo jeho fragmenty,

II) odmytí nespecificky navázaného expozičního prostředku (a a b) a následnou eluci specificky vázaného expozičního prostředku nespecifickými (např. pufr s nízkým pH) nebo specifickými prostředky (např. specifická protilátka k cílovému antigenu), nebo

III) pozitivní obohacení expozičního prostředku navázaného na cílový antigen (bac) z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenze buněk exprimujících cílový antigen pomocí například magnetických perliček vázajících značený cílový antigen nebo značených buněk • · 99 99

·.· '♦'· * 9 ·

9 9 9

999 999

9

99 99 • ·· ···· '·'· '· *· .....·· · * · • · ·

9 9

9999 99

II exprimujících cílový antigen, takto izolované expoziční prostředky s antigenními receptory mohou být dle volby dále množeny replikací a podrobeny dalším kolům in vitro selekce, jak se popisuje.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu se před uvedeným selekčním krokem vybírá buď řetězec VH nebo VL pro vazbu uvedeného antigenu, spolu s náhradním řetězcem V.

Tento dvoustupňový postup může použít templátovou protilátku specifickou pro cílový antigen z různých druhů, například myší monoklonální protilátku proti lidskému cílovému antigenu. Nejdříve se repertoár lidských VH nebo VL spojí s jedním náhradním řetězcem VH nebo VL z myší templátové protilátky, která je exponována prostřednictvím např. vláknitého fága a vybrána in vitro vazbou antigenu. Celý rozsah knihovny je tedy přístupný výlučně repertoáru lidských VL nebo VH a mohou být izolovány kandidátní protilátky lidských řetězců VL nebo VH, které jsou schopné přispět ke specifické vazbě lidského cílového antigenu. Ve druhém kroku se náhradní variabilní oblast templátové protilátky zamění odpovídající variabilní oblastí z lidského repertoáru, a pak následuje druhé kolo in vitro selekce; celý rozsah knihovny je opět výlučně přístupný jednomu repertoáru oblastí VH nebo VL, a tak dvoustupňový postup umožňuje v podmínkách omezené velikosti knihovny screening mnohem více kandidátů oblasti VL a VH pro vazbu antigenu než jednostupňový.

Tento dvoustupňový' selekční postup pro screening lidských IgD kombinačních protilátkových knihoven metodou fágové expozice byl výhodně použit pro klonování sekvencí DNA kódujících variabilní oblasti lidských protilátek, které se specificky vážou na lidský antigen 17-1 A. Nejdříve byl spojen Fd segment těžkého řetězce (VH+CH1) myší monoklonální protilátky (Góttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986), který' se specificky váže na lidský antigen 17-1 A, s repertoárem lidských lehkých řetězců kappa a lambda. Výsledné knihovny byly exponovány prostřednictvím vláknitého fága a proběhla selekce in vitro několika koly ·* ··<·« ft · · *

9 999 „rýžování“ (specifického vychytávání) na imobilizováném rekombinantním lidském antigenu 17-1 A. Rozpustné Fab fragmenty byly exprimovány několika klony po každém kole „rýžování“ a testovaly se pomocí ELISA na vazbu antigenu. Ukázalo se, že každá silná vazebná skupina obohacená během „rýžovací“ procedury obsahuje tentýž lidský lehký řetězec kappa, což bylo potvrzeno sekvenční analýzou. Tento lidský lehký řetězec, nadále nazýván K8, byl pak spojen s knihovnou lidského těžkého řetězce IgD, která byla opět exponována prostřednictvím vláknitého fága a proběhla selekce in vitro několika koly „rýžování“ na imobilizovaném rekombinantním lidském antigenu 17-1 A. Několik Fab fragmentů bylo exprimováno několika klony po každém kole „rýžování“ a opět se testovaly pomocí ELISA na vazbu antigenu. Sekvenční analýza vazebných skupin obohacených během „rýžovací“ procedury odhalila dvě různé variabilní oblasti těžkého řetězce nazvané D4.5 a D7.2, každá z nich se spojuje s lehkým řetězcem K8 za vzniku odlišných lidských antigenních vazebných míst se specifitou pro lidský antigen 17-IA. Repertoáry lidských lehkých a těžkých řetězců se klonovaly z několika preparátů celkové RNA izolované ze vzorků lidské krve a kostní dřeně několika dárců s použitím reakce RT-PCR (reverzní transkriptáza + polymerázová řetězová reakce) specifické pro lehké řetězce kappa nebo lambda, jakož i těžké řetězce IgD. Protože je nemožné selektivně amplifikovat repertoár lehkých řetězců, které jsou spojeny s IgD těžkými řetězci in vivo, pokud nejsou pro preparát RNA purifikovány IgD pozitivní B buňky, použité knihovny lehkých řetězců nejsou omezeny na repertoár protilátek zralých naivních nebo anergních B lymfocytů. Ale díky převaze těžkého řetězce v rozpoznávání antigenu tento fakt nijak neubírá výhody IgD repertoáru pro selekci lidských protilátek k autoantigenům. Kromě toho, a to je nej důležitější, díky vystavení lidskému imunitnímu systému selekce těchto lehkých řetězců stále zaručuje nízký imunogenní profil u člověka.

V dalším zvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený náhradní řetězec myší VH nebo VL řetězec.

• « • * · * • · · · *»· ··· • <1 ·« *·

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu uvedená selekce vhodných kombinací zahrnuje

a) testování jednoho a téhož VH řetězce v kombinaci s velkým počtem různých VL řetězců na vazbu k uvedenému lidskému antigenů, nebo

b) testování jednoho a téhož VL řetězce v kombinaci s velkým počtem různých VH řetězců na vazbu k uvedenému lidskému antigenů.

Toto provedení se opět výhodně použije, jestliže je známo, že buď VL nebo VH řetězec specificky interaguje s lidskou cílovou molekulou. Poté může být příslušný druhý řetězec vybrán na základě výhodně zlepšené vazby na cílovou molekulu.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje uvedený způsob kroky získávání lidských řetězců VH a VL nebo odpovídajících nukleových kyselin po selekci a fúzování uvedených řetězců ke stejným nebo jiným řetězcům VH nebo VL, k imunoglobulinovým konstantním oblastem těžkých (CH) nebo lehkých (CL) řetězců nebo jejich částem, nebo k dalším biologicky aktivním molekulám, jako jsou peptidy, proteiny, nukleové kyseliny, malé organické sloučeniny, hormony, neurotransmitery, peptidomimetika, PNA (Milner, Nátuře Medicine, 1, 879880, 1995, Hupp, Cell, 83, 237-345, 1995, Gibbs a Oliff, Cell, 79, 193-198, 1994). Další funkční molekula může být spojena buď fyzikálně, např. chemickými prostředky k řetězcům VH a VL, nebo může být fúzována technikami rekombinantní DNA v oboru známými.

Toto provedení vynálezu je použitelné obzvláště pro vývoj specifických léků, které mohou být použity pro cílení požadovaných antigenů v lidském těle. Například, jestliže jsou zacíleny nádorové antigeny, mohou být VH a VL řetězce na úrovni nukleové kyseliny nebo aminokyselin fúzovány se skupinou toxinů, výsledkem je imunotoxin; s extracelulární částí buněčného receptoru nebo rozpustného cytokinu či jejich částí, výsledkem jsou konstrukty zesilující imunitní reakci proti nádorům; nebo s protilátkovým Fv fragmentem, výsledkem je protilátkový derivát s dvojí specifitou.

.-. · .*»· .'.?·♦· . _e ..··.<·« '« • · · · • ·· · ·· · • · • · • · · ··· · ··

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu pocházejí uvedené konstantní oblasti řetězců z lidských IgGl nebo IgG3.

Konstantní oblasti řetězců z lidských IgGl nebo IgG3 se používají zejména tehdy, mají-li být buňky⁷ exprimující cílový⁷ antigen v lidském těle zničeny. V oboru je známo, že tyto podtřídy IgG účinně zprostředkovávají buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) a přispívají ke zničení buněk rozpoznaných a navázaných těmito podtřídami protilátek.

V dalším výhodném provedeni způsobu vynálezu jsou uvedené VH a/nebo VL řetězce spojeny s neproteinovým přípravkem (léčivem) s nízkou molekulovou hmotností, jako jsou radioizotopy nebo látky používané pro chemoterapii, výsledkem je specifičtější in vivo cílení uvedených přípravků.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu jsou uvedené VH nebo VL řetězce exprimovány ze sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem amplifikace metodou RT-PCR mRNA pocházející ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní.

Je výhodné amplifikovat VH nebo VL řetězce pomocí RT-PCR, jakmile byl jednou identifikován a izolován vhodný zdroj. Pro amplifikaci VH nebo VL řetězců pomocí RT-PCR se dává přednost použití mRNA z jaderných buněk lidské kostní dřeně nebo výhodněji z lidské krve, protože tyto dva tkáňové kompartmenty jsou nejsnadněji přístupné zdroje B buněk u lidí. Dále se preferuje oddělit před izolací RNA anergní B buňky⁷ nebo výhodněji zralé naivní B lymfocyty od jaderných buněk uvedených tkáňových kompartmentů použitím např. magnetických perliček nebo třídění buněk založené na průtokové cytometrii. Tento postup zaručuje, že oba VH a VL řetězce amplifikované pomocí RT-PCR pocházejí z favorizované populace B buněk. Alternativně, je-li pro amplifikaci VH nebo VL řetězců pomocí RT-PCR použita mRNA z celé frakce jaderných buněk z uvedených tkáňových kompartmentů, je výhodné amplifikovat VH oblast jako polovinu Fd segmentu těžkého řetězce (VH-CH1) lidského IgD s použitím 3'-koncového PCR primeru specifického pro IgD, např. ukázaného v tabulce 1, se kterým vzniknou výlučně PCR produkty z lidského IgD ·· ΦΦ » Φ φ

Φ těžkého řetězce, exprimovaného pouze v zralých naivních B lymfocytech a v anergních lidských B buňkách.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu obsahuje anti-lidský antigenní receptor, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kombinaci funkčně přestavěných VH a VL řetězců výhodně ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě naivní, nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, a které je možno získat způsobem podle vynálezu popsaného výše.

Výhody protilátky podle vynálezu zde byly nastíněny výše. Je třeba zdůraznit, že odpovídající protilátky’ namířené proti lidským antigenům a pocházející z lidských zdrojů, které jsou pro člověka slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní, nebyly doposud v oboru izolovány. Proto jsou protilátky podle vynálezu výchozí bod pro zcela nový’ vývoj protilátek, které mohou být použity⁷ v různých odvětvích medicíny a farmacie.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu je receptor protilátka nebo její fragment.

V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu je receptor specifický pro lidský nádorový⁷ antigen, nejvýhodněji pro lidský antigen

17-1A.

Vynález se dále týká receptoru, kde uvedený VH řetězec obsahuje jednu ze sekvencí ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo uvedený VL řetězec obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy⁷ 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Navíc se vynález týká VH řetězce nebo jeho části obsažené v receptoru podle vynálezu.

Vynález se také týká VL řetězce nebo jeho části obsažené v receptoru vynálezu.

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedená část VH řetězce doména CDR3.

Dále se vynález týká soupravy⁷ obsahující funkčně přestavěné VH a VL řetězce imunoglobulinu, kde alespoň jeden z VH a VL řetězců pochází • · · · • · » 9 ·· · ··· • ·

99 ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě naivní, nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, uvedené řetězce jsou schopné exprese rekombinantními vektory in vitro detekčního (expozičního) systému.

Souprava podle vynálezu je výhodně použita pro provádění způsobu podle vynálezu a tedy k získání receptorů požadované specifičnosti.

V uvedené soupravě je in vitro detekční systém výhodně systém fágové expozice (phage display).

Vynález se dále týká protilátky vyznačující se tím, že pochází z lidských sekvencí a je specifická pro lidský antigen 17-1 A.

Způsobem podle vynálezu byla poprvé vyvinuta lidská protilátka, která je specifická pro lidský antigen 17-1 A. Jak bylo zdůrazněno dříve, tento vývoj nebyl zanedbatelný problém, protože lidské protilátky proti lidským nádorovým antigenům jsou obvykle podrobeny mechanismům zprostředkovávajícím autotoleranci imunitního systému, což má za následek eliminaci B lymfocytů exprimujících autoreaktivní protilátky in vivo. Ze známých nádorových antigenů je antigen 17-1A mnohem siřeji exprimovaný na značné části normálních epitelových tkání než jiné nádorové antigeny, kromě své exprese na epitelových nádorech.

Antigen 17-1A se proto v současné době považuje spíše za představitele panepitelového antigenu než za nádorový antigen, za který byl pokládán v době svého prvního popisu. Pro srovnání, další takzvané nádorové antigeny nalezené na epitelových nádorech, jako erb-B2 (Her2/neu), Muc-1 (PEM) nebo Thompson-Friedreichův antigen obvykle vykazují na normálních epitelových tkáních mnohem omezenější vzorec exprese. Tudíž se očekává, že selektivní tlak autotolerance proti B lymfocytům, expriraujícím 17-1A reaktivní protilátky třebas jen s malou afinitou, je mimořádně silný, protože se zdá téměř nemožné, aby se tyto B buňky vyhnuly po delší časové období setkání s antigenem 17-1 A, díky všudypřítomnosti tohoto antigenu. Bylo překvapivě zjištěno, že z repertoáru protilátek lidských B buněk, jako jsou např. zralé naivní B lymfocyty, mohou být izolovány 17-1A specifické protilátky nebo alespoň ·· ··

:._r< · • · · · «« · · · · «« ·» odpovídající těžké řetězce. Je známo, že tyto B buňky mají dlouhý' poločas života in vivo a už se jím podařilo vyhnout se před svou maturaci depleci navzdory' přítomnosti antigenů 17-1A dokonce i v místě maturace; anergie B buněk v případě antigenů 17-1A nenastává, protože tento typ B buněčné tolerance je vyvoláván pouze rozpustným autoantigenem. Pouze dlouho žijící B buňky, kterým se podařilo přežít navzdory své potenciální 17-1A reaktivitě, představují repertoár variabilních oblastí lidských imunoglobulinů u něhož je pravděpodobné, že bude lidským imunitním systémem dobře tolerován při použití pro konstrukcí lidských protilátek a protilátkových derivátů určených k tomu, aby byly opakovaně systémově podávány lidem, protože již byly buněčným dohledem imunitního systému prověřeny a pak byly z imunogenních sekvencí vyloučeny. Předkládaný vynález se tudíž také týká lidských protilátek specifických pro antigen 17-1A a vhodných pro opakovanou aplikaci in vivo nehledě na způsob, kterým jsou získány, protože se s velkou pravděpodobností očekává, že lidské protilátkové sekvence s uvedenou vysokou kompatibilitou in vivo budou nalezeny, například způsobem podle vynálezu, také v repertoáru B buněk zdravých lidí. Ve shodě s tím byla nyní poprvé vyvinuta lidská protilátka, která může být výhodně použita pro sledování a/ nebo zničení nádorových buněk nesoucích antigen 17-1 A.

Protilátka vynálezu je tudíž výhodně slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka. Ve výhodném provedení lze uvedenou protilátku získat způsobem, jak je popsán výše. V dalším výhodném provedení protilátka vynálezu rozpoznává epitop extracelulární domény antigenů 17-1 A, který výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidu č. 8, 11, 13, 14, 59, 60 a 79. VH řetězec protilátky vynálezu výhodně zahrnuje alespoň jednu CDR z jedné z následujících dvou sekvencí ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo VL řetězec obsahuje alespoň jednu CDR z jedné z následujících dvou sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321). Zejména výhodná je protilátka, kde uvedený VH řetězec obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí ukázaných na

IS

4« 4*44 * • · 4 44 • 4 · • · ♦ 4 • 4 · ·

4444 44 tt«

44 44

4444

4 4 4 4 • 4 ·4· 444

4 4

444 44 44 obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo uvedený VL řetězec obsahuje jednu z následujících dvou sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

Byl učiněn závěr, že tento receptor a výhodně repertoár protilátek vybraných pro nízkou imunogeničnost jsou nejlépe reprezentovány v protilátkové knihovně lidského IgD. IgD je exprimován jako membránový⁷ antigenní receptor spolu s povrchovým IgM na zralých naivních B lymfocytech, které vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální deleci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními a žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů. Kromě zralých naivních B lymfocytů lidské IgD knihovny pouze představují repertoár protilátek krátce žijících B buněk, které se staly anergními při kontaktu s rozpustným monovalentním autoantigenem, ale je nepravděpodobné, že přispějí specifickými vazebnými skupinami k povrchovým molekulám lidské buňky připomínajícím multivalentní autoantigeny, které indukují klonální deleci B buněk namísto anergie.

Kromě toho se předkládaný vynález týká farmaceutického přípravku obsahujícího alespoň jeden z výše uvedených receptorů podle vynálezu nebo jejich části, buď samotné nebo v kombinaci, a volitelně farmaceutický⁷ přijatelný nosič nebo excipient. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou v oboru známy a zahrnují fyziologické roztoky pufrované fosforečnany, vodu, emulze, jako jsou emulze olej/voda, různé typy smáčedel, sterilní roztoky apod. Přípravky obsahující tyto nosiče mohou být formulovány obvyklými známými způsoby. Týto farmaceutické přípravky mohou být pacientovi podávány ve vhodné dávce. Podávání vhodných přípravků se může provádět různými způsoby, např. intravenózním, intraperitoneálním, subkutánním, intramuskulárním, lokálním nebo intradermálním podáváním.

Vynález se tedy také týká použití receptorů, nebo jeho části, připraveného způsobem podle vynálezu pro přípravu farmaceutického • · • · - · · • · · · ··· ♦· ·· «··· ·· ··· přípravku pro léčbu, prevenci a/nebo oddálení nádoru u pacienta, výhodně když je nádor epitelového původu.

Přehled obrázků

Obrázek 1: Klonovací místo pComb3H s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VL, variabilní doména lehkého řetězce, CL, konstantní doména lehkého řetězce, VH, variabilní doména těžkého řetězce, CH1, konstantní doména těžkého řetězce, LI/2, prokaryotické vedoucí sekvence. Doména označená jako gen III v pComb3H kóduje neinfekční část produktu genu III vláknitých fágů, jako např. VCSM13.

Obrázek 2: Schéma plazmidu pComb3H a plně exprimovaného fágu Ml3. Na pComb3H je ukázána organizace vedoucí sekvence (L}ompA, lehkého řetězce, vedoucí sekvence (L}pelB, těžkého řetězce a genu III. Plně exprimovaný fág M13 exponuje na svém povrchu fenotyp určitého protilátkového Fab fragmentu skládajícího se z lehkého řetězce a Fd segmentu (VH+CH1) těžkého řetězce spojeného s neinfekční částí produktu genu III a obsahuje odpovídající genotyp jako jednovláknovou DNA kódující těžký a lehký řetězec vystaveného Fab fragmentu. Infekční protein genu III je poskytnut pomocným fágem VCSM13.

Obrázek 3: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje Fd segment chimérického M79 a jeden lidský řetězec kappa na klon. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla polyklonální proti-lidskou imunoglobulinovou protilátkou konjugovanou s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azinobis(3-etylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila • 0 · ·

ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“ druhé číslo je číslo klonu. Klony 1.5-9 mají kombinaci chimérického M79 Ed segmentu s jedním náhodným řetězcem kappa a představují negativní kontroly.

Obrázek 4: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje k8 lehký řetězec a jeden Fd segment lidského Ig delta řetězce. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla biotinylovanou polyklonální proti-lidskou protilátkou lehkého řetězce kappa, po které následoval streptavidin konjugovaný s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azino-bis(3etylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“ druhé číslo je číslo klonu. Klony 1.2-6 mají kombinaci k8 lehkého řetězce s jedním náhodným Fd segmentem Ig delta těžkého řetězce a představují negativní kontroly.

Obrázek 5: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje Fd segment D4.5 a jeden lidský řetězec kappa na klon. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla biotinylovanou polyklonální proti-lidskou protilátkou lehkého řetězce kappa, po které následoval streptavidin konjugovaný s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azino-bis(3etylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“ druhé číslo je číslo klonu, S. je zkratka pro klony před prvním kolem selekce. Klony S.l-3 mají kombinací k8 lehkého řetězce • · 9 s jedním náhodným Fd segmentem Ig delta těžkého řetězce a představují negativní kontroly.

Obrázek 6: DNA a proteinová sekvence variabilní oblasti lidského lehkého řetězce kappa 8. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 70 až nt 102, CDR2 nt 148 až nt 168, CDR3 nt 265 až nt 294.

Obrázek 7: DNA sekvence variabilní oblasti lidského D4.5 těžkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 91 až nt 105, CDR2 nt 148 až nt 198, CDR3 nt 292 až nt 351. Hranice mezi variabilní oblastí těžkého řetězce a doménou CH 1 konstantní oblasti Ig delta je lokalizována mezi nt 382 a nt 383 s tím, že proteinová sekvence konstantní oblasti delta začíná v nt 384.

Obrázek 8: DNA sekvence variabilní oblasti lidského D7.2 těžkého řetězce. Čísla vyznačuji nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 91 až nt 105, CDR2 nt 148 až nt 198, CDR3 nt 292 až nt 309. Hraníce mezi variabilní oblastí těžkého řetězce a doménou CH 1 konstantní oblastí Ig delta je lokalizována mezi nt 340 a nt 341 s tím, že proteinová sekvence konstantní oblasti delta začíná v nt 343.

Obrázek 9: DNA a proteinová sekvence variabilní oblasti lidského kappa 5.1 lehkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedepy jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 70 až nt 102, CDR2 nt 148 až nt 168, CDR3 nt 265 až nt 294.

Obrázek 10: Analýza průtokovou cytometrií protilátkových Fab fragmentů a kontrolních protilátek M79 na 17-1A pozitivních buňkách Kato pro testování vazebné aktivity periplazmatického preparátu • · obsahujícího fragment k8-D4.5-Fab. Buňky Kato se inkubovaly I) s irelevantním periplazmatickým preparátem, II) s 10 pg/ml chimérického (bivalentního !) M79, III) s periplazmatickým preparátem k8-D4.5 a IV) s periplazmatickým preparátem k8-D4.5 naředěným v poměru 1:10. Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.

Obrázek 11: Analýza průtokovou cytometrií protilátkových Fab fragmentů a kompletních protilátek na 17-1A pozitivních buňkách Kato, buňkách CHO transfekovaných a netransfekováných 17-1 A, v uvedeném pořadí, pro testování vazebné aktivity periplazmatických preparátů (pp) obsahujících k8-D4.5-, k5.1-D4.5- nebo irelevantní k-D4.5-Fab fragmenty. Buňky’ Kato se inkubovaly I) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k5.1-D4.5-pp (plná čára) nebo II) s 20 pg/ml protilátky M79 (plná čára) nebo odpovídající myší IgG2a izotypové kontroly (přerušovaná čára). Buňky CHO transfekované 17-1A se inkubovaly III) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k5.1-D4.5-pp (plná čára), IV) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k8-D4.5-pp (plná čára) nebo V) s 20 pg/ml protilátky M79 (plná čára) nebo odpovídající myší IgG2a izotypové kontroly (přerušovaná čára). V bodech III), IV) a V) se inkubace a detekce relevantních pp (k5.1-D4.5-Fab-pp a k8-D4.5-Fab-pp, v uvedeném pořadí) a myší protilátky M79 prováděla také na netransfekovaných buňkách CHO (tečkované čáry). Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.

Obrázek 12: Klonovací místo pEF-ADA s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VL, variabilní doména lehkého řetězce, CL, konstantní doména lehkého řetězce, Leuc, eukaryotická vedoucí sekvence.

» · · · ·· · ·· ’ t *

Obrázek 13: Klonovací místo pEF-DHFR s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VH, variabilní doména těžkého řetězce, CH1/2/3, konstantní doména těžkého řetězce 1/2/3, Leuc, eukaryotická vedoucí sekvence.

Obrázek 14: SDS-PAGE preparátů lidské protilátky H79. Na 12,5% polyakrylamidovém gelu v redukujících a neredukujících podmínkách se pouštělo přibližně 10 pg každé protilátky a obarvilo se Coomassie modří. Dráha 1: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu)

Dráha 2: varianta H79 lidského IgGl (neredukční)

Dráha 3: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkách

Dráha 4: varianta H79 myšího IgGl (neredukční)

Dráha 5: varianta H79 myšího IgGl v redukčních podmínkách

Obrázek 15: SDS-PAGE preparátů lidských protilátek H79 a HD70. Na 12,5% denaturujícím polyakrylamidovém gelu v neredukčních (gel 1) a redukujících (gel 2) podmínkách se pouštělo 10 pg H79 a 3,5 pg HD70 a obarvily se Coomassie modří.

Gel 1:

Dráha 1: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu)

Dráha 2: varianta H79 lidského IgGl (neredukční)

Dráha 3: varianta HD70 lidského IgGl (neredukční)

Gel 2:

Dráha 4: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu)

Dráha 5: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkách

Dráha 6: varianta HD70 lidského IgGl v redukčních podmínkách

Obrázek 16: Analýza průtokovou cytometrií buněk Kato pozitivních na 17-1A pro testování vazebné aktivity purifikovaného H79 lidského IgGl, • c

•. · ...

·'» ·'9 • <

jakož i purifikovaného H79 myšího IgGl. Buňky Kato se inkubovaly s IgG izotypovými kontrolami (10 Mg/ml lidského IgGl a myšího IgGl), pozitivními kontrolami (M79 a chimerizovaná M74 v 10 Mg/ml, obě 17-1A specifické) a s H79 lidským IgGl nebo H79 myším IgGl (každý 10 Mg/ml a 1 Mg/ml). Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.

Obrázek 17: Analýza průtokovou cytometrií protilátek (každá v koncentraci 20 Mg/ml) na buňkách Kato pozitivních na 17-1 A, na buňkách CHO transfekovaných a netransfekovaných s 17-1 A, pro testování vazebné aktivity purifikovaných protilátek H79 lidského IgGl, H79 myšího IgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex a izotypových kontrol (lidský IgGl, myší IgGl a 2a). I) H79 lidský IgGl (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, II) H79 myší IgGl (plná čára) a myší IgG 1 izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, III) HD70 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, IV) D7.2 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, V) M79 (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, Ví) Panorex (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, VII) H79 lidský IgGl (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, VIII) H79 myší IgGl (plná čára) a myší IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, IX) HD70 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, X) D7.2 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, XI) M79 (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, XII) Panorex (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A. Obrázky VII-XII také ukazují výsledky inkubace * · · · · ····......ζ ....-...··'.· · .· · ΣΖ . · · · • · 1 .»······ • · * . , · · a detekce relevantních protilátek na netransfekovaných buňkách CHO (tečkovaná čára).

Obrázek 18: Test buněčné toxicity závislé na protilátce značené ^5lCr. Pro měření uvolňování ⁵¹Cr se inkubovaly nestimulované lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMC, 5 x 10⁵ buněk) jako efektorové buňky⁷ se značenými cílovými buňkami (buňky Kato značené 2 hodiny s ⁵¹Cr) a protilátkami v různých koncentracích 4 nebo 20 hodin při 37 °C. Jako negativní kontroly (H79=H79hulgGl) byly použity odpovídající nevázající izotypy (h-lgG = lidský IgGl, m-IgG2a = myší IgG2a). Specifická lýze se vypočítávala jako ((cpm, uvolňování během pokusu) - (cpm, spontánní uvolňování))/((cpm, maximální uvolňování) (cpm, spontánní uvolňování)), (cpm ~ counts per minuté = impulsy za minutu).

Obrázek 19: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené M79 (pozitivní kontrola). Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s myší M79 protilátkou (IgG2a) jako pozitivní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou speroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 20: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené H79 myším IgGl. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm tkáně normální sliznice se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). Detekce navázaných myších IgGl protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

«»' ····*

Obrázek 21: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného M79 (pozitivní kontrola). Zmražené ř&zy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s myší M79 protilátkou (IgG2a) jako pozitivní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 22: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného H79 myším IgGl. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). Detekce navázaných myších IgGl protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 23: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené myší izotypovou IgG2a kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s irelevantní myší ígG2a protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 24: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené izotypovou IgGl kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s irelevantní myší IgGl protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

« *

Λ·*·

Obrázek 25: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného myší izotypovou IgG2a kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně z karcinomu tračníku se inkubovaly s irelevantní myší IgG2a protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 26: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného izotypovou IgGl kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s irelevantní myší IgGl protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální antí-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).

Obrázek 27: Analýza epitopů myší protilátky M79 a lidských protilátek H79 a HD70, každá z nich je specifická pro lidský antigen 17-1 A. Protilátky se inkubovaly s mřížkou uspořádaných peptidů obsahující 119 polypeptidů ze 13 aminokyselin, vždy posunutých o dvě aminokyseliny a pokrývajících celou extracelulární aminokyselinovou sekvenci lidského antigenů 17-1 A. Peptidy byly kovalentně připojeny svými C-koncovými částmi na membránu Pep Spots (Jerini Biotools, Berlin) jako. jednotlivé body. Navázaná myší M79 protilátka byla přímo detekována na membráně Pep Spots antí-myší imunoglobulinovou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP), po které následovala detekce chemiluminiscencí. Signály, které jsou způsobeny dík}· reaktivitě sekundární protilátky samotné s jednotlivými peptidovými body, jsou ukázány na odpovídajícím kontrolním značení membrány Pep Spots. Po subtrakci základního pozadí se ukázalo, že značení v peptidovém bodě 87, peptidových bodech 38 a 95 představuje specifickou vazbu myší protilátky ♦·« ·· · ♦

··»

M79. Kvůli vysokému stupni zkřížené reaktivity sekundární anti-lidské imunoglobulinové protilátky konjugované s HRP s několika peptidovými body, byly navázané lidské protilátky H79 a HD70 přeneseny z membrány Pep Spots na blotovací membránu pomocí elektropřenosu a následně detekovány uvedenou anti-lidskou sekundární protilátkou a chemiluminiscencí. Specifická vazba lidské protilátky H79 byla detekována hlavně v peptidových bodech 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 a 79, ale v případě lidské protilátky HD70 nebyla detekována žádná vazba.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Konstrukce kombinačních protilátkových knihoven a fágová expozice

Knihovna DNA fragmentů Fd lehkého řetězce lidského imunoglobulinu (Ig) a Ig těžkého řetězce byla konstruována pomocí metody RT-PCR, se sadami primerů specifických pro řetězce kappa, lambda a Fd delta, z celkové RNA izolované z lymfocytů periferní krve (PBL) a vzorků kostní dřeně ze čtyř a deseti lidských dárců, podle Chomczynského (Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987). Podle standardních metod byla syntetizována cDNA (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 2. vydání).

Byly vybrány následující sady primerů, které dávají vzniknout rozpoznávacím místům pro 5'- Xhol a 3'- Spěl na fragmentech těžkého řetězce a rozpoznávacím místům pro 5’- Sací a 3'- Xbal pro lehké řetězce:

Pro amplifikaci metodou PCR cDNA fragmentů Fd delta se pět různých specifických primerů pro 5'-VH-rodinu kombinovalo s jedním primerem pro 3’-CHl delta, pro amplifikaci PCR fragmentů kappa (K) lehkého řetězce se pět různých specifických primerů pro 5'-VK-rodinu kombinovalo s jedním primerem 3'-CK a pro amplifikaci fragmentů ., _ ..* ....

• · » · · ’ ··« ♦·· ·«*· lambda (L) lehkého řetězce se pět různých specifických primerů pro 5'-VLrodinu kombinovalo s jedním primerem 3' -CL.

Sady primerů pro amplifikaci DNA fragmentů Fab (5’ až 3’) jsou uvedeny v tabulce 1.

Pro amplifikaci byl použit následující program PCR:

Denaturace v 94 °C 15 s, nasedání primerů v 52 °C s a prodloužení v 72 °C 90 s, 40 cyklů, po kterých následovalo konečné prodloužení v 72 °C 10 minut.

Tabulka 1: Sady primerů

Fd fragment těžkého řetězce:

5’ primer:

VH 1,3,5,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG VH2: CAG(AG)TCACCTTGCTCGAGTCTGG VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG VH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG VH6: CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG 3' primer:

CD1: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGAT

Fragment řetězce kappa:

5' primer:

VK1: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG(AT)TGAC(AG)CAGTCTCC VK2/4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC(CT)CAGTCTCC VK5: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC VK6: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC ·

.·♦

4 4

4 «

4

4 ·♦·· ·· 4<

3' primer:

CK1D:GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACG

GGCGAACTCAG

Fragment řetězce lambda:

5' primer:

VL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC

VL2: TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG

VL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG

VL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG

VL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC

VL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC

VL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC

VL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC

3' primer:

CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG

450 ng fragmentů lehkého řetězce kappa (štěpených se Sací a Xbal) se ligovalo se 1400 ng fagemidu pComb3H (štěpeného se Sací a Xbal, velký DNA fragment) odvozeného z pComb (Barbas, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 7978-7982, 1991), kde pozice těžkého řetězce již byla obsazena fragmentem Fd chimerizované myší protilátky M79 (obsahující CH1 lidského IgGl) namířenému proti extracelulární části proteinu 17-1A (viz obr. 1 pro klonovací místa pComb3H).

Výsledná kombinační protilátková DNA knihovna pak byla elektroporací transformována do 300 μΐ elektrokompetentních Escherichia coli XL1 Blue (2,5 kV, kyveta s roztečí elektrod 0,2 cm, 25 FD, 200 Ohm,

9* ♦ 9 » 9 9 «

I 9 9 ¹

99« ··<

ř9 9999

9·9· ** na přístroji Bíorad Gene-Pulser), čímž vznikla knihovna o velikosti 4 x 10⁷ nezávislých klonů. Po jedné hodině fenotypové exprese se vybíraly pozitivní transformanty podle rezistence na karbenicilin kódované vektorem pComb. Po adaptaci byly tyto klony infikovány infekční dávkou 1 x 10¹² fágových částic pomocného fága VCSM13, což mělo za následek produkci a sekreci vláknitých fágů Ml3, z nichž každý obsahoval jednovláknovou pComb3H DNA kódující jeden lidský lehký řetězce a Fd segment chimérického M79 a exponoval na svém povrchu odpovídající Fab fragment jako translaění fúzi neinfekční části obalového proteinu III fága (technika fágové expozice, phage display), viz obr. 2.

Tato fágová knihovna nesoucí klonovaný Fah repertoár se sklidila z tkáňového supernatantu pomocí precípitace s PEG8000/NaCl a stočením, resuspendovala se v TBS/1% BSA a inkubovala se s rekombinantním s 17-1A mobilizovaným na 96 jamkových destičkách pro test ELISA. sl7-lA byl připraven, jak je popsáno (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995). Fab fágy, které se nenavázaly specificky na cílový antigen, se odstranily až deseti promývacími kroky sTBS/0,5% Tween. Ty, co se navázaly, byly eluovány s použitím HCl-glycinu, pH 2,2, a po neutralizaci eluátu s 2 M Tris, pH 12, se použily k infekci kultury nových neinfikovaných E. coli XL1 Blue. Buňky úspěšně transdukované kopií fagemida pComb, kódující Fab fragment vázající antigen, byly opět vybírány podle rezistence na karbenicilin a pak infikovány pomocným fágem VCSM13, aby se začalo druhé kolo expozice protilátek a in vitro selekce.

Po pěti kolech produkce a selekce Fab fágů vázajících antigen byla izolována plazmidová DNA obsahující vybraný Fab repertoár.

Pro produkci rozpustných Fab proteinů byl z plazmidů vyňat DNA fragment genu III, a tak se zrušila translační fúze Fd segmentu těžkého řetězce s proteinem genu III. Po opětné ligaci se tato skupina plazmidové DNA transformovala do 100 μΐ E. coli XL1 Blue, které byly učiněny kompetentními tepelným šokem, a byly vysety na LB agar s karbenicilinem (Carb). Jednotlivé kolonie se pěstovaly v 10 ml kulturách LB-Carb /20 mM <« « ·». - *· » ·· · » · ♦ · ·«· *♦· • * • · · ·

MgCla a exprese Fab se indukovala po šesti hodinách přidáním isopropylβ-D-thiogalaktosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Tato in vitro selekce, jakož i exprese rozpustných fragmentů Fab, se prováděla podle Burtona (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10134-10137, 1991). Buňky- se sklízely po 20 hodinách, periplazmatické izolace se prováděly čtyřmi koly zmražení (etanol/suchý led) a rozmražení (37 °C) a testovaly se pomocí testu ELISA na přítomnost Fab fragmentů vázajících se ksl7-lA. Vazebnou aktivitu vykázalo 23 klonů z 27. Po sekvencování se ukázalo, že dva klony s nej silnějším signálem (viz obr. 3) mají totožné řetězce kappa a byly nazvány k8, viz obr. 6.

Tento lidský lehký řetězec kappa k8 byl nyní použit jako vazebný partner pro skupinu těžkého řetězce lidského Ig delta, 2250 ng DNA Fd fragmentů lidského těžkého řetězce delta (štěpených s Xhol a Spěl) se ligovalo se 7000 ng fagemidového vektoru pComb3H (štěpeného s Xhol a Spěl, velký DNA fragment) obsahujícího DNA fragment k8 v pozici lehkého řetězce.

Výběr repertoáru lidského řetězce delta jako zdroje pro variabilní oblasti těžkého řetězce, které se specifický⁷ vážou na antigen 17-1 A, jsou-li spojeny s lehkým řetězcem k8, se jevilo jako nejvhodnější. Řetězce delta jsou produkovány pouze ve zralých naivních a pro autoantigen specifických anergních B buňkách, které ještě nepodstoupily proliferaci nebo proliferovat nebudou, proto je diverzita jejich repertoáru těžkých řetězců vyšší a výskyt jedné každé specifity ve srovnání s repertoárem těžkých řetězců jiných imunoglobulinových izotypů je nižší.

Transformace knihovny Fd fragmentů pComb-k8-delta do celkem 1500 μΐ E. coli XL1 Blue pěti stejnými elektroporacemi (2,5 kV, 0,2 cm kyveta, 25 FD, 200 Ohm) vedla ke konečnému počtu 1,1 x 10⁹ nezávislých klonů.

In vitro selekce této kombinační protilátkové knihovny se prováděla, jak je popsáno výše pro repertoár lidských lehkých řetězců. Po čtyřech kolech „rýžování“ byly z osmi klonů připraveny rozpustné Fab fragmenty.

·· ··*·

Periplazmatické preparáty se testovaly ELISA. Jeden z klonů vykázal silnou vazbu antigenu (viz. Pbr. 4). Tento klon byl nazván D4.5 a DNA Fd delta fragmentu se sekvencovala s reverzním primerem specifickým pro delta CH1 (viz obr. 7).

Další Fab fragment vázající s 17-1A se izoloval po dalších kolech „rýžování“, poprvé se objevil v sedmém kole s výrazně slabším signálem v testu ELISA ve srovnání s D4.5 (viz obr. 4). Klon byl označen D7.2 a opět se určila sekvence DNA s použitím primeru specifického pro delta (viz obr. 8).

Aby se identifikovaly další partneři lehkých řetězců, kteří se spojují s Fd segmentem těžkého řetězce delta za vzniku Fab fragmentu specifického pro 17-1 A, prováděl se pokus s přestavbou (reshuffling):

450 ng fragmentů lidského lehkého řetězce kappa a 450 ng fragmentů lidského lehkého řetězce lambda (oba štěpené se Sací a Xbal) se zvlášť ligovaly se 1400 ng fagemidu pComb3H (štěpeného se Sací a Xbal, velký DNA fragment), kde pozice těžkého řetězce již byla obsazena D4.5 Fd fragmentem.

Každá z výsledných kombinačních protilátkových knihoven (kappa a lambda) pak byla elektroporací transformována do 300 μΐ elektrokompetentních Escherichia coli XL1 Blue (2,5 kV, 0,2 cm kyveta, 25 FD, 200 Ohm, na přístroji Bíorad gene-pulser), což mělo za následek knihovnu o velikosti 0,5 x 10⁷ nezávislých klonů pro knihovnu kappa al,4x 10⁷ nezávislých klonů pro knihovnu lambda. Po jedné hodině fenotypové exprese se vybíraly pozitivní transformanty podle rezistence na karbenicilin kódované vektorem pComb. Po adaptaci byly tyto klony infikovány infekční dávkou 1 x 10¹² fágových částic pomocného fága VCSM13, což mělo za následek produkci a sekreci vláknitých fágů Ml3, z nichž každý obsahoval jednovláknovou pComb3H DNA kódující jeden lidský lehký řetězce a D4.5 Fd segment těžkého řetězce a exponoval na svém povrchu odpovídající Fab fragment jako translační fúzi neinfekční části obalového proteinu III fága.

• · ····

Obě fágové knihovny nesoucí klonované Fab repertoáry (kappa a lambda) se sklidily z tkáňového supernatantu pomocí precipitace s PEG8000/NaCl a stočením, resuspendovala se v TBS/1% BSA a inkubovala se s rekombinantním s 17-1A imobilizovaným na 96jamkových destičkách pro test ELISA. Fab fágy, které se nenavázaly specificky na cílový⁷ antigen, se odstranily až deseti promývacími kroky s TBS/0,5% Tween. Ty, co se navázaly, z obou knihoven(kappa a lambda), byly eluovány s použitím HCl-glycinu, pH 2,2, a po neutralizaci eluátu s 2M Tris, pH 12, se použily k infekci kultur nových neínfikováných E. coli XL1 Blue, jedna kultura pro knihovnu kappa a druhá pro knihovnu lambda. Buňky úspěšně transdukované kopií fagemida pComb, kódující Fab fragment vázající antigen, byly opět vybírány podle rezistence na karbenicilin a pak infikovány pomocným fágem VCSM13, aby se začalo druhé kolo expozice protilátek a in vitro selekce.

Po pěti kolech produkce a selekce Fab fágů vázajících antigen se izolovala plazmidová DNA obsahující vybraný Fab repertoár z každého kola „rýžování“.

Pro produkci rozpustných Fab proteinů byl z plazmidů vyňat DNA fragment genu III, a tak se zrušila translační fúze Fd segmentu těžkého řetězce s proteinem genu III. Po opětné ligaci se tato skupina plazmidové DNA transformovala do 100 μΐ E. coli XL1 Blue, které byly učiněny kompetentními tepelným šokem, a byly vysety na LB agar s karbenicilinem (Carb). Jednotlivé kolonie se pěstovaly v 10 ml kulturách LB-Carb /20 mM MgCL a exprese Fab se indukovala po šesti hodinách přidáním isopropylβ-D-thiogalaktosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Buňky se sklízely po 20 hodinách, periplazmatické izolace se prováděly zmražením a rozmražením a testovaly se pomocí testu ELISA na přítomnost Fab fragmentů vázajících se k sl7-lA.

Celkově se testovalo 45 klonů z knihovny kappa a 45 klonů z knihovny lambda pocházejících hlavně z pátého kola „rýžování“, ale do menší míry také z jiných kol, na vazbu antigenu 17-1A. Pouze jeden klon označený k5.1 (knihovna kappa), který⁷ se objevil v 5. Kole, vykazoval

9 9

9 9

9 *

999

9 ·

♦ 9

9

vazebnou aktivitu (viz obr. 5). Určila se sekvence DNA V-oblasti kappa 1<5.1 (viz obr. 9).

Příklad 2

Bakteriální exprese v E. coli XL1 Blue

Jak bylo již dříve uvedeno v příkladu 1, E. coli XL1 Blue transformované s pComb3H obsahující jeden lehký' řetězec a Fd segment jednoho těžkého řetězce produkují po vynětí fragmentu genu III a indukci s IPTG rozpustnou Fab v dostatečném množství. Fd segment těžkého řetězce a lehký řetězec jsou přesunovány do periplazmy, kde se spojují a tvoří funkční Fab fragmenty.

Pro lepší periplazmatické preparáty se buňky pěstovaly v médiu SB doplněném o 20 mM MgCU a po sklizení se resuspendovaly v BS. Čtyřmi koly zmrazování v -70 °C a rozmrazování v 37 °C se tepelným šokem porušila vnější membrána bakterií a rozpustné periplazmatické proteiny obsahující Fab fragmenty byly uvolněny do supernatantu. Po odstranění neporušených buněk a buněčného detritu stočením se odebraly supernatanty obsahující protilátkové Fab fragmenty a použily se pro další práci.

Nejdříve se testovaly periplazmatické preparáty k8-D4.5-Fab a l<5.1-D4.5-Fab na vazbu k imobilizovanému antigenů sl7-lA, oba vykázaly silné ELISA signály (viz příklad 1).

Detekce k8-D4.5- a k5.1-D4.5-Fab fragmentů navázaných k imobilizovanému antigenů s 17-1A se prováděla s použitím polyklonální biotinylované protilátky proti lidskému lehkému řetězci kappa (1 pg/ml PBS) detekované avídinem s konjugovanou křenovou peroxidázou (1 pg/ml PBS). Signál se vyvolal přidáním substrátového roztoku obsahujícího 2,2' azino-bis(3-etylbenz-thiazolin-6-sulfonovou kyselinu) a peroxoboritan sodný s detekoval se ve vlnové délce 405 nm.

• · ► * .··♦ • · · »♦· ♦♦· • *

Μ ··

9·+· ·*

Test vazby dvou 17-1A pozitivních lidských Fab fragmentů (k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab) na buňky Kato (buněčná linie karcinomu žaludku exprimující 17-1 A), buňky CHO transfekované 17-1A (CHO/17-1 A) a netransfekované buňky CHO, se opět prováděl na periplazmatických preparátech. Transfekované buněčné linie CHO se tvořily subklonováním DNA fragmentu kódujícího úplnou aminokyselinovou sekvenci antigenu 17-1 A, známého také jako GA733-2 (Szala, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3542-3546, 1990), do eukaryotického expresního vektoru pEF-DHFR (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995) podle standardních postupů (Sambrook, Molecular Cloníng, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Výsledný plazmid se linearizoval s Ndel a transfekoval do DHFR deficitních CHO buněk pro trvalou expresi. Exprese transmembránového 17-1A se zvýšila postupnou genovou amplifikací vyvolanou postoupným přidáváním stoupajících koncentrací inhibitoru DHFR metotrexátu (MTX) do konečné koncentrace 500 nM, rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi byly 20 nM a 100 nM (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566, 1990).

200 000 buněk (buněk Kato, CHO/17-1A nebo CHO) se inkubovalo s jedním z periplazmatických preparátů obsahujících relevantní nebo irelevantní Fab, po které následovala biotinylovaná polyklonální anti-lidská protilátka lehkého řetězce kappa (20 pg/ml PBS) a streptavidin konjugovaný s FITC. Značené buňky se pak analyzovaly průtokovou cytometrií.

Periplazmatické preparáty obsahující k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab vykazovaly zřetelné signály ve srovnání s irelevantním periplazmatickým preparátem (negativní kontrola), ale netransfekované CHO buňky značeny nebyly, což dokazovalo specifičnost na antigen 17-1 A. Jako pozitivní kontrola pro buňky 17-1A pozitivní byla použita protilátka anti-17-ΙΑ M79 (Góttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986) a myší ígG2a protilátka jako izotypová kontrola (viz obr. 10 a 11).

Příklad 3

Eukaryotická exprese v buňkách CHO

Bakterie obvykle nejsou schopné produkovat kompletní funkční imunoglobuliny, ačkoliv exprimují funkční Fab fragmenty.

Pro produkci kompletních funkčních protilátek se musí použít savčí buňky, a proto byly lehký řetězec k8 a variabilní doména těžkého řetězce D4.5 subklonovány do savčích expresních vektorů.

a) Lehké řetězce (k8 a k5.1):

Aby vznikla vhodná koncová restrikení místa, byly DNA fragmenty k8 a k5.1 znovu amplifikovány pomocí PCR, čímž vznikly fragmenty kappa s místem Bsu36I na 5' konci, a také místa Sáli a Notl na 3' konci.

Tyto fragmenty (1<8 a k5.1) byly subklonovány do plazmidu BSPOLL pomocí Bsu36I a Notl, tak se přidaly savčí vedoucí sekvence, a pak byly sekvencovány, aby se zabránilo mutacím vyvolaným PCR.

S použitím EcoRl a Sáli, k8 a k5.1 byly vyňaty z BSPOLL a subklonovány do eukaiyotického expresního vektoru pEF-ADA (viz obr. 12) odvozeného z expresního vektoru pEF-DHFR (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995) nahrazením cDNA kódující myší dihydrofolátreduktázu (DHFR) cDNA kódující myší adenosindeaminázu (ADA).

Pro každý druh lehkého řetězce (k8 a k5.1) bylo 10⁷ buněk CHO transfekováno se 100 pg linearízované plazmídové DNA-a pak pěstováno v podmínkách vybraných dle aktivity adenosindeaminázy (ADA) kódované expresním vektorem.

Přežívající ADA pozitivní buňky se pěstovaly pro další transfekci s těžkými řetězci nesoucími variabilní doménu D4:5 nebo D7.2.

·· ·*.

• · ? :

*·«·

b) Variabilní doména 4.5 těžkého řetězce:

Z Fd fragmentu D4.5 delta se opět amplifikovala variabilní oblast pomocí PCR za vzniku restrikčních míst Bsu36I na obou koncích.

Výsledný DNA fragment V-D4.5 byl pak subklonován s použitím stejných restrikčních míst do eukaryotického expresního vektoru pEFDHFR již obsahujícího eukaryotickou vedoucí sekvenci, jakož i DNA fragment kódující konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl (viz obr. 13). Variabilní oblast D4.5 těžkého řetězce tak byla vložena mezi vedoucí sekvenci a konstantní oblast těžkého řetězce.

Variabilní oblast se sekvencovala a kompletní klon byl označen H79V-D4.5 hu IgGl.

Pro pozdější značení tkání byla konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl nahrazena konstantní oblastí těžkého řetězce myšího IgGl s použitím Xbal pro subklonování. Tento plazmid byl označen H79V-D4.5 MIgGI.

Každá z obou variant D4.5 těžkého řetězce, lidský a myší IgGl, byla transfekována do 10⁷ CHO buněk, které již exprimovaly lehký řetězec k8. Varianta lidského IgGl byla také transfekována do buněk CHO exprimujících lehký řetězec k5.1. Pro transfekci těžkého řetězce bylo použito 100 pg linearizované plazmídové DNA.

Variabilní oblast Fd fragmentu D7.2 těžkého řetězce byla také subklonována do pEF-DHFR za vzniku plazmidu exprimujícího těžký řetězec lidského IgGl, jak je popsáno pro VD4.5. tento expresní plazmid byl pak transfekován do buněk CHO, které již exprimovaly lehký řetězec k8, jak je popsáno výše pro H79V-D4.5 hu IgGl.

Transfekované buňky byly podrobeny selekci dle aktivity ADA a DHFR, jak bylo popsáno (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566,

1990).

Výsledné buněčné linie byly označeny H79-huIgGl (VD4.5huIgGlk8), H79-MIgGl (VD4.5MIgGl-kS), D7.2 (VD7.2huIgGl-k8) a HD70 (VD4.5huIgGl-k5.1).

* · ,· ··*♦ » · · • ·

Supernatanty ze čtyř různých konfluentnich 30 ml tkáňových kultur starých tři dny, z nichž každá produkovala jednu ze čtyř anti-17-ΙΑprotilátek (H79-huIgGl, H79-MIgGl, D7.2 a HD70), se testovaly pomocí ELISA na vazbu k imobilizovanému s 17-1 A. Kromě D7.2, která vykazovala v testu ELISA slabý signál, tři ostatní protilátky prokázaly silné signály, o nichž se usoudilo, že představují vazebnou afinitu v rozsahu myší protilátky M79.

Produkce protilátek ve velkém měřítku se prováděla v rotačních lahvích s použitím 500 ml média.

Protilátky H79-huIgGl, D7.2 a HD70 se purifikovaly s použitím afinitní kolony proteinu A. Protilátka H79-MIgGl se purifikovala pomocí afinitní chromatografie s anti-myším IgG.

Čistota a molekulová hmotnost rekombinantních protilátek se určovala pomocí SDS-PAGE v redukčních a neredukčních podmínkách (obr. 14 a 15).

Purifikace proteinů a SDS-PAGE se prováděly podle standardních postupů.

Příklad 4

Funkční analýza protilátek H79 a HD70

IV. 1. Test na imobilizovaném antigenů

Supematant z koníluentní 30 ml tkáňové kultury transfektant lidského a myšího IgGl staré tři dny, jakož i odpovídající preparáty purifikované protilátky, se testovaly na vazbu na imobilizovaný s 17-1A pomocí ELISA a srovnávaly se s myší M79 anti-17-ΙΑ protilátkou.

Detekce se prováděla, jak je popsáno ve II.

Ukázalo se, že protilátky H79 (varianty huIgGl a MIgGI) a HD70 mají velmi podobné vazebné afinity v rozsahu myší M79.

··· »·«

IV.2. Určení afinit

Měření povrchovou plazmonovou rezonancí se provádělo za použití zařízení BIACORE 2000 (Biacore AB, Freiburg, Německo). Imobilizace rekombinantního rozpustného antigenu 17-1A v každé průtokové komůrce a analýza interakce se prováděly automatickým způsobem v BIACORE 2000. Antigen se kovalentně navázal k senzorovému čipu CM5 prostřednictvím primárních aminových skupin. Po aktivaci karboxylované dextranové matrix senzorového čipu CM5 jednou injekcí 80 μΐ 0.1 Μ Nhydroxysukcinimidu/0,4 M N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidu (NHS/EDC9) do všech čtyřech průtokových komůrek, byly průtokové komůrky 1, 2, 3 a 4 postupně zapojeny do průtokové dráhy v průběhu vtřikování antigenu s 17-1A (60 pg/ml v 10 mM acetátu sodném, pH 4,7). Různé kontaktní časy 17-1A s aktivovaným povrchem vedly k přibližně 2500 jednotkám odpovědi (RU) (9 RU v průtokové komůrce 1, 1400 RU v průtokové komůrce 2, 780 RU v průtokové komůrce 3 a 290 RU v průtokové komůrce 4). Přebytek aktivovaných esterů se blokoval injekcí 85 μΐ 1 M etanolaminu pH 5 do všech čtyřech průtokových komůrek. Vazebné pokusy se prováděly v 25 °C v pufru pH 7,4 obsahujícím 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA a 0,005% surfaktant P20. Vazebná kinetika protilátek k imobilizovanému rekombinantnímu 17-1A se určovala injikováním koncentrací protilátek v rozmezí od 0,5 do 2 μΜ. Senzorový čip se regeneroval mezi každým během 100 mM glycinem, 500 mM NaCl, 0,005% Tweenem pH 3. Asociační a disocíační rychlostní konstanty, K_on a Koff se analyzovaly s použitím vyhodnocovacího programu BIA od Biacore AB, jak popsáno (Karlsson, J. Immunol. Meth., 145, 229-240, 1991).

Prováděly se dvě sady afinitních determinant (1. sada: M79, H79, D7.2, Panorex, 2. sada: Panorex, HD70), myší Panorex byl také zahrnut do

2. sady jako vnitřní reference.

·♦·· » * · · • · · !

··· • · • · · *

Ukázalo se, že Kd D7.2 je pod minimální detekční hodnotou ΙΟ ⁴ M a není proto ukázána v tabulce 2.

Tabulka 2

Rychlosti Kd, K_on a K_Off lidských a relevantních myších protilátek 17-1A

Protilátka	Kon (M^s-1)	Koff	KD (M)
1. sada
myší M79	6,0 x 104	4,5 x ΙΟ-2	7,5 x 107
lidská H79	2,1 x 104	7,2 x 10-3	3,4 x 10-7
myší Panorex	1,1 x 105	2,2 x ÍO-2	2,0 x 10-7
2. sada
lidská HD70	0,9 x 105	3,5 x ΙΟ'2	3,9 x 10-7
myší Panorex	1,0 x 105	2,7 x ΙΟ-2	2,7 x 10-7

IV.3. Průtoková cytometrie eukaryotických buněk exprimujících 17-1A

Purifikované protilátkové preparáty H79 (varianta lidského a myšího IgGl), HD70 (lidský IgGl) a D7.2 (lidský IgGl) se testovaly analýzou FACS na buňkách Kato exprimujících 17-1 A, buňkách CHO transfekovaných 17-1A a netransfekovaných buňkách CHO.

x 10⁵ buněk se inkubovalo s purifikovanými protilátkami H79huIgGl, H79-MIgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch (= lidský CHIgGl lidské C kappa varianty myší anti-17-ΙΑ protilátky M74 (Góttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986)), myší IgG2a, myší IgGl nebo lidský IgGl (20 pg/ml každé protilátky). Detekce protilátek navázaných na buňky se

ΦΦ·* • φ • · φ

φ φ · φφφφ

....-Φ.Φ.. ** : *. ’· · • ··· ··:

• Φ ·· prováděla s protilátkami (každá 20 pg/ml) protí-myším IgG nebo protilidským IgG značenými FITC. Inkubace se prováděla 45-60 minut na ledu.

H79 lidský IgGl, H79 myší IgGl a HD70 vykázaly jasnou vazbu na 17-1A pozitivní buňky, jakož i M79 a Panorex. D7.2 ukázal slabou, ale významnou vazbu na 17-1A pozitivní buňky. Žádná protilátka se nenavázala na netransfekované buňky CHO a IgG kontroly byly negativní na buňkách Kato, buňkách CHO/17-1A a netransfekovaných buňkách CHO (viz obr. 16 a 17).

IV.4. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (uvolňování ⁵¹Cr)

Pro uvolňování ⁵¹Cr byly jako efektorové buňky izolovány mononukleární buňky lidské periferní krve (PBMC) zdravých dárců z čerstvě připravené vrstvy sražených buněk. PBMC se oddělily stočením na hustotním gradientu Ficollu s následným stočením ve 100 x g. Nestimulované PBMC (5 χ 10⁵ buněk) se přidaly do objemu 100 μΐ média RPMI 1640 s 10% FCS do každé jamky na mikrotitrační destičce s plochým dnem a inkubovaly přes noc v 37 °C. Cílové buňky se značily 2 hodiny s ⁵¹Cr. Značené cílové buňky (100 pl) a protilátky v různých koncentracích (50 pl) se přidaly k PBMC a inkubovaly 18 hodin v 37 °C. Odpovídající nevázající izotypy byly použity jako negativní kontroly. Specifická lýze se počítala jako ((cpm, uvolňování během pokusu) - (cpm, spontánní uvolňování))/((cpm, maximální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)), (cpm - counts per minuté = impulsy za minutu).

V tomto testu uvolňování ⁵¹Cr se prokázalo, že lidské anti-17-ΙΑ protilátky H79 a HD70 zprostředkovávají vysokou cytotoxicitu pro 17-1A pozitivní buněčnou linii Kato ze žaludečního karcinomu. Ukázalo se, že myší anti-17-ΙΑ protilátky M79 a Panorex zprostředkovávají usmrcování buněk na zřetelně nižší úrovni.

·♦ * ·· ·«·« • : .· .· . :

·♦·« ·· ·· ·· • · · · * · · ·«* ··· • * ·· ··

IV.5. Test na lidských tkáních

Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku a z tkáně normální sliznice tračníku se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 gg/ml). V tomto pokusu byla použita myší IgGl varianta protilátky H79, aby se zabránilo nespecifickému značení způsobenému přítomností lidského imunoglobulinu v lidské tkáni. Detekce navázané H79MIgGl se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem. Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem.

Výsledky se vyhodnocovaly světelným mikroskopem.

H79MIgGl a také myší monoklonální protilátka M79 (pozitivní kontrola) vykázaly silné značení v normální slizníci tračníku (M79, obr. 19, H79MIgGl, obr. 20) a slabší značení v buňkách karcinomu tračníku (M79, obr. 21, H79MIgGl, obr. 22). Na rozdíl od toho izotypové kontroly nevykázaly žádné značení v tkáních sliznice tračníku a karcinomu tračníku (M79, obr. 23 a 25 a H79MIgGl, obr. 24 a 26).

Příklad 5

Analýza epitopů H79 a HD70

Pro srovnání 17-1A epitopů rozpoznávaných lidskými protilátkami H79 a HD70 a myší templátovou protilátkou M79 byly syntetizovány 13-merní peptidy odvozené z aminokyselinové sekvence extracelulární části antigenu 17-1A jako jednotlivé body na membráně Pep Spots. Tyto peptidy pokrývají veškerou extracelulární aminokyselinovou sekvenci antigenu 17-1A (jak byla definován autorem Szala, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3542-3546, 1990) tak, že se překrývají v 11 aminokyselinách s každým sousedním peptidem, kdy první aminokyselina peptidu 1 je totožná s N-koncovou aminokyselinou antigenu 17-1A a poslední aminokyselina peptidu 119 je totožná s C-koncovou aminokyselinou extracelulární části antigenu 17-1A (tab. 3).

φφ • · • φ φ

♦ e·· ···· • · • φ φ < · 2 φφφ ··· φ ♦ φφ *«

Tabulka 3

Syntetizované peptidy (čísla odpovídají číslům peptidových bodů)

I. TATFAAAQEECVC

3. AAAQEECVCENYK

5. EECVCENYKLAVN

7. CENYKLAVNCFVN

9. KLAVNCFVNNNRQ

II. NCFVNNNRQCQCT 13. NNNRQCQCTSVGA

15. QCQCTSVGAQNTV

17. TSVGAQNTVICSK

19. AQNTVICSKLAAK

21. VICSKLAAKCLVM

23. KLAAKCLVMKAEM

25. KCLVMKAEMNGSK

27. MKAEMNGSKLGRR

29. MNGSKLGRRAKPE

31. KLGRRAKPEGALQ

33. RAKPEGALQNNDG

35. EGALQNNDGLYDP

37. QNNDGLYDPDCDE

39. GLYDPDCDESGLF

41. PDCDESGLFKAKQ

43. ESGLFKAKQCNGT

45. FKAKQCNGTSTCW

47. QCNGTSTCWCVNT

49. TSTCWCVNTAGVR

51. WCVNTAGVRRTDK

53. TAGVRRTDKDTEI

55. RRTDKDTEITCSE

57. KDTEITCSERVRT

59. ITCSERVRTYWII

61. ERVRTYWIIIELK

63. TYWIIIELKHKAR

65. IIELKHKAREKPY

67. KHKAREKPYDSKS

69. REKPYDSKSLRTA

71. YDSKSLRTALQKE

73. SLRTALQKEITTR

75. ALQKEITTRYQLD

77. EITTRYQLDPKFI

2. TFAAAQEECVCEN

4.AQEECVCENYKLA

6. CVCENYKLAVNCF

8. NYKLAVNCFVNNN

10. AVNCFVNNNRQCQ

12. FVNNNRQCQCTSV

14. NRQCQCTSVGAQN

16. QCTSVGAQNTVIC

18. VGAQNTVICSKLA

20. NTVICSKLAAKCL

22. CSKLAAKCLVMKA

24. AAKCLVMKAEMNG

26. LVMKAEMNGSKLG

28. AEMNGSKLGRRAK

30. GSKLGRRAKPEGA

32. GRRAKPEGALQNN

34. KPEGALQNNDGLY

36. ALQNNDGLYDPDC

38. NDGLYDPDCDESG

40. YDPDCDESGLFKA

42. CDESGLFKAKQCN

44. GLFKAKQCNGTST

46. AKQCNGTSTCWCV

48. NGTSTCWCVNTAG

50. TCWCVNTAGVRRT

52. VNTAGVRRTDKDT

54. GVRRTDKDTEITC

56. TDKDTEITCSERV

58. TEITCSERVRTYW

60. CSERVRTYWIIIE

62. VRTYWIIIELKHK

64. WIIIELKHKAREK

66.ELKHKAREKPYDS

68. KAREKPYDSKSLR

70. KPYDSKSLRTALQ

72. SKSLRTALQKEIT

74. RTALQKEITTRYQ

76. QKEITTRYQLDPK

78. TTRYQLDPKFITS • ·-·

79. RYQLDPKFiTSIL 81. DPKFITSILYENN

83. ITSILYENNVITI 85. LYENNVITIDLVQ 87. NVITIDLVQNSSQ 89. IDLVQNSSQKTQN 91. QNSSQKTQNDVDI 93. QKTQNDVDIADVA 95. NDVDIADVAYYFE 97. IADVAYYFEKDVK 99. AYYFEKDVKGESL 101. EKDVKGESLFHSK 103. KGESLFHSKKMDL 105. LFHSKKMDLTVNG 107. KKMDLTVNGEQLD 109. LTVNGEQLDLDPG

111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK

80. QLDPKFITSILYE 82. KFITSILYENNVI

84. SILYENNVITIDL 86. ENNVITIDLVQNS 88. ITIDLVQNSSQKT 90. LVQNSSQKTQNDV 92. SSQKTQNDVDIAD 94. TQNDVDIADVAYY 96. VDIADVAYYFEKD 98. DVAYYFEKDVKGE 100. YFEKDVKGESLFH 102. DVKGESLFHSKKM 104. ESLFHSKKMDLTV 106. HSKKMDLTVNGEQ 108. MDLTVNGEQLDLD 110. VNGEQLDLDPGQT 112. QLDLDPGQTLIYY 114. DPGQTLIYYVDEK 116. TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG

Membrána Pep Spots se syntetizovanými peptidy se třepala 10 minut v metanolu a pak se promývala třikrát po deseti minutách v pufru TBS pH 8. Pak se membrána blokovala jednu hodinu blokovacím roztokem na bázi kasetou, který obsahoval 0,05 g/ml sacharózy, a pak se znovu třepala v TBS pH 8/0,05% Tween 20 (TBS-T). Každá z protilátek 17-IA se inkubovala při teplotě místnosti spolu s membránou tri hodiny v blokovacím roztoku (1 pg protilátky/ml). Po třech promytích v TBS-T, každé deset minut, se spolu s membránou inkubovala dvě hodiny při teplotě místnosti sekundární protilátka (protí-myší/proti-lidská, 1 pg/ml blokovacího roztoku) konjugovaná s křenovou peroxidázou (HRP). Pak se membrána promývala třikrát deset minut v TBS-T. Detekce navázaných protilátek se prováděla v případě M79 přímo na membráně Pep Spots podle protokolu výrobce chemiluminiscenčního kitu (Boehringer). Vyvolané filmy jsou ukázány na obr. 27. Membrána se regenerovala po třech promytích

- 33 sTBS-T (10 minut) v roztoku obsahujícím 50 mM Tris-HCl pH 6,7, 100 mM 2-merkaptoetanol a 2% (w/v) SDS 30 minut v 50 °C a pak použila znovu pro mapování epitopu další protilátky.

Kvůli vysokému stupni nespecifické vazby proti-lidské ímunoglobulinové sekundární protilátky k polypeptidovým bodům na membráně, se v případě HD70 a H79 prováděl frakcíonovaný elektropřenos na druhou přenosovou membránu následovaný detekcí s proti-lidskou sekundární protilátkou podle Rúdigera (EMBO, 16, 1501-1507, 1997). Inkubace se sekundární protilátkou a detekce protilátky na membránách se prováděla, jak je popsáno výše. Vyvolané filmy jsou ukázány na obr. 27.

Jak je na tomto obrázku ukázáno (obr. 27), výsledky mapování epitopů založeného na peptidech naznačují, že epitop rozpoznávaný myší templátovou protilátkou M79, představovaný převážně peptidovými body 38 a 95, se pronikavě liší od epitopu rozpoznávaného lidskou protilátkou H79, představovanou převážně peptidovými body 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 a 79. Protože lidská protilátka HD70 vůbec neukázala detekovatelnou vazbu, může se dále předpokládat, že se její epitop také liší od epitopu myší protilátky M79 a že epitopy lidských protilátek H79 a HD70 také nejsou totožné.

Nepřítomnost detekovatelných vazebných signálů v případě lidské protilátky HD70 se může vysvětlit jejím možným rozpoznáváním buď konformačního, spojitého nebo nespojitého epitopu nebo epitopu částečně nebo úplně sestávajícího ze sacharidu, v každém případě lze těžko očekávat napodobení takových epitopů krátkými peptidy.

··· ··· • ·

Přehled sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleové kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleové kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleové kyselina (A) POPIS: /desc = „primer • ♦ • <· · · · · ······ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina • · · · · · ♦ 0 · · · • « ··· 0 0 0 • · · • 0 · · · · · (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 58 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • ·

I * » · • · · • · · (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC • 9 • 9 • · · · · · 99₉· • · 9 « 9999 • ♦ · · 9 9 999999 • · · 9 9 · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC • · • · • · · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu 1 5

Cys Val Cys Glu Asn 10 ·· · to · ··· ·· ··« to ···· · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 1 5

Leu Ala Val Asn 10 ·· ·· • · · • · · • · · · · · • · ·♦ ·· • «

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe 1.5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn 1 5 10 • 0 0000 • 0 · 00 00 «*·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr 1 5 10 • » ·· • 9 9 ·

9 9 · ·· · ··» «· *··· • · · ·· • · · • · · · • · · · ···· 0· ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn ¹ 5 10

44 • · 4 4

4 4 4

444 44»

4

44

4444 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys 1 5 10 • · · · • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM.40:

Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:

Asn Thr Val Ile 1

Cys Ser Lys Leu Ala 5

Ala Lys Cys Leu 10 ·· · · · · · · • ·· · ········ • · * · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:

Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:

Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:

Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met

10 • · · ·· · · · · * · • · · · · · · · • t « · a · ······ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:

Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:

Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:

Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly

5 10 • · · ·

9 9 9 9 999999

9 9 · ···· • 9 9 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:

Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:

Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:

Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:

Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:.13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:

Lys Leu Gly 1

Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:

Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:

Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:

Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:

Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp ^{1 5} 10

Pro • · · · ·· · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:

Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys ¹⁵ 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:

Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:

Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly ¹ 5 ₁₀ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:

Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA.: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin 15 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:

Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn ^{1 2 * * 5} 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:

Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Glv Thr 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:

Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 15 10 ·4· 444 • · • · 4 4 ·· 444 4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:

Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:

Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:

Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:

Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:

Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr ^{1 5} 10

99

9 9

9 9

999 999

9

99 •· 999 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:

Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:

Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:

Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile 15 10

00 > 0 0 ·

I 0 0 0

000 000

0

00

0000 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:

Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:

Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys Ser Glu ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:

Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys Ser Glu Arg Val ¹ 5 io ·· 9999

	74	99 9999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 9 9 9
2) INFORMACE	PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 78:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: peptid

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 78:

Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:

Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:

Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val· Arg Thr Tyr Trp Ile Ile 15 10 • 4 4 4

4 4 4 • 944 444

4

44 44

9444 •

• 4 *

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:

Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu 1 5 10 .

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:

Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:

Val Arg Thr Tyr 1

Trp Ile Ile Ile Glu 5

Leu Lys His Lys 10 • · · • · · · · ···· ·· ··· ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:’

Thr Tyr Trp lle lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:

Trp lle lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:

lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr

10 • ·· · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:

Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:

Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xí) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:

Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp 1 5

Ser Lys Ser Leu Arg 10 ·· · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:

Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:

Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:

Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu 15 10

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:

Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:

Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:

Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin

10 • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:

Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:

Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:

Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:

Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser 15 10 ' (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:

Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser lle Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:

Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser lle Leu Tyr Glu

5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:

Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:

Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:

Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:

Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:

Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:

Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser ¹ 5 10 ·· ···· • · · ·· ·· ···· • · · · · ♦ · · • · · · ········ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:

Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:

Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr ^{1 5} 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:

Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser 1 5

Gin Lys Thr Gin Asn 10 ♦· 99 9 9

99 9 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:

Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:

Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:

Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp 15 10 ·· 9999

999 9

9

9

99 99

9 -9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 » ······ • · · · ··· *·· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:

Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp 1 5

Ile Ala Asp Val Ala 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:

Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:

Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu

10 ··· · • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:

Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:

Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:

Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys 1 5

Asp Val Lys Gly Glu 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:

Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:

Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:

Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys 1 5 10 • · · · · · • · 9 • · • 9 9 • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:

Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:

Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125:

Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val ¹ 5 10 ··· 99 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:

Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly 1 5 IQ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:

His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:

Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp

10 • · · · · · β · · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:

Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:

Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:

Val Asn Gly Glu 1

Gin Leu Asp Leu Asp 5

Pro Gly Gin Thr 10 • · • ·

	• · · • · • » · • · · • · · · · ·
		92
2) INFORMACE	PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 132
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: peptid

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 132:

Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu lle ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 133:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 133:

Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu lle Tyr Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 134:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 134:

Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu 1 5 lle Tyr Tyr Val Asp 10 ·· ·· » · · · » 4 4 4

444 444 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 135:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 135:

Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys ^{1 5} 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 136:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 136:

Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 137:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 137:

Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe

10 • 0 •00 000 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 138:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 138:

lle Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 139:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 139:

Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 140:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 140:

Asp Glu Lys Ala 1

Pro Glu Phe Ser Met 5

Gin Gly Leu Lys 10 • * ··· · • ·9 · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 141:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..321 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 141:

GAG Glu 1

CTC Leu

CAG ATG

ACC CAG TCT CCA TCC TCC

CTG Leu

TCT Ser

GCT Ala

TCT Ser

GTG Val 15

GGA Gly

48

Gin

Met

Thr Gin 5

Ser

Pro Ser

Ser 10

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGT

CGG

ACA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

AGC

TAT

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

TTA

AAT

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCT

CCT

AAG

CTG

CTC

ATT

144

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

192

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

CAA

CCT

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

GAA

GAT

TCT

GCA

ACT

TAC

TAC

TGT

CAG

CAG

AGT

TAC

GAC

ATC

CCG

TAC

288

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Asp

Ile

Pro

Tyr

85

90

95

ACT

TTT

GGC

CAG

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

ATC

AAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 142:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · • · · · · · · ···· • · * · · · · · • « · · ··«····» • » · · · · * «··· ·· ··· ··· ·· ·· (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 142:

Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

Ser

Val 15

Gly

1

5

10

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Asp

Ile

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100 105 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 143:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 414	párů bázi
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	TYP VLÁKNA:	dvoj ité
(D)	TOPOLOGIE:	lineární

(ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..414 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 143:

GAG GTG CAG

CTG Leu

CTC GAG

TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT

GGG AGG

48

Glu Val

Gin 110

Leu

Glu

Ser

Gly 115

Gly

Gly

Val

Val

Gin 120

Pro

Gly

Arg

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

TTC

AGT

AGC

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

125 130 135 f · · · ·

GGC ATG CAC

TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG

144

Gly 140

Met

His

Trp

Val Arg Gin Ala 145

Pro

Gly

Lys 150

Gly

Leu

Glu

Trp

Val 155

GCA

GTT

ATA

TCA

TAT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Val

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

160

165

170

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

175

180

185

CTG

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCT

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

190

195

200

GCG

AAA

GAT

ATG

GGG

TGG

GGC

AGT

GGC

TGG

AGA

CCC

TAC

TAC

TAC

TAC

336

Ala

Lys

Asp

Met

Gly

Trp

Gly

Ser

Gly

Trp

Arg

Pro

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

205

210

215

GGT

ATG

GAC

GTC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCA

384

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

220

225

230

235

ccc

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

414

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

240 245 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 144:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 138 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 144:

Glu Val 1

Gin

Leu Leu 5

Glu Ser

Gly Gly Gly 10

Val Val Gin

Pro Gly Arg 15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser Tyr

20

25

30

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp Val

35

40

45

Ala

Val 50

lle

Ser

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

lle 70

Ser

Arg Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Lys

Asp

Met 100

Gly

Trp

Gly

Ser

Gly 105

Trp

Arg

Pro

Tyr

Tyr 110

Tyr

Tyr

Gly

Met

Asp 115

Val

Trp

Gly

Gin

Gly 120

Thr

Thr

Val

Thr

Val 125

Ser

Ser

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

130 135 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 145:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 372 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..372 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 145:

GAG GTG Glu Val

CAG CTG

CTC GAG

TCT GGG Ser Gly 145

GGA Gly

GTC GTG GTA CAG

CCT Pro

GGG GGG Gly Gly

48

Gin

Leu

Leu

Glu

Val Val Val 150

Gin

140

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

TTT

GAT

GAT

TAT

96

Ser 155

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys 160

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe 165

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr 170

GCC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Ala

Met

His

Trp

Val 175

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly 180

Lys

.Gly

Leu

Glu

Trp 185

Val

GCA

GTT

ATA

TCA

TAT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Val

lle

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

190 195 200 • · · · * ·

240

* 9 · · • · · 9

999 999

9

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

205

210

215

CTG

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCT

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

220

225

230

GCG

AAA

AAG

GAA

GGC

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

Ala

Lys

Lys

Glu

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

235

240

245

250

TCA

GCA

CCC

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

Ser

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

255 260

288

336

372 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 146:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 124 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 146:

Glu 1

Val

Gin

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Val 10

Val

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Val 50

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Lys

Lys

Glu 100

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin 105

Gly

Thr

Leu

Val

Thr 110

Val

Ser

Ser Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Leu 115 120 • · « · · ·

100

99 ·· · · · · · · *· · • * · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9

9999 99 999 999 99 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 147:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..321 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 147:

GAG Glu 125

CTC CAG ATG

ACC CAG TCT CCA

TCC Ser

TCC CTG Ser Leu 135

TCT Ser

GCA TCT

GTA GGA

48

Leu

Gin Met

Thr

Gin 130

Ser

Pro

Ala

Ser

Val

Gly 140

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

AGC

TAT

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

145

150

155

TTA

AAT

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCT

CCT

AAG

CTG

CTC

ATT

144

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

160

165

170

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGC

GGC

192

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

175

180

185

AGT

GAA

TCT

GGG

ACA

AAT

TAC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

CCT

240

Ser

Glu

Ser

Gly

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

190

195

200

GAA

GAT

TTT

GCT

ACT

TAC

TTT

TGT

CAA

CAG

TCT

GAC

AGT

TTG

CCG

ATC

288

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser

Asp

Ser

Leu

Pro

Ile

205

210

215

220

ACC

TTC

GGC

CAA

GGG

ACA

CGA

CTG

GAC

ATT

CAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Asp

Ile

Gin

225 230 »9 9999

9

9

9 • 99

9 99

9 9 9 • 9 9 9

999 999

9

9 99

101 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 148:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 148:

Glu

Leu

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Glu

Ser

Gly

Thr

Asn

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser

Asp

Ser

Leu

Pro

Ile

85

90

95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Asp Ile Gin

Claims (16)

1. Způsob přípravy anti-lidského antigenního receptorů, výhodně imunoglobulinu nebo jeho fragmentu, zvláště fragmentu Fv, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, vyznačující se t í m, že tento způsob obsahuje kroky, kde se vybere kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH pochází z lidských v podstatě nesenzibilizovaných zralých B lymfocytů a řetězec VL pochází z přirozeně se vyskytujícího repertoáru lidských B buněk, a přičemž oba řetězce jsou exprimovány z rekombinantního vektoru, a kde se použije in vitro detekční expoziční systém, zejména systém fágové expozice, na vazbu k lidskému antigenu, zvláště nádorovému antigenu, výhodně k lidskému antigenu 17-1 A.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň řetězec VH a případně i řetězec VL imunoglobulinu pochází z lidského repertoáru imunoglobulinu IgD.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že kombinace přestavěných řetězců je exprimována z jedné knihovny nebo z několika různých knihoven.

4. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že řetězec VH Obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím selekční krok obsahuje

I) navázání expozičního nosiče exprimujícího antigenní receptor ·· ·· • · « · • · · · • · · · » ·

103

a) na imobilizovaný cílový' antigen nebo jeho fragmenty

b) na volitelně značené buňky exprimující cílový antigen nebo jeho fragmenty,

c) na rozpustný, výhodně značený cílový' antigen nebo jeho fragmenty,

II) odmytí nespecificky'· navázaného expozičního nosiče (a a b) a následnou eluci specificky navázaného expozičního nosiče, nebo

III) pozitivní obohacení expozičního nosiče vázaného na cílový antigen (b a c) z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenze buněk exprimujících cílový antigen, tedy izolované expoziční nosiče včetně jejich antigenních receptorů se případně zmnoží replikací a pak se podrobí dalším cyklům in vitro selekce, jak jsou popsány v krocích I) až III).

6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se t í m, že před selekčním krokem buďto řetězec VH nebo řetězec VL je selektován na vazbu k antigenu společně s náhradním řetězcem V, zvláště myším řetězcem VH nebo VL.

7. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se t i m, že selekce vhodné kombinace zahrnuje

a) testování jednoho a téhož řetězce VH v kombinaci s řadou různých řetězců VL na vazbu k uvedenému lidskému antigenu, nebo

b) testování jednoho a téhož řetězce VL v kombinaci s řadou různých řetězců VH na vazbu k uvedenému lidskému antigenu.

8. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje kroky, kdy se získají, po selekci, lidské řetězce VH a VL nebo odpovídající nukleové kyseliny a tyto řetězce se fúzují se stejnými nebo jinými řetězci VH nebo

99 99

9 9 9 9

9 9 9 9

999 999 • · • · ··

99 9999

104 to ♦ 9

9 9

9 9

9 9 9

9999 99

9 9 9

99 9 9

VL, s imunoglobulinovými konstantními úseky těžkých (CH) nebo lehkých řetězců (CL), zvláště s konstantními úseky řetězců pocházejících z lidských IgGl nebo IgG3, nebo jejich částmi, nebo s řetězci odlišnými od imunoglobulinů, případně odpovídajícími nukleovými kyselinami, a/nebo způsob dále obsahuje kroky, kdy se získají, po selekci, lidské řetězce VH a VL, a kdy se tyto řetězce fyzicky spojí s farmaceutickými přípravky jinými než proteiny a/nebo jinými biologicky aktivními molekulami, přičemž řetězce VH a VL jsou exprimovány ze sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem RT-PCR amplifikace mRNA pocházející z v podstatě nesenzibilizovaných zralých lidských B lymfocytů.

9. Anti-lídský antigenní receptor, výhodně protilátka nebo její fragment, a zvláště receptor specifický⁷ pro lidský nádorový antigen, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto receptor obsahuje kombinaci funkčně přestavěných řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH pochází z lidských v podstatě nesenzibilizovaných zralých B lymfocytů a řetězec VL pochází z přirozeně se vyskytujícího repertoáru lidských B buněk, a přičemž uvedený anti-lidský antigenní receptor je získán způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.

10. Receptor podle nároku 9, který je specifický pro nativní lidský antigen 17-1 A, přičemž zvláště, řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

11. Řetězec VH nebo VL, nebo alespoň jedna CDR, zvláště CDR3, které jsou obsaženy v receptoru podle nároku 9 nebo 10.

12. Souprava vyznačující se t i m, že obsahuje kombinaci funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž • 00 ··

00 0 0· 0

0 0 0 0 0

0 · 000 000

0 0 0

000 *0 *0 <0 0000 • · 0

9 0 • 0

0 0 0 ·»·· 00

105 alespoň jeden z řetězců VH nebo VL pochází z lidských v podstatě nesenzibilizovaných zralých B lymfocytů, a přičemž oba řetězce jsou exprimovány z rekombinantních vektorů in vitro expozičního systému, zvláště systému fágové expozice.

13. Protilátka, která je získána z lidských sekvencí a která je specifická pro nativní lidský antigen 17-1 A.

14. Protilátka podle nároku 13, která je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, přičemž tato protilátka je výhodně získána způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.

15. Protilátka podle nároku 13 nebo 14, která rozpoznává epitop extracelulární domény antigenu 17-1A a výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidů č. 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 a 79, zvláště kde řetězec VH obsahuje alespoň jednu CDR jedné ze sekvencí uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo řetězec VL obsahuje alespoň jednu CDR ze sekvencí uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).

16. Farmaceutický⁷ přípravek vyznačující se tím, že obsahuje receptor podle nároku 9 nebo 10, řetězec VH podle nároku 11 a/nebo protilátku podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, a případně farmaceuticky přijatelný nosič.